ES2552704B2 - Procedimiento para la transformación de Posidonia oceanica seca para producir bioetanol de segunda generación - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la transformación de Posidonia oceánica seca para producir bioetanol de segunda generación.#La invención se fundamenta en la aplicación de una serie de técnicas de pre-tratamiento mecánico, pre-tratamiento térmico, sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), y destilación, con el objetivo de extraer los azúcares fermentables de la matriz lignocelulósica de los depósitos de P. oceánica seca y a continuación convertirlos a bioetanol de segunda generación.#La invención permite el aprovechamiento de los depósitos de P. oceánica seca como un recurso de biomasa lignocelulósica no alimentaria, abundante y no explotada para producir bioetanol de segunda generación para afrontar el agotamiento notable de los recursos en energías fósiles.
Description
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DESCRIPCION
Procedimiento para la transformation de Posidonia oceanica seca para producir bioetanol de segunda generation.
SECTOR DE LA TECNICA.
La invention se inscribe en el marco del desarrollo de biocarburantes a partir de una biomasa lignocelulosica no alimentaria para hacer frente al agotamiento notable de los recursos en energias fosiles.
ESTADO DE LA TECNICA.
Desde la antiguedad, las plantas de Posidonia oceanica han sido empleadas por el hombre para distintos fines, tales como bio-indicador de contaminacion de las aguas, alimentacion animal, fabricacion de zapatos, construccion de techos, produccion de compost, aislamiento termico, production de papel (Boudouresque et al, 2006; Montefalcone, 2009) y adsorcion biologica en el tratamiento de aguas residuales de tintoreria (Guezguez et al, 2009). Sin embargo, hasta la fecha de hoy no ha sido empleada para producir carburante.
Posidonia oceanica es una planta marina endemica del mar mediterraneo (Gobert, 2002). Los depositos de P. oceanica cubren una superficie de entre 25000 y 50000 km2 de las costas mediterraneas (Gobert, 2002).
Los depositos de P. oceanica seca, forman una especie bancos de pelotas en las costas. Se estima que la production primaria neta de P. oceanica seca es de aproximadamente 420 g MS/m ano, pudiendo alcanzar 1300 g MS/m ano. En realidad, los depositos de P. oceanica seca constituyen uno de los ecosistemas mas productivos del planeta (Boudouresque et al., 2006). Ademas, algunas de las caracteristicas del ecosistema formado por esta planta son unicas y particulares en el medio marino y se asemejan a los ecosistemas forestales continentales en cuando a la acumulacion de la biomasa vegetal, siendo esta excepcionalmente elevada (Boudouresque et al., 2006). Las pelotas de P. oceanica poseen una
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composition lignocelulosica similar y comparable a otras plantas lignocelulosicas terrestres (Khiari et al., 2010; Ncibi et al., 2009).
Hasta la fecha, las patentes relativas a la production de bioetanol de segunda generation a partir de la biomasa lignocelulosica principalmente emplean como materia prima los siguientes sustratos:
- El bagazo de la cana de azucar (US 2010/0330638 Al. Dec.30, 2010).
- Residuos agricolas, madera dura y blanda, residuos forestales, lodos de la industria papelera, residuos solidos industriales y municipales, diferentes plantas herbaceas (paja de trigo, maiz, sorgo, cebada, arroz, y soja) (WO 2011/ 137150 Al. Nov. 03, 2011) (WO 2011/ 137147 Al. Nov.03, 2011).
- El pino, el roble y algunas plantas perennes (WO 2011/ 136616 A2. Nov. 03, 2011).
DESCRIPCION DE LA INVENCION.
La presente invention tiene como objetivo principal transformar los depositos de Posidonia oceanica seca, mediante hidrolisis termica y sacarificacion enzimatica, para extraer los azucares fermentables y asi producir bioetanol de segunda generation por fermentation alcoholica. Esta invention permite la valorization de un recurso de biomasa lignocelulosica abundante y no explotado con fines energeticos, a la vez que contribuye al desarrollo de biocarburantes de segunda generation como fuentes de energia renovable limpia.
El sector energetico podra beneficiarse de las ventajas de esta invention en cuanto al desarrollo de los biocarburantes, favoreciendo la independencia energetica frente a las energias fosiles. En efecto, el agotamiento notable de los recursos en energias fosiles y las exigencias dictadas por el desarrollo sostenible, son los principales argumentos a favor del desarrollo de esta invention.
Por otra parte, los depositos de Posidonia oceanica seca en las costas mediterraneas en general, y en Tunez en particular, constituyen una valiosa fuente
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de biomasa lignocelulosica renovable no alimentaria que esta disponible como un substrato para las biorrefinerias.
La invention, tal y como se detallara posteriormente, esta basada en la aplicacion de una serie de tecnicas de pre-tratamiento mecanico (etapa 1), pre-tratamiento teimico (etapa 2), sacarificacion y fermentation simultaneas (SSF) (etapa 3) y separation del etanol formado por destilacion (etapa 4), con el objetivo de extraer los azucares fermentables de la matriz lignocelulosica de los depositos de P. oceanica seca, y a continuation convertirlos a bioetanol de segunda generation. A continuation se describe brevemente cada etapa:
Etapa 1.- Pre-tratamiento mecanico de trituration, para reducir el tamano de las fibras a un diametro medio de particulas de 1 mm. Esta etapa tiene como objeto disminuir el grado de la polimerizacion de la celulosa y de la lignina, y aumentar la superficie de contacto, y por lo tanto, la accesibilidad de la celulosa y de la hemicelulosa a los diferentes reactivos.
Etapa 2.- Pre-tratamiento teimico realizado en atmosfera inerte en presencia de N2, a una temperatura de 150°C, una presion de 1 bar, sin utilizar un agente quimico, durante im tiempo de reaction de 30 minutos. Esta etapa tiene como objetivo la hidrolisis de la fraction hemi celulosica de la biomasa de P. oceanica y hacer que la fraction celulosica sea mas accesible a la digestion enzimatica posterior.
Etapa 3.- Sacarificacion y fermentation simultaneas (SSF) mediante el empleo de una mezcla de enzimas, con las actividades endocelulasa y exocelulasa {fi- glucosidasa) asi como las actividades xilanasas, e inoculando las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Pachysolen tannophilus ATCC 32691, para convertir los disacaridos (sacarosa) y los monosacaridos fermentables en C6 (glucosa, fructosa,...) y en C5 (principalmente xilosa) procedentes de la digestion enzimatica simultanea de la fraction celulosica del pre-tratamiento teimico.
Etapa 4.- Destilacion (separation liquida/vapor) que tiene como objetivo aumentar el contenido de etanol en el mosto obtenido.
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DESCRIPCION DEL CONTENIDO DE LAS FIGURAS
Figura 1.- Diagrama de las etapas del procedimiento de transformation de las fibras de Posidonia oceanica seca para la production de bioetanol de segunda generation.
Figura 2.- Curva relativa a la isoterma de adsortion de las fibras de Posidonia oceanica seca, permitiendo el estudio del comportamiento de estas fibras con respecto al agua, calculando la cantidad maxima de la adsorcion del agua por las fibras de P. oceanica.
Figura 3.- Evolucion del rendimiento de conversion de la celulosa en glucosa de las fibras de Posidonia oceanica al 10% en materia seca (MS) y 100 mg/g de la enzima Ctec2.
Figura 4.-Micrografias fotonicas (3X) de las fibras de Posidonia oceanica brutas (a) y trituradas (b).
Figura 5.-Micrografias Electronicas de Barrido (MEB) de las fibras de Posidonia oceanica brutas (350 X) (c) y sus poros (1500 X) (d).
MODO DE REALIZACION DE LA INVENCION
Como ya se ha comentado, los depositos de Posidonia oceanica seca constituyen uno de los ecosistemas mas productivos del planeta (Boudouresque et al., 2006). Ademas, algunas de las caracteristicas del ecosistema de P. oceanica son unicas y particulares en medio marino y se asemejan a los ecosistemas forestales continentales, en cuanto a la acumulation de la biomasa vegetal, formando una biomasa vegetal excepcionalmente elevada. La composition de las pelotas de P. oceanica seca es rica en fractiones lignocelulosicas (Khiari et al., 2010; Ncibi et al., 2009). En este contexto, esta invencion tiene por objetivo valorizar y utilizar los azucares fermentables de Posidonia oceanica seca, con el fin de producir el bioetanol de segunda generacion. El procedimiento propuesto tiene por objeto operar en las condiciones optimas y favorables para mejorar el rendimiento mediante la aplicacion de un pre-tratamiento mecanico, termico, asi como la
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sacarificacion y fermentation simultanea de la matriz lignocelulosica de P. oceanica.
El procedimiento propuesto para la transformation de los depositos de P. oceanica seca mediante la aplicacion de los pre-tratamientos mecanico y termico, as! como la sacarificacion y la fermentacion simultanea (SSF), seguida por una etapa de destilacion, esta ilustrado en el diagrama de la Figura 1.
A continuacion se detalla el procedimiento aplicado a muestras de depositos de P. oceanica seca procedente de las costas del Golfo de Tunez, y precisamente de las costas del suburbio meridional de Tunez.
Ensayo 1.- Caracterizacion fisico-quimica y estructural, y pre-tratamiento mecanico de las fibras de los depositos de Posidonia oceanica seca empleados.
La caracterizacion fisico-quimica de los depositos de P. oceanica permitio determinar la materia seca contenida en los residuos (solidos totales), la densidad de la fibra, el volumen de inflado de las fibras dentro del agua asi que la capacidad de retention del agua y del aceite. Estas caracteristicas estan recapituladas en la Tabla 1.
El pre-tratamiento mecanico empleado consistio en la trituration, mediante un molino de martillo (Leshan Dongchuan Machinery Co. Ltd, Sichuan).
El estudio estructural de las fibras lignocelulosicas crudas de la biomasa vegetal, previamente trituradas, se realizo mediante la observation microscopica fotonica y electronica de barrido, MEB. Las Figuras 4 y 5 muestran la estructura fibrosa de la P. oceanica seca. De la misma manera, las micrografias electronicas ponen en evidencia la uniformidad de la superficie porosa de las fibras de P. oceanica con un diametro de poros de 10 pm, aproximadamente.
Tabla 1: Caracteristicas fisico-quimicas de las fibras de los depositos de Posidonia oceanica seca.
- Caracteristicas fisico-quimicas
- Valores
- Materia seca (%)
- 91,999 ±0,318
- Contenido en agua (%)
- 8,000 ±0,318
- Contenido en cenizas (%)
- 11,7335 ±0,2518
- Densidad de particulas de las fibras con respecto al iso-butanol.
- 0,684 ± 0,076
- Volumen de inflado de las fibras dentro del agua (ml/g)
- 1,332 ±0,234
- Capacidad de retencion del agua (g agua/ g MS)
- 6,233 ± 1,436
- Capacidad de retencion del aceite (Aceite de girasol) (mL aceite/g MS)
- 12,611 ± 1,952
- Contenido en proteinas (%)
- 5,217 ±0,172
5 El estudio del comportamiento de las muestras de los depositos de Posidonia oceanica frente al agua se efectuo estableciendo isotermas de adsorcion del vapor de agua a 20°C. La Figura 2 ilustra el diagrama de adsorcion de las fibras de P. oceanica seca.
El diagrama de absorcion permite seguir el estado de hidratacion de las fibras de 10 P. oceanica en fimcion de la actividad del agua en el medio. El contenido maximo de agua que puede fijar las fibras de Posidonia oceanica es del orden de 34,59% (g/100 g MS).
La composicion en a-celulosa, hemicelulosa, lignina, en carbono organico total (COT), en carbono inorganico (C ing), en carbono total (C tot) y en nitrogeno 15 total (N tot) de los depositos de Posidonia oceanica seca se recogen en la Tabla 2.
Tabla 2: Composition en a-celulosa, hemicelulosa, lignina, carbono organico total (COT), carbono inorganico (C ing), carbono total (C tot) y nitrogeno total (N tot) de los depositos de Posidonia oceanica seca.
- Componente
- Valor (%)
- a-Celulosa
- 40
- Hemicelulosa
- 19
- Lignina
- 30
- COT
- 1,562 ±0,002
- C ing
- 8,215 ±0,173
- C tot
- 9,777 ±0,173
- N tot
- 1,586 ±0,084
5 Ensayo 2: Pre-tratamiento termico de los depositos de Posidonia oceanica seca.
Una vez trituradas y caracterizadas exhaustivamente, las muestras de los depositos de P. oceanica seca han sido pre-tratadas termicamente en un reactor a presion (Parr®, series 4600-4620) de un litro de volumen util, equipado de valvulas de 10 control de presion y temperatura. La regulation de la presion se hizo mediante una valvula de presion neumatica con un compresor auxiliar.
El reactor a presion utilizado en esta etapa de pre-tratamiento es de tipo ‘batch’, sin agitation. Este reactor se lleno al 10% de su capacidad total con una suspension de fibras al 3% en materia seca. Para generar un ambiente inerte 15 dentro del termo reactor se empleo nitrogeno a una presion fija de 1 bar.
Las condiciones empleadas para el pre-tratamiento termico de las fibras de los depositos de P. oceanica seca empleadas fueron: Una temperaturade 150°C y un tiempo de reaccion de 30 minutosen atmosfera inerte en presencia de nitrogeno.
El analisis de la composicion de las fibras de los depositos de P. oceanica despues 5 del pre-tratamiento termico se presenta en la Tabla 3.
Tabla 3: Analisis de la composicion de las fibras de los depositos de Posidonia oceanica seca antes y despues el pre-tratamiento termico.
- Componente
- Antes del pre-tratamiento Despues del pre-tratamiento
- Carbono total soluble (%)
- 2,489 15,25
- Xilosa (%)
- 2,670 0,672
- Glucosa (%)
- 0 8,36
- Fructosa (%)
- 0 7,73
- Sacarosa (%)
- 0 1,87
- Acidez volatil total (%)
- 0 0
- Hidroxi-metil-furfural (%)
- 0 0
- a-Celulosa (%)
- 40 79,94
- Hemicelulosa (%)
- 19 1,32
- Lignina (%)
- 30 9,67
- Cenizas (%)
- 15,01 10,46
10 El contenido en carbono total soluble (organico y inorganico) se determino mediante un equipo automatico de carbono y nitrogeno (multi N/C3100 analyzer de Analytic Jena) utilizando una fase movil de H3PO4 al 10%. El contenido en azucares se ha determinado mediante un kit enzimatico. La acidez volatil total (expresada por gramos de acido acetico por cada 100 g de muestra) ha sido 15 determinada mediante un cromatografo de gases (Shimadzu mod. GC2010). Los acidos grasos volatiles de cadena corta determinados fueron: acetico, propionico, iso-butirico, butirico, iso-valerico, valerico, iso-caproico, caproico y heptanoico. El contenido en hidroxi-metil-furfural (HMF) se determino igualmente por cromatografia gaseosa.
Ensayo 3: Sacarificacion enzimatica de los depositos de Posidonia oceanica pre-tratados
A continuation del pre-tratamiento mecanico y termico, se realizo un estudio de la sacarificacion enzimatica de las fibras de P. oceanica pre-tratadas. Esta hidrolisis 5 enzimatica se realizo preparando suspensiones de fibras de P. oceanica al 10% en materia seca con una concentration de la enzima comercial Cellic®Cetc2 de lOOmg/g, diluida 10 veces a un pH de 4,8 y a una temperatura de 50 ± 1°C mediante microincubadores con una velocidad de agitation de 150 rpm. La duration de la sacarificacion enzimatica fue de 72 horas.
10 La Cellic®Cetc2 es una preparation enzimatica de la empresa Novo Nordisk, con una concentration en proteinas total es de 217g/L, una actividad de papel filtro de 120,5 FPU/mL y una actividad P-glucosidasa de 2731 U/mL.
El analisis de los azucares por cromatografia gaseosa permitio estudiar los rendimientos de conversion de la sacarificacion enzimatica, igualmente, el 15 contenido en glucosa ha sido determinado con una tecnica enzimatica. Asi, la Figura 3 muestra con detalles la generation de monomeros durante la sacarificacion enzimatica de las fibras de P. oceanica pre-tratadas.
Con este ensayo de sacarificacion se alcanzo un rendimiento de conversion de celulosa a glucosa de 3,553 ± 0,005%.
20 La composition en azucares de las fracciones liquidas de la materia hidrolizada realizada mediante cromatografia gaseosa se presenta en la Tabla 4.
Tabla 4: Composition en azucares liberados durante la sacarificacion enzimatica de las libras pre-tratadas de Posidonia oceanica, determinadas mediante cromatografia gaseosa.
Hidrolisis de Posidonia oceanica al 10% en materia seca y 100 mg/g de enzima
Patrdn 24 h 0,15 0,003
Mue$tra48h 7,476 2,147
*Los contenidos en azucares estan expresados en g/L. Las concentraciones estan 5 determinadas despues de 72 horas de hidrolisis.
Ensayo 4: Sacarificacion y fermentation simultaneas (SSF) de las fibras de depositos de Posidonia oceanica pre-tratadas utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae y la enzima Cellic®Cetc2.
10 El objetivo perseguido para realizar la sacarificacion y fermentacion simulaneas (SSF) fue mejorar la eficacia del procedimiento, particularmente con respecto a la variable tiempo de reaccion y de la concentracion final en etanol. Para ello, se preparo una suspension de fibras de P. oceanica al 12% en materia seca preparada con el tampon acetato de sodio a 50 Mm a un pH 4,82 con el 3% de
15 una disolucion de cloranfenicol al 0,2% preparada en el tampon acetato para evitar las contaminaciones bacterianas durante la reaccion y no afectar la concentracion final en etanol.
Del mismo modo, se anadio al medio de la SSF una suspension de la enzima Cellic®Cetc2 a 100 mg/g, diluida 10 veces a razon de 0,70 v/v con respecto al
20 volumen total de la reaccion. Por otra parte, el medio de la reaccion se inoculo al 10% con la levadura S. cerevisiae procedente de un medio de cultivo liquido sintetico de 20 g/L de azucares a pH de 4,82 cuya composition es la siguiente: extracto de levadura (4,00 g/L), peptona de caseina (3,60 g/L), (NH^SC^ (3,00
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g/L), MgS04 7H20 (2,05 g/L),; KH2P04 (2,00 g/L), xilosa (5 g/L), glucosa (10 g/L), ffuctosa (2,5 g/L) y sacarosa (2,5 g/L). Para favorecer el crecimiento de S. cerevisiae durante la SSF, se anadio un medio de cultivo liquido sintetico concentrado 25 veces con una concentracion de 0,025 v/v con respecto al volumen total. La composicion de este medio de cultivo consta de extracto de levadura (50g/L), peptona de caseina (45 g/L), (NH4)2S04 (37,5 g/L), MgS04 7H20 (25,625 g/L), KH2P04 (25 g/L). El medio se ajusta a un pH de 4,82.
La SSF se desarrollo en un micro-incubador operando a una temperatura de 35 ± 1°C, con agitacion fija a 150 rpm durante 120 horas (5 dlas).
La production de etanol obtenida al final del proceso de SSF se analizo mediante cromatografia gaseosa, y un kit enzimatico (Boehringer Mannhein, Ref. 716251) adaptado que permite calcular el rendimiento final de la conversion de glucosa al etanol. El rendimiento obtenido fue proximo al 22% con respecto al rendimiento de la conversion teorica. La concentracion final obtenida en etanol fue de 0,2 g/L.
Ensayo 5: Sacarificacion y fermentation simultaneas (SSF) de las fibras de los depositos de Posidonia oceanica pre-tratadas con un cultivo de las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Pachysolen tannophilus ATCC 32691, y la enzima Cellic®Cetc2
En este ensayo se probo la posibilidad de convertir a la vez los diferentes azucares en C6 (glucosa y fructosa) y en C5 (xilosa), asi como los disacaridos (sacarosa) producidos durante la digestion enzimatica. Este objetivo se alcanzo mediante el empleo de un cultivo mixto de dos levaduras: Saccharomyces cerevisiae y Pachysolen tannophilus ATCC 32691 durante la SSF.
Con el fin de lograr este objetivo, se elaboro un protocolo experimental del establecimiento de la SSF similar al empleado en el ensayo 4, sobre el que se aplicaron las modificaciones siguientes: la inoculacion se realizo al 10% con un cultivo mixto de las dos levaduras en proporciones del 47% y 53% de P. tannophilus y S. cerevisiae, respectivamente.
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La concentration final de etanol producido se determino por cromatografia gaseosa (GC) y con el kit enzimatico adaptado, esta concentration fue del orden de 0,2 g/L.
Ensayo 6: Destilacion
El objetivo de esta ultima etapa de destilacion es aumentar la concentration de etanol en el producto final de la fermentation. La etapa de destilacion simple consta de una separation liquido-vapor de los componentes de la mezcla obtenida en la etapa anterior mediante una sucesion de vaporization y condensation llevando la mezcla a ebullition (o vaporization) del etanol, cuyo punto de ebullition a una atmosfera es 78,2 °C.
APLICACION INDUSTRIAL
Los sectores industriales que pueden beneficiarse de esta invention son:
- Las empresas que operan en el campo de los biocarburantes, las energias renovables o altemativas, las empresas biotecnologicas.
- Las empresas de combustibles fosiles que desean desarrollar la nueva rama de las nuevas energias.
- Todas las industrias que tratan residuos ricos en lignocelulosas, celulosa (industria del papel), y polisacaridos (industria del almidon).
- Cualquier empresa de servicio de recogida de residuos agricolas y marinos (especialmente las macroalgas marinas, las plantas marinas halofitas que acumulan la sal marina y que constituyen una biomasa lignocelulosica marina), etc....
Claims (7)
- 51015202530REIVINDICACIONES1. Procedimiento para la transformation de Posidonia oceanica seca para produtir bioetanol de segunda generation, que comprende la realization de las siguientes etapas:a) Pre-tratamiento mecanico de trituration de las fibras, para reducir su tamano a un diametro medio de particulas menor o igual a 1 mm.b) Pre-tratamiento termico realizado en atmosfera inerte en presencia de nitrogeno (N2), a una temperatura de 150°C, una presion de 1 bar, sin utilizar un agente quimico, durante un tiempo de reaccion de 30 minutos.c) Sacarificacion y fermentation simultanea (SSF) mediante el empleo de una mezcla enzimatica, con las actividades endocelulasa y exocelulasa (y9-glucosidasa) asi como las actividades xilanasas, e inoculando el medio de reaccion con las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Pachysolen tannophilus ATCC 32691, para convertir los disacaridos (sacarosa) y los monosacaridos fermentables en C6 (glucosa, fructosa,...) y en C5 (principalmente xilosa) procedentes de la digestion enzimatica simultanea de la fraction celulosica del pre- tratamiento termico.d) Destilacion (separation liquida/vapor) para aumentar el contenido en alcohol del mosto obtenido.
- 2. Procedimiento para la transformation de P. oceanica seca para producir bioetanol de segunda generation, segun la revindication 1, caracterizado por el pre-tratamiento termico realizado en un reactor a presion, tipo ‘batch’ sin agitation, lleno al 10% de su capacidad total con una suspension de fibras al 3% en materia seca, con las siguientes condiciones de funcionamiento: presion de 1 bar, 150°C de temperatura y un tiempo de reaccion de 30 minutos en atmosfera inerte en presencia de nitrogeno.51015202530
- 3. Procedimiento para la transformation de P. oceanica seca para produtir bioetanol de segunda generation, segun la revindication 1, caracterizado por la utilization de una concentration del 12% en materia seca de las fibras de P. oceanica empleada en la etapa de sacarificacion y fermentation simultanea con el tampon acetato de sodio a 50 Mm, a un pH 4,82, con el 3% de disolucion de cloranfenicol al 0,2% preparada en el tampon acetato.
- 4. Procedimiento para la transformation de P. oceanica seca para producir bioetanol de segunda generation, segun las reivindicaciones 1 y 3, caracterizado por la adicion de una suspension de la enzima Cellic®Cetc2 a 100 mg/g , diluida 10 veces a razon de 0,70 v/v con respecto al volumen total de la reaction en la etapa de sacarificacion y fermentation simultanea, a las fibras de P. oceanica seca.
- 5. Procedimiento para la transformation de P. oceanica seca para producir bioetanol de segunda generation, segun las reivindicaciones 1, 3 y 4, caracterizado por la inoculation al 10% del medio de la reaction con un cultivo mixto de dos levaduras en proporciones del 47% y 53%, respectivamente, de Pachysolen tannophilus ATCC 32691 y Saccharomyces cerevisiae a pH de 4,82.
- 6. Procedimiento para la transformation de P. oceanica seca para producir bioetanol de segunda generation, segun la revindication 5, caracterizado porque la composition del medio de cultivo liquido sintetico que contiene las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Pachysolen tannophilus ATCC 32691 es extracto de levadura (4,00 g/L), peptona de caseina (3,60 g/L), (NH4)2S04 (3,00 g/L), MgS04 7H20 (2,05 g/L), KH2P04 (2,00 g/L), xilosa (5 g/L), glucosa (10 g/L), fructosa (2,5 g/L), y sacarosa (2,5 g/L).
- 7. Procedimiento para la transformation de P. oceanica seca para producir bioetanol de segunda generacion, segun la revindication 6, caracterizado porque para favorecer el crecimiento de las levaduras S. cerevisiae y P. tannophilus durante la SSF, se afiade un medio de cultivo liquido sintetico 5 concentrado 25 veces con una concentration de 0,025 v/v con respecto alvolumen total, con la siguiente composition: extracto de levadura (50g/L), peptona de caseina (45 g/L), (NH4)2S04 (37,5 g/L), MgS04 7H20 (25,625 g/L), KH2P04 (25 g/L). El medio se ajusta a un pH de 4,82.10 8. Procedimiento para la transformacion de P. oceanica seca para producirbioetanol de segunda generacion, segun las reivindicaciones de 1 a 7, caracterizado porque la etapa de sacarificacion y fermentation simultanea se realiza en un micro-incubador operando a una temperatura de 35 ± 1°C, con agitation fija a 150 rpm durante 120 horas (5 dias).
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