ES2547875T3

ES2547875T3 - Procedimiento de preparación de tejidos biológicos para prótesis biológicas

Info

Publication number: ES2547875T3
Application number: ES11167695.3T
Authority: ES
Inventors: Marina Strasly; Giovanni Rolando
Original assignee: Sorin Group Italia SRL
Current assignee: Sorin Group Italia SRL
Priority date: 2010-06-09
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2015-10-09
Anticipated expiration: 2031-05-26
Also published as: US20110306123A1; CA2742467A1; ITTO20100487A1; US20140370599A1; US8822219B2; US9457130B2; CA2742467C; IT1400545B1; US20160095957A1; EP2394673B1; EP2394673A1

Abstract

Procedimiento de tratamiento de un tejido biológico para prótesis biológicas, comprendiendo dicho procedimiento las etapas: -fijación del tejido biológico mediante un tratamiento con una solución de fijación que contiene glutaral- dehído; -eliminación de los fosfolípidos procedentes del tejido biológico mediante un tratamiento con una solución de eliminación que contiene 1,2-octanodiol y etanol; -desintoxicación mediante un tratamiento con una solución desintoxicante que contiene taurina o ácido homocistéico a una temperatura por encima de la temperatura ambiente, preferiblemente por encima de 30ºC, en el que la etapa de eliminación de los fosfolípidos se lleva a cabo antes de dicha etapa de fijación.

Description

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A continuación, cada pieza se transfirió a una solución obtenida mezclando 8 gr de Na2SO3 y 30 ml de ácido clorhídrico al 37%, llevada a un litro con agua desmineralizada. Las piezas permanecieron sumergidas en esta solución de lavado durante 10 minutos, con agitación suave.

A continuación, se realizaron 2 lavados sucesivos durante 10 minutos, con agitación suave, en solución de lavado de etanol ácido, compuesto por 700 ml de etanol y 30 ml de ácido clorhídrico al 37%, llevada a un litro con agua desmineralizada.

Los lavados eliminaron el tinte no específicamente unido al tejido. En cada cambio, se usaron aproximadamente 20 ml de solución de lavado.

Al final, las piezas se transfirieron a tampón de fosfato a pH 7 y se fotografiaron para documentar las diferencias en el teñido.

Espectroscopia de reflectancia

Las muestras teñidas se sometieron a espectroscopia de reflectancia para evaluar semicuantitativamente las diferentes características cromáticas al teñido con fucsina.

La espectroscopia de reflectancia es una técnica para investigación óptica basada en la medición del factor de reflectancia espectral de la superficie de una muestra como una función de la longitud de onda de la radiación incidente. El parámetro de reflectancia se expresa como la relación de la intensidad de la radiación reflejada y la radiación incidente, en función de la longitud de onda.

Las mediciones de reflectancia se llevaron a cabo a una longitud de onda de 570 nm mediante un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 35, con un integrador esférico.

En una escala de valores, un valor de reflectancia inferior indica un teñido de la muestra más intenso y, al contrario, un valor de reflectancia superior indica una intensidad de teñido débil.

Determinación del contenido en fosfolípidos del tejido

Los inventores presentes han medido la concentración de fosfolípidos en los tejidos biológicos mediante un procedimiento espectrofotométrico para demostrar:

-la eficacia del tratamiento del tejido con una solución que contiene 1,2-octanodiol y etanol, y

-que la etapa de fijación y desintoxicación llevada a cabo de manera sucesiva al tratamiento del tejido con una solución que contiene 1,2-octanodiol y etanol no interfiere sobre el contenido en fosfolípidos del tejido.

A este fin, los análisis cuantitativos se llevaron a cabo sobre muestras tratadas como sigue:

-una primera muestra de control fijada y no desintoxicada (Figura 3A);

-una segunda muestra fijada y desintoxicada con una solución que contiene ácido homocistéico a 40ºC (Figura 3B);

-una tercera muestra sometida a tratamiento para eliminar los fosfolípidos, fijada y desintoxicada con una solución que contienen ácido homocistéico a 40ºC (Figura 3C).

Para la determinación espectrofotométrica del contenido en fosfolípidos, se recuperó una pieza de 300 mg procedente de cada tejido tratado. Cada pieza se sometió a numerosos lavados en solución salina sin iones fosfato, para eliminar todo el tampón de fosfato residual. A continuación, las piezas se retiraron de la solución salina y se secaron con papel de filtro para eliminar el exceso de solución salina. A continuación, las piezas se pesaron y trituraron. Cada pieza pulverizada de este modo se extrajo en una solución caliente de etanol/éter etílico, 3/1. A continuación, el extracto se secó.

Los extractos se sometieron a un tratamiento de digestión ácido realizado mediante la adición de 650 ml de ácido perclórico al 60% a cada muestra durante 30 minutos a 160ºC. Esta etapa transforma el fósforo presente en el fosfato inorgánico que será determinado espetrofotométricamente. Al final de los 30 minutos, las muestras se dejaron enfriar y se mezclaron con una solución constituida por 3,3 ml de agua destilada. 500 ul de una solución que contenía ácido ascórbico al 10% en agua destilada, 500 ul de molibdato amónico al 1% en agua destilada. Las muestras se llevaron a 100ºC durante 5 minutos y se centrifugaron. A continuación, se leyó la absorbancia de los sobrenadantes a 820 nm. La concentración de fosfato se dedujo a partir de una curva patrón construida usando una solución de concentración de fosfato inorgánico conocida, como un patrón. El fosfato determinado los extractos es proporcional a la concentración en fosfolípidos de las muestras.

Determinación de la temperatura de contracción

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La temperatura de contracción es un índice del nivel de reticulación del tejido fijado y se determinó sobre discos de pericardio de aproximadamente 5 mm de diámetro, usando un calorímetro de escaneado diferencial (DSC) Q100 TA Instruments con los parámetros siguientes:

-flujo de nitrógeno de 50 ml/min,

-rampa de calentamiento de 5ºC/min,

-intervalo de temperatura 65ºC a 95ºC.

Resultados

Desintoxicación

La eficacia del procedimiento descrito en la presente invención y, en consecuencia, la reacción que tiene lugar entre los grupos amino de la molécula de desintoxicación y los grupos aldehído sobre el tejido fijado, se demostró mediante teñido con fucsina de los grupos aldehído que permanecían libres; un teñido más intenso indica numerosos grupos aldehído libres y, por el contrario, un teñido más débil o su ausencia indica pocos o ningún grupo aldehído libre, sobre el tejido desintoxicado.

Como se ha demostrado mediante la variación en la intensidad de teñido de los tejidos mostrada en la Figura 1, el incremento de temperatura incrementa la eficacia del tratamiento de desintoxicación. Una muestra desintoxicada a 40ºC con taurina, muestra E, tiene un teñido mucho más débil con respecto a una muestra de control, muestra A, y con respecto a una muestra desintoxicada con taurina a temperatura ambiente, muestra C.

De la misma manera, se llevó a cabo el tratamiento de desintoxicación con ácido homocistéico a 40ºC dando como resultado una intensidad de teñido débil, muestra D, con respecto a la muestra de control A, y con respecto a la muestra tratada con ácido homocistéico a temperatura ambiente, muestra B.

Por ello, estos resultados demuestran la superior eficacia del tratamiento de desintoxicación llevado a cabo a una temperatura superior a la temperatura ambiente, preferiblemente superior a 30ºC usando tanto taurina como ácido homocistéico.

Esta observación se confirmó mediante el análisis espectrofotométrico de reflectancia de las muestras. La reflectancia de cada muestra depende de la intensidad del teñido y es posible asociar un valor de porcentaje de reflectancia a cada muestra mediante el análisis espectroscópico de reflectancia.

Un valor de reflectancia superior está asociado con una intensidad de teñido inferior y viceversa, un valor de reflectancia inferior está asociado con una intensidad de teñido superior.

Como puede apreciarse de los resultados presentados en la Tabla 1, la reflectancia, analizada a una longitud de onda de 570 nm y expresada como un porcentaje, muestra un valor de 5,8 para la muestra no desintoxicada mostrada en la Figura 1A y valores superiores, 9 y 13, para muestras desintoxicadas con ácido homocistéico y taurina, respectivamente, a temperatura ambiente, mostradas en las Figuras 1B y 1C. Decididamente, se observaron valores superiores para muestras desintoxicadas con soluciones que contenían ácido homocistéico o taurina a 40ºC, tal como se observa en las muestras de las Figuras 1D y 1E.

Tabla 1

Muestra: Teñido observado % de reflectancia a 570 nm

A -fijada, no desintoxicada: Púrpura muy intenso 5,8

B – fijada, ácido homocistéico a temperatura ambiente: Violeta 9

C – fijada, taurina a temperatura ambiente: Violeta pálido 13

D – fijada, ácido homocistéico a 40ºC: Rosa obscuro 15

E – fijada, taurina a 40ºC: Rosa 19

Estos resultados confirman que el tratamiento con taurina p ácido homocistéico a 40ºC es más eficaz que los tratamientos respectivos llevados a cabo a temperatura ambiente para la neutralización de los grupos aldehído libres sobre el tejido fijado.

Igualmente, se demostró que la etapa de eliminación de los fosfolípidos que precede a las etapas de fijación y desintoxicación del tejido, potencia la eficacia de la taurina o del ácido homocistéico en la neutralización de los grupos

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aldehídos que permanecen libres en el tejido fijado cuando la desintoxicación se lleva a cabo a temperatura ambiente. La Figura 2 muestra que la intensidad de teñido de las muestras desintoxicadas con ácido homocistéico a temperatura ambiente, muestra C, después de tratamiento con 1,2-octanodiol y etanol, es decididamente inferior que la intensidad de teñido de la muestra desintoxicada con ácido homocistéico a temperatura ambiente, muestra B, sin el tratamiento previo con la solución que contiene 1,2-octanodiol y etanol para eliminar los fosfolípidos.

Se obtuvieron incluso mejores resultados cuando la etapa de eliminación de los fosfolípidos precede a la etapa de desintoxicación llevada a cabo a 40ºC, muestra E, sometida a tratamiento de extracción de los fosfolípidos y desintoxicada con ácido homocistéico a 40ºC, muestra un mejor resultado con respecto a la muestra D desintoxicada con ácido homocistéico a 40ºC, pero no sometida al tratamiento con 1,2-octanodiol y etanol.

La intensidad de teñido de dichas muestras es decididamente menos intensa que la intensidad de teñido de muestras de control no desintoxicadas, muestra A.

Los resultados del análisis espectroscópico de reflectancia para las muestras mostradas en la Figura 2 se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

Muestra: Teñido observado % de reflectancia a 570 nm

A -fijada, no desintoxicada: Púrpura muy intenso 5,8

B – fijada, ácido homocistéico a temperatura ambiente: Violeta 9

C – eliminación de fosfolípidos, fijada, ácido homocistéico a temperatura ambiente: Violeta claro 14

D – fijada, ácido homocistéico a 40ºC: Rosa obscuro 16

E – eliminación de fosfolípidos, fijada, ácido homocistéico a 40ºC: Rosa pálido/incoloro 22

Se obtuvieron Incluso mejores resultados cuando la etapa de desintoxicación se llevó a cabo con taurina, siendo esta más eficaz que el ácido homocistéico para la neutralización de los grupos aldehídos libres previamente a temperatura ambiente, incluso sin la etapa de eliminación de los fosfolípidos, tal como se muestra en la Figura 1.

Contenido en fosfolípidos

El histograma en la Figura 3 muestra que el contenido en fosfolípidos es significativamente inferior en muestras de tejido que se sumergieron en una solución que contenía 1,2-octanodiol y etanol, muestra C, con respecto a una muestra de control no tratada con la misma solución, muestra A.

Además, puede observarse que el contenido en fosfolípidos no está influenciado por la etapa de desintoxicación con ácido homocistéico a 40ºC sola, muestra B.

Temperatura de contracción

Con el fin de verificar que el tratamiento para la eliminación de los fosfolípidos y el tratamiento de desintoxicación no altera la reticulación de los tejidos biológicos obtenidos mediante su tratamiento con una solución que contiene glutaraldehído, las temperaturas de contracción para los tejidos tratados se compararon con las temperaturas de contracción de un tejido de control fijado y no tratado.

Las temperaturas de contracción de los tejidos fijados y tratados con taurina o ácido homocistéico, ambos a temperatura ambiente y a temperaturas superiores, son indistinguibles de la temperatura de contracción de los tejidos fijados y no desintoxicados, siendo dicha temperatura a 85-86ºC.

Por tanto, los tratamientos de desintoxicación no tienen efectos significativos sobre el nivel de reticulación del tejido.

Realmente, cuando los tejidos son sometidos a la etapa de eliminación de los fosfolípidos, fijados y, a continuación, tratados con soluciones que contienen taurina o ácido homocistéico, se observa un pequeño incremento en la temperatura de contracción. Por tanto, este resultado demuestra que el tejido sometido a la etapa de eliminación de los fosfolípidos, fijados y, a continuación, desintoxicados, tiene mejor reticulación.

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Claims

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