ES2532746B1 - Computer-implemented method for dynamic characterization of cells in cell cultures and computer programs to carry out the method - Google Patents
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Abstract
Método implementado por ordenador para caracterización dinámica de células en cultivos celulares y programas informáticos para llevar a cabo el método.#El método comprende adquirir una secuencia de imágenes de fluorescencia de un cultivo celular; segmentar dicha secuencia de imágenes de fluorescencia e identificar la ubicación, forma y tamaño de cada célula que forma parte del cultivo; medir el nivel de fluorescencia de cada célula identificada para determinar una concentración de un ion de Calcio en cada célula identificada; estimular mediante un aporte externo de energía eléctrica dicho cultivo a una determinada frecuencia de estimulación; determinar la respuesta de cada célula identificada a dicha frecuencia de estimulación; y determinar una respuesta global de dicho cultivo estimulado mediante dicho aporte externo de energía eléctrica y analizar la propagación eléctrica de dicho estímulo en forma de una elevación local de la concentración del ion de Calcio a dicha frecuencia de estimulación.Method implemented by computer for dynamic characterization of cells in cell cultures and computer programs to carry out the method. # The method comprises acquiring a sequence of fluorescence images of a cell culture; segment said fluorescence image sequence and identify the location, shape and size of each cell that is part of the culture; measure the fluorescence level of each identified cell to determine a concentration of a calcium ion in each identified cell; stimulate said culture at an external stimulation frequency through an external supply of electrical energy; determine the response of each identified cell to said stimulation frequency; and determine a global response of said stimulated culture by means of said external input of electrical energy and analyze the electrical propagation of said stimulus in the form of a local elevation of the concentration of the calcium ion at said stimulation frequency.
Description
Método implementado por ordenador para caracterización dinámica de células en cultivos celulares y programas informáticos para llevar a cabo el método Computer-implemented method for dynamic characterization of cells in cell cultures and computer programs to carry out the method
Sector de la técnica 5 Technical sector 5
La presente invención concierne en un primer aspecto, en general, a un método implementado por ordenador para caracterización dinámica de células, tal como células cardiacas del tipo cardiomiocitos o células del sistema nervioso del tipo neuronas, en cultivos celulares, basado en imágenes de microscopia de fluorescencia, y en particular a un método que comprende identificar la respuesta 10 dinámica de dichas células a un estímulo externo de energía eléctrica, y analizar la propagación de dicho estímulo externo de energía eléctrica en forma de una elevación local de la concentración de un ion de Calcio (Ca2+) en dichas células. The present invention concerns in a first aspect, in general, a computer-implemented method for dynamic characterization of cells, such as cardiomyocyte-type cardiac cells or neuron-type nervous system cells, in cell cultures, based on microscopy images of fluorescence, and in particular to a method comprising identifying the dynamic response of said cells to an external electrical energy stimulus, and analyzing the propagation of said external electrical energy stimulus in the form of a local elevation of the concentration of an ion of Calcium (Ca2 +) in said cells.
Un segundo aspecto de la invención concierne a programas informáticos adaptados 15 para realizar algunas de las etapas del método del primer aspecto. A second aspect of the invention concerns computer programs adapted to perform some of the steps of the method of the first aspect.
Estado de la técnica anterior Prior art
Los cardiomiocitos son células cardiacas que tienen la particularidad de contraerse. La contracción se regula por la concentración del ion de Calcio (Ca2+) tanto en el 20 medio intracelular como en el extracelular, y para medir esta concentración normalmente se utiliza una técnica de microscopia de fluorescencia convencional o confocal. Generalmente, en un experimento típico se dispone de un cultivo de células cardiacas y se estimula eléctricamente un extremo del cultivo para ver cómo se propaga el impulso eléctrico a lo largo del cultivo en forma de un elevación local 25 de la concentración del ion de Calcio que se graba como una cantidad mayor de luz perteneciente a las regiones donde la concentración del ion de Calcio es más elevada. Cardiomyocytes are cardiac cells that have the peculiarity of contracting. The contraction is regulated by the concentration of calcium ion (Ca2 +) both in the intracellular and extracellular medium, and to measure this concentration a conventional or confocal fluorescence microscopy technique is normally used. Generally, in a typical experiment a culture of cardiac cells is available and one end of the culture is electrically stimulated to see how the electrical impulse propagates along the culture in the form of a local elevation of the concentration of the calcium ion that It is recorded as a larger amount of light belonging to regions where the concentration of calcium ion is highest.
Son conocidas diversas propuestas relativas para la clasificación de la respuesta 30 celular a dichos estímulos eléctricos, y de esta forma se permite realizar una caracterización de su dinámica, es decir, se modifica el ritmo de estimulación para poder observar cómo reacciona el cultivo. La mayoría de dichas propuestas se hallan descritas en artículos especializados, algunos de los cuales serán citados a Various relative proposals are known for the classification of the cellular response to said electrical stimuli, and in this way a characterization of its dynamics is allowed, that is, the stimulation rate is modified to be able to observe how the culture reacts. Most of these proposals are described in specialized articles, some of which will be cited to
continuación, y descritos brevemente, por considerarse como representativos del estado de la técnica más cercano a la presente invención. then, and briefly described, as considered representative of the state of the art closest to the present invention.
Por ejemplo, el documento ‘Stochastic Approximation Techniques Applied to Parameter Estimation in a Biological Model’ C. Renotte, A. Vande Wouwer, da a 5 conocer un proceso para modelar dinámicamente un conjunto de células animales a partir de un conjunto de datos experimentales. Para ello, utiliza unas variantes de unos algoritmos SP de primer y segundo orden y se aplican a la estimación estadística con máxima verosimilitud de parámetros cinéticos y a las condiciones iniciales un modelo de procesamiento biológico de mediciones experimentales 10 procedentes de unos cuantos componentes macroscópicos. For example, the document ‘Stochastic Approximation Techniques Applied to Parameter Estimation in a Biological Model’ C. Renotte, A. Vande Wouwer, discloses a process for dynamically modeling a set of animal cells from a set of experimental data. For this, it uses variants of first and second order SP algorithms and a biological processing model of experimental measurements 10 from a few macroscopic components is applied to the statistical estimation with maximum likelihood of kinetic parameters and to the initial conditions.
Por otro lado, el documento ‘Automated Semantic Analysis of Changes in Image Sequences of Neurons in Culture’ Omar Al-Kofahi, da a conocer un método automatizado para cuantificar el comportamiento dinámico de neuronas generando 15 varios niveles de detalle de las mismas. Para ello, el método utiliza un criterio de selección de modelo bayesiano que aprovecha un conjunto de cambios a corto plazo de los modelos de neuronas y toma en consideración pruebas adicionales aportadas por un cambio de una máscara de iluminación-insensible. On the other hand, the document ‘Automated Semantic Analysis of Changes in Image Sequences of Neurons in Culture’ Omar Al-Kofahi, discloses an automated method to quantify the dynamic behavior of neurons generating 15 various levels of detail of them. For this, the method uses a Bayesian model selection criterion that takes advantage of a set of short-term changes of the neuron models and takes into account additional evidence provided by a change of a light-insensitive mask.
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El documento, ‘Non-Invasive, Label Free, Quantitative Characterisation of Live Cells in Monolayer Culture’ Jing Zhang et al, describe el desarrollo de una nueva técnica para caracterizar poblaciones de células utilizando un microscopio óptico de onda evanescente y un software predictivo que permite el estudio cuantitativo de los procesos celulares y de células vivas de calidad en alta resolución sin el uso de 25 etiquetas. The document, 'Non-Invasive, Label Free, Quantitative Characterization of Live Cells in Monolayer Culture' Jing Zhang et al, describes the development of a new technique to characterize cell populations using an evanescent wave optical microscope and predictive software that allows the quantitative study of high-quality quality living cell and cell processes without the use of 25 labels.
Se conocen también algunas patentes relacionadas con el análisis dinámico de muestras biológicas, por ejemplo, el documento EP 2435834 que divulga un nuevo mecanismo que particularmente mide los estados transitorios del ion de Calcio en un 30 sistema celular. Some patents related to the dynamic analysis of biological samples are also known, for example, EP 2435834 which discloses a new mechanism that particularly measures the transient states of Calcium ion in a cellular system.
Sin embargo, en ninguna de las citadas propuestas se permite, al mismo tiempo y de una manera automática, relacionar conjuntamente la escala a nivel celular y la However, none of the aforementioned proposals allow, at the same time and in an automatic way, to jointly relate the scale at the cellular level and the
escala a nivel de tejido debido a que las técnicas de microscopía actuales no permiten obtener imágenes de cultivos celulares con la suficiente resolución como para adquirir el detalle de cada célula por separado, de este modo no es posible caracterizar o conocer cuando una respuesta individual de una célula tiene consecuencias en la respuesta colectiva. 5 Scale at tissue level because current microscopy techniques do not allow obtaining images of cell cultures with sufficient resolution to acquire the detail of each cell separately, thus it is not possible to characterize or know when an individual response of a cell has consequences in the collective response. 5
Explicación de la invención Explanation of the invention.
Por tanto, existe un interés general para poder caracterizar la propagación de ciertos iones, como el ion de Calcio (Ca2+), en cultivos celulares bajo un estímulo externo de energía eléctrica a nivel celular De este modo se puede relacionar la respuesta 10 dinámica de la concentración del ion de Calcio, de manera automática, tanto a nivel celular como a nivel de tejido. Therefore, there is a general interest to be able to characterize the propagation of certain ions, such as calcium ion (Ca2 +), in cell cultures under an external stimulus of electrical energy at the cellular level. In this way, the dynamic response of the Calcium ion concentration, automatically, both at the cellular level and at the tissue level.
El procedimiento propuesto se aplica a dicha finalidad y su gran utilidad, es por ejemplo, que se puede observar cómo se modifica la propagación del ion de Calcio 15 en función de: la concentración de fármacos candidatos para modular la dinámica del ion de Calcio+, o en función de la presencia de células con mutaciones genéticas con un marcador fluorescente que regulan la dinámica del ion de Calcio. The proposed procedure applies to this purpose and its great utility, for example, it can be seen how the propagation of Calcium ion 15 is modified based on: the concentration of candidate drugs to modulate the dynamics of Calcium + ion, or depending on the presence of cells with genetic mutations with a fluorescent marker that regulate the dynamics of the calcium ion.
La invención proporciona para ello, de acuerdo a un primer aspecto, un método 20 implementado por ordenador para caracterización dinámica de células en cultivos celulares. El método comprende a) adquirir una secuencia de imágenes de fluorescencia de un cultivo celular; b) segmentar dicha secuencia de imágenes de fluorescencia de dicho cultivo celular e identificar la ubicación, forma y tamaño de cada célula que forma parte de dicho cultivo celular; c) medir el nivel de 25 fluorescencia de cada célula identificada para determinar una concentración del ion de Calcio en cada célula identificada; d) estimular, mediante un aporte externo de energía eléctrica, dicho cultivo celular a una determinada frecuencia de estimulación; e) determinar la respuesta de cada célula identificada a dicha determinada frecuencia de estimulación; y f) determinar separadamente una respuesta global de 30 dicho cultivo celular, estimulado por el citado aporte externo de energía eléctrica, y analizar la propagación eléctrica de dicho estímulo eléctrico en forma de una elevación local de la concentración del ion de Calcio a dicha determinada frecuencia de estimulación. The invention provides for this, according to a first aspect, a method 20 implemented by computer for dynamic characterization of cells in cell cultures. The method comprises a) acquiring a sequence of fluorescence images of a cell culture; b) segmenting said sequence of fluorescence images of said cell culture and identifying the location, shape and size of each cell that is part of said cell culture; c) measure the level of fluorescence of each identified cell to determine a concentration of the calcium ion in each identified cell; d) stimulate, by means of an external contribution of electrical energy, said cell culture at a certain stimulation frequency; e) determine the response of each identified cell to said particular stimulation frequency; and f) separately determining an overall response of said cell culture, stimulated by said external input of electrical energy, and analyzing the electrical propagation of said electrical stimulus in the form of a local elevation of the concentration of the calcium ion at said particular frequency of stimulation
Generalmente la metodología consiste en tres tramos de estimulación donde, partiendo de un estado de reposo, se estimula a un ritmo (frecuencia) cada vez con mayor velocidad hasta alcanzar una situación de inestabilidad. De este modo se puede emular por ejemplo una situación de exigencia cardiaca. 5 Generally the methodology consists of three stretches of stimulation where, starting from a state of rest, it is stimulated at a rate (frequency) with increasing speed until reaching a situation of instability. In this way, for example, a situation of cardiac demand can be emulated. 5
Además, en una realización preferida y característica del método propuesto, se correlaciona la respuesta de cada célula identificada a dicha determinada frecuencia de estimulación con la respuesta global de dicho cultivo celular permitiendo determinar la incidencia de dicha respuesta de cada célula con dicha respuesta 10 global. In addition, in a preferred and characteristic embodiment of the proposed method, the response of each identified cell is correlated to said certain stimulation frequency with the overall response of said cell culture allowing determining the incidence of said response of each cell with said global response.
Las imágenes de fluorescencia preferiblemente son obtenidas mediantes técnicas de microscopía de fluorescencia convencional o confocal. En cuanto al tipo de células sobre las que es posible aplicar el método propuesto por la invención, éstas pueden 15 ser células excitables como miocitos, en particular cardiomiocitos, o células del sistema nervioso del tipo neuronas, en función del ejemplo de realización. Fluorescence images are preferably obtained through conventional or confocal fluorescence microscopy techniques. As for the type of cells on which it is possible to apply the method proposed by the invention, these may be excitable cells such as myocytes, in particular cardiomyocytes, or cells of the nervous system of the neuron type, depending on the embodiment example.
La segmentación de la secuencia de imágenes se realiza, según un ejemplo de realización, mediante un filtro, por ejemplo un filtro Watershed, adaptado al tamaño 20 de la célula que se quiera identificar. The segmentation of the image sequence is carried out, according to an example of embodiment, by means of a filter, for example a Watershed filter, adapted to the size 20 of the cell to be identified.
Preferiblemente, en la mencionada etapa c), se normaliza el nivel de fluorescencia medido para determinar la concentración del ion de Calcio a un nivel basal de cada célula identificada. 25 Preferably, in said step c), the measured fluorescence level is normalized to determine the concentration of the calcium ion at a baseline level of each identified cell. 25
En un ejemplo de realización preferido, la determinación de la respuesta de cada célula se determina realizando una clasificación y etiquetación de dicha respuesta en al menos uno de los siguientes regímenes dinámicos: respuesta regular, respuesta alterna, bloqueo, presencia de una onda, respuesta irregular o inactiva. 30 In a preferred embodiment, the determination of the response of each cell is determined by classifying and labeling said response in at least one of the following dynamic regimes: regular response, alternating response, blocking, presence of a wave, irregular response or inactive 30
La respuesta de la célula se clasifica en base a su comportamiento en relación a los estímulos eléctricos aplicados. Preferiblemente, los estímulos eléctricos serán aportados periódicamente. La respuesta regular significa que la célula responde de The response of the cell is classified based on its behavior in relation to the electrical stimuli applied. Preferably, the electrical stimuli will be provided periodically. The regular response means that the cell responds to
forma regular a cada estímulo eléctrico. En la respuesta alterna la célula responde de manera alterna, en uno de cada dos estímulos eléctricos la respuesta de la célula es de menor intensidad. En la respuesta de bloqueo, la célula sólo responde a uno de cada ‘m’ estímulos eléctricos, siendo ‘m’ mayor a 1. En la respuesta presencia de una onda la célula inicia una respuesta que se prolonga durante más de un estímulo 5 eléctrico, que generalmente será de intensidad elevada. En la respuesta irregular, la célula responde de manera irregular y la concentración de Calcio no está correlacionada con los estímulos eléctricos. Finalmente, en la respuesta inactiva la célula no responde a ningún estímulo eléctrico. regular form to each electrical stimulus. In the alternate response the cell responds alternately, in one of every two electrical stimuli the response of the cell is of less intensity. In the blocking response, the cell only responds to one of each 'm' electrical stimuli, being 'm' greater than 1. In the presence of a wave response the cell initiates a response that lasts for more than one electrical stimulus 5 , which will generally be of high intensity. In the irregular response, the cell responds irregularly and the concentration of calcium is not correlated with electrical stimuli. Finally, in the inactive response the cell does not respond to any electrical stimulation.
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Preferiblemente, cada vez que se produce un cambio en la frecuencia de estimulación, se aplica un test estadístico que mide el cambio en el número de células que responden según cada régimen dinámico. Preferably, each time there is a change in the frequency of stimulation, a statistical test is applied that measures the change in the number of cells that respond according to each dynamic regime.
En un ejemplo de realización alternativo, se pueden calcular también histogramas 15 con la medida de las células identificadas, la posición de cada célula identificada en dicho cultivo celular, la cantidad total de células pertenecientes a un mismo régimen dinámico, la respuesta de cada célula identificada dependiendo de su tamaño, mapas con la distribución espacial de la respuesta de cada célula. In an alternative embodiment, histograms 15 can also be calculated with the measurement of the cells identified, the position of each cell identified in said cell culture, the total amount of cells belonging to the same dynamic regime, the response of each cell identified Depending on their size, maps with the spatial distribution of the response of each cell.
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Para caracterizar y clasificar la actividad global del cultivo celular independientemente de lo que ocurra con las células individuales se realiza, preferiblemente, un análisis fotograma a fotograma de las imágenes para poder trazar una frontera entre regiones activas e inactivas y para poder medir también el desplazamiento de dicha frontera en el tiempo. De esta forma, se puede calcular la 25 velocidad lineal y angular de la respuesta global de dicho cultivo celular y también clasificar la propagación de la actividad en dicho cultivo celular en al menos uno de los siguientes modos: propagación plana desde unos electrodos utilizados para inducir la propagación de un señal que tiene su origen en estos electrodos, propagación plana en cualquier otra dirección o propagación curvada o en espiral 30 que tienen su origen en actividad espontánea del cultivo. To characterize and classify the overall activity of the cell culture regardless of what happens with the individual cells, preferably, a frame-by-frame analysis of the images is performed in order to draw a boundary between active and inactive regions and to also measure the displacement of said frontier in time. In this way, it is possible to calculate the linear and angular velocity of the overall response of said cell culture and also classify the propagation of the activity in said cell culture in at least one of the following ways: flat propagation from electrodes used to induce the propagation of a signal that has its origin in these electrodes, flat propagation in any other direction or curved or spiral propagation 30 that have their origin in spontaneous activity of the culture.
Las anteriores y otras ventajas y características se comprenderán más plenamente a partir de la siguiente descripción detallada de unos ejemplos de realización con referencia a los dibujos adjuntos, que deben tomarse a título ilustrativo y no limitativo, en los que: The foregoing and other advantages and features will be more fully understood from the following detailed description of some embodiments with reference to the attached drawings, which should be taken by way of illustration and not limitation, in which:
5 5
la Fig. 1 muestra un ejemplo de segmentación de un cultivo celular. En la Fig. 1A se muestra una imagen de variabilidad de la concentración del ion de Calcio en el cultivo celular. En la Fig. 1B se muestran las células detectadas junto a las etiquetas numéricas adjudicadas; Fig. 1 shows an example of segmentation of a cell culture. An image of variability in the concentration of calcium ion in cell culture is shown in Fig. 1A. In Fig. 1B the cells detected are shown next to the assigned numerical labels;
10 10
la Fig. 2 es una ilustración del procedimiento que sigue el método propuesto de acuerdo a un ejemplo de realización; Fig. 2 is an illustration of the procedure that follows the proposed method according to an embodiment example;
la Fig. 3 muestra, las diferentes señales obtenidas para cada uno de los diferentes regímenes dinámicos para una célula que se está estimulando mediante un aporte 15 externo de energía eléctrica cada dos segundos. Las barras negras de la parte superior marcan el instante de estimulación; Fig. 3 shows the different signals obtained for each of the different dynamic regimes for a cell that is being stimulated by an external input of electrical energy every two seconds. The black bars at the top mark the moment of stimulation;
la Fig. 4 muestra en su imagen superior, la distribución espacial de la respuesta de la concentración del ion de Calcio en las células en un tramo de estimulación 20 concreto según los diferentes regímenes dinámicos, y en su imagen inferior, la distribución radial normalizada representando la distribución de distancias entre células de un mismo tipo dinámico. Fig. 4 shows in its upper image, the spatial distribution of the calcium ion concentration response in the cells in a particular stimulation section 20 according to the different dynamic regimes, and in its lower image, the normalized radial distribution representing the distribution of distances between cells of the same dynamic type.
Descripción detallada de un ejemplo de realización 25 Detailed description of an embodiment example 25
Con referencia a la Fig. 2, el primer paso a realizar es el de la segmentación; es decir, identificar, coger los límites y etiquetar cada una de las células que forman el cultivo celular. Para ello, se coge toda la secuencia de imágenes de un tramo de estimulación y se calcula la variabilidad a lo largo del citado tramo de estimulación. En general, las regiones que presentan más variabilidad corresponden a células, 30 mientras que las de menor variabilidad corresponderán a regiones extracelulares. Posteriormente, la imagen de variabilidad obtenida se procesa mediante una técnica de segmentación de curvas de nivel (por ejemplo, Watershed, cuenca hidrográfica, etc.), que identifica las regiones con variabilidad local máxima. En la invención With reference to Fig. 2, the first step to be performed is that of segmentation; that is, identify, take the limits and label each of the cells that make up the cell culture. To do this, the entire sequence of images of a stimulation section is taken and the variability is calculated along said stimulation section. In general, the regions with more variability correspond to cells, 30 while those with less variability will correspond to extracellular regions. Subsequently, the image of variability obtained is processed by a technique of segmentation of contours (for example, Watershed, river basin, etc.), which identifies regions with maximum local variability. In the invention
propuesta, las regiones identificadas como un máximo local tienen un área comprendida dentro de un cierto intervalo definido según la medida característica de las células del cultivo, con lo que se garantiza que las regiones identificadas presenten una medida que se corresponde con el tamaño típico de una célula, evitando la aparición de pequeñas regiones que corresponderían a subregiones de 5 una célula o a regiones grandes resultantes de la agrupación de diversas células del cultivo celular. Los resultados de aplicar la segmentación son los que se muestran en las Figs. 1A y 1B. proposed, the regions identified as a local maximum have an area within a certain range defined according to the characteristic measure of the cells of the culture, which ensures that the regions identified have a measure that corresponds to the typical size of a cell, avoiding the appearance of small regions that would correspond to subregions of a cell or to large regions resulting from the grouping of various cells of the cell culture. The results of applying the segmentation are those shown in Figs. 1A and 1B.
Una vez la imagen ha sido segmentada se puede medir el nivel de fluorescencia del 10 ion de Calcio para cada una de las células del cultivo. Este nivel de fluorescencia es la intensidad de luz media de los píxeles de la célula y es un nivel de fluorescencia que, en el caso de una célula sana, presentará subidas y bajadas acompasadas con el ritmo de estimulación eléctrica correspondiente al paso del frente eléctrico por la citada célula. Este nivel de fluorescencia se normaliza al valor de la frecuencia basal 15 de la propia célula medida en el tramo de estimulación, y por lo tanto la célula no debería responder a los citados estímulos eléctricos. De este modo, se consigue obtener un nivel de fluorescencia para cada célula del cultivo y además un nivel de fluorescencia de todo el cultivo como un todo. Once the image has been segmented, the fluorescence level of 10 Calcium ion can be measured for each of the cells in the culture. This level of fluorescence is the average light intensity of the cell's pixels and is a level of fluorescence that, in the case of a healthy cell, will present ups and downs accompanied by the rhythm of electrical stimulation corresponding to the passage of the electrical front by the aforementioned cell. This level of fluorescence is normalized to the value of the baseline frequency 15 of the cell itself measured in the stimulation section, and therefore the cell should not respond to said electrical stimuli. In this way, it is possible to obtain a level of fluorescence for each cell of the culture and also a level of fluorescence of the whole culture as a whole.
20 twenty
Seguidamente, tal como se puede observar en la Fig. 3 se clasifica la respuesta de la célula en cada tramo de estimulación, en este caso por ejemplo a estímulos eléctricos periódicos, partiendo de las imágenes de fluorescencia grabadas mientras se estimula la célula clasificando la respuesta de la célula en los citados regímenes dinámicos. Para poder clasificar la actividad de cada célula en los citados regímenes 25 dinámicos se puede utilizar una técnica conocida como Random Forest del tipo machine learning. A partir de un conjunto de señales previamente clasificadas (por ejemplo alrededor de 500), la técnica consiste en generar un conjunto de árboles de decisión con un componente al azar (por ejemplo 1000). Luego, al clasificar una nueva señal se aplica el conjunto de árboles de decisión escogiendo el resultado 30 que ha sido proporcionado un mayor número de veces. Then, as can be seen in Fig. 3, the response of the cell in each stimulation section is classified, in this case, for example, to periodic electrical stimuli, starting from the recorded fluorescence images while stimulating the cell by classifying the response of the cell in the mentioned dynamic regimes. In order to classify the activity of each cell in the aforementioned dynamic regimes, a technique known as Random Forest of the machine learning type can be used. From a set of previously classified signals (for example around 500), the technique consists in generating a set of decision trees with a random component (for example 1000). Then, when classifying a new signal, the set of decision trees is applied, choosing the result 30 that has been provided a greater number of times.
En una opción preferida, cada vez que se modifica el ritmo de estimulación, es decir se modifica la frecuencia de estimulación, se aplica un test estadístico, por ejemplo In a preferred option, each time the stimulation rate is modified, that is, the stimulation frequency is modified, a statistical test is applied, for example
el de McNemar, de significancia de cambios. Por ejemplo cuando se pasa de estimular cada segundo a estimular cada 0.75 segundos. Mediante la utilización de este test, el método propuesto tal como se muestra en la Fig. 4, permite certificar que a frecuencias elevadas los casos para la respuesta ‘bloqueo’ son superiores a los de la respuesta ‘regular’, o que cuando se vuelve a frecuencias bajas, después 5 de haber estimulado a elevada frecuencia, existe una tendencia a que aparezcan más ondas, es decir, que aumente la respuesta ‘Presencia de ondas’, o que cuando una célula responde de forma ‘inactiva’ lo hace independientemente del ritmo de estimulación. that of McNemar, of significance of changes. For example when you go from stimulating every second to stimulating every 0.75 seconds. By using this test, the proposed method as shown in Fig. 4, allows to certify that at high frequencies the cases for the 'blocking' response are superior to those of the 'regular' response, or that when it becomes at low frequencies, after having stimulated at a high frequency, there is a tendency for more waves to appear, that is, to increase the response 'Presence of waves', or that when a cell responds 'inactively' it does so independently of the stimulation rate
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Alternativamente, se pueden calculan también histogramas con la medida de las células identificadas, la posición de cada célula identificada en dicho cultivo celular, la cantidad total de células pertenecientes a un mismo régimen dinámico, la respuesta de cada célula identificada dependiendo de su tamaño, mapas con la distribución espacial de la respuesta de cada célula. 15 Alternatively, histograms can also be calculated with the measurement of the cells identified, the position of each cell identified in said cell culture, the total amount of cells belonging to the same dynamic regime, the response of each cell identified depending on its size, maps with the spatial distribution of the response of each cell. fifteen
Una vez caracterizada y clasificada la respuesta de una única célula, se realiza la caracterización y clasificación de la actividad de todo el cultivo celular. Para ello, se realiza un análisis fotograma a fotograma de las imágenes para poder trazar una frontera entre regiones activas e inactivas y para poder medir también el desplazamiento de dicha frontera en el tiempo. De esta forma, se puede calcular la 20 velocidad lineal y angular de la respuesta global de dicho cultivo celular y acabar dibujando, por ejemplo, un mapa de isócronas (curvas de igual tiempo, de acuerdo al ejemplo de realización curvas según la llegada de los frentes). Con el objetivo de optimizar aquellos puntos en los que la señal es óptima, se descartan las regiones entre células contiguas donde la señal es más pobre. 25 Once the response of a single cell is characterized and classified, the characterization and classification of the activity of the entire cell culture is performed. To do this, a frame-by-frame analysis of the images is carried out in order to draw a border between active and inactive regions and also to measure the displacement of said border over time. In this way, it is possible to calculate the linear and angular velocity of the overall response of said cell culture and end up drawing, for example, an isochron map (curves of equal time, according to the example of curves according to the arrival of the fronts). In order to optimize those points where the signal is optimal, regions between adjacent cells where the signal is poorer are discarded. 25
Para cada tramo de estimulación, se toma la señal total del cultivo (fluorescencia media del fotograma entero en función del tiempo). Esta señal se utiliza para conocer el inicio y el final de cada frente, realizando un filtrando mediante un filtro paso banda previo admitiendo sólo aquellas frecuencias comprendidas en el rango 30 que tiene sentido de acuerdo a la estimulación (periodos entre 0.25 y 5 segundos), y buscando posteriormente los puntos donde la derivada cruza con el eje de coordenadas (obteniendo los máximos y mínimos). For each stretch of stimulation, the total culture signal is taken (mean fluorescence of the entire frame as a function of time). This signal is used to know the beginning and end of each front, by filtering through a previous bandpass filter admitting only those frequencies in the range 30 that makes sense according to the stimulation (periods between 0.25 and 5 seconds), and then looking for the points where the derivative crosses the coordinate axis (obtaining the maximum and minimum).
Luego, para localizar la posición del frente en cada fotograma se utiliza la imagen del cultivo celular segmentado, para ello se puede dividir el campo del cultivo mediante una red de tipo cuadrangular de modo que por ejemplo cada cuadrado contiene píxeles pertenecientes como mínimo a un par de células. En cada uno de estos cuadrados se contabilizan cuantos píxeles forman parte de la célula obteniendo una 5 cuadrícula conociendo cuantos píxeles son susceptibles de ser activados. De este modo se pueden descartar las regiones donde la señal es más ruidosa. Generalmente, se normaliza cada fotograma al máximo de la actividad total del tramo de estimulación de manera que en cada píxel haya un valor intervalo [0 1] y se mira en cada fotograma y cada cuadrado de la red cuantos píxeles superan el 10 umbral de 0.5 (mitad de la actividad máxima). De este modo es posible construir una nueva imagen, que substituye al anterior fotograma, con tan sólo los píxeles que han superado el umbral, consiguiendo de esta forma una imagen de menor resolución pero con un nivel de ruido prácticamente nulo. Then, to locate the position of the front in each frame the image of the segmented cell culture is used, for this purpose the field of the culture can be divided by a quadrangular type network so that for example each square contains pixels belonging to at least one pair of cells. In each of these squares, how many pixels are part of the cell are counted, obtaining a grid knowing how many pixels are capable of being activated. In this way, regions where the signal is louder can be discarded. Generally, each frame is normalized to the maximum of the total activity of the stimulation section so that in each pixel there is an interval value [0 1] and you look at each frame and each square of the network how many pixels exceed the threshold of 0.5 (half of the maximum activity). In this way it is possible to build a new image, which replaces the previous frame, with only the pixels that have exceeded the threshold, thus achieving an image of lower resolution but with a practically zero noise level.
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Finalmente, la velocidad instantánea se calcula, de acuerdo a un ejemplo de realización, cogiendo para cada tres fotogramas consecutivos la imagen binaria con la posición del frente y se busca la frontera entre la zona activa y la no activa, obteniendo así una curva que será la isócrona (puntos donde se encuentra el frente en dicho fotograma). Para cada tres fotogramas consecutivos se puede hacer una 20 medida de la velocidad en el fotograma central de la siguiente manera: con la curva del fotograma central, se va siguiendo los píxeles que la componen trazando rectas perpendiculares a la curva y midiendo la distancia a lo largo de dichas rectas hasta la siguiente y anterior curva. Para cada recta perpendicular se tendrán entonces dos valores, la semisuma de los cuales dividido entre el tiempo entre fotogramas 25 proporciona una medida de la velocidad local en aquel punto de la curva. Haciendo la media de los valores de la velocidad para todos los puntos de la curva se obtiene la velocidad media del fotograma. Una vez medidos todos los fotogramas de un frente se puede representar el módulo de la velocidad en función del fotograma y el ángulo de la velocidad en función del fotograma. Haciendo una regresión lineal de 30 estas dos representaciones se obtiene una medida de la velocidad angular y la velocidad lineal media del frente. Finally, the instantaneous speed is calculated, according to an example of embodiment, taking for every three consecutive frames the binary image with the position of the front and looking for the border between the active and the non-active zone, thus obtaining a curve that will be the isochronous (points where the front is in that frame). For every three consecutive frames a speed measurement can be made in the central frame as follows: with the curve of the central frame, the pixels that compose it are traced by drawing straight lines perpendicular to the curve and measuring the distance along these lines to the next and previous curve. For each perpendicular line there will then be two values, the semi-sum of which divided by the time between frames 25 provides a measure of the local velocity at that point of the curve. By averaging the velocity values for all points on the curve, the average frame rate is obtained. Once all the frames of a front have been measured, the speed module can be represented according to the frame and the speed angle depending on the frame. By making a linear regression of 30 these two representations a measure of the angular velocity and the average linear velocity of the front is obtained.
El alcance de esta invención está definido en el siguiente conjunto de reivindicaciones. The scope of this invention is defined in the following set of claims.
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Claims (15)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201330974A ES2532746B1 (en) | 2013-06-28 | 2013-06-28 | Computer-implemented method for dynamic characterization of cells in cell cultures and computer programs to carry out the method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201330974A ES2532746B1 (en) | 2013-06-28 | 2013-06-28 | Computer-implemented method for dynamic characterization of cells in cell cultures and computer programs to carry out the method |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2532746A2 ES2532746A2 (en) | 2015-03-31 |
| ES2532746R1 ES2532746R1 (en) | 2015-04-10 |
| ES2532746B1 true ES2532746B1 (en) | 2016-01-14 |
Family
ID=52727604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES201330974A Active ES2532746B1 (en) | 2013-06-28 | 2013-06-28 | Computer-implemented method for dynamic characterization of cells in cell cultures and computer programs to carry out the method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2532746B1 (en) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102008059788B4 (en) * | 2008-12-01 | 2018-03-08 | Olympus Soft Imaging Solutions Gmbh | Analysis and classification of biological or biochemical objects on the basis of time series images, applicable to cytometric time-lapse cell analysis in image-based cytometry |
-
2013
- 2013-06-28 ES ES201330974A patent/ES2532746B1/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2532746R1 (en) | 2015-04-10 |
| ES2532746A2 (en) | 2015-03-31 |
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Legal Events
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| FG2A | Definitive protection |
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