ES2540912T3 - Pharmaceutical composition and neoangiogenesis / revascularization method useful in the treatment of ischemic heart disease - Google Patents
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Abstract
Uso de un compuesto aislado de fórmula (I) en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad cardíaca coronaria o infarto cardíaco en un sujeto mamífero.**Fórmula**Use of an isolated compound of formula (I) in the manufacture of a medicament for treating coronary heart disease or heart attack in a mammalian subject. ** Formula **
Description
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DESCRIPCIÓN DESCRIPTION
Composición farmacéutica y método de neoangiogénesis/revascularización útiles en el tratamiento de enfermedades cardíacas isquémicas Pharmaceutical composition and neoangiogenesis / revascularization method useful in the treatment of ischemic heart disease
Campo de la técnica Technical field
Esta invención se refiere a una composición farmacéutica en relación con su uso en un método para tratar enfermedades cardíacas isquémicas. Particularmente, se refiere a una composición farmacéutica y un método para el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos que aportan oxígeno y nutrientes a tejidos cardiovasculares infartados a lo largo de toda la zona infartada y para prevenir la apoptosis de cardiomiocitos en episodios isquémicos. This invention relates to a pharmaceutical composition in relation to its use in a method for treating ischemic heart diseases. Particularly, it refers to a pharmaceutical composition and a method for the growth of new blood vessels that provide oxygen and nutrients to infarcted cardiovascular tissues throughout the entire infarcted area and to prevent cardiomyocyte apoptosis in ischemic episodes.
Antecedentes de la invención Background of the invention
Las enfermedades cardíacas isquémicas, que incluyen la enfermedad cardíaca coronaria y el infarto cardíaco, son enfermedades debidas a un insuficiente aporte de sangre coronaria o a una interrupción del flujo sanguíneo a una parte del corazón, causando daños o muerte de células musculares cardíacas. Esta es la causa más destacada de muerte para hombres y mujeres de todo el mundo. Por ejemplo, alrededor de 1,5 millones de americanos sufren un ataque cardíaco cada año (que es alrededor de un ataque cardíaco cada 20 segundos) y millones sufren de enfermedades cardíacas isquémicas. Ischemic heart diseases, which include coronary heart disease and heart attack, are diseases due to an insufficient supply of coronary blood or a disruption of blood flow to a part of the heart, causing damage or death of heart muscle cells. This is the leading cause of death for men and women around the world. For example, about 1.5 million Americans suffer a heart attack each year (which is about a heart attack every 20 seconds) and millions suffer from ischemic heart disease.
Durante el proceso de remodelación post infarto, la neoangiogéneis/revascularización de los tejidos cardíacos infartados es insuficiente para mantener el ritmo de crecimiento tisular requerido para la compensación contráctil y es incapaz de soportar las mayores demandas del miocardio hipertrofiado, pero viable, especialmente el miocardio a lo largo de la zona limítrofe del infarto-cardiomiocitos en riesgo. La falta relativa de oxígeno y nutrientes a los miocitos hipertrofiados puede ser un importante factor etiológico en la muerte en otra forma viable del miocardio, que da como resultado una progresiva extensión del infarto y reemplazamiento fibroso. Por lo tanto, aparentemente la forma más directa para rescatar del riesgo a los miocitos cardíacos es establecer un nuevo aporte de flujo sanguíneo, en una etapa temprana que permitiera distribuir en la zona infartada células del sistema circulatorio, nutrientes y factores de crecimiento, además de la oxigenación. La restauración de la circulación sanguínea coronaria mediante una angiogénesis rápida debería ofrecer una modalidad terapéutica efectiva y directa a las enfermedades cardíacas isquémicas. During the post-infarction remodeling process, neoangiogenesis / revascularization of infarcted heart tissues is insufficient to maintain the rate of tissue growth required for contractile compensation and is unable to withstand the increased demands of the hypertrophied, but viable myocardium, especially along the border zone of the heart attack-cardiomyocytes at risk. The relative lack of oxygen and nutrients to hypertrophied myocytes can be an important etiological factor in death in another viable form of myocardium, which results in a progressive extension of the infarction and fibrous replacement. Therefore, apparently the most direct way to rescue cardiac myocytes from risk is to establish a new blood flow contribution, at an early stage that would allow circulating circulatory system cells, nutrients and growth factors, in addition to oxygenation The restoration of coronary blood circulation by rapid angiogenesis should offer an effective and direct therapeutic modality to ischemic heart disease.
Aunque la angiogénesis terapéutica se ha estudiado intensamente como una alternativa del tratamiento para enfermedades vasculares isquémicas utilizando factores de crecimiento tales como VEGF, aFGF, bFGF o PDGF, estos factores tardan semanas en actuar 1-6, mientras que la necrosis miocárdica debida a la oclusión coronaria ocurre muy rápidamente en cuestión de horas 5,7,8. La consecuencia es que el tejido fibroso crece rápidamente a pesar de la condición isquémica, lo que reemplaza los tejidos cardíacos infartados y deja una pequeña capacidad para cualquier regeneración nueva del miocito reemplazado. Hasta ahora, no hay ningún fármaco ni método terapéutico disponibles que puedan promover la reconstitución temprana de la circulación coronaria dañada con vasos sanguíneos recién formados. Although therapeutic angiogenesis has been intensively studied as an alternative treatment for ischemic vascular diseases using growth factors such as VEGF, aFGF, bFGF or PDGF, these factors take weeks to act 1-6, while myocardial necrosis due to occlusion Coronary artery occurs very quickly in a matter of 5,7,8 hours. The consequence is that the fibrous tissue grows rapidly despite the ischemic condition, which replaces the infarcted heart tissues and leaves a small capacity for any new regeneration of the replaced myocyte. Until now, there is no drug or therapeutic method available that can promote early reconstitution of damaged coronary circulation with newly formed blood vessels.
Por lo tanto, para aprovechar el valor terapéutico de la angiogénesis en la lucha contra las enfermedades cardíacas isquémicas, hay una necesidad de componentes químicos que posean propiedades biológicas que puedan promover suficientemente el crecimiento temprano de nuevos vasos sanguíneos en la zona infartada para restaurar rápidamente la circulación sanguínea coronaria una vez que ocurre un acontecimiento isquémico. Therefore, to take advantage of the therapeutic value of angiogenesis in the fight against ischemic heart disease, there is a need for chemical components that possess biological properties that can sufficiently promote the early growth of new blood vessels in the infarcted area to quickly restore the coronary blood circulation once an ischemic event occurs.
La solicitud PCT WO 03/043645 se refiere a un extracto orgánico de Geum Japonicum Thunb, que comprende una mezcla de varios taninos hidrolizables (tales como Gemin A, B, C, D, E y F), entre otros, para tratar los músculos cardíacos infartados e isquémicos por estimulación de la angiogénesis y regeneración miocárdica en una etapa temprana del proceso de recuperación del tejido dañado. PCT application WO 03/043645 refers to an organic extract of Geum Japonicum Thunb, which comprises a mixture of several hydrolysable tannins (such as Gemin A, B, C, D, E and F), among others, to treat muscles cardiac infarcted and ischemic by stimulation of angiogenesis and myocardial regeneration at an early stage of the recovery process of damaged tissue.
La solicitud WO 2004/052381 se refiere a un extracto orgánico de una variante de Geum Japonicum Thunb, que comprende una mezcla de varios taninos hidrolizables (tales como Gemin A, B, C, D, E y F), entre otros, para tratar el tejido dañado o isquémico (por ejemplo, después de un daño muscular o cutáneo y fractura ósea). Application WO 2004/052381 refers to an organic extract of a variant of Geum Japonicum Thunb, which comprises a mixture of several hydrolysable tannins (such as Gemin A, B, C, D, E and F), among others, to treat damaged or ischemic tissue (for example, after muscle or skin damage and bone fracture).
Compendio de la invención Compendium of the invention
Es un objeto de la presente invención, es proporcionar una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades cardíacas isquémicas, que comprende un compuesto aislado de fórmula (I). El compuesto de fórmula It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the treatment of ischemic heart diseases, which comprises an isolated compound of formula (I). The compound of formula
(I) muestra efectos terapéuticos beneficiosos potentes en el tratamiento de enfermedades cardíacas isquémicas por estimulación de la angiogénesis y protección contra la apoptosis endotelial, dando como resultado una revascularización en el miocardio infartado y la prevención de la muerte isquémica de más cardiomiocitos. Dicho compuesto se refiere aquí en lo sucesivo como “Ga”. El compuesto es conocido en la técnica pero nunca se ha conocido que poseyera las actividades biológicas y efectos terapéuticos aquí mencionados. De hecho, los taninos, que pertenecen a Ga, son convencionalmente revisados como ingredientes no activos y en el proceso de identificación de los ingredientes activos en fitoterapia los investigadores desechan rutinariamente los taninos como (I) shows powerful beneficial therapeutic effects in the treatment of ischemic heart disease by stimulation of angiogenesis and protection against endothelial apoptosis, resulting in revascularization in the infarcted myocardium and the prevention of ischemic death of more cardiomyocytes. Said compound is referred to hereinafter as "Ga". The compound is known in the art but it has never been known to possess the biological activities and therapeutic effects mentioned herein. In fact, tannins, which belong to Ga, are conventionally reviewed as non-active ingredients and in the process of identifying active ingredients in phytotherapy researchers routinely discard tannins as
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residuos. Ga se puede aislar de materiales naturales, particularmente de plantas, o pueden obtenerse a través de síntesis química total o semi, con las técnicas sintéticas existentes o desarrolladas en el futuro. waste. Ga can be isolated from natural materials, particularly from plants, or they can be obtained through total or semi chemical synthesis, with synthetic techniques existing or developed in the future.
El compuesto troncal de fórmula I (también referido como Ga en esta solicitud) puede tener sustituyentes en varias posiciones y conservar actividades biológicas similares a las del compuesto troncal Ga. Un sustituyente es un átomo The trunk compound of formula I (also referred to as Ga in this application) may have substituents in various positions and retain biological activities similar to those of the backbone compound Ga. A substituent is an atom
o grupo de átomos sustituidos en lugar del átomo de hidrógeno. La sustitución se puede obtener por métodos conocidos en el campo de la química orgánica. or group of substituted atoms instead of the hydrogen atom. The substitution can be obtained by methods known in the field of organic chemistry.
Una persona con conocimiento ordinario en la técnica considerará, que el compuesto troncal de arriba o su variante sustituida se puede hacer en varias, formas posibles isómeras racémicas, diasteroisoméras o enantiómeras, pueden formar sales con minerales ácidos y orgánicos, y pueden también formar derivados tales como N-óxidos, profármacos, bioisósteros. “Profármaco¨ significa una forma inactiva del compuesto debido al acoplamiento de uno o más grupos protectores especializados utilizados de una manera transitoria para alterar o eliminar propiedades indeseables en la molécula madre, que es metabolizada o convertida en el compuesto activo dentro del cuerpo (en vivo) una vez administrado. “Bioisóstero¨ significa un compuesto que resulta del cambio de un átomo o de un grupo de átomos con otro, átomo o grupo de átomos, ampliamente similar. El objeto de un reemplazamiento bioisostérico es crear un nuevo compuesto con propiedades biológicas similares a las del compuesto madre. El reemplazamiento bioisostérico puede estar basado fisicoquímica o topológicamente. Fabricar adecuados profármacos, bioisósteros, Nóxidos, sales o varios isómeros aceptables farmacéuticamente a partir de un compuesto conocido (tales como aquellos descritos en esta memoria) está dentro del conocimiento ordinario de la técnica. Además, todas las formas isoméricas, sales y derivados adecuados de los compuestos arriba mencionados están descritos en la misma. A person of ordinary skill in the art will consider that the above trunk compound or its substituted variant can be made in several, possible racemic, diastereomeric or enantiomeric isomeric forms, may form salts with acidic and organic minerals, and may also form such derivatives. as N-oxides, prodrugs, bioisósteros. "Prodrug" means an inactive form of the compound due to the coupling of one or more specialized protecting groups used in a transient manner to alter or eliminate undesirable properties in the mother molecule, which is metabolized or converted into the active compound within the body (live ) once administered. "Bioisóstero" means a compound that results from the change of an atom or a group of atoms with another, atom or group of atoms, widely similar. The object of a bioisosteric replacement is to create a new compound with biological properties similar to those of the parent compound. The bioisosteric replacement can be physicochemical or topologically based. Making suitable prodrugs, bioisterostero, Nóxidos, salts or several pharmaceutically acceptable isomers from a known compound (such as those described herein) is within the ordinary knowledge of the art. In addition, all suitable isomeric forms, salts and derivatives of the aforementioned compounds are described therein.
Como aquí se describe, el término ¨derivado funcional¨ significa un profármaco, bioisóstero, N-óxido, sal o varios isómeros aceptables farmacéuticamente del compuesto específico descrito arriba, que puede ser ventajoso en uno o más aspectos comparado con el compuesto madre. Fabricar derivados funcionales puede ser laborioso, pero algunas de las tecnologías implicadas son bien conocidas en la técnica. Están disponibles varios métodos sintéticos químicos de alto rendimiento. Por ejemplo, la química combinatoria ha dado como resultado la rápida expansión de colecciones de compuestos, que cuando se acoplan con varias tecnologías eficientes de bio-cribado pueden conducir al descubrimiento eficiente y aislamiento útil de derivados funcionales. As described herein, the term "functional derivative" means a prodrug, bioisoster, N-oxide, salt or several pharmaceutically acceptable isomers of the specific compound described above, which may be advantageous in one or more aspects compared to the parent compound. Manufacturing functional derivatives can be laborious, but some of the technologies involved are well known in the art. Several high performance chemical synthetic methods are available. For example, combinatorial chemistry has resulted in the rapid expansion of collections of compounds, which when coupled with various efficient bio-screening technologies can lead to efficient discovery and useful isolation of functional derivatives.
La composición farmacéutica se puede formular por medios convencionales conocidos por personas expertas en la industria farmacéutica en una forma de dosificación adecuada, tal como comprimidos, cápsulas, inyección, solución, suspensión, polvo, jarabe, etc, y administrarse a un sujeto mamífero que sufre una enfermedad cardiaca coronaria o infarto de miocardio (IM) en una manera adecuada. The pharmaceutical composition may be formulated by conventional means known to persons skilled in the pharmaceutical industry in a suitable dosage form, such as tablets, capsules, injection, solution, suspension, powder, syrup, etc., and administered to a suffering mammalian subject. a coronary heart disease or myocardial infarction (MI) in an appropriate manner.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto aislado de fórmula (I) para uso en un método de estimular la resvascularización en tejidos cardíacos dañados o muertos causados por una enfermedad cardíaca isquémica, tal como por ejemplo, ateroesclerosis de arterias coronarias en un sujeto mamífero. El método comprende una etapa de administrar una cantidad efectiva del compuesto de fórmula (I) al sujeto mamífero. In another aspect, the present invention provides an isolated compound of formula (I) for use in a method of stimulating resvascularization in damaged or dead heart tissues caused by ischemic heart disease, such as, for example, atherosclerosis of coronary arteries in a subject mammal. The method comprises a step of administering an effective amount of the compound of formula (I) to the mammalian subject.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto aislado de fórmula (I) para uso en un método para tratar, mejorar o curar una condición patológica en un mamífero, donde la condición patológica, como juzgan personas expertas en medicina, se pueden tratar o aliviar por regulación al alza de las expresiones de factores angiogénicos (VEGF y FGF), lo que promueve la revascularización temprana en miocardio infartado, y/o por inducción de la expresión de proteínas anti-apoptóticas, lo que inhibe la muerte apoptótica de los cardiomiocitos en los corazones infartados y previene la extensión progresiva de más daño isquémico y limita el tamaño del infarto. El método comprende una etapa de administrar una cantidad efectiva del compuesto de fórmula (I) al mamífero. In another aspect, the present invention provides an isolated compound of formula (I) for use in a method for treating, improving or curing a pathological condition in a mammal, where the pathological condition, as judged by medical experts, can be treated or alleviate by an upward regulation of the expressions of angiogenic factors (VEGF and FGF), which promotes early revascularization in infarcted myocardium, and / or by induction of the expression of anti-apoptotic proteins, which inhibits apoptotic death of cardiomyocytes in infarcted hearts and prevents the progressive spread of more ischemic damage and limits the size of the infarction. The method comprises a step of administering an effective amount of the compound of formula (I) to the mammal.
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Varios rasgos de novedad que caracterizan la invención se señalan con particularidad en las reivindicaciones anexas y forman una parte de esta descripción. Para una mejor comprensión de la invención, sus ventajas operativas, y objetos específicos alcanzados por su uso, debería hacerse referencia a los dibujos y a la siguiente descripción en las que hay realizaciones preferidas ilustradas y descritas de la invención. Several novel features that characterize the invention are pointed out with particularity in the appended claims and form a part of this description. For a better understanding of the invention, its operational advantages, and specific objects achieved by its use, reference should be made to the drawings and the following description in which there are preferred illustrated and described embodiments of the invention.
Breve descripción de los dibujos Brief description of the drawings
FIG. 1 resume el proceso de aislamiento de Ga a partir de la planta de Geum Japonicum como un ejemplo de fabricar el compuesto de la presente invención. FIG. 1 summarizes the isolation process of Ga from the Geum Japonicum plant as an example of manufacturing the compound of the present invention.
FIG. 2 muestra el efecto de neovascularización temprana del miocardio infartado tras tratamiento con Ga. 1: dos días después de la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) e inyección Ga; 2: corazón control día dos; 3: siete días después de la ligadura de LAD e inyección Ga; 4: corazón control siete días; 5: análisis RT-PCR y 6: análisis Western blot, que muestra significativamente expresiones genéticas reguladas al alza de VEGFb y VEGFc en los tejidos cardíacos tratados con Ga (donde A simboliza VEGFb, B simboliza VEGFc, G simboliza GAPDH, C simboliza grupo control, T simboliza grupo tratado con Ga, M simboliza marcador molecular). FIG. 2 shows the effect of early neovascularization of the infarcted myocardium after treatment with Ga. 1: two days after ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD) and Ga injection; 2: control heart day two; 3: seven days after LAD ligation and Ga injection; 4: control heart seven days; 5: RT-PCR analysis and 6: Western blot analysis, which shows significantly upwardly regulated genetic expressions of VEGFb and VEGFc in cardiac tissues treated with Ga (where A symbolizes VEGFb, B symbolizes VEGFc, G symbolizes GAPDH, C symbolizes control group , T symbolizes group treated with Ga, M symbolizes molecular marker).
FIG. 3 muestra el efecto inducido por Ga en el potencial de supervivencia y en el tamaño del infarto. 1: siete días después de la ligadura LAD (control); 2: siete días después de la ligadura LAD (tratado con Ga); 3: análisis Western blot que muestra el aumento de las expresiones de fosfo-Akt1 con tratamiento Ga; 4: análisis Western blot que muestra el incremento de las expresiones de Bc12 con tratamiento Ga (C y T permanente para el grupo control y grupo tratado con Ga, respectivamente); 5: tinción tricrómica del miocardio de rata dos semanas después del infarto (control); y 6: tinción tricrómica del infarto de miocardio de rata dos semanas después del infarto (tratado con Ga), que muestra significativamente la reducción del tamaño del infarto y el incremento de la masa de miocardio viable dentro de la pared anterior. FIG. 3 shows the effect induced by Ga on the survival potential and the size of the infarction. 1: seven days after LAD ligation (control); 2: seven days after LAD ligation (treated with Ga); 3: Western blot analysis showing the increase in phospho-Akt1 expressions with Ga treatment; 4: Western blot analysis showing the increase in Bc12 expressions with Ga treatment (C and T permanent for the control group and group treated with Ga, respectively); 5: trichrome staining of the rat myocardium two weeks after the infarction (control); and 6: trichrome staining of the rat myocardial infarction two weeks after the infarction (treated with Ga), which shows significantly the reduction of the infarct size and the increase of viable myocardial mass within the anterior wall.
Descripción detallada de realizaciones particulares Detailed description of particular embodiments
I. Procedimientos experimentales I. Experimental procedures
Todos los protocolos utilizados en la presente invención están conforme a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud de E.E.U.U, y están aprobados por el Comité Ético Experimental Animal de la Universidad China de Hong Kong. All protocols used in the present invention are in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the National Institutes of Health of the USA, and are approved by the Animal Experimental Ethical Committee of the Chinese University of Hong Kong.
Aislamiento de Ga de Geum Japonicum: Para los experimentos descritos a continuación, se obtuvo Ga de la planta de Geum Japonicum. En referencia a la FIG.1, la planta se recolectó de la provincia Guizhou de China en Agosto, se secó (10 Kg) y se filtró con 70% de etanol (100 L) dos veces al día durante 3 días a temperatura ambiente. El extracto se combinó y pulverizó en seco para producir un residuo sólido (1Kg). El residuo sólido se suspendió en 10 L de agua y sucesivamente se repartió con cloroformo (10 L) dos veces, luego en n-butanol (10 L) dos veces para producir las correspondientes fracciones. La fracción soluble en n-butanol (GJ-B) se filtró y pulverizó en seco para producir una fracción en polvo. Se mostró que la fracción soluble en n-BuOH podía mejorar significativamente la proliferación de células endoteliales de la arteria coronaria humana-HCAECs (Clonetics, Inc.) y estimular la rápida neovascularización en la zona infartada del modelo animal IM. La fracción soluble en n-BuOH se aplicó en una columna de Sephadex LH-20 equilibrada con metanol al 10 % y eluyó incrementando la concentración de metanol en agua, resultando 7 fracciones. La fracción 3, eluída con aproximadamente metanol al 50 %, mostró una actividad potente en estimulación significativa de la angiogénesis en miocardio infartado. Esta fracción 3 contiene taninos que se utilizan para probar sus efectos en un modelo animal de IM. Se determinaron por análisis de RMN las estructuras de los compuestos activos contenidos en esta fracción activa. Por supuesto, como Ga es un compuesto natural conocido, se puede obtener de otras plantas y producir resultados satisfactorios. Isolation of Ga from Geum Japonicum: For the experiments described below, Ga was obtained from the Geum Japonicum plant. Referring to FIG. 1, the plant was collected from Guizhou province of China in August, dried (10 kg) and filtered with 70% ethanol (100 L) twice daily for 3 days at room temperature. The extract was combined and pulverized dry to produce a solid residue (1Kg). The solid residue was suspended in 10 L of water and successively partitioned with chloroform (10 L) twice, then in n-butanol (10 L) twice to produce the corresponding fractions. The n-butanol soluble fraction (GJ-B) was filtered and dried dry to produce a powder fraction. It was shown that the n-BuOH soluble fraction could significantly improve the proliferation of human coronary artery endothelial cells-HCAECs (Clonetics, Inc.) and stimulate rapid neovascularization in the infarcted area of the animal IM model. The n-BuOH soluble fraction was applied on a Sephadex LH-20 column equilibrated with 10% methanol and eluted by increasing the concentration of methanol in water, resulting in 7 fractions. Fraction 3, eluted with approximately 50% methanol, showed a potent activity in significant stimulation of angiogenesis in myocardial infarction. This fraction 3 contains tannins that are used to test its effects in an animal model of IM. The structures of the active compounds contained in this active fraction were determined by NMR analysis. Of course, since Ga is a known natural compound, it can be obtained from other plants and produce satisfactory results.
Animales, procedimientos quirúrgicos: Se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley (SD), de 250-300 g de peso. A continuación de una anestesia adecuada, se realizó a los animales una toracotomía izquierda, se abrió el pericardio y se ligó la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD). Se inyectó Ga disuelta en PBS (0,1 ml, que contienen 0,3 mg de Ga) en el miocardio distal (la región que se presume isquémica) de la arteria ligada inmediatamente después de la ligadura en el grupo de ensayo (que tiene 60 ratas, por ejemplo, n=60). Un volumen equivalente de PBS se inyectó a la localización correspondiente de las ratas en el grupo control (n=60). Se eutanizaron cincuenta ratas de cada grupo en los días 2, 7, 14 y 30 tras el infarto para una medición morfológica y funcional. Para el grupo placebo (n=6), se realizó una toracotomía izquierda y se abrió el pericardio pero no se ligó la LAD. Para el grupo control normal (n=6), las ratas no fueron sujeto de ningún tratamiento y procedimiento quirúrgicos. Animals, surgical procedures: Male Sprague-Dawley (SD) rats weighing 250-300 g were used. Following adequate anesthesia, the animals were performed a left thoracotomy, the pericardium was opened and the left anterior descending coronary artery (LAD) was ligated. Ga dissolved in PBS (0.1 ml, containing 0.3 mg of Ga) was injected into the distal myocardium (the region that is presumed ischemic) of the ligated artery immediately after ligation in the test group (which has 60 rats, for example, n = 60). An equivalent volume of PBS was injected into the corresponding location of the rats in the control group (n = 60). Fifty rats from each group were euthanized on days 2, 7, 14 and 30 after the infarction for a morphological and functional measurement. For the placebo group (n = 6), a left thoracotomy was performed and the pericardium was opened but the LAD was not ligated. For the normal control group (n = 6), the rats were not subject to any surgical treatment and procedure.
Mediciones de la neovascularización en la zona infartada: Se extirparon los ventrículos izquierdos de las ratas sacrificadas en los días post-infarto 2 y 7 y se cortaron de la punta a la base en 3 cortes transversales. Los cortes se fijaron en formaldehído y se embebieron en parafina. Se determinó la densidad vascular de las muestras de sección histológica contando el número de vasos sanguíneos en la zona infartada utilizando un microscopio óptico bajo un campo de alta energía (HPF) (x 400). Se utilizaron ocho HPFs aleatorios y no solapados dentro del infarto presentado para contar todos los vasos sanguíneos en cada sección. El número de vasos sanguíneos en cada HPF Neovascularization measurements in the infarcted area: The left ventricles of the rats sacrificed on post-infarction days 2 and 7 were removed and cut from the tip to the base in 3 cross sections. The cuts were fixed in formaldehyde and embedded in paraffin. The vascular density of the histological section samples was determined by counting the number of blood vessels in the infarcted area using an optical microscope under a high energy field (HPF) (x 400). Eight random and non-overlapping HPFs were used within the presented infarction to count all the blood vessels in each section. The number of blood vessels in each HPF
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Mediciones de la apoptosis del miocito por el ensayo TUNEL de secciones de tejido de parafina: Se utilizó el método de ensayo TUNEL para la detección in situ de la apoptosis a nivel9 celular simple. Las secciones de tejido miocárdico infartado de rata se obtuvieron a partir de ambos grupos ensayo y control en el día 7 post-infarto. Después de la desparafinación y rehidratación, los tejidos se digirieron con Proteinasa K (Dako) durante 15 minutos e incubaron con TdT (Roche) y Biotina-16-dUTP (Roche) durante 60 minutos a 37ºC. Después de la incubación con SP-HRP (Roche) durante 20 minutos, la tinción TUNEL se visualizó con DAB (Dako), que tiñó el núcleo (con el fragmento DNA teñido de marrón). Las secciones de tejido se examinaron microscópicamente a un campo de alta energía (x 400) y al menos 100 células se contaron en un mínimo de 10 HPF. El número de miocitos apoptóticos por HPF se refirió como el índice apoptótico. Measurements of myocyte apoptosis by the TUNEL test of paraffin tissue sections: The TUNEL test method was used for in situ detection of apoptosis at the simple cellular level9. Sections of rat infarcted myocardial tissue were obtained from both test and control groups on day 7 post-infarction. After dewaxing and rehydration, the tissues were digested with Proteinase K (Dako) for 15 minutes and incubated with TdT (Roche) and Biotin-16-dUTP (Roche) for 60 minutes at 37 ° C. After incubation with SP-HRP (Roche) for 20 minutes, TUNEL staining was visualized with DAB (Dako), which stained the nucleus (with the DNA fragment stained brown). Tissue sections were examined microscopically at a high energy field (x 400) and at least 100 cells were counted in a minimum of 10 HPF. The number of apoptotic myocytes by HPF was referred to as the apoptotic index.
Estimación del infarto miocárdico: Los corazones de las ratas, sacrificadas en el día 14 post infarto, se estirparon y seccionaron de la punta a la base en tres o cuatro cortes transversales y se embebieron en parafina. Se cortaron secciones finas (5 m de espesor) para cada portaobjetos y se tiñeron con tinción H&E y tricrómico de Masson (Sigma, E.E.U.U), que marca de azul el colágeno y de rojo el miocardio. Todos los portaobjetos de estas secciones se proyectaron en una pantalla de un ordenador con planimetría asistida (Imagen J 1.34S, Wayne Rasband, National Institutes of Health, E.E.U.U). Se midieron para cada portaobjetos las circunferencias endocárdica y epicárdica así como la longitud de la cicatriz. La porción infartada del ventrículo izquierdo se calculó a partir de estas mediciones y el radio de la longitud de la cicatriz para la circunferencia ventricular del endocardio y epicardio de los portaobjetos se expresó como un porcentaje para definir el tamaño del infarto9,10,11. Estimation of myocardial infarction: The hearts of the rats, sacrificed on day 14 post-infarction, were removed and sectioned from the tip to the base in three or four cross sections and embedded in paraffin. Thin sections (5 µm thick) were cut for each slide and stained with Masson's H&E and trichrome staining (Sigma, USA), which marks the collagen blue and the myocardium red. All slides in these sections were projected on a computer screen with assisted planimetry (Image J 1.34S, Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA). Endocardial and epicardial circumferences as well as the length of the scar were measured for each slide. The infarcted portion of the left ventricle was calculated from these measurements and the radius of the scar length for the ventricular circumference of the endocardium and epicardium of the slides was expressed as a percentage to define the size of the infarction9,10,11.
Medición Ecocardiográfica de la Función Miocárdica: En total, 118 ratas SD recibieron ecocardiografía basal antes de cualquier procedimiento experimental. La ecocardiografía se registró bajo anestesia controlada utilizando un transductor de fase matriz S10-MHz y un sistema GE VingMed Vivid 7. Las imágenes de las ecocardiografías en trazado modo M y bidimensional (2D) se registraron a partir de las vistas de los ejes largo y corto paraesternal. La vista del eje corto era a nivel de los músculos papilares. Las áreas ventricular izquierda final diastólica (LVDA) y final sistólica (LVSA) se midieron a partir de los volúmenes sistólico final y diastólico final LV del ventrículo izquierdo en el eje largo paraesternal (LVEDV y LVESD) calculados mediante el método en modo M. La fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF) y la reducción fraccional (FS) se derivaron del área transversal del LV en la vista del eje corto bidimensional: EF= [(LVEDV – LVESV)/LVEDV] x 100% y FS = [(LVDA – LVSA)/LVDA] x 100% 12. La fórmula estándar se utiliza para los cálculos ecocardiográficos. Echocardiographic Measurement of Myocardial Function: In total, 118 SD rats received baseline echocardiography before any experimental procedure. The echocardiography was recorded under controlled anesthesia using an S10-MHz matrix phase transducer and a GE VingMed Vivid 7 system. The images of the echocardiographs in M-mode and two-dimensional (2D) tracing were recorded from the views of the long and long axes. parasternal short. The view of the short axis was at the level of the papillary muscles. The left ventricular end diastolic (LVDA) and final systolic (LVSA) areas were measured from the final systolic and final diastolic LV volumes of the left ventricle on the parasternal long axis (LVEDV and LVESD) calculated using the M-mode method. Left ventricular ejection fraction (LVEF) and fractional reduction (FS) were derived from the transverse area of the LV in the two-dimensional short axis view: EF = [(LVEDV - LVESV) / LVEDV] x 100% and FS = [( LVDA - LVSA) / LVDA] x 100% 12. The standard formula is used for echocardiographic calculations.
Análisis RT-PCR de supervivencia asociada a expresiones genéticas: Un corte pequeño del tejido de miocardio infartado preparado arriba se puso en nitrógeno líquido inmediatamente después de la incisión y se almacenó a 80ºC. Según las instrucciones del fabricante, se aisló el RNA total utilizando el Mini Kit RNeasy Qiagen (Catálogo Número 74104, Qiagen, Alemania), se disolvió en 20-30µl de agua libre de RNasa y se almacenó a -80ºC. La contaminación integral de RNA ribosómico y ADN se chequeó rutinariamente utilizando formaldehído que desnaturaliza el gel de electroforesis de ARN (1,2%) antes de proceder con el análisis. La contaminación proteica y la concentración de ARN total se valoró por determinación del ratio OD260:OD280 espectrofotométricamente (Eppendorf BioPhotometer, Hamburg, Alemania). RT-PCR analysis of survival associated with genetic expressions: A small cut of the infarcted myocardial tissue prepared above was placed in liquid nitrogen immediately after the incision and stored at 80 ° C. According to the manufacturer's instructions, the total RNA was isolated using the RNeasy Qiagen Mini Kit (Catalog Number 74104, Qiagen, Germany), dissolved in 20-30 µl of RNase-free water and stored at -80 ° C. Integral contamination of ribosomal RNA and DNA was routinely checked using formaldehyde that denatured the RNA electrophoresis gel (1.2%) before proceeding with the analysis. Protein contamination and total RNA concentration was assessed by determining the OD260: OD280 spectrophotometrically ratio (Eppendorf BioPhotometer, Hamburg, Germany).
Análisis Western Blot: Alrededor de 50 mg del tejido arriba mencionado preparado de miocardio infartado se trituró a polvo en nitrógeno líquido. 1 mL de tampón de lisis (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Nonidet P-40, 10% de glicerol, NaF 200 mM, pirofosfato sódico 20 mM, 10 mg/ml de leupeptina, 10 mg/ml de aprotinina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 200 mM, y ortovadanadato de sodio 1 mM) se añadió al polvo y colocó en hielo durante 30 minutos. El rendimiento proteico se cuantificó por un kit de valoración proteica Bio-Rad DC (Bio-Rad). Cantidades iguales (10 g) de proteína total se fraccionaron por tamaño mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas PVDF (Amersham, E.E.U.U). Las hibridaciones se bloquearon con tampón fosfato salino plus 0,1% (vol/vol) Tween 20 (PBST) que contiene 5%(peso/vol) de leche en polvo (PBSTM) durante 30 minutos a temperatura ambiente y sondó durante 60 minutos con anticuerpos primarios específicos frente a fosfo-AKt1 de rata (ratón, Santa Cruz) o Bcl-2 de rata (ratón, Sigma-Aldrich), diluido en 1:1000 en PBSTM. Después del lavado extensivo en PBST, las hibridaciones se sondaron por conjugado anti IgG de ratón-peroxidasa de rábano picante (Amersham Biosciences) (dilución 1/1000 en PBSTM, 60 minutos), se lavaron extensamente con PBST, y desarrollaron por quimiolumiscencia. Western Blot Analysis: About 50 mg of the aforementioned tissue prepared from infarcted myocardium was crushed to powder in liquid nitrogen. 1 mL of lysis buffer (50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Nonidet P-40, 10% glycerol, 200 mM NaF, 20 mM sodium pyrophosphate, 10 mg / ml leupeptin, 10 mg / ml aprotinin, 200 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and 1 mM sodium orthovanadate) was added to the powder and placed on ice for 30 minutes. Protein yield was quantified by a Bio-Rad DC protein titration kit (Bio-Rad). Equal amounts (10 g) of total protein were fractionated by size by SDS-PAGE and transferred to PVDF membranes (Amersham, USA). Hybridizations were blocked with phosphate buffered saline plus 0.1% (vol / vol) Tween 20 (PBST) containing 5% (weight / vol) of milk powder (PBSTM) for 30 minutes at room temperature and probed for 60 minutes with specific primary antibodies against rat phospho-AKt1 (mouse, Santa Cruz) or rat Bcl-2 (mouse, Sigma-Aldrich), diluted 1: 1000 in PBSTM. After extensive washing in PBST, the hybridizations were probed by mouse anti-horseradish peroxidase (Amersham Biosciences) conjugate (1/1000 dilution in PBSTM, 60 minutes), washed extensively with PBST, and developed by chemiluminescence.
Bioestadísticas: Todos los datos morfométricos se recogieron a ciegas. Los resultados se presentan como valor medio ±SD calculados a partir de las mediciones medias obtenidas de cada corazón. Se determinó la significación estadística por comparación entre dos mediciones utilizando el incomparable test de Student de dos colas. Valores de p<0,05 se consideraron ser significativos. Biostatistics: All morphometric data were collected blindly. The results are presented as mean value ± SD calculated from the average measurements obtained from each heart. Statistical significance was determined by comparison between two measurements using the incomparable two-tailed Student test. Values of p <0.05 were considered to be significant.
II. Revascularización inducida por Ga en miocardio infartado. II. Ga-induced revascularization in myocardial infarction.
En referencia a la FIG.2, estudios histológicos revelaron que muchos vasos sanguíneos se formaron nuevamente a lo largo de la zona infartada completa, incluyendo las áreas centrales y las zonas del borde en el día 2 tras el infarto (FIG.2:1), donde los vasos sanguíneos formados nuevamente están indicados por flechas rojas. Algunos de los Referring to FIG. 2, histological studies revealed that many blood vessels formed again along the entire infarcted area, including the central areas and the border areas on day 2 after the infarction (FIG. 2: 1). , where the newly formed blood vessels are indicated by red arrows. Some of the
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vasos sanguíneos nuevamente formados se rellenaron con células sanguíneas y otras estaban aún en la fase temprana de desarrollo de regeneración de vasos sanguíneos y mostraban una estructura similar a un lumen sin relleno de células sanguíneas. La densidad capilar en la zona del infarto del miocardio tratado con Ga era una media de 18 (18±3,9) relleno con células sanguíneas y 8 (8±2,8) con estructuras similares al lumen por HPF, calculado de 8 campos seleccionados aleatoriamente en cada uno de los 15 portaobjetos de los corazones tratados con Ga en el día 2 (FIG.2:1). En cambio, se observaron pocos vasos sanguíneos (5±2,1 por HPF) con una infiltración celular inflamatoria en la zona del infarto en el miocardio control en el día 2 post IM (FIG.2:2). En corazones tratados con Ga, en el día 7 post IM, los vasos sanguíneos nuevamente formados rellenos con células sanguíneas permanecían (11±3,6) a lo largo de la zona del infarto pero no se observaron las estructuras similares al lumen (FIG. 2:3). En cambio, las muestras control mostraron principalmente tejido fibroso sustituido del miocardio infartado con sólo unos pocos vasos sanguíneos (3±1,2) a los 7 días del infarto (FIG.2:4). Los análisis RT-PCR y Western blot demostraron que la revascularización inducida por Ga dentro de las 24 horas en miocardio infartado era acompañado concominantemente con la activación de las expresiones génicas de VEGF y bFGF en los correspondientes tejidos cardíacos. Las expresiones de VEGF y FGF en el miocardio tratado con Ga se incrementaron a 1,8 y 2,2 veces respectivamente (FIG.2:5 & 6,T) comparado con sus expresiones en el grupo control de miocardio no tratado (FIG. newly formed blood vessels were filled with blood cells and others were still in the early stage of development of blood vessel regeneration and showed a structure similar to a lumen without blood cell filling. Capillary density in the area of myocardial infarction treated with Ga was an average of 18 (18 ± 3.9) filled with blood cells and 8 (8 ± 2.8) with structures similar to the lumen by HPF, calculated from 8 fields randomly selected on each of the 15 slides of the hearts treated with Ga on day 2 (FIG. 2: 1). In contrast, few blood vessels (5 ± 2.1 by HPF) were observed with an inflammatory cell infiltration in the area of the myocardial infarction on day 2 post MI (FIG. 2: 2). In hearts treated with Ga, on day 7 post IM, newly formed blood vessels filled with blood cells remained (11 ± 3.6) throughout the infarct area but no lumen-like structures were observed (FIG. 2: 3). In contrast, control samples showed mainly substituted fibrous tissue of the infarcted myocardium with only a few blood vessels (3 ± 1.2) 7 days after the infarction (FIG. 2: 4). The RT-PCR and Western blot analyzes showed that Ga-induced revascularization within 24 hours in myocardial infarction was concomitantly accompanied by the activation of VEGF and bFGF gene expressions in the corresponding cardiac tissues. The expressions of VEGF and FGF in the myocardium treated with Ga were increased to 1.8 and 2.2 times respectively (FIG. 2: 5 & 6, T) compared to their expressions in the untreated myocardial control group (FIG.
2:5 & 6,C). 2: 5 & 6, C).
III. Mejora del potencial de supervivencia de Ga y reducción del tamaño del infarto. III. Improvement of the survival potential of Ga and reduction of the size of the infarction.
En referencia a la FIG.3, siete días después de la ligadura de LAD, los controles de los miocitos en riesgo a lo largo del borde del peri-infarto (FIG. 3:1) mostraron formas distorsionadas e irregulares comparado con los miocitos en la parte distal del corazón. En cambio, los miocitos en el borde del peri-infarto de los corazones tratados con Ga mostraron una forma regular (FIG. 3:2) y las miofibras permanecen saludables y no estrechas y delgadas como en el corazón no tratado. Con la tinción de TUNEL, se encontró que el número de miocitos apoptóticos detectados en el miocardio de ventrículo izquierdo tratado con Ga (FIG. 3:2) era aproximadamente tres veces menor comparado con los controles no tratados (para energía de alto rendimiento: 1,70±0,18 contra 5,04±0,75, P<0,001; FIG.3:1). Estas diferencias eran particularmente evidentes dentro del borde del peri-infarto donde la forma irregular de los miocitos en los corazones control tenía el número más alto de núcleos apoptóticos, que se tiñeron de marrón. Muchos de los núcleos apoptóticos se observaron en el borde del peri-infarto más que en los miocitos de la zona distal del infarto. Además, se encontró en la zona del infarto de los corazones tratados con Ga una significativa mayor densidad de capilares rodeado por los miocitos con muchos menos núcleos apoptóticos. En cambio, se observó una densidad de capilares significativamente menor y más núcleos apoptóticos en los corazones no tratados del grupo control. En total, estos resultados indican que la angiogénesis inducida por el tratamiento con Ga previno un proceso de extensión pro-apoptótico en ambas células, endoteliales y miocitos, mejoró la supervivencia de miocitos viables y células endoteliales dentro de la zona del peri-infarto y consecuentemente mejoró la función miocárdica . Para determinar si el efecto anti apoptótico inducido por Ga en los miocitos viables en riesgo eran a través de expresiones de proteínas anti apoptóticas, se realizaron análisis western blots. Se demostró que la prevención inducida por Ga de la extensión del proceso apoptótico del tejido cardíaco en riesgo era concominantemente acompañado por un incremento en las expresiones génicas de los factores clave supervivientes. Se incrementaron las expresiones de Akt1 (FIG. 3:3,T) y Bc12 (FIG. 3:4,T) por 3,3 y 2,8 veces respectivamente comparado con los tejidos cardíacos en el grupo control (Fig.3 & 4,C). Referring to FIG. 3, seven days after LAD ligation, controls of myocytes at risk along the edge of the peri-infarction (FIG. 3: 1) showed distorted and irregular shapes compared to myocytes in The distal part of the heart. In contrast, myocytes at the edge of the peri-infarction of the hearts treated with Ga showed a regular shape (FIG. 3: 2) and the myofibers remain healthy and not narrow and thin as in the untreated heart. With TUNEL staining, it was found that the number of apoptotic myocytes detected in the left ventricle myocardium treated with Ga (FIG. 3: 2) was approximately three times lower compared to untreated controls (for high-performance energy: 1 , 70 ± 0.18 versus 5.04 ± 0.75, P <0.001; FIG. 3: 1). These differences were particularly evident within the edge of the peri-infarction where the irregular shape of myocytes in the control hearts had the highest number of apoptotic nuclei, which stained brown. Many of the apoptotic nuclei were observed at the edge of the peri-infarction rather than in the myocytes of the distal infarct area. In addition, a significantly higher capillary density surrounded by myocytes with much less apoptotic nuclei was found in the area of heart attack with Ga. In contrast, significantly lower capillary density and more apoptotic nuclei were observed in the untreated hearts of the control group. In total, these results indicate that angiogenesis induced by Ga treatment prevented a pro-apoptotic extension process in both endothelial and myocyte cells, improved the survival of viable myocytes and endothelial cells within the peri-infarction zone and consequently improved myocardial function. To determine whether the anti-apoptotic effect induced by Ga in viable myocytes at risk was through expressions of anti-apoptotic proteins, western blots analyzes were performed. It was shown that Ga-induced prevention of the extension of the apoptotic process of cardiac tissue at risk was concomitantly accompanied by an increase in gene expressions of the surviving key factors. The expressions of Akt1 (FIG. 3: 3, T) and Bc12 (FIG. 3: 4, T) were increased by 3.3 and 2.8 times respectively compared to cardiac tissues in the control group (Fig. 3 & 4, C).
Para investigar si el incremento del potencial de supervivencia de los miocitos viables y células endoteliales dentro de la zona del peri-infarto inducida por Ga resultaría en la reducción del tamaño del infarto, se midieron los tamaños del infarto de diferentes grupos animales. Como se muestra en la FIG.3, la proporción media de deposición de colágeno o tejido cicatrizado/miocardio ventricular izquierdo (como se define por la tinción Tricrómica de Masson) era del 27,44% en ratas tratadas por Ga (FIG.3:5), comparado con el 39,53% para aquellos del grupo control (FIG.3:6) 14 días post infarto, indicando que Ga mejoraba el potencial de supervivencia de ambas células endoteliales y miocitos e incrementó significativamente la masa de miocardio viable dentro de la pared libre anterior de los ventrículos izquierdos. La reconstitución de la vasculatura coronaria dañada y la reducción del tamaño del infarto inducidos por el tratamiento de Ga se acompañaron por una significativa mejora funcional, como se demostró en las mediciones ecocardiográficas donde, en comparación con los corazones control de IM no tratados en el día 7 y 14 post infarto, la fracción de eyección (EF) de los corazones IM tratados con Ga era significativamente mayor (55,68 ± 2,63 veces contra 49,67 ± 2,78, P=0,03) en el día 7, y se incrementó significativamente (60,11 ± 2,66 contra 48,26 ± 2,55, P= 0,001) en el día 14. Similarmente, la fracción corta (FS) de los corazones IM tratados con Ga eran significativamente mayores (27,33 ± 1,63 contra 22,17 ± 1,67, P=0,01) en el día 7 y se incrementó significativamente (29,87 ± 2,66 contra 21,35 ± 2,08, P=0,002) en el día 14. To investigate whether the increased survival potential of viable myocytes and endothelial cells within the area of the Ga-induced peri-infarction would result in the reduction of the infarct size, the infarction sizes of different animal groups were measured. As shown in FIG. 3, the average proportion of collagen deposition or scar tissue / left ventricular myocardium (as defined by Masson's Trichrome stain) was 27.44% in rats treated by Ga (FIG. 3: 5), compared with 39.53% for those in the control group (FIG. 3: 6) 14 days post infarction, indicating that Ga improved the survival potential of both endothelial cells and myocytes and significantly increased the viable myocardium mass within of the anterior free wall of the left ventricles. The reconstitution of the damaged coronary vasculature and the reduction of the infarct size induced by the Ga treatment were accompanied by a significant functional improvement, as demonstrated by echocardiographic measurements where, compared to the control hearts of untreated IM on the day 7 and 14 post infarction, the ejection fraction (EF) of the IM hearts treated with Ga was significantly higher (55.68 ± 2.63 times against 49.67 ± 2.78, P = 0.03) on the day 7, and increased significantly (60.11 ± 2.66 versus 48.26 ± 2.55, P = 0.001) on day 14. Similarly, the short fraction (FS) of the IM hearts treated with Ga were significantly larger (27.33 ± 1.63 against 22.17 ± 1.67, P = 0.01) on day 7 and increased significantly (29.87 ± 2.66 against 21.35 ± 2.08, P = 0.002) on day 14.
En resumen, los ejemplos de arriba demuestran que Ga es capaz de regular al alza las expresiones de VEGF y bFGF para la reconstitución temprana del sistema de suministro sanguíneo, induciendo la expresión de proteínas Akt1 y Bc12 anti apoptóticas para prevenir la muerte apoptótica de cardiomiocitos en riesgo, y lleva a una mejora funcional significativa del corazón que sufre un acontecimiento isquémico. Por consiguiente, Ga proporciona una nueva dimensión, como un medicamento terapéutico en angiogénesis, en el tratamiento de enfermedades cardíacas isquémicas. In summary, the examples above demonstrate that Ga is capable of upregulating the expressions of VEGF and bFGF for early reconstitution of the blood supply system, inducing the expression of anti apoptotic Akt1 and Bc12 proteins to prevent apoptotic death of cardiomyocytes in risk, and leads to a significant functional improvement of the heart that suffers an ischemic event. Therefore, Ga provides a new dimension, as a therapeutic drug in angiogenesis, in the treatment of ischemic heart disease.
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IV. Fabricación de Composiciones Farmacéuticas y sus usos en el tratamiento de enfermedades isquémicas en mamíferos IV. Manufacture of Pharmaceutical Compositions and their uses in the treatment of ischemic diseases in mammals
Una vez que se identifica el compuesto químico eficaz y se obtienen las preparaciones parcial o sustancialmente puras del compuesto, ambos por aislamiento del compuesto natural a partir de recursos naturales tales como plantas Once the effective chemical compound is identified and partially or substantially pure preparations of the compound are obtained, both by isolation of the natural compound from natural resources such as plants
o por síntesis química, se pueden fabricar varias composiciones o formulaciones farmacéuticas de un compuesto puro utilizando procedimientos existentes o procedimientos de desarrollo futuros en la industria. Los procesos específicos de fabricación de formulaciones farmacéuticas y formas de dosificación (incluyendo, pero no limitado a, tableta, cápsula, inyección, jarabe) de compuestos químicos no son parte de la invención y personas expertas en la técnica ordinaria de la industria farmacéutica son capaces de aplicar uno o más procesos establecidos en la industria para la práctica de la presente invención. Alternativamente, personas expertas en la técnica ordinaria pueden modificar los procesos convencionales existentes para un mejor ajuste de los compuestos de la presente invención. Por ejemplo, las bases de datos de patentes o solicitudes de patentes proporcionadas en la página web oficial USPTO contienen sustanciosos recursos que conciernen a la fabricación de formulaciones y productos farmacéuticos de compuestos químicos efectivos. Otro recurso de información útil es Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations, editado por Sarfaraz K. Niazi y vendido por Culinary & Hospitality Industry Publications Services. or by chemical synthesis, various pharmaceutical compositions or formulations of a pure compound can be manufactured using existing procedures or future development procedures in the industry. Specific manufacturing processes of pharmaceutical formulations and dosage forms (including, but not limited to, tablet, capsule, injection, syrup) of chemical compounds are not part of the invention and persons skilled in the ordinary art of the pharmaceutical industry are capable of applying one or more processes established in the industry for the practice of the present invention. Alternatively, persons skilled in the ordinary art can modify existing conventional processes for a better fit of the compounds of the present invention. For example, the patent databases or patent applications provided on the official USPTO website contain substantial resources concerning the manufacture of pharmaceutical formulations and products of effective chemical compounds. Another useful information resource is Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations, edited by Sarfaraz K. Niazi and sold by Culinary & Hospitality Industry Publications Services.
Como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones, el término “extracto de planta” significa una mezcla de compuestos naturales obtenidos vía un proceso de extracción a partir de partes de una planta, donde al menos el 10 % de la masa seca total es de compuestos no identificados. En otras palabras, un extracto de planta no significa un compuesto identificado sustancialmente purificado de la planta. El proceso de extracción implica típicamente una etapa de sumergir una parte(s) de la planta cruda en un disolvente (comúnmente, agua y/o un disolvente orgánico) a lo largo de un tiempo predeterminado, opcionalmente separar la solución de los restos de la planta y luego separar el disolvente de la solución, para obtener un extracto, que puede además opcionalmente someterse a la concentración y/o purificación parcial. El término “excipiente farmacéutico” significa un ingrediente contenido en una formulación de un fármaco que no es un constituyente medicinalmente activo. El término “una cantidad eficaz” se refiere a la cantidad que es suficiente para obtener un efecto terapéutico en el sujeto tratado. La dosis efectiva variará, como reconocen aquellos expertos en la técnica, dependiendo de los tipos de enfermedades tratadas, ruta de administración, uso de excipientes, y la posibilidad de co-uso con otro tratamiento terapéutico. Una persona experta en la técnica puede determinar una cantidad efectiva en una situación particular utilizando un método convencional conocido en la técnica. As used herein and in the claims, the term "plant extract" means a mixture of natural compounds obtained via an extraction process from parts of a plant, where at least 10% of the total dry mass It is of unidentified compounds. In other words, a plant extract does not mean an identified compound substantially purified from the plant. The extraction process typically involves a step of immersing a part (s) of the raw plant in a solvent (commonly, water and / or an organic solvent) over a predetermined time, optionally separating the solution from the remains of the plant and then remove the solvent from the solution, to obtain an extract, which can also optionally undergo the concentration and / or partial purification. The term "pharmaceutical excipient" means an ingredient contained in a formulation of a drug that is not a medicinally active constituent. The term "an effective amount" refers to the amount that is sufficient to obtain a therapeutic effect on the treated subject. The effective dose will vary, as recognized by those skilled in the art, depending on the types of diseases treated, route of administration, use of excipients, and the possibility of co-use with another therapeutic treatment. A person skilled in the art can determine an effective amount in a particular situation using a conventional method known in the art.
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12. Davani S, Marandin A, Mersin N, Royer B, Kantelip B, Herve P, Etievent J-P, Kantelip J-P. Mesenchymal Progenitor Cells Differentiate into Endothelial Phenotype, Enhance Vascular Density, and Improve Heart Function in a Rat Cellular Cardiomyoplasty Model. Circulation. 2003;108:253II-258. 12. Davani S, Marandin A, Mersin N, Royer B, Kantelip B, Herve P, Etievent J-P, Kantelip J-P. Mesenchymal Progenitor Cells Differentiate into Endothelial Phenotype, Enhance Vascular Density, and Improve Heart Function in a Rat Cellular Cardiomyoplasty Model. Circulation 2003; 108: 253II-258.
Claims (8)
- 4. Four.
- Uso según la reivindicación 1, en donde dicha enfermedad cardíaca coronaria o infarto cardíaco es causado 10 por aterosclerosis de arterias coronarias. Use according to claim 1, wherein said coronary heart disease or heart attack is caused by coronary artery atherosclerosis.
- 5. 5.
- Uso de un compuesto aislado de fórmula (I) como se definió en la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para la revascularización del miocardio infartado de un sujeto mamífero. Use of an isolated compound of formula (I) as defined in claim 1, in the manufacture of a medicament for revascularization of the infarcted myocardium of a mammalian subject.
- 6. 6.
- Uso según la reivindicación 5, en donde dicho compuesto activa la expresión de VEGF y bFGF. Use according to claim 5, wherein said compound activates the expression of VEGF and bFGF.
- 7. 7.
- Uso según la reivindicación 5, en donde dicho compuesto es inyectado directamente en los tejidos en dicho 15 miocardio infartado. Use according to claim 5, wherein said compound is injected directly into the tissues in said infarcted myocardium.
- 8. 8.
- Uso según la reivindicación 5, en donde dicho compuesto es llevado a los tejidos en dicho miocardio infartado por administración oral. Use according to claim 5, wherein said compound is carried to the tissues in said infarcted myocardium by oral administration.
- 9. 9.
- Uso según la reivindicación 5, en donde dicho compuesto es llevado a los tejidos en dicho miocardio infartado por inyección subcutánea, inyección intramuscular, o infusión intravenosa. Use according to claim 5, wherein said compound is carried to the tissues in said infarcted myocardium by subcutaneous injection, intramuscular injection, or intravenous infusion.
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