ES2553786B1 - Método para la subclasificación de tumores - Google Patents

Abstract

Método para la subclasificación de tumores.#La presente invención proporciona un método de subclasificación o pronóstico de tumores, preferiblemente de mama, más preferiblemente positivos para los receptores hormonales de estrógenos, basado en la cuantificación de una serie de biomarcadores que se han identificado como diferencialmente expresados entre pacientes con mejor y peor pronóstico de la enfermedad. Dicho método permite determinar el riesgo de recaída y/o metástasis, siendo por tanto una herramienta útil para valorar el tratamiento más adecuado a administrar al paciente. Además, la presente invención se refiere a un kit que permite la subclasificación o pronóstico de tumores mediante este método.

Description

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METODO PARA LA SUBCLASIFICACION DE TUMORES DESCRIPCION

La presente invencion se encuadra dentro del campo de la biolog^a molecular y la oncologia, espedficamente, dentro de los metodos de subclasificacion de tumores, preferiblemente de mama. Concretamente, se refiere a un metodo de pronostico de la evolucion de los tumores, el cual permite determinar el riesgo de recaida y/o metastasis, siendo por tanto una herramienta util para determinar el tratamiento mas adecuado a administrar al paciente. Ademas, la presente invencion se refiere a un kit que permite la subclasificacion de tumores mediante este metodo.

ESTADO DE LA TECNICA

El cancer de mama es el tumor maligno mas frecuente en las mujeres y la primera causa de muerte por cancer en estas. Es una enfermedad heterogenea en cuanto a las manifestaciones clmicas, el pronostico y la sensibilidad a los diferentes tratamientos medicos. El pronostico del cancer de mama es particularmente relevante, ya que sirve para seleccionar los tratamientos mas adecuados que la paciente recibira, por ejemplo, terapia adyuvante despues de la cirugia para reducir el riesgo de recaida.

No todas las pacientes se beneficiaran de una terapia adyuvante. Asi, por ejemplo, en pacientes que presentan un buen pronostico tras un primer tratamiento es menos probable que la enfermedad recurra, y asi es menos probable que estas pacientes obtengan un beneficio adicional por parte de terapias adyuvantes sistemicas, pudiendo evitarse dicho tratamiento en estos casos. Ademas, la respuesta a un determinado tipo de terapia adyuvante puede variar entre las pacientes que estan siendo sometidas a la misma. Es por tanto de crucial importancia identificar factores asociados al pronostico, los cuales permitan determinar la agresividad del tumor y sean utiles para estimar la progresion de la enfermedad. El analisis de dichos factores permitira adecuar el tratamiento terapeutico a cada caso clmico y ademas predecir la sensibilidad o resistencia de un tumor a un determinado agente terapeutico. Estos factores, por tanto, permitiran determinar el pronostico del cancer de mama siendo de utilidad para evaluar si la paciente se beneficiara de una terapia adyuvante y que tipo de terapia sera la mas adecuada en su caso.

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En los ultimos anos numerosas publicaciones han puesto de manifiesto que las nuevas tecnicas de alto rendimiento en genomica pueden ser de gran utilidad en la consecucion de estos objetivos (Marchionni et al. Evid Rep Technol Assess. 2007 Dec.;(160):1-105). Estas tecnicas pueden proporcionar information sobre el riesgo de padecer la enfermedad, la presencia de un tumor oculto en programas de detection precoz, la deteccion precoz de una recaida, la posibilidad de que aparezca dicha reca^da del cancer (pronostico) y la posibilidad de sufrir efectos secundarios y de respuesta a los tratamientos. Asi, se han divulgado varios perfiles geneticos relacionados con el pronostico en cancer de mama. Tres de estos perfiles, los conocidos como “70-gene Signature" (van 't Veer et al. Nature. 2002 Jan 31;415(6871):530-6), “Recurrence Score" (Paik et al. N Engl J Med. 2004 Dec 30;351(27):2817-26), y “H/I Index" (Ma et al. J Clin Oncol. 2006 Oct 1;24(28):4611-9), han pasado una validation independiente, lo que se podria llamar ensayos en fase II.

El perfil de genes con valor pronostico “70-gene Signature", comercializado con el nombre de MammaPrint® por la empresa Agendia, se ofrece para el diagnostico de pacientes que presenten los siguientes criterios: tamano del tumor menor de 5 cm, carcinoma de mama en estadio I o II, sin afectacion ganglionar o hasta 3 ganglios linfaticos afectos, independientemente de la expresion del receptor de estrogenos (ER). El procedimiento requiere la medida de la expresion de los 70 genes que determinan la firma genica asociada a pronostico. El metodo empleado para su desarrollo consistio en la obtencion de RNA a partir de tejido congelado en fresco (FF, siglas del ingles “Fresh Frozen") y el empleo de microarrays de cDNA. El uso de tejido congelado para estudios moleculares a gran escala presenta varios problemas: las muestras congeladas son dificiles de recoger, complicadas de procesar y costosas de almacenar. Por el contrario, las muestras de tejido fijadas en formol y embebidas en parafina (FFPE, siglas del ingles “Formalin-Fixed Paraffin-Embedded") son estables a temperatura ambiente, faciles de almacenar y, lo que es mas importante, existe un amplio archivo de muestras clmicas disponibles junto con su informacion clmica y el seguimiento de la enfermedad. Actualmente este metodo se ofrece tambien en muestras FFPE. Por otro lado, el analisis de expresion mediante microarrays es una tecnica compleja que requiere de equipos sofisticados.

En los otros dos perfiles geneticos con valor pronostico mencionados anteriormente, conocidos como “Recurrence Score" y “H/I Index", el metodo empleado consiste en la obtencion de RNA a partir de muestras de tumores FFPE y el empleo de la tecnica

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RT-PCR a tiempo real, con las ventajas que ello supone.

El perfil “H/I Index" comercializado con el nombre de Theros H/I™ por la empresa BioTheranostics, requiere la medida de la expresion de los genes HOXB13 e IL17BR que determinan la firma genica asociada a pronostico y 4 genes que permiten la normalizacion. Este metodo permite pronosticar la respuesta al tratamiento hormonal en mujeres con carcinoma de mama positivo para la expresion del receptor de estrogenos y sin ganglios afectos.

El perfil “Recurrence Score", comercializado con el nombre de Oncotype DX™ por la empresa Genomic Health, Inc., se ofrece para el pronostico de pacientes a las que se les ha diagnosticado un carcinoma de mama invasivo en estadio I o II positivo para la expresion del receptor de estrogenos y que no presentan afectacion de los ganglios linfaticos. Este perfil es uno de los pocos para los que se han realizado estudios que permiten afirmar su utilidad clmica para predecir el beneficio de un tratamiento quimioterapeutico (Gianni et al. J Clin Oncol. 2005;23(29):7265-7277; Paik et al. J Clin Oncol. 2006;24(23):3726-3724; Chang et al. Breast Cancer Res Treat. 2008 Mar;108(2):233-40).

Por otro lado, otro de los perfiles genicos propuestos para el pronostico o subclasificacion de tumores de mama es el llamado “8-gene Score" (WO2010066928, Sanchez-Navarro et al. BMC Cancer 2010, 10:336), el cual se basa en la cuantificacion de ocho genes relacionados con la proliferacion celular, espedficamente de los genes DTL, ECT2, MTDH, PRC1, RFC4, SCUBE2, STK32B y ZNF533.

Otro de los perfiles genicos propuestos para el pronostico o subclasificacion de tumores de mama es el llamado PAM50 (Prosigna), basado en la expresion de 50 genes (ademas de 5 genes control), permite la identificacion de los subtipos intrinsecos moleculares (LumA, LumB, Her2 y Basal) y la estimacion del riesgo individual de recurrencia distante en pacientes ER+ (Jorgensen CL, Nielsen TO, Bjerre KD, Liu S, Wallden B, Balslev E, et al. PAM50 breast cancer intrinsic subtypes and effect of gemcitabine in advanced breast cancer patients. Acta Oncol. 2013). Tambien proporciona valores cuantitativos para la proliferacion y la expresion de los genes ESR1, PGR y ERBB2. Los 50 genes son espedficamente elegidos por su capacidad

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de ser analizados desde tejidos tumorales parafinados o frescos, y mediante dos plataformas: RT-qPCR o Nanostring.

En conclusion, el cancer, y concretamente el cancer de mama, es una enfermedad heterogenea con diferentes subtipos tumorales que presentan distinto pronostico y respuesta a las diferentes opciones terapeuticas. Durante los ultimos anos se ha puesto de manifiesto que las tecnicas de alto rendimiento en genomica son de gran utilidad para pronosticar el riesgo de recaida, de metastasis, la supervivencia y la respuesta a los diferentes tratamientos medicos adyuvantes. Sin embargo, los perfiles genicos descritos hasta la fecha para el pronostico del cancer requieren aun de ensayos de validation. Por otra parte, la capacidad predictiva de cada perfil es bastante limitada y existe la necesidad de disponer de perfiles genicos que proporcionen information complementaria a los ya existentes y que permitan pronosticar de forma fiable y eficiente la evolution del tumor, especialmente en terminos de recurrencia y/o metastasis, asi como la respuesta a las terapias administradas, sirviendo asi de ayuda en la toma de decisiones terapeuticas.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invention proporciona un metodo de subclasificacion de tumores, preferiblemente de mama, basado en la cuantificacion de una serie de biomarcadores que se han identificado como diferencialmente expresados entre pacientes con mejor y peor pronostico de la enfermedad. Concretamente, se refiere a un metodo de pronostico de tumores, preferiblemente de mama, el cual permite determinar el riesgo de recaida y/o metastasis, siendo por tanto una herramienta util para valorar el tratamiento mas adecuado a administrar al paciente. Ademas, la presente invencion se refiere a un kit que permite la subclasificacion o pronostico de tumores mediante este metodo.

El metodo de la presente invencion permite identificar pacientes con alto riesgo de metastasis y/o recurrencia en cancer, preferiblemente de mama, siendo la informacion pronostica que proporciona independiente y complementaria a la que proporcionan los perfiles geneticos comerciales (Mammaprint, Oncotype, y 8-gene Score). Estos perfiles comerciales estan basados en genes relacionados con la proliferation celular, sin embargo, el metodo de la invencion emplea genes o protemas (biomarcadores) relacionados con otro proceso biologico, la adhesion celular, mtimamente relacionado

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con la metastasis. El uso de la proteomica de alto rendimiento ha permitido a los inventores identificar este proceso como desregulado en una poblacion de pacientes de cancer de mama con positividad para los receptores hormonales de estrogeno (ER+), siendo esta una caracteristica propia de tumores de mama triple negativo (TNBC) los cuales son mas agresivos y presentan un peor pronostico. Por tanto, el metodo de la invention permite pronosticar la evolution del tumor en terminos de metastasis y/o recurrencia, identificando (subclasificando) dentro de los pacientes de cancer, preferiblemente de mama, mas preferiblemente cancer de mama ER+, una poblacion con altas probabilidades de sufrir metastasis/recaida a pesar de ser pacientes que han podido ser previamente clasificadas de bajo riesgo por los perfiles comerciales actuales.

El metodo de la invencion permite ademas decidir si es posible evitar la terapia adyuvante (quimioterapia) en pacientes de cancer, preferiblemente de mama, con riesgo de recurrencia bajo o intermedio en los que no esta clara la decision terapeutica, permitiendo asimismo el uso de terapias dirigidas y personalizadas.

Por ello, un primer aspecto de la invencion se refiere a un metodo para el pronostico in vitro de un sujeto que presenta un tumor, que comprende:

a. Cuantificar, en una muestra biologica aislada que comprende celulas tumorales de dicho sujeto, la cantidad del producto de la expresion del gen THEM6 (SEQ ID NO: 1), y

b. Comparar la cantidad cuantificada en la etapa (a) con un valor de referencia.

A dicho metodo se hara referencia en la presente invencion como "metodo de la invencion”.

En una realization preferida, el metodo de la invencion ademas comprende en la etapa (a) la cuantificacion de la cantidad del producto de la expresion del gen COLGALT1 (SEQ ID NO: 2).

En una realizacion mas preferida, el metodo de la invencion ademas comprende en la etapa (a) la cuantificacion de la cantidad del producto de expresion de al menos uno de los genes seleccionados de la lista que consiste en: APCS (SEQ ID NO: 3), AZGP1 (SEQ ID NO: 4), ASPN (SEQ ID NO: 5), CAPRIN1 (SEQ ID NO: 6), CTSG (SEQ ID

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NO: 7), CPA3 (SEQ ID NO: 8), CCDC40 (SEQ ID NO: 9), CMA1 (SEQ ID NO: 10), NCAPG2 (SEQ ID NO: 11), COL1A1 (SEQ ID NO: 12), COL6A1 (SEQ ID NO: 13), COL6A2 (SEQ ID NO: 14), COL6A3 (SEQ ID NO: 15), COL14A1 (SEQ ID NO: 16), EEF2 (SEQ ID NO: 17), EIF2A (SEQ ID NO: 18), FMOD (SEQ ID NO: 19), HSP90AB1 (SEQ ID NO: 20), HSPB6 (SEQ ID NO: 21), LUM (SEQ ID NO: 22), OGN (SEQ ID NO: 23), NSUN2 (SEQ ID NO: 24), BGN (SEQ ID NO: 25), DCN (SEQ ID NO: 26), PIP (SEQ ID NO: 27), PRKCDBP (SEQ ID NO: 28), PRELP (SEQ ID NO: 29), PSMC2 (SEQ ID NO: 30), RAB10 (SEQ ID NO: 31), SF3A1 (SEQ ID NO: 32), SOD3 (SEQ ID NO: 33), SRRM2 (SEQ ID NO: 34), STIP1 (SEQ ID NO: 35) o CCT7 (SEQ ID NO: 36), o cualquiera de sus combinaciones.

En una realization aun mas preferida, el metodo de la invention comprende en la etapa (a) la cuantificacion de la cantidad del producto de expresion de los genes THEM6, COLGALT1, APCS, AZGP1, ASPN, CAPRIN1, CTSG, CPA3, CCDC40, CMA1, NCAPG2, COL1A1, COL6A1, COL6A2, COL6A3, COL14A1, EEF2, EIF2A, FMOD, HSP90AB1, HSPB6, LUM, OGN, NSUN2, BGN, DCN, PIP, PRKCDBP, PRELP, PSMC2, RAB10, SF3A1, SOD3, SRRM2, STIP1 y CCT7.

Dentro del alance de la presente invencion se incluyen tambien aquellos genes que co-expresan o se encuentran correlacionados con los genes indicados anteriormente. Un ejemplo de dichos genes que co-expresan con estos, y cuya cuantificacion seria por tanto tambien un valor util para el metodo de pronostico aqu descrito, son los que se detallan en la Fig. 8.

El termino "muestra biologica aislada que comprende celulas tumorales”, tal y como se utiliza en la description se refiere, pero no se limita, a tejidos y/o fluidos biologicos de un sujeto, obtenidos mediante cualquier metodo conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biologica puede ser un tejido, por ejemplo, pero sin limitarse, una biopsia tumoral o un aspirado por aguja fina, o puede ser un fluido biologico, por ejemplo, pero sin limitarse, una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, linfa, fluido asdtico, orina o exudado mamario. La muestra puede ser tomada de un mamifero humano, pero tambien de mamiferos no humanos, como por ejemplo, pero sin limitarse roedores, rumiantes, felinos o canidos. La muestra biologica puede ser fresca, congelada, fijada o embebida en parafina. Preferiblemente, la muestra esta fijada en formalina y embebida en parafina. Mas preferiblemente, el sujeto del que se obtiene la muestra biologica aislada es un humano.

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Aun mas preferiblemente, la muestra biologica se a^sla de un sujeto que ha estado previamente sometido a una terapia antitumoral, incluyendo quimio y/o radioterapia, una mastectomia, o bien a una cirugia conservadora seguida de radio o quimioterapia. El metodo de la presente invention es util para predecir la respuesta del cancer a un determinado tratamiento. En otra realization preferida, el metodo de la presente invencion es util para tomar decisiones con respecto al tratamiento adyuvante a un tratamiento principal administrado al paciente. En una realizacion alternativa, el metodo de la presente invencion es util para tomar decisiones con respecto al tratamiento neoadyuvante a un tratamiento principal administrado al paciente.

Los terminos "tumor” o "tumoral”, tal y como se utilizan en la presente description, se refieren a celulas transformadas que presentan un crecimiento incontrolado. Dependiendo de su posible evolution puede tratarse de un tumor benigno, que permanece en su lugar de inicio y no produce metastasis, o de un tumor maligno o cancer, invasivo o que puede producir metastasis. El termino "tumor” se refiere en la presente invencion tanto a un tumor benigno como maligno.

El termino "cancer” o "canceroso” tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere a un tumor maligno, es decir, a una alteration de las celulas tumorales que tienen capacidad de invadir tejidos o de producir metastasis en lugares distantes del tumor primario. El termino "cancer”, tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere por tanto a la enfermedad neoplasica en la cual las celulas, de morfologia anormal, presentan un crecimiento descontrolado llegando a generar un tumor maligno. Se entiende por "cancer” el conjunto de enfermedades en las cuales el organismo produce un exceso de celulas malignas (celulas cancerosas), con crecimiento descontrolado y division mas alla de los limites normales, que en estadios avanzados conduce a la invasion del tejido circundante y, finalmente, a metastasis. Comprende cualquier enfermedad de un organo o tejido en un mamifero, preferiblemente el hombre, caracterizada por una multiplication pobremente controlada, o descontrolada, de celulas normales o anormales en dicho tejido, y su efecto en la totalidad del cuerpo.

El termino "cancer”, dentro de esta definition, incluye las neoplasias malignas (como carcinoma, sarcoma, carcinosarcoma, etc.), displasias, hiperplasias, asi como neoplasias que muestran metastasis, o cualquier otra transformacion como por ejemplo, leucoplasias que a menudo preceden al brote del cancer. Las celulas y los

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tejidos son cancerosos cuando crecen y se replican mas rapidamente de lo normal, desplazandose o dispersandose en el tejido sano circundante o en cualquier otro tejido del cuerpo, lo que se conoce como metastasis, asume formas y tamanos anormales, muestra cambios en su ratio nucleocitoplasmatico, policromasia nuclear, y finalmente cesa. Celulas y tejidos cancerosos pueden afectar al cuerpo como un todo causando smdromes paraneoplasicos, o pueden ocurrir en un organo o tejido vital, siendo interrumpida o danada su funcion normal, con posibles resultados fatales. Generalmente se dice que el cancer se encuentra en uno de tres estados de crecimiento: temprano o localizado, cuando el tumor aun se encuentra confinado en el tejido de origen, o en su localizacion primaria; extension directa, cuando las celulas cancerosas del tumor han invadido el tejido adyacente o se ha extendido unicamente a los nodulos linfaticos regionales; o metastasis, cuando las celulas cancerosas han migrado a partes distantes del cuerpo desde la localizacion primaria, por medio del sistema circulatorio o linfatico, y se ha establecido en localizaciones secundarias.

Ejemplos de tipos de cancer son, aunque sin limitarnos, canceres ginecologicos, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de piel incluyendo melanoma, cancer hepatico, cancer de pulmon, cancer de esofago, cancer gastrico, cancer de pancreas, cancer de vejiga, cancer del tracto urinario, cancer tiroideo, cancer renal, cancer de cerebro, sarcoma, linfoma o leucemia. Existe un grupo de tumores en los que es importante la participation de la regulation hormonal, tales como los tumores de mama, ginecologicos o de prostata. Dentro de los canceres ginecologicos se engloban los tumores de mama, ovario, utero, cervix, vagina y vulva. El metodo de la invention es extrapolable a estos otros tipos de tumores de origen hormonal ademas del de mama. Por tanto, preferiblemente, el metodo de la presente invencion se refiere, pero no se limita a un metodo para la subclasificacion o pronostico in vitro de tumores de origen hormonal, mas preferiblemente de mama, ginecologicos o de prostata.

En una realization mas preferida del metodo de la invencion, el tumor es de mama.

El "tumor de mama” es la proliferation acelerada, desordenada y no controlada de celulas pertenecientes a distintos tejidos de una glandula mamaria. La palabra "carcinoma” se aplica a los tumores malignos que se originan en estirpes celulares de origen epitelial o glandular. La mayoria de los carcinomas de mama tienen su origen en la proliferacion acelerada e incontrolada de las celulas que tapizan el interior de los conductos que durante la lactancia llevan la leche desde los acinos glandulares,

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donde se produce, hasta los conductos galactoforos, situados detras de la areola y el pezon, donde se acumula en espera de salir al exterior; este cancer de mama se conoce como "carcinoma ductal”. En los casos restantes el cancer tiene su origen en los propios acinos glandulares y se le llama "carcinoma lobulillar”.

Muchos carcinomas de mama se encuentran confinados en la luz de los ductos o de los acinos, sin invadir los tejidos vecinos, recibiendo el nombre de "carcinomas in situ”. Cuando proliferan en demasia pueden romper la llamada membrana basal y extenderse infiltrando los tejidos que rodean a ductos y acinos y entonces reciben nombres como "carcinoma ductal infiltrante” o "carcinoma lobulillar infiltrante”.

En la presente invention el termino "tumor de mama” incluye a los carcinomas de mama en cualquiera de los cinco estadios posibles (0, I, II, III y IV). El tumor se clasifica en estos estadios en funcion del tamano del tumor (T), la diseminacion a los ganglios linfaticos (N), y la metastasis o diseminacion a otras partes del cuerpo (M).

Las expresiones "sin afectacion de los ganglios linfaticos”, "sin ganglios linfaticos afectos”, tal y como se utiliza en la presente description, se refiere a un cancer que no se ha diseminado a los ganglios linfaticos. Por el contrario, el termino "con afectacion de los ganglios linfaticos” o "con ganglios linfaticos afectos”, tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere a un cancer que se ha diseminado a al menos a un ganglio linfatico.

Como se muestra posteriormente en los ejemplos de la presente invencion, mediante el metodo aqu descrito los inventores fueron capaces de identificar, dentro de un grupo de pacientes de cancer de mama previamente diagnosticadas clmicamente como pacientes de cancer de mama positivo para la expresion de los receptores hormonales de estrogenos (ER+), una subpoblacion cuyo perfil de expresion en base a la firma proteica aqu propuesta tenia una mayor similitud con un grupo de pacientes de cancer de mama triple negativo (TNBC). Esta subpoblacion ER+ cuya firma genica era similar a la del grupo TNBC presentaba una supervivencia libre de metastasis inferior (71,1%) a la de pacientes con cancer ER+-real (88%). De modo que dicha subpoblacion de pacientes ER+ con tumores con caracteristicas TNBC no solo tenia un perfil molecular mas parecido al de estos ultimos, sino que ademas la evolution clmica de estas pacientes era parecida a la de aquellas con TNBC, siendo los grupos con peor pronostico.

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Asi, el metodo de la invention es de utilidad para subclasificar pacientes diagnosticadas como cancer de mama ER+ en pacientes con cancer de mama con caracteristicas de TNBC con un peor pronostico.

Por ello, mas preferiblemente en el metodo de la invencion el tumor es un tumor de mama HER2 negativo o positivo para la expresion de los receptores hormonales de estrogenos (ER+).

La expresion "positivo para receptores hormonales”, tal y como se utiliza en la presente description, se refiere a un tumor que presenta expresion para el receptor de estrogenos y/o progesterona. Se entiende por "cancer de mama positivo para los receptores hormonales de estrogenos (ER+)” un tumor que presenta expresion para el receptor de estrogenos. La expresion "positivo para receptor de progesterona” se refiere a un tumor que presenta expresion para el receptor de progesterona. Como se ha indicado en el parrafo anterior, preferiblemente, el metodo de la presente invencion se refiere, pero no se limita, a un metodo para la subclasificacion o pronostico de tumores de mama positivos para la expresion del receptor de estrogenos.

El "cancer de mama triple negativo (TNBC)” se define como la ausencia de tincion en el receptor de estrogeno, en el receptor de progesterona y HER2/neu. Suele ser mas agresivo que otros tipos de cancer de mama, ya que al no estar estimulado el crecimiento del tumor por las hormonas estrogeno y progesterona, ni por la presencia de demasiados receptores de HER2, este tipo de cancer no responde a la hormonoterapia (como tamoxifeno o inhibidores de la aromatasa) ni a las terapias dirigidas a los receptores de HER2, como Herceptin (nombre generico: trastuzumab).

El termino "producto de la expresion”, tal y como se utiliza en esta descripcion, hace referencia a cualquier producto de transcription o expresion (ARN o protema) de los genes propuestos en el metodo de la invencion, o a cualquier forma resultante del procesamiento de dichos productos de transcripcion o expresion. Los productos de expresion de los genes descritos en la presente invencion son, preferiblemente, mRNA o protema.

El termino "cantidad”, tal y como se utiliza en la descripcion, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa del producto de expresion del gen, asi como a cualquier otro valor o parametro relacionado con la misma o que pueda derivarse de

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esta. Dichos valores o parametros comprenden valores de intensidad de la senal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades fisicas o qwmicas de los productos de expresion de los genes especificados, obtenidos mediante medida directa, por ejemplo, valores de intensidad de espectrometria de masas o resonancia magnetica nuclear. Adicionalmente, dichos valores o parametros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos posteriormente.

La cuantificacion de la cantidad de producto de la expresion de los genes en la muestra obtenida, tal y como se utiliza en la description, hace referencia a la medida de la cantidad o la concentration, preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa. La medida puede ser llevada a cabo, como se ha indicado anteriormente, de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentracion del producto de la expresion del gen basada en una senal que se obtiene directamente del producto de la expresion del gen y que esta correlacionada directamente con el numero de moleculas del producto de la expresion del gen presente en la muestra. Dicha senal - a la que tambien podemos referirnos como senal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad quimica o fisica del producto de expresion. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario (por ejemplo, un componente distinto del producto de la expresion genica) o un sistema de medida biologica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas” o productos de reaction enzimatica).

De acuerdo con la presente invencion, la cuantificacion de la cantidad de producto de la expresion de los genes puede ser llevada a cabo por cualquier metodo de determination de la cantidad del producto de la expresion de los genes conocido por el experto en la materia. En una realization preferida, la cuantificacion del producto de la expresion de los genes se realiza determinando el nivel de mRNA derivado de su transcription, donde el analisis del nivel de mRNA se puede realizar, a trtulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invention, mediante amplification por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripcion en combination con la reaccion en cadena de la ligasa (RT-LCR), retrotranscripcion en combinacion con la reaccion en cadena de la polimerasa (RT-PCR), retrotranscripcion en combinacion con la reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (qRT-PCR), o cualquier otro metodo de amplificacion de acidos nucleicos; microarrays de DNA elaborados con

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oligonucleotidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de DNA elaborados con oligonucleotidos sintetizados in situ mediante fotolitografia o por cualquier otro mecanismo; hibridacion in situ utilizando sondas espedficas marcadas con cualquier metodo de marcaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridacion con una sonda espedfica; mediante RMN o cualquier otra tecnica de diagnostico por imagen utilizando nanopartmulas paramagneticas o cualquier otro tipo de nanopartmulas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.

El mRNA puede ser extraido, por ejemplo, pero sin limitarse a partir de muestras de tejido fresco, tejido FF o de muestras de tejido FFPE. Los metodos de obtencion de RNA total o mRNA son bien conocidos en el estado de la tecnica. El uso de muestras de tejido FFPE presenta importantes ventajas con respecto a las muestras de tejido FF: son estables a temperatura ambiente, faciles de almacenar y existe un amplio archivo de muestras clmicas disponibles junto con su informacion clmica y el seguimiento de la enfermedad. Por tanto, en una realizacion preferida el mRNA se extrae de muestras de tejido FFPE.

En otra realizacion preferida, la cuantificacion de la cantidad de producto de expresion de los genes en la muestra biologica se realiza determinando el nivel de las protemas codificadas por dichos genes, mediante preferiblemente la incubacion con un anticuerpo espedfico, en ensayos como Western blot, geles de electroforesis, inmunoprecipitacion, arrays de protema, inmunofluorescencia, inmunohistoqdmica, ELISA o cualquier otro metodo enzimatico; mediante la incubacion con un ligando espedfico; mediante RMN o cualquier otra tecnica de diagnostico por imagen; o, por ejemplo, mediante tecnicas cromatograficas combinadas con espectrometria de masas.

La cuantificacion de la protema de interes puede llevarse a cabo por medio de cualquiera de las tecnicas mencionadas o por cualquier combinacion de las mismas. La protema puede ser detectada evaluando su presencia o ausencia. La deteccion puede llevarse a cabo por medio del reconocimiento espedfico de cualquier fragmento de la protema por medio de cualquier sonda y/o cualquier anticuerpo. La protema, o cualquiera de sus fragmentos, puede ser cuantificada, sirviendo estos datos como referencia para compararlos con el valor de referencia y buscar alguna desviacion significativa. Esta desviacion significativa puede ser asignada al pronostico de cancer

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en el individuo del que procede la muestra problema. En una realization preferida, la protema, o cualquiera de sus fragmentos, puede ser cuantificada por medio de electroforesis y/o inmunoensayo.

La “electroforesis” es una tecnica analrtica de separation basada en el movimiento o la migration de macro-moleculas disueltas en un medio (buffer de electroforesis), mediante una matriz o un solido apoyo como resultado de la action de un campo electrico. El comportamiento de la molecula depende de su movilidad electroforetica y esta movilidad depende de la carga, tamano y forma. Existen numerosas variaciones de esta tecnica basadas en el equipamiento usado, soportes y condiciones para llevar a cabo la separacion de las protemas. La electroforesis se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, electroforesis capilar, electroforesis en papel, electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de poliacrilamida, isoelectroenfoque o electroforesis bidimensional.

Un “inmunoensayo” es una prueba bioquimica que mide la concentration de una sustancia en un liquido biologico usando la reaction de un anticuerpo o anticuerpos con alguno de sus antigenos. El ensayo aprovecha la especificidad de un anticuerpo con su antigeno. La cantidad de anticuerpo o antigeno puede detectarse por medio de metodos conocidos en el estado de la tecnica. Uno de los metodos mas comunes es el que se basa en el marcaje del antigeno o de los anticuerpos. El marcaje puede llevarse a cabo, pero sin limitarse, mediante una enzima, radioisotopos (radioinmunoensayo), etiquetas magneticas (inmunoensayo magnetico) o fluorescencia, y tambien otras tecnicas incluidas aglutinacion, nefelometria, turbidimetria o Western Blot. Los inmunoensayos heterogeneos pueden ser competitivos o no competitivos. El inmunoensayo puede ser competitivo: la respuesta sera inversamente proporcional a la concentracion de antigeno en la muestra, o puede ser no competitivo (conocido tambien como "sandwich assay"): los resultados son directamente proporcionales a la concentracion del antigeno. Una tecnica de inmunoensayo que puede ser utilizada en la presente invention es el ensayo ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

Por medio de las “tecnicas cromatograficas”, las moleculas pueden ser separadas, pero sin limitarse, por su carga, tamano, masa molecular, mediante su polaridad o mediante su potencial redox. La tecnica de cromatografia se selecciona, pero sin limitarse, de entre cromatografia de liquidos (cromatografia de partition, cromatografia

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de adsorcion, cromatografia de exclusion o cromatografia de intercambio ionico), cromatografia de gases o cromatografia de fluidos supercriticos.

La “tecnolog^a de microarray” esta basada, por ejemplo, sobre la fijacion en un soporte solido de una molecula que reconoce la protema de interes. El microarray basado en anticuerpos es el microarray de protemas mas comun. En este caso, los anticuerpos se fijan en el soporte solido (tambien se puede emplear el termino chip para referirse a microarray). Estos anticuerpos son utilizados para capturar moleculas que permiten la deteccion de protemas procedentes de muestras biologicas. El termino "soporte solido" tal como se emplea en la presente invencion se refiere a una gran variedad de materiales, por ejemplo, pero sin limitarse, intercambio de iones o resina adsorcion, vidrio, plastico, latex, nylon, gel, esteres de celulosa, esferas paramagneticas o la combinacion de algunos de ellos.

El termino “valor de referenda” o “punto de corte” o “cantidad de referenda”, tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere a cualquier valor o rango de valores derivado de la cuantificacion del producto de la expresion del/los gen/es biomarcador/es en una muestra biologica, o en una coleccion de muestras biologicas, preferiblemente procedentes de individuos afectados de cancer con un mal pronostico, que permita definir dos poblaciones con diferente riesgo de recaida y/o metastasis. La cantidad de referencia se ha de medir de la misma forma, y ser obtenida en el mismo tipo de muestra biologica aislada, que la cantidad medida en el sujeto analizado. Preferiblemente en el metodo de la invencion, el valor de referencia del paso (b) se obtiene tras la cuantificacion del producto de la expresion del gen de la etapa (a) en una muestra biologica aislada que comprende celulas tumorales de un individuo que presenta un tumor de mama triple negativo.

El termino “comparacion”, tal y como se utiliza en la descripcion, se refiere pero no se limita, a la comparacion de la cantidad del producto de expresion del gen cuantificada en la etapa (a) del metodo de la invencion, con un valor de referencia. La comparacion descrita en el apartado (b) del metodo de la presente invencion puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.

En una realizacion mas preferida, el metodo de la invencion ademas comprende un paso (c) donde si la/s cantidad/es cuantificada/s en el paso (a) no presenta/n una

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desviacion significativa con respecto al valor de referencia con el que se compara/n en el paso (b), se asigna al sujeto al grupo de pacientes con un mal pronostico.

El termino “pronostico”, tal y como se utiliza en la presente description, se refiere, pero no se limita, a la determination de la progresion de un tumor, incluyendo recaida o recurrencia, capacidad de diseminacion metastasica, supervivencia libre de metastasis o respuesta a un determinado tratamiento. En una realization mas preferida, el “mal pronostico" se refiere a un alto riesgo de recaida y/o de metastasis, y/o una menor supervivencia libre de recaida a distancia o de metastasis o una menor supervivencia global.

El termino “supervivencia libre de recaida a distancia” (SLRD), tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere al tiempo transcurrido desde la fecha de la cirugia hasta la recaida a distancia o hasta la ultima visita. El termino “supervivencia global” (SG), tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere al tiempo transcurrido desde la fecha de la cirugia hasta la ultima visita o hasta el fallecimiento del paciente.

Una “desviacion significativa” con respecto al valor de referencia puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadisticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinacion de intervalos de confianza, determinacion del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher; preferiblemente mediante las herramientas estadisticas descritas posteriormente en los ejemplos.

Los genes HSP90AB1, EEF2, STIP1, PSMC2, RAB10, NSUN2, CAPRIN1, SF3A1, COLGALT1, THEM6, CCT7, EIF2A y SRRM2 presentan una expresion aumentada en muestras procedentes de pacientes de cancer de mama TNBC con un peor pronostico, con respecto a la expresion cuantificada para esos mismos genes en una muestra de cancer de mama ER+ con un buen pronostico. A su vez, los genes HSPB6, COL1A1, APCS, DCN, SOD3, CTSG, COL6A1, COL6A2, COL6A3, PIP, CPA3, OGN, BGN, CMA1, AZGP1, LUM, PRELP, COL14A1, FMOD, CCDC40, NCAPG2, PRKCDBP y ASPN presentan una expresion reducida en muestras procedentes de pacientes de cancer de mama TNBC con un peor pronostico, con respecto a la expresion cuantificada para esos mismos genes en una muestra de cancer de mama ER+ con un buen pronostico.

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En otra realization preferida, el metodo de la invention ademas comprende en la etapa (a) la cuantificacion de la cantidad del producto de expresion de al menos uno de los genes incluidos en la firma genetica MammaPrint, OncoType, Theros H/I, Prosigna o 8-gene Score, o cualquiera de sus combinaciones. Los genes biomarcadores que forman parte de estas firmas geneticas son los divulgados en la bibliografia correspondiente (MammaPrint divulgado en van 't Veer et al. Nature. 2002 Jan 31;415(6871):530-6; OncoType divulgado en Paik et al. N Engl J Med. 2004 Dec 30;351(27):2817-26, Theros H/I divulgado en Ma et al. J Clin Oncol. 2006 Oct 1;24(28):4611-9; Prosigna divulgado en Jorgensen CL, Nielsen TO, Bjerre KD, Liu S, Wallden B, Balslev E, et al. PAM50 breast cancer intrinsic subtypes and effect of gemcitabine in advanced breast cancer patients. Acta Oncol. 2013; y 8-gene Score divulgado en WO2010066928). Dentro del ambito de la presente invencion tambien se incluyen aquellos genes que co-expresan o se encuentran correlacionados con los genes de estas firmas geneticas.

Los pasos (a) y/o (b) del metodo de la invencion pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un equipo robotico para la cuantificacion, en el paso (a), de la cantidad de producto de expresion del gen en la muestra biologica aislada.

Ademas de los pasos especificados anteriormente, el metodo de la invencion puede comprender otros pasos adicionales, por ejemplo, aunque sin limitarnos, relacionados con el pre-tratamiento de la muestra biologica aislada previamente a su analisis.

El metodo de la presente invencion puede incluir adicionalmente un paso en el cual, si se determina que el paciente presenta un mal pronostico, se determine el tratamiento para el paciente.

El tratamiento principal del cancer habitualmente suele ser la cirugia. En el caso del cancer de mama, la cirugia suele consistir bien en una mastectomia o bien en una cirugia conservadora. La expresion “mastectomia”, tal y como se utiliza en la presente description, se refiere a la extirpation de la mama o de tanto tejido de la mama como este afectado. En la mayoria de los casos, el cirujano extirpa tambien los ganglios linfaticos de la axila. La “expresion cirugia conservadora”, tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere a la extirpacion del tumor pero no de la mama; tambien se conoce como tumorectomia, mastectomia segmentaria o mastectomia

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parcial.

Despues de la cirug^a, muchos pacientes reciben terapia adyuvante. El termino "terapia adyuvante”, tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere al tratamiento que se da despues del tratamiento principal con el objetivo de prevenir la recaida del cancer en el seno o en otro lugar. En el tratamiento del cancer, la terapia adyuvante puede consistir, por ejemplo, pero sin limitarse en radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal o terapia biologica.

La quimioterapia adyuvante implica el uso de farmacos anticancerigenos, generalmente en combination. Los mas frecuentemente usados incluyen antraciclinas, tales como doxorubicina o epirubicina, 5-fluorouracilo, metotrexato, ciclofosfamida, y taxoides como el paclitaxel o docetaxel. La terapia hormonal adyuvante usa analogos de estrogenos tales como el tamoxifeno, que reduce el crecimiento de las celulas cancerosas bloqueando el receptor de estrogenos.

Algunos pacientes antes de la cirugia reciben terapia "neoadyuvante”. El termino "terapia neoadyuvante”, tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere a la terapia adyuvante que se administra antes del tratamiento principal con el objetivo de reducir el tamano del tumor, para posibilitar o facilitar la cirugia. En el tratamiento del cancer dicha terapia, puede incluir, por ejemplo, pero sin limitarse, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal o terapia biologica.

La "radioterapia” consiste en el uso de radiaciones ionizantes para destruir las celulas cancerosas. Despues de la cirugia conservadora de mama, la mayoria de los pacientes reciben radioterapia. Algunos pacientes reciben radioterapia despues de una mastectomia. Algunos pacientes reciben radioterapia antes de la cirugia.

Los tumores positivos para receptores hormonales suelen tratarse con terapia hormonal con el objetivo de reducir o detener los efectos del estrogeno sobre las celulas tumorales. La terapia hormonal, puede consistir, por ejemplo, pero sin limitarse, en la administration de moduladores selectivos de receptores de estrogeno, inhibidores de aromatasa, agonistas de hormonas liberadoras de hormonas luteinizantes u otros agentes hormonales. Algunos moduladores selectivos de receptores de estrogeno son, por ejemplo, pero sin limitarse tamoxifeno, raloxifeno o toremifeno. Algunos inhibidores de aromatasa son, por ejemplo, pero sin limitarse

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letrozol, anastrozol o exemestano. Otras sustancias anti-estrogenicas: fulvestrant. Otros agentes hormonales son, por ejemplo, pero sin limitarse, los androgenos.

El TNBC es insensible a algunos de los tratamientos mas eficaces disponibles para el cancer de mama, incluyendo el tratamiento dirigido al HER2 como el trastuzumab y los tratamientos endocrinos como el tamoxifeno, o los inhibidores de la aromatasa. La quimioterapia citotoxica combinada, administrada en dosis densas o metronomicas, continua siendo el tratamiento estandar en los TNBC en estadio temprano.

La “quimioterapia” consiste en el uso de compuestos o combinaciones de compuestos con el objetivo de destruir celulas cancerosas. Los compuestos administrados en la quimioterapia para el cancer de mama pueden ser por ejemplo, pero sin limitarse, agentes alquilantes, antimetabolitos, inhibidores de la mitosis o antibioticos antitumorales. Algunos agentes alquilantes son, por ejemplo, pero sin limitarse, cisplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, ifosfamida, mecloretamina o melfalan. Algunos antimetabolitos, son por ejemplo, pero sin limitarse, fluorouracilo, metotrexato, gemcitabina, citarabina o fludarabina. Algunos inhibidores de la mitosis son, por ejemplo, pero sin limitarse paclitaxel, docetaxel, etoposido, vinblastina, vincristina o vinorelbina. Algunos antibioticos antitumorales, son por ejemplo, pero sin limitarse bleomicina o antraciclinas. Algunas antraciclinas son, por ejemplo, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina o idarrubicina.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un kit, de ahora en adelante “kit de la invencion”, que consiste en cebadores y/o sondas capaces de hibridar con los productos de expresion de los genes THEM6, COLGALT1, APCS, AZGP1, ASPN, CAPRIN1, CTSG, CPA3, CCDC40, CMA1, NCAPG2, COL1A1, COL6A1, COL6A2, COL6A3, COL14A1, EEF2, EIF2A, FMOD, HSP90AB1, HSPB6, LUM, OGN, NSUN2, BGN, DCN, PIP, PRKCDBP, PRELP, PSMC2, RAB10, SF3A1, SOD3, SRRM2, STIP1 y CCT7.

Otro aspecto de la invencion se refiere al uso de un kit que comprende sondas y/o cebadores capaces de hibridar con los productos de expresion del gen THEM6, preferiblemente que ademas comprende sondas y/o cebadores capaces de hibridar con los productos de expresion de cualquiera de los genes seleccionados de la lista que consiste en: COLGALT1, APCS, AZGP1, ASPN, CAPRIN1, CTSG, CPA3, CCDC40, CMA1, NCAPG2, COL1A1, COL6A1, COL6A2, COL6A3, COL14A1, EEF2,

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EIF2A, FMOD, HSP90AB1, HSPB6, LUM, OGN, NSUN2, BGN, DCN, PIP, PRKCDBP, PRELP, PSMC2, RAB10, SF3A1, SOD3, SRRM2, STIP1 o CCT7, o cualquiera de sus combinaciones, para llevar a cabo el metodo de la invention. En una realization preferida de este aspecto de la invencion, el kit es el kit de la invencion descrito en el parrafo anterior.

Los kits descritos en la presente invencion pueden comprender cebadores, sondas, anticuerpos poli o monoclonales, y todos aquellos reactivos necesarios para cuantificar y analizar la variation en el nivel de expresion de los genes por medio de cualquiera de los metodos descritos anteriormente en este documento y/o conocidos en el estado de la tecnica. Los kits ademas pueden incluir, sin ningun tipo de limitation, el uso de tampones, enzimas, enzimas polimerasas, cofactores para obtener una actividad optima de estas, agentes para prevenir la contamination, etc. Los kits pueden contener ademas otras moleculas, genes, protemas o sondas de interes, que sirvan como controles positivos y negativos. Por otro lado los kits pueden incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimization. Preferiblemente, los kits comprenden ademas las instrucciones para llevar a cabo el metodo de la invencion.

Los cebadores, sondas y/o anticuerpos comprendidos en los kits descritos en la invencion presentan complementariedad, y por tanto, capacidad de hibridacion, con al menos un producto de la expresion de cada uno de los genes descritos para el metodo de la invencion.

El termino “sonda”, tal y como se emplea en la presente description, se refiere a una molecula de ADN o ARN monocatenario con una secuencia de bases espedfica, preferiblemente marcada, que se utiliza para detectar secuencias de bases complementarias en el producto de la expresion de un gen por hibridacion parcial o total. Las sondas pueden ser, por ejemplo, pero sin limitarnos, un oligonucleotido, un fragmento amplificado por PCR o un fragmento de ADN purificado. La expresion “sonda del producto de expresion del gen” se refiere a una sonda que permite detectar la expresion de dicho gen, es decir, se refiere a una sonda complementaria al ARNm o al ADNc de dicho gen.

El termino “cebador”, como se utiliza aqui, se refiere a un oligonucleotido de ADN o ARN complementario a la secuencia de un acido nucleico molde determinado, que

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actua como punto de inicio para la adicion de nucleotidos en el proceso de copia de la cadena complementaria a la secuencia de dicho acido nucleico molde, por ejemplo, pero sin limitarnos en una PCR. Preferiblemente, el cebador es un oligonucleotido de ADN. La expresion "cebador del producto de expresion del gen” se refiere a un cebador que permite detectar la expresion de dicho gen, es decir, se refiere a un cebador complementary al ARNm o al ADNc de dicho gen. Cebadores que pueden emplearse en la presente invention son conocidos en el estado de la tecnica o pueden disenarse con facilidad a partir de la secuencia de los genes aqu descritos.

En una realization preferida, al menos uno de los anticuerpos de los kits de la invencion esta marcado o inmovilizado. En una realizacion mas preferida, al menos uno de los anticuerpos de los kits de la invencion esta marcado con una etiqueta seleccionada de la lista que comprende: un radioisotopo, un marcador fluorescente o luminiscente, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una etiqueta de afinidad, una enzima y un substrato de una enzima. En una realizacion preferida, al menos uno de los anticuerpos de los kits de la invencion esta inmovilizado en una matriz de nylon, en un soporte de plastico o en cuentas.

A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteristicas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Cluster jerarquico en base a protelnas expresadas diferencialmente entre pacientes de cancer de mama positivo para receptores hormonales de estrogeno (ER+) (gris oscuro, cuarta llnea desde arriba) y pacientes de cancer de mama triple negativo (TNBC) (gris mas oscuro, segunda llnea desde arriba).

Apareda un grupo de pacientes diagnosticadas como ER+ con un perfil mas parecido a las TNBC, denominadas TNBC-like (gris mas claro, primera lmea desde arriba). Las que se mantetian como ER+ (gris claro, tercera lmea desde arriba) se denominaron ER-true.

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FIG. 2. Cluster jerarquico en base a protelnas expresadas diferencialmente entre ER-true (gris claro) y TNBC-like (gris oscuro).

FIG. 3. Evolucion cllnica de los subgrupos identificados mediante el cluster: ER- true, TNBC-like y TNBC. Los dos ultimos presentaron una evolucion similar, siendo los grupos de peor pronostico.

FIG. 4. Predictor TNBC-like en la poblacion base.

FIG. 5. Firma de Adhesion en la poblacion de pacientes ER+, nodulo linfatico positivo (LN+) (n=421) pertenecientes a la cohorte de validacion.

FIG. 6. Firma de Adhesion por subtipos moleculares (A) LumA (n=363), (B) LumB (n=223), (C) Normal (n=246), (D) Her2 (n=129) y (E) Basal (n=180).

FIG. 7. Perfiles comerciales aplicados sobre las pacientes ER+ de la cohorte de validacion (n=1028). A. Mammaprint. Clasifica en 2 grupos de riesgo (alto y bajo) B. Combination de Mammaprint con la Firma de Adhesion. A cada uno de los grupos de riesgo (alto y bajo), la Firma de Adhesion los subdivide en 2 nuevos grupos (ER-true o TNBC). C. Oncotype. Clasifica en 3 grupos de riesgo: bajo, intermedio y alto. D. Combinacion de Oncotype con la Firma de Adhesion. A cada uno de los grupos de riesgo del Oncotype, la Firma de Adhesion los subdivide en 2 nuevos grupos (ER-true o TNBC). E. 8-geneScore. Clasifica en 2 grupos de riesgo (alto y bajo). F. Combinacion de 8-geneScore con la Firma de Adhesion. A cada uno de los grupos de riesgo (alto y bajo), la Firma de Adhesion los subdivide en 2 nuevos grupos (ER-true o TNBC).

FIG. 8. Genes correlacionados con los genes biomarcadores descritos para el metodo de la invencion.

EJEMPLOS

A continuation se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del metodo de pronostico de la invencion.

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1. Material y metodos

1.1. Selection de muestras.

Se seleccionaron 106 muestras parafinadas (FFPE) de pacientes diagnosticados de cancer de mama. Nueve de ellas estaban disponibles en el Biobanco del Hospital Universitario La Paz, IdiPAZ (RD09/0076/00073) y las 97 restantes pertenedan al Biobanco del Hospital Universitario 12 de Octubre, I+12 (RD09/0076/00118), ambos integrados en la red Nacional de Biobancos (RetBioH;
www.redbiobancos.es).

Unicamente se procesaron las muestras con un contenido mmimo de celulas tumorales del 50%. Solo fueron incluidas en el estudio aquellas para las que hatia suficiente cantidad de protema, asi como aquellas para las que el numero de peptidos fuera superior a la media menos 2 desviaciones estandar sobre el numero total de peptidos identificados.

1.2. Extraction y digestion de proteinas.

Las muestras FFPE se cortaron en un microtomo. Cada corte se desparafino en xileno y se lavo dos veces con etanol absoluto. Las muestras lavadas se resuspendieron en Tris-HCl 40 mM- 2% SDS, pH 8,2. A continuation se incubo la mezcla en un termobloque (Eppendorf) a 100°C durante 20 minutos seguido de 2 horas a 80° C (1). A continuacion, se centrifugaron a 15.000 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente, y los pellets obtenidos fueron desechados. El extracto obtenido se guardo a -80 °C hasta ser utilizado (2). La concentration de proteinas se determino usando el kit MicroBCA (Pierce-Thermo Scientific).

La digestion de los extractos (10 ^g) se llevo a cabo con tripsina (1:50) y se elimino el SDS de los lisados digeridos usando el kit Detergent Removal Spin Columns (Pierce). A continuacion las muestras fueron desaladas (ZipTips-Millipore), se secaron y se resolubilizaron en 15 ^L de acido formico al 0,1% y acetonitrilo al 3% antes de ser analizados por espectrometria de masas (2).

1.3. Cromatografia liquida y espectrometria de masas.

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Las muestras (4 ^L) se analizaron en un espectrometro de masas hforido, LTQ- Orbitrap Velos (Thermo Fischer Scientific) acoplado a un sistema NanoLC-Ultra (Eksigent Technologies) de gran precision. La separation de peptidos se llevo a cabo en una columna de fase reversa (75 ^m x 150 mm) a una velocidad de flujo de 250 nL/min.

La composition del solvente fue acido formico al 0,1% para el canal A y acido formico al 0,1%/acetonitrilio al 99,9% para el canal B. Los peptidos se eluyeron con un gradiente de 5-30% de acetonitrilo en 95 minutos.

El espectrometro opero en el modo data-dependent (DDA), adquiriendo un espectro de 300-1.700 m/z con una resolution de 30.000 a 400 m/z, seguido por una fragmentation CID (collision-induced dissociation) de las 20 senales mas intensas cada ciclo. El automatic gain control (AGC) se establecio en 10.000 iones. Las muestras se calibraron empleando las senales m/z de 429,088735 y 445,120025, que corresponden a peptidos conocidos.

1.4. Procesamiento de datos de expresion de proteinas.

Los datos adquiridos por espectrometria de masas (MS) se procesaron con el software MaxQuant (version 1.2.7.4) (3) y mediante el motor de busqueda Andromeda, se procedio a la identification de proteinas (4). Para identificar los espectros, se compararon con los de las bases de datos humanas UniProtKB/Swiss- Prot. La carbamidometilacion de la cistema se asumio como una modification fija, mientras que la oxidation (M), desamidacion (N, Q) y la acetilacion en el extremo N- terminal como modificaciones variables. La tasa de falsos descubrimientos (FDR) maxima fue de 0,01 para peptidos y 0,05 para proteinas.

La cuantificacion sin marcaje se llevo a cabo estableciendo ventanas de 2 minutos entre las multiples carreras. La abundancia de proteinas se calculo en base a la intensidad del espectro proteico normalizado (intensidad LFQ).

Como proteinas cuantificables, se seleccionaron aquellas que fueran detectadas en al menos un 75% de las muestras dentro de al menos un grupo (ER+ o TNBC), y que contaran con, al menos, dos peptidos unicos. Solo estas proteinas fueron consideradas para analisis posteriores.

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Los datos obtenidos para las protemas, en un primer paso se transformaron (log2), y tal como esta descrito en (5), se imputaron los valores nulos. Por ultimo, estos valores de expresion se centraron (z-score) y los efectos de grupo se corrigieron usando ComBat ("Combating Batch Effects When Combining Batches of Gene Expression Microarray Data”) (6). Este software esta basado en un metodo empmco Bayesiano; corrige los efectos de grupo estandarizando la media y la varianza entre los grupos (7).

1.5. Analisis de supervivencia.

Para identificar protemas expresadas de forma diferencial entre las pacientes ER+ (71 pacientes) y las TNBC (25 pacientes) se llevo a cabo un analisis de expresion diferencial empleando SAM (Significance Analysis of Microarrays) (8) con un "False Discovery Rate” por debajo del 5% (estimation de la proportion de protemas que han podido salir como significativos al azar).

Con las protemas significativas se construyeron clusters jerarquicos usando la correlacion de Pearson y el metodo de average-linkage (metodo para calcular la distancia entre clusters; el average-linkage entre dos clusters se calcula como la distancia media entre los componentes de cada cluster). A continuation, se calculo un nivel de signification estadistico para cada protema en base a un modelo univariante (6) con el fin de identificar los genes cuya expresion estuviera significativamente relacionada con la supervivencia libre de metastasis (en ingles, "distant metastasis- free survival" DMFS) como esta descrito en (9). Brevemente, las protemas relacionadas con DMFS fueron filtradas en base a sus p-valores. Aquellas con un p- valor<0,01 se seleccionaron para desarrollar modelos de prediction de riesgo utilizando el metodo de componentes principales supervisado de E. Bair and R. Tibshirani (10). Ademas, entre las protemas seleccionadas se establecieron grupos de correlation con el fin de encontrar perfiles reducidos. La validation cruzada (Leave- one-out cross-validation) se utilizo para evaluar la precision en cuanto a la prediccion de los perfiles (cada una de las muestras a nivel individual se considera cohorte de validacion, y es sobre la que se analiza el perfil obtenido. El proceso se repite hasta que todas las muestras hayan pasado por esa etapa). Se considera a una determinada muestra como datos de validacion, y a las restantes como los datos muestrales. Esto se repite de tal manera que cada muestra se utiliza una vez como datos de validacion. Para probar la significacion estadistica y descartar que hubiese

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ocurrido por un proceso al azar, los perfiles fueron sometidos a 1.000 permutaciones aleatorias. Ademas, por el hecho de usar permutaciones, se detectaron correlaciones entre genes, evitando as^ el hecho de asumir situaciones parametricas en la distribution de genes. Esto es una ventaja sobre otras tecnicas (ANOVA, Bonferroni), las cuales asumen igualdad de varianzas y/o independencia de genes.

La eficiencia de estos modelos se evaluo por el area bajo la curva (AUC) de las curvas ROC, que consisten en una representation grafica de la sensibilidad frente a (1 - especificidad) (11). Los analisis se realizaron en el programa BRB-ArrayTools v4_2_1, desarrollado por el Dr. Richard Simon y BRB-ArrayTools Equipo de Desarrollo.

1.6. Predictores de riesgo.

Los predictores de riesgo, realizados en BRB-Array Tools, estan basados en el Compound Covariate Predictor (12), Diagonal Linear Discriminant Analysis (13), Nearest Neighbor Classification (13) y Support Vector Machines with linear kernel (14). Estan compuestos por un conjunto de genes con expresion diferencial al nivel 0,05 del random variance t-test (15) y que teman tanto datos de expresion de protemas como de genes (para la meta-validacion). El error de prediction se estimo usando leave- one-out cross-validation (LOOCV), como esta descrito en (16). Para cada conjunto de datos LOOCV se repitio todo el proceso de construction de modelos, incluyendo el proceso de selection de genes. Tambien se evaluo si la estimation de la tasa de error por validation cruzada era significativamente menor de lo que cabria esperar de prediccion aleatoria (por permutaciones). El nivel de signification es, por tanto, la proportion de las permutaciones aleatorias que dieron una tasa de error menor que la tasa de error obtenida con los datos reales. Para probar la significacion estadistica del punto de corte, se evaluo el valor p del estadistico log-rank test entre los grupos de riesgo mediante 1.000 permutaciones aleatorias.

Cuando se estudiaron posibles diferencias entre las pacientes ER+ y TNBC, ademas de las protemas, se analizaron datos de expresion de miRNAs. Se utilizo la base de datos miRWalk (version 15 de Marzo de 2013) (17) para encontrar posibles dianas de los miRNAs entre las protemas identificadas con el SAM.

1.7. Analisis ontologico.

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Al tener bases de datos tanto de expresion proteica como de expresion genica, fue necesario hacer una conversion gen-protema. Para ello, en un primer lugar se utilizo la base de datos Uniprot (
http://www.uniprot.org), cuya mision es proporcionar information a la comunidad cientifica en cuanto a lo que se refiere a secuencia y funcionalidad de la protema. Reune ademas resultados experimentales sobre cada una de las protemas.

Teniendo el nombre oficial de la protema, asi como del gen, a continuation se uso la base de datos DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery v6.7) (18, 19). Esta base proporciona un conjunto de anotaciones funcionales para conocer el significado biologico que hay detras esos genes, agrupandolos a su vez en clusters segun su funcionalidad. Ademas, permite establecer asociaciones gen-enfermedad y visualizar los genes en los mapas de las rutas de Biocarta, KEGG y Panther aportando referencias bibliograficas en las que se hace mention al gen/genes de interes.

Para el analisis ontologico en esta base de datos, se acotaron los resultados a la lista de “homo sapiens”, la categoria GOTERM-FAT y las rutas Biocarta, KEGG y Panther.

1.8. Verification ortogonal.

Se construyo una gran base de datos de expresion genica (cohorte de validation) compuesta por 1.296 pacientes con carcinomas mamarios primarios, y 32.339 valores de expresion genica, obtenida de dos trabajos publicados previamente (20, 21). Ademas, los subtipos moleculares de las pacientes se asignaron usando el algoritmo Single Sample Predictor (SSP) descrito por Hu et al. (22) y usado por Fan et al. (23).

Combinar datos de diferentes experimentos de microarrays es una gran ventaja, ya que permite trabajar con un numero mayor de muestras, dando un mayor poder estadistico a los resultados. No obstante, hay que tener cuidado con los efectos de grupo que se generan cuando las muestras son procesadas en dias o grupos diferentes, o por distinta gente. En este caso, los efectos de grupo que surgen entre las dos bases de datos se corrigieron con el software ComBat (6).

Al trabajar con datos de expresion proteica en las muestras empleadas y de expresion genica en la base de datos construida, habia que hacer la conversion protema-gen.

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Una vez hecha esta conversion, se seleccionaron todos los ensayos para los genes de interes y, en aquellos casos en los que hubiera varias entradas para un mismo gen, se selecciono aquel con mayor desviacion estandar.

En esta cohorte de validation, ademas de los datos de expresion genica, estaban disponibles los datos de supervivencia libre de enfermedad as^ como la recaida o no y su estatus de receptor de estrogenos, pero no se conoda ni el estatus de Her2, ni el de PR, ni el tratamiento recibido por las pacientes. Esto supoma un problema en cuanto a la selection de pacientes TNBC. Para conseguir una mayor precision, se seleccionaron aquellas pacientes ER- con niveles de expresion de PGR<12 y de ERBB2<11.8 como esta descrito por otros grupos (24, 25).

1.9. Analisis estadistico.

Para el analisis estadistico se utilizaron los programas BRB-ArrayTools, SPSS v16, GraphPad Prism 5.1 y R v2.15.2 (con el paquete Design 0.2.3). Todos los p-valores se consideraron estadisticamente significativos cuando eran por debajo de 0,05. Los datos de expresion se centraron y se analizaron en MeV (26) y Cytoscape (27).

2. Resultados

2.1. Analisis de proteinas “label-free”: 224 proteinas diferenciales.

Haciendo un estudio paralelo pero partiendo del mismo SAM inicial (con 1085 proteinas), se trabajo con 224 proteinas expresadas de forma diferencial entre ER+ y TNBC con un FDR<5%. Se construyo un cluster jerarquico usando la expresion de esas 224 proteinas (Figura 1). Lo que se puede observar a simple vista es que hay un grupo de pacientes que han sido diagnosticadas clmicamente como ER+ pero cuyo perfil de expresion tiene mas similitud con el grupo TNBC que con el mismo ER+. A estas pacientes ER+ con tendencia a TNBC, se les denomino en el presente trabajo como TNBC-like. Las ER+ que se mantetian como tal, recibieron el nombre de ER- true.

2.2. ER-true vs. TNBC-like.

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Para tratar de reducir el numero de protemas diferenciales entre las pacientes ER+ true y TNBC-like, se hizo de nuevo un SAM, pero en este caso solo con estos 2 grupos (dejando ya fuera a las TNBC, centrando el estudio en las ER+). Con este nuevo SAM, partiendo del total de las 1.085 protemas, 44 de ellas presentaban una expresion diferencial (Figura 2).

2.3. Evolucion clinica de las pacientes.

En base a los clusters, al identificar un nuevo posible subgrupo de pacientes, se trabajo con las muestras clasificadas como: ER+-true, TNBC-like y TNBC. Para conocer un poco mejor el comportamiento de este nuevo grupo TNBC-like, tanto a nivel clmico como a nivel molecular, se analizo el perfil de supervivencia de estos tres grupos mediante las graficas Kaplan-Meier (estimador no parametrico de la funcion de supervivencia), cuyo objetivo es estimar la probabilidad de supervivencia de un grupo de pacientes en un intervalo de tiempo definido (Figura 3). En el grupo TNBC-like, la supervivencia libre de metastasis (DMFS) a los 5 anos fue de 71,1% mientras que en las ER-true de 88% (p-valor=0.24). De nuevo lo que se puede observar es que los tumores con caracteristicas de TNBC-like no solo tienen un perfil molecular mas parecido a los tumores TNBC, sino que ademas, la evolucion clinica de estas pacientes es tambien muy parecida, siendo los grupos con peor pronostico.

2.4. Predictor TNBC-like.

El siguiente paso consistio en verificar si esa tendencia que apareda en la poblacion ensayada se podia validar en una cohorte mayor. Como no hay bases de datos de expresion proteica en grandes poblaciones, se trabajo con la base de datos de expresion genica de 1296 pacientes. Para ello, partiendo de las 44 protemas significativas del SAM (Figura 2), se hizo la conversion a genes. Durante esta conversion, se perdieron 6 protemas (en la base de datos Swissprot, 3 salian desconocidas y otras 3 sin referencias), por lo que quedaron 38. Al buscarlas en la base de datos de expresion genica, 2 de ellas no aparedan, por lo que al final, se trabajo con 36 protemas/genes.

Se diseno un predictor de clase (denominado "predictor TNBC-like”) usando la herramienta "Class Prediction” de BRB-ArrayTools a partir de la poblacion de pacientes ER+ (clasificadas por el cluster) (Figura 4). A pesar de que el p-valor no

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salia significativo (p=0.086), se ve^a de nuevo una tendencia, que se comprobo en la base de datos de validation, sobre 421 pacientes (ER+, LN+). En este caso, el p-valor fue de 0.0047, por lo que tanto el predictor como la tendencia se validaban.

Una vez validado el predictor, hatia que profundizar un poco sobre las protemas que lo compotian, por lo que se realizo un analisis ontologico (Swissprot y DAVID). Curiosamente, la mayoria de las 36 protemas estaban relacionadas con procesos de adhesion. Con esta information, el predictor TNBC-like paso a llamarse "Firma de Adhesion”.

2.5. Validacion por subtipos.

Una vez obtenido un predictor con peso, el paso siguiente fue la verification de su validacion. Para ello se cogio la cohorte de validacion con las 1296 pacientes y, en un primer lugar, se valido el predictor en toda la poblacion de pacientes ER+ con ganglios positivos (n=421). En este caso salia significativo (p=0.0047) (Figura 5).

La siguiente prueba de validacion que se llevo a cabo consistio en aplicar el predictor a cada uno de los subgrupos moleculares de pacientes por separado, es decir, en LumA (n=363), LumB (n=223), Basal (n=180), Normal (n=246) y Her2 (n=129). En este caso lo que ocurria es que solo para el subgrupo LumA (pacientes que son generalmente ER+ con buen pronostico) aparedan diferencias significativas entre ambos grupos (Figura 6).

2.6. TNBC-like vs. Mammaprint, Oncotype y 8-genes Score.

Una vez comprobado que el predictor disenado se validaba en una poblacion de pacientes, se paso a compararlo con los perfiles existentes mencionados anteriormente (Mammaprint, Oncotype y 8-gene-Score). Para ello se aplico cada test a las pacientes ER+ de la cohorte de validacion (752 pacientes).

Estos perfiles comerciales estan basados principalmente en genes de proliferacion mientras que la Firma de Adhesion aqu propuesta, como su nombre indica, lo hace en genes de adhesion. Cuando se combinaron parejas de perfiles en la poblacion de pacientes (Firma de Adhesion + Mammprint/Oncotype/8-gene) se vio que la Firma de Adhesion aportaba una informacion extra a la proporcionada por los otros (Figura 7).

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BIBLIOGRAFfA

1. Gamez-Pozo A, Sanchez-Navarro I, Calvo E, Diaz E, Miguel-Martin M, Lopez R, et al. Protein phosphorylation analysis in archival clinical cancer samples by shotgun and targeted proteomics approaches. Mol Biosyst. 2011 Aug;7(8):2368-74.

2. Gamez-Pozo A, Ferrer NI, Ciruelos E, Lopez-Vacas R, Martinez FG, Espinosa E, et al. Shotgun proteomics of archival triple-negative breast cancer samples. Proteomics Clin Appl. 2013 Apr;7(3-4):283-91.

3. Cox J, Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 2008 Dec;26(12):1367-72.

4. Cox J, Neuhauser N, Michalski A, Scheltema RA, Olsen JV, Mann M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 2011 Apr 1;10(4):1794-805.

5. Deeb SJ, D'Souza RCJ, Cox J, Schmidt-Supprian M, Mann M. Super-SILAC Allows Classification of Diffuse Large B-cell Lymphoma Subtypes by Their Protein Expression Profiles. Molecular & Cellular Proteomics. 2012 May 1, 2012;11(5):77-89.

6. Johnson WE, Li C, Rabinovic A. Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostatistics. 2007 Jan;8(1):118-27.

7. Kupfer P, Guthke R, Pohlers D, Huber R, Koczan D, Kinne RW. Batch correction of microarray data substantially improves the identification of genes differentially expressed in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. BMC Med Genomics. 2012;5:23.

8. Tusher VG, Tibshirani R, Chu G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5116-21.

9. Cox DR. Regression Models and Life-Tables. J Roy Stat Soc; 1972. p. 187220.

10. Bair E, Tibshirani R. Semi-supervised methods to predict patient survival from gene expression data. PLoS Biol. 2004 Apr;2(4):E108.

11. Mossman D, Somoza E. ROC curves, test accuracy, and the description of diagnostic tests. J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 1991 Summer;3(3):330-3.

12. Radmacher MD, McShane LM, Simon R. A paradigm for class prediction using gene expression profiles. J Comput Biol. 2002;9(3):505-11.

13. Dudoit S, Fridlyand J, Speed TP. Comparison of Discrimination Methods for the Classification of Tumors Using Gene Expression Data. Journal of the American Statistical Association. 2002 2002/03/01;97(457):77-87.

5

10

15

20

25

30

14. Ramaswamy S, Tamayo P, Rifkin R, Mukherjee S, Yeang C-H, Angelo M, et al. Multiclass cancer diagnosis using tumor gene expression signatures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001 December 18, 2001;98(26):15149-54.

15. Wright GW, Simon RM. A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments. Bioinformatics. 2003 December 12, 2003;19(18):2448-55.

16. Simon R, Radmacher MD, Dobbin K, McShane LM. Pitfalls in the Use of DNA Microarray Data for Diagnostic and Prognostic Classification. Journal of the National Cancer Institute. 2003 January 1,2003;95(1):14-8.

17. Dweep H, Sticht C, Pandey P, Gretz N. miRWalk--database: prediction of possible miRNA binding sites by "walking" the genes of three genomes. J Biomed Inform. 2011 Oct;44(5):839-47.

18. Huang da W, Sherman BT, Lempicki RA. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 2009;4(1):44-57.

19. Huang da W, Sherman BT, Lempicki RA. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 2009 Jan;37(1):1-13.

20. Guedj M, Marisa L, de Reynies A, Orsetti B, Schiappa R, Bibeau F, et al. A refined molecular taxonomy of breast cancer. Oncogene. 2012 Mar 1;31(9):1196-206.

21. Miller LD, Coffman LG, Chou JW, Black MA, Bergh J, D'Agostino R, Jr., et al. An iron regulatory gene signature predicts outcome in breast cancer. Cancer Res. 2011 Nov 1;71(21):6728-37.

22. Hu Z, Fan C, Oh DS, Marron JS, He X, Qaqish BF, et al. The molecular portraits of breast tumors are conserved across microarray platforms. BMC Genomics. 2006;7:96.

23. Fan C, Oh DS, Wessels L, Weigelt B, Nuyten DS, Nobel AB, et al. Concordance among gene-expression-based predictors for breast cancer. N Engl J Med. 2006 Aug 10;355(6):560-9.

24. Bianchini G, Iwamoto T, Qi Y, Coutant C, Shiang CY, Wang B, et al. Prognostic and therapeutic implications of distinct kinase expression patterns in different subtypes of breast cancer. Cancer Res. 2010 Nov 1;70(21):8852-62.

25. Gong Y, Yan K, Lin F, Anderson K, Sotiriou C, Andre F, et al. Determination of oestrogen-receptor status and ERBB2 status of breast carcinoma: a gene-expression profiling study. Lancet Oncol. 2007 Mar;8(3):203-11.

26. Saeed AI, Sharov V, White J, Li J, Liang W, Bhagabati N, et al. TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 2003 Feb;34(2):374-8.

27. Shannon P, Markiel A, Ozier O, Baliga NS, Wang JT, Ramage D, et al. 5 Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction

networks. Genome Res. 2003 Nov;13(11):2498-504.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Metodo para el pronostico in vitro de un sujeto que presenta un tumor, que comprende:

   a. Cuantificar, en una muestra biologica aislada que comprende celulas tumorales de dicho sujeto, la cantidad del producto de la expresion del gen THEM6, y

   b. comparar la cantidad cuantificada en la etapa (a) con un valor de referencia.
2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, donde el tumor es de mama.
3. 3. Metodo segun la reivindicacion 2, donde el tumor es HER2 negativo o positivo para la expresion de los receptores hormonales de estrogenos.
4. 4. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el valor de referencia del paso (b) se obtiene tras la cuantificacion del producto de expresion del gen de la etapa (a) en una muestra biologica aislada que comprende celulas tumorales de un individuo que presenta un tumor de mama triple negativo.
5. 5. Metodo segun la reivindicacion 4, que ademas comprende un paso (c) donde si la cantidad cuantificada en el paso (a) no presenta una desviacion significativa con respecto al valor de referencia con el que se compara en el paso (b), se asigna al sujeto al grupo de pacientes con un mal pronostico.
6. 6. Metodo segun la reivindicacion 5, donde el mal pronostico se refiere a un alto riesgo de recalda y/o de metastasis.
7. 7. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el producto de expresion del gen es mRNA o protelna.
8. 8. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la muestra biologica aislada que comprende celulas tumorales esta fijada en formalina y embebida en parafina.
9. 9. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde el sujeto es un humano.
10. 10. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el sujeto ha estado previamente sometido a una terapia antitumoral.
11. 11. Uso de un kit que comprende sondas y/o cebadores capaces de hibridar con los productos de expresion del gen THEM6, para llevar a cabo el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.