ES2502068B1 - Method for the diagnosis of essential thrombocythemia and kit to perform it - Google Patents
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Abstract
Método para el diagnóstico de Trombocitemia esencial y kit para realizarlo.#La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas y más concretamente de la Trombocitemia esencial JAK2WT, el cual comprende la cuantificación de SERPINB1 mediante inmunohistoquímica, preferiblemente en granulocitos de médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea. El método adicionalmente puede comprender la cuantificación de CD44. La presente invención también se refiere al uso de un kit para el diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas y más concretamente Trombocitemia Esencial JAK2WT.Method for the diagnosis of essential thrombocythemia and kit for carrying it out. # The present invention relates to a method for the diagnosis of myeloproliferative neoplasms and more specifically JAK2WT essential thrombocythemia, which comprises the quantification of SERPINB1 by immunohistochemistry, preferably in granulocytes of bone marrow, clot or bone marrow aspirate. The method may additionally comprise the quantification of CD44. The present invention also relates to the use of a kit for the diagnosis of myeloproliferative neoplasms and more specifically JAK2WT Essential Thrombocythemia.
Description
Método para el diagnóstico de Trombocitemia esencial y kit para realizarlo. Method for the diagnosis of essential thrombocythemia and kit to perform it.
La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas y más concretamente de la Trombocitemia esencial JAK2 Wild Type, el cual comprende la cuantificación de SERPINB1 de forma independiente o en combinación con CD44, preferiblemente en granulocitos de médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea. La presente invención también se refiere al uso de un kit para el diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas y más concretamente Trombocitemia esencial JAK2WT que permite realizar el método indicado. Por tanto la presente invención podría encuadrarse en el campo de la biotecnología y más concretamente en la biomedicina. The present invention relates to a method for the diagnosis of myeloproliferative neoplasms and more specifically JAK2 Wild Type essential thrombocythemia, which comprises the quantification of SERPINB1 independently or in combination with CD44, preferably in bone marrow granulocytes, clot or bone marrow aspirate. The present invention also relates to the use of a kit for the diagnosis of myeloproliferative neoplasms and more specifically JAK2WT essential thrombocythemia that allows to perform the indicated method. Therefore the present invention could be framed in the field of biotechnology and more specifically in biomedicine.
Las neoplasias mieloproliferativas (NMPs) son trastornos hematológicos crónicos. Este término engloba un conjunto de trastornos los cuales presentan como característica común la hiperproducción de al menos una línea de células sanguíneas. De forma general estos trastornos cursan con hiperplasia eritroide y/o megacariocítica. Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are chronic hematological disorders. This term encompasses a set of disorders which have as common characteristic the hyperproduction of at least one blood cell line. In general, these disorders involve erythroid and / or megakaryocytic hyperplasia.
Dentro de estas enfermedades, se encuentra la Trombocitemia Esencial (TE), la cual se debe a una superproducción de células sanguíneas, especialmente de plaquetas en la médula ósea. Esta superproducción provoca la formación de trombos y bloqueos en los vasos sanguíneos, así como episodios hemorrágicos. Among these diseases, is the Essential Thrombocythemia (TE), which is due to an overproduction of blood cells, especially platelets in the bone marrow. This overproduction causes the formation of thrombi and blockages in the blood vessels, as well as bleeding episodes.
De forma general esta neoplasia mieloproliferativa, ha sido tradicionalmente diagnosticada por exclusión, cuando se manifiesta la ausencia de condiciones reactivas y desordenes clonales que se pueden presentar en la trombocitosis (Beer et al. 2011, Blood, 117:1472-1482). Aproximadamente el 50% de los casos de TE presentan una mutación en el gen jak2 (Janus quinasa 2) que provoca la sustitución de una valina por una fenilalanina en la posición 617 de la proteína resultante (JAK2 V617F (Campbell et al. 2006, N Engl. J Med, 255:2452-2466; Levine et al. 2007, Nat Rev Cancer, 7:673-683). Por otro lado, las mutaciones MPL están presentes en el 4% de los casos (Pikman et al. 2006, PLoS Med, 3:e270; Beer et al. 2008, Blood, 112: 141-149). Sin embargo en pacientes que no tienen esas mutaciones el diagnóstico de TE tiene que hacerse por exclusión de causas reactivas. La diferenciación de TE de Policitemia Vera (PV) y Mielofibrosis Primaria (MFP) es particularmente problemática. Además cabe destacar que muchos pacientes con neoplasias mieloproliferativas, y más concretamente con TE, son asintomáticos, resulta necesaria la búsqueda de elementos que permitan un rápido y sencillo diagnóstico de la enfermedad para por ejemplo individuos de riesgo. In general, this myeloproliferative neoplasm has been traditionally diagnosed by exclusion, when the absence of reactive conditions and clonal disorders that can occur in thrombocytosis is manifested (Beer et al. 2011, Blood, 117: 1472-1482). Approximately 50% of cases of TE have a mutation in the jak2 gene (Janus kinase 2) that causes the replacement of a valine with a phenylalanine at position 617 of the resulting protein (JAK2 V617F (Campbell et al. 2006, N Engl. J Med, 255: 2452-2466; Levine et al. 2007, Nat Rev Cancer, 7: 673-683) On the other hand, MPL mutations are present in 4% of cases (Pikman et al. 2006 , PLoS Med, 3: e270; Beer et al. 2008, Blood, 112: 141-149) However, in patients who do not have these mutations the diagnosis of TE has to be made by exclusion of reactive causes. Polycythemia Vera (PV) and Primary Myelofibrosis (MFP) is particularly problematic.In addition, it should be noted that many patients with myeloproliferative neoplasms, and more specifically with TE, are asymptomatic, it is necessary to search for elements that allow a quick and simple diagnosis of the disease for example risk individuals.
Por otro lado resulta de vital importancia tener un diagnóstico rápido y preciso para poder seleccionar el tratamiento adecuado, ya que este tratamiento depende de diversos criterios de riesgo los cuales a su vez vienen determinados en función del diagnóstico. La neoplasia mieloproliferativa TE JAK2V617F positiva de forma habitual es diagnosticada rápidamente. Sin embargo el diagnóstico de la neoplasia mieloproliferativa Trombocitemia Esencial JAK2 wild type en pacientes conlleva un largo tiempo de espera ya que debido a la falta de criterios diagnósticos y elementos que permitan su diagnóstico rápido se requieren seguimientos de entre 3 y 6 meses para confirmar la existencia de hematopoyesis no reactiva. Este retraso provoca un incremento en el riesgo de sucesos hemorrágicos y trombóticos en pacientes de alto riesgo (Giona et al. 2012, Blood, 119:2219-2227; Martínez-Aviles et al. 2012, Ann Hematol, 91(4):533-541; Ponce et al. 2012, Leuk Res, 36(1):93-97; Teofili et al. 2011, Blood, 117(9):2700-2707; Tefferi et al. 2010, Leukemia, 24:1302-1309). On the other hand it is vitally important to have a fast and accurate diagnosis in order to select the appropriate treatment, since this treatment depends on various risk criteria which in turn are determined based on the diagnosis. Myeloproliferative neoplasia TE JAK2V617F positive on a regular basis is quickly diagnosed. However, the diagnosis of myeloproliferative neoplasia Essential Thrombocythemia JAK2 wild type in patients entails a long waiting time because due to the lack of diagnostic criteria and elements that allow rapid diagnosis, follow-ups of between 3 and 6 months are required to confirm the existence of non-reactive hematopoiesis. This delay causes an increase in the risk of hemorrhagic and thrombotic events in high-risk patients (Giona et al. 2012, Blood, 119: 2219-2227; Martínez-Aviles et al. 2012, Ann Hematol, 91 (4): 533 -541; Ponce et al. 2012, Leuk Res, 36 (1): 93-97; Teofili et al. 2011, Blood, 117 (9): 2700-2707; Tefferi et al. 2010, Leukemia, 24: 1302- 1309).
A pesar de que se han encontrado algunos marcadores moleculares para la Trombocitemia esencial JAK2V617F negativa (o trombocitemia esencial WT), como por ejemplo la mutación MPL, estas no son una herramienta diagnóstica útil ya que presenta una baja prevalencia (<5%). Por tanto sigue resultando necesario encontrar marcadores fiables que permitan el diagnóstico de estas enfermedades. Además el diagnóstico de la TE JAK2WT se basa en criterios de exclusión, no habiendo ningún criterio positivo de la enfermedad. El diagnóstico se basa en la determinación de trombocitosis, y con una médula ósea compatible mediante un estudio anatomopatológico excluir el resto de causas de causas de trombocitosis. Por estas razones es necesaria la implementación de nuevas pruebas diagnósticas. Although some molecular markers have been found for negative JAK2V617F essential thrombocythemia (or WT essential thrombocythemia), such as the MPL mutation, these are not a useful diagnostic tool since it has a low prevalence (<5%). Therefore, it is still necessary to find reliable markers that allow the diagnosis of these diseases. In addition, the diagnosis of TE JAK2WT is based on exclusion criteria, there being no positive criteria for the disease. The diagnosis is based on the determination of thrombocytosis, and with a compatible bone marrow through an anatomopathological study, exclude all other causes of thrombocytosis causes. For these reasons it is necessary to implement new diagnostic tests.
El inhibidor B1 de la serín proteasa de la familia SERPINB humana, promueve la movilidad de las células cancerosas (Tseng et al. 2009, Oral Oncol, 45: 771-776) y es expresada por los granulocitos. SERPINB1 es más conocido como “serpin peptidase inhibitor”, y su función es la de protector ante las endopeptidasas y regulador de numerosas proteasas: “Neutrophil proteases elastase”, Catepsina G, Proteinasa-3, Quimasa, Quimiotripsina, y Kallikreina-3. Este papel protector le implica en la supervivencia y maduración de los neutrófilos, tanto de sangre periférica como de médula ósea, y especialmente de las series inmaduras de la línea mieloide. También parece jugar un papel protector respecto a la migración y metástasis en algunos fenómenos neoplásicos, (Tseng et al. 2009, Oral Oncol, 45: 771-776) aunque otros autores han encontrado justo lo contrario, una sobre-expresión de esta proteína en canceres con un alto grado de migración y metástasis (Miyata T et al. 2002, J Clin Invest. 109: 585–93). The serine protease B1 inhibitor of the human SERPINB family promotes the mobility of cancer cells (Tseng et al. 2009, Oral Oncol, 45: 771-776) and is expressed by granulocytes. SERPINB1 is better known as "serpin peptidase inhibitor", and its function is to protect against endopeptidases and regulator of numerous proteases: "Neutrophil proteases elastase", Cathepsin G, Proteinase-3, Chymase, Chymotrypsin, and Kallikreina-3. This protective role involves the survival and maturation of neutrophils, both peripheral blood and bone marrow, and especially the immature series of the myeloid line. It also seems to play a protective role regarding migration and metastasis in some neoplastic phenomena, (Tseng et al. 2009, Oral Oncol, 45: 771-776) although other authors have found just the opposite, an overexpression of this protein in cancers with a high degree of migration and metastasis (Miyata T et al. 2002, J Clin Invest. 109: 585–93).
CD44 es un receptor del ácido hialurónico expresado en la membrana de los granulocitos y participa en la interacción y migración celular. La proteína CD44 es el receptor del acido hialurónico, y está íntimamente ligado a MMP14, compartiendo función en la remodelación de la matriz extracelular (Tseng et al. 2009, Oral Oncol, 45: 771-776). El receptor del ácido hialurónico es una proteína ubicua en la mayoría de las estirpes celulares. Tiene una estrecha relación con proteínas de citoesqueleto y proteínas relacionadas con la adhesión y la remodelación de la matriz celular como las metalo-proteasas. CD44 is a hyaluronic acid receptor expressed in the granulocyte membrane and participates in cell interaction and migration. The CD44 protein is the hyaluronic acid receptor, and is intimately linked to MMP14, sharing function in the remodeling of the extracellular matrix (Tseng et al. 2009, Oral Oncol, 45: 771-776). The hyaluronic acid receptor is a ubiquitous protein in most cell lines. It has a close relationship with cytoskeleton proteins and proteins related to the adhesion and remodeling of the cell matrix such as metalloproteases.
En la presente invención se describe un método sencillo y preciso de diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas, y más concretamente de Trombocitemia Esencial (TE) JAK2WT (Wild Type). Este método ofrece una alternativa para el proceso de diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas. Además el método presenta como ventaja que permite diagnosticar TE JAK2WT. El método de la presente invención requiere la cuantificación del nivel de expresión de la proteína SERPINB1 de forma independiente o en combinación con la proteína CD44, mediante inmunohistoquímica, y presenta altos niveles de sensibilidad y especificidad. El método permite que un paciente sea diagnosticado como paciente con neoplasia mieloproliferativa, diferenciándolos así por ejemplo de pacientes con trombocitosis, enfermedad que presenta una sintomatología similar. Por tanto el método de la invención permite clasificar individuos de forma correcta dentro de una patología para poder administrar un tratamiento adecuado diferenciándolos de individuos con otras enfermedades de sintomatología similar. In the present invention a simple and precise method of diagnosis of myeloproliferative neoplasms, and more specifically of Essential Thrombocythemia (TE) JAK2WT (Wild Type) is described. This method offers an alternative to the diagnostic process of myeloproliferative neoplasms. In addition, the method has the advantage of diagnosing TE JAK2WT. The method of the present invention requires quantification of the level of expression of the SERPINB1 protein independently or in combination with the CD44 protein, by immunohistochemistry, and has high levels of sensitivity and specificity. The method allows a patient to be diagnosed as a patient with myeloproliferative neoplasia, thus differentiating them for example from patients with thrombocytosis, a disease that presents a similar symptomatology. Therefore, the method of the invention allows classifying individuals correctly within a pathology to be able to administer a suitable treatment, differentiating them from individuals with other diseases of similar symptoms.
Cabe destacar que el método de la invención se lleva a cabo fuera del cuerpo del sujeto en una muestra biológica aislada del mismo. It should be noted that the method of the invention is carried out outside the subject's body in an isolated biological sample thereof.
La presente invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa caracterizado porque comprende la cuantificación del nivel de expresión de la proteína SERPINB1 mediante inmunohistoquímica en una muestra biológica aislada de un sujeto. La inclusión en el método de la cuantificación del nivel de expresión de la proteína CD44 mediante inmunohistoquímica permitiría diagnosticar neoplasias mieloproliferativas y más concretamente TE JAK2WT con mayor precisión que utilizando de forma independiente SERPINB1. Además el uso de inmunohistoquímica permite también una mayor precisión que otros métodos conocidos para la medición de los niveles de proteínas como por ejemplo western-blot o citoquímica. The present invention relates to a method of obtaining useful data for the diagnosis of a myeloproliferative neoplasm characterized in that it comprises the quantification of the level of expression of the SERPINB1 protein by immunohistochemistry in an isolated biological sample of a subject. The inclusion in the method of quantifying the level of expression of the CD44 protein by immunohistochemistry would allow to diagnose myeloproliferative neoplasms and more specifically TE JAK2WT with greater precision than using SERPINB1 independently. In addition, the use of immunohistochemistry also allows greater precision than other known methods for measuring protein levels such as western blotting or cytochemistry.
Se entiende por inmunohistoquímica en la presente invención un procedimiento histopatológico que se basa en la utilización de un anticuerpo específico, el cual forma un complejo con el antígeno que reconoce el cual se aplica a una muestra de tejido o fluido biológico. Este anticuerpo específico puede encontrarse previamente marcado mediante un enlace químico con una enzima que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno, o bien ser reconocido por un segundo anticuerpo el cual es el que se encuentra marcado para hacer visibles los puntos donde el anticuerpo se une al antígeno y por tanto se encuentra este antígeno. Immunohistochemistry in the present invention is understood as a histopathological procedure that is based on the use of a specific antibody, which forms a complex with the recognizing antigen which is applied to a biological tissue or fluid sample. This specific antibody can be previously labeled by a chemical bond with an enzyme that can transform a substrate into visible, without affecting the ability of the antibody to bind to the antigen, or be recognized by a second antibody which is the one that is labeled for make visible the points where the antibody binds to the antigen and therefore this antigen is found.
En la presente invención se muestran datos de asociación independiente y significativa de la sobreexpresión con respecto a un control de la proteína SERPINB1 con las neoplasias proliferativas y más concretamente con TE JAK2WT. The present invention shows data of independent and significant association of overexpression with respect to a control of the SERPINB1 protein with proliferative neoplasms and more specifically with JAK2WT TE.
Así, la presente invención supone una alternativa al diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas y una solución a la necesidad de aportar un método de diagnóstico precoz de TE JAK2WT. Thus, the present invention is an alternative to the diagnosis of myeloproliferative neoplasms and a solution to the need to provide a method of early diagnosis of TE JAK2WT.
Por todo ello, un primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa caracterizado porque comprende la cuantificación del nivel de expresión de la proteína SERPINB1 mediante inmunohistoquímica en una muestra biológica aislada de un sujeto. En una realización preferida de este aspecto de la invención la neoplasia mieloproliferativa se selecciona de la lista que comprende: Policitemia Vera (PV), Mielofibrosis Primaria (MFP), TE JAK2WT o TE JAK2V617F. En una realización más preferida la neoplasia mieloproliferativa es TE JAK2WT. En otra realización preferida en la inmunohistoquímica el anticuerpo primario utilizado para detectar SERPINB1 es un anticuerpo que reconoce la secuencia SEQ ID NO:3. En una realización más preferida en la inmunohistoquímica el anticuerpo primario utilizado para detectar SERPINB1 es HPA018871 SERPINB1 (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania). Therefore, a first aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data for the diagnosis of a myeloproliferative neoplasm characterized in that it comprises the quantification of the expression level of the SERPINB1 protein by immunohistochemistry in an isolated biological sample of a subject . In a preferred embodiment of this aspect of the invention, myeloproliferative neoplasia is selected from the list comprising: Polycythemia Vera (PV), Primary Myelofibrosis (MFP), TE JAK2WT or TE JAK2V617F. In a more preferred embodiment, the myeloproliferative neoplasm is TE JAK2WT. In another preferred embodiment in immunohistochemistry the primary antibody used to detect SERPINB1 is an antibody that recognizes the sequence SEQ ID NO: 3. In a more preferred embodiment in immunohistochemistry the primary antibody used to detect SERPINB1 is HPA018871 SERPINB1 (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany).
Se entiende por SERPINB1 en la presente invención al inhibidor B1 de la serpín proteasa de la familia SERPINB humana. Este péptido también es conocido como “serpin peptidase inhibitor” y presenta como función actuar como protector ante las endopeptidasas participar como regulador de numerosas proteasas como por ejemplo “Neutrophil proteases elastase”, Catepsina G, Proteinasa-3, Quimasa, Quimiotripsina, y Kallikreina-3. Este péptido SERPINB1 puede presentar por ejemplo, aunque sin limitarse una identidad de al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95%, aun más preferiblemente la secuencia SEQ ID NO:1. SERPINB1 in the present invention is understood as the B1 inhibitor of the human SERPINB family serine protease. This peptide is also known as "serpin peptidase inhibitor" and has the function of acting as a protector against endopeptidases to participate as a regulator of numerous proteases such as "Neutrophil proteases elastase", Cathepsin G, Proteinase-3, Chymase, Chymotrypsin, and Kallikreine- 3. This SERPINB1 peptide may, for example, have an identity of at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, even more preferably the sequence SEQ ID NO: 1.
Se entiende por CD44 en la presente invención al receptor del ácido hialurónico expresado en la membrana de los granulocitos el cual participa en la interacción y migración celular de dichos granulocitos. Este péptido CD44 puede presentar por ejemplo, aunque sin limitarse una identidad de al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95%, aun más preferiblemente la secuencia SEQ ID NO:2. It is understood by CD44 in the present invention the hyaluronic acid receptor expressed in the granulocyte membrane which participates in the cellular interaction and migration of said granulocytes. This CD44 peptide may, for example, have an identity of at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, even more preferably the sequence SEQ ID NO: 2.
Se entiende por “diagnóstico” en la presente invención, la determinación de la presencia o ausencia de una neoplasia mieloproliferativa en un sujeto, de forma preferible Policitemia Vera, Mielofibrosis Primaria, TE JAK2WT o TE JAK2V617F, y de forma más preferible TE JAK2WT. "Diagnosis" in the present invention is understood as the determination of the presence or absence of a myeloproliferative neoplasm in a subject, preferably Vera Polycythemia, Primary Myelofibrosis, TE JAK2WT or TE JAK2V617F, and more preferably TE JAK2WT.
El término “muestra biológica” en la presente invención se refiere a cualquier muestra que permita medir los niveles de expresión de la proteína SERPINB1 o de SERPINB1 y CD44 mediante inmunohistoquímica del individuo del que se ha obtenido dicha muestra, e incluye, pero sin limitarnos, tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. Existen muestras biológicas que no son útiles para tal fin como por ejemplo la sangre periférica. Estudios hechos en esta muestra, a pesar de que presentan granulocitos, demuestra que no es posible determinar adecuadamente las células y por ello la determinación mediante inmunohistoquímica de los niveles de expresión de la proteína SERPINB1 o de SERPINB1 y CD44. La muestra biológica de forma preferible podría ser, por ejemplo, pero sin limitarse, médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea. Dentro de estas muestras biológicas una de las que presenta mayor utilidad es la médula ósea ya que es de fácil obtención y presenta gran cantidad de granulocitos, el cual es el lugar de expresión de SERPINB1 y CD44, y por tanto donde es más sencilla la cuantificación de los marcadores de interés de la invención. Además la médula ósea es el tejido preferentemente afecto en estas enfermedades por lo que es de especial utilidad en la determinación de los niveles de expresión de la proteína SERPINB1 o de SERPINB1 y CD44. Por todo lo descrito, en una realización preferida de este primer aspecto de la invención, la muestra biológica aislada es médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea. En una realización más preferida la muestra biológica aislada es médula ósea. The term "biological sample" in the present invention refers to any sample that allows the levels of expression of the SERPINB1 or SERPINB1 and CD44 protein to be measured by immunohistochemistry of the individual from whom said sample was obtained, and includes, but is not limited to, tissues and / or biological fluids of an individual, obtained by any method known to a person skilled in the art that serves this purpose. There are biological samples that are not useful for this purpose such as peripheral blood. Studies done in this sample, although they have granulocytes, show that it is not possible to properly determine the cells and therefore the determination by means of immunohistochemistry of the expression levels of the SERPINB1 protein or of SERPINB1 and CD44. The biological sample may preferably be, for example, but not limited to, bone marrow, clot or bone marrow aspirate. Within these biological samples, one of the most useful is the bone marrow since it is easy to obtain and has a large amount of granulocytes, which is the place of expression of SERPINB1 and CD44, and therefore where quantification is easier of the markers of interest of the invention. In addition, the bone marrow is the preferentially affected tissue in these diseases, so it is especially useful in determining the levels of expression of the SERPINB1 protein or SERPINB1 and CD44. For all that described, in a preferred embodiment of this first aspect of the invention, the isolated biological sample is bone marrow, clot or bone marrow aspirate. In a more preferred embodiment the isolated biological sample is bone marrow.
Por otro lado la muestra biológica puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina. Resulta de especial relevancia que la muestra se encuentra fijada y embebida en parafina ya que es el formato más adecuado para llevar a cabo la inmunohistoquímica. Por todo ello, en una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada es fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina. En una realización más preferida a muestra biológica es fijada y embebida en parafina. On the other hand, the biological sample can be, for example, but not limited, fresh, frozen, fixed or fixed and embedded in paraffin. It is especially important that the sample is fixed and embedded in paraffin as it is the most appropriate format for carrying out immunohistochemistry. Therefore, in a preferred embodiment of this aspect of the invention, the isolated biological sample is fresh, frozen, fixed or fixed and embedded in paraffin. In a more preferred embodiment a biological sample is fixed and embedded in paraffin.
Se entiende por “sujeto” en la presente invención aquel individuo susceptible de padecer neoplasias mieloproliferativas. El sujeto al que se refiere puede ser un humano, pero también un mamífero no humano, como por ejemplo, pero sin limitarse, roedores, rumiantes, felinos o cánidos. La presente invención presenta especial utilidad en el diagnóstico cuando el sujeto es un humano. Por ello, en otra realización preferida, el sujeto del cual procede la muestra biológica aislada es un mamífero. En una realización más preferida, el mamífero es un humano. By "subject" is understood in the present invention that individual susceptible to myeloproliferative malignancies. The subject referred to may be a human, but also a non-human mammal, such as, but not limited to, rodents, ruminants, felines or canids. The present invention has special utility in diagnosis when the subject is a human. Therefore, in another preferred embodiment, the subject from which the isolated biological sample is derived is a mammal. In a more preferred embodiment, the mammal is a human.
Se entiende por “neoplasia mieloproliferativa” en la presente invención una proliferación clonal de los progenitores de la médula ósea que produce un exceso de elementos maduros hematopoyéticos en la sangre periférica "Myeloproliferative neoplasia" in the present invention is understood as a clonal proliferation of bone marrow progenitors that produces an excess of mature hematopoietic elements in peripheral blood.
Se entiende por “Policitemia Vera” en la presente invención una neoplasia mieloproliferativa en que hay principalmente un aumento de eritrocitos. "Polycythemia Vera" in the present invention is understood as a myeloproliferative neoplasm in which there is mainly an increase in erythrocytes.
Se entiende por “Mielofibrosis Primaria” o “MFP” en la presente invención una neoplasia mieloproliferativa en que hay fundamentalmente una fibrosis de la médula ósea. "Primary myelofibrosis" or "MFP" in the present invention is understood as a myeloproliferative neoplasm in which there is essentially a bone marrow fibrosis.
Se entiende por “Trombocitemia Esencial JAK2WT”, “TE JAK2V617F negativa”, “TEWT” o “TE JAK2WT” en la presente invención una neoplasia mieloproliferativa en que hay un aumento principalmente de los megacariocitos y plaquetas en la que no existe la mutación JAK2V617F. By "Essential Thrombocythemia JAK2WT", "TE JAK2V617F negative", "TEWT" or "TE JAK2WT" in the present invention is understood as a myeloproliferative neoplasm in which there is an increase mainly of megakaryocytes and platelets in which there is no JAK2V617F mutation.
Se entiende por “Trombocitemia Esencial JAK2V617F” o “Trombocitemia Esencial JAK2V617F positiva” en la presente invención una neoplasia mieloproliferativa en que hay un aumento principalmente de los megacariocitos y plaquetas en la que está presente la mutación JAK2V617F. By "JAK2V617F Essential Thrombocythemia" or "JAK2V617F Essential Essential Thrombocythemia" in the present invention is a myeloproliferative neoplasm in which there is an increase mainly of megakaryocytes and platelets in which the JAK2V617F mutation is present.
Se entiende por “sensibilidad” de una prueba diagnóstica a la probabilidad de obtener un resultado positivo cuando el individuo padece la enfermedad. Mide su capacidad para detectar la característica estudiada cuando está presente. "Sensitivity" of a diagnostic test is understood as the probability of obtaining a positive result when the individual suffers from the disease. It measures its ability to detect the characteristic studied when it is present.
Se entiende por “especificidad” de una prueba diagnóstica la probabilidad de obtener un resultado negativo cuando el individuo no tiene la enfermedad. “Specificity” of a diagnostic test is understood as the probability of obtaining a negative result when the individual does not have the disease.
En la presente invención también se muestra que la inclusión de la cuantificación del nivel de expresión del marcador CD44 junto a la cuantificación de SERPINB1, presenta una mayor sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas y más concretamente para TE JAK2WT que la cuantificación exclusivamente de SERPINB1. Por ello, una realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa caracterizado porque comprende la cuantificación del nivel de expresión de la proteína SERPINB1 y de la proteína CD44 mediante inmunohistoquímica en una muestra biológica aislada de un sujeto. In the present invention it is also shown that the inclusion of the quantification of the expression level of the CD44 marker together with the quantification of SERPINB1, presents a greater sensitivity and specificity for the diagnosis of myeloproliferative neoplasms and more specifically for TE JAK2WT than the quantification exclusively of SERPINB1. Therefore, a preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data for the diagnosis of a myeloproliferative neoplasm characterized in that it comprises quantifying the level of expression of the SERPINB1 protein and the CD44 protein by immunohistochemistry in a biological sample isolated from a subject.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa, preferiblemente seleccionada de la lista que comprende Policitemia Vera, Mielofibrosis Primaria, TE JAK2WT o TE JAK2V617F y más preferiblemente TE JAK2WT de un sujeto que comprende las siguientes etapas: Another aspect of the invention relates to a method for the diagnosis of a myeloproliferative neoplasm, preferably selected from the list comprising Vera Polycythemia, Primary Myelofibrosis, TE JAK2WT or TE JAK2V617F and more preferably TE JAK2WT of a subject comprising the following stages:
- a.to.
- cuantificar el nivel de expresión de la proteína SERPINB1 mediante inmunohistoquímica en una muestra biológica aislada de un sujeto, quantify the level of expression of the SERPINB1 protein by immunohistochemistry in a biological sample isolated from a subject,
- b.b.
- comparar el valor obtenido en (a) con un valor estándar. compare the value obtained in (a) with a standard value.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada es médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea. En una realización más preferida la muestra biológica aislada es médula ósea. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the isolated biological sample is bone marrow, clot or bone marrow aspirate. In a more preferred embodiment the isolated biological sample is bone marrow.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada es fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina. En una realización más preferida a muestra biológica es fijada y embebida en parafina. In another preferred embodiment of this aspect of the invention, the isolated biological sample is fresh, frozen, fixed or fixed and embedded in paraffin. In a more preferred embodiment a biological sample is fixed and embedded in paraffin.
En otra realización preferida en la inmunohistoquímica el anticuerpo primario utilizado para detectar SERPINB1 es un anticuerpo que reconoce la secuencia SEQ ID NO:3. En una realización más preferida en la inmunohistoquímica el anticuerpo primario utilizado para detectar SERPINB1 es HPA018871 SERPINB1 (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania). In another preferred embodiment in immunohistochemistry the primary antibody used to detect SERPINB1 is an antibody that recognizes the sequence SEQ ID NO: 3. In a more preferred embodiment in immunohistochemistry the primary antibody used to detect SERPINB1 is HPA018871 SERPINB1 (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany).
La expresión “cuantificar el nivel de expresión” tal y como se utiliza en la presente invención se refiere a la medida de la cantidad de proteína presente en una muestra biológica. La cuantificación se realiza mediante inmunohistoquímica y cuantificación de la cantidad e intensidad de la tinción en la muestra biológica teñida. La cuantificación se puede llevar a cabo tanto de forma manual mediante la visualización mediante patólogos expertos que puedan determinar la positividad de las células con respecto a la tinción utilizada. La cuantificación también se puede llevar a cabo mediante herramientas informáticas que permitan establecer un límite a partir del cual la tinción de un granulocito se considere positiva, o de forma totalmente automatizada mediante diversas herramientas informáticas que permiten determinar la intensidad de tinción de la muestra biológica. The term "quantify the level of expression" as used in the present invention refers to the measure of the amount of protein present in a biological sample. Quantification is performed by immunohistochemistry and quantification of the amount and intensity of staining in the stained biological sample. The quantification can be carried out both manually by visualization by expert pathologists who can determine the positivity of the cells with respect to the staining used. The quantification can also be carried out by means of computer tools that allow to establish a limit from which the staining of a granulocyte is considered positive, or in a fully automated way by means of various computer tools that allow to determine the staining intensity of the biological sample.
Se entiende por “valor estándar” cualquier valor o rango de valores derivado de la cuantificación de las proteínas incluidas en el método de la invención en una muestra biológica control procedente de un individuo sano o en una mezcla de muestras biológicas derivadas de un grupo control. La presente invención presenta especial utilidad para poder diagnosticar pacientes con neoplasias mieloproliferativas de pacientes que presentan enfermedades con similar sintomatología como pueden ser las trombocitosis. Por ello, el término valor estándar en la presente invención también se refiere a cualquier valor o rango de valores derivado de la cuantificación de las proteínas incluidas en el método de la invención en una muestra biológica control procedente de un individuo o grupo de individuos que presentan una enfermedad con una sintomatología similar a las neoplasias mieloproliferativas y preferiblemente a TE JAK2WT pero que no presentan dichas enfermedades. De forma preferible la enfermedad con sintomatología similar a las neoplasias mieloproliferativas es trombocitosis. "Standard value" means any value or range of values derived from the quantification of the proteins included in the method of the invention in a biological control sample from a healthy individual or in a mixture of biological samples derived from a control group. The present invention has special utility to be able to diagnose patients with myeloproliferative neoplasms of patients presenting diseases with similar symptoms such as thrombocytosis. Therefore, the term "standard value" in the present invention also refers to any value or range of values derived from the quantification of the proteins included in the method of the invention in a biological control sample from an individual or group of individuals presenting a disease with a symptomatology similar to myeloproliferative neoplasms and preferably JAK2WT TE but which do not have such diseases. Preferably, the disease with symptoms similar to myeloproliferative neoplasms is thrombocytosis.
En la presente descripción, se entiende por “grupo control”, un grupo de individuos sanos, preferiblemente de la misma o similar edad que el sujeto estudiado, del cual se han obtenido valores o rangos de valores de expresión en una colección de muestras biológicas procedentes de dichos individuos sanos, y que son representativos de la población en la que se va a aplicar el método de la invención. La cuantificación del nivel de expresión de las proteínas se ha de realizar de la misma forma, y ser obtenida a partir del mismo tipo de muestra biológica aislada que la procedente del sujeto a estudiar en el paso (a) del método de la invención. In the present description, "control group" means a group of healthy individuals, preferably of the same or similar age as the subject studied, from which values or ranges of expression values have been obtained in a collection of biological samples from of said healthy individuals, and that are representative of the population in which the method of the invention is to be applied. The quantification of the level of expression of the proteins must be performed in the same way, and be obtained from the same type of isolated biological sample as that from the subject to be studied in step (a) of the method of the invention.
Se entiende por “sano”, “individuo sano” o “sujeto sano” en la presente invención aquel sujeto o individuo que no padece una neoplasia mieloproliferativa, preferiblemente PV, MFP, TE JAK2WT o TE JAK2V617F, y más preferiblemente TE JAK2WT. By "healthy", "healthy individual" or "healthy subject" is understood in the present invention that subject or individual who does not suffer from a myeloproliferative neoplasm, preferably PV, MFP, TE JAK2WT or TE JAK2V617F, and more preferably TE JAK2WT.
Se entiende por “población sana” en la presente invención, un conjunto de individuos o sujetos que no padece una neoplasia mieloproliferativa, preferiblemente PV, MFP, TE JAK2WT o TE JAK2V617F, y más preferiblemente TE JAK2WT. By "healthy population" is understood in the present invention, a set of individuals or subjects who do not suffer from a myeloproliferative neoplasm, preferably PV, MFP, TE JAK2WT or TE JAK2V617F, and more preferably TE JAK2WT.
Se entiende por “individuos sanos representativos de la población en la que se va a aplicar el método de la invención” aquellos sujetos que no padecen neoplasias mieloproliferativas, en el momento de la extracción de la muestra biológica aislada a analizar y que como grupo tienen un patrón similar en cuanto a por ejemplo, aunque sin limitarnos, raza, edad o distribución por género, que la población de pacientes o sujetos a los que se va a aplicar el método de la invención. "Healthy individuals representative of the population in which the method of the invention is to be applied" means those subjects who do not suffer from myeloproliferative neoplasms, at the time of extraction of the isolated biological sample to be analyzed and who as a group have a similar pattern in terms of, for example, but not limited to, race, age or gender distribution, than the population of patients or subjects to whom the method of the invention is to be applied.
El término “comparación”, tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere pero no se limita, a la comparación del nivel de expresión de las proteínas incluidas en el método de la invención cuantificado en la muestra biológica del paso (a) con un valor estándar. La comparación descrita en el apartado (b) del método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador. The term "comparison," as used in the present invention, refers to, but is not limited to, the comparison of the level of expression of the proteins included in the method of the invention quantified in the biological sample of step (a). With a standard value. The comparison described in section (b) of the method of the present invention can be performed manually or assisted by a computer.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el método de la invención además comprende: In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the method of the invention further comprises:
c. asignar al sujeto del paso (a) al grupo de pacientes que padecen una neoplasia mieloproliferativa, preferiblemente seleccionada de la lista que comprende Policitemia Vera, Mielofibrosis Primaria, TE JAK2WT o TE JAK2V617F y más preferiblemente TE JAK2WT cuando el valor obtenido en el paso (a) es significativamente mayor que el valor estándar del paso (b). C. assign the subject of step (a) to the group of patients suffering from myeloproliferative neoplasia, preferably selected from the list comprising Vera Polycythemia, Primary Myelofibrosis, TE JAK2WT or TE JAK2V617F and more preferably TE JAK2WT when the value obtained in step (a ) is significantly greater than the standard value of step (b).
Una cantidad significativamente mayor que un valor estándar en la presente invención puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, como por ejemplo, aunque sin limitarse, mediante análisis de Kruskal-Wallis. An amount significantly greater than a standard value in the present invention can be established by one skilled in the art by using different statistical tools, such as, but not limited to, by Kruskal-Wallis analysis.
Como se demuestra en los ejemplos, la determinación tanto de SERPINB1 como de CD44 de forma conjunta presenta una mayor especificidad para el diagnostico de neoplasias mieloproliferativas, y más concretamente de TE JAK2WT que SERPINB1 de forma individual. Por todo ello, otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a un método para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa, preferiblemente seleccionada de la lista que comprende Policitemia Vera, Mielofibrosis Primaria, TE JAK2WT o TE JAK2V617F y más preferiblemente TE JAK2WT, de un sujeto que comprende las siguientes etapas: As demonstrated in the examples, the determination of both SERPINB1 and CD44 together presents greater specificity for the diagnosis of myeloproliferative neoplasms, and more specifically of TE JAK2WT than SERPINB1 individually. Therefore, another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to a method for the diagnosis of a myeloproliferative neoplasm, preferably selected from the list comprising Vera Polycythemia, Primary Myelofibrosis, TE JAK2WT or TE JAK2V617F and more preferably TE JAK2WT, of a subject that comprises the following stages:
- a.to.
- cuantificar el nivel de expresión de la proteína SERPINB1 y CD44 mediante inmunohistoquímica en una muestra biológica aislada de un sujeto, preferiblemente médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea, y más preferiblemente médula ósea, y quantify the level of expression of the SERPINB1 and CD44 protein by immunohistochemistry in an isolated biological sample of a subject, preferably bone marrow, clot or bone marrow aspirate, and more preferably bone marrow, and
- b.b.
- comparar los valores obtenidos en (a) con unos valores estándar. compare the values obtained in (a) with standard values.
En una realización más preferida, el método además comprende: In a more preferred embodiment, the method further comprises:
c. asignar al sujeto del paso (a) al grupo de pacientes que padecen una neoplasia mieloproliferativa, preferiblemente seleccionada de la lista que comprende Policitemia Vera, Mielofibrosis Primaria, TE JAK2WT o TE JAK2V617F y más preferiblemente TE JAK2WT cuando los valores obtenidos en el paso (a) de SERPINB1 y CD44 son significativamente mayores que los valores estándar del paso (b). C. assign the subject of step (a) to the group of patients suffering from a myeloproliferative neoplasia, preferably selected from the list comprising Vera Polycythemia, Primary Myelofibrosis, TE JAK2WT or TE JAK2V617F and more preferably TE JAK2WT when the values obtained in step (a ) of SERPINB1 and CD44 are significantly higher than the standard values of step (b).
La muestra biológica, preferiblemente médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea, y más preferiblemente médula ósea puede ser fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina, y preferiblemente fijada y embebida en parafina. The biological sample, preferably bone marrow, clot or bone marrow aspirate, and more preferably bone marrow may be fresh, frozen, fixed or fixed and embedded in paraffin, and preferably fixed and embedded in paraffin.
En otra realización más preferida en la inmunohistoquímica el anticuerpo primario utilizado para detectar SERPINB1 es un anticuerpo que reconoce la secuencia SEQ ID NO:3. En una realización más preferida en la inmunohistoquímica el anticuerpo primario utilizado para detectar SERPINB1 es HPA018871 SERPINB1 (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania). In another more preferred embodiment in immunohistochemistry the primary antibody used to detect SERPINB1 is an antibody that recognizes the sequence SEQ ID NO: 3. In a more preferred embodiment in immunohistochemistry the primary antibody used to detect SERPINB1 is HPA018871 SERPINB1 (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany).
Los métodos incluidos en la presente invención pueden incluir adicionalmente un paso en el cual si se determina que el paciente presenta una neoplasia mieloproliferativa, se determine el tratamiento para el paciente. En el caso de las neoplasias mieloproliferativas, este tratamiento puede ser por ejemplo, aunque sin limitarse, hidroxiurea en personas con riesgo trombótico o de sangrado y antiagregación. The methods included in the present invention may additionally include a step in which if it is determined that the patient has a myeloproliferative neoplasm, the treatment for the patient is determined. In the case of myeloproliferative neoplasms, this treatment can be, for example, but not limited to, hydroxyurea in people at risk of thrombotic or bleeding and antiplatelet.
El método de la invención puede ser realizado de forma manual mediante un técnico, o puede llevarse a cabo de forma totalmente automatizada. Esta forma automatizada se puede realizar mediante un equipo o dispositivo médico-sanitario electromecánico compuesto por tecnología mecánica, eléctrica, electromecánica, electrónica, hidráulica, óptica (escáner, laser), ondas, radiofrecuencia y cuyos elementos físicos son bombas, centrífugas, sensores, detectores, transductores y/o software de control y monitorización. El método también se puede realizar en un dispositivo medico sanitario desechable el cual es un equipo que puede ir unido y conectado o por separado al equipo electromecánico. The method of the invention can be performed manually by a technician, or it can be carried out in a fully automated manner. This automated form can be carried out by means of an electromechanical medical device or device composed of mechanical, electrical, electromechanical, electronic, hydraulic, optical technology (scanner, laser), waves, radiofrequency and whose physical elements are pumps, centrifuges, sensors, detectors , transducers and / or control and monitoring software. The method can also be performed in a disposable medical sanitary device which is a device that can be attached and connected or separately to the electromechanical equipment.
Cualquiera de los métodos descritos en la presente invención, pueden comprender, además de la determinación SERPINB1 o SERPINB1 y CD44, la determinación de otras variables clínicas de interés, como por ejemplo, aunque sin limitarse, edad, sexo, respuesta posterior, cifra de plaquetas y presencia de fenómenos trombóticos o de sangrado. Any of the methods described in the present invention may comprise, in addition to the SERPINB1 or SERPINB1 and CD44 determination, the determination of other clinical variables of interest, such as, but not limited to, age, sex, subsequent response, platelet count and presence of thrombotic or bleeding phenomena.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un kit que comprende anticuerpos específicos para SERPINB1 para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa, preferiblemente seleccionada de la lista que comprende Policitemia Vera, Mielofibrosis Primaria, Trombocitemia Esencial JAK2WT o Trombocitemia Esencial JAK2V617F y más preferiblemente Trombocitemia Esencial JAK2WT. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de un kit que comprende anticuerpos específicos para SERPINB1 y CD44 para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa, preferiblemente seleccionada de la lista que comprende Policitemia Vera, Mielofibrosis Primaria, Trombocitemia Esencial JAK2WT o Trombocitemia Esencial JAK2V617Fy más preferiblemente Trombocitemia Esencial JAK2WT. En otra realización preferida en la inmunohistoquímica el anticuerpo primario utilizado para detectar SERPINB1 es un anticuerpo que reconoce la secuencia SEQ ID NO:3. En una realización más preferida en la inmunohistoquímica el anticuerpo primario utilizado para detectar SERPINB1 es HPA018871 SERPINB1 (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania). En otra realización preferida el anticuerpo específico para CD44 es CD44 humano pan-específico (R&D, Minneapolis, MN, USA). Another aspect of the invention relates to the use of a kit comprising antibodies specific for SERPINB1 for the diagnosis of a myeloproliferative neoplasm, preferably selected from the list comprising Vera Polycythemia, Primary Myelofibrosis, Essential Thrombocythemia JAK2WT or Essential Thrombocythemia JAK2V617F and more preferably Thrombocythemia Essential JAK2WT. A preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of a kit comprising antibodies specific for SERPINB1 and CD44 for the diagnosis of a myeloproliferative neoplasm, preferably selected from the list comprising Vera Polycythemia, Primary Myelofibrosis, Essential Thrombocythemia JAK2WT or Thrombocythemia Essential JAK2V617Fy more preferably Essential Thrombocythemia JAK2WT. In another preferred embodiment in immunohistochemistry the primary antibody used to detect SERPINB1 is an antibody that recognizes the sequence SEQ ID NO: 3. In a more preferred embodiment in immunohistochemistry the primary antibody used to detect SERPINB1 is HPA018871 SERPINB1 (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany). In another preferred embodiment the antibody specific for CD44 is pan-specific human CD44 (R&D, Minneapolis, MN, USA).
Los kits utilizados para el diagnóstico pueden comprender todos aquellos reactivos necesarios para determinar la cantidad de la proteína SERPINB1 sola o SERPINB1 y CD44 mediante inmunohistoquímica como, por ejemplo, pero sin limitarse, anticuerpos específicos de la proteína SERPINB1, anticuerpos específicos de la proteína CD44, anticuerpos secundarios o controles positivos y/o negativos. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, medios de fijación de muestras, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención. The kits used for diagnosis can comprise all those reagents necessary to determine the amount of the SERPINB1 protein alone or SERPINB1 and CD44 by immunohistochemistry such as, but not limited to, antibodies specific to the SERPINB1 protein, antibodies specific to the CD44 protein, secondary antibodies or positive and / or negative controls. The kit can also include, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, sample fixation media, etc. On the other hand, the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization. Preferably, the kit further comprises instructions for carrying out the method of the invention.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention. The following examples and figures are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
Fig. 1: Representa los resultados de la tinción por inmunohistoquímica de granulocitos de medula ósea en pacientes control, y pacientes de Policitemia Vera (PV), TE JAK2V617F, TE JAK2WT y PMF para (A) CD44 y (B) SERPINB1. Fig. 1: Represents the results of immunohistochemical staining of bone marrow granulocytes in control patients, and patients of Polycythemia Vera (PV), TE JAK2V617F, TE JAK2WT and PMF for (A) CD44 and (B) SERPINB1.
Fig. 2: Representa curvas ROC (Receiver Operating Characteristic o Característica Operativa del Receptor) de los resultados de inmunohistoquímica de CD44 en pacientes de Trombocitemia Esencial JAK2WT frente a un grupo control (A) y de SERPINB1 en pacientes de neoplasias proliferativas frente a un grupo control (B). Fig. 2: Represents ROC curves (Receiver Operating Characteristic or Receiver Operative Characteristic) of the results of immunohistochemistry of CD44 in patients of Essential Thrombocythemia JAK2WT against a control group (A) and SERPINB1 in patients of proliferative neoplasms against a group control (B).
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la utilidad del método de la invención. The invention will now be illustrated by tests carried out by the inventors, which show the usefulness of the method of the invention.
-Pacientes: Los pacientes diagnosticados con neoplasias mieloproliferativas y los controles sanos (medula ósea sana y no infiltrada, libre de patología reactiva y enfermedad neoplásica) se reclutaron para el estudio en Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid, España para la fase de screening, y del Hospital del Mar (Barcelona, España) y de Guadalajara (Guadalajara, España) para la fase de validación. -Patients: Patients diagnosed with myeloproliferative neoplasms and healthy controls (healthy and non-infiltrated bone marrow, free of reactive pathology and neoplastic disease) were recruited for study at the University Hospital 12 de Octubre, Madrid, Spain for the screening phase, and from the Hospital del Mar (Barcelona, Spain) and Guadalajara (Guadalajara, Spain) for the validation phase.
El diagnostico de la neoplasia mieloproliferativa se estableció en función de los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS) 2001/2008 o los criterios del grupo de estudio de Policitemia Vera. Los datos clínicos, incluidos los parámetros hematológicos, presencia de hipertrofia de bazo o hígado, incidentes hematológicos, características de la enfermedad y detalles del tratamiento fueron registrados. El screening mutacional para JAK2V617F se llevó a cabo mediante RT-PCR en el DNA de sangre periférica según el método descrito en Rapado et al. 2008, Ann Hematol.; 87:741-749. The diagnosis of myeloproliferative neoplasia was established according to the criteria of the World Health Organization (WHO) 2001/2008 or the criteria of the study group of Polycythemia Vera. Clinical data, including hematological parameters, presence of spleen or liver hypertrophy, hematological incidents, disease characteristics and treatment details were recorded. Mutational screening for JAK2V617F was carried out by RT-PCR in the peripheral blood DNA according to the method described in Rapado et al. 2008, Ann Hematol .; 87: 741-749.
-Inmunohistoquímica. (IHC) La inmunohistoquímica de médula ósea se llevó a cabo en el Hospital 12 de Octubre. Las biopsias de médula ósea se fijaron en formalina y embebidas en parafina. La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo en secciones de tejido de 4 µm de grosor. La tinción de imunohistoquímica se realiza en un aparato BON MAX (Leica) usando sus propios tampones y anticuerpo secundario polímero marcado con peroxidasa y revelado con diaminobencidina. Para la tinción de las respectivas moléculas se usan los siguientes anticuerpos: anticuerpo CD44 humano pan-específico (R&D, Minneapolis, MN, USA), anticuerpo monoclonal de ratón IgG2A clon 2C5 (dilución 1/8000), (R&D, Minneapolis, MN, USA) y HPA018871 SERPINB1 (1/1200) (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania). Tras la incubación, la inmunodetección se llevó a cabo usando el método de visualización DAKO EnVision (Dako, Glostrup, Dinamarca), con diaminobenzidina como sustrato cromogénico. En las secciones se utilizó hematoxilina como colorante de contraste. La inmunotinción fue evaluada por dos patólogos diferentes, usando el porcentaje de granulocitos y la intensidad de tinción como criterios. Solo la tinción intensa citoplásmica fue considerada positiva. Una muestra fue considerada positiva para CD44 cuando un número superior al 3% de granulocitos fueron positivos a la tinción. Por otro lado una muestra fue positiva para SERPINB1 cuando un número superior al 88% de los granulocitos fueron positivos a la tinción. -Immunohistochemistry. (IHC) Bone marrow immunohistochemistry was carried out at the 12 de Octubre Hospital. Bone marrow biopsies were fixed in formalin and embedded in paraffin. Immunohistochemical staining was carried out in tissue sections 4 µm thick. Imunohistochemical staining is performed in a BON MAX (Leica) apparatus using its own buffers and peroxidase-labeled polymer secondary antibody and developed with diaminobenzidine. For staining the respective molecules the following antibodies are used: pan-specific human CD44 antibody (R&D, Minneapolis, MN, USA), mouse monoclonal antibody IgG2A clone 2C5 (dilution 1/8000), (R&D, Minneapolis, MN, USA) and HPA018871 SERPINB1 (1/1200) (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany). After incubation, immunodetection was carried out using the DAKO EnVision visualization method (Dako, Glostrup, Denmark), with diaminobenzidine as a chromogenic substrate. In the sections hematoxylin was used as a contrast dye. Immunostaining was evaluated by two different pathologists, using the percentage of granulocytes and staining intensity as criteria. Only intense cytoplasmic staining was considered positive. A sample was considered positive for CD44 when a number greater than 3% granulocytes were positive for staining. On the other hand, a sample was positive for SERPINB1 when a number greater than 88% of the granulocytes were positive for staining.
-Análisis estadísticos. Los datos de la inmunohistoquímicas fueron analizados utilizando el test de Mann-Whitney para valorar los porcentajes de positividad (la significación estadística se definió como P < 0,05) y curvas ROC para establecer el valor de positivo o negativo de CD44 y SERPINB1 ( o Característica Operativa del Receptor). -Statistical analysis. Immunohistochemical data were analyzed using the Mann-Whitney test to assess the percentages of positivity (statistical significance was defined as P <0.05) and ROC curves to establish the positive or negative value of CD44 and SERPINB1 (or Receiver Operating Characteristic).
-Pacientes El estudio incluyó 152 pacientes diagnosticados con neoplasias mieloproliferativas (66 TEJAK2WT, 20 TEJAK2V617F, 30PV, 19PMF y 17 TE sin clasificar) y 13 controles. -Patients The study included 152 patients diagnosed with myeloproliferative neoplasms (66 TEJAK2WT, 20 TEJAK2V617F, 30PV, 19PMF and 17 unclassified TE) and 13 controls.
Expresión diferencial de CD44 y SERPINB1 Differential expression of CD44 and SERPINB1
-Fase de screening La fase de screening incluía datos de 12 pacientes de PV, 10 de TE JAK2V617F, 13 de TEJAK2WT, 11 de PMF y 11 individuos control. La expresión en granulocitos de medula ósea de CD44 fue similar para PV, TE JAK2V617F positiva, PMF y muestras control (mediana de granulocitos positivos para CD44: 3% [rango, 0,5–5%], 1% [rango, 2–95%], 2% [rango, 0–40%], 2% [rango, 0–70%], respectivamente). Sin embargo, TE JAK2WT mostró una fuerte sobreexpresión de CD44 (mediana de granulocitos positivos para CD44: 80% [rango, 2–95%]), mostrando diferencias significativas con respecto a PV, JAK2V617F positiva TE, PMF y controles (P = 0,001) (Figura 1A). - Screening phase The screening phase included data from 12 PV patients, 10 from TE JAK2V617F, 13 from TEJAK2WT, 11 from PMF and 11 control individuals. CD44 bone marrow granulocyte expression was similar for PV, JAK2V617F positive TE, PMF and control samples (median granulocyte positive for CD44: 3% [range, 0.5–5%], 1% [range, 2– 95%], 2% [range, 0–40%], 2% [range, 0–70%], respectively). However, TE JAK2WT showed a strong overexpression of CD44 (median granulocyte positive for CD44: 80% [range, 2–95%]), showing significant differences with respect to PV, JAK2V617F positive TE, PMF and controls (P = 0.001 ) (Figure 1A).
La expresión de SERPINB1 en médula ósea fue significativamente mayor para muestras de PV, TE JAK2V617F, TE JAK2WT y PMF (mediana de granulocitos positivos: 95% [rango, 60–99%], 67% [rango, 5–99%], 98% [rango, 3–98%] y 98% [rango, 3–98%], respectivamente) en comparación con los controles (mediana de granulocitos positivos: 20% [rango, 2–99%]) (P = 0,03) (Figure 1B). The expression of SERPINB1 in bone marrow was significantly higher for samples of PV, TE JAK2V617F, TE JAK2WT and PMF (median of positive granulocytes: 95% [range, 60–99%], 67% [range, 5–99%], 98% [range, 3–98%] and 98% [range, 3–98%], respectively) compared to controls (median positive granulocyte: 20% [range, 2–99%]) (P = 0 , 03) (Figure 1B).
-Fase de validación La fase de validación incluyó datos de 18 pacientes de PV, 10 de TE JAK2V617F, 17 de TE sin clasificar, 53 de TE JAK2WT, 8 de PMF y 2 sujetos control. Dado que con 2 controles no se podía llevar a cabo el análisis estadístico adecuado, se incluyeron en la fase de validación además los 11 controles utilizados en la fase de screening. -Validation phase The validation phase included data from 18 PV patients, 10 from JAK2V617F TE, 17 from unclassified TE, 53 from JAK2WT TE, 8 from PMF and 2 control subjects. Since with 2 controls the adequate statistical analysis could not be carried out, the 11 controls used in the screening phase were also included in the validation phase.
La expresión en granulocitos de medula ósea de CD44 fue similar para PV, TE JAK2V617F positiva, controles y muestras PMF (mediana de granulocitos positivos para CD44: 3,5% [rango, 0,5–80%], 5% [rango, 0,5–70%], 2% [rango, 0–40%], 2% [070%], respectivamente). CD44 bone marrow granulocyte expression was similar for PV, JAK2V617F positive TE, controls and PMF samples (median granulocyte positive for CD44: 3.5% [range, 0.5–80%], 5% [range, 0.5–70%], 2% [range, 0–40%], 2% [070%], respectively).
La expresión de CD44 fue significativamente mayor en muestras de TE JAK2WT (mediana de granulocitos positivos para CD44: 10% [rango, 0–95%]), con respecto a PV, TE JAK2V617F positiva y muestras control (P = 0,027) (Figura 2A). The expression of CD44 was significantly higher in samples of JAK2WT TE (median granulocyte positive for CD44: 10% [range, 0–95%]), with respect to PV, JAK2V617F positive TE and control samples (P = 0.027) (Figure 2A).
De nuevo, el patrón de expresión de SERPINB1 en medula ósea fue significativamente mayor en muestras PV, TE JAK2V617F, TE JAK2WT y PMF (mediana de granulocitos positivos: 95% [rango, 1–99%], 80% [rango, 1–99%], 95% [rango, 1–95%] y 90% [rango, 3–98%], respectivamente) en comparación con los controles (mediana de granulocitos positivos: 20% [rango, 2–99%]) (P = 0,009) (Figura 2B). En general los resultados obtenidos en la fase de validación se correspondían con los obtenidos en la fase de a pesar de llevarse a cabo en diferentes grupos de pacientes. Again, the expression pattern of SERPINB1 in bone marrow was significantly higher in PV, TE JAK2V617F, TE JAK2WT and PMF samples (median of positive granulocytes: 95% [range, 1–99%], 80% [range, 1– 99%], 95% [range, 1–95%] and 90% [range, 3–98%], respectively) compared to controls (median of positive granulocytes: 20% [range, 2–99%]) (P = 0.009) (Figure 2B). In general, the results obtained in the validation phase corresponded with those obtained in the phase of despite being carried out in different groups of patients.
Correlación entre las características clínicas y de laboratorio y los resultados inmunohistoquímicos: Correlation between clinical and laboratory characteristics and immunohistochemical results:
La expresión de CD44 y SERPINB1 evaluada por inmunohistoquímica no se vio The expression of CD44 and SERPINB1 evaluated by immunohistochemistry was not seen
5 influenciada por variables clínicas y de laboratorio (edad, sexo, respuesta posterior, cifra de plaquetas y presencia de fenómenos trombóticos o de sangrado) analizadas en este estudio, indicando el potencial de ambas proteínas como buenas herramientas diagnósticas (Tablas 1-9). 5 influenced by clinical and laboratory variables (age, sex, subsequent response, platelet count and presence of thrombotic or bleeding phenomena) analyzed in this study, indicating the potential of both proteins as good diagnostic tools (Tables 1-9).
10 Tabla 1: TE JAK2WT fase de screening 10 Table 1: TE JAK2WT screening phase
- SERPINB1 negativo SERPINB1 negative
- SERPINB1 positivo Total SERPINB1 positive Total
- Controles Controls
- 9 2 11 9 2 eleven
- TE JAK2WT TE JAK2WT
- 6 7 13 6 7 13
- Total Total
- 15 9 24 fifteen 9 24
Sensibilidad: 54; Especificidad: 82; PPV: 78; NPV: 60. Tabla 2: TE JAK2WT fase de screening Sensitivity: 54; Specificity: 82; PPV: 78; NPV: 60. Table 2: TE JAK2WT screening phase
- CD44 negativo Negative CD44
- CD44 positivo Total CD44 positive Total
- Controles Controls
- 4 7 11 4 7 eleven
- TE JAK2WT TE JAK2WT
- 2 11 13 2 eleven 13
- Total Total
- 6 18 24 6 18 24
Sensibilidad: 84; Especificidad: 36; PPV: 61; NPV: 67. Tabla 3: TE JAK2WT fase de screening Sensitivity: 84; Specificity: 36; PPV: 61; NPV: 67. Table 3: TE JAK2WT screening phase
- SERPINB1 y CD44 negativo (Modelo -) SERPINB1 and CD44 negative (Model -)
- SERPINB1 y CD44 positivo (Modelo +) Total SERPINB1 and CD44 positive (Model +) Total
- Controles Controls
- 10 1 11 10 one eleven
- TE JAK2WT TE JAK2WT
- 7 6 13 7 6 13
- Total Total
- 17 7 24 17 7 24
Sensibilidad: 46; Especificidad: 91; PPV: 86; NPV: 60. Tabla 4: TE JAK2WT fase de validación Sensitivity: 46; Specificity: 91; PPV: 86; NPV: 60. Table 4: TE JAK2WT validation phase
18 Sensibilidad: 83; Especificidad: 77; PPV: 94; NPV: 53. Tabla 5: TE JAK2WT fase de validación 18 Sensitivity: 83; Specificity: 77; PPV: 94; NPV: 53. Table 5: TE JAK2WT validation phase
- SERPINB1 negativo SERPINB1 negative
- SERPINB1 positivo Total SERPINB1 positive Total
- Controles Controls
- 10 3 13 10 3 13
- TE JAK2WT TE JAK2WT
- 9 44 53 9 44 53
- Total Total
- 19 47 66 19 47 66
- CD44 negativo Negative CD44
- CD44 positivo Total CD44 positive Total
- Controles Controls
- 5 8 13 5 8 13
- TE JAK2WT TE JAK2WT
- 14 39 53 14 39 53
- Total Total
- 19 47 66 19 47 66
Sensibilidad: 74; Especificidad: 39; PPV: 83; NPV: 26. Tabla 6: TE JAK2WT fase de validación Sensitivity: 74; Specificity: 39; PPV: 83; NPV: 26. Table 6: TE JAK2WT validation phase
- SERPINB1 y CD44 negativo (Modelo -) SERPINB1 and CD44 negative (Model -)
- SERPINB1 y CD44 positivo (Modelo +) Total SERPINB1 and CD44 positive (Model +) Total
- Controles Controls
- 10 3 13 10 3 13
- TE JAK2WT TE JAK2WT
- 9 44 53 9 44 53
- Total Total
- 19 47 66 19 47 66
Sensibilidad: 64; Especificidad: 92; PPV: 97; NPV: 39. Tabla 7: Todas las neoplasias mieloproliferativas (fase de screening y validación) Sensitivity: 64; Specificity: 92; PPV: 97; NPV: 39. Table 7: All myeloproliferative neoplasms (screening and validation phase)
- SERPINB1 negativo SERPINB1 negative
- SERPINB1 positivo Total SERPINB1 positive Total
- Controles Controls
- 10 3 13 10 3 13
- Neoplasias mieloproliferativas Myeloproliferative Neoplasms
- 48 91 139 48 91 139
- Total Total
- 58 94 152 58 94 152
10 Sensibilidad: 66; Especificidad: 78; PPV: 97; NPV: 18. Tabla 8: Todas las neoplasias mieloproliferativas 10 Sensitivity: 66; Specificity: 78; PPV: 97; NPV: 18. Table 8: All myeloproliferative neoplasms
- CD44 negativo Negative CD44
- CD44 positivo Total CD44 positive Total
- Controles Controls
- 5 8 13 5 8 13
- Neoplasias mieloproliferativas Myeloproliferative Neoplasms
- 42 97 139 42 97 139
- Total Total
- 47 105 152 47 105 152
Sensibilidad: 71; Especificidad: 38; PPV: 92; NPV: 11. Tabla 9: Todas las neoplasias mieloproliferativas Sensitivity: 71; Specificity: 38; PPV: 92; NPV: 11. Table 9: All myeloproliferative neoplasms
- SERPINB1 y CD44 negativo (Modelo -) SERPINB1 and CD44 negative (Model -)
- SERPINB1 y CD44 positivo (Modelo +) Total SERPINB1 and CD44 positive (Model +) Total
- Controles Controls
- 12 1 13 12 one 13
- Neoplasias mieloproliferativas Myeloproliferative Neoplasms
- 64 75 139 64 75 139
- Total Total
- 76 76 152 76 76 152
Sensibilidad: 54; Especificidad: 92; PPV: 99; NPV: 16. Sensitivity: 54; Specificity: 92; PPV: 99; NPV: 16.
5 Estableciendo un modelo diagnóstico para TE JAK2WT basado en inmunohistoquímica de CD44 y SERPINB1. Para desarrollar un modelo inmunohistoquímico para el diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas se llevaron a cabo dos análisis de curvas ROC, uno comparando 5 Establishing a diagnostic model for JAK2WT TE based on immunohistochemistry of CD44 and SERPINB1. To develop an immunohistochemical model for the diagnosis of myeloproliferative neoplasms, two ROC curve analyzes were performed, one comparing
10 los resultados para CD44 por inmunohistoquímica entre TE JAK2WT y los controles (Figura 2A, área bajo la curva 0,69), y uno que comparó los resultados para SERPINB1 por inmunohistoquímica entre neoplasias mieloproliferativas (PV, TE JAK2WT, TE JAK2V617F positiva y PMF) y controles (área bajo la curva 0,73; Figura 2B). 10 the results for CD44 for immunohistochemistry between TE JAK2WT and the controls (Figure 2A, area under the curve 0.69), and one that compared the results for SERPINB1 for immunohistochemistry between myeloproliferative neoplasms (PV, TE JAK2WT, TE JAK2V617F positive and PMF ) and controls (area under the curve 0.73; Figure 2B).
15 TE JAK2WT fue predicho por una expresión > 3% de CD44 y > 88% de SERPINB1. Estos puntos de corte fueron utilizados para desarrollar un modelo diagnóstico. 15 TE JAK2WT was predicted by an expression> 3% of CD44 and> 88% of SERPINB1. These cut-off points were used to develop a diagnostic model.
La especificidad, sensibilidad, y valores diagnósticos positivo y negativo para los Specificity, sensitivity, and positive and negative diagnostic values for
20 modelos cuando se utilizaron para diagnosticar TE JAK2WT y neoplasias proliferativas se muestran en las tablas 1-9; en resumen, el modelo para diagnosticar TE JAK2WT tenía un 97% PPV (positive predictive value o valor diagnóstico de un resultado positivo) y un 39% NPV (negative predictive value o valor diagnóstico de un resultado negativo), con un 64% de sensibilidad y un 92% de especificidad. Tanto en la fase de screening como de validación, la inmunohistoquímica de SERPINB1 tenía una alta especificidad y una buena sensibilidad, las cuales incrementaban si se combinaban con CD44. Los datos demuestran que SERPINB1 es un buen marcador diagnóstico para neoplasias mieloproliferativas y más concretamente para TE JAK2WT, y que la combinación de SERPINB1 y CD44 mejora la especificidad del uso de SERPINB1 de forma independiente y más concretamente para TE JAK2WT. 20 models when used to diagnose JAK2WT TE and proliferative neoplasms are shown in tables 1-9; In summary, the model to diagnose TE JAK2WT had 97% PPV (positive predictive value or diagnostic value of a positive result) and 39% NPV (negative predictive value or diagnostic value of a negative result), with 64% sensitivity and 92% specificity. Both in the screening and validation phase, the immunohistochemistry of SERPINB1 had high specificity and good sensitivity, which increased if combined with CD44. The data show that SERPINB1 is a good diagnostic marker for myeloproliferative neoplasms and more specifically for TE JAK2WT, and that the combination of SERPINB1 and CD44 improves the specificity of the use of SERPINB1 independently and more specifically for TE JAK2WT.
Claims (18)
- 1. one.
- Un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa caracterizado porque comprende la cuantificación del nivel de expresión de la proteína SERPINB1 mediante inmunohistoquímica en una muestra biológica aislada de médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea de un sujeto. A method of obtaining useful data for the diagnosis of a myeloproliferative neoplasm characterized in that it comprises quantifying the level of expression of the SERPINB1 protein by immunohistochemistry in an isolated biological sample of bone marrow, clot or bone marrow aspirate of a subject.
- 2. 2.
- Método según la reivindicación 1, en el que además se cuantifica el nivel de expresión de la proteína CD44 mediante inmunohistoquímica en una muestra biológica aislada de médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea de un sujeto. A method according to claim 1, wherein the level of expression of the CD44 protein is also quantified by immunohistochemistry in a biological sample isolated from bone marrow, clot or bone marrow aspirate of a subject.
- 3. 3.
- Un método para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa de un sujeto que comprende las siguientes etapas: A method for the diagnosis of a myeloproliferative neoplasm of a subject comprising the following stages:
- o aspirado de médula ósea de un sujeto, or bone marrow aspirate of a subject,
- b.b.
- comparar el valor obtenido en (a) con un valor estándar. compare the value obtained in (a) with a standard value.
- 4. Four.
- Método según la reivindicación 3 que además comprende: Method according to claim 3 further comprising:
- 5. 5.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 que además comprende la cuantificación del nivel de expresión de CD44. Method according to any of claims 3 or 4 which further comprises quantifying the level of CD44 expression.
- 6. 6.
- Método según la reivindicación 5 donde la asociación del sujeto al grupo de pacientes que padecen una neoplasia mieloproliferativa se produce cuando el valor obtenido de CD44 es significativamente mayor que el valor estándar. Method according to claim 5 wherein the association of the subject to the group of patients suffering from a myeloproliferative neoplasm occurs when the value obtained from CD44 is significantly greater than the standard value.
- 7. 7.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 donde el valor estándar es el nivel de expresión de la proteína SERPINB1 y/o CD44 en una muestra biológica Method according to any of claims 3 to 6 wherein the standard value is the level of expression of the SERPINB1 and / or CD44 protein in a biological sample
- 8. 8.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 donde el valor estándar es el nivel de expresión de la proteína SERPINB1 y/o CD44 en una muestra biológica aislada de médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea de un sujeto que padece una trombocitosis. Method according to any of claims 3 to 6 wherein the standard value is the level of expression of the SERPINB1 and / or CD44 protein in an isolated biological sample of bone marrow, clot or bone marrow aspirate of a subject suffering from thrombocytosis.
- 9. 9.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde la neoplasia mieloproliferativa se selecciona de la lista que comprende Policitemia Vera, Mielofibrosis Primaria, Trombocitemia Esencial JAK2WT o Trombocitemia Esencial JAK2V617F. Method according to any of claims 1 to 8 wherein the myeloproliferative neoplasm is selected from the list comprising Vera Polycythemia, Primary Myelofibrosis, Essential Thrombocythemia JAK2WT or Essential Thrombocythemia JAK2V617F.
- 10. 10.
- Método según la reivindicación 9 donde la donde la neoplasia mieloproliferativa es Trombocitemia Esencial JAK2WT. Method according to claim 9 wherein the myeloproliferative neoplasm is JAK2WT Essential Thrombocythemia.
- 11. eleven.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde el anticuerpo primario para SERPINB1 es HPA018871 SERPINB1. Method according to any one of claims 1 to 10 wherein the primary antibody for SERPINB1 is HPA018871 SERPINB1.
- 12. 12.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 donde el sujeto es un humano. Method according to any one of claims 1 to 11 wherein the subject is a human.
- 13. 13.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde la muestra biológica aislada es médula ósea. Method according to any one of claims 1 to 12 wherein the isolated biological sample is bone marrow.
- 14. 14.
- Uso de un kit que comprende anticuerpos específicos para SERPINB1 para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa. Use of a kit comprising antibodies specific for SERPINB1 for the diagnosis of a myeloproliferative neoplasm.
- 15. fifteen.
- Uso de un kit según la reivindicación 14 que además comprende anticuerpos específicos para CD44 para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa. Use of a kit according to claim 14 further comprising antibodies specific for CD44 for the diagnosis of a myeloproliferative neoplasm.
- 16. 16.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 donde la neoplasia mieloproliferativa se selecciona de la lista que comprende Policitemia Vera, Use according to any of claims 14 or 15 wherein the myeloproliferative neoplasm is selected from the list comprising Vera Polycythemia,
- 17. 17.
- Uso según la reivindicación 16 donde la neoplasia mieloproliferativa es Trombocitemia Esencial JAK2WT. Use according to claim 16 wherein the myeloproliferative neoplasm is JAK2WT Essential Thrombocythemia.
- 18. 18.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 donde el anticuerpo primario para SERPINB1 es HPA018871 SERPINB1. Use according to any of claims 14 to 17 wherein the primary antibody for SERPINB1 is HPA018871 SERPINB1.
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