ES2521495T9 - Procedimiento y kit para probar si una planta específica se ha expuesto a un pesticida específico - Google Patents

Description

Procedimiento y kit para probar si una planta específica se ha expuesto a un pesticida específico

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento y un kit para la detección de efectos de pesticidas en plantas antes de cualquier signo visual, es decir, los signos morfológicos son detectables en la planta. Más específicamente, la 5 invención se refiere a un procedimiento simple y rápido de detección de compuestos químicos en plantas vivas expuestas a pesticidas que incluyen herbicidas. El kit y procedimiento se correlacionan con compuestos fitoquímicos que no se han separado con exposición de una planta a pesticidas o herbicidas. El kit proporciona un procedimiento simple y rápido de detección de efectos de pesticidas y herbicidas en el campo.

Antecedentes de la invención 10

Las plantas y animales se exponen a estrés continuamente o temporalmente durante su tiempo de vida. Se sabe que diferentes tipos de estrés, diferentes tiempos de exposición y diferentes cantidades de un único tipo de estrés pueden influir de forma diferente dependiendo de las especies de plantas o animales.

Se han usado compuestos fitoquímicos como biomarcadores para obtener un patrón de biomarcador (documento WO 01/92879). Un patrón de biomarcador en plantas se define como los cambios en la composición y contenido de los 15 compuestos fitoquímicos detectados en plantas después de la exposición a herbicidas.

La detección y/o predicción de los efectos de pesticidas finales en plantas es de especial interés para la industria agropecuaria, principalmente para reducir y controlar el uso de productos químicos tales como pesticidas. Puede realizarse una reducción y/o control de la cantidad de pesticidas usados cuando los efectos de pesticidas puedan detectarse y/o predecirse poco tiempo después de la exposición al pesticida. 20

La presente invención desvela un procedimiento simple, rápido y altamente sensible de prueba de los efectos finales de productos químicos en plantas poco tiempo después de la exposición a productos químicos tales como pesticidas. El procedimiento aprovecha un cambio en la composición de los compuestos químicos y estos compuestos pueden usarse como biomarcadores en el material de una planta cuando se expone a estrés. Particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento de prueba de los efectos no visuales, además de los visuales, sobre plantas 25 expuestas a estrés químico producido por pesticidas.

Resumen de la invención

La invención se refiere a un procedimiento simple y rápido para probar si material de una planta específica se ha expuesto a un pesticida específico, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) obtener material de una planta específica, 30

b) preparar una suspensión líquida de la planta específica de a) en el que la suspensión líquida de la planta específica comprende al menos un compuesto fitoquímico,

c) detectar los compuestos fitoquímicos en la suspensión líquida de b) por su color de luz visible y/o UV, en el que la detección se realiza sin separación de dichos compuestos fitoquímicos,

d) correlacionar dicho color de los compuestos fitoquímicos detectados con una escala estándar de colores de luz 35 visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para la planta específica y el pesticida específico,

e) evaluar si la planta específica se ha expuesto al pesticida específico.

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de preparación de una escala estándar para evaluar si una planta viva específica se ha expuesto a un pesticida específico, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) someter una planta viva específica a un pesticida específico, 40

b) obtener material de la planta expuesta de a),

c) determinar respuestas químicas de la planta específica por una detección de color de luz visible y/o UV sin realizar una separación de los compuestos fitoquímicos de la planta,

d) obtener una escala estándar de colores de luz visible y/o UV únicos de los compuestos fitoquímicos no separados para la combinación de planta específica y pesticida específico. 45

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit de ensayo para su uso en el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicho kit:

- al menos un papel de filtro,

- al menos un disolvente,

- al menos un medio para estrujar, 5

- al menos una escala de visualización convencional de colores de luz visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para la detección y/o predicción de la exposición a un pesticida específico,

- al menos un recipiente.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Intensidad de color de dos tipos diferentes de tiras (tira A y B) de material de planta en relación con la tasa de 10 exposición a diferentes herbicidas y correlacionada con el crecimiento reducido de las plantas (peso fresco y seco). Los colores PANTONE® (indicados en las columnas), la intensidad (AU) (indicada por la altura de las columnas) calculada en el equipo CAMAG y el crecimiento reducido (peso fresco y seco (indicados por las gráficas)) como el 100 % - el peso relativo calculado 21 días después de la exposición: Apera spica-venti 4 y 7 días después de la exposición a los herbicidas Hussar (fig. 1e y fig. 1f), Atlantis (fig. 1a y fig. 1b), Monitor (fig. 1g y fig. 1h) y Lexus (fig. 1m y fig. 1n); Lolium 15 perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar (fig. 1 y fig. 1); Poa annua 4 días después de la exposición al herbicida Atlantis (fig. 1c y fig. 1d); Alopecurus myosuroides 4 y 7 días después de la exposición al herbicida Lexus (fig. 1k y fig. 1I) y Bromus hordeaceus 4 y 7 días después de la exposición al herbicida Monitor (fig. 1i y fig. 1j). La descripción de los colores de las tiras y, por tanto, de las columnas de la figura puede verse de la tabla 4 y 5 en las que también se indica el número de color según la escala de color Pantone. La intensidad de color indica el nivel 20 de los compuestos probados por cada prueba, y cuanto más oscuro sea el color, más es el material de planta afectado por el tratamiento con herbicida.

Figura 2. Resultados del estudio n.º 972/04. Ballico perenne (Lolium perenne) expuesto a Hussar (1 N = 200 g/ha) con tratamiento con lluvia 0, 1 y 4 horas después de la aplicación. ▲ = % de efecto (peso fresco), • = % de efecto (peso seco). Fig. 2a: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar sin aditivo y sin lluvia; fig. 2b: Lolium 25 perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar con aditivo y sin lluvia; fig. 2c: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar sin aditivo y lluvia después de 1 hora; fig. 2d: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar con aditivo y lluvia después de 1 hora; fig. 2e: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar sin aditivo y lluvia después de 4 horas; fig. 2f: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar con aditivo y lluvia después de 4 horas. Se da más información en los 30 ejemplos. Para una descripción de las columnas y gráficas véase la leyenda para la figura 1.

Figura 3: Resultados del estudio n.º 946/06. Ballico perenne (Lolium perenne) expuesto a Atlantis y sin lluvia o con lluvia 1 o 3 horas después de la aplicación. 1N: 480 g/ha de Atlantis solo y sin lluvia, 1920 g/ha con lluvia, 120 g/ha con aditivo y sin lluvia, 960 g/ha con aditivo y con lluvia. ▲ = % de efecto (peso fresco), • = % de efecto (peso seco). fig. 3a: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Atlantis sin aditivo y sin lluvia; fig. 3b: Lolium perenne 4 35 días después de la exposición al herbicida Atlantis con aditivo y sin lluvia; fig. 3c: Lolium perenne 7 días después de la exposición al herbicida Atlantis sin aditivo y sin lluvia; fig. 3d: Lolium perenne 74 días después de la exposición al herbicida Atlantis con aditivo y sin lluvia; fig. 3e: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Atlantis sin aditivo y lluvia después de 1 hora; fig. 3f: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Atlantis con aditivo y lluvia después de 1 hora. fig. 3g: Lolium perenne 7 días después de la exposición al herbicida Atlantis sin 40 aditivo y lluvia después de 1 hora; fig. 3h: Lolium perenne 7 días después de la exposición al herbicida Atlantis con aditivo y lluvia después de 1 hora; fig. 3i: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Atlantis sin aditivo y lluvia después de 3 horas; fig. 3j: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Atlantis con aditivo y lluvia después de 3 horas; fig. 3k: Lolium perenne 7 días después de la exposición al herbicida Atlantis sin aditivo y lluvia después de 3 horas; fig. 3I: Lolium perenne 7 días después de la exposición al herbicida Atlantis con 45 aditivo y lluvia después de 3 horas. Se da más información en los ejemplos. Para una descripción de las columnas y gráficas véase la leyenda para la figura 1.

Figura 4: Resultados del estudio n.º 945/06. Ballico perenne (Lolium perenne) expuesto a Hussar OD solo y en mezcla con 0,5 l/ha de Oxitril, 0,6 l/ha de Starane o 1 pastilla/ha de Express. ▲ = % de efecto (peso fresco), • = % de efecto (peso seco) 1N = 30 ml/ha. fig. 4a: Lolium perenne 4 días después de expuesto a Hussar; fig. 4b: Lolium perenne 7 50 días después de expuesto a Hussar; fig. 4c: Lolium perenne 4 días después de expuesto a Hussar con 0,5 l/ha de Oxitril; fig. 4d: Lolium perenne 7 días después de expuesto a Hussar con 0,5 l/ha de Oxitril; fig. 4e: Lolium perenne 4 días después de expuesto a Hussar con 0,6 l/ha de Starane; fig. 4f: Lolium perenne 7 días después de expuesto a Hussar con 0,6 l/ha de Starane; fig. 4g: Lolium perenne 4 días después de expuesto a Hussar con 1 pastilla/ha de

Express; fig. 4h: Lolium perenne 7 días después de expuesto a Hussar con 1 pastilla/ha de Express. Para una descripción de las columnas y gráficas véase la leyenda para la figura 1.

Figura 5: Resultados del estudio en campo. Ballico perenne (Lolium perenne), agrostis espiga de viento (Apera spica-venti) y poa anual (Poa annua) expuestos a Hussar OD en otoño (“efterår”) de 2005 y primavera (“forår”) de 2006 (Hobro y Sealand). ▲ = % de efecto de aplicación en otoño (peso fresco), • = % de efecto de aplicación en primavera 5 (peso fresco). 1N para ballico perenne fue en el otoño 150 g/ha y 200 g/ha en la primavera. Las dosis correspondientes para agrostis fueron 100 g/ha en el otoño para agrostis y 150 g/ha en la primavera. 1N para poa anual fue 150 g/ha en el otoño y 200 g/ha en la primavera. fig. 5a: Lolium perenne 4 días después de la exposición a Hussar en otoño de 2005 y primavera de 2006; fig. 5b: Lolium perenne 7 días después de la exposición a Hussar en otoño de 2005 y primavera de 2006; fig. 5c: Poa annua 4 días después de la exposición a Hussar en otoño de 2005 y primavera de 10 2006; fig. 5d: Poa annua 7 días después de la exposición a Hussar en otoño de 2005 y primavera de 2006; fig. 5e: Apera spica-venti 4 días después de la exposición a Hussar en otoño de 2005 y primavera de 2006; fig. 5f: Apera spica-venti 7 días después de la exposición a Hussar en otoño de 2005 y primavera de 2006. Para una descripción de las columnas y gráficas véase la leyenda para la figura 1.

Figura 6: Resultados del estudio en campo. Ballico perenne (Lolium perenne), agrostis espiga de viento (Apera spica-15 venti) y poa anual (Poa annua) expuestos a Atlantis en otoño (“efterår”) 2005 y primavera (“forår”) de 2006 (Hobro y Sealand 917/06). ▲ = % de efecto de aplicación en otoño (peso fresco), ● = % de efecto de aplicación en primavera (peso fresco). 1N para ballico perenne en otoño fue 200 g/ha y 300 g/ha en primavera. Las dosis correspondientes para agrostis fueron 150 g/ha en otoño y 150 g/ha en primavera. 1N para poa anual fue 200 g/ha en otoño y 300 g/ha en primavera. fig. 6a: Lolium perenne 4 días después de la exposición a Atlantis en otoño de 2005 y primavera de 2006; 20 fig. 6b: Lolium perenne 7 días después de la exposición a Atlantis en otoño de 2005 y primavera de 2006; fig. 6c: Lolium perenne 4 días después de la exposición a Atlantis en otoño de 2005 y primavera de 2006; fig. 6d: Lolium perenne 7 días después de la exposición a Atlantis en otoño de 2005 y primavera de 2006; fig. 6e: Lolium perenne 4 días después de la exposición a Atlantis en primavera de 2006; fig. 6f: Lolium perenne 7 días después de la exposición a Atlantis en primavera; fig. 6g: Poa annua 4 días después de la exposición a Atlantis en otoño de 2005 y primavera de 25 2006; fig. 6h: Poa annua 7 días después de la exposición a Atlantis en otoño de 2005 y primavera de 2006; fig. 6i: Apera spica-venti 4 días después de la exposición a Atlantis en otoño de 2005 y primavera de 2006; fig. 6j: Apera spica-venti 7 días después de la exposición a Atlantis en otoño de 2005 y primavera de 2006. Para una descripción de las columnas y gráficas véase la leyenda para la figura 1.

Figura 7: Resultados del estudio en campo n.º (948/06). Ballico perenne (Lolium perenne) tratado con Hussar OD (1 N 30 = 75 ml/ha) en tres etapas de crecimiento diferentes (1.º aplicación = etapa 12; 2.º aplicación = etapa 30.2; 3.º aplicación = etapa 32), ▲ = % de efecto (peso fresco). fig. 7a: Lolium perenne 4 días después de la exposición a Hussar, tratamiento en la etapa de crecimiento de la planta 12; fig. 7b: Lolium perenne 7 días después de la exposición a Hussar, tratamiento en la etapa de crecimiento de la planta 12; fig. 7c: Lolium perenne 4 días después de la exposición a Hussar, tratamiento en la etapa de crecimiento de la planta 30.2; fig. 7d: Lolium perenne 7 días después 35 de la exposición a Hussar, tratamiento en la etapa de crecimiento de la planta 30.2; fig. 7e: Lolium perenne 4 días después de la exposición a Hussar, tratamiento en la etapa de crecimiento de la planta 32; fig. 7f: Lolium perenne 7 días después de la exposición a Hussar, tratamiento en la etapa de crecimiento de la planta 32; para una descripción de las columnas y gráficas véase la leyenda para la figura 1.

Figura 8: Resultados del estudio de semi-campo. Diente de león germinado de semilla, Taraxacum vulgare Weber, 40 expuesto al herbicida Roundup Bio. ■ = % de reducción de biomasa (peso fresco) 24 semanas después de la exposición. ▲= % de reducción de biomasa (peso seco). SDT = semanas después del tratamiento.

Figura 9: Resultados del estudio de semi-campo. Diente de león germinado de raíz, Taraxacum vulgare Weber, expuesto al herbicida Roundup Bio. ■ = % de reducción de biomasa (peso fresco) 24 semanas después de la exposición. ▲= % de reducción de biomasa (peso seco). 1N para 360 g/ha. SDT = semanas después del tratamiento. 45

Descripción detallada de la invención

Por la presente invención ha sido posible detectar si una planta viva se ha expuesto o no a pesticidas aplicando un procedimiento de prueba simple y altamente sensible. Las plantas pueden producir diferentes cantidades y/o diferentes tipos de compuestos químicos tras la exposición a pesticidas cuando se comparan con plantas vivas sin pesticida.

Especialmente ha sido posible detectar y/o predecir efectos de pesticidas en plantas antes de signos visuales, es decir, 50 los signos morfológicos son detectables sobre las plantas. La invención se refiere a un procedimiento en campo simple y rápido para detectar compuestos químicos en plantas expuestas a pesticidas. El nivel y/o tipo de compuestos químicos/fitoquímicos del organismo vivo pueden correlacionarse con efectos finales en el organismo vivo, por ejemplo, crecimiento reducido o muerte y también pueden correlacionarse con una dosis correspondiente de un factor de estrés tal como la dosis de un pesticida. 55

Un aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de detección de si material de una planta específica se ha expuesto a un pesticida específico, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) obtener material de una planta específica,

b) preparar una suspensión líquida de la planta específica de a) en el que la suspensión líquida de la planta específica comprende al menos un compuesto fitoquímico, 5

c) detectar los compuestos fitoquímicos en la suspensión líquida de b) por su color de luz visible y/o UV, en el que la detección se realiza sin separación de dichos compuestos fitoquímicos,

d) correlacionar dicho color de los compuestos fitoquímicos detectados con una escala estándar de colores de luz visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para la planta específica y pesticida específico,

e) evaluar si la planta específica se ha expuesto al pesticida específico. 10

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de preparación de una escala estándar para evaluar si una planta viva específica se ha expuesto a un pesticida específico, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) someter una planta viva específica a un pesticida específico,

b) obtener material de la planta expuesta de a),

c) determinar respuestas químicas de la planta específica por una detección de color de luz visible y/o UV sin realizar 15 una separación de los compuestos fitoquímicos de la planta,

d) obtener una escala estándar de colores de luz visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para la combinación de planta específica y pesticida específico.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit de ensayo para su uso en el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicho kit: 20

- al menos un papel de filtro,

- al menos un disolvente,

- al menos un medio para estrujar,

- al menos una escala de visualización convencional de colores de luz visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para la detección y/o predicción de la exposición a un pesticida específico, 25

- al menos un recipiente.

La presente invención se basa en proporcionar un patrón de biomarcador o un patrón de visualización, por ejemplo, como patrón de color de un grupo mezclado o no separado de compuestos químicos o fitoquímicos obtenidos en extractos de una planta. Opcionalmente, el grupo no separado de compuestos químicos o fitoquímicos puede hacerse reaccionar con un reactivo químico antes de obtener el patrón de biomarcador o un patrón de visualización. Cuando se 30 obtiene un extracto, este puede incluir compuestos químicos o fitoquímicos que se ensayan juntos en una etapa sin separar el grupo de compuestos en compuestos individuales. Uno o más grupos de compuestos químicos o bioquímicos o fitoquímicos obtenidos de un organismo vivo tal como en un extracto y que no se separan en subgrupos de compuestos o en compuestos individuales pueden llamarse “compuestos químicos mezclados”, “compuestos químicos no separados” o “compuestos químicos reunidos”. Una muestra, por ejemplo, un extracto de planta de tales 35 compuestos químicos no separados puede llamarse una muestra no separada. “Químico” puede sustituirse con “fitoquímico” si los compuestos químicos se obtienen de plantas.

En una realización preferida, la detección está siendo realizada sin realizar una separación de los compuestos químicos o de los compuestos químicos reaccionados.

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, en una realización la invención podría referirse a un 40 procedimiento de detección y/o predicción de efectos finales de estrés sobre un organismo vivo determinando este efecto directamente basado en el grupo no separado del producto químico, comprendiendo dicho procedimiento

- obtener material de un organismo vivo, que puede o puede no haberse expuesto a una cantidad de un factor de estrés,

- proporcionar una forma ensayable de al menos una parte de dicho material de organismo vivo, 45 comprendiendo dicha forma ensayable de material de organismo vivo al menos un grupo de compuestos químicos,

- detectar al menos un grupo de compuestos químicos opcionalmente por una detección visual y/o detección de luz UV,

- correlacionar dicho resultado con un resultado convencional,

evaluando el efecto final para dicho material de planta viva.

Los compuestos probados como al menos un grupo de compuestos químicos pueden ser al menos uno del grupo de 5 compuestos químicos que está naturalmente presente dentro de un organismo o que se produce en un organismo debido al efecto de un tratamiento de estrés, realizándose dicho tratamiento debido a que se producen naturalmente cambios en el entorno, por ejemplo, calor, lluvia, sequía, influencia por insectos u otros animales, o debido a cambios realizados por el ser humano, por ejemplo, riego, tratamiento químico. El grupo de compuestos químicos probados puede seleccionarse de los grupos mencionados en cualquier parte en el presente documento. 10

En plantas, los compuestos fitoquímicos o patrón de biomarcador pueden detectarse como un grupo de compuestos que muestran una reacción de color (o detección en luz UV) sobre una tira/disco. El color e intensidad de la tira/disco indican el efecto final como una reducción sobre el crecimiento o muerte de las plantas después de la exposición al estrés químico tales como pesticidas, por ejemplo, herbicidas.

Los compuestos químicos no separados obtenidos de un organismo vivo pueden tener, dependiendo de la actual 15 cantidad y tipos de compuestos químicos, algunas características únicas que pueden usarse para determinar el nivel de estrés impuesto al organismo vivo. Cualquier procedimiento de detección útil puede usarse para distinguir entre diferentes muestras de compuestos químicos no separados. La detección puede realizarse con compuestos químicos no separados reaccionados con compuestos químicos o con compuestos químicos no separados que no han reaccionado con ningún otro compuesto para realizar una reacción química. 20

Para simplificar la descripción de la presente invención, el siguiente texto se referirá a material por el que el organismo vivo se ejemplifica por plantas y el procedimiento de detección de los compuestos fitoquímicos no separados se ejemplifica por una reacción de color que puede detectarse en luz visible o en luz ultravioleta (luz UV). El término “compuestos químicos” se ejemplifica por compuestos bioquímicos en organismo vivos y compuestos fitoquímicos como compuestos presentes en plantas o células de planta. Además, la invención desvela particularmente el uso de 25 compuestos fitoquímicos en el control de la pulverización de herbicidas, aunque el efecto de otros factores de estrés también pueda probarse por la presente invención.

Si los compuestos fitoquímicos no separados se obtienen de una planta, estos pueden hacerse reaccionar con un reactivo químico y una reacción de color puede detectarse tanto en luz visible como en luz UV y semi-cuantificarse usando la intensidad del color. En una realización preferida, el color se visualiza sobre un soporte sólido. En una 30 realización más preferida, el color se visualiza sobre una tira o un disco hecho de un material que puede retener los compuestos fitoquímicos opcionalmente junto con líquido que comprende extracto de planta, disolventes y/o un reactivo químico. También pueden detectarse de una manera similar compuestos no separados que no reaccionan con un reactivo químico.

El color e intensidad de los compuestos fitoquímicos reaccionados cuando se aplican sobre el soporte sólido es 35 diferente dependiendo del estrés impuesto a la planta, por ejemplo, dependiente de la dosis de un pesticida o herbicida. El color e intensidad del color puede correlacionarse con una escala de color estándar para determinar/predecir el efecto final como, por ejemplo, crecimiento reducido de la planta o muerte de la planta. El extracto obtenido de una planta no expuesta a un estrés tal como pesticida/herbicida tiene un color de tira/disco y/o intensidad de color diferente cuando se compara con extractos de plantas expuestas a pesticidas/herbicidas. El 40 extracto de diferentes especies de plantas libres de estrés puede producir diferentes colores y/o intensidad de color sobre la tira/disco y por este documento el procedimiento de la presente invención puede diferenciar las diferentes especies de planta antes de la exposición al estrés.

Una escala estándar de colores y/o intensidad de color obtenida sobre el soporte sólido puede obtenerse cuando se prueban y/o analizan grupos de productos fitoquímicos obtenidos de diferentes plantas de tipo similar, por ejemplo, de 45 variedad similar que se someten a series de cantidad de estrés, por ejemplo, se someten a un intervalo de estrés de no pulverización a dosis completas recomendadas de un herbicida o incluso por encima de tales dosis completas recomendadas. La escala de color obtenida basándose en productos fitoquímicos extraídos de plantas caracterizadas por series de plantas no expuestas a expuestas completas sigue los cambios de biomasa relativos (reducción del crecimiento) de la planta. Si la producción relativa de biomasa, por ejemplo, tras el tratamiento con herbicida es alta y 50 así la reducción en el crecimiento es baja, el color de la tira/disco será pálido y menos intenso cuando se compara con material de planta obtenido de una planta en la que las biomasas relativas son bajas y así la reducción en el crecimiento es alta.

Para cada especie de, por ejemplo, una planta de mala hierba expuesta a cierta dosis de pesticida/herbicida, una escala de color e intensidad de color obtenida sobre una tira/disco puede correlacionarse con una escala de color estándar que indica la reducción en el crecimiento calculado en porcentaje de los cambios en biomasa relativos (reducción del crecimiento). Diferentes colores e intensidad de tiras pueden indicar diferentes especies de plantas no expuestas. 5

La presente invención se basa en el reconocimiento de que los compuestos fitoquímicos en plantas expuestas a estrés, tales como pesticidas, están relacionados con y dependen de los pesticidas usados y sus modos de acción en la planta. El inventor ha encontrado reacciones de color reproducibles y únicas de composición no separada de grupos de compuestos fitoquímicos en plantas después de la exposición a un factor de estrés, tal como un pesticida, siendo dichas reacciones de color únicas para el factor de estrés específico y nivel de estrés aplicado, y únicas para la familia 10 de plantas individuales, más preferido las especies de planta individuales, tales como con variedades de plantas individuales. La reacción de color única puede considerarse una huella molecular del efecto de un pesticida específico en la planta en cuestión, es decir, la planta específica que va a probarse. Así, la presente invención ofrece una oportunidad para evaluar/determinar si una planta se ha expuesto a factores de estrés, tales como pesticidas, a pesar del hecho de que la posible exposición no pueda evaluarse por inspección visual de dicha planta como signos visuales. 15

Adicionalmente, la presente invención ofrece una oportunidad para predecir o determinar en una etapa temprana del crecimiento de la planta un efecto final debido a un tratamiento con herbicida. Un procedimiento tal permite que un agricultor pruebe si una cantidad de un herbicida, por ejemplo, una cantidad reducida de herbicida con respecto a una dosis recomendada completa, tiene el efecto esperado sobre una mala hierba. La presente invención también da a un agricultor la oportunidad de predecir o determinar en una etapa temprana del crecimiento de la planta un efecto final 20 debido a un tratamiento con herbicida, por ejemplo, después de tiempo lluvioso poco después de aplicar el herbicida a las plantas. Si el efecto final predicho es inferior al esperado es posible volver a pulverizar en una etapa temprana del crecimiento de la planta, siendo esto antes de que sea posible una inspección visual del efecto de la pulverización.

Por el término “inspección visual” se indica una inspección visual habitual a simple vista, por la cual pueden inspeccionarse cambios morfológicos tales como cambios en el color, clorosis, necrosis, marchitamiento, etc. de la 25 planta.

Pueden producirse ciertos nuevos compuestos químicos en la planta después de la exposición al estrés, o la concentración de compuestos ya existentes puede cambiar, por ejemplo, por una acumulación de ciertos compuestos químicos en las plantas. Además, el color obtenido basado en compuestos químicos no separados también puede relacionarse con una disminución o incluso una eliminación de compuestos químicos en las plantas después de la 30 exposición al estrés. Estos cambios de concentración de compuestos, eliminación de compuestos y/o producción de nuevos compuestos después de la exposición al estrés pueden ser debidos a cambios en las rutas bioquímicas de las plantas.

Por consiguiente, un color obtenido basado en un único grupo de compuestos químicos no separados es una huella molecular única de la composición de compuestos fitoquímicos, es decir, compuestos endógenamente producidos en 35 la planta después de la exposición a un factor de estrés, es decir, una exposición externa, y dicha huella molecular es única para cada tipo de factores de estrés, tales como pesticidas, o para un grupo de factores de estrés.

En un aspecto de la invención, los compuestos presentes en las plantas después de la exposición son los mismos que antes de exposición, pero la concentración de los compuestos individuales es diferente, por lo que se ha producido una nueva huella molecular de los compuestos fitoquímicos después de la exposición. 40

En un aspecto de la invención, la presencia de cambios fitoquímicos y el grado de sensibilidad de la planta a la exposición al estrés puede ser dependiente de la edad de la planta. Plantas jóvenes tienden a ser más sensibles a la exposición de estrés, tales como herbicidas, que plantas más viejas. Mediante cualquier medio, una huella molecular de los compuestos fitoquímicos puede detectarse en una etapa temprana después del tiempo de exposición en una planta joven a diferencia de la etapa tardía de detección de una huella molecular de los compuestos fitoquímicos en 45 una planta más vieja. Este conocimiento de la correlación entre la edad de la planta y el tiempo necesario para que la planta desarrolle una huella molecular de los compuestos fitoquímicos (es decir, sensibilidad) puede usarse para determinar hace cuánto tiempo se expuso una cierta planta a factor(es) de estrés. Debido a su alta sensibilidad, las plantas jóvenes muestran menor estabilidad de los cambios bioquímicos, es decir, la huella molecular de los compuestos fitoquímicos es más estable en plantas más viejas y puede observarse durante todo el resto de vida de la 50 planta más vieja. Sin embargo, plantas más jóvenes tienen una mayor sensibilidad al estrés y también una mayor tasa de mortalidad. Pocas especies de plantas jóvenes sobrevivirán a la exposición al estrés las primeras semanas después de la emergencia, mientras que las plantas más viejas están menos afectadas.

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para la detección del tiempo transcurrido desde que un organismo vivo se ha expuesto a un factor de estrés específico y/o para la detección de la cantidad de factor de estrés 55 específico, dicho procedimiento comprende

- obtener material de un organismo vivo, que puede o puede no haberse expuesto a una cantidad de un factor de estrés,

- proporcionar una forma ensayable de al menos una parte de dicho material de organismo vivo, comprendiendo dicha forma ensayable de material de organismo vivo al menos un grupo de compuestos químicos,

- opcionalmente proporcionar al menos un reactivo químico aplicable para una reacción química con el al 5 menos un grupo de compuestos químicos,

- opcionalmente provocar una reacción química entre dicho al menos un reactivo químico y dicho al menos un grupo de compuestos químicos de dicho material de organismo vivo,

- detectar dicho al menos un grupo de compuestos químicos opcionalmente basado en el resultado de dicha reacción química, en el que dicha detección es opcionalmente por una detección visual y/o detección de luz UV, 10

- correlacionar dicho resultado con un resultado convencional,

- evaluar el tiempo transcurrido desde que dicho organismo vivo se ha expuesto a un factor de estrés específico y/o evaluar la cantidad del factor de estrés específico.

Por consiguiente, la presente invención aprovecha varios parámetros, tales como las respuestas fitoquímicas y el tiempo después de la exposición al estrés en el que se producen, los efectos fisiológicos, los tipos, números y 15 concentraciones de compuestos biosintetizados en las plantas después de la exposición a pesticidas.

En una realización de la invención, la huella molecular de los compuestos fitoquímicos de la composición de la planta puede referirse a un grupo de productos fitoquímicos, tales como a al menos 2 grupos de productos fitoquímicos. En otra realización de la invención, la huella molecular de los compuestos fitoquímicos de la composición se refiere a al menos 3 grupos de productos fitoquímicos, tales como al menos 4 grupos de productos fitoquímicos, por ejemplo, al 20 menos 5 grupos de productos fitoquímicos, tales como al menos 6 grupos de productos fitoquímicos, por ejemplo, al menos 7 grupos de productos fitoquímicos, tales como al menos 8 grupos de productos fitoquímicos, por ejemplo, al menos 9 grupos de productos fitoquímicos, tales como al menos 10 grupos de productos fitoquímicos. Los grupos de productos fitoquímicos pueden seleccionarse entre los productos fitoquímicos mencionados en cualquier parte en el presente documento. 25

Por el término “escala de color estándar” se indica una escala de color de la composición de compuestos presente en una planta después de la exposición a factores de estrés conocidos. Una escala de color estándar puede basarse en colores obtenidos cuando uno o más grupos de compuestos fitoquímicos u otros compuestos del organismo se hacen reaccionar con uno o más reactivos químicos. La escala de color también puede basarse directamente en uno o más grupos de compuestos químicos no reaccionados con un reactivo. La visualización de los colores se describe en 30 cualquier parte en el presente documento.

Según la invención, la huella molecular relacionada con uno o más grupos de compuestos fitoquímicos inducida debido a estrés producido por un compuesto conocido o desconocido, es decir, la respuesta de color anteriormente descrita, se correlaciona con una escala de color estándar. Con el fin de interpretar la huella molecular relacionada con compuestos fitoquímicos del material de prueba que se ha expuesto a factores de estrés conocidos o desconocidos, es 35 un requisito previo proporcionar escalas de color estándar. La reacción de color o huella molecular relacionada con compuestos fitoquímicos del material de prueba que se ha expuesto a factores de estrés conocidos o desconocidos puede entonces correlacionarse con escalas de color estándar. Las escalas de color estándar pueden obtenerse para un factor de estrés particular o para una combinación de al menos dos factores de estrés diferentes, tales como al menos tres factores de estrés diferentes, por ejemplo, al menos cuatro factores de estrés diferentes, tales como al 40 menos cinco factores de estrés diferentes, por ejemplo, al menos seis factores de estrés diferentes, tales como al menos siete factores de estrés diferentes, por ejemplo, al menos ocho factores de estrés diferentes.

Es posible preparar una escala de color estándar para material de un organismo vivo que se ha expuesto a estrés que comprende las etapas de:

- someter un organismo vivo a tipos de estrés conocidos, a cantidad conocida de un único o múltiples tipos de 45 estrés o a no estrés,

- obtener material de dicho organismo vivo,

- determinar las respuestas químicas de dicho material de dicho organismo vivo para cada tipo de estrés o para cada combinación de tipos de estrés o para cada nivel de estrés, y

- obtener al menos una escala de color estándar relacionada con compuestos fitoquímicos relacionada con 50 dichos tipos de estrés o a dicho nivel de estrés.

La descripción en el presente documento se aplica a tanto un procedimiento de proporcionar una escala de color estándar relacionada con compuestos fitoquímicos de plantas expuestas a diferentes tipos de estrés y/o diferente nivel de estrés, además de a un procedimiento de prueba de si material de un organismo vivo se ha expuesto a estrés, y adicionalmente a un procedimiento de predicción del efecto final del organismo vivo sometido al estrés.

El material sobre el que se realiza la prueba puede ser de cualquier material vivo, tal como de animales, por ejemplo, 5 mamíferos, invertebrados de la tierra e insectos, o de talofitas, tales como hongos o algas. Sin embargo, en una realización preferida de la invención, el material de un organismo vivo es material de planta.

En otra realización preferida, el material está seleccionado de plantas, hongos o algas. Lo siguiente es una descripción de una realización de la invención, en la que el material de un organismo vivo se origina de plantas. La descripción de esta realización de la invención usando plantas también se refiere a otras realizaciones de la invención en las que el 10 material de un organismo vivo no es material de planta.

Así, en una realización de la invención, el procedimiento de prueba es para determinar la huella molecular química relacionada con compuestos fitoquímicos después de la exposición al estrés.

El material de planta de la invención puede seleccionarse de entre cualquier planta o células de planta. El material de planta puede elegirse de planta vascular, pteridofitas, plantas de semilla, las gimnospermas, las angiospermas, mono- 15 y dicotiledóneas. En una realización preferida de la invención, el material de planta se elige de, pero no se limita a, dicotiledóneas o monocotiledóneas. También se prefiere material de planta elegido de plantas que se consideran que son una mala hierba, especialmente es de interés mala hierba en plantas de cultivo. La mala hierba se considera una planta que compite con la planta de cultivo de forma que la planta de cultivo es negativamente influida tanto en el crecimiento como en la composición. 20

Según la invención, las plantas dicotiledóneas pueden seleccionarse de las familias de Asteráceae, Brassicaceae, Lamiaceae, Polygonaceae, Papaveraceae, Primuláceae, Plantagináceae y Scrophulariaceae y las plantas monocotiledóneas pueden seleccionarse de las familias de Poáceae.

Las plantas también pueden seleccionarse de las familias de Convolvolaceae, Umbelliferae, Oenotheraceae, Papilivanaceae, Violaceae, Malvaceae, Euphorbiaceae, Geraniaceae, Cruciferae, Fumariaceae, Urticaceae, 25 Caryophyllaceae, Portulacaceae, Amarnthaceae, Cnenopodiaceae, Ranunculaceae, Boraginaceae, Labiatae, Solanaceae, Rubiaceae, Compositae, Graminea, Cyperaceae, Alismataceae, Lemnaceae, Potamogetonnaceae, Hydrocharitaceae, Juncaceae, Liliaceae, Convallariaceae, Iridacaea o todas las familias presentes.

En una realización preferida, la planta se selecciona de una planta de los géneros Apera, Alopecurus, Lolium, Bromus, Setaria, Echinochloa, Stellaria, Papaver, Polygonum, Galeopsis, Sinapis, Amaranthus, Brassica, Tripleurospermum, 30 Matricaria y Poa.

En otra realización preferida, la planta se selecciona del grupo de especies de plantas Apera spica-venti, Alopecurus myosuroides, Lolium perenne, Bromus hordaceus, Avena fatua, Stellaria media, Tripleurospermum inodorum, Chenopodium album, Amaranthus retroflexus, Galeopsis sp., Papaver rhoeas, Lolium sp., Setaria sp., Echinocloa crus-galli y Conyza canadensis y Poa annua. 35

Según la invención, el material de planta usado para realizar el procedimiento de prueba puede ser la planta entera o puede ser al menos un área seleccionada de cualquier parte de la planta. El área seleccionada de la planta puede ser un área tal como de al menos flores, brotes, hojas, tallos, raíces, semillas, polen, rizomas, estámenes, sépalos, pétalos, carpelos, estilos, estigmas, microsporangios, anteras, frutos, cotiledones, hipocótilos, epicótilos, xilema y/o floema (madera), peridermo (corteza), yemas, yemas florales, conos, escalas del cono, tubérculos, bulbos, nódulos de la raíz, 40 resinas o savia, o una combinación de los mismos.

Se prefiere material de planta obtenido de una o más flores. También se prefiere material de planta obtenido de uno o más brotes. También se prefiere material de planta obtenido de una o más hojas. Adicionalmente se prefiere material de planta obtenido de uno o más tallos. Todavía adicionalmente se prefiere material de planta obtenido de una o más raíces. También se prefiere material de planta obtenido de una o más semillas. 45

El kit de prueba puede desarrollarse para probar plantas en la etapa de crecimiento de BBCH 12 (2 hojas) a la etapa de crecimiento de BBCH 23 (macollo). La etapa/fase también puede ser 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26.

Una vez se obtiene una muestra del material de planta, empieza una segunda etapa en el procedimiento según la invención. Es un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento de prueba, en el que el material de 50 planta usado está en una forma adecuada para ensayar. Una forma tal puede ser una forma líquida, por ejemplo, una suspensión líquida. Una suspensión líquida del material de planta puede obtenerse aplicando disolventes de extracción, tales como agua o etanol al material de planta. El disolvente puede garantizar que se extraigan todos los

compuestos de uno o más grupos químicos presentes en el material de planta. El material de planta ensayable puede ser fresco o no fresco. También una suspensión líquida obtenida directamente del organismo o estrujando el organismo puede ser adecuada para la prueba sin ninguna extracción por un disolvente, por ejemplo, savia de la planta. La suspensión líquida puede filtrarse antes de utilizarse en la prueba, aunque también puede usarse suspensión no filtrada. 5

En una realización preferida de la invención, el material de planta está fresco. El material fresco puede usarse para el análisis inmediatamente después de recolectar dicho material o puede usarse para análisis hasta algunos minutos después de su recolección. El material fresco puede analizarse en el plazo de al menos 15 min, tal como 30 min, por ejemplo, 45 min, tal como 1 hora, por ejemplo, 2 horas, tal como 3 horas. Se prefiere que el material fresco se use tan pronto como sea posible después de su recolección para evitar procedimientos de descomposición, tales como 10 actividad enzimática. Preferentemente, el material fresco se analiza en el plazo de 1 hora.

En una realización, el material de planta está congelado. El material congelado de planta puede congelarse hasta el punto o momento del análisis, tal como congelarse durante un periodo de al menos 1 semana, tal como al menos 1 mes, por ejemplo, al menos 1 año, tal como al menos 3 años, por ejemplo, al menos 5 años y puede descongelarse/derretirse antes de realizar la prueba. El material de planta congelado puede analizarse dentro de al 15 menos 15 min, tal como 30 min, por ejemplo, 45 min, tal como 1 hora, por ejemplo, 2 horas, tal como 3 horas. Sin embargo, se prefiere que el material congelado de planta se use para análisis inmediatamente después de sacarse del almacenamiento frío. Puede usarse cualquier procedimiento de congelación para congelar el material de planta. Se prefiere cuando el material de planta se somete al procedimiento de congelación inmediatamente después derecolectar, por ejemplo, en el plazo de 5 min, tal como en el plazo de 15 min, por ejemplo, en el plazo de 30 min, tal 20 como en el plazo de 45 min, por ejemplo, en el plazo de 60 min, tal como en el plazo de 75 min, por ejemplo, en el plazo de 90 min, tal como dentro de 105 min, por ejemplo, en el plazo de 120 min.

En otra realización de la invención, el material de planta está seco. El procedimiento de secado puede realizarse por aire, o nitrógeno, o puede ser un procedimiento de liofilización, tal como secado con nitrógeno. Adicionalmente, el material de planta puede secarse con calor, tal como secarse al sol. El material de planta puede estar sustancialmente 25 seco, y la longitud del procedimiento de secado depende del tipo de material de planta. El secado al aire puede ser a aproximadamente 20º C y, por ejemplo, sin calor y luz. El calor y la luz podrían destruir los compuestos del material.

La longitud del periodo de tiempo antes de que las plantas reaccionen a la exposición al pesticida y la sensibilidad de las especies de plantas al pesticida pueden depender de diferentes factores, tales como las especies y edad de la planta. Las diversas especies de plantas tienen diferente sensibilidad a los tipos de pesticida, por ejemplo, la especie 30 de planta Lolium perenne es más sensible al herbicida de sulfonilurea yodosulfuron que Apera spica-venti o Poa annua. Por tanto, una menor dosis del herbicida expuesto a Lolium perenne que a Apera spica-venti o Poa annua puede detectarse como respuesta fitoquímica correspondiente a un mayor biomasa reducida a Lolium perenne que a Apera spica-venti o Poa annua. Con respecto a la edad, las plantas de semillero pueden ser más sensibles que las plantas más viejas a los herbicidas y, por tanto, las plantas de semillero son más sensibles al herbicida. 35

En una realización, el procedimiento y kit se desarrolla con respecto a un organismo vivo mencionado en cualquier parte en el presente documento en al menos una etapa de desarrollo seleccionada de las escalas de crecimiento 0, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8 o 9 que representan etapas de germinación, brotación, desarrollo de la yema, desarrollo de hojas, formación de brotes laterales/macollamiento, alargamiento de tallos o crecimiento en roseta, desarrollo de brotes (brote principal), desarrollo de partes de plantas vegetativas cosechables u órganos vegetativos de 40 propagación/embuchamiento (brote principal), emergencia de inflorescencias (brote principal)/espigamiento, florecimiento (brote principal), desarrollo de frutos, maduración o madurez de fruto y semilla, senescencia, inicio de la dormancia. Las escala de crecimiento se describen adicionalmente en “Growth stages of mono- and dicotyledonous plants”, BBCH Monograph, 2.º edición 2001. Editado por Uwe Meier, Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry. 45

En una realización, el procedimiento y kit se desarrolla para ser útil sobre una especie de planta o variedad dentro de un periodo de tiempo que dura durante al menos más que el tiempo que el organismo tiene que crecer dentro de una escala de crecimiento. Por este documento, el procedimiento y kit pueden desarrollarse para ser usados en, por ejemplo, escala de crecimiento 0 y 1 (parcialmente o completamente), o escala de crecimiento 1 y 2 (parcialmente o completamente); escala de crecimiento 2 y 3 (parcialmente o completamente); escala de crecimiento 3 y 4 50 (parcialmente o completamente). Por tanto, más de dos escalas de crecimiento pueden ser cubiertas mediante el procedimiento y kit, por ejemplo, escala de crecimiento 0 a 2 (parcialmente o completamente), escala de crecimiento 1 a 3 (parcialmente o completamente), escala de crecimiento 2 a 4 (parcialmente o completamente), escala de crecimiento 0 a 3 (parcialmente o completamente), escala de crecimiento 1 a 4 (parcialmente o completamente), escala de crecimiento 0 a 4 (parcialmente o completamente). 55

La presente invención se refiere además a un procedimiento de prueba que tiene una sensibilidad mejorada, es decir, límite de detección cuando se compara con otras pruebas. Por límite de detección se indica la dosis posible más baja

de pesticidas que puede determinar el kit de prueba de la invención. Es posible detectar un efecto fitoquímico por debajo del nivel de dosificación recomendado de, por ejemplo, pesticidas. La “dosis recomendada” es la dosis eficaz necesaria para obtener un resultado dado como, por ejemplo, efecto final como muerte de la planta o al menos > 80 % de reducción del crecimiento. Según la invención, el procedimiento de prueba puede realizarse sobre plantas que están expuestas a la dosis de 0 a dosis recomendada o igual. Una dosis de hasta 1/32 dosis de dosis recomendada sin 5 ningún signo visual sobre la planta puede detectarse como efecto fitoquímico sobre la tira/disco, dependiendo de la especie de planta o por el color de la suspensión líquida o el extracto. Algunas plantas pueden recuperarse de una exposición, y la detección puede tener lugar antes de tal recuperación. Entonces se detectará un efecto fitoquímico y ningún cambio en el efecto final en comparación con las plantas no expuestas. En tales casos, el límite de detección del kit de prueba relacionado con la dosis de exposición del pesticida está en un punto en el que el efecto fitoquímico 10 se corresponde con un cambio en la biomasa final.

Puede obtenerse una escala de color estándar aplicando plantas de especies similares y/o variedad a una serie de estrés, por ejemplo, a una serie de herbicida que incluye plantas libres de estrés. La serie de estrés puede ser el nivel de estrés, por ejemplo, inducir 0, 25 %, 50 %, 75 % y 100 % de muerte de la planta, o puede ser 0, 25 %, 50 %, 75 % y 100 % de dosis de herbicida, en la que el 100 % es la dosis recomendada, por ejemplo, la dosis recomendada por el 15 fabricante del herbicida. Puede determinarse una escala de color estándar aplicando series de estrés de niveles seleccionados del 0, 1, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 95 y el 100 % de efecto o dosis como se ha descrito anteriormente, también dosis por encima del 100 %, es decir, pueden incluirse por encima del nivel recomendado cuando se produzca una escala de color estándar.

Como un ejemplo no limitante, el procedimiento de preparación de una escala de color estándar para mala hierba de 20 planta que se ha expuesto a estrés en forma de un herbicida puede comprender las etapas de:

- someter diferentes grupos de plantas de malas hierbas a no herbicida o cada grupo a una dosis diferente del herbicida en el intervalo de dosis muy bajas con respecto a la dosis recomendada a dosis correspondientes a o que superan la dosis de aplicación recomendada del herbicida,

- obtener material de dichas plantas de malas hierbas vivas, por ejemplo, en diferentes momentos después de 25 la exposición de las plantas al herbicida, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 días después de la exposición,

- determinar las respuestas químicas del material de dichas plantas de malas hierbas viva a cada tratamiento con herbicida determinando un color basado en los cambios químicos realizados directamente y/o indirectamente por el herbicida, por ejemplo, a compuestos fitoquímicos,

- determinar el efecto final de cada tratamiento con herbicida sobre las plantas de malas hierbas de las que no 30 se ha quitado material de planta,

- correlacionar el color que indica las respuestas químicas del material de planta tratado con herbicida con el efecto final del tratamiento con herbicida, y

- obtener al menos una escala de color estándar relacionada con compuestos fitoquímicos relacionada con el herbicida y al nivel de herbicida aplicado sobre las plantas. 35

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, la escala de color estándar puede determinarse al menos 1 día después de que las plantas se sometan al estrés, tal como al menos 2 días, por ejemplo, al menos 3 días, tal como al menos 4 días, por ejemplo, al menos 5 días, tal como al menos 6 días, por ejemplo, al menos 7 días, tal como al menos 8 días, por ejemplo, al menos 9 días, tal como al menos 10 días, por ejemplo, al menos 11 días, tal como al menos 12 días, por ejemplo, al menos 13 días, tal como al menos 14 días, por ejemplo, al menos 15 días, tal 40 como al menos 16 días, por ejemplo, al menos 17 días, tal como al menos 18 días, por ejemplo, al menos 19 días, tal como al menos 20 días, por ejemplo, al menos 21 días, tal como al menos 22 días, por ejemplo, al menos 23 días, tal como al menos 24 días, por ejemplo, al menos 25 días, tal como al menos 26 días, por ejemplo, al menos 27 días, tal como al menos 28 días, por ejemplo, al menos 29 días, tal como al menos 30 días, por ejemplo, al menos 31 días.

La longitud del periodo de tiempo antes de que las plantas reaccionen a la exposición al estrés puede depender de 45 numerosos factores, tales como la especie y edad de la planta. Algunas plantas pueden recuperarse de una exposición, y la detección puede tener lugar antes de una recuperación tal. Sin embargo, puede ser posible detectar biomarcadores después de que la planta se haya recuperado de la exposición. Sin desear quedar ligado a teoría, la detección de biomarcadores puede ser posible para algunas plantas durante la vida entera de las plantas, mientras que la detección de biomarcadores de otras plantas solo puede ser posible dentro de un cierto periodo de tiempo. Esto 50 puede depender, por supuesto, de la naturaleza de la especie de planta y de los factores de estrés como tales, por ejemplo, el nivel de concentración de pesticidas.

La longitud del periodo de tiempo antes de que las plantas reaccionen a la exposición al pesticida y la sensibilidad de la especie de planta al pesticida puede depender de diferentes factores, tales como la especie y edad de la planta. Las

diversas especies de planta tienen diferente sensibilidad a los tipos de pesticida, por ejemplo, la especie de planta Lolium perenne es más sensible al herbicida de sulfonilurea yodosulfuron que Apera spica-venti o Poa annua. Por tanto, una menor dosis del herbicida expuesta a Lolium perenne que a Apera spica-venti o Poa annua puede detectarse como respuesta fitoquímica correspondiente a una mayor biomasa reducida a Lolium perenne que a Apera spica-venti o Poa annua. Con respecto a la edad, las plantas de semillero pueden ser más sensibles que las plantas 5 más viejas a los herbicidas y, por tanto, las plantas de semillero son más sensibles al herbicida.

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, con respecto a las plantas de prueba (3-4 hojas), estas especies de planta/variedades se expusieron a 1/32 (3,125 %) de la dosis de herbicida recomendada y los compuestos fitoquímicos se detectaron y se correlacionaron con los efectos finales como crecimiento reducido antes de que aparecieran visualmente signos sobre las plantas. 10

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, por consiguiente, la detección del efecto fitoquímico puede ser posible en tanto que la planta esté viva. Esta detección puede realizarse entre menos de un día y hasta al menos 21 días después de la exposición, tal como entre 1-20 días después de la exposición, por ejemplo, entre 4-7 días después de la exposición. El momento de prueba también puede ser cualquiera de los días mencionados con respecto a producir una escala de color estándar o el momento de prueba puede ser incluso después. Un momento de 15 prueba después también puede ser en un momento cuando el organismo se ha procesado, por ejemplo, cuando el material de planta de una cosecha se ha procesado en un producto para venderlo en el mercado. Este producto puede incluir adicionalmente componentes, por ejemplo, granos de una cosecha se procesan en harina a partir de la cual se produce pan. Probando el pan puede ser posible probar si el material de cosecha usado se ha expuesto a estrés, a qué tipo de estrés y/o si la planta era una planta genéticamente modificada. 20

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, en una realización el procedimiento de prueba de los efectos se refiere a todos los pesticidas que representan grupos con diferente modo de acción, por ejemplo, glifosato y herbicidas similares a glifosato o herbicidas de sulfonilurea.

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, la detección de una huella molecular en una planta puede servir en una realización de la invención al fin de una señal de “aviso temprano” de exposición al estrés antes de 25 que aparezca cualquier signo visual sobre la planta.

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, se ha informado que cuando las plantas se exponen a estrés pueden reaccionar cambiando su composición fitoquímica. La presente invención presenta un procedimiento por el cual se obtienen huella molecular reproducible relacionada con compuestos fitoquímicos, proporcionando así posiblemente herramientas analíticas para el establecimiento de exposición a e identificación de compuestos 30 conocidos, además de desconocidos. Hay una variedad de factores de estrés que pueden todos tener un impacto sobre la composición química de las plantas. La planta puede exponerse a más de un factor de estrés, en el que en una realización el efecto de la exposición es sinérgico y así produce una huella molecular relacionada con compuestos fitoquímicos que reflejan el efecto sinérgico de los factores de estrés individuales. En otra realización, en la que la planta puede exponerse a más de un factor de estrés, la huella molecular resultante relacionada con compuestos 35 fitoquímicos refleja el efecto antagonista de los factores de estrés individuales. Está dentro del alcance de la invención desarrollar una huella molecular estándar relacionada con compuestos fitoquímicos para cualquier combinación de factores de estrés.

Según la invención, uno de los factores de estrés es abiótico, tal como estrés químico y/o estrés físico.

En el presente contexto, el estrés químico puede producirse por pesticidas, tales como herbicidas. Los herbicidas están 40 todos diseñados para destruir plantas alterando y afectando la homeostasis bioquímica de las células de la planta. Las plantas reaccionan a la exposición de herbicidas produciendo o descomponiendo compuestos fitoquímicos. Pueden también reaccionar cambiando la concentración de compuesto(s) ya existente(s). El efecto resultante sobre las plantas depende del modo individual de acción del herbicida.

En una realización de la invención, el procedimiento de prueba para la exposición de pesticidas se refiere a herbicidas 45 y/o pesticidas que comprenden principios activos seleccionados del grupo que consiste en glifosato, bromoxinil, pendimetalina, metsulfuron-metilo, prosulfocarb, clodinafop-propargilo, fenoxaprop-p-etilo, iodosulfuron, sulfosulfuron y flupirsulfuron o una combinación de los mismos. Los principios activos pueden todos representar diferentes modos de acción sobre las plantas diana. Los pesticidas/herbicidas con estos principios activos se usan todos ampliamente en América del Norte y Europa Occidental para el control de, por ejemplo, plantas de hoja ancha y gramíneas. Otros 50 pesticidas distintos a los mencionados anteriormente también están dentro del alcance de la invención. Pueden ser los descritos en The Pesticida Manual, British Crop Protection Council, por ejemplo, insecticidas, acaricidas, nematicidas/vermicidas, rodenticidas y fungicidas pueden ser los factores inductores del estrés.

El glifosato (GLY) es un herbicida no selectivo que controla plantas de hoja ancha anuales y perennes emergentes y gramíneas. El glifosato inhibe la actividad de la enzima EPSP (5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato) de la ruta biosintética de 55

ácidos aromáticos en plantas. Se absorbe a través de la cutícula de la cera sobre las hojas y se produce un rápido desplazamiento mediante el floema a las raíces, rizomas y meristemas apicales. Se degrada por la rápida acción microbiana, con una semivida de 3-5 semanas. Es no volátil y no se degrada fotoquímicamente. La solubilidad en agua es 11,6 g/l a 25º C . Se une fuertemente a partículas de la tierra y mediante esto es inmóvil, a menos que se transporte con la tierra. 5

El bromoxinil (BRY) es un herbicida selectivo con algo de actividad sistemática. El herbicida se absorbe por el follaje mediante penetración cuticular. El bromoxinil destruye por inhibición de la fotosíntesis y respiración de la planta en plantas de hoja ancha anuales. Se degrada rápidamente en la mayoría de los tipos de tierra, con una semivida en el orden de dos semanas que puede reducirse considerablemente a bajas temperaturas. Es soluble en agua (130 mg/l), potencialmente perjudicial para los peces y los invertebrados acuáticos para los que es tóxico si alcanza cuerpos de 10 agua.

La pendimetalina (PEN) es un herbicida selectivo que inhibe el crecimiento celular inhibiendo la división celular de todas y cada una de las células de la planta actuando de toxina mitótica. Se absorbe por las raíces y las hojas, pero inicialmente limita el crecimiento de las raíces, tal como el desarrollo de raíces laterales o secundarias. La pendimetalina es moderadamente persistente en limo arenoso húmedo (semivida 50 días) a altamente persistente en 15 tierra limosa húmeda (semivida 140 días) y en limo arcillo limoso seco (250 días). Es un herbicida muy estable, excepto cuando se volatiliza de superficies de tierra húmeda (Barrett & Lavy 1983). La solubilidad en agua es 0,3 mg/l a 20 °C. Así, es probable que se transfiera a otros compartimentos medioambientales, aunque puede moverse con partículas de tierra a cuerpos de agua en los que es tóxico para los peces.

El metsulfuron-metilo (METS) es un potente inhibidor del crecimiento de las plantas usado sobre cultivos de trigo y 20 cebada para el control de especies de hoja ancha y la supresión de algunas gramíneas. El herbicida es absorbido por el follaje o las raíces y se desplaza mediante el xilema y el floema. El metsulfuron-metilo es un herbicida selectivo que actúa inhibiendo la enzima acetolactato sintasa (ALS) que cataliza la síntesis de los tres aminoácidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina. El mecanismo de acción preciso es desconocido, pero poco después de la aplicación del herbicida se detiene rápidamente la división de las células de la planta, y se produce la muerte en el 25 plazo de una a tres semanas. La acumulación de sustratos de ALS (por ejemplo, -cetobutirato) en hojas puede ser responsable del cese del crecimiento de la planta con disminución de la producción de nuevas hojas y órganos reproductores. El metsulfuron-metilo es móvil en la mayoría de las tierras y la movilidad se potencia a medida que aumenta el pH.

Todos los herbicidas anteriormente mencionados se aplican actualmente a cultivos importantes, tales como maíz, trigo, 30 cebada, sojas, avenas, guisantes, patatas y tomates. Cuando se aplican herbicidas a un campo cultivado de cultivos adyacentes, las áreas no objetivo también pueden afectarse por los herbicidas. Aunque no es según la presente invención como se reivindica, la presente invención podría usarse para probar si malas hierbas o plantas de cultivo en cultivos tratados con el herbicida responden como era de esperar a este tratamiento con herbicida. Aunque no es según la presente invención como se reivindica, la invención también podría usarse para probar si plantas en un área 35 no objetivo como se ha descrito anteriormente en realidad están afectadas por un tratamiento en el campo cultivado adyacente. Por este documento, la prueba puede indicar si cultivos ecológicamente cultivados en realidad están libres de herbicidas u otra exposición química.

Además, aunque no es según la presente invención como se reivindica, el procedimiento de prueba podría aplicarse a plantas que están potencialmente expuestas a estrés físico, tales como temperatura, viento, luz UV, daño físico, calidad 40 de la tierra y humedad de la tierra.

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, los factores de estrés podrían ser bióticos, tales como estrés biológico y/o alelopatía. El término “estrés biológico” se indica como estrés y daño posiblemente visual producido por herbívoros, patógenos de las plantas y/o competición de otras plantas. Lo último también puede denominarse alelopatía, tal como competición de otras plantas y/o compuestos químicos de otras plantas que afectan/estresan la 45 planta sobre la que se realiza una prueba.

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, hay una diferencia en la sensibilidad de plantas contra diversos factores de estrés, y podría, por tanto, recomendarse para usar plantas sensibles. Esto permite la detección de pesticidas que se han aplicado a plantas objetivo en incluso muy pequeñas concentraciones. Un ejemplo de una planta modelo es Anagallis arvensis. 50

El término “fitoquímico” como se usa en el presente documento se refiere a cualquier producto químico o compuesto o nutriente o compuesto esencial presente en las plantas. Hay un amplio número de compuestos presentes en las plantas. Algunos de los compuestos son fácilmente detectables bajo circunstancias en las que las plantas no se exponen a pesticidas. Si, sin embargo, las plantas se exponen a pesticidas, las rutas bioquímicas dentro de las células de la planta pueden afectarse. La influencia de pesticidas sobre la ruta bioquímica puede conducir a un aumento o 55

cambio, tal como eliminación en la concentración de compuestos ya existentes, o puede conducir a la producción de compuestos normalmente no presentes en plantas no expuestas a pesticidas.

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, en una realización de la invención podría determinarse la composición de compuestos fitoquímicos de al menos un tipo y/o grupo.

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, en una realización de la invención el producto 5 fitoquímico podría ser una sustancia, o al menos parte de una sustancia, o un derivado de los grupos aminoácidos, aminas, azúcares, flavonoides, compuestos fenólicos, sapogeninas, saponinas, iridoides, glucósidos, alcaloides, alcaloides alcalinos, compuestos que contienen C, compuestos que contienen N, compuestos que contienen S, compuestos que contienen P, compuestos que contienen O, cualquier elemento esencial, terpenoides, lípidos, esteroides, carotenoides, quinonas, cumarinas y nutrientes, tales como cualquier compuesto necesario para que la 10 planta sobreviva, por ejemplo, sales. Los compuestos fitoquímicos también pueden asociarse al compuesto químico o partes de los compuestos químicos usados como estrés químico para las plantas, por ejemplo, descomposición del compuesto químico que va a desintoxicarse de las plantas por una reacción con los grupos reactivos de los compuestos fitoquímicos.

Por el término elementos esenciales se indica cualquier compuesto representado en el sistema periódico. 15

El análisis químico de pesticidas es muy difícil cuando la presencia del pesticida en el entorno es baja. Además, es muy caro realizar cribados químicos para compuestos químicos, tales como pesticidas y/o sus compuestos de descomposición y/o adyuvantes presentes en pesticidas. Por la presente invención es ahora posible determinar factores de estrés diferentes, tales como pesticidas por un procedimiento de prueba simple y asequible.

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, en una realización de la invención el procedimiento de 20 prueba podría comprender las siguientes etapas:

- poner en contacto una forma ensayable de material de planta con un soporte para recibir dicho material de planta,

- someter dicho soporte a un disolvente,

- opcionalmente secar dicho soporte, 25

- opcionalmente poner en contacto dicho soporte con un reactivo químico,

- obtener una huella molecular relacionada con compuestos fitoquímicos de dicha forma ensayable.

En otra realización de la invención, el procedimiento de prueba comprende las siguientes etapas:

- obtener una forma ensayable de al menos un grupo de componentes químicos de material de planta, por ejemplo, por extracción de los componentes químicos con un disolvente, 30

- opcionalmente hacer reaccionar dicho al menos un grupo de componentes químicos con un reactivo,

- poner en contacto un soporte con los componentes químicos extraídos o con los componentes químicos reaccionados con un reactivo,

- opcionalmente secar dicho soporte,

- opcionalmente poner en contacto dicho soporte con un reactivo químico, 35

- detectar dichos componentes químicos extraídos o dichos componentes químicos reaccionados con un reactivo, en el que dicha detección puede ser debida a un color de los componentes químicos extraídos o un color de dichos componentes químicos reaccionados con un reactivo y por este medio

- obtener una huella molecular relacionada con compuestos fitoquímicos de dicha forma ensayable de material de planta. 40

En el presente contexto, una forma ensayable puede ser un líquido, o un líquido mezclado con sólidos, tales como líquidos mezclados con sales.

En otra realización, la prueba que comprende etapas similares como se ha descrito anteriormente, pero la reacción química se realiza antes de la forma ensayable del material de planta, se pone en contacto con un soporte, por este documento el soporte no necesita someterse a un disolvente. 45

El obtener una huella molecular relacionada con compuestos fitoquímicos puede estar en forma de una reacción de color sobre el soporte.

En una realización, el reactivo químico o disolvente se basa en uno o más de los compuestos seleccionados del grupo de vainillina, ácido sulfúrico, naftoresorcinol, azul de metileno, β-naftol, timol, fluoresceína, amoniaco, verde de bromocresol, azul de bromofenol, permanganato de potasio, 2,7-diclorofluoresceína, rodamina 6G, éster 2-aminoetílico 5 de ácido difenilbórico, ácido fosfórico, yodo, yoduro de potasio, cloruro de amoniomolibdatoestaño (II), cloruro de cobalto (II), cloruro de paladio (II), 1-naftol, ninhidrina, nitrato de bismuto (III), yoduro de potasio, molibdato ácido fosfórico, rodamina B, anisaldehído, nitrato de plata, cloruro de hierro (III), cloruro de cinc, rojo de clorofenol, rojo de metilo, rojo de etilo, azul de bromotimol, sal sódica de 2,6-diclorofenolindofenol, púrpura de bromocresol, ninhidrina, hidróxido potásico, glucosa, 4-cloro-7-nitrobenzofurazano, 2,4-dinitrofenilhidracina, cloroformiato de 9-fluorenilmetilo, 10 hidróxido de tetrabutilamonio, yodo, sulfato férrico (III) amoniacal, 2-metoxi-2,4-difenil-3(2H)furanona (MDPF), borinato de 2-aminoetil-difenilo, cloruro de aluminio, cloruro de berberina dihidratado, sal sódica de 1,2-naftoquinon-4-sulfona, antrona, 8-hidroxiquinolina, 2-aminodifenil(bifenil-2-amina), orcinol, urea, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 4-aminobenzoico, ácido molibdatofosfórico, 2',7'-diclorofluoresceína, sal de amonio de ácido 8-anilinonaftaleno-1-sulfónico, rodamina, nitrato de bismuto (III), yoduro de potasio y productos químicos o mezclas de los mismos. 15

El reactivo químico necesario para la reacción es 0,001 - 10 mg/ml de extracto dependiendo del mecanismo de reacción, condiciones y adicionales.

El soporte para recibir el material puede ser un material sólido, soporte sólido o al menos material sólido, tal como un material blando, por ejemplo, un material líquido. El soporte puede pretratarse con una sustancia que puede promover reacciones cuando se ponen en contacto con el material de planta. Dichas reacciones pueden ser visuales detectables, 20 radiactivas, fluorescentes o inmunológicas. Se prefiere cuando el soporte sólido está hecho de un material adecuado que funciona de papel de filtro, tal como, por ejemplo, nitrocelulosa o papel Whatman.

En una realización preferida, el material sólido o soporte sólido está en forma de una tira o un disco. También se prefiere una tira o disco hecho de una tela que puede absorber al menos una parte de la disolución con los productos fitoquímicos opcionalmente reaccionados con un reactivo químico. 25

El soporte sólido está opcionalmente en el kit descrito en cualquier parte en el presente documento. El color del extracto de planta o extracto reaccionado con un reactivo químico puede determinarse poniendo un recipiente con el extracto y con o sin un soporte sólido dentro del recipiente próximo a la escala de color estándar o un resultado estándar y determinar el color del extracto de planta o extracto reaccionado con un reactivo químico. El soporte sólido también puede sacarse del recipiente antes de comparar el color del soporte sólido con los colores de la escala de 30 color estándar.

El soporte sólido puede usarse para ponerse en contacto con el extracto reaccionado, pero también puede usarse para obtener un fondo con un color estándar detrás de un recipiente que contiene una muestra coloreada de una planta, tal como un extracto coloreado. Si el soporte sólido se usa como color de fondo, por ejemplo, un color blanco, esto minimiza el riesgo de una determinación errónea del color del extracto dentro de un recipiente. 35

En una realización, la escala de color estándar puede ser una parte integral del soporte sólido o medio de sujeción que comprenden el soporte sólido. El soporte sólido puede comprender una sección para aplicar el extracto o extracto reaccionado del material que va a probarse y otra sección del soporte sólido puede comprender una escala de color estándar. El medio de sujeción puede ser un casete, por ejemplo, que encierra un soporte sólido y una escala de color estándar puede unirse al casete y/o al soporte sólido encerrado. 40

El soporte sólido también puede servir de tira o disco que se coloca dentro del recipiente con el extracto. El soporte sólido puede absorber parte o todo el volumen del extracto o puede sumergirse dentro del extracto. El color del soporte sólido o del extracto puede determinarse cuando el soporte sólido ha absorbido parte o todo el extracto o cuando el soporte sólido se sumerge dentro del extracto, también el color puede detectarse cuando un volumen del extracto se absorbe sobre solo una parte del soporte sólido. En el último caso, el extracto puede ser succionado por el soporte 45 sólido, por ejemplo, sumergiendo el soporte sólido en el extracto o aplicando extracto sobre el soporte sólido. Por extracto se indica extracto en bruto del organismo que va a probarse, extracto en un disolvente, por ejemplo, en agua o extracto que se ha sometido a una reacción, por ejemplo, una reacción química y/o una reacción de color.

En el procedimiento de prueba según la invención, la evaluación de la exposición al pesticida para material de plantas puede ser cualitativa y/o semi-cuantitativa y/o cuantitativa. En una realización de la invención, la evaluación es 50 cualitativa, y se detectan efectos fitoquímicos como colores diferentes. En otra realización, la evaluación es semi-cuantitativa en la que se evalúan tanto color como intensidad parcialmente cuantitativamente por los medios de tanto inspección visual como uso de un aparato. La concentración de la muestra puede determinarse como valor de intensidad aproximada dentro de un intervalo dado o sistema de puntos. En una realización de la invención, la evaluación es cuantitativa, y el efecto fitoquímico se detecta como intensidad (concentración de los compuestos) que 55

refleja la concentración del pesticida. La evaluación cuantitativa puede realizarse usando un análisis de vídeo, densitómetro de barrido o análisis espectrofotométrico.

En una realización, el uso de reactivos químicos y tira/discos para determinar el efecto del estrés realizado sobre un organismo vivo comprende las siguientes etapas:

- poner en contacto una forma ensayable de dicho organismo vivo, por ejemplo, material de planta con 5 reactivos químicos,

- proporcionar una reacción química entre la forma ensayable de material del organismo vivo y los productos químicos,

- poner en contacto el soporte sólido con el material del organismo vivo químicamente reaccionado con los productos químicos, por este medio 10

- obtener un soporte sólido con un color (o detección en luz UV)

- comparar el color e intensidad de color con un patrón de color,

- evaluar el efecto final esperado del estrés sobre dicho organismo vivo.

El efecto final de un estrés para detectar en el organismo vivo puede ser una reducción en el crecimiento o muerte.

En el presente contexto, el término “disolvente” se indica que cubre una sustancia o una combinación de dos o más 15 sustancias, en el que el disolvente puede ser una combinación de sustancias líquidas y sólidas y gaseosas. Un disolvente puede ser un reactivo, un eluyente o un medio de extracción. Los tres últimos pueden estar en un estado físico sólido o líquido, o pueden estar en forma de un gas.

En una realización de la invención se proporciona un extracto de material de una planta. La extracción puede realizarse bajo temperaturas frías o calientes, tales como por medio de ultrasonidos, o estimulación. 20

El disolvente de extracción puede ser cualquier disolvente útil. Ejemplos no limitantes son agua, alcohol, ácidos, éteres, petróleo, sales o una combinación de los mismos. Los disolventes mencionados pueden estar en cualquier concentración, tal como, por ejemplo, el 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o el 100 %.

Ejemplos de disolventes son disolventes de éter de petróleo, 10 % de ácido ácido en etanol al 96 %, etanol al 75-80 %. La extracción puede realizarse sobre material de la planta fresco o no fresco. 25

Según la invención, los disolventes y el soporte pueden tener diferentes polaridades, tales como entre -0,1-10, por ejemplo, entre 2-8, tal como entre 4-6, como se define por Snyder (1974).

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un kit de ensayo para la determinación de si material de un organismo vivo se ha expuesto a estrés o para determinar el efecto de un estrés sobre un organismo vivo, comprendiendo el kit 30

- al menos un disolvente y/o reactivo,

- al menos una escala de color estándar,

- al menos un recipiente/vaso

- opcionalmente al menos un soporte sólido (por ejemplo, tiras y/o discos).

El disolvente y/o reactivo puede ser disolvente y/o reactivo como se describe en cualquier parte en el presente 35 documento. La cantidad de disolvente/reactivo puede estar entre algunas gotas, por ejemplo, retenidas sobre un soporte sólido o en un matraz a 100 ml. Se prefiere volumen de disolvente/reactivo inferior a 75 ml, por ejemplo, inferior a 50 ml, tal como inferior a 25 ml, por ejemplo, inferior a 15 ml. También se prefiere volumen de disolvente y/o reactivo entre 0,5 y 5 ml, tal como 5-10 ml, por ejemplo, 10-15 ml, por ejemplo, 15-20 ml. El volumen de disolvente y reactivo puede ser diferente. Así, los volúmenes preferidos pueden seleccionarse para cada disolvente/reactivo entre los 40 mencionados anteriormente.

El volumen preferido de extracto en bruto puede ser entre 0,1 ml y 5 ml, tal como entre 0,15 ml y 4 ml, por ejemplo, entre 0,2 ml y 3 ml, tal como entre 0,25 ml y 2 ml, por ejemplo, entre 0,3 ml y 1 ml, tal como entre 0,35 ml y 0,8 ml, por ejemplo, entre 0,4 ml y 0,5 ml.

Puede obtenerse un extracto extrayendo una cantidad de material de planta en un disolvente, la relación entre el peso 45 del material de planta y el volumen de disolvente puede ser entre 1:100 y 1:1, tal como al menos 1:80, por ejemplo, al

menos 1:60, tal como al menos 1:40, por ejemplo, al menos 1:30, tal como al menos 1:25, por ejemplo, al menos 1:20; tal como al menos 1:15, por ejemplo, al menos 1:10, tal como al menos 1:5, por ejemplo, al menos 1:2. Un ejemplo que ilustra la relación descrita es 0,2 mg de material de planta extraído con 3,5 ml de disolvente.

El extracto puede diluirse adicionalmente con el mismo disolvente que se usa para la extracción o con otro disolvente. La relación final entre el peso de material de planta usado inicialmente para la extracción y el volumen total de 5 disolvente opcionalmente antes de realizar cualquier reacción adicional del extracto puede ser entre 1:400 y 1:1, tal como al menos 1:300, por ejemplo, al menos 1:250, tal como al menos 1:200, por ejemplo, al menos 1:150, tal como al menos 1:100, por ejemplo, al menos 1:80; tal como al menos 1:70, por ejemplo, al menos 1:60, tal como al menos 1:50, por ejemplo, al menos 1:40. Un ejemplo que ilustra la relación descrita es 0,2 mg de material de planta extraído con 3,5 ml de disolvente y adicionalmente diluido con 10 ml de disolvente. 10

El disolvente y/o reactivo pueden estar sustituidos con de anticuerpos a sustancias en uno o más de los grupos de compuestos mencionados en cualquier parte en el presente documento. Los anticuerpos cuando se unen a productos fitoquímicos pueden detectarse mediante procedimientos conocidos en la técnica.

En otro aspecto más de la invención se usa una prueba inmunológica, tal como una “tira reactiva”.

La al menos una escala de color estándar también puede ser una descripción de los colores que pueden ser los 15 colores a determinar, es decir, posibles colores del extracto y entre los cuales el usuario tiene que distinguir.

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, la escala de color o la descripción de los colores pueden organizarse con respecto al efecto final de las plantas. La organización puede ser en varios grupos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más grupos. Con respecto a una organización con 3 grupos, cada grupo puede incluir subgrupos relacionados con colores individuales que indican efectos finales. Una organización con 3 grupos, que de nuevo puede 20 basarse en 3 a 10 colores del extracto, puede indicar al usuario que el efecto final del estrés puede caracterizarse como sin efecto o solo poco efecto sobre el crecimiento de la planta; un cierto nivel de reducción en el crecimiento de las plantas, por ejemplo, una reducción del 30-80 %; y muerte o al menos por encima del 90 % de reducción en el crecimiento.

En una realización el kit comprende: 25

- al menos un soporte sólido (por ejemplo, tiras y/o discos),

- al menos un disolvente,

- al menos un medio para estrujar,

- opcionalmente al menos una escala de color estándar,

- al menos un vaso. 30

El kit de ensayo puede comprender además uno o más de los componentes seleccionados del grupo de

- al menos un reactivo químico,

- al menos un mortero con pistilo y/o al menos una caja de bolas para agitar y/o al menos una prensa de mano

- al menos una pipeta,

- al menos una lámpara de UV, 35

- al menos un calentador y/o al menos una cobertera caliente hecha de reactivos químicos y disolventes,

- al menos una balanza,

- al menos unas tijeras,

- al menos un par de pinzas,

- al menos una bolsa de plástico, 40

- al menos una información de identificación para identificar especies de plantas,

- al menos una instrucción que describe cómo usar el kit de ensayo,

- al menos una jeringa,

- al menos un filtro.

Ejemplos de elementos adicionalmente incluidos en el kit comprenden una de las combinaciones, aunque pretende describirse cualquier combinación de los elementos enumerados anteriormente:

 al menos un reactivo químico, mortero con pistilo y/o bolas para agitar y/o prensa de mano, pipeta.

 al menos un reactivo químico, calentador y/o cobertera caliente hecha de reactivos químicos y disolventes, 5 información de identificación para identificar especies de plantas.

 al menos un reactivo químico, mortero con pistilo y/o bolas para agitar y/o prensa de mano, calentador y/o cobertera caliente hecha de reactivos químicos y disolventes, jeringa, filtro.

 calentador y/o cobertera caliente hecha de reactivos químicos y disolventes, balanza, tijeras, información de identificación para identificar especies de plantas, instrucción que describe cómo usar el kit de ensayo. 10

 al menos un reactivo químico, mortero con pistilo y/o bolas para agitar y/o prensa de mano, pipeta, calentador y/o cobertera caliente hecha de reactivos químicos y disolventes, tijeras, par de pinzas, información de identificación para identificar especies de plantas, instrucción que describe cómo usar el kit de ensayo, jeringa, filtro.

En una realización preferida, el kit comprende los siguientes componentes:

- 3 soportes sólidos (por ejemplo, tiras y/o discos), 15

- 3 recipientes con tapas y cada uno con 2, 3 o 4 bolas de vidrio

- 6 vasos,

- 3 jeringas cada una con, por ejemplo, 13,5 ml de disolvente,

- 1-3 recipientes con reactivos químicos,

- 3 pipetas, 20

- 1 balanza,

- 1 tijeras,

- 1 par de pinzas,

- 3 bolsas de plástico,

- 1 información de identificación para identificar especies de plantas, 25

- 1 instrucción que describe cómo usar el kit de ensayo que incluye una escala de color estándar,

- 3 filtros.

Los componentes del kit pueden localizarse en una caja. La caja puede ser de cartón y/o plástico o cualquier otro material adecuado.

Las bolas de vidrio del kit pueden tener cualquier tamaño adecuado tal como entre 1 mM y 3 cM de diámetro, por 30 ejemplo, entre 1,1 mM y 1 cM, tal como entre 1,2 mM y 9 mM, por ejemplo, entre 1,3 mM y 8 mM, tal como entre 1,4 mM y 7 mM, por ejemplo, entre 1,5 mM y 6 mM, tal como entre 1,6 mM y 6 mM, por ejemplo, entre 1,7 mM y 5 mM, tal como entre 1,8 mM y 4 mM, por ejemplo, entre 1,9 mM y 3 mM, tal como entre 2 mM y 2,5 mM.

Las bolas de vidrio se usan para moler o exprimir el material de planta agitando un recipiente cerrado que contiene las bolas de vidrio junto con material de planta y opcionalmente un disolvente. 35

El filtro del kit puede ser un papel de filtro usado para filtrar el extracto o puede ser un cartucho de filtro que incluye el filtro, en el que el cartucho de filtro puede conectarse a una jeringa. La jeringa puede usarse para obligar al extracto o extracto reaccionado a pasar a través del filtro.

Los recipientes con reactivos químicos pueden tener cualquier tamaño adecuado, por ejemplo, un tamaño entre 0,5 y 30 ml. Los recipientes pueden incluir un volumen de reactivo químico correspondiente a varias pruebas que van a 40 realizarse, por ejemplo, a 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más pruebas.

Los disolventes de un recipiente o jeringa puede usarse dividiendo el volumen de forma que el material de planta sea exprimido en una parte del disolvente, por ejemplo, 3,5 ml, por ejemplo, agitando durante, por ejemplo, aproximadamente 2 minutos y luego de nuevo aproximadamente ½ minuto cuando se añaden, por ejemplo, 10 ml de disolvente.

En una realización preferida, el kit de prueba podría detectar el efecto final en plantas debido al tratamiento con 5 herbicidas de sulfonilurea. Las plantas a probar pueden ser Apera spica-venti, Lolium perenne y Poa annua u otra planta de mala hierba u otras plantas. El herbicida puede ser, por ejemplo, Hussar, Atlantis, Monitor y Lexus. Se prefieren Hussar y Atlantis. Las pruebas pueden ser, por ejemplo, una o más de las pruebas descritas en cualquier parte en el presente documento.

El kit de prueba podría usarse para probar plantas tratadas en una etapa temprana tal como 1-15 días después de 10 realizar un tratamiento. Se prefiere una prueba entre 4 y 9 días después de la exposición a los herbicidas, tal como 6 a 8 días después de la exposición. Se prefiere cuando se realiza una prueba 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 días después de la exposición del estrés. Una prueba tal puede usarse para predecir el efecto del estrés realizado, por ejemplo, el efecto de un tratamiento con herbicida.

Si se usa la prueba de la invención para determinar si un organismo se ha sometido a un tipo de estrés específico y la 15 cantidad de este tipo de estrés, la prueba puede realizarse en una etapa tardía a la descrita anteriormente. En esta situación, la prueba puede realizarse, por ejemplo, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o incluso más días después de someter la planta al estrés. En una prueba tal, la fecha actual de una posible exposición al estrés puede no ser posible de interpretar.

El kit de prueba puede desarrollarse para probar plantas en la etapa o fase 12 (2 hojas) a etapa o fase 23 (tupida). La 20 etapa/fase también puede ser 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26.

El kit de prueba puede incluir componentes y reactivos para realizar tres pruebas. Con respecto a un campo de cultivo tratado con herbicida se prefiere que se recojan tres muestras de plantas de malas hierbas de tres sitios diferentes en el sitio tratado. Cada muestra puede ser de, por ejemplo, 20-25 plantas. El kit de prueba también puede incluir componentes para más de 3 pruebas, por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o incluso 25 más.

En una realización, el ensayo comprende componentes, en el que algunos componentes van a usarse varias veces y algunos componentes son desechables.

En una realización, los componentes que pueden reutilizarse son medio para estrujar, por ejemplo, mortero con pistilo y/o al menos una caja con bolas para agitar y/o al menos una prensa de mano, escala de color estándar, vaso, pipeta, 30 lámpara de UV, calentador, balanza, tijeras, par de pinzas, información de identificación para identificar especies de plantas, instrucción que describe cómo usar el kit de ensayo, jeringa, filtro.

En otra realización, los componentes que pueden reutilizarse son medio para estrujar, por ejemplo, mortero con pistilo y/o al menos una caja con bolas para agitar y/o al menos una prensa de mano, escala de color estándar, lámpara de UV, calentador, balanza, tijeras, par de pinzas, información de identificación para identificar especies de plantas, 35 instrucción que describe cómo usar el kit de ensayo.

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, en una realización, los componentes desechables pueden ser soporte sólido (por ejemplo, tiras y/o discos), disolvente, medio para estrujar, por ejemplo, mortero con pistilo y/o al menos una caja con bolas para agitar y/o al menos una prensa de mano, escala de color estándar, vasos, reactivo químico, pipeta, lámpara de UV, calentador y/o al menos una cobertera caliente hecha de reactivos químicos y 40 disolventes, tijeras, par de pinzas, bolsa de plástico, información de identificación para identificar especies de plantas, instrucción que describe cómo usar el kit de ensayo, jeringa, filtro.

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, en otra realización los componentes desechables pueden ser soporte sólido (por ejemplo, tiras y/o discos), disolvente, medio para estrujar, por ejemplo, mortero con pistilo y/o al menos una caja con bolas para agitar y/o al menos una prensa de mano, vasos, reactivo químico, pipeta, 45 calentador y/o al menos una cobertera caliente hecha de reactivos químicos y disolventes, bolsa de plástico, jeringa, filtro.

El kit de ensayo podría restablecerse con componentes desechables después de al menos un uso, por este medio el kit está listo para usarse de nuevo.

Es un fin de la invención reducir los costes y el tiempo del procedimiento de prueba, y al mismo tiempo proporcionar un 50 procedimiento de prueba que tiene excelente sensibilidad. El kit de ensayo de la invención puede usarse para todos los fines prácticos como prueba en el campo, o como prueba de laboratorio. Un objetivo de la invención es tener una prueba accesible fácil que va a usarse comercialmente o a escala privada. Así, el kit de ensayo de la invención es en

una realización práctico y portátil en tamaño y fácil de operar. El material de prueba se pone en contacto con un soporte para recibir dicho material. El material de prueba está en un forma ensayable, por ejemplo, en forma de una suspensión líquida.

Aunque no es según la presente invención como se reivindica, en una realización el kit de ensayo de prueba se produce como un sistema práctico y móvil que puede ser completamente o parcialmente desechable como se describe 5 en cualquier parte. La etapa individual de la prueba puede realizarse en el campo, y no necesita requerir ninguna habilidad técnica particular de la persona que realiza la prueba. La prueba puede completarse en menos de 3 horas desde que se obtiene el organismo vivo, tal como en menos de 2 horas, por ejemplo, menos de 1 hora, tal como menos de 45 min, por ejemplo, menos de 30 min, tal como menos de 15 minutos.

En una realización, el procedimiento de prueba de la invención se realiza con las siguientes etapas: 10

- Se recoge material de planta (material de prueba),

- El material de prueba se corta en pequeños trozos con las tijeras y se pesa sobre la balanza,

- El material se pone en contacto con un disolvente,

- El mortero con un pistilo, o una caja con bolas para agitar, junto con un disolvente, machacan la savia del material de planta. 15

- Puede usarse una prensa de mano para presionar la savia del material de planta.

- La suspensión se filtra a través de un filtro.

- El extracto se pone en contacto con reactivos químicos

- Después de una reacción química se obtiene el extracto reaccionado, que puede tener un color diferente cuando se compara con el extracto 20

- Opcionalmente, el extracto reaccionado se pone en contacto con un soporte sólido, por ejemplo, una tira o disco, y aparecerá un color sobre el soporte sólido,

- El color del propio extracto reaccionado o el color del soporte sólido se compara con una escala de color estándar, de esta comparación puede determinarse el tipo de estrés y/o el efecto del estrés sobre la planta.

En una realización, el kit de prueba comprende recipientes con disolvente y/o reactivos, tal como disolventes y/o 25 reactivos descritos en cualquier parte en el presente documento. Los recipientes pueden estar en forma de, por ejemplo, matraces, vasos y jeringas. Los recipientes pueden tener una tapa.

En otra realización, el kit de ensayo comprende recipientes en los que las reacciones químicas se realizan. Este recipiente puede ser recipiente(s) con disolvente y/o reactivo.

En una realización, todos los componentes del kit de ensayo están contenidos en un recinto, teniendo este 30 opcionalmente una unidad de tamaño bolsillo.

En una realización, el procedimiento de la presente invención se usa para probar si material de planta se expone a estrés a pesticida. La invención también se refiere al uso de un kit de ensayo para la determinación de si una planta se ha expuesto a estrés a pesticida. También puede probarse qué efecto tendrá el estrés del pesticida sobre la planta. En otra realización, la invención puede usarse por un agricultor para evaluar el efecto de un pesticida dado sobre plantas 35 que se exponen a niveles similares o diferentes de un pesticida. De esta forma, el agricultor puede determinar a qué dosificaciones del pesticida se obtiene un cierto efecto sobre las plantas.

En otra realización, la invención puede usarse para identificar plantas no expuestas y/o para identificar especies de plantas y/o variedades de plantas usando las diferencias en composición y concentración de compuestos fitoquímicos, es decir, quimiotaxonomía. La prueba que incluye la escala de color estándar se desarrolla en esta realización con 40 respecto a los diferentes productos químicos de las plantas no expuestas y expuestas y/o los diferentes productos químicos de diferentes especies de plantas y/o los diferentes productos químicos de diferentes variedades de plantas.

En un aspecto de la invención, el procedimiento y/o kit de ensayo se usa para probar si el material de un organismo vivo, que incluye material de planta, se ha expuesto a estrés.

Ejemplos de usos según la invención pueden ser en el control de cultivos tales como determinar efectos de estrés en 45 malas hierbas y plagas tales como plagas de insecto.

El uso del procedimiento y/o ensayo como se describe en el presente documento también puede ser en el control de plantas genéticamente modificadas. Se prevé que la huella molecular relacionada con compuestos fitoquímicos de plantas que están genéticamente modificadas pueda determinarse usando el presente procedimiento de prueba. Las plantas pueden modificarse genéticamente para volverse resistentes a pesticidas, y tales plantas genéticamente modificadas pueden producir compuestos fitoquímicos que se diferencian de los compuestos fitoquímicos de plantas 5 no genéticamente modificadas. En una realización de la invención, la huella molecular relacionada con compuestos fitoquímicos de plantas genéticamente modificadas y plantas no genéticamente modificadas, que no se han expuesto a pesticidas, pueden compararse para detectar la planta genéticamente modificada o no genéticamente modificada. La prueba que incluye la escala de color estándar puede diseñarse para responder con una respuesta sí o no con respecto a si la planta es una planta genéticamente modificada. La prueba también puede dirigirse a una respuesta que 10 indica qué tipo de gen o exactamente qué gen de la planta se modifica.

En otro aspecto, la invención puede usarse en el control de la distribución geográfica de pesticidas. Hábitats no objetivo adyacentes a campos cultivados pueden afectarse por pesticidas durante la aplicación. Esta exposición puede producirse debido a pulverización en exceso, o mediante desplazamiento de la pulverización de la aplicación sobre cultivos objetivo adyacentes a hábitats naturales. También puede proceder de pesticidas que se deslizan o lavados. 15 Los pesticidas pueden desplazarse distancias considerables por aire, tanto por desplazamiento como por volatilización. La prueba que incluye la escala de color estándar puede diseñarse para responder con una respuesta sí o no con respecto a si la planta se ha sometido a pesticida(s). La prueba también puede diseñarse para indicar la cantidad de pesticida aplicada a la planta.

En otro aspecto, la invención puede usarse por el agricultor para evaluar el efecto óptimo de un pesticida dado sobre 20 plantas que se exponen a niveles reducidos de un pesticida. De esta forma, el agricultor puede determinar a qué dosificaciones mínimas de pesticida una planta está todavía respondiendo, y así puede ser capaz de reducir la cantidad de pesticida necesario para obtener un efecto dado en la planta. La prueba que incluye la escala de color estándar puede diseñarse para responder con un sí o no y opcionalmente también una respuesta quizás con respecto a si la planta se ha sometido a pesticida(s) en una cantidad que producirá el efecto deseado del crecimiento de la 25 planta. La prueba también puede diseñarse para indicar la cantidad del pesticida aplicado a la planta.

En otro aspecto más, la invención puede usarse en el control de calidad de alimentos, tal como en el control de la producción agrícola, tal como cultivos. Particularmente, la invención puede usarse para el control de si el cultivo orgánico se ha expuesto a estrés, tal como herbicidas. Es importante poder determinar si los cultivos orgánicos están libres de residuos de productos químicos, tales como herbicidas y/o agentes defoliantes y/o agentes reguladores del 30 crecimiento, tales como agentes de inhibición de la respiración y germinación, agentes retardantes del crecimiento, agentes de formación de raíces, agentes de formación de flores y frutos, agentes promotores de la germinación, agentes que retrasan el florecimiento, agentes de dispersión, compuestos de mantenimiento y agentes de injerto, o libres de residuos de productos químicos usados para: el control o tratamiento de enfermedades de las plantas, hongos destructores de la madera, crecimiento de la planta no deseado, crecimiento de algas, organismos promotores de limo 35 en pasta de papel, animales que pueden dañar plantas de utilidad y cultivadas, plaga sobre animales domésticos, cereal infestado, productos de cereal, semillas y piensos, infestante de textiles, infestante de madera y trabajos en madera, insectos, caracoles, ácaros, gusanos de la lluvia, conejos, topillos de agua, topos, ratones y ratas, o libres de residuos de productos químicos para la prevención de daños producidos por plagas y productos químicos para la exclusión de plagas de áreas geográficas específicas. La prueba que incluye la escala de color estándar puede 40 diseñarse para responder con una respuesta sí o no con respecto a si la planta se ha sometido a estrés. La prueba también puede diseñarse para indicar a qué tipo de estrés se ha sometido la planta.

Procedimientos de control convencionales de prueba para residuos de, por ejemplo, herbicidas incluyen procedimientos analíticos laboriosos y caros, basados en cromatografía de gases o cromatografía de líquidos, tales como HPLC. Sin embargo, como los grupos químicos activos de la mayoría de los herbicidas, agentes desfoliantes y/o 45 agentes reguladores del crecimiento están siendo descompuestos a concentraciones residuales por debajo del límite de detección, la tarea de detectar los productos de descomposición requiere el cumplimiento de varios análisis químicos diferentes para cada herbicida individual, agentes desfoliantes y/o agente regulador del crecimiento.

El procedimiento y/o kit de ensayo de la invención también puede usarse para determinar de qué especie de planta y/o variedad de planta se obtiene un material de planta. 50

El procedimiento de las pruebas descritas en el presente documento también puede diseñarse para basarse en un valor de corte por el cual un desarrollo de color indica una respuesta y si no hay desarrollo de color indica otra respuesta. Esto puede ser especialmente de valor cuando se realiza una prueba para determinar una “respuesta sí o no” como se describe en cualquier parte en el presente documento tal como, por ejemplo, si una planta es una planta genéticamente modificada. El color que indica el valor por encima o por debajo de un color de corte puede realizarse 55 por el color del propio extracto opcionalmente reaccionado con uno o más reactivos químicos, o el color puede ser un color de la escala de color estándar.

Ejemplos

Lo siguiente son ejemplos que ilustran diferentes realizaciones de la invención.

Ejemplo 1

Procedimiento

Material de planta: 5

El procedimiento se probó en 10 especies de plantas diferentes, que representan 4 familias de plantas diferentes que incluyen tanto mono- como dicotiledóneas:

Especies de plantas

Familias de plantas

Monocotiledóneas

Apera spica-venti

Poaceae

Lolium perenne

Poaceae

Poa annua

Poaceae

Lolium multiflorum

Poaceae

Alopercurus myosuroides

Poaceae

Bromus hordeaceus

Poaceae

Avena fatua

Poaceae

Dicotiledóneas

Taraxacum vulgare

Asteraceae

Urtica dioeca

Urticaceae

Stellaria media

Caryophyllaceae

Las plantas se sembraron y se cultivaron en invernadero, algunas se cultivaron como estudios de semi-cultivo con condiciones al aire libre danesas o se recogieron directamente en el campo en Jutland próximo a Hobro o Sealand próximo a Naestved y Kalundborg. 10

Condiciones de invernadero:

Los experimentos se realizaron en invernadero en el Instituto Danés de Investigación Agrícola (ahora Universidad de Aarhus), Centro de Investigación Flakkebjerg, Slagelse, Dinamarca. Se cultivaron plantas en macetas de 2 l en una mezcla para maceta que consistía en tierra, arena y turba (2:1:1 % en peso/peso) que contenía todos los macro- y micro-nutrientes necesarios. Las macetas se colocaron en un invernadero con calefacción (14º C ) con luz artificial 15 suplementaria (fotoperiodo de 16 horas). Las macetas se regaron por debajo dos veces al día con agua desionizada.

Condiciones de semi-campo:

Los experimentos se realizaron al aire libre bajo condiciones de semi-campo en el Instituto Danés de Investigación Agrícola (ahora Universidad de Aarhus), Centro de Investigación Flakkebjerg, Slagelse, Dinamarca. Se cultivaron plantas en macetas de 2 l en una mezcla para maceta que consistía en tierra, arena y turba (2:1:1 % en peso/peso) que 20 contenía todos los macro- y micro-nutrientes necesarios. Las macetas se colocaron al aire libre. Las macetas se regaron por debajo dos veces al día con agua desionizada.

Condiciones de campo:

Los experimentos se realizaron por el Instituto Danés de Investigación Agrícola (ahora Universidad de Aarhus), Centro de Investigación Flakkebjerg, Slagelse, Dinamarca, y la Unión de Agricultores de Hobro - Aalborg, Hobro, Dinamarca. 25 Se seleccionaron campos agrícolas que contenían las especies de plantas de malas hierbas que iban a investigarse.

Herbicidas probados (tabla 1)

Marca registrada

Principio activo (p.a. en g/kg-l) Aditivos Dosis recomendadas

Atlantis WG

Mesosulfuron 30 g/kg + yodosulfuron 6 g/kg Mefenpir-dietilo 90 g/kg (protector) Biopower (1 l/ha) o Renol (0,5 l/ha) 150 g/ha (otoño) 150-300 g/ha (primavera)

Boxer EC

Prosulfocarb 800 g/l Ninguno 3,5 l/ha

Hussar

Yodosulfuron 50 g/kg Mefenpir-dietilo 150 g/kg (protector) Renol (0,5 l/ha) 200 g/ha

Hussar OD

Yodosulfuron 100 g/kg Mefenpir-dietilo 300 g/kg (protector) Renol (0,5 l/ha) 0,1 l/ha (cultivos de invierno)

Lexus 50 WG

Flupirsulfuron-metil-Na 500 g/kg 0,1 % de Lissapol Bio 20 g/ha

MaisTer

Foramsulfuron 300 g/kg + yodosulfuron 10 g/kg Isoxadifeno 272 g/kg (protector) 150 g/ha

Monitor

Sulfosulfuron 800 g/kg 0,1 % de Lissapol 21,88 g/ha

Primera Super

Fenoxaprop-P-etilo 69 g/l Protector 69 g/l 0,2 % de Isoblette 1,0 l/ha

Roundup Bio

Glifosato 360 g/l Ninguno 3,5 l/ha

Stomp 400 EC

Pendimetalina 400 g/l Ninguno 4,0 l/ha

Topik 100 EC

Clodinafob-propargilo 100 g/l Cloquintocet-mexilo 25 g/l (protector) 0,5 l/ha de Renol 0,4 l/ha

Los herbicidas fueron formulaciones comerciales disponibles obtenidas directamente de los fabricantes. La cantidad de los herbicidas se ajustó según la etapa de crecimiento de los cultivos tratados con los herbicidas.

Invernadero

La aplicación de herbicida se llevó a cabo en la etapa de cuatro hojas. Se aplicó una dosis recomendada del herbicida 5 en agua desionizada usando un pulverizador de macetas de laboratorio provisto de dos boquillas de abanico plano Hardi-ISO F-110-02 en un volumen de espray de 145 l ha-1. Las plantas se recolectaron 14 días después de la exposición y se liofilizaron inmediatamente y se mantuvieron secas protegidas de la luz.

Semi-campo

La aplicación de herbicida se llevó a cabo en la etapa de tres a cuatro hojas. Se aplicó una dosis de 0, 1/32 N, 1/16 N, 10 1/8 N, ¼ N, ½ N, 1 N (N = dosis recomendada) del herbicida en agua desionizada usando un pulverizador de macetas de laboratorio provisto de dos boquillas de abanico plano Hardi-ISO F-110-02 en un volumen de espray de 145 l ha-1. Las plantas se evaluaron para efectos visuales antes de recolectarse 4, 7, 14 y 21 días después de la exposición y se congelaron inmediatamente en bolsas de plástico para evitar la evaporación de agua y se mantuvieron en el congelador (-18º C ). 15

Campo

La aplicación de herbicida se llevó a cabo en la etapa de tres a cuatro hojas. Se aplicó una dosis de 0, ¼ N, ½ N, 1 N (N = dosis recomendada) del herbicida en agua desionizada usando un pulverizador de campo. Las plantas se recolectaron 4 y 7 después de la exposición y se probaron directamente en el campo. La reducción de biomasa se determinó 21 días después de la exposición. 20

Efectos visuales sobre plantas expuestas a los herbicidas.

Cuatro, siete, catorce y veintiún días después de la exposición se anotaron los efectos visuales sobre plantas antes de recolectarlas, usando el cuadro de clasificación a continuación en la tabla 2 como se usa en Ravn (2000).

Tabla 2. Sistema de clasificación usado para evaluar efectos visuales (EV) de herbicidas.

Clasificación/ escala

Descripción detallada de efectos visuales observados sobre plantas expuestas a herbicidas

Sin efecto

Efecto traza: Aspecto normal, generalmente asociado a una ligera estimulación del crecimiento

Ligero efecto, es decir, débil biomasa reducida

Efecto moderado: planta 75 % del tamaño de control (disminución del 25 %)

Lesión/daño: plantas más del 50 % del control y con alguna lesión apreciable clara sobre las hojas y el tallo

Lesión evidente: plantas mitad de tamaño del control, epinastia de las hojas ( hojas curvas), partes de la planta deformadas y de color alterado

Efecto herbicida: plantas 25 % del tamaño del control, epinastia de las hojas, partes de la planta deformadas y de color alterado

Buen efecto herbicida: plantas muy pequeñas, epinastia de las hojas, partes de la planta deformadas y de color alterado

Destrucción que se aproxima a completa, solo quedan algunas partes verdes

Destrucción completa/muerte

Procedimiento de extracción/preparación de muestras

En un aspecto de la invención, el disolvente de extracción puede ser un disolvente con una alta solubilidad de lípidos, o un disolvente con solubilidad de lípidos moderada como, por ejemplo, etanol al 75 % o un disolvente hidrófilo como, por ejemplo, 10 % de ácido acético en agua o agua pura.

Material de planta fresco o congelado 10

El material de planta fresco o congelado se cortó en pequeños trozos con unas tijeras. Se pesó una cantidad de 200 mg y se machacó en un mortero/pistilo con 4,00 ml de agua pura. La suspensión acuosa verde se filtró usando una jeringa con un filtro Whatman de 0,45 µm GMF w/GMF inmediatamente antes de uso.

Material de planta liofilizado

Se pesó material de planta liofilizado y se extrajo con etanol al 75 % o con agua pura (50 mg/l). La extracción se realizó 15 en un baño ultrasónico durante 2 horas. La temperatura se mantuvo < 0º C (usando hielo) durante la extracción para evitar la descomposición de biomarcadores. La suspensión acuosa verde se filtró usando una jeringa con un filtro Whatman de 0,45 µm GMF w/GMF antes de uso.

Tira A 20

Se añadieron tres gotas de extractos (una gota = 80,22 mg +/- 22 mg) en vaso médico de plástico (d = 25 mm en el fondo) y se mezclaron con 3 gotas de reactivo A (= vaso I) (8 % de ninhidrina en etanol al 96 %). Se preparó una cobertera calefactora usando un nuevo vaso médico de plástico con 10 gotas de agua y 15 gotas de ácido sulfúrico concentrado (la temperatura será aprox. 70º C) (vaso II). El vaso I se pone inmediatamente en el vaso II. Después de 15 minutos* se sumergió una tira (filtro n.º 526 de 4 cm x 1 cm de Advantec sumergido en parafina de manera que 1 x 25 1 cm es filtro puro) y el color se identificó usando un sólido sin revestir de la guía de formulación PANTONE® (www.pantone.com/register). Las tiras se fotografiaron en una capa de papel creada especial (orificios con diámetro = 5 mm) usando CAMAG Digistore 2 con el software Camag WinCats usando la lámpara CAMAG (luz blanca), una caja CAMAG Reprostar 3 provista de una cámara digital (DXA252 con una lente de 12 mm). Se usó CAMAG VideoScan Programme con software para el análisis informático de la intensidad en unidades UA (alturas de los picos). La tira A 30 detectó el grupo de aminoácidos y derivados de aminoácidos.

Los colores denominado colores PANTONE son como en PANTONE Formula Guide/ Solid Uncoated ISBN 978-1-590650-63-9, cuarta edición, segunda impresión.

Tira B

Se añadieron tres gotas de extractos en vaso médico de plástico y se mezclaron con 10 gotas (0,5 ml) de agua pura y 2 gotas de reactivo B (5 % de -naftol en etanol al 96 %). Se añadieron quince gotas de ácido sulfúrico concentrado (70º C ). El ácido fuerte caliente realizó la reacción química y se produjo una reacción de color. Después de 15 minutos se sumergió una tira en la muestra y el color se identificó usando un sólido sin revestir de la guía de formulación PANTONE® y se fotografió y se analizó como se describe para la tira A. La tira B detectó el grupo de hidratos de 5 carbono y derivados de hidrato de carbono.

*Si solo se evaluó el color PANTONE®, un disco d = 2,5 cm de filtro n.º 590 de Advantec se colocó en el fondo del vaso con la reacción de color para tanto la tira A y B.

Determinación de biomasa

Las biomasas de las plantas se pesaron como peso en gramos por maceta. Se cultivaron seis a diez plantas en cada 10 maceta dependiendo de la especie de planta. Las plantas se recolectaron próximas a la tierra y se pesaron (peso fresco). Entonces, las plantas se colocaron en un armario de secado a 80º C en 18 horas y luego se pesaron de nuevo (peso seco).

Resultados

En la tabla 3 se presentan el herbicida, especies de plantas, dosis, peso fresco y seco relativo de plantas de control y 15 efectos visuales sobre las plantas debidos al tratamiento con herbicida. En la tabla 4 y 5 se indica la reducción en biomasa fresca y seca, además de colores obtenidos sobre las tiras después de 4 y 7 días después de la exposición para la tira A y la tira B.

Tabla 3. Herbicida, especies de plantas, dosis de herbicida, peso fresco y seco relativo de plantas con respecto a plantas de control y plantas tratadas. Los efectos visuales se indican para 4, 7, 14 y 21 días después de tratar las plantas con el herbicida.

Herbicida

Especies de plantas Dosis (g/ha) Peso fresco relativo (g/maceta) Peso seco relativo (g/maceta) Efecto visual 4 días después de la exposición Efecto visual 7 días después de la exposición Efecto visual 14 días después de la exposición Efecto visual 21 días después de la exposición

Atlantis

Apera spica-venti 100,0 (38,2) 100,0 (34,8) 1,0 (1,3) 0,8 (1,0)

0,625 54,1 (9,3) 56,8 (10,9) 2,3 (0,6) 2,0 (0,0)

1,25 51,5 (9,6) 51,6 (10,0) 2,0 (1,0) 2,3 (0,6)

2,5 30,8 (3,6) 34,1 (4,4) 3,3 (0,6) 4,0 (0,0)

32,0 86,6) 34,6 (7,1) 5,3 (0,6) 4,3 (0,6)

16,1 (7,3) 18,6 (8,8) 3,0 (0,0) 6,0 (0,0) 6,0 (0,0)

11,8 (4,7) 12,8 (5,4) 4,0 (0,0) 6,7 (0,6) 7,0 (0,0)

Poa annua 100,0 (24,1) 100 0 (13,6) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,3 (0,6)

3,9 38,1 (14,3) 39,4 (14,2) 3,0 (0,0) 3,0 (0,0) 1,0 (1,7)

7,8 19,0 (5,9) 22,4 (4,8) 4,0 (0,0) 4,0 (0,0) 3,7 (0,6)

15,6 8,6 (0,8) 12,4 (2,5) 4,0 (0,0) 4,0 (0,0) 6,0 (0,0)

31,3 5,7 (5,3) 9,0 (6,8) 4,0 (0,0) 4,0 (0,0) 7,0 (0,0)

62,5 5,1 (2,0) 10,0 (2,8) 4,0 (0,0) 5,0 (0,0) 7,0 (0,0)

5,0 (1,2) 11,2 (2,7) 4,0 (0,0) 5,0 (0,0) 7,0 (0,0)

(continuación)

Herbicida

Especies de plantas Dosis (g/ha) Peso fresco relativo (g/maceta) Peso seco relativo (g/maceta) Efecto visual 4 días después de la exposición Efecto visual 7 días después de la exposición Efecto visual 14 días después de la exposición Efecto visual 21 días después de la exposición

Hussar

Apera spica-venti 100,0 (38,2) 100,0 (34,8) 0,0 (0,0) 1,0 (1,3) 0,8 (1,0)

3,125 52,4 (12,2) 55,0 (8,9) 0,0 (0,0) 2,0 (0,0) 2,0 (0,0)

6,25 41,7 (12,6) 43,7 (7,0) 3,0 (0,0) 2,0 (0,0) 3,0 (0,0)

12,5 20,9 (6,0) 24,5 (7,3) 4,0 (0,0) 3,0 (0,0) 4,0 (0,0)

23,9 (6,4) 25,7 (6,3) 4,0 (0,0) 4,7 (1,5) 4,0 (0,0)

14,5 (3,9) 16,7 (2,1) 4,0 (0,0) 6,7 (0,6) 6,0 (0,0)

14,8 (9,5) 18,4 (8,2) 4,0 (0,0) 6,7 (0,6) 7,3 (0,6)

Lolium perenne 100,0 (16,5) 100,0 (15,2) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)

1,56 83,8 (13,2) 85,5 (10,6) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)

3,125 31,2 (11,1) 36,0 (9,4) 2,0 (0,0) 3,7 (0,6) 4,0 (0,0)

6,25 24,7 (11,5) 29,0 (12,1) 3,0 (0,0) 4,7 (0,6) 5,0 (0,0)

12,5 8,8 (4,1) 12,9 (3,2) 4,0 (0,0) 6,0 (0,0) 6,3 (0,6)

1,9 (0,2) 6,6 (0,7) 4,0 (0,0) 7,0 (0,0) 8,0 (0,0)

1,4 (0,1) 5,3 (0,7) 5,0 (0,0) 7,0 (0,0) 9,0 (0,0)

(continuación)

Herbicida

Especies de plantas Dosis (g/ha) Peso fresco relativo (g/maceta) Peso seco relativo (g/maceta) Efecto visual 4 días después de la exposición Efecto visual 7 días después de la exposición Efecto visual 14 días después de la exposición Efecto visual 21 días después de la exposición

Monitor

Apera spica-venti 100,0 (33,8) 100,0 (30,4) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,5 (0,8)

0,313 58,1 (15,2) 60,6 (15,4) 0,0 (0,0) 1,0 (0,0) 2,3 (0,6) 2,0 (1,0)

0,625 37,6 (5,9) 40,1 (8,2) 0,0 (0,0) 1,0 (0,0) 3,0 (0,0) 3,0 (0,0)

1,25 26,4 (3,3) 31,3 (4,0) 0,0 (0,0) 1,0 (0,0) 5,0 (0,0) 5,0 (0,0)

2,5 11,6 (4,5) 14,5 (3,8) 1,0 (0,0) 2,3 (0,6) 6,0 (0,0) 6,3 (0,6)

8,5 (2,9) 14,1 (5,0) 2,0 (0,0) 3,7 (0,6) 6,0 (0,0) 7,0 (0,0)

4,7 (1,8) 8,6 (1,4) 2,3 (0,7) 4,7 (0,6) 6,7 (0,6) 8,7 (0,6)

Bromus hordeaceus 100,0 (2,1) 100,0 (2,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)

0,39 50,6 (4,3) 53,1 (9,6) 0,7 (0,6) 2,0 (0,0) 3,0 (0,0) 2,3 (0,6)

0,78 31,8 (5,7) 38,7 (9,2) 1,0 (0,0) 2,3 (0,6) 3,0 (0,0) 3,3 (0,6)

1,56 16,3 (6,0) 21,8 (7,1) 1,0 (0,0) 2,7 (0,6) 4,0 (0,0) 5,0 (0,0)

3,13 9,5 (2,0) 16,6 (3,7) 2,0 (0,0) 3,0 (0,0) 4,0 (0,0) 5,0 (0,0)

6,25 7,1 (2,0) 15,7 (0,8) 2,0 (0,0) 3,0 (0,0) 5,0 (0,0) 7,3 (0,6)

12,5 5,7 (0,5) 13,3 (1,0) 2,0 (0,0) 3,7 (0,6) 6,0 (0,0) 8,0 (0,0)

(continuación)

Herbicida

Especies de plantas Dosis (g/ha) Peso fresco relativo (g/maceta) Peso seco relativo (g/maceta) Efecto visual 4 días después de la exposición Efecto visual 7 días después de la exposición Efecto visual 14 días después de la exposición Efecto visual 21 días después de la exposición

Lexus

Apera spica-venti 100,0 (33,8) 100,0 (19,4) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,5 (0,8)

0,625 60,4 (10,1) 65,4 (10,9) 0,3 (0,6) 0,7 (0,6) 3,7 (0,6) 2,0 (0,0)

1,25 70,9 (8,2) 84,3 (4,6) 0,0 (0,0) 1,0 (0,0) 3,0 (0,0) 2,0 (0,0)

2,5 60,6 (9,9) 78,3 (13,5) 1,0 (0,0) 2,0 (0,0) 3,7 (0,6) 2,0 (0,0)

30,1 (9,5) 37,1 (7,6) 1,0 (0,0) 2,7 (0,6) 5,3 (0,6) 4,7 (1,2)

22,2 (18,4 31,6 (23,5) 1,7 (0,6) 3,3 (0,6) 5,0 (1,0) 6,3 (1,2)

11,3 (8,2) 18,2 (12,3) 2,3 (0,6 5,0 (0,0) 5,7 (0,6) 7,0 (1,0)

Alopecurus myosuroides 100,0 (26,9) 100,0 (25,1) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)

0,5 16,2 (7,2) 17,1 (6,2) 4,3 (0,6) 4,3 (0,6) 5,0 (0,0) 6,3 (0,6)

7,1 (3,3) 9,8 (3,8) 4,7 (0,6) 4,7 (0,0) 6,0 (0,0) 7,7 (0,6)

5,4 (3,1) 6,8 (4,01) 4,7 (0,6) 5,0 (0,0) 6,0 (0,0) 8,0 (0,0)

1,9 (0,8) 3,6 /(0,3) 5,0 (0,0) 5,3 (0,6) 7,0 (0,0) 9,3 (0,0)

2,7 (1,0) 6,9 (3,2) 4,7 (0,6) 5,0 (0,0) 7,0 (0,0) 9,0 (0,0)

3,5 (2,5) 6,8 (4,6) 5,3 (0,6) 5,7 (0,6) 7,0 (0,0) 10,0 (0,0)

En la figura 1, los colores PANTONE®, la intensidad (UA) calculada en el equipo CAMAG (equipo para el análisis de imágenes) y el crecimiento reducido (peso fresco y seco como 100 % - el peso relativo calculado 21 días después de la exposición) se presentan para 4 y 7 días después de la aplicación del herbicida. Para Poa annua expuesta a Atlantis y Lolium perenne expuesta a Hussar los resultados se presentan 4 días después de la exposición.

Tabla 4. Dosis/respuesta en semi-campo de Apera spica-venti, Lolium perenne y Poa annua (3 a 4 hojas) expuestos a Hussar y Atlantis. Todos los datos son valores medios de tres 5 duplicados. Los valores entre paréntesis son desviaciones estándar. Los números mencionados con respecto a la tira de color son los números PANTONE.

Herbicida

Especies de plantas Dosis (g de p.a./ha) Efecto visual 4 días después de la exposición Efecto visual 7 días después de la exposición Reducción en biomasa fresca (%) Reducción en biomasa seca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

Atlantis

Apera spica-venti 0 (38,2) 0 (34,8) Violeta muy claro Violeta rojizo muy claro 7437-7439 Verde azulado claro Verde grisáceo claro

0,625 45,9 (9,3) 43,2 (10,9) Violeta claro Violeta rojizo muy claro Verde azulado Verde grisáceo claro

1,25 48,5 (9,6) 48,4 (10) Violeta Violeta rojizo Gris claro Gris

2,5 69,2 (3,6) 65,9 (4,4) Violeta oscuro Violeta rojizo Gris claro Gris

5,0 68 (6,6) 65,4 (7,1) Violeta oscuro Violeta oscuro Gris claro Azul

10,0 3 (0) 83,9 (7,3) 81,4 (8,8) Violeta más oscuro Violeta más oscuro Gris Azul oscuro

20,0 4 (0) 88,2 (4,7) 88 (5,4) Violeta más oscuro Violeta más oscuro Azul Azul oscuro

Atlantis

Poa annua 0 (24,1) 0 (13,6) Crema claro

-

-

Verde amarillento claro 5783-5645

-

-

3,9 3 (0) 61,9 (14,3) 60,6 (14,2) Violeta rojizo muy claro

-

-

Verde amarillento 443-5645

-

-

Herbicida

Especies de plantas Dosis (g de p.a./ha) Efecto visual 4 días después de la exposición Efecto visual 7 días después de la exposición Reducción en biomasa fresca (%) Reducción en biomasa seca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

7,8 4(0) 81 (5,9) 77,6 (4,8) Violeta rojizo

-

-

Azul grisáceo 7546-535

-

-

15,6 4 (0) 91,4 (0,8) 87,6 (2,5) Violeta rojizo

-

-

Azul grisáceo 7546-535

-

-

31,3 4 (0) 94,3 (5,3) 91 (6,8) Violeta oscuro

-

-

Azul oscuro

-

-

62,5 4 (0) 94,9 (2) 90 (2,8) Violeta oscuro

-

-

Azul oscuro

-

-

4 (0) 95 (1,2) 88,8 (2,7) Violeta oscuro

-

-

Azul oscuro

-

-

Hussar

Apera spica-venti 0 (24,1) 0 (13,6) Violeta muy claro Violeta rojizo muy claro 7437-7439 Verde azulado claro Verde grisáceo claro

3,125 61,9 (14,3) 60,6 (14,2) Violeta Violeta rojizo muy claro Verde azulado Verde grisáceo claro

6,25 3 (0) 81 (5,9) 77,6 (4,8) Violeta Violeta rojizo Gris Gris

12,5 4 (0) 91,4 (0,8) 87,6 (2,5) Violeta oscuro Violeta rojizo Azul Gris

4 (0) 94,3 (5,3) 91 (6,8) Violeta oscuro Violeta oscuro Azul Azul

4 (0) 94,9 (2) 90 (2,8) Violeta oscuro Violeta más oscuro Azul oscuro Azul oscuro

4 (0) 95 (1,2) 88,8 (2,7) Violeta oscuro Violeta más oscuro Azul oscuro Azul oscuro

Herbicida

Especies de plantas Dosis (g de p.a./ha) Efecto visual 4 días después de la exposición Efecto visual 7 días después de la exposición Reducción en biomasa fresca (%) Reducción en biomasa seca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

Hussar

Lolium perenne 0 (16,5) 0 15,2 Crema claro

-

-

Verde amarillento muy claro

-

-

1,56 16,2 (13,2) 14,5 (10,6) Violeta rojizo muy claro

-

-

Gris claro

-

-

3,125 2 (0) 68,8 (31,2) 64 (9,4) Violeta rojizo

-

-

Azul

-

-

6,25 3 (0) 75,3 (11,5) 71 (12,1) Violeta oscuro

-

-

Azul

-

-

12,5 4 (0) 91,2 (4,1) 87,1 (3,2) Violeta oscuro

-

-

Azul oscuro

-

-

4 (0) 98,1 (0,2) 93,4 (0,7) Violeta más oscuro

-

-

Azul oscuro

-

-

5 (0) 98,6 (0,1) 94,7 (0,7) Violeta más oscuro

-

-

Azul oscuro

-

-

Tabla 5. Dosis/respuesta en semi-campo de Apera spica-venti, Bromus hordeaceus y Alopecurus myosuroides (3 a 4 hojas) expuestos a Monitor y Lexus. Todos los datos son valores medios de tres duplicados. Los valores entre paréntesis son desviaciones estándar. Los números mencionados con respecto a la tira de color son los números PANTONE.

Herbicida

Especies de plantas Dosis (g de p.a./ha) Efecto visual 4 días después de la exposición Efecto visual 7 días después de la exposición Reducción en biomasa fresca (%) Reducción en biomasa seca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

Monitor

Apera spica-venti 0 (33,8) 0(30,4) Violeta rojizo muy claro Crema claro Verde azulado claro Verde muy claro

0,313 1 (0) 41,9 (15,2) 39,4 (15,4) Violeta rojizo claro Crema claro Gris claro Azul claro

0,625 1 (0) 62,4 (5,9) 59,9 (8,2) Violeta rojizo Crema claro Azul Azul claro

1,25 1 (0) 73,6 (3,3) 68,7 (4) Violeta rojizo más oscuro Rosa claro Azul Azul

2,5 1 (0) 2,3 (0,6) 88,4 (4,5) 85,5 (3,8) Violeta oscuro Violeta rojizo muy claro Azul oscuro Azul oscuro

2(0) 3,7 (0,6) 91,5 (2,9) 85,9 (5) Violeta más oscuro Violeta rojizo Azul oscuro Azul muy oscuro

2,3 (0,7) 4,7 (0,6) 95,3 (1,8) 91,4 (1,4) Violeta oscuro Violeta rojizo Azul oscuro Azul oscuro

Monitor

Bromus hordeaceus 0 (2,1) 0 (30,4) Crema claro Crema claro Azul claro Verde amarillento muy claro

0,39 0,7 (0,6) 2(0) 49,4 (4,3) 39,4 (15,4) Crema claro Crema claro Azul Azul

0,78 1 (0) 2,3 (0,6) 68,2 (5,7) 59,9 (8,2) Crema claro Rosa claro Azul Azul

1,56 1 (0) 2,7 (0,6) 83,7 (6,0) 68,7 (4) Crema claro Crema claro Azul Azul muy oscuro

3,13 2(0) 3 (0) 90,5 (2,0) 85,5 (3,8) Crema claro Rosa claro Azul Azul muy oscuro

(continuación)

Herbicida

Especies de plantas Dosis (g de p.a./ha) Efecto visual 4 días después de la exposición Efecto visual 7 días después de la exposición Reducción en biomasa fresca (%) Reducción en biomasa seca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

6,25 2(0) 3 (0) 92,9 (2) 85,9 (5) Crema claro Rosa claro Azul oscuro Oscuro

12,5 2(0) 3,7 (0,6) 94,3 (0,5) 91,4 (1,4) Crema claro Rosa claro Azul Azul muy oscuro

Lexus

Apera spica-venti 0 (33,8) 0(19,4) Violeta rojizo muy claro Crema claro Verde grisáceo claro Verde amarillento muy claro

0,625 0,3 (0,6) 0,7 (0,6) 39,6 (10,1) 34,6 (10,9) Violeta rojizo muy claro Crema claro Verde grisáceo claro Verde amarillento muy claro

1,25 1 (0) 29,1 (8,2) 15,7 (4,6) Violeta rojizo muy claro Violeta rojizo muy claro Verde grisáceo Verde muy claro

2,5 1 (0) 2 (0) 39,4 (9,9) 21,7 (13,5) Violeta rojizo muy claro Crema claro Gris muy claro Verde grisáceo claro

1 (0) 2,7 (0,6) 69,9 (9,5) 62,9 (7,6) Violeta Violeta rojizo muy claro Azul Azul

1,7 (0,6) 3,3 (0,6) 77,8 (18,4) 68,4 (23,5) Violeta Violeta rojizo claro Azul Azul oscuro

2,3 (0,6) 5 (0) 88,7 (8,2) 81,8 (12,3) Violeta oscuro Violeta oscuro Azul Azul muy oscuro

Lexus

Alopecurus myosuroides 0 (26,9) 0(25,1) Violeta rojizo muy claro Violeta rojizo muy claro Azul claro Verde muy claro

0,5 4,3 (0,6) 4,3 (0,6) 83,8 (7,2) 82,9 (6,2) Violeta oscuro Violeta claro Azul Azul oscuro

4,7 (0,6) 4,7 (0,6) 92,9 (3,3) 90,2 (3,8) Violeta oscuro Violeta claro Azul Azul muy oscuro

(continuación)

Herbicida

Especies de plantas Dosis (g de p.a./ha) Efecto visual 4 días después de la exposición Efecto visual 7 días después de la exposición Reducción en biomasa fresca (%) Reducción en biomasa seca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

4,7 (0,6) 4,7 (0,6) 94,6 (3,1) 93,2 (4) Violeta oscuro Violeta Azul oscuro Azul muy oscuro

5 (0) 5 (0) 98,1 (0,8) 96,4 (0,3) Violeta oscuro Violeta Azul oscuro Azul muy oscuro

4,7 (0,6) 4,7 (0,6) 97,3 (1) 90,4 (3,2) Violeta Violeta Azul oscuro Azul muy oscuro

5,3 (0,6) 5,3 (0,6) 96,5 (2,5) 93,2 (4,6) Violeta Violeta Azul oscuro Azul muy oscuro

Análisis

En general, para ambos tipos de tira, la intensidad (UA) de los colores aumentó al aumentar la dosis y el porcentaje de crecimiento reducido 21 días después de la exposición. Para la tira A, los colores variaron de beis, violeta rojizo claro a violeta oscuro y para la tira B los colores variaron de verde a gris claro a gris oscuro a azul claro y finalmente azul oscuro. El equipo CAMAG no puede separar los colores, sino solo la intensidad y, por consiguiente, la intensidad de 5 algunos de los colores verde y gris puede tener la misma intensidad que el color azul más oscuro. Es, por tanto, importante usar la detección de colores cualitativa (PANTONE®) de las tiras para evaluar el efecto final de las plantas de malas hierbas.

Para la tira B, las plantas no expuestas mostraron un color verde diferente. Esta diferencia de color puede usarse para identificar las diferentes especies de plantas sin ninguna exposición al estrés. 10

Para todas las especies de plantas, excepto para Apera spica-venti expuesta a Atlantis y Bromus hordeaceus expuesta a Monitor, el efecto final en el porcentaje de crecimiento reducido 21 días después de la exposición pudo predecirse 4 días después de la exposición sin ningún efecto visual que fuera a detectarse sobre las plantas (véase la tabla 3). Para Apera spica-venti expuesta a Atlantis y Bromus hordeaceus expuesta a Monitor se necesitaron siete días.

El análisis de plantas expuestas a herbicidas de diferente modo de acción (es decir, yodosulfuron, glifosato, 15 prosulfocarb, etc.) ha mostrado el mismo patrón de respuestas con colores ligeramente diferentes que dependen de los otros compuestos en las plantas, la sensibilidad de las plantas al herbicida y la edad de las plantas. Otros experimentos en curso muestran que los estresores naturales tales como temperatura y sequía pueden ralentizar el tiempo de reacción fitoquímica, pero el patrón de colores oscuros de las tiras relacionados con un alto porcentaje de crecimiento reducido es el mismo. 20

Se detectaron diferencias menores en la reacción patrón cuando las plantas se desarrollaron en invernadero, al aire libre o en el campo. Las plantas cultivadas en el invernadero fueron más sensibles que las plantas cultivadas en el campo.

El cambio en el color e intensidad de color apareció en las plantas anuales aproximadamente cuatro días después de la exposición dependiendo de la sensibilidad a los herbicidas. Cuanto más viejas eran las plantas, menos sensibles a 25 los herbicidas.

Ejemplo 2

Las realizaciones desveladas como ejemplo 2 son esquemas de los resultados de diferentes pruebas que evalúan el procedimiento descrito en cualquier parte en el presente documento. Primero se describen los diferentes tipos de experimentos. Los resultados se presentan después. 30

Estudio de semi-campo (dosis - respuesta)

Los resultados de los experimentos de semi-campo muestran para ciertas especies de plantas y herbicidas que una conexión entre el color de la tira/disco y la reducción de biomasa (biomasa relativa en porcentaje de control) puede detectarse ya 4 días después de la exposición. En estudios de respuesta a dosis 4 y 7 días después de la exposición se observa una respuesta significativa en relación con plantas sin tratar con más del 80 % de efecto sobre la biomasa 35 para tanto la tira/disco A como B después de la exposición con Atlantis y Hussar.

El estudio de semi-campo se realizó con concentraciones de herbicida y/o aditivos que fueron mayores que las normalmente usadas cuando se tratan plantas en los campos. El fin de estos estudios fue obtener una reacción dentro de las plantas y así evaluar los posibles colores que podrían obtenerse directamente en el extracto de planta o desarrollarse debido a las reacciones químicas realizadas cuando se añade al menos un reactivo químico al extracto 40 de planta. Con el estudio de semi-campo el efecto final de los herbicidas también ha estado en el foco, es decir, el efecto sobre el crecimiento de la planta medido como biomasa reducida cuando se compara con plantas no tratadas.

Estudios de semi-cultivo (estabilidad a la lluvia)

Para los estudios de semi-cultivo con estabilidad a la lluvia hubo una gran desviación en la reducción de biomasa usando herbicidas sin y con aditivos y tiempo de tratamiento con lluvia diferente después de la exposición. 45

Se observó un resultado significativo para intensidad de color de hasta el 50 % de efecto de reducción de la biomasa para los estudios de estabilidad a la lluvia con Atlantis sobre Lolium perenne. Para el análisis siete días después del tratamiento con herbicida para la tira/disco B hubo una buena concordancia entre las dosis del herbicida en las que la curva para la intensidad de color fue plana y en las que se observa más del 80 % de reducción de biomasa.

Estudios de semi-cultivo (mezcla con otros herbicidas) 50

En un estudio de semi-campo se investigó si una mezcla con otros herbicidas influye en la respuesta de color para los diferentes tipos de tira. Las mezclas probadas fueron Hussar en combinación con Oxitril, Starane o Luxus (véase la tabla 15 del estudio n.º 945/06). Los resultados mostraron una buena correlación entre el color sobre la tira/disco y el efecto de reducción de biomasa final para Hussar como único herbicida o en una mezcla con Starane y Express. Resultados significativos de la intensidad de color para los tratamientos en los que se detectó una reducción de 5 biomasa final superior al 80 %. No hubo resultados con respuestas positivas falsas con los colores de las tiras.

Una mezcla de Hussar y Starane da los mismos resultados que para Hussar solo (véase la tabla 15 del estudio n.º 945/06). Sin embargo, una mezcla de Express y Hussar aumenta la reducción de biomasa final y la intensidad de color para las tiras. Los herbicidas Express, Hussar y Atlantis son herbicidas de sulfonilurea. Express tiene un efecto importante para dicotiledóneas de especies de mala hierba, pero también algún efecto para las monocotiledóneas 10 Lolium sp. Hay una buena correlación entre la reacción de color y el efecto de reducción de biomasa final.

Estudios de campo

Algunos experimentos de campo realizados en tanto el otoño de 2005 como en la primavera de 2006 soportan los resultados observados en los estudios de semi-cultivo. Los análisis se realizaron en el campo sobre material de planta recolectado fresco. 15

Para Apera spica-venti, la dosis de herbicida probada resultó ser demasiado alta y, por tanto, no hubo buena diferenciación entre la reducción de biomasa final y los colores sobre las tiras/discos para dosis de herbicida medias, pero la prueba indica claramente la capacidad de uso del kit y procedimiento. Para los estudios de campo se necesitaron siete días después del tratamiento con herbicida antes de realizar el análisis. Por este documento se aseguró que las reacciones de las plantas tuvieron tiempo para desarrollarse y se eliminó cualquier desviación debida a 20 la disminución de la reacción dentro de las plantas a las menores temperaturas del otoño.

En Sealand para Lolium perenne se observaron significativos cambios de color para ambos análisis de los tipos de tiras/discos A y B con una reducción final en biomasa superior al 80 %.

En total, el tipo de tira/disco B muestra una alta correlación entre el color de las tiras y la reducción de biomasa final dentro de tres niveles de efecto: sin efecto, efecto medio y efecto completo. Estos experimentos mostraron la 25 posibilidad de desarrollar un kit que fuera una herramienta para que los agricultores detectaran rápidamente y prematuramente efectos de herbicidas en plantas de malas hierbas al menos para Lolium perenne, Poa annua y Apera spica-venti expuestas a Hussar y/o Atlantis.

La reacción de plantas al estrés por herbicida

La planta reacciona al estrés como, por ejemplo, exposición a herbicidas como respuestas bioquímicas. Los herbicidas 30 se desarrollan para afectar mecanismos generales o específicos en plantas que implican que plantas sensibles morirán. Cuando estos mecanismos en las plantas son afectados, naturalmente la planta reaccionará cambiando la concentración de compuestos ya presentes, producirá nuevos compuestos o dejará la producción de compuestos. Los cambios específicos dependen del modo de acción del herbicida y la dosis usada.

La planta tiene un contenido natural de compuestos fitoquímicos. El contenido de los compuestos fitoquímicos es 35 diferente en las diferentes especies de plantas, incluso cuando estas especies de plantas puedan ser especies de plantas de la misma familia. Se ha observado que el tratamiento con herbicida de las plantas produce un cambio en la composición fitoquímica y concentración de estas composiciones en las plantas. Estos cambios pueden detectarse y visualizarse por el ojo humano. Los cambios en la composición fitoquímica y concentración en las plantas después de la exposición al estrés por herbicida se llaman biomarcadores. El procedimiento de biomarcador de la presente 40 invención se basa en un patrón de biomarcadores desarrollado en plantas expuestas a herbicidas.

Cambios significativos en la composición fitoquímica y contenido en plantas mono- y dicotiledóneas silvestres podrían detectarse cuatro días después de la exposición a hasta el 1 % de la dosis en campo recomendada de herbicidas. Esto es antes de que pudieran detectarse signos visuales sobre la planta. En plantas expuestas a glifosato (el herbicida Roundup Bio), los cambios fitoquímicos en la composición y contenido (patrón de biomarcador) podrían detectarse 45 cuatro horas después de la exposición a herbicida.

Se han realizado experimentos con 16 especies de plantas silvestres diferentes seleccionadas de entre plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, y se detectó un claro patrón de biomarcadores para cuatro herbicidas diferentes con cuatro modos de acción diferentes. Los resultados mostraron que cuanto mayor es la concentración de los herbicidas, más corto es el tiempo después de la exposición que los biomarcadores podrían detectarse. 50

Los experimentos basados en plantas jóvenes y plantas más viejas mostraron que las plantas más jóvenes reaccionan más rápido después de la exposición a herbicida que las plantas más viejas.

Material de planta, técnicas y procedimientos

Plantas

Las especies de plantas usadas para los estudios son todas las plantas de malas hierbas comunes en cultivos en Dinamarca. Las especies de plantas son: Agrostis (Apera spica-venti L., Beauv), hierba de cola de zorra (Alopecurus myosuroides Hudson), ballico perenne (Lolium perenne L.), barbas de macho (Bromus hordeaceus L.) y poa anual (Poa 5 annua L.).

Herbicidas

Los herbicidas probados fueron: Hussar (yodosulfuron + mefenpir-dietilo (protector) (50 + 150) g/kg, Bayer CropScience A/S), Hussar OD (yodosulfuron + mefenpir-dietilo (100 + 300) g/l, Bayer CropScience A/S); Atlantis WG (mesosulfuron + yodosulfuron + mefenpir-dietilo (30 + 6 + 90) g/kg, Bayer CropScience A/S); Lexus 50 WG (flupirsulfuron-metilo, 10 500 g/kg, DuPont Denmark A/S); Monitor (sulfosulfuron, 800 g/kg, Monsanto Crop Sciences Denmark A/S). En la tabla 6 se presenta una visión general de especies de plantas, herbicidas y tratamientos de los estudios.

Tabla 6: Visión general de estudios, especies de plantas, herbicidas y tratamientos.

Código

Especies de plantas y etapas en el tratamiento con herbicida Herbicida Tratamiento Tratamiento de material antes de la prueba

972/04

Lolium perenne (3-4 hojas), Apera spica-venti (3-4 hojas, Poa annua (3-4 hojas) Hussar Semi-campo (estable a la lluvia) Liofilizado

927/05

Lolium perenne (3-4 hojas), Apera spica-venti (3-4 hojas) Hussar Semi-campo (dosis/respuesta) Fresco, congelado

927/05

Apera spica-venti (3-4 hojas), Poa annua (3-4 hojas) Atlantis Semi-campo (dosis/respuesta) Fresco, congelado

928/05

Apera spica-venti (3-4 hojas), Bromus hordeaceus (3-4 hojas) Monitor Semi-campo (dosis/respuesta) Fresco, congelado

928/05

Apera spica-venti (3-4 hojas), Alopecurus myosuroides (3-4 hojas) Lexus Semi-campo (dosis/respuesta) Fresco, congelado

945/06

Lolium perenne (3-4 brotes laterales) Hussar OD; Oxitril; Starane; Express Semi-campo (mezcla de herbicidas) Fresco, congelado

946/06

Lolium perenne (3-4 brotes laterales) Atlantis Semi-campo (estable a la lluvia) Fresco, congelado

Hobro

Poa annua (Lolium perenne) Hussar Campo Fresco, congelado

Hobro

Poa annua (Lolium perenne) Atlantis Campo Fresco, congelado

964/05

Lolium perenne Hussar Campo Fresco, congelado

964/05

Lolium perenne Atlantis Campo Fresco, congelado

966/05

Apera spica-venti Hussar Campo Fresco, congelado

966/05

Apera spica-venti Atlantis Campo Fresco, congelado

948/06

Lolium perenne (2 hojas, sección, 2 nudos) Hussar OD Campo (etapa de desarrollo) Fresco, congelado

917/06

Lolium perenne Atlantis Campo Fresco

Estudio de semi-campo – Cultivo y exposición de especies de plantas

Las especies de plantas de malas hierbas que iban a probarse se sembraron en macetas de 2 l en una mezcla de tierra de campo, arena y esfagno (2:1:1 porcentaje en peso). Después de la siembra, las macetas se pusieron sobre mesas al aire libre, en las que se regaron varias veces al día. Después de la germinación, las plantas en las macetas se aclararon para tener el mismo número de plantas en todas las macetas. Los herbicidas se aplicaron cuando las plantas 5 estuvieron en la etapa adecuada (véase la tabla 6). Los herbicidas se aplicaron en agua desionizada usando un pulverizador de macetas de laboratorio provisto de dos boquillas de abanico plano ISO F-02-110 que liberan un volumen de pulverización de 145 l por ha con una presión de 3 bar.

En los estudios se aspiró a que el nivel de efecto diferente del herbicida pudiera correlacionarse con la reacción de color sobre las tiras/discos con el crecimiento reducido final de las plantas (porcentaje relativo de los controles). Se 10 obtienen efectos variables con diferentes dosis y en ciertos casos tras el tratamiento con lluvia, en los que una parte del herbicida se lava. En el estudio n.º 945/06, Hussar OD se aplica por aspersión en mezclas con herbicidas para combatir dicotiledóneas para investigar si la mezcla en tanque con otros herbicidas afecta la reacción de color sobre las tiras/discos.

La dosis normal (1 N) usada es variable entre los estudios dependiendo de la sensibilidad de las especies de plantas 15 de malas hierbas, etapa de desarrollo de las plantas y tratamiento con lluvia. Las dosis se eligen en vista de obtener una gran variación en los efectos de los tratamientos, que entran en una alianza con los diferentes estudios. Por tanto, la dosis normal no es en todos los estudios la misma que la dosis recomendada del herbicida. Aunque el fin de los estudios ha sido principalmente correlacionar el efecto final del crecimiento de la planta y la reacción de color sobre la tira, las dosis en todos los resultados se presentan como dosis relativas en relación con la dosis normal, en la que la 20 dosis normal es la dosis indicada por el fabricante del herbicida.

Las plantas usadas para la prueba de biomarcadores se recolectaron 4 y 7 días después de la exposición a los herbicidas. Las plantas se cortaron en la superficie de la tierra y se congelaron inmediatamente por el uso de hielo seco (el estudio n.º 972/04 se liofilizó). Antes de recolectar se realizó una evaluación visual del efecto (cambios morfológicos), como se describe más adelante. La escala usada para la evaluación se explica brevemente en la tabla 25 2. Se realizaron determinaciones de biomasa de las plantas en la recolección 21 días después de la exposición, como se describe más adelante. Antes de la recolección de biomasa se realizó una evaluación visual del efecto.

Estudios de semi-cultivo con dosis/respuesta (927/05 y 928/05)

El estudio n.º 927/05 contuvo agrostis espiga de viento y poa anual tratadas con Atlantis (1 N = 20 g/ha con respecto a agrostis espiga de viento y 125 g/ha con respecto a poa anual). Tanto la agrostis espiga de viento como el ballico 30 perenne se trataron con Hussar (1 N = 100 g/ha y 50 g/ha, respectivamente). Ambos herbicidas se aplicaron por aspersión en 6 dosis en una mezcla con 0,5 l/ha de Renol (Bayer Crop Science). Renol es un aditivo que aumenta la penetración del herbicida en la planta. El estudio n.º 928/05 contuvo agrostis espiga de viento y barbas de macho tratadas con Monitor (1 N = 10 g/ha y 12 g/ha, respectivamente para las especies de plantas mencionadas). Además, agrostis espiga de viento y hierba de cola de zorra se trataron con Lexus (1 N = 20 g/ha y 16 g/ha, respectivamente 35 para las especies de plantas mencionadas). Los herbicidas se aplicaron por aspersión en 6 dosis en una mezcla con 0,1 % de Lissapol Bio (Syngenta). Lissapol Bio es un aditivo que disminuye la tensión superficial y aumenta el contacto entre el herbicida y la planta a medida que el herbicida se pega mejor a la planta. Ambos estudios incluyeron área de estudio sin tratar.

Estudio de semi-campo con estabilidad a la lluvia (972/04 y 946/06) 40

El estudio n.º 972/04 contuvo ballico perenne (3-4 hojas) tratado con 6 dosis de Hussar (1 N = 200 g/ha) por separado y en una mezcla con 0,5 l/ha de Renol. Los tratamientos con lluvia se realizaron en un simulador de lluvia con una intensidad de 20 mm/hora. Se realizó un tratamiento con 5 mm de lluvia, 1 y 4 horas después de la exposición. El material de planta recolectado se liofilizó. En el estudio n.º 946/06 se realizó el tratamiento de ballico perenne (3-4 hojas) con 6 dosis de Atlantis y en la mezcla con 0,5 l/ha de Renol. Las dosis usadas de Atlantis fueron 480 g/ha en 45 tratamiento sin lluvia y 1920 g/ha en tratamientos con lluvia. Correspondientemente a una mezcla con Renol se usaron 120 y 960 g/ha, respectivamente. Se usaron un tratamiento con 3 mm de lluvia a la intensidad de 10 mm/h, respectivamente, 1 y 3 horas después de la exposición.

Estudio de semi-campo con mezcla de herbicidas (945/06)

El estudio se realizó con ballico perenne y Hussar (1 N = 30 ml/ha) y en una mezcla con 3 herbicidas únicamente con 50 efecto sobre plantas de malas hierbas dicotiledóneas: (0,5 l/ha de Oxitril (200 g/l de ioxinil + 200 g/l de bromoxinil), 0,6 l/ha de Starane (180 g/l de fluroxipir) y 1 pastilla/ha de Express (3,75 g/pastilla de tribenuron).

Estudio de campo en 2005 y 2006 - Cultivo y exposición

El propósito de los estudios de campo fue validar el kit de prueba bajo condiciones naturales, en las que factores como la humedad de la tierra, suministro de nutrientes y tipos de tierra fueron variables. Estos factores podrían afectar el contenido de compuestos naturales en las plantas y de ese modo cambiar la reacción de color sobre las tiras usadas. Los estudios se planearon en dos campos de trigo de invierno próximos a la ciudad de Hobro y dos campos de trigo de 5 invierno en Sealand (Moerkoev y Vejloe). Además, se sembraron dos experimentos en campo con ballico perenne en estado puro.

En los estudios con trigo de invierno se usaron 3 dosis (1/4, 1/2 y 1 N) de Hussar y Atlantis. Ambos herbicidas se aplicaron en una mezcla con 0,5 l/ha de Renol. La exposición se realizó en el otoño de 2005 y en la primavera de 2006. En Sealand se usó un pulverizador autopropulsado equipado con boquilla LD-015-110, una presión de 3,2 bar y una 10 cantidad de disolvente de 150 l/ha. En el estudio en Moerkoev, el ballico perenne fue la especie de planta de mala hierba dominante. Las plantas se expusieron al herbicida el 24 de octubre de 2005 (1 N=150 g/ha de Hussar y 200 g/ha de Atlantis), cuando la etapa de crecimiento de ballico perenne era BBCH 11-12 (desarrollo de hojas). En la primavera, la exposición se realizó el 28 de abril (1 N=200 g/ha de Hussar y 300 g/ha de Atlantis). En ese momento, el ballico perenne estaba en una etapa de crecimiento BBCH de 30,2 (estiramiento). En el estudio en Vejloe, agrostis espiga de 15 viento fue la especie de mala hierba dominante. Este estudio se pulverizó el 14 de noviembre (1 N=100 g/ha de Hussar y 150 g/ha de Atlantis), cuando el agrostis espiga de viento estaba en la etapa de crecimiento de BBCH 10-11 y el 11 de mayo (1 N = 150 g/ha de Hussar y 150 g/ha de Atlantis), cuando el agrostis espiga de viento estaba en la etapa de crecimiento de BBCH 30-31. En Hobro en Koldkaergaard se usó pulverizador equipado con una boquilla de difusión plana 4110-16. Se usó una presión de 2,5 bar y una cantidad de disolvente de 150 l/ha. En el estudio n.º 02, ballico 20 perenne fue la especie de planta de mala hierba dominante. El herbicida en el estudio se pulverizó el 19 de septiembre (1 N=100 g/ha de Hussar y 1 N=200 g/ha de Atlantis), cuando el ballico perenne estaba en la etapa de crecimiento de BBCH 11-12 y el 4 de mayo (1 N=150 g/ha de Hussar y 1 N=200 g/ha de Atlantis), cuando el ballico perenne estaba en la etapa de crecimiento de BBCH 30.

En el estudio n.º 03, el ballico perenne era la especie de planta de mala hierba dominante. Este estudio se pulverizó el 25 20 de septiembre (1 N=150 g/ha de Hussar y 200 g/ha de Atlantis), cuando la poa anual estaba en la etapa de crecimiento de BBCH 12 y el 15 de mayo (1 N=200 g/ha de Hussar y 300 g/ha de Atlantis) cuando la poa anual estaba en la etapa de crecimiento de BBCH 33. Los estudios se realizaron con 4 duplicados para cada tratamiento. En el estudio, el material de planta se eliminó para ballico perenne, poa anual y agrostis espiga de viento 4 y 7 días después de la exposición. El kit de prueba se probó directamente en el campo. Al mismo tiempo, las muestras se congelaron 30 con hielo seco para la posterior prueba en el laboratorio.

Además, se realizaron dos estudios de ballico perenne en población pura en la primavera de 2006. En el primer estudio se investigó la importancia de la etapa de desarrollo para el resultado final del procedimiento. En el estudio, las plantas se expusieron a 4 dosis (1/8, 1/4, 1/2 y 1 N) de Hussar OD (1 N=0,075 l/ha) en una mezcla con 0,5 l/ha de Renol a 3 etapas de desarrollo diferentes (9 de junio etapa de crecimiento de BBCH 12 (desarrollo de hojas), 19 de junio etapa de 35 crecimiento de BBCH 30 (estiramiento) y 29 de junio etapa de crecimiento de BBCH 32 (estiramiento)). Las evaluaciones visuales y la reducción de biomasa de efecto final (peso fresco) se observaron 42 días después de la exposición. En el segundo estudio se investigó el efecto de Atlantis. Las plantas en el estudio se expusieron el 28 de abril, cuando el ballico perenne estaba en la etapa 29. Atlantis (1 N = 400 g/ha) se aplicó por aspersión en 4 dosis (1/8, 1/4, 1/2 y 1 N) en mezcla con 1 l/ha de Biopower (Bayer Crop Science). Biopower es un aditivo. Ambos estudios fueron 40 con 4 duplicados de cada tratamiento. Las evaluaciones visuales del efecto se realizaron 38 días después de la exposición.

Efectos fisiológicos

Se observaron dos tipos diferentes de efectos fisiológicos. Se realizó una evaluación de los efectos visuales de las plantas en cada recolección (véase Evaluación del efecto visual). En los estudios de campo, una evaluación visual del 45 efecto de aplicar por aspersión en otoño se detectó en la primavera después de que empezara el crecimiento, mientras que el efecto de la aspersión de la primavera se evaluó aprox. 6 semanas después de la aspersión. Además, se realizó una determinación de biomasa final 21 días después de la aspersión (véase Evaluación de biomasa). En el estudio de campo se realizó una evaluación visual del efecto de deslizamiento de espigas.

Evaluación del efecto visual 50

La evaluación del efecto visual sobre las plantas antes del muestreo se evaluó según la tabla 2. La clasificación/escala 0 no refleja efecto sobre las plantas y 9 refleja plantas muertas (Hamil y col., 1977; Boutin y col., 1993). En los estudios de campo, las evaluaciones visuales 5-6 semanas después de la aspersión se basaron en una reducción de la cobertura de plantas de malas hierbas del área en relación con parcelas sin tratar.

Evaluación de biomasa

En los estudios de semi-cultivo, la determinación de biomasa se realizó 21 días después de la aspersión. El peso fresco se calculó con 3 duplicados para cada tratamiento. El material de planta se recolectó y se secó al aire a 80º C durante 18 horas, después de lo cual se calculó el peso seco. Para los estudios de campo, la biomasa de las plantas de malas hierbas se calculó cortando plantas de malas hierbas en 3 x 0,25 m2 de cada parcela. Se registró el número 5 de plantas y se pesó (peso fresco).

Técnicas usadas para el desarrollo de procedimientos

Para el desarrollo de procedimientos se han usado diferentes técnicas químicas analíticas. Se usó cromatografía en capa fina (CCF) para separar y seleccionar biomarcadores relevantes y grupos de biomarcadores. Esta técnica de CCF forma los antecedentes para el desarrollo del procedimiento de tiras. Pueden usarse procedimientos de CCF para 10 evaluar el efecto de tratamiento con herbicida, aunque el procedimiento se basa en la separación de las composiciones del material de planta. Las muestras de planta de los estudios de semi-cultivo y estudios de campo en 2005 se analizaron poco después de la congelación. Las muestras de planta de los estudios de campo en 2006 se probaron con material de planta recolectado fresco directamente en el campo 4 y 7 días después de la exposición a los herbicidas. También se realizó el análisis de muestras de plantas congeladas de las mismas macetas en el laboratorio 15 para calcular el máximo de intensidad (esta característica se describe adicionalmente más adelante) de los colores de la tiras.

Recogida de plantas de malas hierbas

Se recogieron tres muestras (20-25 plantas) para cada campo 4 y 7 días después de la exposición a Hussar o Atlantis. Las plantas se congelaron inmediatamente con hielo seco o se probaron en el plazo de 30 min. 20

Color, intensidad de color y el máximo de intensidad de color

Se compararon el color e intensidad de color de las tiras de prueba de plantas de estudios de semi-cultivo con una escala no revestida de la guía de formulación PANTONE® y también se analizaron usando equipo de analítico de imágenes CAMAG avanzado. Aquí, la intensidad de color de cada tira se midió en una forma de cartón de 5 mm (diámetro) en una caja cerrada con luz blanca (CAMAG Video-Store). El máximo del área de la curva de intensidad de 25 la señal electrónica del equipo se usó como valor de la intensidad de color. La intensidad (máximo del área) se correlaciona con la concentración de los biomarcadores en el extracto (ley de Lambert-Beer).

Los colores PANTONE se evaluaron visualmente y se usaron ya que no se determinaron los colores observados por el equipo CAMAG. Usando el análisis de CAMAG se usó la intensidad entre colores oscuros y claros. Sin embargo, el color de, por ejemplo, azul y verde que va a verse para la tira B no fue posible usando el equipo CAMAG. La 30 comparación entre el máximo en la intensidad de color para la tira A siguió la escala de violeta claro para las plantas sin tratar a violeta oscuro para las plantas tratadas a alta exposición a herbicida (y efecto). Los colores para la tira B fueron fáciles de evaluar usando colores PANTONE ya que se detectó verde de claro a oscuro en el extracto de plantas sin tratar y gris de claro a oscuro y azul de claro a oscuro para extractos de plantas tratadas con herbicidas. Un valor detectado por CAMAG para un verde oscuro y azul oscuro pudo detectarse fácilmente similarmente, si no, el color se 35 identificó usando los colores PANTONE.

Los resultados del análisis de CAMAG de los estudios 927/05 y 928/05 se calcularon como valores medios con desviación estándar. Estos valores se usan como cálculos estimados de los valores de los resultados de color de los estudios de campo en los que no fue posible realizar análisis de laboratorio.

Preparación de extracto de planta 40

En el estudio n.º 972/04 se usó material de planta liofilizado. Este material de planta se machacó y se extrajeron 250 mg con 5,00 ml de ELGA-agua (agua desionizada) en 2 horas con hielo en un baño ultrasónico. Las muestras se filtraron a través de filtros WHATMAN de 0,45 m GMF w/GMF. Los extractos se trataron en lo que respecta al extracto de plantas congelado y fresco (véase 2.7.3 Análisis con tiras A y B).

En los otros estudios, el material de planta fresco o congelado se cortó en pequeños trozos con unas tijeras. Se 45 pesaron 200 mg de material fresco de planta en una balanza KERN 60-2N Pocket (máx = 60 g d = 0,01 g) y se machacaron en un mortero (diámetro interno = 5,2 cm) con 4,00 ml de agua desionizada. El extracto se filtró a través de un filtro WHATMAN de 0,45 µm GMF w/GMF. Este extracto filtrado se usó para la tira A y la tira B.

Análisis realizados con el procedimiento de las tiras

Este procedimiento de tiras y su componente descritos más adelante es una realización del procedimiento y el kit de 50 prueba. Se describen dos tipos de tira llamados tira A y tira B. Los dos grupos de biomarcadores analizados mediante

el procedimiento/tiras son aminoácidos y compuestos relacionados (tira A) e hidratos de carbono, derivados de hidratos de carbono y compuestos relacionados (tira B).

Tira A

Se recolectó material de planta, se obtuvo un extracto del material de planta y el extracto se filtró. Se pusieron tres gotas del extracto filtrado en un vaso de plástico (vaso de plástico n.º 1) junto con 3 gotas de reactivo A (8 % de 5 ninhidrina en etanol al 96 %). Se preparó una cobertera caliente (vaso de plástico n.º 2) añadiendo 0,5 ml de agua desionizada con 15 gotas de ácido sulfúrico añadidas gota a gota al vaso con ½ segundo entre gota (la reacción inició un procedimiento de calentamiento a aproximadamente 70º C ). El vaso n.º 1 se puso inmediatamente en el vaso n.º 2 y ambos vasos se inclinaron para garantizar el calentamiento del material en el vaso n.º 1. El calor del vaso n.º 2 aumentará la reacción química en el vaso n.º 1. Después de 10-15 minutos, una tira de filtro n.º 526 de 1 cm x 4 cm de 10 Advantec, en la que 3 cm se impregnaron con parafina, y así 1 x 1 cm sin parafina, se puso en contacto con el disolvente/extracto de planta de forma que la sección sin parafina entrara en el disolvente en el vaso n.º 1 durante aproximadamente 5 segundos (la parafina hace la tira más fácil de manipular y detiene la penetración del extracto de planta adicionalmente en la tira, de este modo la cantidad de extracto de planta absorbida es sustancialmente igual en todas las pruebas ya que el volumen/área de la tira en la que el extracto de planta se absorbe es similar para cada 15 prueba). El color de la tira se evaluó inmediatamente (dentro de 5-15 minutos) comparando el color de la tira con una escala no revestida de la guía de formulación PANTONE® y se anotó el número Pantone. Para el análisis en el laboratorio, las tiras se colocaron en forma de cartón y se analizaron usando la caja CAMAG Video-Store como se ha descrito anteriormente.

Tira B 20

Se añadieron tres gotas de extracto filtrado a un vaso de plástico. Se añadieron 0,50 ml de agua desionizada y 2 gotas de reactivo B (5 % de α-naftol en etanol al 96 %). Se añadieron quince gotas de ácido sulfúrico concentrado a la mezcla con ½ segundo entre las gotas produciendo desarrollo de calor y se creó una reacción de color. El vaso se inclinó mientras que se enfriaba durante 10-15 minutos. Una tira (filtro n.º 526 de 1 cm x 4 cm de Advantec, en el que 3 cm estaban impregnados con parafina) con la parte sin parafina se pegó en el disolvente en el vaso n.º 1 durante 25 aproximadamente 5 segundos. El color se evaluó (en el plazo de 5-15 minutos) comparando el color de la tira con una escala no revestida de la guía de formulación PANTONE® y se anotó el número Pantone. Para el análisis en el laboratorio, las tiras se colocaron en forma de cartón y se analizaron usando la caja CAMAG Video-Store como se ha descrito anteriormente.

Tira C 30

Se añadieron tres gotas de extracto filtrado a un vaso de plástico y se añadieron 3 gotas de reactivo C (2,5 % de 2-aminoetil-difenilborinato en etanol al 96 %) y la reacción se dejó desarrollar durante 2 minutos. Una tira (filtro n.º 526 de 1 cm x 4 cm de Advantec, en el que 3 cm estaban impregnados con parafina) y con la parte sin parafina se puso en el disolvente en el vaso durante aproximadamente 5 segundos. El color de la reacción se evaluó (en el plazo de 5-15 minutos) comparando el color de la tira con una escala no revestida de la guía de formulación PANTONE® y se anotó el 35 número Pantone. Para el análisis en el laboratorio, las tiras se colocaron en forma de cartón y se analizaron usando la caja CAMAG Video-Store como se ha descrito anteriormente.

Resultados

En la figura 1-8 se presentan la conexión entre los colores PANTONE® y el efecto sobre la biomasa debido al tratamiento con herbicida (no tratado = 0 %). Para cada color PANTONE® se observaron el número y la intensidad de 40 color y se calculó la intensidad de color alta usando los valores medios +/- desviación estándar de las curvas de los estudios de semi-cultivo n.º 927/05 y 928/05. Estos valores se usaron para el cálculo de las curvas en los otros estudios y estudios de campo de 2005 y 2006.

Los colores sobre ambos tipos de tiras (A y B) varían de color claro a oscuro con respecto a dosis elevadas y elevado efecto sobre la reducción en biomasa. Para el tipo de tira A, el color e intensidad variaron de beis claro/violeta rojizo 45 pasando por violeta azulado claro a violeta oscuro. Para el tipo de tira B, los colores variaron de verde pasando por gris a azul muy oscuro para todas las especies de plantas expuestas a los herbicidas. Las especies de plantas más sensibles a los herbicidas presentaron el patrón de color tan pronto como 4 días después de la exposición, mientras que las especies de plantas menos sensibles tanto no mostraron cambios de color tan poderosos como el patrón no estuvo presente antes de 7 días después de la exposición. En el apéndice 2 a 8 se presenta toda la información 50 detallada relacionada con especies de plantas, dosis de herbicida, efectos visuales o efecto sobre la biomasa (peso fresco y seco).

El color PANTONE® para tanto la el tipo A como B de tira puede dividirse en tres niveles referentes a diferente cantidad de crecimiento reducido (biomasa) de las malezas gramíneas basándose en, por ejemplo, los resultados mostrados en la tabla 7 a 10.

A continuación, los resultados de los diferentes estudios se presentan en gráficas. Las dosis se presentan en el eje X como partes de las dosis normales (1 N) en las que se observa el efecto completo bajo las condiciones de cultivo. Las 5 dosis normales para cada especie de planta y herbicida se presentan en cualquier parte en el presente documento. El efecto de la biomasa se presenta como gráficas que van a leerse en el eje y derecho. El efecto presenta el porcentaje (%) de reducción de peso fresco y seco de plantas en relación con plantas sin tratar 21 días después de la exposición. En las figuras de los estudios de semi-cultivo (figura 1-5) dos columnas están presentando diferentes resultados de pruebas con respecto a las especies de plantas, el máximo de las columnas indica la intensidad de color cuando la 10 escala se presenta en el eje y izquierdo. La columna izquierda representa los resultados de la tira A y la columna derecha representa los resultados de la tira B. Los colores de las columnas indican el color PANTONE® observado. Los números del color PANTONE® también aparece en las tablas. Todos los parámetros se analizan para 3 duplicados y la desviación estándar se presenta en las columnas. En las figuras con resultados de los estudios de campo se presentan 4 columnas para cada dosis - las 2 primeras columnas muestran los resultados de la tira A después del tratamiento en 15 otoño y primavera, respectivamente, mientras que las columnas 3.º y 4.º muestran los resultados de la tira B para la aspersión en otoño y primavera.

Estudio de semi-campo con dosis/respuesta (927/05 y 928/05)

En estos estudios se investigaron la correlación entre color y reducción de biomasa. Los resultados mostraron que para ciertas especies de plantas y herbicidas la correlación entre color y reducción de biomasa puede detectarse ya 4 días 20 después de la exposición. Como se presenta en la figura 1 para el análisis, 4 y 7 días después de aplicar por aspersión Atlantis y Hussar se observó una respuesta significativa en relación con plantas sin tratar para la intensidad de color en tratamientos con más del 80 % de efecto sobre la reducción en biomasa para tanto la tira A como B. La figura 1 mostró distinción de color, intensidad y efecto sobre la biomasa para los tratamientos con Lexus y Monitor.

Los resultados indican que en ciertos casos puede preferirse la tira B. También puede preferirse una combinación de 25 los resultados de las tiras A y B.

Estudio de semi-campo con estabilidad a la lluvia (972/04 y 946/06)

El estudio de semi-campo con estabilidad a la lluvia (972/04 y 946/06) se realizó para investigar la conexión entre el color de las tiras y la reducción en biomasa antes y después de la lluvia con y sin exposición a herbicida. Se observó una gran dispersión para el efecto sobre la reducción de biomasa usando herbicidas sin y con aditivo (adhesivo), y en 30 el tratamiento con lluvia en momentos diferentes después de la exposición. En el estudio n.º 972/04, el material de planta se liofilizó y a continuación se analizó, mientras que en el estudio n.º 946/06 se analizó material de planta congelado fresco.

Los resultados en la figura 2 muestran después del tratamiento con Hussar y lluvia sobre ballico perenne, en el que se observó una respuesta significativa sobre la intensidad de color de la tira A y B. El color PANTONE® indica un alto 35 efecto reducido. Solo en un caso la tira B indica una respuesta positiva falsa sobre la intensidad de color (sin aditivo, lluvia después de 4 horas), pero el color PANTONE® tiene una respuesta firme. La prueba de tira en este estudio solo se realizó 4 días después de tratar las plantas con el herbicida. Así, la prueba también puede realizarse cuando al herbicida se añade un aditivo o llueve después de que las plantas se traten con el herbicida.

Los resultados en la figura 3 muestran que se obtuvo un resultado significativo para la intensidad de color de hasta el 40 50 % de efecto sobre la reducción de biomasa. Para el análisis 7 días después de aplicar por aspersión para la tira B se obtiene una buena correlación entre las dosis en la que la curva es plana y en la que más del 80 % del efecto en reducción de biomasa.

Estudio de semi-campo con mezclas de herbicidas (945/06)

En estos estudios el objetivo era investigar la mezcla de Hussar con otros herbicidas y sus efectos tanto fitoquímicos 45 como fisiológicos. Los resultados muestran una buena correlación entre el color sobre las tiras y el efecto final como reducción en biomasa para Hussar solo y en mezcla con Starane y Express. Se observó una respuesta significativa para intensidad de color de las tiras que indican que el tratamiento con herbicidas tuvo un efecto final superior al 80 % de reducción en biomasa. No hubo respuesta positiva falsa con colores PANTONE®. La mezcla de Hussar con el herbicida Starane da el mismo resultado que para Hussar solo, mientras que las mezclas de Hussar con el herbicida 50 Express aumentaron el efecto final sobre la biomasa y también aumentó la intensidad de color sobre las tiras. El herbicida Express es, al igual que Hussar y Atlantis, un herbicida de sulfonilurea. Express tiene un efecto para plantas de malas hierbas dicotiledóneas, pero también algún efecto para ballico perenne. Por tanto, el resultado observado no

es una sorpresa. Hay una buena correlación entre una reacción de color y el efecto final 21 días después de la exposición.

Estudios de campo

Estudios de campo en cultivos de invierno en Hobro y Sealand 2005/2006 (incluyendo el estudio n.º 917/06)

El estudio de campo en otoño de 2005 y primavera de 2006 soportan los resultados observados en los estudios de 5 semi-cultivo. Los análisis se realizaron para material de planta recolectado fresco directamente en los campos. Los resultados se presentan en la figura 5 a 7.

Para agrostis espiga de viento las dosis fueron demasiado altas y, por tanto, no se detectó diferenciación entre efecto y color sobre las tiras. Para estos estudios de campo, los resultados indicaron que realizar la prueba 4 días después de la exposición no necesita dar un resultado adecuado, realizar la prueba 5, 6 o 7 días después de la exposición puede 10 ser necesario. En ciertos casos se detectó un efecto según los colores de las tiras en las parcelas sin tratar (ballico perenne, Sealand otoño de 2005). Una contaminación de las parcelas laterales como desviación podría explicar los valores de bajo efecto que se calculan relativamente a las plantas de control y color de las tiras. Se realizaron análisis suplementarios de campos sin herbicidas (campos orgánicos) para garantizar los valores de campo para el 0 % del efecto de color en relación con los estudios de semi-cultivo. Estos análisis mostraron los mismos resultados que para 15 los estudios de semi-cultivo.

En Sealand para ballico perenne estuvo de acuerdo un cambio de color en el color PANTONE® para el efecto final de más del 80 % de efecto sobre la reducción de biomasa.

El estudio de desarrollo con ballico perenne expuesto a Hussar OD (948/06) se realizó para evaluar la sensibilidad de la planta al herbicida en diferentes etapas de crecimiento y se correlacionan entre sensibilidad y reacción de color con el 20 procedimiento de tiras. No se detectó gran diferencia de la reacción (tanto el color de las tiras como la reducción de biomasa) en las diferentes etapas de crecimiento 12, 30.2 y 32. Los resultados fueron como se ha visto antes los más distintos 7 días después de la exposición. En este estudio, una tendencia del efecto sobre la reducción de biomasa se subestima según la reacción de color de la tira. Mediante cualquier medio, la reacción de color sobre las tiras en las dos mayores dosis de herbicida de Hussar en las etapas de crecimiento 30.2 y 32 indicaron un efecto sobre la 25 reducción de la biomasa superior al 80 % de efecto.

Resumen para estudios de semi-campo y de campo

En relación con la utilidad del procedimiento en práctica es importante que no se detecten resultados positivos falsos que predigan que el efecto es suficiente en casos en los que se necesita una aspersión suplementaria. Un resultado negativo falso es menos importante para el agricultor, pero importante para el entorno. 30

Tabla 7: Visión general de las especies de plantas, herbicidas y colores PANTONE® para tratamiento con herbicida con bajo efecto final sobre la reducción de biomasa (0-39 %).

Especies de plantas

Herbicida Efecto final (peso fresco) Tira A 4 días n.º PANTONE® Tira B 4 días n.º PANTONE® Tira A 7 días n.º PANTONE® Tira B 7 días n.º PANTONE® Estudio n.º/ Comentarios

Ballico perenne

Hussar 0-12,8 %

-

-

972/04 Ninguno/Ninguno

Ballico perenne

Hussar 0-11,3 % 665, 666, 7446 5645, 416, 417, 418

-

-

972/04 Ninguno/1 hora

Ballico perenne

Hussar 0-3,6 % 666, 667

-

-

972/04 Ninguno/4 horas

Ballico perenne

Hussar 0 %

-

-

972/04 Aditivo/Ninguno

Ballico perenne

Hussar 0 %

-

-

972/04 Aditivo/1 hora

Ballico perenne

Hussar 0 %

-

-

972/04 Aditivo/4 horas

Ballico perenne

Hussar 0-16,2 % 7527, 664 5803, 7544

-

-

927/05 Dosis/respuesta

Ballico perenne

Hussar 0-30,4 % 665, 666 535” 535** 945/06 Sin mezcla

(continuación)

Especies de plantas

Herbicida Efecto final (peso fresco) Tira A 4 días n.º PANTONE® Tira B 4 días n.º PANTONE® Tira A 7 días n.º PANTONE® Tira B 7 días n.º PANTONE® Estudio n.º/ Comentarios

Ballico perenne

Hussar 0-38,3 %* 664, 665 945/06 0,5 l/ha de Oxitril

Ballico perenne

Hussar 0 % 665, 7445 535*,** 945/06 0,6 l/ha de Starane

Ballico perenne

Hussar 0* 272* 535* 273* 534* 945/06 3,75 g de p.a./ha de Lexus

Ballico perenne

Hussar 0-6,7 % 271, 272** 534, 2758** 948/06 Etapa 12

Ballico perenne

Hussar 0-25,7 % 7445, 665 663, 665 7544, 7546 948/06 Etapa 30.2

Ballico perenne

Hussar 0-21,7 % 7544, 7546 948/06 Etapa 32

Ballico perenne

Hussar 0 % Hobro 2005

Ballico perenne

Hussar 0 % 534** Sealand 2005

Ballico perenne

Hussar 0 % 534** Hobro 2006

Ballico perenne

Hussar 0 % 272** 272** Sealand 2006

Ballico perenne

Atlantis 0 % 664, 665 7543, 7544 7527, 664, 5235 5565, 5527, 7543 946/06 Ninguno/Ninguno

Ballico perenne

Atlantis 0 % 664, 665 7543, 7544 946/06 Ninguno/1 hora

Ballico perenne

Atlantis 0-23,5 % 664, 665 7527, 664 5565 (0 %), 7543 (0 %), 7544 (23,5 %) 946/06 Ninguno/3 veces

Ballico perenne

Atlantis 0-29,0 % 665, 5235 7543 (0 %) 946/06 Aditivo/Ninguno

Ballico perenne

Atlantis 0 % 946/06 Ninguno/Ninguno

Ballico perenne

Atlantis 0 % 946/06 Ninguno/Ninguno

Ballico perenne

Atlantis 0 % Hobro 2005

Ballico perenne

Atlantis 0 % 534** Sealand 2005

Ballico perenne

Atlantis 0 % 534” Hobro 2006

Ballico perenne

Atlantis 0 % 272** 272** Sealand 2006

Ballico perenne

Atlantis 0 % 273** 273** 917/06 Estudio de campo

Agrostis espiga de viento

Hussar 0 % 7437-7439 927/05 Dosis/respuesta

Agrostis espiga de viento

Hussar 0 % 272** 534** 273** 534** Sealand 2005

(continuación)

Especies de plantas

Herbicida Efecto final (peso fresco) Tira A 4 días n.º PANTONE® Tira B 4 días n.º PANTONE® Tira A 7 días n.º PANTONE® Tira B 7 días n.º PANTONE® Estudio n.º/ Comentarios

Agrostis espiga de viento

Hussar 0 % 535” Sealand 2006

Agrostis espiga de viento

Atlantis 0 % 7437-7439 927/05 Dosis/respuesta

Agrostis espiga de viento

Atlantis 0 % 272** 7545-533** 2745** 534** Sealand 2005

Agrostis espiga de viento

Atlantis 0 % 535** Sealand 2006

Agrostis espiga de viento

Monitor 0 % 928/05 Dosis/respuesta

Agrostis espiga de viento

Lexus 0-39,4 % 664 (0 %) 7542 (0-39,6 %) 663, 7527 5803 (0 %) 928/05 Dosis/respuesta

Poa anual

Hussar 0 % Hobro 2005

Poa anual

Hussar 0 % 534” Hobro 2006

Poa anual

Atlantis 0 % Hobro 2005

Poa anual

Atlantis 0 % 534** Hobro 2006

Poa anual

Atlantis 0 % 5783-5645

-

-

927/05 Dosis/respuesta

Barbas de macho

Monitor 0 % 928/05 Dosis/respuesta

Agerraeve-hale

Lexus 0 % 928/05 Dosis/respuesta

*Oxitril, Starane y Lexus tienen un efecto que se observa en el “valor o”,

**Altos valores inexplicables

Tabla 8a: Visión general de especies de plantas, herbicidas, color PANTONE® para tratamiento con herbicidas con efecto final medio sobre la reducción de biomasa (40-85 %).5

Especies de plantas

Herbicida Efecto final (peso fresco) Tira A 4 días n.º PANTONE® Tira B 4 días n.º PANTONE® Tira A 7 días n.º PANTONE® Tira B 7 días n.º PANTONE® Estudio n.º/ Comentarios

Ballico perenne

Hussar 33,6-61,8 % 665, 666 443 (33,6 %) 7545, 7546 (61,8 84,3 %)

-

-

972/04 Ninguno/Ninguno

Ballico perenne

Hussar 57,2 %

-

-

972/04 Ninguno/1 hora

Ballico perenne

Hussar 24-78,9 % 5487 (24 %), 7545 (51,5 %), 534 (78,9 %)

-

-

972/04 Ninguno/4 horas

Ballico perenne

Hussar 52,2 % 7545 (52,2-85,1 %)

-

-

972/04 Aditivo/Ninguno

Ballico perenne

Hussar 36,1 % 7446 273 (59,5-88,0 %) 5625 (36,1 %), 7545 (59,5 %)

-

-

972/04 Aditivo/1 hora

Especies de plantas

Herbicida Efecto final (peso fresco) Tira A 4 días n.º PANTONE® Tira B 4 días n.º PANTONE® Tira A 7 días n.º PANTONE® Tira B 7 días n.º PANTONE® Estudio n.º/ Comentarios

Ballico perenne

Hussar 61,5-77,0 %

-

-

972/04 Aditivo/4 horas

Ballico perenne

Hussar 68,8 % 7446 272 (>7 5,3 %) 535 (68,8-75,3 %)

-

-

927/05 Dosis/respuesta

Ballico perenne

Hussar 64,7 % 7445 (64,7-94,9 %) 945/06 Sin mezcla

Ballico perenne

Hussar 79,0-90,4 % 663, 7445 665, 666 945/06 0,5 l/ha de Oxitril

Ballico perenne

Hussar 79,2 % 534* 2766* (>79,4 %) 945/06 0,6 l/ha de Starane

Ballico perenne

Hussar 83,7 % 2766* (>83,7 %) 945/06 3,75 g de p.a./ha de Lexus

Ballico perenne

Hussar 40-86,7 % 273 (>40 %) 534,27 58 (>40 %) 534 (40 %) 2758 (86,7 %) 948/06 Etapa 12

Ballico perenne

Hussar 85 % 948/06 Etapa 30.2

Ballico perenne

Hussar 50-86,7 % 7445 (50 %) 7545 (>50 %) 272 (50 %) 7546 (86,7 %) 948/06 Etapa 32

Ballico perenne

Hussar

-

-

-

-

-

Hobro 2005

Ballico perenne

Hussar 41,3-76,3 % 271 (>41,3 %) 666, 272 534 (>41,3 %) Sealand 2005

Ballico perenne

Hussar

-

-

-

-

-

Hobro 2006

Ballico perenne

Hussar 53,8 % 273 (>53,8 %) 443 (53,8 %) Sealand 2006

Ballico perenne

Atlantis 31,6-78 % 664 (31,6 %) 666 (78 %) 7544 (31,6 %) 7545 (78 %) 946/06 Ninguno/Ninguno

Ballico perenne

Atlantis 28,4-64,9 % 665 (>28,4 %) 536 (28,4 %) 535 (64,9 %) 5245 (28,4 %) 665 (64,9 %) 7543 (28,4 %) 535 (>64,9 %) 946/06 Ninguno/1 hora

Ballico perenne

Atlantis 72,8 % 535 (>72,8 %) 946/06 Ninguno/3 veces

Ballico perenne

Atlantis 55,7 % 665 (>55,7 %) 535 (>29,0 %) 946/06 Aditivo/Ninguno

Ballico perenne

Atlantis 56,2 % 535 (>56,2 %) 535 (>56,2 %) 946/06 Ninguno/1time

Especies de plantas

Herbicida Efecto final (peso fresco) Tira A 4 días n.º PANTONE® Tira B 4 días n.º PANTONE® Tira A 7 días n.º PANTONE® Tira B 7 días n.º PANTONE® Estudio n.º/ Comentarios

Ballico perenne

Atlantis 71,9-89,3 % 535 (>71,9 %) 535 (>71,9 %) 946/06 Ninguno/3 veces

Ballico perenne

Atlantis

-

-

-

-

-

Hobro 2005

Ballico perenne

Atlantis 35-70 % 666 (35 %) 7446 (43,8 %) 7545 (35 %) Sealand 2005

Ballico perenne

Atlantis

-

-

-

-

-

Hobro 2006

Ballico perenne

Atlantis 48,3-62,5 % 443 (>48,3 %) 444 (48,3 %) 7545 (62,5 %) Sealand 2006

Ballico perenne

Atlantis 7,5-75,0 % 667 (7,5-20 %) 273 (75,0 %) 667 (7,5 %) 273 (20-75 %) 7544, 7545 917/06 Estudio de campo

Agrostis espiga de viento

Hussar 61,9-81 % 443 (61,9 %) 7545 (81 %) 7439 (61,9 %) 7440(> 81 %) 7542 (61,9 %) 7545, 535 (>81 %) 927/05 Dosis/respuesta

Agrostis espiga de viento

Hussar >60 % Sealand 2005

Agrostis espiga de viento

Hussar

-

-

-

-

-

Sealand 2006

Agrostis espiga de viento

Atlantis 45,9-68 % 271, 272 (45,9-48,5 %) 273 (>68 %) 443 (45,9 %) 7544 7439, 7440, 260 7545, 535 927/05 Dosis/respuesta

Agrostis espiga de viento

Atlantis

-

-

-

-

-

Sealand 2005

Agrostis espiga de viento

Atlantis

-

-

-

-

-

Sealand 2006

Agrostis espiga de viento

Monitor 41,9-73,6 % 665, 7445, 7446 7544, 535 536, 535 928/05 Dosis/respuesta

Agrostis espiga de viento

Lexus 29,1-69,9 % 663 271(>6 9,9 %) 535 (>69,9 %) 664, 665 5655 (29,1 %) 7542 (39,4 %) 535 (69,9 %) 928/05 Dosis/respuesta

Especies de plantas

Herbicida Efecto final (peso fresco) Tira A 4 días n.º PANTONE® Tira B 4 días n.º PANTONE® Tira A 7 días n.º PANTONE® Tira B 7 días n.º PANTONE® Estudio n.º/ Comentarios

Poa anual

Hussar 37,7 % 7544 (37,7-46,8 %) Hobro 2005

Poa anual

Hussar 41,2-58,2 % Hobro 2006

Poa anual

Atlantis 29-58,8 % 7545 (29-43,7 %) 534 (>29 %) Hobro 2005

Poa anual

Atlantis 56,4-77,1 % 272, 273 2745, 2755 Hobro 2006

Poa anual

Atlantis 61,9 % 443, 5645

-

-

927/05 Dosis/respuesta

Barbas de macho

Monitor 49,4-83,7 % 7527 (>0 %) 7527, 5245 928/05 Dosis/respuesta

Hierba de cola de zorra

Lexus >83,8 % 270, 271, 272 535, 534 (>96,4 %) 7444, 7445, 270, 271 534, 2766 928/05 Dosis/respuesta

*Oxitril, Starane y Lexus tienen un efecto que se observa en el “valor o”,

**Altos valores inexplicables

Tabla 8b: Visión general de especies de plantas, herbicidas, colores PANTONE® para el tratamiento con alto efecto final sobre la biomasa (>85 %)

Especies de plantas

Herbicida Efecto final (peso fresco) Tira A 4 días n.º PANTONE® Tira B 4 días n.º PANTONE® Tira A 7 días n.º PANTONE® Tira B 7 días n.º PANTONE® Estudio n.º/ Comentarios

Ballico perenne

Hussar >89,3 % 534 (>88,8 %)

-

-

972/04 Ninguno/Ninguno

Ballico perenne

Hussar >79,9 %

-

-

972/04 Ninguno/1 hora

Ballico perenne

Hussar 24-78,9 % 534 (>78,9 %)

-

-

972/04 Ninguno/4 horas

Ballico perenne

Hussar >89,5 % 274 (>85,1 %) 972/04 Aditivo/Ninguno

Ballico perenne

Hussar > 86,8 % 534 (>77,2 %) 972/04 Aditivo/1 hora

Ballico perenne

Hussar >82,6 % 972/04 Aditivo/4 horas

Ballico perenne

Hussar >98,1 % 534 (>91,2 %) 927/05 Dosis/respuesta

Ballico perenne

Hussar >94,9 % 666 (>96,1 %) 668, 273 945/06 Sin mezcla

Ballico perenne

Hussar >95,3 % 444, 7545 945/06 0,5 l/ha de Oxitril

Especies de plantas

Herbicida Efecto final (peso fresco) Tira A 4 días n.º PANTONE® Tira B 4 días n.º PANTONE® Tira A 7 días n.º PANTONE® Tira B 7 días n.º PANTONE® Estudio n.º/ Comentarios

Ballico perenne

Hussar >97 % 273 (>40 %) 948/06 Etapa 12

Ballico perenne

Hussar >98,7 % 948/06 Etapa 30.2

Ballico perenne

Hussar >86,7 % 7545 (>50 %) 7545, 7546 948/06 Etapa 32

Ballico perenne

Hussar

-

-

-

-

-

Hobro 2005

Ballico perenne

Hussar >95,3 % 272 (>76,3 %) 534 (>41,3 %) Sealand 2005

Ballico perenne

Hussar

-

-

-

-

-

Hobro 2006

Ballico perenne

Hussar >96,0 % Sealand 2006

Ballico perenne

Atlantis >95,4 % 665, 7445 534,2766 946/06 Ninguno/Ninguno

Ballico perenne

Atlantis >96,8 % 665 (>28,4 %) 534 (>89,0 %) 666 (>89,0 %) 273 535 (>64,9 %) 946/06 Ninguno/1 hora

Ballico perenne

Atlantis >95,7 % 665, 5235 666, 667 946/06 Ninguno/3 veces

Ballico perenne

Atlantis >94,2 % 665, 7445 666, 667 946/06 Aditivo/Ninguno

Ballico perenne

Atlantis >93,3 % 665 (>56,2 %) 535 (>79,4 %) 946/06 Ninguno/1 hora

Ballico perenne

Atlantis >96,4 % 666, 667 946/06 Ninguno/3 veces

Ballico perenne

Atlantis

-

-

-

-

-

Hobro 2005

Ballico perenne

Atlantis >43,8 % Sealand 2005

Ballico perenne

Atlantis

-

-

-

-

-

Hobro 2006

Ballico perenne

Atlantis >91,5 % 273 (>48,1 %) 443 (>48,1 %) 2755 (>62,5 %) Sealand 2006

Ballico perenne

Atlantis >97,3 % 917/06 Estudio de campo

Agrostis espiga de viento

Hussar >88,8 % 260, 261, 262 927/05 Dosis/respuesta

Especies de plantas

Herbicida Efecto final (peso fresco) Tira A 4 días n.º PANTONE® Tira B 4 días n.º PANTONE® Tira A 7 días n.º PANTONE® Tira B 7 días n.º PANTONE® Estudio n.º/ Comentarios

Agrostis espiga de viento

Hussar >93,3 % 272, 2745 2756, 2766 Sealand 2006

Agrostis espiga de viento

Atlantis >83,9 % 2745, 2755 927/05 Dosis/respuesta

Agrostis espiga de viento

Atlantis >90 % 2745, 2755 534, 2768 Sealand 2005

Agrostis espiga de viento

Atlantis >96 % Sealand 2006

Agrostis espiga de viento

Monitor >88,4 % 272,273 664, 665 534, 2766 928/05 Dosis/respuesta

Agrostis espiga de viento

Lexus >88,7 % 535 (>69,9 %) 534, 2766 928/05 Dosis/respuesta

Poa anual

Hussar >46,8 % Hobro 2005

Poa anual

Hussar >74,7 % 273 (>58,2 %) 2766 (>58,2 %) 2756 (>58,2 %) Hobro 2006

Poa anual

Atlantis >58,8 % 272 (>29 %) 273 (>29 %) 534 (>29 %) Hobro 2005

Poa anual

Atlantis >56,4 % 272, 273 2745, 2755 Hobro 2006

Poa anual

Atlantis >94,3 %

-

-

927/05 Dosis/respuesta

Barbas de macho

Monitor >90,5 % 7527 (>0 %) 534, 2766 928/05 Dosis/respuesta

Hierba de cola de zorra

Lexus >83,8 % 270, 271, 272 535, 534 (>96,4 %) 7444, 7445, 270, 271 534, 2766 928/05 Dosis/respuesta

*Oxitril, Starane y Lexus tienen un efecto que se observa en el “valor o”,

**Altos valores inexplicables

Tabla 9: Visión general de especies de plantas, herbicidas, colores PANTONE® para el tratamiento con alto efecto final sobre la biomasa.

Especies de plantas

Herbicida Efecto final (peso fresco) Tira A 4 días n.º PANTONE® Tira B 4 días n.º PANTONE® Tira A 7 días n.º PANTONE® Tira B 7 días n.º PANTONE®

Ballico perenne

-

0 % 664, 665 7543, 7544 7527, 665 7543, 7544, 5565

Especies de plantas

Herbicida Efecto final (peso fresco) Tira A 4 días n.º PANTONE® Tira B 4 días n.º PANTONE® Tira A 7 días n.º PANTONE® Tira B 7 días n.º PANTONE®

Ballico perenne

Hussar >96 %

Ballico perenne

Atlantis 32-78 % 666, 667, 7446, 273 443, 7545, 535 666, 271, 273 7545, 535

Ballico perenne

Atlantis >97 %

Agrostis espiga de viento

-

0 % 7446, 664, 270 5517, 7542, 7545 7527, 7446, 7439 5517, 7542

Agrostis espiga de viento

Hussar 60-81 % 272, 273 443, 7545, 534 7440,273 7545, 535, 534

Agrostis espiga de viento

Hussar >93 %

Agrostis espiga de viento

Atlantis 46-68 % 271, 272, 273 443, 7544 7440, 260 7545, 535

Agrostis espiga de viento

Atlantis >90 %

Agrostis espiga de viento

Monitor 42-74 % 665, 7445, 7446 7544, 535 536,535

Agrostis espiga de viento

Monitor >88 %

Agrostis espiga de viento

Lexus 29-70 % 663, 271 664, 665 5655, 7542, 535

Agrostis espiga de viento

Lexus >89 %

Poa anual

-

0 % 664, 7445, 7527 5783, 5645, 7544 7527, 665, 7444 7543, 7544

Poa anual

Hussar 38-58 % 272, 273 272, 273

Poa anual

Hussar >58 %

Poa anual

Atlantis 29-77 % 665, 272, 273 443, 7545, 534

Poa anual

Atlantis >56 %

Barbas de macho

-

0 %

Barbas de macho

Monitor >91 %

Barbas de macho

Monitor 49-83 % 7527, 5245

Hierba de cola de zorra

-

0 %

Hierba de cola de zorra

Lexus >84 % 270, 271, 272 535, 534 7444, 7445, 270, 271 534,2766

Para todos los resultados de la tira A, las reacciones de color son de violeta claro para las plantas sin tratar a violeta oscuro a alta reducción en los efectos de biomasa debido al tratamiento con herbicida. Este resultado se observa correspondientemente con la tira B, en la que los colores varían de verde/gris claro para las plantas sin tratar a gris oscuro y finalmente azul oscuro para altos efectos del tratamiento con herbicida. Pueden usarse colores del borde para el kit de prueba para garantizar respuestas apropiadas para ninguno y altos efectos sobre la reducción de biomasa. En 5 muy pocos casos se observó un resultado positivo falso. Este se produjo por contaminación de herbicida de las parcelas vecinas ya que las parcelas estuvieron muy próximas entre sí y así fue posible un desvío del herbicida. Las pruebas positivas falsas se detectaron por los resultados de biomasa ya que estos resultados fueron inferiores a los esperados. Para soportar la reacción de color para las plantas no tratadas se realizaron varias pruebas adicionales con plantas sin tratar para garantizar la reacción de color de valores del 0 % (plantas non tratadas). 10

El uso del kit de prueba para otras plantas y herbicidas

Un cribado por cromatografía en capa fina realizado con diferentes plantas (monocotiledóneas y dicotiledóneas) indicó que al menos los dos grupos fitoquímicos probados representan biomarcadores generales en plantas y así pueden usarse para un procedimiento de determinación del efecto de un tratamiento con herbicida y para un kit de prueba basado en estos procedimientos. 15

Ejemplo 3

Kit de prueba basado en plantas dicotiledóneas tratadas con herbicidas

Los análisis de las dos tiras (tira A y tira B) como se describen en cualquier parte en el presente documento también se han probado en plantas germinadas a partir de semilla y plantas germinadas a partir de raíz de diente de león, Taraxacum vulgare Weber, expuestas al herbicida Roundup Bio. 20

Planta y condiciones de crecimiento

Se obtuvieron semillas de diente de león de HerbiSeed U.K. Los efectos del tratamiento con herbicida se evaluaron para dosis subletales. Las plantas se sembraron en macetas de 2 l en una mezcla de tierra de campo, arena y esfagno (2:1:1) (porcentaje en peso). Las macetas se pusieron en invernadero. Después de la germinación, el número de plantas por maceta se redujo a una. Cuando las plantas tuvieron 8-10 hojas, la masa de la planta aérea se cortó en la 25 posición en la que se habían desarrollado las plantas germinadas a partir de raíz. Esto no se hizo para las plantas germinadas a partir de semilla. El día antes de la exposición, las macetas se colocaron sobre una mesa de riego automático en el invernadero. Aquí se registró el peso de cada maceta. La exposición a herbicida se realizó cuando las plantas tuvieron 8 a 12 hojas.

Herbicida 30

El herbicida usado fue: Roundup Bio, 360 g/l (Monsanto Crop Sciences Denmark A/S) (glifosato 360 g/l).

Los herbicidas se aplicaron en agua desionizada usando un pulverizador de macetas de laboratorio provisto de dos boquillas de abanico plano ISO F-02-110 que liberan un volumen de espray de 150 l por ha con una presión de 3 bar. Se usaron seis dosis de Roundup Bio (véase la tabla 6). Todos los tratamientos se repitieron tres veces. Los 15 duplicados de cada tratamiento se separaron en 5 grupos con tres duplicados por tratamiento. Durante las 3 primeras 35 semanas después del tratamiento, cada semana se recolectó un grupo de plantas y se midió el peso fresco y seco con respecto a cada planta. Se usó un grupo de plantas para la producción de semillas cuando las semillas maduras se seleccionaron semanalmente hasta 4 meses después del tratamiento. Se calculó el peso de mil semillas contando y pesando 100 semillas de cada maceta. Se usó un grupo de plantas para el análisis de la tira A y B 7 días después del tratamiento. 40

Hasta 3 semanas después del tratamiento se realizaron observaciones semanales de mediciones no destructivas de efectos visuales (véase la tabla 2 para una visión general de la puntuación 0-9 que indica el efecto visual del tratamiento), uso de agua y medición de fluorescencia. Se registró el uso de agua diario para cada maceta, y las macetas se pesaron automáticamente varias veces al día y se añadieron nutrientes regularmente. Se realizaron detecciones de fluorescencia (curvas de luz-respuesta) semanalmente con HansaTech PAM. Antes de las mediciones, 45 la planta se mantuvo en una habitación oscura durante al menos 1 hora para normalizar el nivel de fotosíntesis en la planta en relación con los días de sol y nublados. Todas las mediciones se realizaron sobre la misma hoja de cada planta.

Resultados

En la tabla 10 y 11 se presentan todos los datos de estas investigaciones. En la figura 8 y 9 se presentan los resultados 50 de la tira A y B junto con la reducción en biomasas 24 semanas después del tratamiento. En comparación con las monocotiledóneas, esto es un efecto a muy largo plazo 24 semanas = 168 días después del tratamiento.

Según la reducción en biomasas tres semanas después de tratamiento, las plantas previamente estresadas (germinación de la raíz estresada cortando las partes aéreas antes del tratamiento) son menos sensibles a los herbicidas. Esto también se confirmó probando la reacción de color para la tira A y B.

La correlación del color de los dos tipos de tiras A y B para el dicotiledón, Taraxacum vulgare, están de acuerdo con aquellos observados para las monocotiledóneas. Los colores son diferentes para los dos tipos de tira cuando se 5 comparó con las tiras correspondientes obtenidas cuando se prueba el tratamiento con herbicida de plantas monocotiledóneas. Esto es debido a que hay diferentes compuestos químicos en plantas dicotiledóneas y su reacción al estrés es diferente a la observada en plantas monocotiledóneas. Sin embargo, pueden construirse tres intervalos de respuesta diferentes debidos al tratamiento con herbicida en cuanto a las monocotiledóneas según el nivel de la reducción de biomasa y el color correspondiente de la tiras. 10

Para las plantas germinadas a partir de raíz (figura 9) se observa muy poco efecto o no se observa para tanto la reducción de biomasa 24 semanas después del tratamiento como el color de tira A y B. Esto está de acuerdo con los resultados de las monocotiledóneas. Así, la figura y los resultados muestran claramente que el procedimiento y la tira pueden usarse para probar el efecto del herbicida, ya que el color obtenido sobre las tiras indicó que no hubo efecto del tratamiento con herbicida que también se observó por la evaluación de biomasa.15

Tabla 10: Resultados del proyecto n.º 903/06 de diente de león germinado de semilla, recolectada 24 semanas después del tratamiento (SDT). El número entre paréntesis es la desviación estándar.

Herbicida

Dosis (g de p.a./ha) Peso fresco (g/maceta) Peso seco (g/maceta) Puntuación Adición de hoja Semilla (número/maceta) Agua usada por semana

1 SDT

2 SDT 3 SDT 1 SDT 2 SDT 3 SDT 1 SDT 2 SDT 3 SDT

Sin tratar

68,2 (20,8) 21,3 (1,7) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 10,7 (1,7) 14,8 (3,8) 15,7 (3,9) 572 (159) 769 (87) 1017 (111)

Roundup

11,25 48,8 (19,4) 20,6 (3,3) 1,7 (1,5) 2,7 (0,6) 1,7 (0,6) 9,4 (2,3) 11,9 (3,3) 12,2 (4,5) 358 (194) 528 (132) 767 (104)

22,5 50,6 (28,8) 16,8 (4,5) 2,3 (2,1) 4,3 (1,5) 3,7 (1,5) 7,5 (3,2) 9,1 (4,5) 7,6 (3,6) 310(72) 332 (140) 440 (225)

67,0 (21,7) 18,7 (4,5) 2,7 (0,6) 5,3 (1,5) 3,3 (1,5) 7,8 (1,9) 8,2 (3,8) 8,2 (3,9) 470 (116) 416 (155) 519 (222)

80,8 (24,1) 15,7 (3-8) 4,7 (0-6) 7,7 (0,6) 7,7 (0,6) 1,8 (1,3) 2,6 (2,4) 2,0 (3,1) 143 (31) 131 (36) 200(32)

40,3 (43,5) 6,5 (6,6) 7,3 (2,3) 9,3 (0,6) 9,0 (1,0)

-

-

-

124 (27) 95 (22) 118(40)

0,8 (0,1) 0,8 (0,0) 9,0 (1,0) 10,0 (0,0) 10,0 (0,0)

-

-

-

103 (1) 105 (44) 80(10)

Herbicida

Recolección Dosis (g de p.a./ha) Peso fresco (g/maceta) Peso seco (g/maceta) Peso seco de la raíz Puntuación en la recolección

Sin tratar

1 SDT 14,5(4,5) 2,0 (0,7) 0,0 (0,0)

Roundup

11,25 16,7 (5,7) 2,2 (0,6) 0,0 (0,0)

22,5 13,9 (5,8) 2,3 (0,2) 0,0 (0,0)

11,3 (4,6) 1,6 (0,5) 0,3 (0,6)

8,5 (4,0) 1,4 (0,5) 1,7 (1,2)

6,0 (1,3) 1,3 (0,2) 4,3 (2,1)

(continuación)

Herbicida

Recolección Dosis (g de p.a./ha) Peso fresco (g/maceta) Peso seco (g/maceta) Peso seco de la raíz Puntuación en la recolección

3,6 (1,0) 1,2 (0,5) 7,7 (0,6)

Sin tratar

2 SDT 28,5 (6,2) 4,0 (0,5) 0,0 (0,0)

Roundup

11,25 33,4 (-) 3,2 (1,3) 0,0 (0,0)

22,5 26,0 (3,8) 3,6 (0,4) 0,7 (1,2)

17,0 (6,5) 2,4 (0,7) 0,7 (1,2)

13,1 (6,1) 2,1 (0,8) 3,0 (1,7)

11,4 (7,0) 1,7 (0,9) 4,0 (0,0)

3,1 (1,7) 1,2 (0,2) 7,0 (0,0)

Sin tratar

3 SDT 21,6 (24,9) 3,9 (3,5) 2,1 (2,9) 0,0 (0,0)

Roundup

11,25 37,9 (35,5) 5,7 (4,5) 2,8 (0,9) 2,0 (2,0)

22,5 20,8(19,0) 5,1 (1,5) 2,8 (2,7) 1,0 (0,0)

20,1 (13,7) 3,2 (2,0) 1,9 (1,4) 4,7 (1,2)

7,9 (8,5) 2,2 (0,7) 1,6 (1,6) 6,3 (0,6)

1,5 (0,4) 1,0 (0,3) 0,3 (0,1) 6,7 (1,5)

1,0 (0,6) 0,6 (0,3) 0,1(0,1) 8,7 (0,6)

Tabla 11: Resultados del proyecto n.º 903/06 de diente de león germinado de raíz, recolectada 24 semanas después del tratamiento (SDT). El número entre paréntesis es la desviación estándar.

Herbicida

Dosis (g de p.a./ha) Peso fresco (g/maceta) Peso seco (g/maceta) Puntuación Adición de hoja Semilla (número/maceta) Agua usada por semana

1 SDT

2 SDT 3 SDT 1 SDT 2 SDT 3 SDT 1 SDT 2 SDT 3 SDT

Sin tratar

40,8 (6,2) 14,8 (2,9) 0,0 (0,0) 0,0 (1,7) 0,0 (13,9) 3,8 (2,4) 4,9 (2,4) 5,1 (2,1) 800 (185) 1243 (271) 1214 (214) 850 (110)

Roundup

11,25 53,8 (13,3) 19,5 (3,1) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 3,8 (0,8) 3,5 (-) 3,9 (0,8) 1184 (287) 1266 (84) 760 (143)

22,5 32,6 (7,2) 12,0 (2,8) 3,3 (2,1) 3,3 (2,1) 0,0 (0,0) 3,9 (0,6) 3,8 (0,8) 4,4 (0,6) 543 (227) 1124 (221) 1155 (173) 876 (86)

61,6 (31,0) 18,7 (4,4) 1,0 (0,0) 2,0 (1,0) 0,0 (0,0) 2,6 (1,9) 3,2 (2,6) 3,1 (1,9) 1081 (302) 1211 (81) 877 (94)

67,2 (25,6) 23,5 (12,2) 2,7 (1,2) 4,3 (1,5) 1,0 (1,7) 3,8 (0,8) 4,7 (0,6) 4,3 (0,6) 30 (-) 1003 (94) 1044 (134) 831 (81)

42,9 (8,1) 15,6 (4,5) 5,0 (1,7) 4,7 (1,5) 2,0 (0,0) 4,3 (1,9) 5,2 (2,4) 5,0 (2,2) 284 (-) 733 (287) 783 (258) 621 (235)

37,8 (11,3) 12,8 (3,3) 6,0 (1,0) 6,3 (2,1) 3,3 (0,6) 3,1 (0,4) 3,3 (0,3) 3,6 (0,4) 738 (-) 666 (268) 661 (250) 476 (182)

Herbicida

Recolección Dosis (g de p.a./ha) Peso fresco (g/maceta) Peso seco (g/maceta) Peso seco de la raíz Puntuación en la recolección

Sin tratar

1 SDT 31,3 (3,1) 3,5 (0,3) 9,9 (4,0) 0,0 (0,0)

Roundup

11,25 24,3 (7,9) 2,6 (0,8) 6,1 (1,1) 0,7 (1,2)

22,5 32,3(1,9) 3,3 (0,3) 7,6 (2,2) 0,7 (0,6)

25,0 (3,1) 2,6 (0,3) 7,5 (1,4) 2,0 (1,0)

22,2 (3,3) 2,4 (0,1) 7,3 (0,5) 4,3 (1,2)

180' 17,6 (3,9) 2,0 (0,3) 7,9 (0,8) 3,7 (0,6)

15,7 (3,8) 2,2 (0,8) 7,1 (2,5) 3,7 (0,6)

(continuación)

Herbicida

Recolección Dosis (g de p.a./ha) Peso fresco (g/maceta) Peso seco (g/maceta) Peso seco de la raíz Puntuación en la recolección

Sin tratar

2 SDT 47,9 6,5 (1,7) 10,1 (2,9) 1,3 (2,3)

Roundup

(11,6)

11,25 40,5 (2,0) 5,7 (0,6) 12,0 (4,2) 2,0 (2,0)

22,5 41,5 (6,6) 5,7 (1,1) 12,5(1,7) 1,7 (1,5)

25,0 (5,3) 3,5 (0,3) 9,9 (0,7) 3,3 (1,5)

24,0 (2,4) 3,2 (0,5) 9,8 (1,5) 5,7 (1,5)

19,8 (2,0) 2,8 (0,5) 11,7 (6,1) 4,7 (0,6)

15,2 (5,9) 2,5 (0,7) 10,1 (0,3) 6,7 (1,5)

Sin tratar

3SDT 40,7 (8,3) 6,8 (1,0) 12,1 (1,2) 1,0 (1,7)

Roundup

11,25 42,3 (10,8) 7,3 (1,7) 17,3 (3,7) 1,0 (1,0)

22,5 49,2 (12,5) 8,3 (1,9) 11,6 (4,6) 1,3 (0,6)

37,9 (1,1) 6,0 (0,1) 12,8 (4,4) 1,0 (0,0)

32,7 (10,2) 5,4 (1,3) 11,1 (7,2) 1,3 (0,6)

16,8 (5,9) 2,8 (0,9) 12,8 (4,4) 4,3 (1,5)

15,7 (1,5) 2,7 (0,4) 11,1 (7,2) 5,7 (1,2)

Tabla 12 (A y B). Datos del estudio de semi-campo 930/06 datos para la figura 8 y 9.

Tabla 12A. Estudio de semi-campo de diente de león germinado de semilla, Taraxacum vulgare

Herbicida

Recolección Dosis Dosis Peso fresco % 100 % SDV Peso seco % 100 % SDV Tira A Tira A Tira A Tira B Tira B Tira B

Días después de la exposición Gramos de p.a./ha N = dosis normal Después de 24 semanas g de FW/maceta FW FW FW Después de 24 semanas g de DW/maceta DW DW DW Pantone Alto SDW Pantone Alto SDW

Roundup

68,2 20,8 21,3 1,7 Sin color 1786,4 181,6 3277,0 416,4

Roundup

22,5 16 de enero 50,6 74,2 25,8 28,8 16,8 78,9 21,1 4,5 1815,5 49,1 3156,0 496,1

Roundup

1 de agosto 98,2 1,8 21,7 18,7 87,8 12,2 4,5 Sin color 1727,0 208,0 3237,2 232,3

Roundup

1 de abril 80,8 118,5 24,1 15,7 73,7 26,3 3,8 2319,2 439,0 3779,3 1055,2

Roundup

1 de febrero 40,3 59,1 40,9 43,5 6,5 30,5 69,5 6,6 3747,2 630,8 4426,5 379,4

Roundup

0,8 1,2 98,8 0,1 0,8 3,8 96,2 4012,0 638,7 3865,2 518,1

Tabla 12B. Estudio de semi-campo de diente de león germinado de raíz, Taraxacum vulgare

Herbicida

Recolección Dosis Dosis Peso fresco % 100 % SDV Peso seco % 100 % SDV Tira A Tira A Tira A Tira B Tira B Tira B

Días después de la exposición Gramos de p.a./ha N = dosis normal Después de 24 semanas g de FW/maceta FW FW FW Después de 24 semanas g de DW/maceta DW DW DW Pantone Alto SDW Pantone Alto SDW

Roundup

40,8 6,2 14,8 2,9 Sin color 2139,7 101,3 3050,7 285,6

Roundup

22,5 16 de enero 32,6 79,9 20,1 7,2 81,1 18,9 2,8 Sin color 2308,5 208,9 2945,5 228,8

Roundup

1 de agosto 61,6 18,7 126,4 4,4 Sin color 2240,2 102,5 2955,7

Roundup

1 de abril 67,2 164,7 25,6 23,5 158,8 12,2 Sin color 2315,9 85,8 3027,7

Roundup

1 de febrero 42,9 105,1 8,1 15,6 105,4 4,5 Sin color 2324,7 217,1 3058,7 359,6

Roundup

37,8 92,6 7,4 11,3 12,8 86,5 13,5 3,3 Sin color 2698,5 782,9 3450,9 142,3

La conclusión es el que el mismo patrón de color para la tira A y B para las monocotiledóneas se detectó para las dicotiledóneas. Esto indica que este procedimiento puede usarse para especies de plantas dicotiledóneas y otros herbicidas como, por ejemplo, Roundup Bio.

Referencias

Boutin, C.; Freemark, K.E. & Keddy, C.J. (1993): Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Nontarget 5 plant testing and evaluation. Technical Report Series. n.º 145. 1-91. Ottawa. Canadian Wildlife Service. Environment Canada.

Hamil, A.I.; Marriage, P.B. & Friesen, G. (1977): A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Sciences. 25. 386-389.

Snyder, L.R. (1974). Journal of Chromatography A, 92, 2, 233-230. 10

Tabla 13. Visión general del material de planta probado.

Herbicida

Principio activo (p.a.) Abreviaturas Aditivos Dosis Especies de plantas Especies de plantas (latín) Etapa Comentarios Datos

Boxer

Prosulfocarb PRO 2400 g/ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 2-3 hojas Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Boxer

Prosulfocarb PRO 2400 g/ha Poa anual Poa annua 2-3 hojas Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Stomp 400 EC

Pendimetalina PEN 1600 g/ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 2-3 hojas Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Stomp 400 EC

Pendimetalina PEN 1600 g/ha Poa anual Poa annua 2-3 hojas Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Primera Super

Fenoxaprop-p-etilo FEN 0,2 % de Isoblette 69 g/ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 4 hojas 2 brotes Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Primera Super

Fenoxaprop-p-etilo FEN 0,2 % de Isoblette 55,2 g/ha Hierba de cola de zorra Alopecurus myosuroides 5 hojas 1 brote Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Hussar

lodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 5 g/ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 4 hojas 2 brotes Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Hussar

lodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 5 g/ha Ballico perenne Lolium perenne 4 hojas 1 brote Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Monitor

Sulfosulfuron SUL 0,1 % de Lissapol Bio 3,2 g/ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 4 hojas 2 brotes Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) evaluación visual (7 días)

Monitor

Sulfosulfuron SUL 0,1 % de Lissapol Bio 6,4 g/ha Barbas de macho Bromus hordeaceus 4 hojas 1 brote Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Lexus

Flupirsulfuron FLU 0,1 % de Lissapol Bio 5 g/ha Hierba de cola de zorra Alopecurus myosuroides 5 hojas 1 brote Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

(continuación)

Herbicida

Principio activo (p.a.) Abreviaturas Aditivos Dosis Especies de plantas Especies de plantas (latín) Etapa Comentarios Datos

Topik

Clodinafob-propargilo CLO 0,5 l/ha de Renol 30 g/ha Hierba de cola de zorra Alopecurus myosuroides 5 hojas 1 brote Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Topik

Clodinafob-propargilo CLO 0,5 l/ha de Renol 40 g/ha Ballico perenne Lolium perenne 4 hojas 1 brote Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Roundup Bio

Glifosato GLY 360 g/ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 4 hojas 2 brotes Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Roundup Bio

Glifosato GLY 360 g/ha Hierba de cola de zorra Alopecurus myosuroides 5 hojas 1 brote Dosis recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Roundup Bio

Glifosato GLY 360 g/ha Ballico perenne Lolium perenne 4 hojas 1 brote Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Roundup Bio

Glifosato GLY 360 g/ha Barbas de macho Bromus hordeaceus 4 hojas 1 brote Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Roundup Bio

Glifosato GLY 360 g/ha Poa anual Poa annua 4 hojas 1 brote Dosis letal recolectada dos veces (7 y 14 días) Evaluación visual (7 días)

Roundup Bio

Glifosato GLY 90 g de p.a./ha Ballico perenne Lolium perenne Etapa 21 Recolectada después de 4, 7 y 14 días (tratada y sin tratar)

Boxer

Prosulfocarb PRO 600 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti Etapa 12 Recolectada después de 4, 7 y 14 días (tratada y sin tratar)

Monitor

Sulfosulfuron SUL 0,1 % de Lissapol Bio 4 g de p.a./ha Barbas de macho Bromus hordeaceus Etapa 13 Recolectada después de 4, 7 y 14 días (tratada y sin tratar)

(continuación)

Herbicida

Principio activo (p.a.) Abreviaturas Aditivos Dosis Especies de plantas Especies de plantas (latín) Etapa Comentarios Datos

Hussar

lodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 3 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti Etapa 12-13 Recolectada después de 4, 7 y 14 días (tratada y sin tratar)

Hussar

lodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 3 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti Etapa 22 Recolectada después de 4, 7 y 14 días (tratada y sin tratar)

Roundup Bio

Glifosato GLY 30 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti Etapa 21-22 Recolectada después de 7 y 14 días (tratada y sin tratar)

Roundup Bio

Glifosato GLY 45 g de p.a./ha Ballico perenne Lolium perenne Etapa 21-22 Recolectada después de 7 y 14 días (tratada y sin tratar)

Boxer

Prosulfocarb PRO 1600 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti Etapa 21 5 recolecciones (días 1, 3, 7, 14, 21) y 5 dosis (1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N y control Biomasa; evaluación visual

Hussar

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 3 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti Etapa 21-22 5 recolecciones (días 1, 3, 7, 14, 21) y 5 dosis (1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N y control Biomasa; evaluación visual

Roundup Bio

Glifosato GLY 120 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti Etapa 21-22 5 recolecciones (días 1, 3, 7, 14, 21) y 5 dosis (1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N y control Biomasa; evaluación visual

(continuación)

Herbicida

Principio activo (p.a.) Abreviaturas Aditivos Dosis Especies de plantas Especies de plantas (latín) Etapa Comentarios Datos

Monitor

Sulfosulfuron SUL 0,1 % de Lissapol Bio 16 g de p.a./ha Barbas de macho Bromus hordeaceus Etapa 22 5 recolecciones (días 1, 3, 7, 14, 21) y 5 dosis (1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N y control Biomasa; evaluación visual

Boxer

Prosulfocarb PRO 3200 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti Etapa 22 Recolectada después de 1 y 2 semanas

Monitor

Sulfosulfuron SUL 0,1 % de Lissapol Bio 4 g de p.a./ha Barbas de macho Bromus hordeaceus Etapa 22 Recolectada después de 1 y 2 semanas

Roundup Bio

Glifosato GLY as/Ha 180 g de p.a./ha Ballico perenne Lolium perenne Etapa 22 Recolectada después de 1 y 2 semanas

Hussar

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 1 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti Etapa 22 Recolectada después de 1 y 2 semanas

Roundup Bio

Glifosato GLY 360 g de p.a./ha Ballico perenne Lolium perenne Etapa 24 Aspersión d.5/11. ¿¿Recolectada??

Hussar

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 200 g/ha = 10 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti Etapa 23-24 Aspersión d.5/11. ¿¿Recolectada??

Monitor

Sulfosulfuron SUL 0,1 % de Lissapol Bio 20 g de p.a./ha Barbas de macho Bromus hordeaceus Etapa 23 Aspersión d.5/11. ¿¿Recolectada??

Boxer

Prosulfocarb PRO 2400 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 3-4 hojas Aspersión d.5/11. ¿¿Recolectada??

(continuación)

Herbicida

Principio activo (p.a.) Abreviaturas Aditivos Dosis Especies de plantas Especies de plantas (latín) Etapa Comentarios Datos

Hussar

lodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 1 N = 0,05 g de p.a./ha Hierba gallinera Stellaria media 4-6 hojas 2 biotipos (sensible y resistente) 3 dosis sin tratar. Recolección de 1N y 3 N 1, 4, 6, 8, 14 días)

Primera Super

Fenoxaprop-p-etilo FEN 0,2 % de Isoblette 1 N = 55,2 g de p.a./ha Hierba de cola de zorra Alopecurus myosuroides 3 hojas 4 biotipos (sensible, 2 resistentes y 1 resistente metabólico) 3 dosis sin tratar. Recolección de 1N y 3 N 1, 4, 6, 8, 14 días)

Hussar

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 1 N = 2,5 y 5 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 1) 3-4 hojas 2) 6-8 hojas 3 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final =21) 5 Dosis: 1/16 N. 1/8 N. 1/4 N. 1/2 N. 1N (tres duplicados) Biomasa; evaluación visual

Hussar

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 1 N = 2,5 y 5 g de p.a./ha Ballico perenne Lolium perenne 1) 3-4 hojas 2) 6-8 hojas 3 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final =21) 5 Dosis: 1/16 N. 1/8 N. 1/4 N. 1/2 N. 1N (tres duplicados) Biomasa; evaluación visual

Hussar

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 1 N = 2,5 y 5 g de p.a./ha Italiensk rajgræs Lolium multiflorum 1) 3-4 hojas 2) 6-8 hojas Recolecciones (4, 7, 14 y recolección final =21) 5 Dosis: 1/16 N. 1/8 N. 1/4 N. 1/2 N. 1N (tres duplicados) Biomasa; evaluación visual

(continuación)

Herbicida

Principio activo (p.a.) Abreviaturas Aditivos Dosis Especies de plantas Especies de plantas (latín) Etapa Comentarios Datos

Hussar

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 1 N = 5 y 10 g de p.a./ha Poa anual Poa annua 1) 3-4 hojas 2) 6-8 hojas 3 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final =21) 5 Dosis: 1/16 N. 1/8 N. 1/4 N. 1/2 N. 1N (tres duplicados) Biomasa; evaluación visual

Primera Super

Fenoxaprop-p-etilo FEN 0,2 % de Isoblette 1 N = 48,3 y 69 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 1) 3-4 hojas 2) 6-8 hojas 3 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final = 25 / 21) 5 Dosis: 1/16 N. 1/8 N. 1/4 N. 1/2 N. 1N (tres duplicados) Biomasa; evaluación visual

Primera Super

Fenoxaprop-p-etilo FEN 0,2 % de Isoblette 1 N = 48,3 y 69 g de p.a./ha Hierba de cola de zorra Alopecurus myosuroides 1) 3-4 hojas 2) 6-8 hojas 3 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final =25/21) 5 Dosis: 1/16 N. 1/8 N. 1/4 N. 1/2 N. 1N (tres duplicados) Biomasa; evaluación visual

Primera Super

Fenoxaprop-p-etilo FEN 0,2 % de Isoblette 1 N = 48,3 y 69 g de p.a./ha Avena loca Avena fatua 1) 3-4 hojas 2) 6-8 hojas 3 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final = 25/21) 5 Dosis: 1/16 N. 1/8 N. 1/4 N. 1/2 N. 1N (tres duplicados) Biomasa; evaluación visual

(continuación)

Herbicida

Principio activo (p.a.) Abreviaturas Aditivos Dosis Especies de plantas Especies de plantas (latín) Etapa Comentarios Datos

Hussar Atlantis

Yodosulfuron + mesosulfuron IOD IOD + MES Ninguno/0,5 l/ha de Renol 0,5 l/ha de Renol 1 N = 10 g de p.a./ha 1 N = 0,72 g de p.a./ha Ballico perenne Agrostis espiga de viento Lolium perenne Apera spica-venti 3-4 hojas (macetas de 2 l) 3-4 hojas (macetas de 2 l) 3 recolecciones. 3 tratamientos con lluvia. +/-Aditivos. 1/32 N. 1/16 N. 1/8 N. 1/4 N. 1/2 N. 1N (tres duplicados) 4 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final = 21*) 7 Dosis: 0N, 1/32N. 1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N (tres duplicados a 3 macetas) Biomasa final. Evaluación visual

Atlantis

Yodosulfuron + mesosulfuron IOD + MES 0,5 l/ha de Renol 1 N = 4,5 g de p.a./ha Poa anual Poa annua 3-4 hojas (macetas de 2 l) 4 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final = 21*) 7 Dosis: 0N. 1/32N. 1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N (tres duplicados a 3 macetas) Biomasa final. Evaluación visual

Hussar

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 1 N = 5 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 3-4 hojas (macetas de 2 l) 4 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final = 21*) 7 Dosis: 0N. 1/32N. 1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N (tres duplicados a 3 macetas) Biomasa final. Evaluación visual

(continuación)

Herbicida

Principio activo (p.a.) Abreviaturas Aditivos Dosis Especies de plantas Especies de plantas (latín) Etapa Comentarios Datos

Hussar

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 1 N = 2,5 g de p.a./ha Ballico perenne Lolium perenne 3-4 hojas (macetas de 2 l) 4 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final = 21*) 7 Dosis: 0N. 1/32N. 1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N (tres duplicados a 3 macetas) Biomasa final. Evaluación visual

Monitor

Sulfosulfuron SUL 0,1 % de Lissapol Bio 1 N = 8 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 3-4 hojas (macetas de 2 l) 4 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final =21*) 7 Dosis: 0N. 1/32N. 1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N (tres duplicados a 3 macetas) Biomasa final. Evaluación visual

Monitor

Sulfosulfuron SUL 0,1 % de Lissapol Bio 1 N = 10 g de p.a./ha Barbas de macho Bromus hordeaceus 3-4 hojas (macetas de 2 l) 4 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final = 21*) 7 Dosis: 0N. 1/32N. 1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N (tres duplicados a 3 macetas) Biomasa final. Evaluación visual

Lexus

Flupirsulfuron FLU 0,1 % de Lissapol Bio 1 N = 10 g de p.a./ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 3-4 hojas (macetas de 2 l) 4 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final = 21*) 7 Dosis: 0N. 1/32N. 1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N (tres duplicados a 3 macetas) Biomasa final. Evaluación visual

(continuación)

Herbicida

Principio activo (p.a.) Abreviaturas Aditivos Dosis Especies de plantas Especies de plantas (latín) Etapa Comentarios Datos

Lexus

Flupirsulfuron FLU 0,1 % de Lissapol Bio 1 N = 8 g de p.a./ha Hierba de cola de zorra Alopecurus myosuroides 3-4 hojas (macetas de 2 l) 4 recolecciones (4, 7, 14 y recolección final = 21*) 7 Dosis: 0N. 1/32N. 1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N (tres duplicados a 3 macetas) Biomasa final. Evaluación visual

Hussar

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol Ballico perenne Lolium perenne

Atlantis

Yodosulfuron + mesosulfuron IOD + MES 0,5 l/ha de Renol Ballico perenne Lolium perenne

Hussar Atlantis

Yodosulfuron + mesosulfuron IOD + MES 0,5 l/ha de Renol Poa anual Poa annua

Hussar

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 1 N = 150 g/ha otoño. 200 g/ha primavera Ballico perenne Lolium perenne 1-2 hojas Plantas seleccionadas 4 y 7 días después de la aspersión. 4 dosis (0. 1/4N. 1/2N y 1N) Biomasa final. Evaluación visual 2 semanas después de la aspersión)

Atlantis

Yodosulfuron + mesosulfuron IOD + MES 0,5 l/ha de Renol 1 N = 200 g/ha otoño. 300 g/ha primavera Ballico perenne Lolium perenne Plantas seleccionadas 4 y 7 días después de la aspersión. 4 dosis (0. 1/4N. 1/2N y 1N)

(continuación)

Herbicida

Principio activo (p.a.) Abreviaturas Aditivos Dosis Especies de plantas Especies de plantas (latín) Etapa Comentarios Datos

Hussar

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 1 N = 100 g/ha otoño. 150 g/ha primavera Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 1 hoja Plantas seleccionadas 4 y 7 días después de la aspersión. 4 dosis (0. 1/4N. 1/2N y 1N) Biomasa final. Evaluación visual primavera)

Atlantis

Yodosulfuron + mesosulfuron IOD + MES 0,5 l/ha de Renol 1 N = 150 g/ha otoño. 150 g/ha primavera Agrostis espiga de viento Apera spica-venti Plantas seleccionadas 4 y 7 días después de la aspersión. 4 dosis (0. 1/4N. 1/2N y 1N) Biomasa final

Atlantis

Yodosulfuron + mesosulfuron IOD + MES 1 l/ha de Bio-power 1N = 400 g/ha primavera Alm raj-græs Lolium perenne Etapa 28 Plantas seleccionadas 4 y 7 días después de la aspersión. 5 dosis (0. 1/8N. 1/4N. 1/2N y 1N) Biomasa final, evaluación visual

Hussar OD

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 1 N = 0,075 l/ha Ballico perenne Lolium perenne Etapa 12. 30.2. 32 Plantas seleccionadas 4 y 7 días después de la aspersión. 5 dosis (0. 1/8 N. 1/4N. 1/2N y 1N) Biomasa final. evaluación visual

Roundup Bio

Glifosato GLY 1 N = 2 l/ha Ortiga Urtica dioeca Germinada de raíz Plantas seleccionadas 8 DDT. 7 dosis (0. 1/32N. 1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N) Biomasa final

MaisTer

Foramsulfuron + yodosulfuron FOR + IOD Aceite de maíz 1 N = 100 g/ha Ortiga Urtica dioeca Germinada de raíz Plantas seleccionadas 8 DDT. 5 dosis (0. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N) Biomasa final

(continuación)

Herbicida

Principio activo (p.a.) Abreviaturas Aditivos Dosis Especies de plantas Especies de plantas (latín) Etapa Comentarios Datos

Roundup Bio

Glifosato GLY 1 N = 1 l/ha Diente de león Taraxacum vulgare Germinada de raíz Plantas seleccionadas 7 DDT. 7 dosis (0. 1/32N. 1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N) Biomasa final

MaisTer

Foramsulfuron + yodosulfuron FOR + IOD Aceite de maíz 1 N = 50 g/ha Diente de león Taraxacum vulgare Germinada de raíz Plantas seleccionadas 7 DDT. 5 dosis (0. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N) Biomasa final

Roundup Bio

Glifosato GLY 1 N = 4 l/ha Ortiga Urtica dioeca Germinada de semilla Plantas 8 DDT. 7 dosis (0. 1/32N. 1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N) Biomasa final

MaisTer

Foramsulfuron + yodosulfuron FOR + IOD Aceite de maíz 1 N = 40 g/ha Ortiga Urtica dioeca Frofremspio ret Plantas seleccionadas 8 DDT. 5 dosis (0. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N) Biomasa final

Roundup Bio

Glifosato GLY 1 N = 1 l/ha Diente de león Taraxacum vulgare Germinada de semilla Plantas seleccionadas 7 DDT. 7 dosis (0. 1/32N. 1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N) Biomasa final

MaisTer

Foramsulfuron + yodosulfuron FOR + IOD Aceite de maíz 1 N = 25 g/ha Diente de león Taraxacum vulgare Germinada de semilla Plantas seleccionadas 7 DDT. 5 dosis (0. 1/8N. 1/4N. 1/2N. 1N) Biomasa final

Hussar OD

Yodosulfuron IOD 0,5 l/ha de Renol 1 N = 3 g de p.a./ha Ballico perenne Lolium perenne 3-4 brotes Plantas seleccionadas 4 DDT. 7 DDT. 14 DDT (0. 1/16 N. 1/8 N. 1/4 N. 1/2 N. 1N) Biomasa final

(continuación)

Herbicida

Principio activo (p.a.) Abreviaturas Aditivos Dosis Especies de plantas Especies de plantas (latín) Etapa Comentarios Datos

Atlantis

Yodosulfuron + mesosulfuron TOD + MES 0,5 l/ha de Renol 1 N = 120-1920 afh. Af regn Ballico perenne Lolium perenne 3-4 brotes Plantas seleccionadas 4 DDT. 7 DDT. 14 DDT (0. 1/32 N. 1/16 N. 1/8 N. 1/4 N. 1/2 N. 1N) Biomasa final

Atlantis

Yodosulfuron + mesosulfuron IOD + MES 0,5 l/ha de Renol 1 N = 20 g/ha Agrostis espiga de viento Apera spica-venti 5-6 hojas. 2-3 brotes Plantas seleccionadas 8 DDT (0. 1/16N. 1/8N. 1/4N. 1/2N y 1N de biotipo 1 y 2. De 1/4 N a 8 N en el biotipo 3-5 (resistente) Evaluación visual 8 DDT. Biomasa final después de 3 semanas

Tabla 14. Estudio n.º 972/04. Estudio de semi-campo (dosis/respuesta) estabilidad a la lluvia 1. Estudio (liofilizado)

Estabilidad a la lluvia de ballico perenne (Lolium perenne) expuesto a Hussar. Las plantas se trataron por aspersión el 30/09/2004 sobre la etapa de 3-4 hojas y se trataron con 5 mm de lluvia a la intensidad de 20 mm/hora. Recolectado para el biomarcador 4/10 (momento 1), 7/10 (momento 2) y 21/10 (momento 3). En el momento 3 las plantas se recolectaron para la determinación de biomasa. No están presentes evaluaciones visuales. Todos los datos son valores 5 medios de tres duplicados. Los números entre paréntesis son desviaciones estándar.

Aditivo

Lluvia Dosis (g de p.a./ha) Reducción en biomasa fresca (%) Reducción en biomasa seca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición

Ninguno

Ninguna 0 (20,8) 0 (18,1)

0,313 12,8 (18,9) 6,2 (18,1)

0,625 33,6 (10,3) 31,5 (11,1)

1,25 61,8 (5,8) 51,5 (6,4)

2,5 84,3 (3,6) 72,0 (6,8)

5,0 88,8 (2,4) 76,6 (5,5)

10,0 89,3 (1,4) 77,8 (3,4)

Ninguno

Ninguna 0 (20,8) 0 (18,1)

1 hora 0,313 8,3 (15,8) 5,9 (15,6)

0,625

-

13,9 (16,2)

-

11,9 (16,7)

1,25

-

11,6 (2,4)

-

13,5 (3,2)

2,5 11,3 (29,8) 11,4 (28,4)

5,0 57,2 (2,9) 49,2 (2,0)

10,0 79,9 (4,1) 67,5 (3,4)

Ninguno

Ninguno

0 (20,8) 0 (18,1)

4 horas 0,313

-

13,6 (26,1)

-

18,9 (24,2)

0,625 1,1 (13,1) 5,4 (10,6)

1,25 3,6 (9,6) 3,8 (11,5)

2,5 24 (18,2) 18,8 (17,5)

5,0 51,5 (19,9) 42,2 (17,7)

10,0 78,9 (0,6) 64,3 (1,7)

Ninguno

Ninguno

0 (20,8) 0 (18,1)

0,5 l/ha de Renol

0,313 52,2 (5,2)

-

16,3 (0,9)

0,625 85,1 (8,1) 40,3 (2,2)

1,25 89,5 (3,0) 77,9 (6,1)

2,5 87,0 (2,8) 80,5 (4,5)

(continuación)

Aditivo

Lluvia Dosis (g de p.a./ha) Reducción en biomasa fresca (%) Reducción en biomasa seca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición

5,0 91,1 (2,0) 72,4 (1,0)

10,0 90,8 (0,6) 79,9 (4,3)

Ninguno

Ninguno

0 (20,8) 0 (18,1)

0,5 l/ha de Renol

1 hora 0,313 36,1 (19,7) 22,1 (5,8)

0,625 59,5 (6,7) 49,1 (8,2)

1,25 77,2 (1,7) 65,8 (2,5)

2,5 88,0 (2,4) 78,7 (3,4)

5,0 86,8 (2,0) 73,1 (2,6)

10,0 89,8 (1,2) 77,8 (2,2)

Ninguno

Ninguno

0 (20,8) 0 (18,1)

0,5 l/ha de Renol

4 horas 0,313 61,5 (6,3) 53,8 (6,7)

0,625 77,0 (5,5) 68,8 (3,2)

1,25 82,6 (2,5) 69,7 (3,1)

2,5 89,2 (1,6) 78,8 (3,1)

5,0 88,7 (0,3) 76,7 (1,7)

10,0 90,7 (2,2) 83,0 (2,9)

Tabla 15: Estudio n.º 945/06. Estudio de semi-campo (Hussar en mezcla con otros herbicidas)

Estudio de dosis/respuesta de semi-campo con Hussar y mezclas con otros herbicidas para plantas de malas hierbas dicotiledóneas sobre ballico perenne (Lolium perenne) en la etapa de 3-4 hojas. Todos los datos son valores medios de 5 tres duplicados. Los valores entre paréntesis son desviaciones estándar.

Hussar mezclado con

Dosis de Hussar (g de p.a. /ha) Efecto visual 4 días después de la exposición Efecto visual 7 días después de la exposición Reducción en biomasa fresca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® B 7 días después de la exposición

Ninguno

0 (5,3)

0,19 2,3 (0,6) 30,4 (4,1)

0,38 2,3 (0,6) 64,7 (4,2)

0,75 2,7 (0,6) 94,9 (0,4)

1,5 4,0 (1,0) 96,1 (0,7)

4,7 (1,2) 97,4 (0,4)

(continuación)

Hussar mezclado con

Dosis de Hussar (g de p.a. /ha) Efecto visual 4 días después de la exposición Efecto visual 7 días después de la exposición Reducción en biomasa fresca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® B 7 días después de la exposición

0,5 l/ha de Oxitril

2,0 (0) 0(10,1)

0,19 1,7 38,3

(0,6) (10,1)

0,38 4,5 (2,1) 79,0 (5)

0,75 3,3 (0,6) 90,4 (0,4)

1,5 3,3 (0,6) 95,3 (0,4)

3,0 (0) 95,5 (0,1)

0,6 l/ha de Starane

0 (6,6)

0,19 0 (1,3)

0,38 2,3 (0,6) 79,4 (2,6)

0,75 3,3 (1,5) 79,2 (5,7)

1,5 3,7 (0,6) 96,1 (0,6)

3,0 (1,0) 96,2 (0,4)

1 pastilla/ha* de Lexus

3,0 (1,0) 0 ()

0,19 3,7 (0,6) 83,7 (4,6)

0,38 5,7 (0,6) 92,5 (0,4)

0,75 4,0 (1,7) 97,0 (0,8)

1,5 4,0 (1,4) 98,1 (0,2)

4,3 (1,5) 94,4 (0,3)

* 1 pastilla/ha se corresponde con 3,75 g de p.a./ha.

Tabla 16: Estudio n.º 946/06. Estudio de semi-campo (dosis/respuesta) 2. Estudio con estabilidad a la lluvia

Estudio de semi-campo de dosis/respuesta con Atlantis sobre ballico perenne (Lolium perenne) en el estado de 3-4 hojas. Todos los datos son valores medios para tres duplicados. Los datos entre paréntesis son desviaciones estándar. 5

Aditivo

Lluvia (3 mm a 10 mm/t) Dosis de Atlantis (g de p.a./ha ) Reducción en biomasa fresca (%) Reducción en biomasa seca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

Ninguno

Ninguno

0 (3,8) 0 (0,9)

(continuación)

Aditivo

Lluvia (3 mm a 10 mm/t) Dosis de Atlantis (g de p.a./ha ) Reducción en biomasa fresca (%) Reducción en biomasa seca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

-

16,8 (2,5)

-

4,8 (0,8)

31,6 (5) 36,9 (0,9)

78 (2,5) 72,6 (0,6)

95,4 (0,7) 88,1 (0,2)

95,4 (0,3) 86,9 (0,3)

Ninguno

Ninguno

0 (3,8) 0 (0,9)

1 hora

-

2,3 (12,1)

-

6,0 (3)

28,4 (0,5) 27,4 (0,2)

64,9 (3,2) 60,7 (0,4)

89,0 (1,8) 82,1 (0,5)

95,4 (0,3) 88,1 (0,2)

96,8 (0,3) 90,5 (0,2)

Ninguno

Ninguno

0 (3,8) 0 (0,9)

3 horas

-

4,1 (7,6)

9,5 (0,7)

23,5 (4,8) 26,2 (0,6)

72,8 (1,6) 69,0 (0,5)

90,4 (1,4) 83,3 (0,4)

95,9 (0,4) 89,3 (0,3)

95,7 (0,8) 85,7 (0,4)

Ninguno

Ninguno

0 (3,8) 0 (0,9)

0,5 l/ha de Renol

Ninguno 3,8 16,8(1,5) 20,2 (1)

7,5 29,0 (4,1) 31,0 (1)

55,7 (6,8) 51,2 (1,4)

94,2 (0,9) 86,9 (0,5)

93,9 (0,3) 83,3 (0,2)

95,1 (0,3) 86,9 (0,2)

(continuación)

Aditivo

Lluvia (3 mm a 10 mm/t) Dosis de Atlantis (g de p.a./ha ) Reducción en biomasa fresca (%) Reducción en biomasa seca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

Ninguno

Ninguno

0 (3,8) 0 (0,9)

0,5 l/ha de Renol

1 hora 56,2 (9,1) 56,0(1,8)

80,9 (3,2) 77,4 (0,8)

79,4 (2) 72,6 (0,6)

93,6 (0,8) 91,7 (0,6)

92,8 (0,6) 82,1 (0,3)

93,3 (1,3) 82,1 (0,9)

Ninguno

Ninguno

0 (3,8) 0 (0,9)

0,5 l/ha de Renol

3 horas 71,9 (7,2) 69,0 (1,4)

89,3 (0,9) 82,1 (0,2)

94,5 (0,4) 86,9 (0,1)

96,5 (0,2) 89,3 (0,1)

95,4 (0,2) 88,1 (0,1)

96,5 (0,4) 90,5 (0,2)

Tabla 17: Estudio de campo en Hobro/Sealand (964/05, 966/05 y 917/06) con Hussar y Atlantis y poa anual, agrostis espiga de viento y ballico perenne en 2005 y 2006

Estudio de campo (dosis/respuesta) con Hussar y Atlantis en ballico perenne (Lolium perenne), agrostis espiga de 5 viento (Apera spica-venti) y poa anual (Poa annua) en la aspersión de otoño de 2005 y la aspersión de primavera de 2006. Todos los datos son valores medios de tres duplicados. Los datos entre paréntesis son desviaciones

Herbicida/ especie de planta/ año/ área de campo

Dosis (g de p.a./ha) Reducción en biomasa fresca (%) Efecto visual Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

Atlantis/ Poa anual / 2005/ Hobro

0 (0)

-

29,0 (33,0)

-

43,7 (30,3)

-

58,8 (35,1)

-

Atlantis/ Poa anual / 2006/ Hobro

0 (0)

-

(continuación)

Herbicida/ especie de planta/ año/ área de campo

Dosis (g de p.a./ha) Reducción en biomasa fresca (%) Efecto visual Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

56,9 (18,6)

-

77,1 (6,7)

-

56,4 (26,2)

-

Hussar/ Poa anual/ 2005/ Hobro

0 (0)

-

37,5 37,7 (23,6)

-

46,8 (20,9)

-

61,5 (13,1)

-

Hussar/ Poa anual/ 2006/ Hobro

0 (0)

-

58,2 (19,9)

-

41,2 (22,9)

-

74,7 (8,1)

-

Atlantis/ Ballico perenne/ 2005/ Hobro

-

-

-

-

-

-

-

Atlantis/ Ballico perenne/ 2005/ Sealand

0 (0)

35 (26,5) 5,63 (0,75)

43,8 (35,4) 7,50 (1,29)

70 (33,7) 9,17 (0,29)

Atlantis/ Ballico perenne/ 2006/ Hobro

-

25,1

-

48,1

-

65,6

-

Atlantis/ Ballico perenne/ 2006/ Sealand

0(0)

48,3 (45,9) 1 (0)

(continuación)

Herbicida/ especie de planta/ año/ área de campo

Dosis (g de p.a./ha) Reducción en biomasa fresca (%) Efecto visual Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

62,5 (23,6) 3,3 (1,0)

91,5 (11,1) 4,8 (1,7)

Atlantis/ Ballico perenne/ 2006/ Sealand

(Forsøgs nr. 917/06)

7,5 (9,6)*

20 (8,2)* 1,4

75,0 (5,8)* 50,0 (10,8)** 2,9

97,3 (1,5)* 90,0 (5,8)** 3,1

Hussar/ Ballico perenne/ 2005/ Hobro

-

37,5

-

-

-

-

-

-

Hussar/ Ballico perenne/ 2005/ Sealand

37,5 41,3 (32,8) 7,1 (0,5)

76,3 (12,5) 7,4 (1,0)

95,3 (3,8) 9,1 (0,3)

Hussar/ Ballico perenne/ 2006/ Hobro

-

-

-

-

-

-

-

Hussar/ Ballico perenne/ 2006/ Sealand

53,8 (34,0) 3,1 (1,3)

95,3 (3,8) 6,0 (1,4)

96,0 (4,0) 5,5 (1,7)

(continuación)

Herbicida/ especie de planta/ año/ área de campo

Dosis (g de p.a./ha) Reducción en biomasa fresca (%) Efecto visual Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

Atlantis/ Agrostis espiga de viento/ 2005/ Sealand

7545-533

37,5 6,5 (2,2)

90 (0) 6,8 (2,2)

92,5 (3,5) 9,1 (0,9)

Atlantis/ Agrostis espiga de viento/ 2006/ Sealand

37,5 96,0 (1,7) 7,7 (0,6)

98,7 (0,6) 9,2 (0,6)

98,0 (0) 9,5 (0)

Hussar/ Agrostis espiga de viento/ 2005/ Sealand

60,0 (28,3) 6,3 (2,4)

96,5 (2,1) 9,0 (0,8)

99,0(1,4) 9,7 (0,2)

Hussar/ Agrostis espiga de viento/ 2006/ Sealand

37,5 93,3 (2,9) 7,7 (0,6)

97,0 (1,7) 9,2 (0,6)

97,0 (1,7) 9,5 (0)

*Con cultivo; **Sin cultivo

Tabla 18: Estudio n.º 948/06. Investigaciones del estudio de semi-campo (dosis/respuesta) con Hussar OD y etapas de desarrollo diferentes para ballico perenne 5

Estudio de dosis/respuesta de semi-campo con Hussar OD en ballico perenne (Lolium perenne) en tres etapas diferentes. Todos los datos son valores medios de tres duplicados. Los valores entre paréntesis son desviación estándar.

Etapa de desarrollo

Dosis de Hussar OD (g de p.a./ha) Reducción en biomasa fresca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

Etapa 12

0 (0)

0,0094 6,7 (5,8)

0,0188 40 (10) 2758/534

(continuación)

Etapa de desarrollo

Dosis de Hussar OD (g de p.a./ha) Reducción en biomasa fresca (%) Color PANTONE® Tira A 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira A 7 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 4 días después de la exposición Color PANTONE® Tira B 7 días después de la exposición

0,0375 86,7 (5,8)

0,075 97 (1,7)

Etapa 30.2

0 (0)

0,0094 25,7 (7,6)

0,0188 85 (5)

0,0375 98,7 (0,6)

0,075 100 (0)

Etapa 32

0 (0)

0,0094 21,7 (12,8)

0,0188 50 (0)

0,0375 86,7 (2,9)

0,075 97 (1,7)

Ejemplo 4

Un kit de prueba que va a usarse para probar el efecto de Hussar o Atlantis sobre ballico perenne, agrostis espiga de viento o poa anual

El kit se describe con respecto a la tira B como prueba de respuesta de las malas hierbas a herbicida. El reactivo es 5 5 % de α-naftol (1-naftol) en etanol al 96 %. El disco que va a añadirse es el filtro Advantec 590.

Prueba de respuesta de las malas hierbas a herbicida para herbicidas de sulfonilurea

Esta prueba de respuesta de las malas hierbas a herbicida se usa para evaluar el efecto final de los herbicidas Hussar o Atlantis, con extractos de especies de plantas de malas hierbas frescas: ballico, agrostis espiga de viento o poa anual 6-8 días después de la exposición. 10

La prueba se usa para controlar el efecto de la dosis de herbicida aplicada. En el caso de lluvia poco después de la pulverización, la prueba también puede usarse para controlar si el herbicida ha tenido suficiente tiempo para tener un efecto en la dosis usada.

La prueba se desarrolla para plantas de malas hierbas en la etapa de crecimiento de BBCH 12 (2 hojas) a la etapa de crecimiento de BBCH 23 (macollamiento o etapa de arbusto). Las etapas se describen en danés en “Vejledning i 15 Planteværn”, Landbrugsforlaget, Dansk Landbrugsrädgivning Landscenteret, Planteavl, Ministeriet for Fodevare, Landbrug og Fiskeri, Danmarks Jordbrugs-Forskning (ISSN: 0907-4066; ISBN: 87 7470 926 7, página 303 (1-323). Aunque las etapas se describen con respecto a cereales, la descripción también puede usarse con respecto a otras

plantas, por ejemplo, plantas de malas hierbas, y especialmente plantas de malas hierbas gramíneas. La prueba se realiza en el plazo de 15 minutos después de recogerse las plantas de malas hierbas.

Recogida de las plantas de malas hierbas

1. Empezar identificando qué especie de planta de las 3 especies de plantas diferentes ballico, agrostis y poa anual es la ampliamente distribuida o la más problemática en el campo. 5

2. Necesitan recogerse tres muestras de esta especie de mala hierba de 3 sitios diferentes en cada campo (sin considerar el tamaño del campo). Elegir las áreas en el campo en las que la pulverización ha sido la más uniformemente distribuida.

3. Las plantas deben recogerse 6 a 8 días después de la exposición.

4. De cada área, un pequeño ramo de 20-25 plantas de malas hierbas se coloca en las bolsas de plástico. Evitar tierra 10 y agua sobre las plantas.

5. Poner las bolsas de plástico en un área fresca protegida de la luz.

6. Las plantas deben probarse entre media hora y una hora después de recogerse.

Descripción de plantas de malas hierbas

Ballico, Lolium perenne 15

Familia: Gramínea (Poaceae)

Etapa temprana: La vernación es valvada. Las hojas parecen suaves y sueltas. El lado ventral de las hojas es muy brillante. Pequeños dientes de la hoja. La lígula es corta de aprox. 1 mm. Las lígulas inferiores son frecuentemente púrpuras rosáceas.

Riesgo de confusión: El ballico italiano tiene dientes de hoja mayores y más amplios y vernación rizada. 20

Plantas adultas: El ballico es una especie de gramínea de tamaño medio con 20-50 cm de altura, tallos verticales. Las vainas de las hojas están comprimidas y los lados ventrales son muy brillantes. Las espiguillas sin aristas se recogen en una espiga oblonga abierta. El borde de las espiguillas está en contra de la paja a diferencia del ballico en el que la superficie de las espiguillas está en contra de la paja.

Producción de semilla: Hasta 150 semillas por espiga. 25

Poa anual, Poa annua

Familia: Gramínea (Poaceae)

Etapa temprana: La vernación es valvada y las vainas de las hojas están comprimidas. Las hojas son finas y frecuentemente arrugadas transversalmente. El vértice de la hoja tiene forma de barco. Cuando las hojas se mantienen contra una fuente de luz aparecerán dos tiras claras a lo largo del centro de la hoja. La lígula tiene 2-4 mm de longitud. 30 La planta entera tiene frecuentemente un aspecto arrugado.

Riesgo de confusión: 1. El ballico que es más largo y sin hojas transversales. 2. Agrostis que no tiene vértices de la hoja en forma de barco.

Plantas adultas: La poa anual es una planta pequeña con 5-20 cm de longitud de tallos ascendentes. Las espiguillas sin aristas se colocan en pequeñas cimas abiertas. La poa anual se distingue fácilmente de otras poas de los prados 35 por el tamaño.

Producción de semilla: Hasta 500 semillas por espiga.

Agrostis espiga de viento, Apera spica-venti

Familia: Gramínea (Poaceae)

Etapa temprana: La vernación es enrollada. Las hojas son sin filo, escabrosas y estrechas. Los dientes de las hojas 40 están ausentes. La lígula está raída y frecuentemente muy larga, hasta aprox. 7 mm.

Riesgo de confusión: Gramínea doblada puntiaguda que tiene vértices de la hoja en forma de barco.

Plantas adultas: El agrostis espiga de viento es una planta grande con 40-80 cm de altura de paja ascendente. Las pequeñas espiguillas de flor individuales (longitud aprox. 2,5-3 mm) se recogen en una cima piramidal. Cada espiguilla se suministra con una arista de 5-10 mm de largo.

Producción de semilla: Hasta 5.000 semillas por espiga.

Recogida de plantas de malas hierbas 5

Independientemente del tamaño del campo, se recogen 3 muestras de 3 sitios diferentes en el campo. La recogida y prueba deben tener lugar 6-8 días después de la exposición a los herbicidas. Se recogen 20-25 plantas de malas hierbas y las raíces se cortan. Entonces, las plantas se colocan en las bolsas de plástico incluidas y se guardan en un sitio fresco protegido de la luz. Las plantas de malas hierbas deben probarse entre ½ hora y 1 hora después de la recogida. 10

Preparación de extracto de planta

Se usan 0,20 g de material de planta para cada prueba.

Quitar la cubierta protectora de la escala y asegurarse de que la báscula se coloque en una posición horizontal. Presionar el botón de encendido/apagado para encender la báscula y asegurarse de que la báscula esté nivelada.

Desenroscar la tapa del recipiente amarillo. Quitar la espuma y poner las bolas de vidrio en la tapa. Poner el recipiente 15 sin la tapa sobre la báscula. Presionar el botón de reinicio de manera que aparezca 0,00 en la pantalla.

Pesar el material de planta necesario. Use solo plantas sin agua y tierra. Usar las tijeras para cortar trozos de aprox. 1/4 de cm de un ramo de las plantas de la bolsa de plástico directamente en el recipiente de plástico. Mover las bolas de vidrio de nuevo en el vaso de plástico y añadir cuidadosamente 3,5 ml del disolvente de la jeringa (el émbolo se coloca en el punto de 10 ml) en el recipiente de plástico. 20

Poner la tapa sobre el vaso de plástico y asegurarse de que se cierra herméticamente. Agitar el material de planta vigorosamente durante 2 minutos hasta que el extracto aparece verde y turbio y solo siguen las fibras en el recipiente. Cuidadosamente añadir el resto de disolvente en la jeringa a la suspensión en el recipiente y agitar el recipiente cerrado con la tapa durante adicionalmente ½ minuto.

Aspirar el extracto con la jeringa vacía. Poner un filtro de jeringa sobre la jeringa llena y filtrar el extracto en el pequeño 25 vaso de plástico que se encuentra en el lazo izquierdo de la caja del kit de prueba. Lentamente presionar el émbolo enteramente hacia abajo. El extracto filtrado está ahora listo para su uso. La bolsa de plástico va a usarse como bolsa de desechos para la jeringa, filtros de jeringa, vaso de plástico, bolas de vidrio, etc.

La prueba

La prueba debe realizarse en una habitación bien ventilada o al aire libre. Evitar la inhalación de vapores. Usar los 30 reactivos con cuidado.

Sujetar la pipeta próxima al vaso de plástico que contiene el extracto filtrado y aspirar el extracto un par de veces hasta que la pipeta esté llena.

Sujetar la pipeta en posición vertical y dejar caer 13 gotas (aproximadamente 0,67 g) en un vaso de plástico vacío. Con el vaso inclinado, añadir lentamente 2 gotas de reactivo (aproximadamente 0,04 g) seguido de 24 gotas 35 (aproximadamente 0,95 g) de ácido sulfúrico conc. a la mezcla. La mezcla desarrolla calor a 70º C que empieza la reacción química (burbujea y desarrolla vapores - no inhalar estos vapores). (La densidad del extracto de planta y cada uno de los productos químicos puede ser diferente, así 1 gota de un líquido no necesita tener el mismo peso que 1 gota de otro líquido).

Dejar que el vaso de plástico se enfríe durante 10-15 minutos. 40

Lectura de los resultados

Agitar suavemente el vaso de plástico y colocar un disco de filtro en el fondo del vaso. El color se distribuye de este modo uniformemente en el disco. Después de 15 segundos, comparar el color con el cuadro de color.

Poner el vaso de plástico con el disco sobre el cuadro de color a la derecha, comparar los colores y leer el resultado del efecto final indicado por un color rojo, amarillo o verde. Si al menos dos de las tres muestras de un campo están dentro 45 de la misma zona de color, el resultado es inequívoco.

Después de la prueba, poner los vasos de plástico apilados, jeringa, filtro de jeringa y bolas de vidrio en la bolsa desechable de plástico.

Solo pueden reutilizarse la báscula, las tijeras y las tenazas.

Escala de color - Evaluación del efecto

Se separan zonas de efecto en tres zonas indicadas por rojo, amarillo y verde. Estos colores no son los colores obtenidos sobre la tira, pero un grupo de colores que puede ser obtenido sobre la tira se corresponden con uno de los tres colores indicados. 5

Zona roja (PANTONE® n.º 5517u, 443u, 7543u, 7544u (u = sin revestir) sobre la tira) - ¡Parar! Ningún efecto del tratamiento con herbicida

Zona amarilla (PANTONE® n.º 7545u, 535u, 534u (u = sin revestir) sobre la tira) - ¡Coincide el resultado!

Ballico

-

Hussar/Atlantis

40-90 % de reducción en el crecimiento

Agrostis espiga de viento

-

Hussar/Atlantis

45-80 % de reducción en el crecimiento

Poa anual

-

Hussar/Atlantis

30-80 % de reducción en el crecimiento

Zona verde (PANTONE® n.º 2766u (u = sin revestir) sobre la tira) - ¡OK! El efecto del tratamiento con herbicida es reducir el crecimiento de la planta en una cantidad suficiente 10

Ballico

-

Hussar/Atlantis

> 96 % de reducción en el crecimiento

Agrostis espiga de viento

-

Hussar/Atlantis

> 90 % de reducción en el crecimiento

Poa anual

-

Hussar/Atlantis

> 90 % de reducción en el crecimiento

Zona roja

Pantone n.º 5517u, 443u, 7543u, 7544u (u = sin revestir) se observa sobre la tira. El efecto de la pulverización es completamente insuficiente

Zona amarilla

Pantone n.º 7545u, 535u, 534u (u = sin revestir) se observa sobre la tira. El efecto del tratamiento con herbicida es 15 insuficiente. Considerar tratamiento adicional.

Zona verde

Pantone n.º 2766u (u = sin revestir) se observa sobre la tira. Se espera que el efecto del tratamiento con herbicida tenga efecto completo. No es necesaria acción adicional.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES
2. 1. Un procedimiento para probar si material de una planta viva específica se ha expuesto a un pesticida específico, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

   a) obtener material de una planta específica,

   b) preparar una suspensión líquida de la planta específica de a) en el que la suspensión líquida de la planta específica 5 comprende al menos un compuesto fitoquímico,

   c) detectar los compuestos fitoquímicos en la suspensión líquida de b) por su color de luz visible y/o UV, en el que la detección se realiza sin separación de dichos compuestos fitoquímicos,

   d) correlacionar dicho color de los compuestos fitoquímicos detectados con una escala estándar de colores de luz visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para combinaciones de planta específica y pesticida 10 específico,

   e) evaluar si la planta específica se ha expuesto al pesticida específico.
3. 2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que antes de evaluar si la planta específica se ha expuesto al pesticida específico

   (a) al menos un reactivo químico se selecciona de uno o más de los siguientes compuestos: 15

   Vainillina, ácido sulfúrico, naftoresorcinol, azul de metileno, β-naftol, timol, fluoresceína, amoniaco, verde de bromocresol, azul de bromofenol, permanganato de potasio, 2,7-diclorofluoresceína, rodamina 6G, éster 2-aminoetílico de ácido difenilbórico, ácido fosfórico, yodo, yoduro de potasio, cloruro de amoniomolibdatoestaño (II), cloruro de cobalto (II), cloruro de paladio (II), ninhidrina, 1-naftol, nitrato de bismuto (III), yoduro de potasio, molibdato ácido fosfórico, rodamina B, anisaldehído, nitrato de plata, cloruro de hierro (III), cloruro de cinc, rojo de clorofenol, rojo de 20 metilo, rojo de etilo, azul de bromotimol, sal sódica de 2,6-diclorofenolindofenol, púrpura de bromocresol, hidróxido potásico, glucosa, 4-cloro-7-nitrobenzofurazano, 2,4-dinitrofenilhidracina, cloroformiato de 9-fluorenilmetilo, hidróxido de tetrabutilamonio, yodo, sulfato férrico (III) amoniacal, 2-metoxi-2,4-difenil-3(2H)furanona (MDPF), borinato de 2-aminoetil-difenilo, cloruro de aluminio, cloruro de berberina deshidratado, sal sódica de 1,2-naftoquinon-4-sulfona, antrona, 8-hidroxiquinolina, 2-aminodifenil(bifenil-2-amina), orcinol, urea, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 4-25 aminobenzoico, ácido molibdatofosfórico, 2',7'-diclorofluoresceína, sal de amonio de ácido 8-anilinonaftaleno-1-sulfónico, rodamina, nitrato de bismuto (III), yoduro de potasio y productos químicos o mezclas de los mismos, con al menos un grupo de dichos compuestos químicos que pueden o pueden no estar presentes en dicho material de planta, y

   (b) provocar una reacción química entre dicho al menos un reactivo químico y los compuestos fitoquímicos no 30 separados del material de planta,

   (c) detectar el resultado de la reacción química de la etapa (b) por luz visible y/o UV, sin realizar una separación de los compuestos fitoquímicos,

   (d) correlacionar los resultados de la etapa (c) con un resultado de escala estándar desarrollado con respecto a la planta específica. 35
4. 3. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además

   i) poner en contacto la suspensión líquida del material de planta con un reactivo químico, provocando así una reacción química entre la suspensión líquida del material de planta y el reactivo químico, y

   ii) poner en contacto un soporte sólido con el material de planta químicamente reaccionado con los productos químicos de i), obteniendo así un soporte sólido con un color e intensidad de color. 40
5. 4. Un procedimiento de preparación de una escala estándar para evaluar si una planta viva específica se ha expuesto a un pesticida específico, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

   a) someter una planta viva específica a un pesticida específico,

   b) obtener material de la planta expuesta de a),

   c) determinar respuestas químicas de la planta específica por una detección de color por luz visible y/o UV sin realizar 45 una separación de los compuestos fitoquímicos de la planta,

   d) obtener una escala estándar de colores de luz visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para la combinación de planta específica y pesticida específico.
6. 5. Un kit de ensayo para su uso en el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicho kit:

   -

   al menos un papel de filtro, 5

   -

   al menos un disolvente,

   -

   al menos un medio para estrujar,

   -

   al menos una escala de visualización estándar de colores de luz visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para la detección y/o predicción de la exposición de una planta viva específica a un pesticida específico,

   -

   al menos un recipiente. 10

7. 6. El kit de ensayo según la reivindicación 5, que comprende además uno o más de los componentes seleccionados del grupo que consiste en:

   -

   al menos un reactivo químico, en el que dicho reactivo químico se selecciona de uno o más de los compuestos:

   Vainillina, ácido sulfúrico, naftoresorcinol, azul de metileno, β-naftol, timol, fluoresceína, amoniaco, verde de bromocresol, azul de bromofenol, permanganato de potasio, 2,7-diclorofluoresceína, rodamina 6G, éster 2-aminoetílico 15 de ácido difenilbórico, ácido fosfórico, yodo, yoduro de potasio, cloruro de amoniomolibdatoestaño (II), cloruro de cobalto (II), cloruro de paladio (II), ninhidrina, 1-naftol, nitrato de bismuto (III) yoduro de potasio, molibdato ácido fosfórico, rodamina B, anisaldehído, nitrato de plata, cloruro de hierro (III), cloruro de cinc, rojo de clorofenol, rojo de metilo, rojo de etilo, azul de bromotimol, sal sódica de 2,6-diclorofenolindofenol, púrpura de bromocresol, hidróxido potásico, glucosa, 4-cloro-7-nitrobenzofurazano, 2,4-dinitrofenilhidracina, cloroformiato de 9-fluorenilmetilo, hidróxido de 20 tetrabutilamonio, yodo, sulfato férrico (III) amoniacal, 2-metoxi-2,4-difenil-3(2H)furanona (MDPF), borinato de 2-aminoetil-difenilo, cloruro de aluminio, cloruro de berberina deshidratado, sal sódica de 1,2-naftoquinon-4-sulfona, antrona, 8-hidroxiquinolina, 2-aminodifenil(bifenil-2-amina), orcinol, urea, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 4-aminobenzoico, ácido molibdatofosfórico, 2',7'-diclorofluoresceína, sal de amonio de ácido 8-anilinonaftaleno-1-sulfónico, rodamina, nitrato de bismuto (III), yoduro de potasio y productos químicos o mezclas de los mismos, 25

   -

   al menos un mortero con pistilo y/o al menos una caja con bolas para agitar y/o al menos una prensa de mano

   -

   al menos una pipeta,

   -

   al menos una lámpara de UV,

   -

   al menos un calentador y/o al menos una cobertera caliente hecha de reactivos químicos y disolventes,

   -

   al menos una balanza, 30

   -

   al menos unas tijeras,

   -

   al menos un par de pinzas,

   -

   al menos una bolsa de plástico,

   -

   al menos una información de identificación para identificar especies de plantas,

   -

   al menos una instrucción que describe cómo usar el kit de ensayo, 35

   -

   al menos una jeringa,

   -

   al menos un filtro.

8. 7. El kit de ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en el que dicho kit comprende

   • 3 trozos de papel de filtro,

   • 3 recipientes con tapas y cada uno con 2, 3 o 4 bolas de vidrio 40

   • 6 vasos,

   • 3 jeringas cada una con, por ejemplo, 13,5 ml de disolvente,

   • 1-3 recipientes con reactivos químicos,

   • 3 pipetas,

   • 1 balanza,

   • 1 tijeras,

   • 1 par de pinzas, 5

   • 3 bolsas de plástico,

   • 1 información de identificación para identificar especies de plantas,

   • 1 instrucción que describe cómo usar el kit de ensayo que incluye una escala de color estándar, y

   • 3 filtros.
9. 8. Uso de un procedimiento como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para determinar si una 10 planta de cultivo viva o planta de mala hierba viva específica se ha sometido a un pesticida específico.
10. 9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el uso según la reivindicación 8, en el que el pesticida específico es un herbicida.
11. 10. El procedimiento o el uso según la reivindicación 9, en el que el herbicida es un herbicida de sulfonilurea.
12. 11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el uso según la reivindicación 8, en el que la 15 planta específica se selecciona del grupo que consiste en Apera spica venti, Lolium perenne, Poa annua y Bromus hordeaceus.