2DETERMINACIÓN RÁPIDADE SUSCEPTIBILIDADA COMPUESTOS ANTIMICROBIANOSEstado del arteLa presente invención se refiere a métodos e instrumentos para la determinación de 5susceptibilidad a distintos compuestos por parte de diferentes microorganismos. Más específicamente, se refiere a la determinación de susceptibilidad a antibióticos por parte de microorganismos patógenos multirresistentes. La presente invención hace referencia a la utilización de un componente iónicamente entrecruzable utilizado para la producción de microesferas, dichas microesferasserán producidas mediante la aplicación de técnicas de 10microencapsulación, más específicamente de una tecnología de encapsulación mediante flowfocusing, que garantiza una producción monodispersa de microesferas. La presente invención hace referencia también a una metodología para el análisis de la proliferación microbiana dentro de esas cápsulas y a la interpretación de los mismos.La determinación de susceptibilidad a antibióticos es un procedimiento con una importancia 15crucial en los laboratorios microbiológicos clínicos para la definición del tratamiento óptimo frente a una determinada infección microbiana. Los tratamientos empíricos se siguen llevando a cabo en aquellas infecciones causadas por microorganismos que todavía no han desarrollado mecanismosde resistencias a antibióticos, sin embargo, la proliferación de microorganismos que han incorporado diversos mecanismos de resistencia ha aumentado exponencialmente, 20incrementando así el riesgo de implementar terapias antibióticas incorrectas por determinaciones deficitarias de la resistencia. Existen numerosas técnicas para la determinación de la susceptibilidad a antibióticos, lastécnicas clásicas descritas en los 1970s, revisadas por Jorgensen y Ferraro en AntimicrobialSusceptibilitytesting: A review of general principles and contemporarypractices; Medical 25Microbiology CID 2009: 49. Entre estas técnicas clásicas cabe destacar las diluciones seriadas en medio de crecimiento microbiano con crecientes concentraciones de antibiótico y la técnica dedifusión de disco de P20133093314-08-2013
3Bauer-Kirby (1966) (Woods gl, Washington JA. Antimicrobialsusceptibilitytests: dilution and disk diffusionmethods).En las técnicas clásicas se necesitan 72h desde el procesamiento de la muestra hasta la obtención de los resultados delos ensayos de susceptibilidad. 24 horas para el crecimiento en placa, 24 horas para el aislamiento de clones y 24 h para la determinación de la 5susceptibilidad a antibióticos.La reducción del tiempo hasta la consecución de resultados objetivos, sin afectar la precisión y la reproducibilidad, para la implementación de la terapia correcta es de crucial importancia en los laboratorios clínicos microbiológicos.El desarrollo de técnicas para la reducción de este tiempo de procesamiento ha centrado el 10esfuerzo de numerosas empresas de biotecnología y grupos de investigación.Entre los avances descritos en el estado del arte, se encuentran los sistemas automatizados, con ellos se consigue reducir a 3,5h para determinaciones de gram negativas en el MicroScanWalkAway (Siemens HealthCareDiagnostics) a 18h en el Sensititre AIRIS 2x (TrekDiagnosticsSystmes). Estos sistemas, basados en el análisis de la proliferación 15microbiana basándose en técnicas fluorimétricas, además de reducir el tiempo incrementan la objetividad debido a la mecanización de los procesos y a la disminución de los errores en la realización de los procedimientos. Sin embargo, hay microorganismos más complejos que requieren de incubaciones más largas por lo que la reducción del tiempo no es igual entodos los casos. Los inconvenientes de estos sistemas son generalmente el alto precio tanto de 20implementación como de mantenimiento, así como el hecho de que son sistemas cerrados, con un determinado formato predefinido y una serie de microorganismos paralos que son válidos que no siempre coinciden con los requerimientos de un determinado entorno clínico.La encapsulación celular y su aplicación en clínica está descrita en la bibliografía desde 1960s (CHANG TMS (1964) Semipermeable microcapsules. Science 146(3643):524-525., Chang 25T.M.S. Artificial Cells, Spingfield, III. Charles C Thomas (1972)). En el campo que nos ocupa de la determinación de susceptibilidad a antibióticos, se han ido aplicando técnicas de encapsulación para el análisis individualizado de microorganismos. El concepto más extendido es el de ensayo de crecimiento por microgotas en gel o GMD (gel microdrop) (patente EP0411038A1), en el, se encapsulan los microorganismos en gotas de 30P20133093314-08-2013
4agarosa y se analiza el crecimiento de los microorganismos dentro de los mismos en determinados condiciones (Journal of Microbiologicalmethods 62 (2005)181-197).Esta tecnología presenta algunas desventajas, en primer lugar las encapsulaciones se realizan con agarosa, esta agarosa necesita una temperatura elevada para poder utilizarla, sometiendo a los microorganismos a temperaturas superiores a los 40°C. Además el procedimiento para la 5realización de los microgotas es por emulsión con un aceite, esto hace que se necesiten numerosos pasos posteriores para la eliminación del aceite con el consiguiente sufrimiento celular y la imposibilidad de uso del sistema para microorganismos más sensibles a la temperatura o al estrés. Sin embargo el sistema es muy bueno porque permite el análisis individualizado del crecimiento bacteriano, reduciendo el número de divisiones necesarias 10para hacer patente un efecto del compuesto analizado sobre el crecimiento celular. Un problema añadido al sistema es la variabilidad en el tamaño de las capsulas producidas, mediante las emulsiones es muy difícil controlar el tamaño de la capsula y por tanto la cantidad de bacterias en ellas. La obtención de resultados a partir de estas técnicas se realiza a través de citometría de flujo, esta técnica aunque muy precisa y consistente, tiene el problema 15del tamaño máximo que puede analizar, teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente sobre el poco control que hay sobre el tamaño de capsulas cuando se produce por emulsión, requiere un paso previo al análisis de filtrado, esto puede inducir un error en el análisis al descartar una población de capsulas por su tamaño. Además la citometría de flujo requiere de una capacitación del personal que lo maneja, y esto dificulta su introducción en el ámbito 20clínico que estamos tratando.En esta misma línea de desarrollo, se han publicado distintas técnicas para la determinación de susceptibilidad a antibióticos basados en análisis individualizados de crecimiento celular. En el caso del artículo publicado en Labon Chip en 2013 (Lab Chip, 2013,13,280), utilizan un sistema de microfluídica para fijar las bacterias en unos canales de agarosa, mediante 25difusión, se ponen en contacto con un gradiente de concentración del antibiótico analizado y mediante un análisis por microscopia, se determina que concentración inhibe el crecimiento del microorganismo en cuestión. Este sistema, reduce mucho el tiempo hasta la obtención de resultados a 3h, sin embargo, la lectura de los resultados necesita de un tratamiento de imágenes complejo que permita diferenciar si esas células están en crecimiento o no. Además 30de los inconvenientes debidos a la utilización de agarosa (temperatura) y de microfluídica (manejo).P20133093314-08-2013
5Una combinación de las dos técnicas anteriores es la aplicación de microfluídica para la encapsulación de microorganismos y su análisis de susceptibilidad a diversos compuestos (ACS ChemicalBiology 2011,6, 260-266) mediante la aplicación de microfluídica para la producción de capsulas monodispersas mediante flow-focusing, conteniendo 1-0 bacterias y el análisis del crecimientode las mismas dentro de las capsulas por citometría de flujo, en este 5caso, siguen utilizando agarosa, con el consiguiente requerimiento térmico necesario para su manejo. Además utilizan el citómetro para la obtención de resultados cuyos inconvenientes han sido discutidos con anterioridad. Enfocamiento de chorro®es una tecnología de manipulación de microfluidos para la generación de gotas monodispersas, basada en la producción de microchorros capilares que 10son “enfocados” hacia un orificio (US6,464,886). Descubierta en 1994 por el grupo de investigación del profesor Alfonso Gañán-Calvo. Esta tecnología permite diseñar y producir micropartículas con tamaño, estructura y composición seleccionables. Esta tecnología se ha desarrollado hasta un instrumento (Cellena ®) que permite la encapsulación mediante FlowFocusing® de células manteniendo su viabilidad mediante la utilización de polímero de 15gelificación iónica como el alginato, ampliamente reportado como biocompatible en otros campos de investigación y desarrollo como la terapia celular (US4352883). Esta técnica de encapsulación, proporciona un control muy elevado del tamaño de partículas a producir, se lleva a cabo a temperatura ambiente, en solución acuosa sin aceites y además sin someter a las células a fuerzas vibracionales o electroestáticas para su producción. 20La aplicación de esta tecnología al estudio de microorganismos ha sido documentada para la detección de mutantes en levadura (NARSebastian Chavez) acoplada al análisis del crecimiento dentro de las microesferas a un citómetro de flujo específico para partículas grandes. Sin embargo, esta instrumentación es costosa y compleja de manejar por técnicos de laboratorio de los sistemas desalud. Lo que dificulta su implementación para el análisis 25rutinario de susceptibilidad a antibióticos.P20133093314-08-2013
6Compendio de la invención En la presente invención se describen los métodos y procedimientos para la encapsulación de células, específicamente células microbianas con el objetivo de realizar análisis de susceptibilidad a diversos compuestos mediante la directa observación de la proliferación celular de las células encapsuladas.5Más específicamente, la invención comprende un sistema patentado de encapsulación mediante tecnología de enfocamiento de chorro, una metodología de incubación frente a distintos compuestos objetos de análisis, y un procedimiento de análisis. El procedimiento de encapsulación está basado en la utilización de polímeros entrecruzables iónicamente, más específicamente el alginato, mezclado con células microbianas objetos del 10estudio. Esteprocedimiento de encapsulación se realiza aplicando la tecnología de enfocamiento de chorro. Las células encapsuladas pasarían entonces a estar en contacto con los compuestos sujetos al análisis, más específicamente, esos compuestos pueden ser antibióticos. Tras un periodo de incubación corto, se realiza el análisis de las microcolonias que han crecido dentro de las microesferas. Este análisis se hace de forma específica mediante 15el análisis por microscopia de la formación de microcolonias dentro de las microesferas. La diferencia en el diámetro de la microcolonia formada dentro de la microesferas nos da una idea del efecto que dicho compuesto testado tiene frente al organismo en cuestión microencapsulado.Mediante la aplicación de esta secuencia de procedimientos, el tiempo necesario para obtener 20resultados se ve reducido de 24 a 8h aproximadamente, dependiendo del tipo de microorganismo. Es unsistema abierto en el que tanto los compuestos como los microorganismos analizados se pueden seleccionar según la epidemiología específica del laboratorio microbiológico.En otro aspecto más de la invención, este procedimiento puede ser aplicado a muestras 25clínicas, de forma específica a muestras clínicas líquidas o mucosas, como por ejemplo aspirados broncoalveolares, de forma directa, sin necesidad de aislamiento previo de los microorganismos causantes de la infección, mediante la aplicación de una modificación en el protocolo de encapsulación, pero siguiendo los mismos pasos básicos que componen esta invención.30P20133093314-08-2013
7Otro aspecto más de esta invención es la identificación de clones heterorresistentes y la posterior selección del mismo.Otro aspecto más de esta invención es el aislamiento de clones con características fenotípicas diferenciables.5P20133093314-08-2013
8Breve descripción de los dibujosLa Fig.1 es un ejemplo de cápsulas monodispersas producidas mediante la tecnología Flow-Focusing, empleada en esta invención.La Fig.2 es un ejemplo del crecimiento microbiano a lo largo del tiempo y la formación de microcolonias.5La Fig.3 es un gráfico del análisis estadístico poblacional del tamaño de las microcolonias dependiendo del efecto del compuesto añadido sobre el microorganismo encapsulado.La Fig.4 es un gráfico que representa el tamaño medio de las microcolonias según el efecto que el compuesto analizado tenga sobre el microorganismo encapsulado.10Descripción detallada de la invenciónDefinicionesCélula, en este documento hace referencia a la unidad estructural más pequeña de un organismo que es capaz de funcionar independientemente o un organismo unicelular, que estácompuesta de uno o más núcleos, citoplasma y varios orgánulos, rodeada por una 15membrana celular semipermeable o una pared celular. La célula puede ser eucariota, procariota, animal, planta o archeobacteria. En el contexto de esta invención las células serán mayoritariamente procariotas.Muestra clínica es el origen de los microorganismos a encapsular, puede ser de naturaleza líquida o mucosao semisóliday podría ser utilizada o bien para aislar los microorganismos de 20interés para su posterior análisis o bien para ser tratada directamente para su análisis.Microencapsulación,es el proceso de recubrimiento de moléculas, partículas sólidas, o glóbulos líquidos con materiales de distinta naturaleza para dar lugar a partículas de tamaño micrométrico. En el contexto de esta invención, microencapsulación es el proceso de recubrimiento de células para la formación de microesferas.25Enfocamientode chorro, a partir de ahora referida en el documento como FF (FlowFocusing, siglas en inglés), es la tecnología preferentepara la encapsulación en el contexto de esta invención. La selección de esta tecnología se basa fundamentalmente en que tiene pocos P20133093314-08-2013
9efectos sobre la viabilidad celularal ser muy suave en el uso de presiones, ejerciendo menos influencia sobre las condiciones vitales de la célula encapsulada y aportando objetividad a la encapsulación. Microesferas,son partículas de tamaño homogéneo y semipermeables que contienen en su interior una o más de una célula.5Microcolonia,es el resultado de la proliferación de una célula en el interior de una microesferas, generalmente adopta una conformación esférica y opaca en el contexto translúcido de la microesfera, lo que la hace fácilmente distinguible.En el contexto de esta invención, la muestra puede ser tratada de forma directa para su posterior encapsulación y análisis, reduciendo el tiempo de determinación de susceptibilidad 10de 48-72h a 20-24h obteniendo de forma simultánea aislados y datos de susceptibilidad.La muestra clínica puede ser, de forma preferentepara esta invención, líquida o mucosa, por ejemplo un aspirado broncoalveolar. Para su procesamiento se diluye entre 5 y 10 L de la muestra en 500 L de suero fisiológico, esta dilución se deja agitando en vortex durante 20-30 minutos. Una vez transcurrido este tiempo se procede a la mezcla de estos 500 L con el 15material de encapsulación, siguiendo el procedimiento descrito a continuación. El método seleccionado para la encapsulación de células en el contexto de esta invención es la tecnología FF (US6,464,886). El material preferido para este procedimiento de encapsulación son los polímeros entrecruzables iónicamente.20Entre los materiales utilizados para esta invención se incluyen, pero no están limitados a, alginato y polisacáridos naturales tales como quitopectina, goma gelan, goma de xantano, ácido hialurónico, heparina, pectina y carragenano. Entre los ejemplos de polianiones iónicamente entrecruzables para su uso en la práctica de la presente invención se incluyen pero no están limitados a, ácido poliacrílico y ácido polimetacrílico. Los policationes 25iónicamente entrecruzables tales como la polietilenimina y polilisina también son adecuados para la presente invención. En una realización preferida de la presente invención se utilizará alginato (alginato referido aquí corresponde con sales de ácido algínico) como polímero entrecruzable iónicamente, a un P20133093314-08-2013
10intervalo de concentración entre el 0,5% y 5% p/v. Preferiblemente el alginato se proporciona en un intervalo de concentración entre el 1,5% y 2% p/v.En el caso de encapsular muestras clínicas de forma directa, el porcentaje preferido de esta invención es 2% p/v.El procedimiento de entrecruzamiento del polímero iónicamente entrecruzable se lleva a cabo mediante la adición de la mezcla de encapsulaciónde cationes multivalente, tales como 5calcio, cinc, bario, estroncio, aluminio, hierro, manganeso, níquel, cobalto, cobre, cadmio, plomo, o mezclas de 2 o más cualesquiera de los mismo. En una realización preferida de la presente invención se utiliza calcio como entrecruzador del polímero entrecruzable iónicamente de la mezcla de encapsulación.Para la presente invención, este alginato se puede preparar en agua, o en medio específico 10para el crecimiento de las células que se van a encapsular. Para la producción de cápsulas mediante la tecnología FF es necesario la preparación de la mezcla de encapsulación, tal y como hemos descrito anteriormente en la presente invención. La mezcla de encapsulación consta de un polímero entrecruzable iónicamente, el preferido para está invención es el alginato, y de las células específicas que queremos encapsular. 15La proporción de células utilizadas para la mezcla de encapsulación determinará la cantidad de células presentes en una microesferas. En la realización preferida de la presente invención, el objetivo principal es obtener entre 1 y 2 células por cápsula.El tamaño preferido de microesferas en el contexto de esta invención es de 80 a200 m. Siendo preferible pero no indispensable, una encapsulación monodispersa con un coeficiente 20de variaciónpor debajo de 20%.En el contexto de la presente invención, una vez concluida la encapsulación, las microesferas se pueden recoger mediante diversas metodologías, las microesferas pueden ser centrifugadas y lavadas abundantemente con agua antes de transferirlas al medio de cultivo específico para el tipo celular encapsulado o en un segundo aspecto de esta invención, las células pueden ser 25filtradas mediante un filtro de nylon de 70um. La realización preferida de esta invención es el filtrado de las microesferas, puesto que además mediante este filtrado se elimina cualquier satélite o irregularidad que haya podido suceder mediante el procedimiento de encapsulación. P20133093314-08-2013
11Una vez concluido el procedimiento de encapsulación, el siguiente paso en el desarrollo de esta invención es la incubación de las microesferas con el compuesto específico objeto del análisis.Las distintas condiciones de incubación se realizarán con microesferas procedentes de una única encapsulación, la realización de los cálculos de microesferas requeridas para tener todos 5los puntos requeridos para la realización de un análisis completo es fundamental para un desarrollo óptimo de la presente invención.En una realización preferida de la presente invención el compuesto a analizar es un antibiótico. Las células encapsuladas corresponden con un microorganismo patógeno. Se realizará un barrido de concentraciones de antibióticos en un medio de cultivo óptimo para el 10crecimiento del microorganismo seleccionado. Seincluirá una concentración 0 de antibiótico que corresponderá con un control positivo de la formación de microcolonias.En la realización preferida de esta invención, pero no excluyente de cualquier otro modo de dispensación e incubación, el medio se repartirá en tubos cónicos con una capacidad 10 veces mayor que el volumen de medio que se le va a añadir (tubos de 50mL para 5mL de cultivo). 15Las microesferasse repartirán de forma homogénea entre todas las condiciones de antibióticos a analizar. En una realización preferida de esta invención, las microesferas se resuspenderán en un volumen determinado de medio de cultivo específico para el microorganismo encapsulado. Se repartirá volúmenes iguales de cápsulas a cada condición.El tiempo de incubación se determinará empíricamente para cada microorganismos. El tiempo 20mínimo de incubación será aquel necesario para identificar microcolonias de aproximadamente un tercio del volumen total de la microesferas en la condición control del análisis, en condiciones de crecimiento óptimas sin ningún compuesto en el medio.En una realización preferida de la invención, el tiempo de incubación puede ser reducido de 16-24h a 6hen microorganismos de rápido crecimiento y de 12-15días a 2-4 días en 25microorganismos de crecimiento lento como el Mycobacterium tuberculosis.En el caso de la encapsulación de muestras clínicas de forma directa, las incubaciones se regirán por las mismas normas que las descritas anteriormente, a excepción de que en ese caso, las incubaciones son más largas, requiriéndose al menos 16h para observar un patrón P20133093314-08-2013
12claro de crecimiento y sensibilidad. En cualquier caso, al suprimir el paso de aislamiento de colonias y preinóculos, el tiempo global se ve reducido de 48-72 h a 20h con todos los pasos del procedimiento incluidos.En la presente invención el método de análisis seleccionado puede ser mediante un análisis de imágenesde las microesferas tomadas desde un microscopio.5En una realización preferida de la invención, las microesferas que han sido incubadas durante un tiempo determinado, se transfieren, preferiblemente pero no excluyente, a un portaobjetos, donde vana ser examinadas por microscopia para determinar el tamaño de las microcolonias en la condición control del análisis.El microscopio preferido para esta invención es un microscopio óptico con un objetivo 4x, 10aunque también puedes ser utilizado uno 2,5x o un 10x. En la realización preferida de esta invención, el microscopio es invertido. Para el análisis de las microcolonias, lo más conveniente para tener un tratamiento estadístico es hacerfotos secuenciales de las microesferas después de la incubación. Para una realización sobradamente representativa, es preferible realizar un númerode imágenespara tener un 15mínimo de 100 microcolonias. El análisis de las microcolonias se realizarápreferentementeobteniendo unaserie de parámetrosrelevante:1.-Númerode microesferas:Se realizará una identificación y conteo de microesferas presentes en la preparación.202.-Conteo de microcolonias: Durante la identificación y conteo de las microcolonias presentes en las cápsulas se pueden dar varios casos dependiendodel efecto que el compuesto analizado tiene sobre el microorganismo encapsulado:a-Si el compuesto tiene un efecto lento sobre las colonias, o una penetración lenta a través de las cápsula por sus características químicas o es un citoestático o cualquier 25otra causa que permita a las células realizar algunas divisiones antes de que el compuesto haga su efecto total sobre la misma, el conteo de las capsulas será semejante entre todas las condiciones del análisis. P20133093314-08-2013
13b-Si el compuesto no tiene el efecto descrito en el punto uno de la siguiente lista, el conteo de las colonias será inferior, puesto que el número de clones que dará lugar a una microcoloniaes típicamente0. En casos extremos el número de microcolonias será 0. En casos de heteroresistencia o efecto heterogéneo del compuesto sobre la población o en el caso de mutantes, se producirá la identificación de alguna microcolonia aislada dentro de la 5población.3.-Tamaño de las microcolonias: Al igual que en el conteo podemos encontrar dos posibilidadesen el contaje de colonias:a-Si el compuesto tiene un efecto lento sobre las colonias, o una penetración lenta a través de las cápsula por sus características químicas o es un citoestático o cualquier 10otra causa que permita a las células realizar algunas divisiones antes de que el compuesto haga su efecto total sobre la misma, el conteo de las capsulas será semejante entre todas las condiciones del análisis. Sin embargo el tamaño de las microcolonias será significativamente menor. Al menos se identificará una reducción en el tamaño de 2,5 veces el tamaño de las microcolonias en la condición control.15b-Si el compuesto no tiene el efecto descrito en el punto uno de la siguiente lista, el conteo de las colonias será inferior, puesto que el número de clones que dará lugar a una microcoloniaes típicamente0. En casos de heteroresistencia o efecto heterogéneo del compuesto sobre la población o en el caso de mutantes, se producirá la identificación de alguna microcolonia aislada dentro de la población. En este caso, el tamaño general de las 20microcolonias será indetectable, sin embargo, los clones mencionados con anterioridad, que presenten mutaciones, o heteroresistencia pueden llegar a presentar un tamaño similar al observado en la condición control.La representación de los datos en la metodología de esta invención, preferida pero no excluyente de cualquier otra, sería la distribución normal de los tamaños obtenidos en cada 25una de las condiciones incluyendo al control. Otra forma de representar los datos sería la representación de los diámetros medios de las microcolonias presentes en cada condición. Análisis de la desviación estándar, de los tamaños máximos y mínimos, así como los coeficientes de variación de las microcolonias en cada condición proporcionan información P20133093314-08-2013
14fundamental para la obtención de resultados objetivos e identificación de resistencia heterogenea.En otro aspecto de la presente invención, las microesferas que contienen microcolonias en ambientes donde la mayoría de las microesferas están sin crecimiento celular pueden ser identificadas como clones mutantes o clones con heteroresistencia dentro de una población. 5Dichos clones pueden tener un interés específico para su identificación y caracterización.La selección de dichas microesferas y aislamiento de dichas capsulas se puede llevar a cabo mediante el uso de una microagujao micropipeta o pipeta Pasteur. Mediante estas herramientas típicas de laboratorios, se puedenaislarlasmicroesferas con la microcolonia de interés, visualizando la operación almicroscopio,y transferir dicha capsula a un medio de 10cultivo óptimo para la expansión de esa célula seleccionada.Debido a las características de las microesferas utilizadas en la presente invención, no es necesario disgregar la microesferapara permitir la expansión de la colonia, el crecimiento dentro de la cápsula no está limitado por el hidrogel, así que seguirá creciendo hasta que la microcolonia de su interior alcance el borde de la microesferas, una vez que la microcolonia 15se haya expandido hasta el borde, las células pueden salir al exterior y crecer como un cultivo estándar en suspensión.P20133093314-08-2013
15EjemplosEjemplo 1: Determinación de patrones de resistencia a antibióticosen patógenos oportunistas.Se parte de un cultivo axénico de Acinetobacterbaumaniiobtenido a partir de una muestra clínica. Se parte de un cultivo creciendo en fase logarítmica y se mide la densidad óptica 5OD600. Previamente se han preparado las soluciones necesarias para la encapsulación. Se ha preparado el alginato al 1,5%, en agua. El alginato se esteriliza por filtración a través de un tamaño de poro de 20um. Se ha preparado también el cloruro cálcico al 3% en agua, que también se esteriliza por filtración.10Se realiza un inóculo de 1,5x106células /mL de alginato, la mezcla se agita suavemente por inversión para garantizar una distribución homogénea de las células en el alginato. Se procede a la encapsulación, para la encapsulación se utiliza un nebulizador de 200um que produce partículas entre 100 y120 um de diámetro. Para la encapsulación por FF mediante este nebulizador y estas condiciones de alginato y células se necesita un flujo de aire a una presión 15de 60mBar. Y la encapsulación se lleva a cabo a una velocidad de 3mL/h. Las partículas caen en un baño de cloruro cálcico al 3% en agitación, la agitación ha de ser suficientemente fuerte para mantener las cápsulas en movimiento y separadas unas de otras. El chorro de microesferas no puede caer directamente sobre el remolino producido por el agitador.Una vez completa la encapsulación, se recogen las capsulas mediante un filtro de 70 um. Se 20lavan con abundante PBS y se resuspenden en 2mL de LB y se reparten 200uL de esta suspensión de cápsulas por cada condición de antibiótico a testar, en este ejemplo se van a utilizar dos antibióticos a 4 concentraciones cada uno más el control, por lo que se repartirían 200ul en cada uno de las nueve condiciones a testar en 3mL de medio de crecimiento LB + la concentración del antibiótico a testar.25Se procede a laincubación de las cápsulas a 37°C, 200rpm durante 6h. A las 6h se toman 10uL de cada condición y se analizan las microcolonias por microscopia.Se procede al conteo de las microcolonias y a la representación de la distribución de los diámetros de las mismas según las condiciones de antibióticos testadas frente al control sin P20133093314-08-2013
16antibióticos y se determina que condición es la mínima inhibitoria para esta cepa en concreto de Acinetobacter.El total de tiempo desde el inóculo del alginato, hasta la obtención deresultados es de 7-8h.Ejemplo 2: Identificación deheterorresistenciasEl procedimiento de encapsulación y de análisis es el mismo que el descrito en el ejemplo 1. 5Sin embargo, bajo determinadas condiciones y ante antibióticos específicos se ha descritola presencia de heterorresistencias en poblaciones microbianas axénicas, la metodología descrita en la presente invención permite la identificación de esos clones resistentes dentro de una población mayoritariamente sensible. La caracterización de estos clones y la posibilidad de su estudio es una herramienta fundamental para la microbiología clínica.10La identificación de clones resistentes en poblaciones mayoritariamente sensible, puede tener una significancia importante a la hora de explicar factores como el desarrollo de multirresistencias y las reservas patogénicas.P20133093314-08-2013
2DETERMINATION QUICK SUSCEPTIBILITY ANTIMICROBIAL COMPOSTS STATE OF THE ART The present invention relates to methods and instruments for the determination of susceptibility to different compounds by different microorganisms. More specifically, it refers to the determination of susceptibility to antibiotics by multi-resistant pathogenic microorganisms. The present invention refers to the use of an ionically crosslinkable component used for the production of microspheres, said microspheres will be produced by the application of techniques of microencapsulation, more specifically an encapsulation technology by flowfocusing, which guarantees a monodispersed production of microspheres. The present invention also refers to a methodology for the analysis of microbial proliferation within these capsules and the interpretation thereof. The determination of antibiotic susceptibility is a procedure with a critical importance in clinical microbiological laboratories for the definition of treatment. optimal against a certain microbial infection. Empirical treatments are still carried out in those infections caused by microorganisms that have not yet developed mechanisms of resistance to antibiotics, however, the proliferation of microorganisms that have incorporated various resistance mechanisms has increased exponentially, thus increasing the risk of implementing antibiotic therapies. incorrect due to poor resistance determinations. There are numerous techniques for determining the susceptibility to antibiotics, classical techniques described in the 1970s, reviewed by Jorgensen and Ferraro in Antimicrobial Susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices; Medical 25Microbiology CID 2009: 49. These classic techniques include serial dilutions in microbial growth media with increasing concentrations of antibiotics and the disc diffusion technique of P20133093314-08-2013
3Bauer-Kirby (1966) (Woods gl, Washington JA. Antimicrobialsusceptibilitytests: dilution and disk diffusionmethods). In classical techniques 72 hours are needed from sample processing to obtaining the results of susceptibility tests. 24 hours for plaque growth, 24 hours for clone isolation and 24 h for the determination of antibiotic susceptibility. Reduction of time to the achievement of objective results, without affecting accuracy and reproducibility, for the implementation of The correct therapy is of crucial importance in the microbiological clinical laboratories. The development of techniques for the reduction of this processing time has focused the efforts of numerous biotechnology companies and research groups. Among the advances described in the state of the art, Automated systems are found, with them it is possible to reduce to 3.5h for negative gram determinations in the MicroScanWalkAway (Siemens HealthCareDiagnostics) to 18h in the Sensititre AIRIS 2x (TrekDiagnosticsSystmes). These systems, based on the analysis of the 15microbial proliferation based on fluorimetric techniques, in addition to reducing the time increase the objectivity due to the mechanization of the processes and the decrease of the errors in the performance of the procedures. However, there are more complex microorganisms that require longer incubations, so the reduction in time is not the same in all cases. The disadvantages of these systems are generally the high price of both implementation and maintenance, as well as the fact that they are closed systems, with a certain predefined format and a series of microorganisms for which they are valid that do not always coincide with the requirements of a certain clinical environment.Cell encapsulation and its clinical application has been described in the literature since 1960s (CHANG TMS (1964) Semipermeable microcapsules. Science 146 (3643): 524-525., Chang 25T.MS Artificial Cells, Spingfield, III. Charles C Thomas (1972)). In the field that concerns us with the determination of susceptibility to antibiotics, encapsulation techniques have been applied for the individualized analysis of microorganisms. The most widespread concept is that of growth test by microdroplets in gel or GMD (gel microdrop) (patent EP0411038A1), in which the microorganisms are encapsulated in drops of 30P20133093314-08-2013
4agarose and the growth of microorganisms within them is analyzed under certain conditions (Journal of Microbiological Methods 62 (2005) 181-197) .This technology has some disadvantages, first the encapsulations are performed with agarose, this agarose needs a temperature high for use, subjecting microorganisms to temperatures above 40 ° C. In addition, the procedure for the realization of the microdroplets is by emulsion with an oil, this means that numerous subsequent steps are necessary for the elimination of the oil with the consequent cellular suffering and the impossibility of using the system for microorganisms that are more sensitive to temperature or stress. However, the system is very good because it allows the individualized analysis of bacterial growth, reducing the number of divisions needed to demonstrate an effect of the analyzed compound on cell growth. A problem added to the system is the variability in the size of the capsules produced, using emulsions it is very difficult to control the size of the capsule and therefore the amount of bacteria in them. The results obtained from these techniques are carried out through flow cytometry, this technique although very precise and consistent, has the problem of the maximum size that can be analyzed, taking into account the aforementioned about the little control over the Capsule size when produced by emulsion, requires a previous step to the filtering analysis, this can induce an error in the analysis by discarding a population of capsules by their size. In addition, flow cytometry requires a training of the personnel that manages it, and this makes it difficult for them to be introduced in the clinical field that we are treating.In this same line of development, different techniques for the determination of susceptibility to antibiotics based on analysis have been published individualized cell growth. In the case of the article published in Labon Chip in 2013 (Lab Chip, 2013,13,280), they use a microfluidic system to fix the bacteria in agarose channels, through diffusion, they contact a concentration gradient of the analyzed antibiotic and by a microscopy analysis, it is determined what concentration inhibits the growth of the microorganism in question. This system greatly reduces the time until obtaining results at 3 hours, however, the reading of the results requires a complex image treatment that allows differentiating whether these cells are growing or not. In addition to the inconveniences due to the use of agarose (temperature) and microfluidic (handling) .P20133093314-08-2013
5A combination of the two previous techniques is the application of microfluidics for the encapsulation of microorganisms and their susceptibility analysis to various compounds (ACS ChemicalBiology 2011,6, 260-266) by applying microfluidics for the production of monodisperse capsules by flow- focusing, containing 1-0 bacteria and the analysis of their growth inside the capsules by flow cytometry, in this case, they continue using agarose, with the consequent thermal requirement necessary for their management. They also use the cytometer to obtain results whose problems have been discussed previously. Chorro® Focusing is a microfluidic manipulation technology for the generation of monodisperse droplets, based on the production of capillary microbeads that are “focused” towards a hole (US6,464,886). Discovered in 1994 by the research group of Professor Alfonso Gañán-Calvo. This technology allows to design and produce microparticles with selectable size, structure and composition. This technology has been developed to an instrument (Cellena ®) that allows encapsulation by FlowFocusing® of cells maintaining their viability through the use of ionic polymerization polymer such as alginate, widely reported as biocompatible in other fields of research and development such as therapy cellular (US4352883). This encapsulation technique, provides a very high control of the size of particles to be produced, is carried out at room temperature, in aqueous solution without oils and also without subjecting the cells to vibrational or electrostatic forces for their production. 20 The application of this technology to the study of microorganisms has been documented for the detection of mutants in yeast (NAR Sebastian Chavez) coupled to the analysis of growth within the microspheres to a flow cytometer specific for large particles. However, this instrumentation is expensive and complex to handle by laboratory technicians of health systems. What hinders its implementation for the routine analysis of antibiotic susceptibility. P20133093314-08-2013
6Compendium of the invention The present invention describes the methods and procedures for encapsulating cells, specifically microbial cells with the aim of performing susceptibility analysis to various compounds by direct observation of the cell proliferation of encapsulated cells.5 More specifically, The invention comprises a patented encapsulation system by means of jet focusing technology, an incubation methodology against different compounds object of analysis, and an analysis procedure. The encapsulation process is based on the use of ionically crosslinkable polymers, more specifically alginate, mixed with microbial cells object of the study. This encapsulation procedure is performed by applying the jet focusing technology. The encapsulated cells would then come into contact with the compounds subject to the analysis, more specifically, those compounds may be antibiotics. After a short incubation period, the analysis of the microcolonies that have grown within the microspheres is performed. This analysis is done specifically by microscopy analysis of the formation of microcolonies within the microspheres. The difference in the diameter of the microcolony formed within the microspheres gives us an idea of the effect that said tested compound has on the organism in question microencapsulated.Through the application of this sequence of procedures, the time needed to obtain results is reduced from Approximately 24 to 8 hours, depending on the type of microorganism. It is an open system in which both the compounds and the microorganisms analyzed can be selected according to the specific epidemiology of the microbiological laboratory.In another aspect of the invention, this procedure can be applied to clinical samples, specifically to liquid or mucous clinical samples. , such as bronchoalveolar aspirates, directly, without the need for prior isolation of the microorganisms causing the infection, through the application of a modification in the encapsulation protocol, but following the same basic steps that make up this invention.30P20133093314-08 -2013
7 Another aspect of this invention is the identification of heterresistant clones and their subsequent selection. Another aspect of this invention is the isolation of clones with distinguishable phenotypic characteristics.5P20133093314-08-2013
8 Brief description of the drawings Fig. 1 is an example of monodisperse capsules produced by Flow-Focusing technology, used in this invention. Fig. 2 is an example of microbial growth over time and the formation of microcolonies. 5 Fig. .3 is a graph of the population statistical analysis of the size of the microcolonies depending on the effect of the added compound on the encapsulated microorganism. Fig. 4 is a graph that represents the average size of the microcolonies according to the effect that the analyzed compound has on the encapsulated microorganism. 10 Detailed description of the invention Definitions Cell, in this document refers to the smallest structural unit of an organism that is capable of functioning independently or a unicellular organism, which is composed of one or more nuclei, cytoplasm and several organelles, surrounded by a 15 semipermeable cell membrane or a cell wall. The cell can be eukaryotic, prokaryotic, animal, plant or archeobacteria. In the context of this invention, the cells will be mostly prokaryotic. The clinical sample is the origin of the microorganisms to be encapsulated, it can be of a liquid or semisolid nature could be used either to isolate the microorganisms of interest for later analysis or to be treated directly for analysis. Microencapsulation is the process of coating molecules, solid particles, or liquid globules with materials of different nature to give rise to micrometric sized particles. In the context of this invention, microencapsulation is the process of coating cells for the formation of microspheres. 25 Jet approach, hereafter referred to in the document as FF (FlowFocusing), is the preferred technology for encapsulation in the context of this invention. The selection of this technology is based fundamentally on the fact that it has few P20133093314-08-2013
9effects on cell viability be very gentle in the use of pressures, exerting less influence on the vital conditions of the encapsulated cell and providing objectivity to encapsulation. Microspheres, are particles of homogeneous and semipermeable size that contain within one or more of a cell.5Microcolonia, is the result of the proliferation of a cell inside a microsphere, generally adopts a spherical and opaque conformation in the translucent context of the microsphere, which makes it easily distinguishable. In the context of this invention, the sample can be treated directly for subsequent encapsulation and analysis, reducing the susceptibility determination time from 48-72h to 20-24h, obtaining Simultaneously isolated and susceptibility data.The clinical sample may be, preferably for this invention, liquid or mucous, for example a bronchoalveolar aspirate. For processing it is diluted between 5 and 10 L of the sample in 500 L of physiological serum, this dilution is left stirring in vortex for 20-30 minutes. Once this time has elapsed, these 500 L are mixed with the encapsulation material, following the procedure described below. The method selected for the encapsulation of cells in the context of this invention is FF technology (US6,464,886). The preferred material for this encapsulation process is the ionically crosslinkable polymers.20 Among the materials used for this invention are included, but not limited to, natural alginate and polysaccharides such as chitopectin, gellan gum, xanthan gum, hyaluronic acid, heparin, Pectin and carrageenan. Examples of ionically crosslinkable polyanions for use in the practice of the present invention include but are not limited to, polyacrylic acid and polymethacrylic acid. The ionically crosslinkable polycations such as polyethyleneimine and polylysine are also suitable for the present invention. In a preferred embodiment of the present invention, alginate (alginate referred to herein corresponds to alginic acid salts) will be used as an ionically crosslinkable polymer, to a P20133093314-08-2013
10 concentration range between 0.5% and 5% w / v. Preferably the alginate is provided in a concentration range between 1.5% and 2% w / v. In the case of encapsulating clinical samples directly, the preferred percentage of this invention is 2% w / v. Crosslinking of the ionically crosslinkable polymer is carried out by adding the multivalent cation encapsulation mixture, such as calcium, zinc, barium, strontium, aluminum, iron, manganese, nickel, cobalt, copper, cadmium, lead, or mixtures of 2 or more any of them. In a preferred embodiment of the present invention calcium is used as an ionic crosslinkable polymer crosslinker of the encapsulation mixture. For the present invention, this alginate can be prepared in water, or in specific medium for the growth of the cells to be encapsulate For the production of capsules by means of FF technology it is necessary to prepare the encapsulation mixture, as we have described previously in the present invention. The encapsulation mixture consists of an ionically crosslinkable polymer, the preferred one for this invention is alginate, and the specific cells we want to encapsulate. 15The proportion of cells used for the encapsulation mixture will determine the amount of cells present in a microsphere. In the preferred embodiment of the present invention, the main objective is to obtain between 1 and 2 cells per capsule. The preferred size of microspheres in the context of this invention is 80 to 200 µm. Preferably but not indispensable, a monodispersed encapsulation with a coefficient of variation below 20%. In the context of the present invention, once the encapsulation is concluded, the microspheres can be collected by various methodologies, the microspheres can be centrifuged and washed thoroughly With water before transferring them to the specific culture medium for the encapsulated cell type or in a second aspect of this invention, the cells can be filtered through a 70um nylon filter. The preferred embodiment of this invention is the filtering of the microspheres, since in addition, by means of this filtering, any satellite or irregularity that may have occurred by means of the encapsulation process is eliminated. P20133093314-08-2013
11Once the encapsulation procedure is completed, the next step in the development of this invention is the incubation of the microspheres with the specific compound object of the analysis.The different incubation conditions will be performed with microspheres from a single encapsulation, the realization of the Microsphere calculations required to have all the points required for a complete analysis is essential for an optimal development of the present invention. In a preferred embodiment of the present invention the compound to be analyzed is an antibiotic. The encapsulated cells correspond to a pathogenic microorganism. Antibiotic concentrations will be scanned in an optimal culture medium for the growth of the selected microorganism. A concentration 0 of antibiotic will be included which will correspond to a positive control of the formation of microcolonies. In the preferred embodiment of this invention, but not exclusive of any other mode of dispensing and incubation, the medium will be distributed in conical tubes with a capacity 10 times greater than the volume of medium to be added (50mL tubes for 5mL culture). 15 The microspheres will be distributed homogeneously among all the antibiotic conditions to be analyzed. In a preferred embodiment of this invention, the microspheres will be resuspended in a given volume of culture medium specific to the encapsulated microorganism. Equal volumes of capsules will be distributed to each condition.The incubation time will be determined empirically for each microorganism. The minimum incubation time will be that necessary to identify microcolonies of approximately one third of the total volume of the microspheres in the control condition of the analysis, under optimal growth conditions without any compound in the medium. In a preferred embodiment of the invention, the time of incubation can be reduced from 16-24h to 6hen fast-growing microorganisms and from 12-15 days to 2-4 days in 25 slow-growing microorganisms such as Mycobacterium tuberculosis.In the case of encapsulation of clinical samples directly, incubations they will be governed by the same rules as those described above, except that in that case, the incubations are longer, requiring at least 16h to observe a pattern P20133093314-08-2013
12 clear growth and sensitivity. In any case, by suppressing the isolation step of colonies and pre-circles, the overall time is reduced from 48-72 h to 20h with all the steps of the procedure included.In the present invention the method of analysis selected can be by means of an analysis of images of the microspheres taken from a microscope.5 In a preferred embodiment of the invention, the microspheres that have been incubated for a certain time, are preferably transferred, but not exclusive, to a slide, where they will be examined by microscopy to determine the size of microcolonies in the control condition of the analysis.The preferred microscope for this invention is an optical microscope with a 4x objective, although a 2.5x or a 10x can also be used. In the preferred embodiment of this invention, the microscope is inverted. For the analysis of microcolonies, the most convenient way to have a statistical treatment is to make sequential photos of the microspheres after incubation. For an overly representative embodiment, it is preferable to make a number of images to have a minimum of 100 microcolonies. The analysis of the microcolonies will be carried out preferably obtaining a series of relevant parameters: 1.-Number of microspheres: An identification and counting of microspheres present in the preparation will be carried out.202.-Counting of microcolonies: During the identification and counting of the microcolonies present in the capsules Several cases may occur depending on the effect that the analyzed compound has on the encapsulated microorganism: a-If the compound has a slow effect on the colonies, or a slow penetration through the capsule due to its chemical characteristics or is a cytostatic or any other cause that allows the cells to make some divisions before the compound has its full effect on it, the capsule count will be similar among all the conditions of the analysis. P20133093314-08-2013
13b-If the compound does not have the effect described in point one of the following list, the colony count will be lower, since the number of clones that will result in a microcolony typically0. In extreme cases the number of microcolonies will be 0. In cases of heterogeneity or heterogeneous effect of the compound on the population or in the case of mutants, the identification of some isolated microcolony within the population will occur.3.- Size of the microcolonies: As in the count we can find two possibilities in the colony count: a-If the compound has a slow effect on the colonies, or a slow penetration through the capsule due to its chemical characteristics or is a cytostatic or any other cause that allow the cells to make some divisions before the compound has its full effect on it, the capsule count will be similar among all the conditions of the analysis. However, the size of the microcolonies will be significantly smaller. At least a 2.5-fold reduction in the size of the microcolonies will be identified in the control condition.15b-If the compound does not have the effect described in point one of the following list, the colony count will be lower , since the number of clones that will lead to a microcolony typically0. In cases of heterogeneity or heterogeneous effect of the compound on the population or in the case of mutants, the identification of some isolated microcolony within the population will occur. In this case, the general size of the 20microcolonies will be undetectable, however, the aforementioned clones, which present mutations, or heterorsistance may have a size similar to that observed in the control condition. The representation of the data in the methodology of this invention, preferred but not exclusive of any other, would be the normal distribution of the sizes obtained in each of the conditions including the control. Another way of representing the data would be the representation of the average diameters of the microcolonies present in each condition. Analysis of the standard deviation, of the maximum and minimum sizes, as well as the coefficients of variation of the microcolonies in each condition provide information P20133093314-08-2013
Fundamental for obtaining objective results and identification of heterogeneous resistance. In another aspect of the present invention, microspheres that contain microcolonies in environments where most microspheres are without cell growth can be identified as mutant clones or clones with heterorsistance within a population. 5These clones may have a specific interest for their identification and characterization.The selection of said microspheres and isolation of said capsules can be carried out by using a micropipette microagujao or Pasteur pipette. By means of these typical laboratory tools, the microspheres can be isolated with the microcolony of interest, visualizing the almicroscope operation, and transferring said capsule to an optimal culture medium for the expansion of that selected cell. Due to the characteristics of the microspheres used in the present invention. , it is not necessary to disintegrate the microsphere to allow the expansion of the colony, the growth inside the capsule is not limited by the hydrogel, so it will continue to grow until the microcolony of its interior reaches the edge of the microsphere, once the microcolony 15 has expanded to the brim, cells can go outside and grow as a standard culture in suspension.P20133093314-08-2013
15Examples Example 1: Determination of antibiotic resistance patterns in opportunistic pathogens. It is based on an axine culture of Acinetobacterbaumanium obtained from a clinical sample. It starts from a crop growing in the logarithmic phase and the optical density 5OD600 is measured. Previously, the necessary solutions for encapsulation have been prepared. The 1.5% alginate has been prepared in water. The alginate is sterilized by filtration through a pore size of 20um. The 3% calcium chloride in water has also been prepared, which is also sterilized by filtration.10 An inoculum of 1.5x106 cells / mL of alginate is made, the mixture is gently stirred by inversion to ensure a homogeneous distribution of the cells in the alginate The encapsulation is carried out, for encapsulation a 200um nebulizer is used that produces particles between 100 and 120 um in diameter. For FF encapsulation using this nebulizer and these alginate and cell conditions, an air flow is required at a pressure of 60mBar. And encapsulation is carried out at a speed of 3mL / h. The particles fall into a 3% calcium chloride bath while stirring, the stirring must be strong enough to keep the capsules moving and separate from each other. The microsphere jet cannot fall directly on the eddy produced by the agitator. Once the encapsulation is complete, the capsules are collected using a 70 um filter. They are washed with abundant PBS and resuspended in 2mL of LB and 200uL of this capsule suspension is distributed for each antibiotic condition to be tested, in this example two antibiotics will be used at 4 concentrations each plus the control, so 200ul would be distributed in each of the nine conditions to be tested in 3mL of LB growth medium + the antibiotic concentration to be tested.25 The capsules were incubated at 37 ° C, 200rpm for 6h. At 6h, 10uL of each condition is taken and the microcolonies are analyzed by microscopy. The microcolonies are counted and the distribution of their diameters is represented according to the antibiotic conditions tested against the control without P20133093314-08- 2013
16 antibiotics and determine which condition is the minimum inhibitory for this particular strain of Acinetobacter. The total time from the inoculum of the alginate, until obtaining results is 7-8h. Example 2: Identification of resistance resistance The encapsulation and analysis procedure is the same as that described in Example 1. 5 However, under certain conditions and in the presence of specific antibiotics the presence of heteresistance in axenic microbial populations has been described, the methodology described in the present invention allows the identification of these resistant clones within a majority population sensitive. The characterization of these clones and the possibility of their study is a fundamental tool for clinical microbiology.10 The identification of resistant clones in mostly sensitive populations may have an important significance when explaining factors such as the development of multiresistance and pathogenic reserves. .P20133093314-08-2013