ES2475974T3 - Prueba genética para predisposición genética de hemofilia B en perro crestado rodesiano - Google Patents

Abstract

El gen de factor IX canino aislado de acuerdo con la Sec ID N.º: 1 que tiene una mutación puntual, en el que el nucleótido 752 es A en vez de G.

Description

Prueba genética para predisposición genética de hemofilia B en perro crestado rodesiano

La invención se refiere a una prueba genética para predisposición genética de hemofilia B en perro crestado rodesiano genotipando el gen del factor IX canino.

5 Introducción

La hemofilia B es una afección que afecta el proceso de coagulación de la sangre por falta de factor de coagulación IX biol�gicamente activo. El factor IX es una glucoprote�na plasm�tica de 56 kDa que se requiere para activación de Factor X en la cascada de coagulación. La hemofilia canina B representa una coagulopat�a hereditaria que se da en la naturaleza con un intervalo de gravedad de signos cl�nicos y actividad coagulante en diferentes variantes de cría. Se

10 ha informado de casos en muchas razas. En perros crestados rodesianos, una forma grave de hemofilia B con signos cl�nicos pronunciados se describió por primera vez por Lutze et al. (2000). Actualmente es la forma de hemofilia canina más importante en Alemania.

Bottema C D K et al.: "Missense mutations and evolutionary conservation of amino acids: evidence that many of the amino acids in factor IX function as spacer elements", American Journal of Human Genetics, American Society of 15 Human Genetics, Chicago, IL, EE.UU., vol.: 49, n.�: 4, 1 de enero de 1991 (1-1-1991), páginas 820-838, XP009007557, ISSN: 0002-9297. Bottema C D K et al. desvela que en el factor IX humano mutaciones de sentido alterado en residuos específicos en el factor IX (es decir, aquellos conservados en factor IX de ser humano, vaca, perro y ratón pero no en proteasas relacionadas) es seis veces menos probable que causen la enfermedad. La posición 244 del factor IX del perro, corresponde a la posición 207 en factor IX humano y en un residuo G conservado. Dicho 20 documento también se refiere a esta posición en seres humanos como una mutación de sentido alterado comunicada.

GIANNELLI F. et al. "Haemophilia B: Database of point mutations and short additions and deletions-cuarta edición, 1993", Nucleic Acids Research, vol. 21, n.�: 13, 1993, páginas 3075-3087, XP002659955, ISSN: 0305-1048. Giannelli

F. et al. desvela varias mutaciones de Factor IX humano que causan hemofilia. Una de ellas es una mutación G->A en

el nucleótido, dando como resultado un cambio de amino�cidos en la posición 253, G253->E; esto corresponde a la 25 posición 244 en factor IX canino (de perro), donde se sitúa la misma mutación identificada en la solicitud.

F. Giannelli et al.: "Haemophilia B (sixth edition): a database of point mutations and short additions and deletions", Nucleic Acids Research, vol. 24, n.�: 1, 1 de enero de 1996 (1-1-1996), páginas 103-118, XP55036054, ISSN: 0305-1048, DOI: 10.1093/nar/24.1.103. F. Giannelli et al. desvela adicionalmente una lista larga de mutaciones en el factor IX humano tres de las cuales est�n en la posición 207, a saber: G207->R, G207->detención y G207->E.

30 Se han identificado diferentes mutaciones en el gen que codifica el factor IX en diferentes razas de perro, incluyendo, labrador, lhasa apso, pit bull terrier y airedale terrier dando como resultado los síntomas cl�nicos t�picos para hemofilia B (Evans et al., 1989; Mauser et al., 1996; Brooks et al., 1997; Gu et al., 1999; Tabla 11). Según el mejor conocimiento del autor, el origen genético de hemofilia B en perros crestados rodesianos es desconocido. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar si un defecto genético podría identificarse como causa subyacente de hemofilia en perros

35 crestados rodesianos. Una prueba genética ayudaría a diagnosticar perros enfermos y a identificar genéticamente perros afectados y portadores.

Es el objeto de la presente invención proporcionar una prueba genética para el análisis de un genotipo de un perro, preferentemente un crestado rodesiano con respecto a la hemofilia B.

Este objetivo se logra por las invenciones según se reivindica en las reivindicaciones independientes. Se describen 40 realizaciones ventajosas en las reivindicaciones dependientes.

El problema se resuelve proporcionando un factor IX de acuerdo con la Sec ID N.�: 1 que tiene una mutación puntual, en la que el nucleótido 752 es A en vez de G.

Se ha encontrado que una única mutación puntual en el factor IX canino conduce a una reducción muy fuerte en la actividad del factor y podría asignarse a hemofilia B en el perro, preferentemente en los perros crestados rodesianos.

45 En la Sec ID N.�: 1 el nucleótido en la posición 752 est� mutado de G a A. Esta mutación da como resultado un intercambio de glicina (GGA) a ácido glut�mico (GAA) en la posición 244 en el dominio catalítico del factor XI hemofílico (Sec ID N.�: 3; Sec ID N.�: 2 de tipo silvestre).

La invención se refiere por lo tanto a una prueba genética para identificación de al menos una mutación puntual en la Sec ID N.�: 1 del genoma del perro, en el que al menos una mutación puntual conduce a un intercambio de

50 amino�cidos en posición 244 de factor canino IX.

La mutación puntual es una mutación puntual en el nucleótido 752 de la Sec ID N.�: 1, en la que el nucleótido 752 es A en vez de G.

El análisis se puede usar también para detectar mutaciones adicionales en la secuencia Sec ID N.�: 1, por ejemplo mutaciones que no est�n relacionadas con hemofilia B.

En una realización de la invención el procedimiento para el análisis de un genotipo de un perro con respecto a hemofilia B comprende la identificación de una mutación puntual en la Sec ID N.�: 1 del genoma del perro, en el que una mutación puntual es una mutación puntual en la que el nucleótido 752 es A en vez de G.

5 Mediante esta prueba es posible identificar el genotipo del perro crestado rodesiano con respecto a hemofilia B y especialmente si la perra es una portadora heterocigota de la mutación.

Los procedimientos para detectar una mutación puntual en un genoma se conocen por el experto en la técnica. Los procedimientos posibles son secuenciar la región del genoma, donde la mutación est� localizada, con cebadores específicos y comparar después la secuencia con la secuencia de tipo silvestre. La secuenciaci�n se puede hacer

10 directamente con el ADN gen�mico o por amplificación de la región seleccionada y después secuenciando la secuencia amplificada.

Otros procedimientos posibles comprenden reacción en cadena de la ligasa (LCR), polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), espectroscop�a de masas (MALDI-TOF), SSCP, DGGE, pirosecuenciaci�n, dHPLC, hibridación de alelos específicos, balizas moleculares, micromatrices, endonucleasa Flap (FEN), PCR en tiempo real,

15 PCR específica de alelos, ensayo de Taqman.

Por ejemplo se puede usar PCR para la amplificación de la región de la mutación puntual, la región de Sec ID N.�: 1, que contiene al menos un de las mutaciones puntuales en la Sec ID N.�: 1 del genoma del perro, en la que el nucleótido 752 es A en vez de G.

En una realización preferida el perro es un crestado rodesiano.

20 Otra realización de la invención es un procedimiento para la determinación de la predisposición genética para hemofilia B de un perro mediante el uso del gen del factor IX canino del perro de acuerdo con la Sec ID N.�: 1 que tiene al menos una mutación puntual en la Sec ID N.�: 1 del genoma del perro, en la que al menos una mutación puntual conduce a un intercambio de amino�cidos en posición 244 del factor IX canino.

La mutación puntual es una mutación puntual en el nucleótido 752, en la que este nucleótido es A en vez de G.

25 En una realización preferida el perro es un crestado rodesiano.

En otra realización de la invención este procedimiento se pueden usar para la selección de un perro crestado rodesiano para cría.

Incluso si no se recogen referencias de apoyo múltiples, se desvelarán en las reivindicaciones todas las combinaciones razonables de las características.

30 Tabla 1. Supervivencia en la bibliografía de mutaciones en gen del factor IX canino en perros con hemofilia;

Tabla 2. Resultados de análisis de secuencia del ADN del factor IX canino y ensayo de genotipado TaqMan para una mutación G-A de sentido alterado en el ex�n 7 en perros crestados rodesianos con est�tus de hemofilia B diferente (Se�alamiento, linaje: Portadora confirmada, madres de los números 4 y 5; signos cl�nicos: Sangrado grave después de intervenciones quirúrgicas menores; Análisis de secuencia: n = normal c = portadora a = afectado) y daños,

35 sangrado espontáneo ocasional (+/-));

Fig. 1. Alineamiento de secuencia aminoac�dico de dominio proteasa de factor IX canino (CFIX) con factor IX humano (HFIX), tripsina bovina (TRYP), elastasa porcina (ELAS), quimiotripsina bovina (CHYM) y calicre�na porcina (KALL);

Fig. 2. Composición de dominios del factor IX: características detectadas de acuerdo con ProSite y SMART. Los dominios clave del factor IX incluyen gamma-carboxiglutamato N-terminal (GLA, véase flecha gris) que contiene

40 dominio (hexágono), el dominio EGF de unión a calcio (pentágono, enlaces disulfuro indicados en gris) y dominio serina proteasa similar a tripsina (elipse, C-terminal). Los tres residuos de sitios activos (H258, D306 y S402) de este dominio se muestran como diamantes pequeños as� como los enlaces disulfuro (líneas rectangulares grises). Una lista detallada de las características de este dominio y posiciones se muestra en la Tabla 3;

Figura 3, Figura 3A: Vista interior de la proteína mutada: disulfuros (esferas), sitio activo y amino�cidos mutados (lazo);

45 Comparación de la estructura de factor IX canino mutado y de factor XI de tipo silvestre. Ilustración de los residuos afectados de factor IX desde el interior; Figura 3A es tipo silvestre; Figura 3B es proteína mutada. Forma esférica: puente disulfuro; forma de lazo: amino�cido mutado. La vista incluye el sitio activo; la Figura 3C muestra una Superposición de las Figuras 3A y 3B (regiones gris oscuro: Figura 3A; gris claro: Figura 3B); N�tese como el cambio de residuo 244 condice a un cambio en geometría de la proteína general. Especialmente se afecta el puente disulfuro.

50 Fig. 4. Modelo de los residuos afectados de las moléculas del factor IX desde el exterior; Figura 4A muestra la proteína mutada; Figura 4B el tipo silvestre; Forma esférica: puente disulfuro; forma de lazo: amino�cido mutado; superficie oscura alrededor del círculo blanco: sitio activo; los puentes disulfuro y los sitios activos son claramente visibles. Es

claramente visible, que el amino�cido mutado causa un cambio en la estructura espacial en el puente disulfuro y as� también en el sitio activo (círculo blanco; gris oscuro). Ello causa también un cambio en la periferia de las estructuras (esquina derecha inferior, rectángulo blanco) con el efecto de que un enlace adicional est� formando un bucle. Ambos pueden verse en la superposición de la Figura 4A y la Figura 4B mostradas en la Figura 4C (gris oscuro: figura 4A; gris claro: figura 4B).

Descripci�n detallada de la invención

Materiales y procedimientos

Dise�o de estudio

El estudio incluyó seis perros macho fenot�picamente afectados, cuatro portadoras sospechadas y 12 perros sanos. De todos los perros con est�tus de hemofilia B conocida o sospechada, la actividad del factor IX se midió para verificar el est�tus para hemofilia B. De todos estos perros, se aisl� ADN a partir de sangre en EDTA y la región codificante de factor IX canino se amplificó y se secuenci�. La secuencia de ADN obtenida se compar� con el ADN del factor IX canino de tipo silvestre(número de acceso del banco de genes: NM_001003323). Además, se llev� a cabo un ensayo de genotipado TaqMan específico para la mutación detectada en todos estos perros. Con el fin de demostrar la relevancia funcional de la mutación detectada, se llevaron a cabo estudios de alineamiento de amino�cidos as� como los análisis de modelización de estructura . Para investigar, si la mutación es un polimorfismo de solo un nucleótido (SNP) no relacionado con hemofilia B, se llevaron a cabo ensayos de genotipado específicos para la mutación en muestras de ADN de 30 perros crestados rodesianos con estado de hemofilia B indefinido y muestras de otras tres razas de perro (doberman pinscher: n = 20; perro apuntador alemán de pelo de alambre: n = 20; labrador: n = 25).

Animales y material de muestra

Los perros crestados rodesianos con est�tus conocido de hemofilia B estuvieron presentes como pacientes o para diagnóstico de hemofilia para la Clónica de Animales Pequeños, Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover. Los seis perros crestados rodesianos machos tienen un historial de sangrado conocido y actividades de factor IX sustancialmente reducidas de aproximadamente el 1 % (Tabla 2). Las señales clónicas incluyeron principalmente sangrado grave después de intervenciones quirúrgicas y heridas menores y sangrado espontáneo ocasional. Entre las cuatro perras con est�tus de portadora sospechada debido a actividad moderadamente reducida de factor IX (48-69 %), una se confirm� por hermanos de camada afectados. Doce perros crestados rodesianos sanos tuvieron una actividad de factor XI en el intervalo de referencia y no hubo en su historial ningún indicio para un sangrado excesivo.

Recogida de muestras de sangre

Se obtuvo sangre citrada para medidas de actividad de factor IX de una vena cefálica o vena safena usando jeringuillas disponibles estériles (1,1 x 30 mm) y solo se us� presión ligera para elevar la vena. La sangre citrada se recogió en tubos de plástico que contienen una parte (1 ml) de solución de citrato de sodio a 0,11 mol/l por nueve partes (9 ml) de sangre y se mezclan inmediatamente por balanceo cuidadoso. Se obtuvo por centrifugaci�n plasma citrado pobre en plaquetas para medidas de factor IX por centrifugaci�n dos veces durante 10 minutos a 2000 g. El sobrenadante final se recogió después y se almacen� en alícuotas a -70 �C. Además, se recogieron 5 ml de sangre en EDTA para las pruebas genéticas.

Medidas de actividad del factor IX

Las actividades del factor de coagulación IX se midieron automáticamente usando una prueba coagulom�trica de rutina, que se optimizó para material de muestra canino y est� basado en plasma deficiente de ser humano comercial (Mischke, 2001). Las medidas se llevaron a cabo en un analizador de coagulación AMAX Destiny (Trinity Biotech). Se incub� una mezcla de 20 μl de plasma citrado diluido (diluido 1:40 con tampón de imidazol, Siemens Healthcare Diagnostics), 20 μl de plasma deficiente en factor IX (Siemens Healthcare Diagnostics) y 20 μl de reactivo de activación (reactivo PTT�, Diagnostica Stago) y exactamente después de 3 minutos se añadieron 20 μl de solución de CaCl2 a 25 mmol/l (Diagnostica Stago) como reactivo de partida. Una curva de calibración se prepar� con diluciones diferentes de un plasma acumulado que corresponden al 200 % (1:20), 150 % (1:26,7), 125 % (1:32), 100 % (1:40), 75 % (1:53,3), 50 % (1:80), 25 % (1:160), 10 % (1:400), 5 % (1:800) y 1 % (1:4000) que se usaron en vez de la mezcla diluida. El plasma acumulado canino se prepar� mezclando alícuotas de plasma citrado idénticas a partir de 100 perros cl�nicamente sanos con perfil hematol�gico y bioquímico irrelevante y su actividad del factor IX se definió como el 100 %. Todos los resultados son valores promedio de medidas por duplicado. El intervalo de referencia para esta prueba es del 75-140 %.

Aislamiento y amplificación de ADN

El ADN gen�mico se extrajo con 200 μl de sangre entera de EDTA usando un kit comercialmente disponible Kit de Sangre de ADN Biosprint 15 (Qiagen) siguiendo las instrucciones de fabricantes. La secuencia de ADNc de factor IX canina se utilizó para buscar la base de datos del genoma del perro en NCBI y se determinaron los ocho exones del gen del factor IX canino. Nueve pares de cebadores oligonucleot�dicos (las secuencias y las condiciones de PCR se muestran en la Tabla 4) se usaron para amplificar la región codificante y los límites ex�n-intr�n del factor IX canino usando ADN gen�mico de los perros. Las secuencias objetivo se amplificaron en mezclas de reacción de 50 μl en condiciones de reacción convencionales que contienen aproximadamente 50 ng de ADN gen�mico y 0,2 μmol/l de cada cebador.

Secuenciaci�n de ADN

Los productos de PCR se purificaron antes de secuenciaci�n usando kit de purificación de PCR MinElute (Qiagen). Se

5 hizo la secuenciaci�n por secuenciaci�n cíclica usando Terminadores DyeDeoxy (Applied Biosystems) en un secuenciador automatizado Analizador Genético ABI 3130 (Applied Biosystems). Se llev� a cabo comparación de secuencias entre grupos diferentes de perros crestados rodesianos con est�tus de hemofilia B definido usando alineamiento de BLAD ClustalW.

Cribado rápido de la mutación de sentido alterado

10 Se dise�� un ensayo de genotipado TaqMan para la mutación usando File Builder Software Versión 3.1 (Applied Biosystems). La región que flanquea el SNP se amplificó en presencia de dos sondas fluorescentes específicas de alelos. Una sonda marcada con tinción VIC, detect� la secuencia del alelo de tipo silvestre y una sonda marcada con tinción FAM detect� la secuencia de alelo mutante. La amplificación de PCR y la discriminación al�lica se llev� a cabo usando Rotor-Gene 6000 (Corbett).

15 Alineamiento de secuencia de amino�cidos y análisis de dominios

El alineamiento de la estructura primaria del dominio de proteasa del factor IX canino con aquellas del factor IX humano, tripsina bovina, quimiotripsina bovina, elastasa porcina y calicre�na porcina estaba basado en la identidad de secuencia y la equivalencia topológica estructural y us� el programa Clustal (Larkin et al., 2007). Los análisis de dominio aplicaron SMART (Letunic et al., 2009) y ProSite (Sigrist et al., 2009), se hen descrito previamente los

20 procedimientos detallados (Gaudermann et al., 2006).

Modelizaci�n proteica estructural

La modelización proteica estructural aplicó modelos CPH (Lund et al., 2002) para generar un modelo estructural y us� PyMol (DeLano, 2002) para análisis gráficos.

Resultados

25 Identificación y cribado rápido de la mutación de sentido alterado

La comparación de la región codificante completa de la secuencia de ADN del factor IX canino y de las uniones ex�n-intr�n de seis perros hemofílicos con deficiencia de factor IX grave (N.�s: 1-6) con el ADN del factor IX canino de tipo silvestre revel� una mutación de sentido alterado G-A en el nucleótido 752 en el ex�n 7 del gen del factor IX hemofílico. Esta mutación da como resultado una glicina (GGA) para intercambio de ácido glut�mico (GAA) en el 30 dominio catalítico del factor XI hemofílico. Todos los perros afectados eran hemicigotos para la mutación detectada en el ex�n 7 (Tabla 2). Se encontr� que cuatro perras (N.�s: 7-10), que eran sospechosas de ser portadoras o portadoras demostradas, eran heterocigotas para la mutación G-A y ninguno de los perros crestados rodesianos sanos estaban afectados por la mutación. No se pudo observar ninguna alteración adicional en las secuencias entre perros afectados y el grupo control sano. En todos los casos de perros crestados rodesianos con est�tus de hemofilia B definido, el

35 resultado del ensayo de genotipado TaqMan confirm� el est�tus de hemofilia B y por lo tanto los resultados de análisis de secuenciaci�n. El análisis con ensayo de genotipado TaqMan no revel� la presencia de la mutación de sentido alterado G-A en el ex�n 7 del ADN del factor IX canino en 30 perros crestados rodesianos con est�tus de hemofilia B indefinido y 65 animales de otras tres razas de perros.

Alineamiento de secuencia de amino�cidos y análisis de dominios

40 El dominio catalítico de proteasas de serina similares a tripsina est� altamente conservado a lo largo de la evolución. El alineamiento de las secuencias de amino�cidos de los miembros de esta familia de proteasas demostr� que ciertos amino�cidos son homólogos entre mamíferos. La Fig. 1 mostr� el alineamiento de secuencias de amino�cidos de la cadena pesada del factor IX canino con la región correspondiente de varias otras serina proteasas (factor IX humano, tripsina bovina, elastasa porcina, quimiotripsina bovina, calicre�na porcina). La Fig. 1 demostr� que la mutación en el

45 factor XI canino afecta a uno de los amino�cidos altamente conservados, sustituyendo un residuo cargado negativamente (ácido glut�mico) por un amino�cido que no est� cargado y que no tiene ninguna cadena lateral (glicina). El análisis de dominios muestra, que la mutación del amino�cido 244 de G a E est� localizada en el dominio de tripsina del factor IX (Fig. 2). También est� directamente contigua a un puente disulfuro (residuos 243 y 259).

Modelizaci�n proteica estructural

50 El análisis de estructura muestra que un cambio en la conformación es más probable que ocurra dentro de la parte interna de la proteína localizada cerca del centro activo debido al hecho de que la mutación a ácido glut�mico conduce a una cadena lateral larga que necesita más espacio y perturba la estructura incluso más debido a su carga (Figs. 3 y 4). La mutación de residuo 244 conduce a un cambio en la estructura del sitio activo con forma de bolsillo del dominio de tripsina. La proximidad estructural es evidente. La mutación se encuentra directamente adyacente a un puente disulfuro que estabiliza el sitio activo y causa, debido a la estructura cambiada del amino�cido mutado, un cambio en la geometría del enlace disulfuro y as� también en el sitio activo.

Discusi�n

Los resultados del presente estudio revelan con certidumbre suficiente que la mutación de sentido alterado G-A en el

5 ex�n 7 es la mutación responsable de hemofilia B grave en perros crestados rodesianos. La presencia de mutación se confirm� por dos técnicas diferentes en 22 perros con est�tus de hemofilia B definido. Además, una cohorte de muestras de diferentes razas no mostr� la mutación observada. Los últimos resultados sugieren fuertemente que la mutación detectada no puede ser una mutación común y no importante.

El alineamiento de secuencias de amino�cidos y el análisis de modelización estructural de proteínas demuestra que en

10 los perros crestados rodesianos hemofílicos una sustitución aminoac�dica no conservada causada por la mutación conduce a un cambio principal en estructura y actividad:. En base al análisis estructural de la proteína creada por modelización proteica, la mutación detectada da como resultado más probablemente una reducción de actividad de factor IX, bien de acuerdo con la actividad de factor XI residual baja valorada en la prueba coagulom�trica funcional de aproximadamente el 1 % y con los signos cl�nicos graves correspondientes. Esto respalda adicionalmente la hipótesis

15 de que la mutación detectada es responsable de la hemofilia B en perros crestados rodesianos. Además, un cambio similar en el ADN canino da como resultado una afección clónica similar (Evans et al., 1989; Tabla 1).

Las actividades de IX medidas en los perros hemofílicos fueron más bajas que en la comunicación anterior de un perro crestado rodesiano hemofílico (al 4 %) (Lutze et al., 2000). En base a los criterios cl�nicos aplicados a seres humanos, la actividad de factor IX residual corresponde a un grado de gravedad de hemofilia grave (< 1 %) o moderadamente 20 grave (1-5 %) (Rizza, 1977) y en general, los perros parecen tener una clónica más grave a un grado definido de reducción de actividades de factores debido a su comportamiento discrepante (Mischke et al., 1996; Lutze et al., 2000). Además, la anormalidad estructural principal de la molécula de factor IX est� bien de acuerdo con el hecho de que un anticuerpo heter�logo contra el factor IX humano, que reacciona de forma cruzada con la molécula de factor canino normal IX, mostr� actividad reducida para unir en el dominio respectivo en la molécula de factor IX defectuosa en

25 perros crestados rodesianos afectados (Lutze et al., 2000). En el estudio citado, el perro crestado rodesiano hemofílico (actividad del factor IX: al 4 %) tuvo una concentración de ant�geno del 25 % y una portadora (actividad del factor IX: al 56 %) una concentración de ant�geno del 53 % de un plasma de reserva canino. El hecho de que un ELISA con un anticuerpo heter�logo se usase en este estudio puede haber potenciado este fenómeno.

Sin un origen genético conocido, el diagnóstico de portadoras hembra de un defecto es difícil. Aparte de análisis sobre

30 hermanos de camada ello se basa principalmente en mediciones de factores. El presente estudio demuestra que la actividad de factor IX en portadoras confirmada por análisis genéticos (valor máximo 69 %) puede alcanzar el límite inferior del intervalo de referencia (el 75 %). Es por lo tanto probable que en condiciones menos óptimas (por ejemplo, consignación de muestras para el laboratorio, prueba calibrada menos óptimamente), la detección de vehículo en base a medidas de actividad del factor IX es poco fiable. El ensayo de genotipado TaqMan desarrollado específico para la

35 mutación detectada es por lo tanto una herramienta valiosa para detección fiable de vehículos, que es esencial para programas de higiene de cría efectivos. A menos que ninguno de los 30 perros crestados rodesianos se probara positivo para la mutación, la investigación de números mayores de perros de esta raza parece valiosa para definir la prevalencia real de la enfermedad.

Conclusiones

40 Una mutación G-A de sentido alterado en el ex�n 7 del factor IX canino se identificó como la mutación probablemente responsable de hemofilia B grave en perros crestados rodesianos. Esta mutación da como resultado una glicina (GGA) para intercambio de ácido glut�mico (GAA) en el dominio catalítico del factor XI hemofílico.

Mientras las presentes invenciones se han descrito e ilustrado junto con un número de realizaciones específicas, los expertos en la técnica apreciarán que se pueden hacer variaciones y modificaciones sin apartarse de los principios de

45 las invenciones como se ilustran en el presente documento, según se reivindica. Se considera a todos los respectos que las realizaciones descritas son ilustrativas y no restrictivas. El alcance de las invenciones est�, por lo tanto, indicado por las reivindicaciones adjuntas, en vez de por la descripción precedente. Todos los cambios que entran dentro del significado y el intervalo de equivalencia de las reivindicaciones est�n englobados en su alcance.

Referencias citadas

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55 Gaudermann, P., Vogl, I., Zientz, E., Silva, F.J., Moya, A., Gross, R., Dandekar, T., 2006. Analysis of and function

Raza mezclada, originalmente cairn terrier y beagle (colonia de Chapel Hill)

Lhasa Apso

Labrador

Pit bull terrier

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Tabla 1

Raza Mutación en gen del factor IX canino Referencias

Una transición G → A en el nucleótido 1477 en la región que codifica el dominio catalítico (sustitución de ácido glut�mico por glicina)

La deleci�n incluye nucleótidos 772-776 y una transición C → T en el nucleótido 777

Deleci�n completa del gen del factor IX

Mutaci�n de deleci�n grande que va desde la región 5' completa del factor IX prolong�ndose hasta el ex�n 6

Inserci�n de 5 kb en el ex�n 8, que codifica con el ex�n 7 la región catalítica del factor XI.

Tabla 2

N�mero de perro

Número interno Se�alamiento, linajea , Signos cl�nicosb Actividad factor IX del Análisis de secuenciac TaqManc

1

P 1549 Macho, 3 meses - 1 a a

2

P 1551 Macho, 2 años 5 meses - <1 a a

3

P 1554 Macho, 1 año, 2 meses - 3 a a

4

P 1615 Macho, 6 meses (hermano del - 1 a a

n�mero 4, hijo del número: 10)

Evans et al. (1989)

Mauser et al. (1996)

Brooks et al. (1997)

Gu et al (1999)

Gu et al. (1999) Número Número Se�alamiento, linajea, Signos Actividad del Análisis de TaqManc de perro interno cl�nicosb factor IX secuenciac

5 P 1621 Macho, 6 meses (hermano del -1 a a

n�mero: 4, hijo del número: 10) 6 P 1867 Macho, 2 años, 8 meses -1 a a 7 N 983 Hembra, 2 años, 2 meses -48 c c 8 P 1520 Hembra, 2 años, 7 meses -62 c c 9 P 1552 Hembra, 5 meses -69 c c 10 P 1616 Hembra, 3 años, 2 meses -65 c c 11 N 909 Hembra, 1a�o, 7 meses -84 n n 12 N 910 Hembra, 1a�o, 6 meses -92 n n 13 N 988 Macho, 3 años, 4 meses -104 n n 14 N 989 Macho, 5 años, 1 mes -100 n n 15 156834 Macho, 7 años, 11 meses -154 n n 16 156854 Hembra, 2 meses -109 n n 17 P 1519 Hembra, 4 meses 77 n n 18 105960 Macho, 2 años, 2 meses -127 n n 19 Txxx Macho castrado, 2 años, 6 meses -110 n n 20 P 1943 Macho, 1 año, 1 mes -87 n n 21 158120 Macho castrado, 1 año, 9 meses -98 n n 22 148756 Macho, 7 años, 4 meses -150 n n

a Portadora confirmada, madre de los números 4 y 5 b Sangrado grave después de intervenciones quirúrgicas y heridas menores, sangrado espontáneo ocasional. c n = normal, c = portadora, a = afectado.

Tabla 3 Características predichas por ProSite para dominio de tripsina: DISULFID 243 259 Por similitud [condición: C-x*-C] ACT_SITE 258 Sistema de reguladores de cargas (por similitud) [condición: H]

[grupo: 1]

ACT_SITE 306 Sistema de reguladores de cargas (por similitud) [condición: D] [grupo: 1] DISULFID 373 387 Por similitud [condición: C-x*-C] DISULFID 398 426 Por similitud [condición: C-x*-C] ACT_SITE 402 Sistema de reguladores de cargas (por similitud) [condición: S]

[grupo: 1] Característica ausente: DISULFID 342 408 Por similitud [condición no cierta: C-x*-C]

Tabla 4

Cebador

Sec ID N.�: Secuencia (5'→3') Unión Temperatura defusi�n

cFIXg-for-1

4 TGTGTCACTTCCGGCTTCAG Intr�n 1 58 �C

cFIXg-rev-1

5 TCTACAGCTAGAAGACAAGCATAC Intr�n 2

cFIXg-for-2

6 GATAAATTGGCTTTGGGATTACTTGG Intr�n 2 58 �C

cFIXg-rev-2

7 GTACTTTGCATCTGAAGAACATTACG Intr�n 3

cFIXg-for-3

8 GCAGTTTTGAAGAAGCACGGG Ex�n 2 58 �C

cFIXg-rev-3

9 ACACAGAGAAAAGATACCTAATTCTCA Intr�n 4

cFIXg-for-4

10 AAGACAGGGGCATCCCATAATC Intr�n 4 58 �C

cFIXg-rev-4

11 CTTCCATTAAGTGTTCCTTACCAC Intr�n 5

cFIXg-for-5

12 CTCCCAAGCCTCTTTCCATG Intr�n 5 58 �C

cFIXg-rev-5

13 CAAACAGGGTTTATGAAAGTATGTGAAC Intr�n 6

cfix-g-6-for

14 CCGCTTGCCAATGAAAAATA Intr�n 6 58 �C

cfix-g-6-rev

15 CTCTGGGCTCCAGTTTTGAC Intr�n 7

cFIXg-for-7

16 ACACCCCTGCCTATCAACAG Intr�n 7 58 �C

cFIXg-rev-7

17 GCTCCTCTAGCATTAGCCC Intr�n 8

cFIXg-for-8

18 CCTTGGCAAATACGTTTATGTGTAAG Intr�n 8 58 �C

cFIXg-rev-8

19 TCATGGAAGCCAGCACAGAAC Ex�n 8

cfix-g-9-for

20 TTCCTCAAATTTGGGTCTGG Ex�n 8 58 �C

cfix-g-9-rev

21 CCTAAACGTGTCAACCTTGGA Ex�n 8

Listado de secuencias

<110> LABOKLIN GmbH & Co. KG

<120> Prueba genética para predisposición genética de hemofilia B en perro crestado rodesiano 5 <130> Documento W/LAO-006-EP-2

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3080 10 <212> ADN

<213> Canis familiaris

<220>

<221> gen

<222> (1)..(3080) 15 <223> F9

factor de coagulación IX ID de gen: 404015

<220>

<221>

CDS 5 <222> (22)..(1380)

<223> /protein_id="NP_001003323.1" /db_xref="GI:50979168" /db_xref="GeneID:404015"

<220>

<221>

mutación 10 <222> (752)..(752)

<223> G= tipo silvestre; A= hemofilia B

<400> 1

<210>2

<211> 452

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 2

<210>3

<211> 452

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<220>

<221> mutación

<222> (244)..(244)

<223> G = tipo silvestre; E = hemofilia B

<400> 3 <210>4

<211> 20

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador cFIxg-for-1

<400> 4

tgtgtcactt ccggcttcag 20 10 <210> 5

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

5

<223> Cebador cFIXg-rev-1

<400> 5

tctacagcta gaagacaagc atac

24

<210> 6

<211> 26

10

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador cFIXg-for-2

<400> 6

15

gataaattgg ctttgggatt acttgg 26

<210> 7

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> Cebador cFIXg-rev-2

<400> 7

gtactttgca tctgaagaac attacg

26

<210> 8

25

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador cFIXg-for-3

30

<400> 8

gcagttttga agaagcacgg g

21

<210> 9

<211> 27

<212> ADN

35

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador cFIXg-rev-3

<400> 9

acacagagaa aagataccta attctca

27

<210> 10

<211> 22

5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador cFIXg-for-4

<400> 10

10

aagacagggg catcccataa tc 22

<210> 11

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Cebador cFIxg-rev-4

<400> 11

cttccattaa gtgttcctta ccac

24

<210> 12

20

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador cFIxg-for-5

25

<400> 12

ctcccaagcc tctttccatg

20

<210> 13

<211> 28

<212> ADN

30

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador cFIXg-rev-5

<400> 13

caaacagggt ttatgaaagt atgtgaac

28

35

<210> 14

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador cfix-g-6-for

<400> 14

5

ccgcttgcca atgaaaaata 20

<210> 15

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10

<220>

<223> Cebador cfix-g-6-rev

<400> 15

ctctgggctc cagttttgac

20

<210> 16

15

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador cFIXg-for-7

20

<400> 16

acacccctgc ctatcaacag

20

<210> 17

<211> 19

<212> ADN

25

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador cFIxg-rev-7

<400> 17

gctcctctag cattagccc

19

30

<210> 18

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

35

<223> Cebador cFIXg-for-8

<400> 18

ccttggcaaa tacgtttatg tgtaag

26

<210> 19

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Cebador cFIxg-rev-8

<400> 19

tcatggaagc cagcacagaa c

21

<210> 20

10

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador cfix-g-9-for

15

<400> 20

ttcctcaaat ttgggtctgg

20

<210> 21

<211> 21

<212> ADN

20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador cfix-g-9-rev

<400> 21

cctaaacgtg tcaaccttgg a

21

25

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   El gen de factor IX canino aislado de acuerdo con la Sec ID N.�: 1 que tiene una mutación puntual, en el que el nucleótido 752 es A en vez de G.

2. 2.

   Procedimiento de análisis de un genotipo de un perro con respecto de hemofilia B por un ensayo genético para

   5 identificación de al menos una mutación puntual en la Sec ID N.�: 1 del genoma del perro, en el que al menos una mutación puntual conduce a un intercambio aminoac�dico en la posición 244 de factor IX canino, en el que una mutación puntual es una mutación puntual en nucleótido 752 y en el que la mutación puntual en nucleótido 752 es una mutación puntual, donde el nucleótido 752 es A en vez de G y en el que al menos esta mutación puntual define el genotipo del perro con respecto a hemofilia B.

   10 3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la PCR se usa para amplificación de una región de Sec ID N.�: 1, que contiene la mutación puntual del nucleótido 752.

3. 4.

   Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 o 3, en el que el perro es un crestado rodesiano.

4. 5.

   Procedimiento para la determinación de la predisposición genética para hemofilia B de un perro, caracterizado por el uso del gen del factor IX canino del perro de acuerdo con la Sec ID N.�: 1 que tiene una mutación puntual en Sec

   15 ID N.�: 1 del genoma del perro, en la que al menos una mutación puntual conduce a un intercambio aminoac�dico en la posición 244 del factor XI canino y en la que una mutación en un punto es una mutación puntual, en la que el nucleótido 752 es A en vez de G y en la que al menos esta mutación puntual determina la predisposición genética para hemofilia B del perro.
5. 6. Uso del procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 para la selección de un perro crestado rodesiano para 20 reproducción.