ES2455491A1

ES2455491A1 - Cepa de hongo Hormonema sp. CECT 13092 y procedimiento de aplicación para la deslignificación de biomasa lignocelulósica

Info

Publication number: ES2455491A1
Application number: ES201430065A
Authority: ES
Inventors: Juan Antonio MARTÍN GARCÍA; David MACAYA SANZ; María Eugenia EUGENIO MARTÍN; Raquel MARTÍN SAMPEDRO; Úrsula FILLAT LATORRE; David Ibarra Trejo
Original assignee: Universidad Politecnica de Madrid; Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria INIA
Current assignee: Universidad Politecnica de Madrid; Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria INIA
Priority date: 2014-01-23
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2014-04-15
Anticipated expiration: 2034-01-23
Also published as: ES2455491B2; WO2015110680A1

Abstract

Cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2 y procedimiento de deslignificación de biomasa lignocelulósica, en el que se aplica a dicha biomasa lignocelulósica una cepa de hongo depositada con el número de depósito CECT 13092 o un crudo enzimático aislado de una cepa de hongo depositada con el número de depósito CECT 13092. En dicho procedimiento, se biopulpea la biomasa realizando un pasteado kraft, se bioblanquea realizando un blanqueo con peróxido de hidrógeno o se utiliza la biomasa deslignificada para producir bioetanol.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de la invención está relacionado de forma general con la industria de la celulosa y la fabricación de papel. Específicamente, en la presente invención se describe una cepa de hongo eficaz en diferentes aplicaciones relacionadas con la industria de la celulosa, concretamente en los procesos de biopulpeo, bioblanqueo y producción de bioetanol.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los hongos endófitos habitan los tejidos asintomáticos de las plantas, viviendo en simbiosis con sus hospedantes. Estos hongos representan una elevada diversidad fúngica de magnitud desconocida. Esto les convierte en fuentes potenciales de herramientas biotecnológicas para múltiples usos.

Tras la muerte de la planta o de alguno de sus órganos, ciertos endófitos pasan de un estado de latencia a otro de colonizadores primarios dominantes en la descomposición de los tejidos. La posterior aparición de hongos saprófitos secundarios que colonizan el sustrato conduce frecuentemente a la desaparición de los endófitos, que parecen tener diferentes habilidades degradadoras que los anteriores. Los mecanismos de degradación de la madera por los hongos endófitos no están claros, aunque se piensa que existe una alta diversidad en la forma que diferentes endófitos degradan a sus hospedantes y sus sustratos.

Los hongos saprófitos secundarios han sido ampliamente investigados como herramientas biotecnológicas para mejorar procesos y disminuir contaminantes en la industria de la celulosa y en la producción de bioetanol. Aunque su uso ha mostrado ciertos beneficios, su aplicación a escala industrial no está aún optimizada en la mayoría de los casos. En este sentido, la cepa de hongo endófito descrita en la presente invención ha demostrado tener una capacidad deslignificante superior a un saprófito de referencia (Trametes sp I-62) en el caso del biopulpeo.

La actividad altamente específica de los hongos endófitos, como degradadores primarios de materiales lignocelulósicos a los que están adaptados por procesos evolutivos, podría facilitar la posterior actuación degradadora de los saprófitos secundarios. Por ello, es esperable que su aplicación tecnológica en los procesos industriales como etapa previa o en combinación con saprófitos secundarios, mejore los rendimientos actualmente obtenidos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La realización preferida de la invención consiste en una cepa de hongo Hormonema sp depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2, en adelante cepa de la invención.

La cepa CECT 13092 ha sido depositada el 16 de octubre de 2013 en la autoridad internacional de depósito Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con dirección en Parc Científic Universitat de València, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia, España), por la Universidad Politécnica de Madrid, con dirección en Ramiro de Maeztu, 7, 28040, Madrid (España).

La cepa CECT 13092 ha sido identificada por el depositante mediante la referencia AS3-R3, y recibió el número de depósito CECT 13092 por la autoridad internacional de depósito. En la presente solicitud, se hace referencia a la cepa CECT 13092 mediante los términos “cepa CECT 13092”, “AS3-R3” o “AS3R3”.

La cepa CECT 13092 es un hongo endófito aislado a partir de una rama de eucalipto (Eucalyptus globulus Labill.) recogida en el concejo de Llanes (Asturias) en septiembre de 2012. El aislamiento inicial se realizó utilizando como medio de cultivo rosa de bengala y cloranfenicol, agar. Posteriormente se repicó a extracto de malta, agar.

La clasificación taxonómica de la cepa de hongo endófito CECT 13092 se realizó mediante sus características morfológicas y mediante la secuenciación de su ADN.

Morfológicamente se trata de un hongo que en extracto de malta-agar crece inicialmente con un color blanquecino o amarillento y posteriormente adquiere una tonalidad oscura, casi negra, y un aspecto ceroso. La colonia combina zonas en las que el hongo crece predominantemente en forma de hifa y otras donde crece en forma de levadura. Las colonias crecen lentamente, alcanzando los 2 cm de diámetro trascurridos 15-20 días. Las hifas son densamente septadas y los conidios son hialinos, sin septos, usualmente elipsoidales y de tamaño heterogéneo, siendo el rango más habitual 5-7 x 2,5-3,5 µm. No se observó la presencia de conidióforos. Las células conidiógenas de las hifas normalmente no se diferencian de las que componen el resto del micelio. Los conidios se suelen observar en proceso de gemación, originando uno o dos conidios secundarios que se acumulan en masas de aspecto de levadura.

Atendiendo a la morfología de la colonia, la cepa se puede clasificar como perteneciente al grupo de hongos dematiáceos conocido como levaduras negras, miembros imperfectos de los Dothideales (Ascomicetos). Este grupo incluye diferentes géneros y especies de hongos que son difíciles de clasificar e identificar por métodos microscópicos.

Se aisló el ADN nuclear, posteriormente se amplificó y se secuenció la región ITS (del inglés Internal Transcribed Spacers) del hongo. La secuencia parcial de la región ITS1 del hongo es la SEQ ID NO: 1 y la secuencia completa de la region ITS2 del hongo es la SEQ ID NO:

2. Tras comparar esta secuencia con las existentes en Genebank usando el programa Blast, la secuencia identificada con mayor similitud corresponde a Dothideomycetes, y como especie Hormonema sp. (identities: 98%; gaps: 0%). La secuencia del hongo no apareció cercana a la de dos especies del género Hormonema frecuentes en la Península Ibérica, como son H. carpetanum y H. dematioides.

Otra realización preferida es un procedimiento de deslignificación de biomasa lignocelulósica, donde se aplica a dicha biomasa lignocelulósica una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2 o un crudo enzimático aislado de una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2, en adelante procedimiento de la invención.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha biomasa lignocelulósica se biopulpea aplicando a dicha biomasa lignocelulósica una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2 y realizando un pasteado kraft. De forma particular, el procedimiento de la invención comprende incubar dicha cepa con dicha biomasa lignocelulósica entre 18 y 38 días a una temperatura entre 18 y 28 ºC.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha biomasa lignocelulósica se bioblanquea aplicando a dicha biomasa lignocelulósica un crudo enzimático aislado de una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2, y realizando un blanqueo con peróxido de hidrógeno.

Otra realización es el procedimiento de la invención, que comprende:

(a): aplicar dicha cepa a dicha biomasa lignocelulósica, y

(b): utilizar la biomasa resultante de la etapa (a) para producir bioetanol.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha biomasa lignocelulósica es de olmo, álamo, chopo, eucalipto, pino, picea, paja de trigo, paja de cebada, poda de naranjo, poda de olivo y/o Hesperaloe funifera.

TEXTO LIBRE DE LA LISTA DE SECUENCIAS

A continuación se aporta una traducción del texto libre en inglés que aparece en la lista de secuencias.

SEQ ID NO: 1. ITS1 de Hormonema sp. CECT 13092; secuencia parcial. SEQ ID NO: 2. ITS2 de Hormonema sp. CECT 13092; secuencia completa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Producción de actividad lacasa de la cepa CECT 13092 en medio 7 Czapek-Dox modificado en presencia de CuSO4 0,30 mM y 1% de etanol.

Figura 2. Actividad enzimática del crudo de la cepa CECT 13092 medida con ABTS a distintos pHs.

Figura 3. Actividad enzimática residual del crudo incubado a distintos pHs y temperatura de 40 y 50ºC a lo largo del tiempo. pH=2 y 40 ºC (círculos negros), pH=3 y 40 ºC (círculos blancos), pH=4 y 40 ºC (triángulos negros), pH=2 y 50 ºC (triángulos blancos), pH=3 y 50 ºC (cuadrados negros) y pH=4 y 50 ºC (cuadrados blancos).

Figura 4. Número kappa obtenidos tras los procesos de biopulpeo ensayados con el hongo endófito seleccionado y secuencias de hongos.

Figura 5. Blancura (%ISO) obtenidas tras los procesos de biopulpeo ensayados con el hongo endófito seleccionado y secuencias de hongos.

Figura 6. Propiedades mecánicas obtenidas tras los procesos de biopulpeo ensayados con el hongo endófito seleccionado y secuencias de hongos.

Figura 7. Azúcares reductores obtenidos tras la sacarificación enzimática de astillas pretratadas con el hongo endófito seleccionado y secuencias de hongos.

MODOS DE REALIZACIÓN PREFERENTE

Ejemplo 1. Aislamiento de hongos endófitos El aislamiento de hongos endófitos se realizó a partir de ramillos de Eucalyptus sp. de 1 a 3 cm de diámetro, recogidos en las provincias de Huelva, Cáceres, Asturias y Cantabria. Se muestrearon cuatro árboles en cada provincia. Todo el proceso de aislamiento tuvo lugar en una cámara de flujo laminar para evitar contaminaciones. Se procedió a la desinfección superficial de los ramillos sumergiéndolos 30 segundos en etanol al 70%, 5 minutos en hipoclorito de sodio al 4 % y 15 segundos en etanol al 70%. Mediante esta técnica de desinfección se comprobó que los epífitos eran eliminados eficazmente de los tejidos superficiales. A continuación, se dejaron secar durante 10 minutos, y se eliminó la parte más externa de la corteza (1-2 mm). Se cortaron porciones del tejido de floema y xilema, de aproximadamente 5 x 5 mm de superficie y 1-2 mm de grosor, que fueron sembradas en placas Petri conteniendo diferentes medios de cultivo, con el fin de abarcar un amplio rango de pHs (extracto de malta-agar, extracto de patata-dextrosa-agar, extracto de levadura-agar, extracto de rosa de bengala-agar con cloranfenicol, y madera de eucalipto triturada-agar). Las placas fueron selladas con parafilm y se incubaron en oscuridad a 22°C en una cámara de cultivo. Transcurridos 7 y 14 días desde el aislamiento, se anotaron las colonias de hongos crecidas y se procedió al aislamiento individual de cada cepa en nuevas placas con extracto de malta-agar mediante repicado.

Ejemplo 2. Screening en medio sólido Se realizó un screening en medio sólido de actividad oxidativa haciendo crecer a los hongos en placas que contenían medio basal LBM en presencia de agar y ABTS (2,2’azino-bis-3etil-benzotiazolin-6-sulfonato). El medio sólido utilizado consistió en KH2PO4 1g/L, C4H12N2O6 0.5g/L, CuSO4•5H2O, 0,001g/L, MgSO4•7H2O 0,5g/L, Fe2(SO4)3 0.001g/L, CaCl2•2H2O 0.01g/L, MnSO4•H2O 0,001g/L, extracto de levadura 0,01g/L, agar 16g/L y ABTS 0,5g. De los 135 hongos de los que se partió, 21 de ellos presentaron valores positivos de actividad oxidativa en placa al aparecer una coloración verde-azulada de diferente intensidad, según la muestra, debido a la oxidación del ABTS.

Ejemplo 3. Screening en medio líquido El screening en medio líquido se centró en la actividad lacasa, que ha demostrado su eficacia en los procesos de deslignificación. Por ello, los 21 hongos que dieron positivo en medio sólido se cultivaron en varios medios líquidos con inductores de lacasa [medio Kirk modificado (sacarosa 10g/L, KH2PO4 2g/L, aspargina 1g/L, tiamina•HCl 1mg/L, MgSO4•7H2O 0,5g/L, alcohol veratrílico 57µL/L, CaCl2•2H2O 0,1g/L, elementos traza, cobre (CuSO4 0,27mM) y paja de trigo (10g/L); y medio 7 Czapek-Dox modificado (glucosa 10g/L, KH2PO4 1g/L, C4H12N2O6 2g/L, extracto de levadura 1g/L, MgSO4•7H2O 0,5 g/L, KCl 0,5g/, elementos traza, cobre a dos concentraciones (CuSO4 0,15 o 0,30mM) y con/ sin adición de etanol (0 o 1% de etanol)].

Los cultivos líquidos se incubaron a 22ºC y 120 rpm realizándose un seguimiento de la actividad lacasa durante 35 días. La actividad lacasa se midió siguiendo espectrofotométricamente la oxidación de ABTS (2,2’azino-bis-3-etil-benzotiazolin-6sulfonato) 5mM en tampón acetato sódico 100 mM, pH 4,0.

Siete hongos presentaron actividad lacasa en alguno de los medios líquidos utilizados. La muestra de la cepa AS3-R3 (CECT 13092) presentó uno de los valores más altos de actividad, en el medio 7 Czapek-Dox modificado con CuSO4 0,30mM y 1% de etanol (Figura 1).

Ejemplo 4. Estudio de actividad enzimática óptima y estabilidad al pH y a la temperatura Para determinar las condiciones óptimas de aplicación del crudo enzimático de la cepa CECT 13092 al bioblanqueo de pastas de celulosa, se realizaron estudios de actividad enzimática óptima y estabilidad al pH y a la temperatura. Para ello, se utilizó el crudo obtenido al filtrar los cultivos de la cepa CECT 13092 crecidos en el medio 7 Czapek-Dox modificado con CuSO4 0,30mM y 1% de etanol. En la Figura 2 se observa que el crudo de la cepa CECT 13092 presenta la máxima actividad enzimática (medida a partir de la oxidación de ABTS 5mM en diversos tampones 100mM) a pHs inferiores a 3, aunque entre 3 y 5 todavía es bastante activa. El crudo de la cepa CECT 13092 se incubó con diferentes tampones 50mM (pH 2, 3 y 4) y a las temperaturas de 40ºC y 50ºC durante 24 h. El crudo enzimático resultó ser bastante estable a pH 4 y 40ºC, un aumento de temperatura de 10ºC supone una mayor desactivación. La incubación del crudo a pHs inferiores a 3 produce una rápida e importante pérdida de actividad enzimática durante la primera hora (Fig. 3).

Ejemplo 5. Uso de hongos endófitos en el proceso de pasteado (biopulpeo) El biopulpeo consiste en la aplicación de un pre-tratamiento biológico a las astillas que modifique su estructura y composición con el fin de facilitar la separación de las fibras o la deslignificación en una etapa posterior de pasteado mecánico o químico, respectivamente. Con este objetivo, el hongo endófito utilizado en este trabajo en el biopulpeo de astillas de eucalipto fue aquel que dio mejores resultados (cepa CECT 13092) en un estudio preliminar de biopulpeo con distintos hongos endófitos seleccionados a partir de su capacidad oxidativa (mayor coloración) en el screening en medio sólido.

Para llevar a cabo el proceso de biopulpeo, se inocularon 200g de astillas de eucalipto con 200 ml de preinóculo del hongo endófito seleccionado o de un hongo saprófito de referencia (Trametes sp I-62), y se agitaron a 125 rpm durante 28 días a 23ºC. También se realizaron ensayos de biopulpeo en serie donde las astillas fueron inoculadas de la misma manera que en el caso anterior pero en primer lugar con el hongo endófito y a continuación con el hongo saprófito de referencia (Trametes sp I-62), con la idea de plasmar el proceso natural de degradación de la madera por dichos hongos. Una vez finalizado el tratamiento fúngico, las astillas fueron lavadas con tampón acetato para eliminar el micelio superficial del hongo y una vez filtradas se dejaron secar a temperatura ambiente. Posteriormente, se llevó a cabo un proceso standard de pasteado kraft en las siguientes condiciones: 80 g de astillas secas, 4 L/kg relación líquido/sólido, 16% álcali activo, 20% sulfidez, 160 ºC de temperatura de cocción y 60 min de tiempo para alcanzar la temperatura máxima. El tiempo a la máxima temperatura fue ajustado para llegar a un factor H (variable que relaciona temperatura y tiempo) de 430 en cada caso. Se realizaron ensayos controles de pasteado con astillas que no habían sido tratadas con ningún tipo de hongos. En todos los casos, se determinó el consumo de reactivos y el rendimiento del proceso. Además, las pastas obtenidas fueron evaluadas según el número kappa (grado de deslignificaión) de acuerdo a la norma UNE 57034 y la viscosidad (grado de polimerización) según UNE 57-039-92. Finalmente, se formaron hojas de papel según ISO 5269-2 a partir de las pastas obtenidas y se evaluaron sus propiedades ópticas y mecánicas (blancura según ISO 2470 y los índices de tracción, estallido y desgarro según ISO 5270).

Los principales resultados obtenidos están representados en las Figuras 4-6.

Como puede observarse en la Figura 4, el número kappa fue menor (mayor deslignificación) cuando las astillas fueron pretratadas únicamente con el nuevo hongo endófito seleccionado obteniéndose una mejora del 26,7% respecto al control (astillas no pretratadas), mayor incluso que la obtenida cuando el hongo saprófito fue utilizado por sí solo (9.3%). Sin embargo, la aplicación de un saprófito de referencia (Trametes sp I-62) en secuencia a el hongo endófito, no parece favorecer el proceso de deslignificación.

Puede observarse en la Figura 5 que los valores de blancura están en concordancia con los obtenidos en el número kappa. Así, la mayor blancura fue obtenida cuando las astillas fueron tratadas únicamente con el hongo endófito seleccionado, presentando una mejora de 8,3 ptos en blancura %ISO comparado al control. Esta mejora fue también mayor que la obtenida cuando el saprófito de referencia se utiliza solo como pretratamiento (4.7 ptos en blancura %ISO). Nuevamente, como ocurría con el número kappa, la secuencia ensayadas de endófito + saprófito no parecen mejorar la blancura de las pastas.

En ninguno de los experimentos ensayados se observó una disminución importante en la viscosidad de las pastas obtenidas (resultados no mostrados), indicando que el hongo seleccionado es selectivo hacia la lignina y no degrada significativamente a la celulosa. Estos datos se corroboran con los valores obtenidos en las propiedades mecánicas de las hojas de papel realizadas a partir de las pastas. Como puede observarse en la gráfica 6, no existe una variación significativa en ninguna de las propiedades mecánicas ensayadas.

Por todos los resultados anteriores se puede concluir que el hongo endófito ensayado en el proceso de biopulpeo de eucalipto, la cepa CECT 13092, proporciona valores de deslignificación y blancura superiores incluso a uno de los hongos saprófitos más referenciados (Trametes sp I-62) en los procesos de biopulpeo y no disminuyendo significativamente la calidad de las pastas obtenidas (como puede comprobarse por la viscosidad y propiedades mecánicas) aunque con una pérdida de rendimiento del proceso del 9% (debido a la eliminación de lignina). Además, fue capaz de reducir en un 9% el consumo de sosa durante el proceso de pasteado kraft.

Ejemplo 6. Uso de hongos endófitos en el proceso de blanqueo de pastas celulósicas (bioblanqueo)

Varias razones han motivado la aplicación de la biotecnología en los procesos de blanqueo. Por un lado, existen razones medioambientales, como la reducción de la carga contaminante derivada de la disminución en el consumo de reactivos clorados (en secuencias ECF). Por otro lado, las razones técnicas incluyen el aumento de selectividad hacia la lignina (en las secuencias TCF), la economía de reactivos de blanqueo y la mejora de la calidad de las pastas al obtenerse mayores blancuras. Sin embargo, la aplicación directa de microorganismos que se emplean en el biopulpeo, tendría consecuencias indeseables en el bioblanqueo, como la degradación de la celulosa o la contaminación de las pastas con sustancias que acompañan o son producidas por los hongos. Por ello, la búsqueda, selección y posible modificación de enzimas producidas por tales hongos implicadas en la degradación de lignocelulosa para adecuarlas a las condiciones industriales del blanqueo de pastas representa uno de los campos de investigación con mayor potencial en esta industria. De entre todas estas enzimas, las lacasas junto con mediadores, son las que han dado resultados más prometedores en los procesos de blanqueo. Sin embargo, el proceso aún no se ha implantado a escala industrial debido principalmente al alto coste/toxicidad de los mediadores sintéticos y a las condiciones del tratamiento enzimático que deben cumplir los requerimientos exigidos por la industria. Para solucionar estos problemas, una intensa búsqueda de mediadores y nuevas lacasas que presenten características físico-químicas óptimas para su aplicación industrial se está llevando a cabo.

Es por ello que en la presente invención se ha utilizado un crudo enzimático enriquecido en actividad lacasa obtenido a partir de un nuevo hongo endófito aislado para llevar a cabo los procesos de bioblanqueo. El hongo endófito seleccionado para tal fin fue AS3-R3 (cepa CECT 13092), uno de los que proporcionó una mayor actividad lacasa en el screening en medio líquido (ejemplo 3) cuando fue crecido en medio 7 Czapek-Dox modificado y en presencia de los inductores de lacasa CuSO4 a 0,30mM y etanol al 1%.

Antes de llevar a cabo los procesos de bioblanqueo, los cultivos líquidos se incubaron a 22ºC y 120 rpm durante 30 días, momento en el que presentaron la máxima actividad lacasa. El crudo se congeló para su almacenamiento y posteriormente se descongeló y el micelio se separó por centrifugación a 13000 rpm y a una temperatura de 4ºC. A continuación, el crudo se filtró con un filtro de 0,22µm y finalmente se concentró en un equipo de ultrafiltración tangencial que dispone de una membrana con un corte molecular de 5 kDa (Membrane Cassette, Filtron) y se congeló hasta su uso. Mediante este procedimiento se consiguió concentrar el crudo unas 20 veces.

Finalmente, los ensayos de bioblanqueo se llevaron a cabo utilizando dicho crudo concentrado y en presencia del mediador natural acetosiringona. Dichos ensayos se efectuaron en reactores a presión con 15 g de pasta cruda industrial de eucalipto en una solución tamponada 50 mM de tartrato sódico a pH 4 y 40ºC (fijado según estudios de estabilidad del crudo enzimático utilizado-ejemplo 4) y en las siguientes condiciones: 5 U/g de pasta de lacasa, 1% de mediador sobre pasta seca, presión de oxígeno de 2 kg/cm2, un tiempo de 4 horas y unas gotas de Tween 80. Paralelamente, también se realizó un bioblanqueo con lacasa comercial (Novozyme 51003) del hongo saprófito Myceliophtora thermophila en una solución tamponada de fosfato sódico 50mM a pH 7 (fijado según la hoja de especificaciones del suministrador) en las mismas condiciones que el bioblanqueo anterior. Se realizaron además ensayos control (sin adición de lacasa ni mediador) en ambos casos. Al finalizar el tiempo de tratamiento, las pastas se sometieron a un lavado exhaustivo.

Después del bioblanqueo se llevó a cabo una etapa de blanqueo con peróxido de hidrógeno, con el fin de evaluar la eficacia del pretratamiento biológico, en las siguientes condiciones: 10 g de pasta seca, H2O2 3% odp, NaOH 1,5% odp, DTPA 1% odp, MgSO4•7H2O 0,2% odp, consistencia 5%, temperatura 90 ºC y tiempo de tratamiento de 90 min. Finalmente, las pastas blanqueadas obtenidas se caracterizaron en términos de número kappa según la normativa ISO 5351-1. Y se midieron también sus propiedades ópticas (blancura según norma ISO 2470 y coordenadas cromáticas CIE L*a*b* según norma T 527).

Los resultados obtenidos al final de la secuencia con peróxido de hidrógeno se muestran en la Tabla 1. La pasta obtenida en el blanqueo que incluye el pretratamiento con el hongo endófito AS3-R3 (cepa CECT 13092) y mediador natural acetosiringona presenta 0,5 puntos menos en número kappa y 3,3%ISO más de blancura que la secuencia control sin crudo ni mediador. En cambio, el pretratamiento con lacasa comercial de Myceliphtora thermophila y acetosiringona no mejoró significativamente las propiedades de las pastas respecto al tratamiento control.

Tabla 1. Propiedades de las pastas obtenidas después de la secuencia de blanqueo con peróxido de hidrógeno.

Número kappa: Blancura (%ISO) L* a* b*

pasta cruda: 16,4 32,1 72,3 2,68 15,7

control pH4: 10,1 46,5 82,9 1,69 15,8

AS3-R3 (cepa CECT 13092) + acetosiringona: 9,6 49,9 85,3 0,98 16,4

Ejemplo 7. Producción de bioetanol El continuo aumento de la demanda energética mundial basada fundamentalmente en la utilización de combustibles fósiles crea la necesidad de desarrollar fuentes de energías alternativas y renovables. En este contexto, la biomasa constituye una de las fuentes de energía claves para reducir la dependencia de los combustibles fósiles. La producción de bioetanol a partir de la biomasa lignocelulósica se basa en la obtención de azúcares fermentables a partir de los polisacáridos que la componen. El proceso de producción de bioetanol basado en la hidrólisis enzimática consta generalmente de las siguientes etapas: pretratamiento, hidrólisis enzimática y fermentación. Las características estructurales de la biomasa lignocelulósica hace necesaria una etapa previa o pretratamiento cuyo objetivo fundamental es alterar la estructura lignocelulósica y aumentar su digestibilidad en la etapa de hidrólisis enzimática. Sin embargo, la mayoría de los pretratamientos implican una demanda energética elevada, alto capital de inversión, degradación de azúcares y generación de compuestos de degradación que afectan de forma negativa a los procesos de hidrólisis enzimática y fermentación. Como alternativa a estas tecnologías se plantea el uso de microorganismos que degradan la lignina y/o la hemicelulosa y, como consecuencia, aumentan la accesibilidad de la celulosa al ataque enzimático. Las ventajas de los pretratamientos biológicos son su bajo coste de inversión y energético, el mínimo requerimiento de reactivos químicos y las suaves condiciones a las que se realiza el proceso. Una amplia variedad de hongos saprófitos han sido probados como pretratamientos en la producción de biotetanol. Sin embargo, la búsqueda de nuevos hongos que demuestren una mayor eficacia y una posible implementación industrial es uno de los campos en los que se está investigando en la actualidad. En este contexto, la aplicación de la nueva cepa de hongo endófito como pretratamiento para aumentar el rendimiento de la posterior hidrólisis enzimática ha sido ensayada.

Para ello, las astillas de eucalipto han sido inoculadas de forma similar a la realizada en el pretratamiento mencionado para un posterior proceso de pasteado (ejemplo 5) con una única modificación: el tamaño de astillas, que en este caso ha sido inferior (1-2 mm de ancho y 1-1.5 cm de largo). El tratamiento biológico también ha sido llevado a cabo en las

mismas condiciones que en el caso del pretratamiento biológico para un posterior proceso de pasteado. Posteriormente, se realizó un tratamiento con 0.1% NaOH (50ºC, 5% consistencia, durante 1 hora) para eliminar la lignina modificada por el hongo, seguido de un lavado con agua destilada. Por último, se llevaron a cabo ensayos de hidrólisis enzimática 5 para evaluar la eficacia de los pretratameintos biológicos en las siguientes condiciones: 5% (s/l) de astillas pretratadas, 50ºC, pH 5, durante 72h con una agitación de 150 rpm y una carga de enzima de 15 FPU/g de sustrato tanto de Novozyme 510013 (preparación de enzimas celulolíticas comercial) como de Novozyme 510010 (preparación comercial de βglucosidasa). Los azúcares obtenidos, que serán convertidos en el proceso de fermentación

10 a etanol, se determinaron utilizando reactivo DNS (ácido 3,5-dinitrosalicilico) para determinar los azúcares reductores.

Los resultados obtenidos mostraron una mejora en la sacarificación enzimática del eucalipto, cuando se aplicó la cepa de hongo endófito seleccionado, respecto al control sin

15 tratamiento, como muestra la Figura 7. Sin embargo, estas mejoras fueron menores que las que proporcionó el hongo saprófito de referencia. En cuanto al tratamiento en serie, endófitos + saprófito, no proporcionó mejoras respecto al control, como ocurría en el caso del biopulpeo.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2.
2.

Procedimiento de deslignificación de biomasa lignocelulósica, caracterizado por que se aplica a dicha biomasa lignocelulósica una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2 o un crudo enzimático aislado de una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2.
3.

Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicha biomasa lignocelulósica se biopulpea aplicando a dicha biomasa lignocelulósica una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2 y realizando un pasteado kraft.
4.

Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que comprende incubar dicha cepa con dicha biomasa lignocelulósica entre 18 y 38 días a una temperatura entre 18 y 28 ºC.
5.

Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicha biomasa lignocelulósica se bioblanquea aplicando a dicha biomasa lignocelulósica un crudo enzimático aislado de una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2, y realizando un blanqueo con peróxido de hidrógeno.
6.

Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que comprende:

(a)

aplicar dicha cepa a dicha biomasa lignocelulósica, y

(b)

utilizar la biomasa resultante de la etapa (a) para producir bioetanol.
7.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado por que dicha biomasa lignocelulósica es de olmo, álamo, chopo, eucalipto, pino, picea, paja de trigo, paja de cebada, poda de naranjo, poda de olivo y/o Hesperaloe funifera.

AS3R3

0,30 0,25 0,20 0,15

0,00

0 5 101520253035 Días�de�cultivo Fig.�1

100 80 60 40 20

0 02468 pH Fig.�2

Actividad lacasa (%)

100

Actividad enzimática

residual (%)

80 60 40 20 0

Tiempo�(h)

Fig.�3

Fig.�4

Fig.�5

Fig.�6

Fig.�7

P6766-2013 seq listing.txt SEQUENCE LISTING

<110> UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y TECNOLOGÍA AGRARIA Y ALIMENTARIA (INIA)

<120> CEPA DE HONGO Hormonema sp. CECT 13092 Y PROCEDIMIENTO DE APLICACIÓN PARA LA DESLIGNIFICACIÓN DE BIOMASA LIGNOCELULÓSICA

<160> 2

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 167

<212> DNA

<213> Hormonema

<220>

<221> source

<222> 1..167

<223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Hormonema sp. CECT 13092 ITS1 (Internal Transcribed Spacer

1); partial sequence." /organism="Hormonema"

<400> 1 tcccgcaacc tcaacccttt gttgttataa ctaccttgtt gctttggcgt ggaccgttcg

60

gttcgccgaa ctgccagggc ccttcggggt cgcggtaagt gcccgccaga gtcaaaccaa

120

actcttgttt ttaaccggtc gtctgagtac aagtttaaat taaatta

167

<210> 2

<211> 162

<212> DNA

<213> Hormonema

<220>

<221> source

<222> 1..162

<223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Hormonema sp. CECT 13092 ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2); complete sequence." /organism="Hormonema"

<400> 2 caccactcaa gctctgcttg gtattaggca ttcgtcctcc tcacggtggg cgtgcctcaa 60

aaatctcggc ggagcctttc cggctttggg cgtagtagaa tttctaatca cgtctttaaa 120

cggagaggtt tccattgccg ctaaaccttt tatttttaca gg 162