ES2502666A1

ES2502666A1 - Stabilization procedure for biomolecules (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Info

Publication number: ES2502666A1
Application number: ES201330466A
Authority: ES
Inventors: Juan Miguel GONZÁLEZ GRAU; María Carmen PORTILLO GUISADO; Jorge CRUCES TOVA; María De Piedras Alba CUECAS MORANO
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2013-04-02
Filing date: 2013-04-02
Publication date: 2014-10-03
Anticipated expiration: 2033-04-02
Also published as: ES2502666B1

Abstract

The present invention relates to a process for the stabilization of biomolecules characterized in that said stabilization is achieved by maintaining the viscosity of the medium in which said biomolecules are found. It is applicable to a large number of biomolecules such as atp or nadh and allows their use in analytical, clinical or medical procedures that are to be carried out under unsuitable conditions for the maintenance of their stability. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Description

5 SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCiÓN La presente invención se encuadra en el ámbito del sector farmacéutico y de la biotecnología. El procedimiento de estabilización de biomoléculas objeto de la presente invención pretende dar solución al problema técnico que representa el hecho de que ciertas moléculas orgánicas necesarias para que la maquinaria celular pueda seguir funcionando 5 SECTOR AND OBJECT OF THE INVENTION The present invention falls within the scope of the pharmaceutical sector and the biotechnology. The method of stabilization of biomolecules object of the present invention aims to solve the technical problem that represents the fact that certain organic molecules necessary for cellular machinery to continue functioning

10 (como ATP, NADH, ARN, Y muchas proteínas y enzimas) son muy inestables, sobre todo cuando las condiciones a que se ven expuestas son extremas, por ejemplo pero no exclusivamente, por aumentos de temperatura. 10 (such as ATP, NADH, RNA, and many proteins and enzymes) are very unstable, especially when the conditions to which they are exposed are extreme, for example but not exclusively, due to temperature increases.

Para la utilización de estas moléculas en ensayos o reacciones y para su empleo clínico, For the use of these molecules in trials or reactions and for clinical use,

15 esas biomoléculas han de mantenerse en condiciones estables hasta su utilización. Además, su almacenamiento o transporte no siempre es posible hacerlo en frío y en muchas ocasiones algunos reactivos que contienen algunas de estas biomoléculas han de ser transportados o mantenidos en condiciones inadecuadas para el mantenimiento de su estabilidad. La tecnología propuesta presenta la posibilidad de aumentar significativamente 15 these biomolecules must be kept in stable conditions until they are used. In addition, its storage or transport is not always possible to do it cold and in many occasions some reagents that contain some of these biomolecules have to be transported or maintained in inadequate conditions for the maintenance of their stability. The proposed technology presents the possibility of significantly increasing

20 la estabilidad de biomoléculas lo que tiene aplicaciones prácticas para su utilización en reacciones o ensayos enzimáticos o analíticos, en procedimientos clínicos o médicos, o cualquier otra utilización. 20 the stability of biomolecules which has practical applications for use in enzymatic or analytical reactions or tests, in clinical or medical procedures, or any other use.

ESTADO DE LA TÉCNICA STATE OF THE TECHNIQUE

25 Las células vivas se componen de un amplio número de moléculas orgánicas. La gran mayoría de ellas son propias de esas células por lo que se suelen denominar biomoléculas. Aunque las células parecen perfectamente estables, se sabe que un gran número de biomoléculas son relativamente inestables en solución dependiendo de las condiciones en las que se mantengan (Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL. 2002. Bioquímica. Ed. Reverté, 25 Living cells are made up of a large number of organic molecules. The vast majority of them are typical of these cells, so they are often called biomolecules. Although the cells seem perfectly stable, it is known that a large number of biomolecules are relatively unstable in solution depending on the conditions in which they are maintained (Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL. 2002. Biochemistry. Ed. Reverté,

30 Barcelona). Por ejemplo, la gran mayoría de biomoléculas no resisten exposición a temperaturas relativamente elevadas. Como ejemplos típicos de biomoléculas inestables podemos eitar, entre otras, el ATP (adenosin trifosfato), NAD (nieotinamida adenina dinucleótido) y NADP (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato), ARN (ácido ribonucleico) y un largo número de proteínas (Stryer et al. 2002). 30 Barcelona). For example, the vast majority of biomolecules do not resist exposure to relatively high temperatures. As typical examples of unstable biomolecules we can mention, among others, ATP (adenosine triphosphate), NAD (nieotinamide adenine dinucleotide) and NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), RNA (ribonucleic acid) and a large number of proteins (Stryer et al. 2002).

A pesar de la inestabilidad de muchas moléculas biológicas, hoy en día sabemos que existen microorganismos que necesitan temperaturas elevadas, incluso alrededor de los 100°C, para crecer y desarrollarse (Grogan, DW. 1998. Hyperthermophiles and the problem 01 DNA instability. Mol Microbiol. 28: 1043-1049; Vieille C, Zeikus GJ . 2001 . Hyperthermophilic enzymes: Sources, uses, and molecular mechanisms of thermostability. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 1-43). Estos microorganismos termófilos, sin embargo, utilizan las mismas biomoléculas que cualquier otro ser vivo (Stetter, KO. 1999. Extremophiles and their adaptation to hot environments. FEBS Lett 452: 22-25; Daniel, RM, DA Cowan. 2000. Biomolecular stability and life at high temperatures. Cell Mol Life Sci. 57: 250-264). Un problema fundamental es como moléculas tan lábiles como el ATP, que es la molécula energética por excelencia en las células, pueden permitir que continúe la vida de esas células a temperaturas elevadas. El ATP, por ejemplo, se descompone un 60% al exponerse 1 h a 95°C y el NAD más del 95% en dichas condiciones (Daniel and Cowan , 2000) en solución a pH 7. Despite the instability of many biological molecules, today we know that there are microorganisms that need high temperatures, even around 100 ° C, to grow and develop (Grogan, DW. 1998. Hyperthermophiles and the problem 01 DNA instability. Mol Microbiol. 28: 1043-1049; Vieille C, Zeikus GJ. 2001. Hyperthermophilic enzymes: Sources, uses, and molecular mechanisms of thermostability. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 1-43). These thermophilic microorganisms, however, use the same biomolecules as any other living being (Stetter, KO. 1999. Extremophiles and their adaptation to hot environments. FEBS Lett 452: 22-25; Daniel, RM, DA Cowan. 2000. Biomolecular stability and life at high temperatures. Cell Mol Life Sci. 57: 250-264). A fundamental problem is how molecules as labile as ATP, which is the energy molecule par excellence in cells, can allow the life of these cells to continue at elevated temperatures. ATP, for example, decomposes 60% when exposed 1 h at 95 ° C and NAD more than 95% under these conditions (Daniel and Cowan, 2000) in solution at pH 7.

Existen un sinfín de casos en los que distintas biomoléculas de uso comercial se exponen a elevadas temperaturas u otras condiciones adversas para su estabilidad. En la actualidad, prácticamente todas las biomoléculas inestables se transportan y almacenan bajo refrigeración. Sin embargo, existen muchas ocasiones que no es posible mantenerlas refrigeradas o un sistema de refrigeración adecuado no está disponible. El caso más típico sería el envio de biomoléculas para análisis o procedimientos médicos o clínicos a países del tercer mundo, o el mantenimiento de reactivos para análisis en condiciones de calor intenso como pueden ser ambulancias o coches de policía en épocas veraniegas en España. El problema es conseguir mantener biomoléculas estables en cualquier condición ambiental sin necesidad de sistemas caros de congelación. There are countless cases in which different biomolecules for commercial use are exposed to high temperatures or other adverse conditions for their stability. At present, virtually all unstable biomolecules are transported and stored under refrigeration. However, there are many occasions that it is not possible to keep them refrigerated or an adequate cooling system is not available. The most typical case would be the sending of biomolecules for medical or clinical analysis or procedures to third world countries, or the maintenance of reagents for analysis in conditions of intense heat such as ambulances or police cars in summer times in Spain. The problem is to maintain stable biomolecules in any environmental condition without the need for expensive freezing systems.

Se discuten a continuación documentos encontrados que reflejan cual es el estado de la técnica: Documents found that reflect the state of the art are discussed below:

CA2568714A1: A biomolecule-containing formulation of increase stability Esta patente se centra en administrar biomoléculas, glicoproteínas (interferon) en este caso, en una solución relativamente compleja que le confiere mayor estabilidad dentro de un fluido no acuoso. Los interferones son especialmente inestables y han de estabilizarse durante su administración. La solución que proponen incluye la desecación de la biomolécula (por ejemplo, por liofilización) y suspensión de la particula desecada resultante en un fluido no CA2568714A1: A biomolecule-containing formulation of increase stability This patent focuses on administering biomolecules, glycoproteins (interferon) in this case, in a relatively complex solution that gives it greater stability within a non-aqueous fluid. Interferons are especially unstable and must be stabilized during administration. The proposed solution includes the drying of the biomolecule (for example, by lyophilization) and suspension of the resulting dried particle in a non-fluid

acuoso hidrofóbico. La particula desecada incluye la biomolécula (interferon) un tampón, un surfactante, y uno o más estabilizadores que pueden ser un carbohidrato, un antioxidante y un aminoacido. La temperatura para las que se propone es de 37°C o ligeramente superior. El procedimiento objeto de la presente invención es mucho más sencillo, es aplicable a cualquier biomolécula (no sólo glicoproteinas) y puede emplearse para el mantenimiento a largo plazo de biomoléculas a elevadas temperaturas (muy superiores a 37°C), no únicamente durante su administración. No se requiere la inclusión de la biomolécula como una suspensión de partículas secas. aqueous hydrophobic The dried particle includes the biomolecule (interferon) a buffer, a surfactant, and one or more stabilizers that can be a carbohydrate, an antioxidant and an amino acid. The temperature for which it is proposed is 37 ° C or slightly higher. The process object of the present invention is much simpler, is applicable to any biomolecule (not only glycoproteins) and can be used for long-term maintenance of biomolecules at high temperatures (much higher than 37 ° C), not only during administration . The inclusion of the biomolecule as a suspension of dry particles is not required.

EP1449523A1 : Composition and method for stable injectable liquids Esta patente se basa en la estabilización de vacunas para su transporte sin refrigeración . La vacuna o material bioactivo se estabiliza inmovilizándolo en una substancia cristalina (glassy; por ejemplo, cristales de azúcares), de la cual las pequeñas partículas siempre se suspenden en uno o más fluorocarbonos líquidos en los que las partículas son insolubles. A efectos de lo buscado en este documento, lo que se utiliza es la elevada densidad de los fluorocarbonos para separarlos en distintas fases de substancias tampón que disolverían las partículas cuando necesiten ser utilizadas. Un inconveniente de este procedimiento es que los fluorocarbonos están muy regulados por su riesgo ambiental. EP1449523A1: Composition and method for stable injectable liquids This patent is based on the stabilization of vaccines for transport without refrigeration. The vaccine or bioactive material is stabilized by immobilizing it in a crystalline substance (glassy; for example, sugar crystals), of which the small particles are always suspended in one or more liquid fluorocarbons in which the particles are insoluble. For the purposes of what is sought in this document, what is used is the high density of fluorocarbons to separate them into different phases of buffer substances that would dissolve the particles when they need to be used. A drawback of this procedure is that fluorocarbons are highly regulated by their environmental risk.

Frente a lo divulgado en este documento, el procedimiento de la invención no contempla necesariamente el empleo de fluorocarbonos sino que se basa en aumentar la viscosidad como un método sencillo para estabilizar biomoléculas sometidas a situaciones inadecuadas para su almacenamiento, transporte °manipulación. In contrast to what is disclosed in this document, the process of the invention does not necessarily contemplate the use of fluorocarbons but is based on increasing viscosity as a simple method to stabilize biomolecules subjected to situations inappropriate for storage, transport or handling.

EP2489736A1: Verfahren zur Stabilisierung einer biologischen Probe Se basa en el empleo de amidas para la estabilización de biomoléculas (sondas biológicas). Está dirigida al mantenimiento de diversos tipos de biomoléculas, entre ellas ácidos nucleicos y proteínas que pueden estar refrigeradas o no. Opcionalmente se emplean, además de las amidas, diversos compuestos como alcoholes, disolventes, tampones, sustancias osmóticamente activas, quelatantes u otras, consiguiéndose estabilizar las biomoléculas en un rango de temperaturas comprendido entre -80 y 80°C. El procedimiento de invención propuesto en el presente caso no utiliza amidas y propone un método sencillo de estabilizar biomoléculas aumentando la viscosidad de la solución que contiene dichas biomoléculas. EP2489736A1: Verfahren zur Stabilisierung einer biologischen Probe It is based on the use of amides for the stabilization of biomolecules (biological probes). It is aimed at maintaining various types of biomolecules, including nucleic acids and proteins that may or may not be refrigerated. Optionally, in addition to the amides, various compounds such as alcohols, solvents, buffers, osmotically active substances, chelatants or others are used, thus stabilizing the biomolecules in a temperature range between -80 and 80 ° C. The invention process proposed in the present case does not use amides and proposes a simple method of stabilizing biomolecules by increasing the viscosity of the solution containing said biomolecules.

US2012308987A1: Matrices and media lor storage and stabilization 01 biomolecules Esta invención se basa en el empleo de compuestos, principalmente inorgánicos y solubles en agua, que funcionan como antioxidantes y permiten la estabilización y almacenaje de biomoléculas en estado seco (dry-state). En ciertas composiciones emplean lo que denominan plastificador que es un compuesto que facilita el almacenamiento de la matriz en estado seco. Estos plastificadores mejoran las propiedades de la matriz (por ejemplo, su flexibilidad) y entre muchos de los posibles plastificadores que mencionan se encuentra el etilen glicol. Se menciona que el plastificador no interfiere con la estabilidad química o física de las biomoléculas almacenadas. US2012308987A1: Matrices and media lor storage and stabilization 01 biomolecules This invention is based on the use of compounds, mainly inorganic and water soluble, that function as antioxidants and allow the stabilization and storage of dry-state biomolecules. In certain compositions they use what they call plasticizer which is a compound that facilitates the storage of the matrix in a dry state. These plasticizers improve the properties of the matrix (for example, its flexibility) and among many of the possible plasticizers mentioned are ethylene glycol. It is mentioned that the plasticizer does not interfere with the chemical or physical stability of the stored biomolecules.

La principal diferencia con respecto al procedimiento objeto de la presente invención es que en esta patente se requiere que se seque la biomolécula, su uso en seco. Además la formulación es más compleja y se basa en el empleo de compuestos inorgánicos solubles en agua, antioxidantes y una larga lista de otros posibles compuestos (plastificadores) para mejorar el funcionamiento de la formula. La formula puede incluir inhibidores de ARNasas, ADN, ARN, aminoácidos, entre otros. La formulación es altamente compleja. The main difference with respect to the process object of the present invention is that in this patent the biomolecule is required to dry, its use in dry. In addition, the formulation is more complex and based on the use of water-soluble inorganic compounds, antioxidants and a long list of other possible compounds (plasticizers) to improve the functioning of the formula. The formula may include inhibitors of RNAse, DNA, RNA, amino acids, among others. The formulation is highly complex.

W00243750A2: Method for stabilizing biomolecules in liquid formulations. Esta tecnología se centra en el empleo de solventes líquidos para la estabilización de biomoléculas (proteínas con actividad biológica fundamentalmente en el tracto respiratorio) para su empleo en su administración como aerosoles incluyendo sistemas electrostáticos y electrohidrodinámicos. La formula se compone de un líquido portador (agua y un líquido orgánico), la proteína con efecto biológico, un estabilizador (un derivado de un carbohidrato con una cadena carbonada suspendido o disuelto en el líquido portador) y, opcionalmente, un excipiente farmaceutico. Entre los compuestos orgánicos que componen los líquidos portadores o solvente mencionan polietilenglicol entre otros (entre los ejemplos citados proponen la mezcla etanol/polietilen glicol 80%/20%). Lo más característico de esta tecnología es el empleo del agente estabilizador que se compone de un derivado de un carbohidrato con una cadena de entre 8·12 carbonos. La presencia del polietilen glicol como solvente no implica una mayor estabilidad de la proteína ensayada, dicha estabilidad viene dada por el derivado del carbohidrato, según los resultados presentados. W00243750A2: Method for stabilizing biomolecules in liquid formulations. This technology focuses on the use of liquid solvents for the stabilization of biomolecules (proteins with biological activity mainly in the respiratory tract) for use in its administration as aerosols including electrostatic and electrohydrodynamic systems. The formula is composed of a carrier liquid (water and an organic liquid), the protein with a biological effect, a stabilizer (a carbohydrate derivative with a carbon chain suspended or dissolved in the carrier liquid) and, optionally, a pharmaceutical excipient. Among the organic compounds that make up the carrier liquids or solvent they mention polyethylene glycol among others (among the examples cited they propose the mixture ethanol / polyethylene glycol 80% / 20%). The most characteristic feature of this technology is the use of the stabilizing agent that is composed of a carbohydrate derivative with a chain of 8-12 carbons. The presence of polyethylene glycol as a solvent does not imply greater stability of the tested protein, said stability is given by the carbohydrate derivative, according to the results presented.

Esta invención se refiere a proteínas y su administración como aerosoles. La estabilidad que proporciona esta formulación parece venir dada (según sus resultados) por el agente estabilizador que es el derivado de un azúcar con una cadena de 8-12 carbonos. This invention relates to proteins and their administration as aerosols. The stability provided by this formulation seems to be given (according to its results) by the stabilizing agent that is derived from a sugar with an 8-12 carbon chain.

A la vista de los documentos del estado de la técnica discutidos en los párrafos anteriores, sería interesante disponer de una tecnología que permita rebajar los costes requeridos para poder transportar y mantener biomoléculas y que sea capaz de mantenerlas estables por In view of the state of the art documents discussed in the preceding paragraphs, it would be interesting to have a technology that allows to reduce the costs required to transport and maintain biomolecules and that is able to keep them stable by

5 más tiempo en condiciones de preservación inadecuadas. Su utilización debería extenderse a cualquíer aplícacíón que emplee bíomoléculas relatívamente inestables para su utilización en condiciones adversas de laboratorio o industria, de utilización en análisis de campo o en lugares inhóspitos o con reducida infraestructura y condiciones lejanas a las ideales para su preservación. 5 more time in inadequate preservation conditions. Its use should be extended to any application that uses relatively unstable biomolecules for use in adverse laboratory or industry conditions, for use in field analysis or in inhospitable places or with reduced infrastructure and conditions far from ideal for preservation.

10 DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN Constituye el objeto de la presente invención un procedimiento para la estabilización de biomoléculas caracterizado porque dicha estabilización se consigue manteniendo la viscosidad del medio en el cual se encuentran dichas biomoléculas. DESCRIPTION OF THE INVENTION The object of the present invention constitutes a process for the stabilization of biomolecules characterized in that said stabilization is achieved by maintaining the viscosity of the medium in which said biomolecules are found.

15 En una realización preferente del objeto de la presente invención, el medio en el cual se encuentran las biomolécuas es acuoso y el mantenimiento de la viscosidad se lleva a cabo añadiendo modificadores de la viscosidad seleccionados entre etilenglicol, ectoína, polisacáridos tales como almidón o ficolI, azúcares tales como sacarosa, maltosa o In a preferred embodiment of the object of the present invention, the medium in which the biomolecules are found is aqueous and the maintenance of viscosity is carried out by adding viscosity modifiers selected from ethylene glycol, ectoin, polysaccharides such as starch or ficol. , sugars such as sucrose, maltose or

20 trehalosa, proteínas tales como gelatina, albúmina, caseína o enzimas tales como lisozima. Esta relación de modificadores de la viscosidad se aporta con carácter indicativo, no limitativo. Trehalose, proteins such as gelatin, albumin, casein or enzymes such as lysozyme. This ratio of viscosity modifiers is provided as an indication, not a limitation.

Más específicamente, se emplea etilenglicol a una concentración comprendida entre 20% y 25 el 70% dependiendo del grado de estabilidad que se desee alcanzar. More specifically, ethylene glycol is used at a concentration between 20% and 70% depending on the degree of stability that is desired.

Las biomoléculas a estabilizar se seleccionan entre, ARN, ATP, NAD, NADH, NADP, otros factores enzimáticos, enzimas y proteínas. La referida relación de biomoléculas se aporta con carácter indicativo, no limitativo. The biomolecules to be stabilized are selected from, RNA, ATP, NAD, NADH, NADP, other enzymatic factors, enzymes and proteins. The aforementioned relationship of biomolecules is provided as an indication, not a limitation.

30 En una realización particular de la presente invención, la biomolécula estabilizada es adenosín trifosfato (ATP), empleándose para ello una solución acuosa de etilenglicol, concretamente una disolución al 50% en tampón fosfato al 0,1 M Y pH = 7,3. En esas condiciones, la molécula de ATP es mucho más estable en dicho medio en un intervalo de In a particular embodiment of the present invention, the stabilized biomolecule is adenosine triphosphate (ATP), using an aqueous solution of ethylene glycol, specifically a 50% solution in 0.1 M phosphate buffer and pH = 7.3. Under these conditions, the ATP molecule is much more stable in said medium in a range of

35 temperaturas comprendido entre 25 y 90°C. 35 temperatures between 25 and 90 ° C.

En otra realización particular de la presente invención, la biomolécula estabilizada es NADH (nicotinamida adenín nucleótido), empleándose para ello una solución acuosa de etillénglicol, específicamente una disolución al 50% en tampón fosfato al 0,1 M Y pH = 7,3. In another particular embodiment of the present invention, the stabilized biomolecule is NADH (nicotinamide adenine nucleotide), using an aqueous solution of ethylene glycol, specifically a 50% solution in 0.1 M phosphate buffer and pH = 7.3.

En otra realización de la invención, el medio utilizado para la estabilización del NADH es una solución acuosa de ectoina, especificamente una disolución a una concentración de 0,45 g/mI. In another embodiment of the invention, the medium used for the stabilization of NADH is an aqueous solution of ectoin, specifically a solution at a concentration of 0.45 g / ml.

10 En ambos casos se consigue incrementar considerablemente el tiempo en el que la molécula de NADH permanece estable en solución . 10 In both cases, the time in which the NADH molecule remains stable in solution is considerably increased.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A: Resultados del experimento para determinar la estabilidad del ATP a distinta 15 viscosidad en presencia y ausencia de etilenglicol a 25°C y 80°C. Figura 1 B: Detalle de los resultados de la figura 1 A a BOoC. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES Figure 1A: Results of the experiment to determine the stability of ATP at different viscosity in the presence and absence of ethylene glycol at 25 ° C and 80 ° C. Figure 1 B: Detail of the results of Figure 1 A at BOoC.

Figura 2: Resultados del experimento realizado para determinar el aumento de la estabilidad del NADH en presencia y ausencia de etilenglicol. Figura 3: Resultados de la variación de la tasa de degradación de NADH frente a la Figure 2: Results of the experiment performed to determine the increase in NADH stability in the presence and absence of ethylene glycol. Figure 3: Results of the variation in the degradation rate of NADH versus the

20 viscosidad en presencia de etilen glicol Figura 4: Resultados del experimento realizado para determinar el aumento de la estabilidad del NADH en presencia y ausencia de ectoína. 20 viscosity in the presence of ethylene glycol Figure 4: Results of the experiment performed to determine the increase in NADH stability in the presence and absence of ectoin.

DESCRIPCiÓN DETALLADA Y MODO DE REALIZACiÓN DE LA INVENCiÓN DETAILED DESCRIPTION AND MODE OF EMBODIMENT OF THE INVENTION

25 La presente tecnología que se propone sería válida para la generalidad de biomoléculas y específicamente adecuado para pequeñas biomoléculas como ATP, NAD, NADH Y NADP, muy comunes en reacciones enzimáticas o ensayos enzimáticos utilizados en analítica. 25 This proposed technology would be valid for the generality of biomolecules and specifically suitable for small biomolecules such as ATP, NAD, NADH and NADP, very common in enzymatic reactions or enzymatic assays used in analytics.

En un intento de disminuir la interacción entre las moléculas en suspensión, se propone el In an attempt to decrease the interaction between the suspended molecules, the

30 empleo de soluciones con viscosidad elevada con objeto de reducir la fricción entre biomoléculas y facilitar así su mantenimiento o estabilidad. Al aumentar la temperatura, la viscosidad de los líquidos acuosos disminuye drásticamente lo que resulta en una mayor inestabilidad de las moléculas por su constante vibración. Por tanto, sería necesaria la utilización de substancias que aumenten la viscosidad de las soluciones donde se 30 using solutions with high viscosity in order to reduce friction between biomolecules and thus facilitate their maintenance or stability. As the temperature rises, the viscosity of the aqueous liquids dramatically decreases resulting in greater instability of the molecules due to their constant vibration. Therefore, it would be necessary to use substances that increase the viscosity of the solutions where

35 encuentran las biomoléculas para poder aumentar su estabilidad. Por ejemplo, el agua a 35 find biomolecules to increase their stability. For example, water to

20°C posee una viscosidad de aproximadamente 1.0 mPa.s mientras que a 90°C su viscosidad se reduce a 0.3 mPa.s, unas 3.2 veces inferior. 20 ° C has a viscosity of approximately 1.0 mPa.s while at 90 ° C its viscosity is reduced to 0.3 mPa.s, about 3.2 times lower.

Una disminución de la viscosidad da lugar a una mayor inestabilidad de las moléculas y por tanto aumenta la degradación y desnaturalización de las biomoléculas o moléculas orgánicas clave para el mantenimiento de la vida de las células. El procedimiento objeto de la presente invención propone que aumentando la viscosidad se puede conseguir una estabilización de las biomoléculas bajo condiciones extremas (por ejemplo, de temperatura) de modo que se obtengan tiempos de vida equiparables o superiores a los que presentan esas biomoléculas en condiciones idóneas de mantenimiento o funcionamiento. A decrease in viscosity results in greater instability of the molecules and therefore increases the degradation and denaturation of the biomolecules or key organic molecules for the maintenance of cell life. The process object of the present invention proposes that by increasing the viscosity a stabilization of the biomolecules can be achieved under extreme conditions (for example, temperature) so that life times comparable to or greater than those exhibiting those biomolecules under suitable conditions are obtained. of maintenance or operation.

Para ello se propone el empleo de moléculas que proporcionen un aumento de viscosidad incluso a temperaturas elevadas. Un ejemplo sencillo es el etilenglicol, otros ejemplos pueden ser gelatinas o almidón, como proteínas o polisacáridos, respectivamente, entre otras muchas moléculas. Concentraciones elevadas de moléculas orgánicas también suelen resultar en aumentos de viscosidad en la solución. Ejemplos, pueden ser aminoácidos o azúcares, entre otros. For this purpose, the use of molecules that provide an increase in viscosity even at high temperatures is proposed. A simple example is ethylene glycol, other examples can be gelatins or starch, such as proteins or polysaccharides, respectively, among many other molecules. High concentrations of organic molecules also often result in increases in viscosity in the solution. Examples may be amino acids or sugars, among others.

Ejemplo 1: Para aumentar la viscosidad de las soluciones con biomoléculas y como modelo para comprobar la tecnología se empleó etilenglicol. El etilenglicol al 50% en agua y a 80°C presenta una viscosidad equivalente a la viscosidad del agua a 25°C (o temperatura ambiente). La biomolécula inestable utilizada como modelo en este estudio fue el ATP (adenosin trifosfato o trifosfato de adenosina) que es la mólecula energética por excelencia en todas las células vivas. La presencia de etilenglicol al 50% en agua no presentaba ningún efecto en la estabilidad del ATP ni en la reacción de la luciferasa (Enliten, kit comercial para la cuantificación de ATP, Promega). Se comparó la degradación del ATP a 25°C y 80°C en solución acuosa (tampón fosfato 0.1 M Y pH 7.3) con y sin etilenglicol de forma que se pudo ver como se degrada el ATP a lo largo del tiempo de incubación a esas temperaturas. A 80°C, en presencia de etilenglicol la viscosidad era aproximadamente 1 mPa.s (equivalente a la viscosidad del agua a 25°C) mientras que en solución acuosa sin la adición de etilenglicol la viscosidad era de aproximadamente 0.3 mPa.s. (Nota: mPa.s = miliPascales segundo; unidades recomendadas de viscosidad). Example 1: To increase the viscosity of the solutions with biomolecules and ethylene glycol was used as a model to verify the technology. The 50% ethylene glycol in water and at 80 ° C has a viscosity equivalent to the viscosity of water at 25 ° C (or room temperature). The unstable biomolecule used as a model in this study was ATP (adenosine triphosphate or adenosine triphosphate), which is the energy molecule par excellence in all living cells. The presence of 50% ethylene glycol in water had no effect on the stability of ATP or the reaction of luciferase (Enliten, commercial kit for the quantification of ATP, Promega). The degradation of ATP at 25 ° C and 80 ° C in aqueous solution (0.1 MY phosphate buffer pH 7.3) was compared with and without ethylene glycol so that it could be seen how ATP degrades over the incubation time at those temperatures . At 80 ° C, in the presence of ethylene glycol the viscosity was approximately 1 mPa.s (equivalent to the viscosity of water at 25 ° C) while in aqueous solution without the addition of ethylene glycol the viscosity was approximately 0.3 mPa.s. (Note: mPa.s = milliPascals second; recommended units of viscosity).

Los resultados a 25°C demostraban que la presencia de etilenglicol no afectaba la estabilidad del ATP (Figura 1 A). De los resultados a 80°C se observa una mayor estabilidad del ATP en la solución más viscosa (con etilenglicol) (Figura 1 B) la cual permitió la detección de niveles elevados de ATP durante toda la duración del experimento mientras The results at 25 ° C showed that the presence of ethylene glycol did not affect the stability of ATP (Figure 1 A). From the results at 80 ° C, greater stability of ATP is observed in the more viscous solution (with ethylene glycol) (Figure 1 B) which allowed the detection of high levels of ATP during the entire duration of the experiment while

5 que a la viscosidad baja el ATP dejaba de ser detectable a las 7 horas (Figura 1 B). En la Figura 1 B se presenta un detalle de los resultados a 80°C. 5 that at low viscosity ATP ceased to be detectable at 7 hours (Figure 1 B). A detail of the results at 80 ° C is presented in Figure 1B.

Ejemplo 2: De forma similar se han hecho experimentos para determinar si un aumento de la viscosidad Example 2: Similarly experiments have been done to determine if an increase in viscosity

10 aumenta la estabilidad del NAOH (nicotina mida adenín dinucleotido). Se realizaron dos experimentos, uno en presencia y ausencia de etilenglicol y otro en presencia y ausencia de ectoina. Etilenglicol y ectoina son dos compuestos que se utilizan para elevar la viscosidad de la solución. El etilenglicol se utilizó al 50% en agua como en el caso descrito anteriormente. La ectoina se empleó a una concentración de 0.45 g/mi que daba lugar a un 10 increases the stability of NAOH (nicotine measure adenine dinucleotide). Two experiments were performed, one in the presence and absence of ethylene glycol and one in the presence and absence of ectoin. Ethylene glycol and ectoin are two compounds that are used to raise the viscosity of the solution. Ethylene glycol was used at 50% in water as in the case described above. Ectoin was used at a concentration of 0.45 g / mi that resulted in a

15 aumento de la viscosidad con respecto al agua (1 .6 mPa.s a 80°C; 7.7 mPa.s a 20°C) similar al descrito para el caso del etilenglicol. Los experimentos se realizaron con una concentración final de NADH de 1 mM. Los resultados obtenidos se muestran en las figuras 2 y 3 (para el NAOH con etilenglicol) y 4 (para el NADH con ectoina). En ambos casos (figuras 2 y 4) se observó que al aumentar la temperatura, las soluciones con mayor Increase in viscosity with respect to water (1 .6 mPa.s at 80 ° C; 7.7 mPa.s at 20 ° C) similar to that described for ethylene glycol. The experiments were performed with a final NADH concentration of 1 mM. The results obtained are shown in Figures 2 and 3 (for NAOH with ethylene glycol) and 4 (for NADH with ectoin). In both cases (Figures 2 and 4) it was observed that as the temperature increased, the solutions with the highest

20 viscosidad conferían una mayor estabilidad a las biomoléculas (NADH en este ejemplo). 20 viscosity gave greater stability to biomolecules (NADH in this example).

En la figura 3 se representa la velocidad de degradación frente a la viscosidad. Corresponde a NAOH en etilenglicol y las distintas viscosidades se han conseguido aumentando la concentración de etilenglicol desde 10 hasta 60%. Figure 3 shows the degradation rate versus viscosity. It corresponds to NAOH in ethylene glycol and the different viscosities have been achieved by increasing the concentration of ethylene glycol from 10 to 60%.

25 Es decir, en presencia de etilenglicol o ectoina se obtenía una mayor viscosidad y a temperaturas elevadas se observó mayor estabilidad o persistencia del compuesto lábil ensayado (NADH en estos ejemplos) que en soluciones con viscosidad más baja (en ausencia de esos compuestos). That is, in the presence of ethylene glycol or ectoin a higher viscosity was obtained and at higher temperatures greater stability or persistence of the tested labile compound (NADH in these examples) was observed than in solutions with lower viscosity (in the absence of those compounds).

Claims

1. Procedure for the stabilization of biomolecules characterized in that said

Stabilization is achieved by maintaining the viscosity of the medium in which said biomolecules are found.

2. Method for stabilizing biomolecules according to claim 1, characterized in that the medium in which the biomolecules are found is aqueous.

Method for the stabilization of biomolecules according to claims 1 and 2, characterized in that the maintenance of the viscosity of the aqueous medium in which the biomolecules are found is carried out by adding viscosity modifiers selected from ethylene glycol, ectoin, starch , ficoll, sucrose, maltose, trehalose, gelatin, albumin, casein or lysozyme.

4. Four.: Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 3, caracterizado porque el modificador de la viscosidad es etilenglicol. Method for stabilizing biomolecules according to claim 3, characterized in that the viscosity modifier is ethylene glycol.

5. 5.: Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 4, Method for stabilizing biomolecules according to claim 4,

20 characterized in that ethylene glycol is added to the aqueous medium at a concentration between 20% and 70%, preferably 50%.

6. Method for stabilizing biomolecules according to claims 1 to 5,

characterized in that the biomolecules to be stabilized are selected from, RNA, ATP, NAO, NAOH, NAOP, other enzymatic factors and enzymes.

7. Method for the stabilization of biomolecules according to claim 6, characterized in that the stabilized biomolecule is adenosine triphosphate (ATP).

: 30 8. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 7, caracterizado porque el medio utilizado para la estabilización del ATP es una solución acuosa de etilenglicol. Method for the stabilization of biomolecules according to claim 7, characterized in that the medium used for the stabilization of ATP is an aqueous solution of ethylene glycol.

9. Method for stabilizing biomolecules according to claim 8, characterized in that the aqueous solution of ethylene glycol is a 50% solution in 0.1 M phosphate buffer and pH = 7.3.

: 5 10. Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicaciones 8 y 9, caracterizado porque la molécula de ATP se estabiliza en dicho medio en un intervalo de temperaturas comprendido entre 25 y 90°C. 5. Method for stabilizing biomolecules according to claims 8 and 9, characterized in that the ATP molecule is stabilized in said medium in a range of temperatures between 25 and 90 ° C.

eleven . Method for stabilizing biomolecules according to claim 6,

10 characterized in that the stabilized biomolecule is nicotinamide adenine dinucleotide (NADH).

12. Method for stabilizing biomolecules according to claim 11,

characterized in that the medium used for the stabilization of NADH is an aqueous solution of ethylene glycol.

13. Method for stabilizing biomolecules according to claim 12, characterized in that the aqueous solution of ethylene glycol is a 50% solution in 0.1 M phosphate buffer and pH = 7.3.

14. Method for the stabilization of biomolecules according to claim 11, characterized in that the medium used for the stabilization of NADH is an aqueous solution of ectoin

15. Method for stabilizing biomolecules according to claim 14, characterized in that the aqueous solution of ectoin is a solution at a concentration

0.45 g / ml.