ES2538489T3

ES2538489T3 - Remedios para pénfigo que contienen anticuerpos contra el ligando Fas

Info

Publication number: ES2538489T3
Application number: ES08859792.7T
Authority: ES
Inventors: Carlo Pincelli; Alessandra Marconi
Original assignee: PINCELL Srl
Current assignee: PINCELL Srl
Priority date: 2007-12-12
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2015-06-22
Anticipated expiration: 2028-12-12
Also published as: NZ586148A; SI2231708T1; WO2009074339A1; CA2708790A1; RU2558260C2; PT2231708E; US20110038867A1; IL206280A0; PL2231708T3; CN101918449A; JP2011506371A; EP2231708B1; DK2231708T3; RU2010128556A; AU2008334912A1; BRPI0820877A2; ZA201004271B; HRP20150457T1; HRP20150409T1; MX2010006450A

Abstract

Anticuerpo seleccionado de (i) un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo que se une a antígeno, específico para proteína de ligando Fas (FasL) humano, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en el que las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la cadena pesada son: (a1) CDR H1: Asn Tyr Trp Ile Gly (SEC ID NO: 1), (b1) CDR H2: Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly (SEC ID NO: 2), (c1) CDR H3: Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr (SEC ID NO: 3) y las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la cadena ligera son (a2) CDR L1: Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Thy Leu Gly (SEC ID NO: 4), (b2) CDR L2: Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEC ID NO: 5), (c2) CDR L3: Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr (SEC ID NO: 6) para uso en la prevención y/o tratamiento de pénfigo.

Description

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DESCRIPCIÓN

Remedios para pénfigo que contienen anticuerpos contra el ligando Fas

La presente invención se refiere al uso de antagonistas del ligando Fas humano (también denominado CD95L o Apo1L, y abreviado aquí en lo sucesivo como FasL), más particularmente al uso de anticuerpos humanizados frente a FasL para la prevención y/o tratamiento de enfermedades de la piel asociadas con acantólisis de queratinocitos, particularmente para la prevención y/o tratamiento de pénfigo.

El pénfigo es una afección de la piel ampollosa autoinmunitaria caracterizada por pérdida de adhesión queratinocítica debido a autoanticuerpos dirigidos contra proteínas desmosómicas (desmogleínas, dsg). El pénfigo tiene una distribución amplia en el mundo, con una incidencia de aproximadamente 1-5 por 100.000 por año, y con una predominancia de las mujeres.

El pénfigo se caracteriza por pérdida de adhesión de queratinocitos suprabasales que termina en un proceso denominado acantólisis. La patogénesis del pénfigo está sufriendo una revisión importante, principalmente debido a que, además de anticuerpos anti-desmogleínas, un nuevo grupo de anticuerpos anti-receptor colinérgico puede inducir acantólisis (Kalish, 2000). Además, se ha demostrado que el impedimento estérico solo no puede dar cuenta de la formación de ampollas con la unión antígeno-anticuerpo (Kitajima, 2002). Además, se demostró que la formación de desmosomas no está inhibida por autoanticuerpos del pénfigo (PVIgG) que se unen a pénfigo, mientras que las conexiones desmosómicas se disocian 24-36 h después del tratamiento con PvIgG. Durante este tiempo, tiene lugar una serie de etapas de transducción de señales disparadas por PVIgG.

Estas observaciones sugieren un papel para la apoptosis en el pénfigo. De hecho, el pénfigo es una enfermedad debido a la falta de adhesión celular (Payne AS et al, 1978), y se puede producir apoptosis en asociación con el desprendimiento celular (Marconi et al, 2004). Estos conceptos están completamente confirmados por la detección de apoptosis en piel con pénfigo lesional. En particular, las células acantolíticas expresan los marcadores principales de la apoptosis (Wang X et al, 2004). De forma más interesante, también se encuentran núcleos de marcaje por TUNEL unidas al techo de la ampolla, sugiriendo la presencia de células apoptóticas en piel perilesional antes del desprendimiento. Además, en el borde de la lesión se detectan células apoptóticas que expresan Ig y caspasa-8 activada, en áreas en las que no es visible ninguna interrupción de los contactos célula con célula (Wang X et I, 2004). Estos datos demuestran definitivamente que, en el pénfigo, la apoptosis tiene lugar en queratinocitos antes de la acantólisis.

La apoptosis desempeña un papel fundamental en la regulación de la homeostasis celular, y está implicada en muchos procesos patofisiológicos. La apoptosis puede resultar tanto del desprendimiento de célula a célula (Rezgui et al, 2000; Bergin et al, 2000) como de la pérdida de interacción célula-matriz (Giancotti y Ruoslahti, 1999).

Fas (o FasR) es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF que, al unirse con el ligando Fas (FasL), dispara la apoptosis en muchos sistemas celulares (Sharma et al, 2000). La señalización intracelular de apoptosis inducida por Fas-FasL opera vía el reclutamiento de un número de moléculas adaptadoras tales como FADD (dominio de muerte asociado a Fas) y FLICE (ICE similar a FADD, caspasa 8), que a su vez es inhibida por FLIP (proteína inhibidora de FLICE) (Juo et al, 1998). La interacción Fas-FasL está implicada en los patomecanismos de varias afecciones inmunitarias-inflamatorias e infecciosas, tales como SIDA (Bahr et al, 1977) y lupus eritematoso sistémico (Kovacs et al, 1997). Las enfermedades cutáneas caracterizadas por una implicación de la ruta Fas-FasL incluyen enfermedad aguda de hospedante frente a injerto, necrólisis epidérmica tóxica y melanoma (Wehrli et al, 2000). Además, se dio a conocer que se observan lesiones de tipo acantolíticas en queratinocitos cultivados tratados tanto con PVIgG como con anti-FasR, mientras que PvIgG induce el agrupamiento de FasR, FasL y caspasa-8 en la membrana celular varias horas después de la formación de las lesiones (Wang X et al, 2004). Además, se dio a conocer que el inhibidor similar a caspasa-1 bloqueó significativamente la formación de ampollas en el modelo de ratón de pénfigo (Li et al, 2006). Tomados en conjunto, estos datos indican que FasL y la ruta apoptótica extrínseca desempeñan un papel crítico en los mecanismos que subyacen a la acantólisis.

Cualquiera que sea la naturaleza de los autoanticuerpos del pénfigo, la exposición a PVIgG aumenta la expresión de varios genes proapoptóticos, incluyendo FasL, muchas horas antes de la acantólisis. Además, IgG intravenosa (IVIgG) evita el aumento, inducido por PvIgG, de FasL y apoptosis en queratinocitos. IVIgG también evita la acantólisis y la apoptosis in vivo (Arredondo J et al, 2005).

Puviani et al. (J. Investigative Dermatology, vol. 120, nº 1, enero 2003, páginas 164-169) describen que la adición de anticuerpos neutralizantes anti-FasL inhibe parcialmente la apoptosis de queratinocitos inducida por sueros con pénfigo in vitro. Puviani et al. no proporcionan ninguna prueba de un efecto sobre la acantólisis o de la eficacia in vivo de dichos anticuerpos.

Sin tratamiento, la mortalidad del pénfigo vulgar se aproxima a 100%. Es necesaria la terapia sistémica prematura para controlar el pénfigo, pero los efectos secundarios debidos a la terapia sistémica son una complicación importante. El tratamiento incluye la administración de corticosteroides, medicaciones que contienen oro, el fármaco antiinflamatorio dapsona, o medicaciones que suprimen el sistema inmunitario (tal como azatioprina, metotrexato, ciclosporina, ciclofosfamida, o micofenolato mofetilo). El tratamiento más habitual para pénfigo es actualmente los

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esteroides, que necesitan ser administrados durante toda la vida y pueden provocar efectos secundarios graves. La mayoría de los pacientes con pénfigo mueren debido a estos efectos secundarios. Algunos antibióticos también son eficaces, particularmente minociclina y doxiciclina. Ocasionalmente se usa inmunoglobulina intravenosa (IVIg). La plasmaféresis es un proceso mediante el cual se elimina de la sangre plasma que contiene anticuerpos y se sustituye por fluidos intravenosos o plasma donado. La plasmaféresis se puede usar además de las medicaciones sistémicas para reducir la cantidad de anticuerpos en el torrente sanguíneo. También está bajo desarrollo un número de nuevas moléculas: micofenolato mofetilo, PI-0824, PRTX-100, anti-CD20 son fármacos inmunosupresores que actúan sobre células T y B.

La tasa de mortalidad actual todavía oscila de 5 a 25%; la infección es la causa más frecuente de muerte, y la terapia inmunosupresora a largo plazo (principalmente corticosteroide) es uno de los factores significativos que todavía provocan una tasa elevada de mortalidad. La inmunoglobulina puede producir cierta mejora a corto plazo, pero no parece inducir remisiones duraderas, y su coste hace muy poco práctico el uso a largo plazo.

También hay varias advertencias en el uso de la plasmaféresis. Los pacientes suprimidos con prednisona u otros agentes inmunosupresores y que reciben plasmaféresis tienen un mayor riesgo de muerte repentina por septicemia. Además, el tratamiento es muy caro, y es necesario un período de hospitalización de 2 semanas para administrar la terapia. Por lo tanto, debido al riesgo de muerte repentina por septicemia y al coste elevado, la plasmaféresis está indicada solamente en los casos más refractarios, en los que el paciente está claramente en riesgo de morir por la propia enfermedad.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un agente terapéutico para pénfigo. El desarrollo de un nuevo fármaco que bloquee FasL permitiría evitar completamente el desprendimiento celular y la formación de la lesión de la piel.

En general, la presente invención se refiere al tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantólisis de queratinocitos mediante la administración de un antagonista de FasL. Los antagonistas de FasL se pueden seleccionar de anticuerpos anti-FasL, particularmente anticuerpos humanos o humanizados anti-FasL, moléculas efectoras de ácido nucleico de la expresión de Fas, tales como moléculas antisentido, o moléculas capaces de la interferencia por ARN, tales como moléculas de ARNip, moléculas del receptor de Fas solubles, muteínas de FasL antagonistas, y compuestos químicos de peso molecular bajo que inhiben la interacción Fas-FasL. Los antagonistas de FasL evitan la apoptosis de queratinocitos y el desprendimiento subsiguiente de célula-célula (acantólisis). De este modo, los antagonistas de FasL son particularmente adecuados para la prevención y/o tratamiento de pénfigo, por ejemplo para la prevención y/o tratamiento de pénfigo mucocutáneo.

La presente invención se refiere a un medicamento que contiene al menos un compuesto que inhibe los efectos biológicos de FasL. La expresión “compuesto que inhibe los efectos biológicos de FasL”, usada aquí, se refiere a todos los compuestos que pueden inhibir o neutralizar completamente o al menos sustancialmente los efectos biológicos de FasL. Por ejemplo, el efecto inhibidor o neutralizante se puede basar en la supresión de la unión de FasL a su receptor natural, y por lo tanto las transmisiones de señales así causadas. Esto se puede lograr, por ejemplo, usando anticuerpos que se unen a FasL per se, o receptores solubles que imitan a Fas, o muteínas de FasL antagonistas, bloqueando así la unión de FasL a los receptores celulares. La interferencia con la expresión de Fas o FasL mediante ARNip bloqueará el sistema Fas/FasL.

La terapia antagonista de FasL es una monoterapia o se puede dar en combinación con otros medicamentos adecuados para el tratamiento de pénfigo u otras enfermedades de la piel, particularmente como se describe anteriormente. Por ejemplo, una combinación de terapia de antagonistas de FasL y esteroides puede permitir una drástica reducción de las dosis de esteroides.

En una realización preferida de la presente invención, se proporciona un agente terapéutico para pénfigo, que comprende un anticuerpo frente a un ligando Fas humano, o un fragmento activo del mismo, como ingrediente activo. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo anti-FasL quimérico, humanizado o humano, o un fragmento o derivado que se une al antígeno, por ejemplo un anticuerpo monocatenario recombinante. Si se desea, el anticuerpo se puede conjugar a moléculas efectoras, por ejemplo compuestos citostáticos, citotóxicos y/o radioactivos.

Los anticuerpos humanizados preferidos adecuados para el tratamiento de la enfermedad de la piel asociada con acantólisis de queratinocitos, en particular pénfigo, según la presente invención, se describen en el documento WO 1997/002290A1 (“Anticuerpos anti-ligando Fas y método de ensayo que usa el mismo anticuerpo”) o en el documento WO 1998/010070 A1 (“Inmunoglobulina humanizada que reacciona específicamente con ligando Fas o sus fragmentos activos y región que induce apoptosis que se origine en anticuerpos humanizados frente al Ligando Fas”).

Otros anticuerpos humanos preferidos adecuados para el tratamiento de la enfermedad de la piel asociada con acantólisis de queratinocitos, en particular pénfigo, según la presente invención, se describen en el documento US

7.262.277 (“Anticuerpos humanos antagonistas anti-ligando hFas y sus fragmentos”).

Los anticuerpos humanos o humanizados tienen al menos tres ventajas potenciales con respecto al ratón y en algunos casos anticuerpos quiméricos para uso en terapia humana: 1) debido a que la porción efectora es humana,

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puede interactuar mejor con las otras partes del sistema humano; 2) el sistema inmunitario humano no debería reconocer el armazón o región C del anticuerpo humanizado como extraño, y por lo tanto la respuesta de anticuerpo frente a tal anticuerpo inyectado debería ser menor que frente a un anticuerpo de ratón totalmente extraño o un anticuerpo quimérico parcialmente extraño; 3) los anticuerpos humanizados inyectados presumiblemente tendrán una semivida más probable que la de los anticuerpos humanos de origen natural, permitiendo que se administren dosis más pequeñas y menos frecuentes.

Otros antagonistas de FasL preferidos son moléculas de FasR solubles que comprenden la parte soluble extracelular del receptor de Fas, o moléculas de FasL antagonistas modificadas que tienen actividad antagonista competitiva o no competitiva. Estas moléculas inhiben las interacciones FasL/FasR por cuanto FasL se une al análogo del receptor soluble, o la molécula de FasL antagonista se une al receptor natural reduciendo de ese modo

o eliminando totalmente la unión de FasL biológicamente activo al receptor natural. Durante el tratamiento con ARNip, se puede usar un análisis de los niveles de proteína de Fas y/o de FasL o los niveles de ARN para determinar el tipo de tratamiento y el curso de terapia en el tratamiento de un sujeto. La monitorización de los niveles de proteína Fas y/o FasL o los niveles de ARN se puede usar para predecir el resultado del tratamiento y determinar la eficacia de los compuestos y composiciones que modulan el nivel y/o actividad de ciertas proteínas Fas y/o FasL asociadas con un rasgo, afección, o enfermedad.

En un aspecto especialmente preferido, la presente invención se refiere a un anticuerpo seleccionado de

(i) un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo que se une a antígeno, específico para proteína de ligando Fas (FasL) humano, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en el que las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la cadena pesada son:

(a1) CDR H1: Asn Tyr Trp Ile Gly (SEC ID NO: 1),

(b1) CDR H2: Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly (SEC ID NO: 2),

(c1) CDR H3: Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr (SEC ID NO: 3)

y las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la cadena ligera son

(a2) CDR L1: Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Thy Leu Gly (SEC ID NO: 4),

(b2) CDR L2: Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEC ID NO: 5),

(c2) CDR L3: Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr (SEC ID NO: 6)

para uso en la prevención y/o tratamiento de pénfigo.

También se describe aquí un anticuerpo, o un fragmento del mismo que se une a antígeno, que reconoce el mismo epítopo en FasL humana como el anticuerpo (i) descrito anteriormente, para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantólisis de queratinocitos, particularmente de pénfigo.

Además, la presente memoria descriptiva describe el uso de

(i): un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo que se une a anticuerpo, específico para la proteína del ligando Fas (FasL) humano, en el que el anticuerpo monoclonal se produce mediante la célula hibridoma bajo el número de acceso FERM BP-5045 o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo derivado de aquella, o

(ii): un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo que se une a antígeno, que reconoce el mismo epítopo de FasL humano como el anticuerpo de (i)

para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantólisis de queratinocitos, particularmente de pénfigo.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un anticuerpo seleccionado de

(a1) CDR H1: Glu Tyr Pro Met His (SEC ID NO: 7),

(b1) CDR H2: Met Ile Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly (SEC ID NO: 8),

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(c1) CDR H3: Phe Tyr Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr (SEC ID NO: 9) y/o las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la cadena ligera son (a2) CDR L1: Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn (SEC ID NO: 10), 5 (b2) CDR L2: Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser (SEC ID NO: 11),

(c2) CDR L3: Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp Thr (SEC ID NO: 12) para uso en la prevención y/o tratamiento de pénfigo. También se describe aquí un anticuerpo, o un fragmento del mismo que se une a antígeno, que reconoce el mismo

epítopo de FasL humano como el anticuerpo de (i) descrito anteriormente, para la fabricación de un medicamento 10 para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantólisis de queratinocitos, particularmente de pénfigo. La presente memoria descriptiva describe además el uso de

(i) un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo que se une a anticuerpo, específico para la proteína del ligando Fas (FasL) humano, en el que el anticuerpo monoclonal se produce mediante la célula hibridoma

15 bajo el número de acceso FERM BP-5533, FERM BP-5534 y/o FERM BP-5535 o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo derivado de aquella, o

(ii) un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo que se une a antígeno, que reconoce el mismo epítopo de FasL humano como el anticuerpo de (i)

para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la piel asociada 20 con acantólisis de queratinocitos, particularmente de pénfigo.

La presente memoria descriptiva describe además

el uso de anticuerpos humanos anti-FasL, o sus porciones de unión a antígeno, que comprenden una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada como se describe en el documento US 7.262.277.

En particular, los anticuerpos humanos anti-FasL adecuados para el tratamiento de enfermedad de la piel asociada

25 con acantólisis de queratinocitos descritos aquí comprenden una región variable de cadena ligera que comprende un polipéptido con la secuencia mostrada en SEC ID NO 2 del documento US 7.262.277, y que comprenden además una región variable de cadena pesada que comprende un polipéptido con la secuencia mostrada en SEC ID NO 10 ó 18 del documento US 7.262.277.

Más particularmente, la memoria descriptiva describe el uso del anticuerpo humano anti-hFas 3E1 y/o 4G11 como 30 se describe en el documento US 7.262.277, para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de enfermedad de la piel asociada con acantólisis de queratinocitos, particularmente de pénfigo.

En este aspecto, la presente memoria descriptiva describe el uso de

(i) un anticuerpo humano monoclonal, o un fragmento del mismo que se une a antígeno, específico para proteína de ligando Fas (FasL) humano, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende al menos una 35 región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en el que las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la cadena pesada son: (a1) CDR H1: Arg His Gly Ile Thr (SEC ID NO: 13), o (a2) CDR H1: Ser His Gly Ile Ser (SEC ID NO: 14), (b1) CDR H2: Trp Ile Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val Gln Gly (SEC ID NO: 15), 40 (b2) CDR H2: Trp Ile Asn Ala Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly (SEC ID NO: 16), (c1) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Leu Asp Tyr (SEC ID NO: 17) o

(c2) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Cys Asp Tyr (SEC ID NO: 18), o (d1) una secuencia derivada sustituyendo 1, 2 ó 3 aminoácidos de las SEC ID NOs 13, 14, 15, 16, 17 y/o 18,

45 y/o las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la cadena ligera son

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(a3) CDR L1: Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala (SEC ID NO: 19),

(b3) CDR L2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEC ID NO: 20),

(c3) CDR L3: Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr (SEC ID NO: 21) o

(d3) una secuencia derivada sustituyendo 1, 2 ó 3 aminoácidos de las SEC ID NOs: 19, 20 y/o 21

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(ii) un anticuerpo, o un fragmento del mismo que se une a antígeno, que reconoce el mismo epítopo en FasL humana como el anticuerpo (i),

10 Finalmente, la presente memoria descriptiva describe el uso de

(i) un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo que se une a antígeno, específico para la proteína del ligando Fas (FasL) humano, en el que el anticuerpo monoclonal se produce mediante la célula hibridoma bajo el número de acceso ATCC PTA-4017 y/o ATCC PTA-4018 o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo derivado de aquella, o

15 (ii) un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo que se une a antígeno, que reconoce el mismo epítopo de FasL humano como el anticuerpo de (i)

El medicamento de la presente invención se puede proporcionar como una composición farmacéutica junto con un

20 vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la composición farmacéutica se administra mediante inyección o infusión, por ejemplo intravenosamente, intraarterialmente, subcutáneamente, intraperitonealmente o por otros medios adecuados. La composición se puede administrar local o sistémicamente. Preferiblemente, la composición se administra sistémicamente.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en la invención comprenden el agente activo en una cantidad

25 eficaz para lograr el fin pretendido. Una dosis eficaz de un medicamento de la presente invención puede estar en el intervalo de 0,1 g a 100 mg, hasta una dosis total de alrededor de 1 g, dependiendo de la vía de administración. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar diariamente, por ejemplo una o varias veces, o cada dos a cuatro días, cada semana, o una vez cada dos semanas. El medicamento se puede administrar en un único ciclo de tratamiento que consiste en una o varias administraciones del medicamento, o en varios ciclos de tratamiento que

30 consisten cada uno en una o varias administraciones del medicamento. Cada ciclo de tratamiento puede tener una duración de un día hasta varias semanas, meses, o incluso años.

Por tanto, según la presente invención, el medicamento también se puede usar en una terapia de combinación con al menos una terapia adicional eficaz frente a una enfermedad de la piel asociada con acantólisis de queratinocitos, y en particular frente a pénfigo. El medicamento se puede usar solo o en combinación con otros fármacos

35 inmunosupresores, particularmente con esteroides, a fin de reducir su dosis y/o para minimizar sus efectos secundarios crónicos. Cuando se usa en combinación, el medicamento se administrará preferiblemente en una base mensual. Cuando se usa solo, el medicamento se administrará preferiblemente de forma continua en un marco de tiempo dependiendo del caso individual.

Además, la presente invención se explicará con más detalle mediante los siguientes ejemplos.

40 Ejemplos

En primer lugar se evaluó la presencia de apoptosis en epidermis de piel perilesional en secciones congeladas procedentes de pacientes con pénfigo sin tratar, mediante tinción de TUNEL. Las muestras fluorescentes se analizaron mediante microscopía confocal de barrido por láser. En capas suprabasales de epidermis perilesional, la mayoría de los queratinocitos son apoptóticos, en comparación con la piel normal (Fig 1).

45 A fin de confirmar la apoptosis en lesiones de pénfigo, se usaron biopsias fijadas con formalina y embebidas en parafina y se detectó la forma activa de caspasa-3. El protocolo de tinción se llevó a cabo mediante UltraVision LP Detection System AP Polymer and Fast Red Chromogen (Lab Vision Corporation, CA, USA) según la instrucción del fabricante. La visualización se obtuvo con comprimidos de Fast Red en sustrato de fosfato de naftol. En muestras de pénfigo, se encontró que el fragmento de caspasa-3 está situado tanto en el techo como en el suelo de la ampolla,

50 siendo algunas células positivas en epidermis perilesional (Fig 2). Este resultado parece indicar que la muerte celular de queratinocitos se produce antes del desprendimiento de los queratinocitos que conduce a acantólisis.

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Puesto que los queratinocitos apoptóticos están expresados abundantemente en pénfigo, se deseó explorar si los sueros de pénfigo son capaces de inducir apoptosis en queratinocitos humanos normales. Para este fin, se sembraron queratinocitos en placas en portaobjetos de cámara y se cultivaron en medio libre de suero (KGM) hasta la preconfluencia. Las células se cultivaron entonces en medio basal de queratinocitos y se trataron durante 48 h con la adición de 25% de suero procedente de pacientes no tratados o de pacientes tratados con corticosteroides sistémicos. Como controles, se usaron sueros de sujetos sanos. La apoptosis se evaluó mediante tinción de TUNEL in situ. Se evaluaron aproximadamente 100 células, en campos seleccionados al azar, y se contó el porcentaje de células positivas para TUNEL. Los sueros de pénfigo pero no de sujetos sanos o pacientes que se encuentran bajo tratamiento con esteroides indujeron apoptosis en queratinocitos humanos (Fig 3A-B).

Puesto que el sistema Fas/FasL está implicado en muchos procesos apoptóticos también a nivel de la piel (Wehrli et al, 2000), se midieron los niveles de FasL en sueros de pacientes con pénfigo mediante un inmunoensayo enzimático de dos sitios (ELISA). La concentración de suero se determinó mediante absorbancia a 450 nm frente a proteína estándar FasL humana recombinante. Los niveles de FasL fueron muy elevados en sueros procedentes de pacientes sin tratar, y estaban por debajo del límite de detección en sueros procedentes de pacientes tratados con corticosteroides o en sueros procedentes de sujetos sanos. Los sueros procedentes de pacientes con HBV se usaron como control positivo (Fig 4A). En un paciente, los niveles de FasL disminuyeron progresivamente con la terapia de esteroides sistémica (Fig 4B).

Puesto que FasL está contenido en cantidades elevadas en sueros de pénfigo, se observó la expresión de su receptor cognado FasR. Para este fin, se usaron biopsias fijadas con formalina y embebidas en parafina. El protocolo de tinción se llevó a cabo mediante UltraVision LP Detection System AP Polymer and Fast Red Chromogen (Lab Vision Corporation, CA, USA) según la instrucción del fabricante. La visualización se obtuvo con comprimidos de Fast Red en sustrato de fosfato de naftol. Mientras que FasR se expresa solamente en queratinocitos basales en piel normal, en lesiones penfigosas activas, FasR se detecta tanto en las células basales como en las células suprabasales. Incluso más intrigante, en pénfigo mucocutáneo (PMC), FasR parece expresarse a lo largo de las capas epidérmicas, e incluso antes de la formación de las ampollas (Fig 5).

FasL es uno de los disparadores principales de la ruta apoptótica extrínseca activada por caspasa-8. Por lo tanto, se deseó evaluar si esta ruta desempeña un papel en la apoptosis de pénfigo. Para este fin, sueros de pacientes se pretrataron con anticuerpo neutralizante anti-FasL o con inhibidor de caspasa-8, y se añadieron a cultivos de queratinocitos. Los queratinocitos se cultivaron en KGM y se trataron con sueros de pénfigo o con sueros de pacientes sin tratar. Los sueros se pretrataron con anticuerpo neutralizante anti-FasL (2,5 mg por ml durante 30 min.) o con inhibidor de caspasa-8 Z-IETD-FMK (100 M durante 30 min.). La apoptosis se evaluó mediante tinción de TUNEL. La adición de anticuerpo neutralizante anti-FasL o de inhibidor de caspasa-8 evitó parcialmente la apoptosis de queratinocitos inducida por sueros de pénfigo (Fig 6).

Además, los queratinocitos se trataron como en la Fig 6 y se les proporcionó anticuerpo anti-FasL o inmunoglobulinas irrelevantes. Las células se homogeneizaron entonces en tampón RIPA para el análisis mediante transferencia Western. Las membranas se incubaron con anticuerpos anti-caspasa-8 humana o anti-b-actina. La intensidad relativa de las bandas en autorradiogramas se cuantificó mediante densitometría de barrido por láser. Los resultados muestran que caspasa-8 estaba notablemente activada en queratinocitos tratados con sueros de pénfigo, en comparación con células no tratadas, mientras que la escisión de la caspasa se inhibió parcialmente mediante pretratamiento con anticuerpo anti-FasL (Fig. 7).

Tomados juntos, estos datos sugieren que los sueros de pénfigo inducen apoptosis de queratinocitos a través de la ruta apoptótica extrínseca disparada por el sistema Fas/FasL.

Estudios recientes han mostrado que los componentes del complejo de adhesión cadherina-catenina en uniones adherentes epiteliales son seleccionados como dianas por las caspasas durante la apoptosis (Weiske et al, 2001). A fin de evaluar si la ruta apoptótica inducida por Fas/FasL es también responsable de la separación desmosómica, se trataron durante 72 h queratinocitos confluentes, se cultivaron en KGM en presencia de CaCl2 1,8 mM, con sueros de pénfigo con o sin terapia. Los extractos proteicos del cultivo se analizaron mediante transferencia Western usando anticuerpos anti-Dsg1 y anti-Dsg3. Como control interno, se usó -actina. Se encontró que los sueros de pénfigo pueden escindir Dsg1 y Dsg3. En particular, los sueros procedentes de pacientes no tratados, pero no los de pacientes bajo terapia con esteroides, escinden sorprendentemente Dsg1 y Dsg3 (Fig 8).

De forma más importante, el tratamiento de queratinocitos con cantidades crecientes de FasL (0,1, 10, 100 ng/ml) durante 72 h escindió dsgs de manera dependiente de la dosis. Los extractos proteicos del cultivo se analizaron mediante transferencia Western usando anticuerpos anti-Dsg1 y anti-Dsg3. Como control interno, se usó -actina. Estas dosis son consistentes con las detectadas en sueros de pénfigo (Fig 9).

Puesto que FasL ejerce un papel importante en la patogénesis de pénfigo, se ensayó un anticuerpo anti-FasL (NOK2, anticuerpo producido por la estirpe de célula de hibridoma NOK2, número de acceso FERM BP-5045). Queratinocitos confluentes, cultivados en KGM con CaCl2 1,8 mM, se trataron durante 72 h con: 1. KGM solo; 2. Ab anti-FasL (NOK2, 15 g/ml); 3. FasL (50 ng/ml); 4. FasL + Ab anti-FasL. Se presentan pruebas de que Ab anti-FasL (NOK2) evita la escisión de dsg inducida por FasL. También se muestra que Ab anti-FasL (NOK2) inhibe la

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apoptosis inducida por caspasa-8 (Fig 10A). La Fig 10B muestra que Ab anti-FasL (NOK2) evita el desprendimiento de célula a célula inducido por FasL, es decir, la acantólisis.

A fin de confirmar adicionalmente el papel central de FasL, se han usado otros anticuerpos anti-FasL (F918-7-3, anticuerpo producido por la estirpe de célula de hibridoma con el número de acceso FERM BP-5533; F918-7-4, anticuerpo producido por la estirpe de célula de hibridoma con el número de acceso FERM BP-5534; F919-9-18, anticuerpo producido por la estirpe de célula de hibridoma con el número de acceso FERM BP-5535). Queratinocitos confluentes, cultivados en KGM con CaCl2 1,8 mM, se trataron durante 72 h con: KGM solo; FasL recombinante (50 ng/ml); medio de hibridoma diluido 1:1 en KGM; FasL + medio de hibridoma a diferente dilución en KGM. Se presentan pruebas de que los anticuerpos anti-FasL evitan la escisión de dsg3 inducida por FasL de una manera dependiente de la dosis (Fig 11A y Fig 11B), inhibiendo la activación de apoptosis inducida por caspasa-8 (Fig 11A). La Fig 11C muestra que el Ab anti-FasL contenido en el medio de la estirpe de célula de hibridoma FERM BP-5535 evita el desprendimiento de célula a célula inducido por FasL, es decir, la acantólisis.

Para investigar si la ruta apoptótica extrínseca es responsable de la escisión de dsg, se pretrataron queratinocitos confluentes con el inhibidor de caspasa-8 Z-IETD-FMK (100 M durante 30 min.) o con Ab anti-FasL (NOK2, 15 g/ml). Después, las células se incubaron durante 72 h con sueros sanos o de pénfigo sin tratar. Los extractos proteicos del cultivo se analizaron mediante transferencia Western usando anticuerpos anti-Dsg3 y Ab anti-caspasa

8. Como control interno, se usó vinculina. (Fig 12A). La Fig 12B muestra que el desprendimiento de células (es decir, la acantólisis) se evita mediante Ab anti-FasL o mediante inhibidor de caspasa-8. Estos resultados indican que la inhibición de FasL o la ruta apoptótica activada por caspasa-8 evita tanto la activación de caspasa-8 como la escisión de dsg, bloqueando así la acantólisis.

En conclusión, se ha mostrado que FasL ejerce actividad dual, tanto activando la ruta apoptótica extrínseca mediada por caspasa-8 como la escisión de Dsg. De acuerdo con nuestro trabajo, Wang y colaboradores (Wang et al, 2004) han sugerido que la apoptosis podría ser la causa del fenómeno acantolítico. Mostraron que PV-IgG y un anticuerpo contra el receptor de Fas (anti-FasR) inducen lesiones in vitro de manera similar, provocando: (1) secreción de FasL soluble; (2) cantidades celulares elevadas de proteínas FasR, FasL (soluble y membranaria), Bax y p53; (3) reducción en niveles de Bcl-2 celular; (4) enriquecimiento en caspasa 8, y activación de caspasas 1 y 3; (5) coagregación de FasL y FasR con caspasa 8 en el complejo de señalización inductor de muerte (DISC) membranario. Por tanto, la ruta de señalización de muerte mediada por Fas parece que está implicada en la formación de lesiones.

Para estudiar el pénfigo, se ha usado ampliamente y desde hace mucho tiempo un modelo de animal bien establecido. La transferencia pasiva de PVIgG a ratones neonatos induce el desprendimiento celular y la formación de las ampollas. Este modelo se ha usado para evaluar la implicación de apoptosis y FasL en la patogénesis de pénfigo. Se inyectó subcutáneamente PVIgG (5 mg/g/peso corporal) purificado de sueros de pacientes en ratones C57BL/6N Crl neonatos. Los ratones neonatos normales tratados con IgG purificada a partir de sueros de individuos sanos (NIgG) se usarán como controles. Los animales se sacrificaron 20 horas después de la inyección.

La tinción con hematoxilina y eosina muestra que la ampolla se desarrolla solamente en ratones tratados con PVIgG, pero no en ratones tratados con IgG humana normal (Fig 13A). La apoptosis se detectó mediante TUNEL o mediante activación de caspasa-3 solamente en ratones tratados con PVIgG (Fig 13B).

A fin de evaluar el papel de FasL in vivo, los ratones se trataron con PVIgG o PVIgG más anticuerpo anti-FasL (clon MFL3, específico para ratón). Anti-FasL (40 g/ratón) se administró 3 h después de la inyección de PVIgG y evitó la formación de ampollas en ratones, como se muestra mediante tinción de H y E. Además, la longitud de las hendiduras en ratones tratados con anti-FasL se redujo notablemente (Fig 14).

En conclusión, se ha mostrado que FasL ejerce actividad dual, tanto activando la ruta apoptótica extrínseca mediada por caspasa-8 como la escisión de Dsg. De forma más importante, el bloqueo de FasL protege de la acantólisis in vitro e in vivo.

Referencias

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Claims

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REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo seleccionado de

(i) un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo que se une a antígeno, específico para proteína de ligando Fas (FasL) humano, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en el que las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la cadena pesada son:

(a1) CDR H1: Asn Tyr Trp Ile Gly (SEC ID NO: 1),

(b1) CDR H2: Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly (SEC ID NO: 2),

(c1) CDR H3: Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr (SEC ID NO: 3)

y las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la

cadena ligera son

(a2) CDR L1: Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Thy Leu Gly (SEC ID NO: 4),

(b2) CDR L2: Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEC ID NO: 5), (c2) CDR L3: Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr (SEC ID NO: 6) para uso en la prevención y/o tratamiento de pénfigo.
2. Anticuerpo seleccionado de

(i) un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo que se une a antígeno, específico para proteína de ligando Fas (FasL) humano, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en el que las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la cadena pesada son:

(a1) CDR H1: Glu Tyr Pro Met His (SEC ID NO: 7), (b1) CDR H2: Met Ile Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly (SEC ID NO: 8), (c1) CDR H3: Phe Tyr Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr (SEC ID NO: 9), y las secuencias de aminoácidos de

las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la cadena ligera son (a2) CDR L1: Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn (SEC ID NO: 10), (b2) CDR L2: Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser (SEC ID NO: 11), (c2) CDR L3: Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp Thr (SEC ID NO: 12) para uso en la prevención y/o

tratamiento de pénfigo.
3.

El anticuerpo para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno se selecciona de un anticuerpo parcial o totalmente humanizado, un anticuerpo monocatenario parcial o totalmente humanizado, o un fragmento del mismo.
4.

El anticuerpo para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en una terapia de combinación con al menos una terapia adicional eficaz frente a pénfigo.
5.

El anticuerpo para el uso según la reivindicación 4 combinación con al menos un fármaco inmunosupresor adicional, en particular con al menos un esteroide adicional.

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