ES2433142A1 - Use of ortho-depsid compounds as neuroprotective agents (Machine-translation by Google Translate, not legally binding) - Google Patents
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Abstract
Description
Uso de compuestos orto-dépsidos como agentes neuroprotectores. Use of ortho-depside compounds as neuroprotective agents.
5 La presente invención se refiere a uso de derivados del ácido isolecanórico para la elaboración de una composición farmacéutica, más preferiblemente para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad relacionada con la actividad de GSK-3 1 / caseín kinasa-1 y las propiedades antioxidantes de la molécula, seleccionada de la lista que comprende enfermedad neurodegenerativa, cáncer, diabetes y obesidad. The present invention relates to the use of isolecaloric acid derivatives for the preparation of a pharmaceutical composition, more preferably for the treatment and / or prevention of a disease related to the activity of GSK-3 1 / casein kinase-1 and the properties Antioxidants of the molecule, selected from the list comprising neurodegenerative disease, cancer, diabetes and obesity.
El ácido isolecanórico es un producto natural aislado por primera vez del líquen Parmelia Tinctorum (Sakurai, A.; Goto, Y. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1987, 60, 1917-1918). Hasta la fecha no se ha reportado actividad biológica alguna asociada al ácido isolecanórico. Isolecaloric acid is a natural product isolated for the first time from lichen Parmelia Tinctorum (Sakurai, A .; Goto, Y. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1987, 60, 1917-1918). To date, no biological activity associated with isolecanoric acid has been reported.
15 La biosíntesis del ácido isolecanórico está encuadrada dentro de la ruta de los policétidos polifenólicos, formando parte del subgrupo de los llamados orto-dépsidos. 15 The biosynthesis of isolecanoric acid is framed within the path of polyphenolic polyketides, forming part of the subset of the so-called ortho-depsides.
La estructura básica de un dépsido consiste en dos o más subunidades mono- o poli-fenólicas unidas mediante un The basic structure of a depside consists of two or more mono- or poly-phenolic subunits linked by a
20 enlace éster. En función del modo de unión de dichos monómeros, los dépsidos pueden clasificarse en tres grupos principales: para- y meta-dépsidos, relativamente comunes y aislados de numerosos líquenes y hongos, y los ortodépsidos, mucho menos frecuentes. 20 ester link. Depending on the mode of attachment of said monomers, the depsides can be classified into three main groups: para- and meta-depsides, relatively common and isolated from numerous lichens and fungi, and the orthopedids, much less frequent.
Por su parte, dentro del subgrupo de los para-dépsidos, el más numeroso de los dépsidos, se encuentran productos On the other hand, within the subgroup of the para-depsids, the most numerous of the depsids, there are products
25 naturales con actividad biológica descrita, tales como los ácidos lecanórico, evérnico, barbático, diffractaico y girofórico y los ésteres atranorin y su derivado cloroatranorin. Estos productos naturales han sido descritos como potenciales fármacos frente a la enfermedad de Alzheimer y como agentes antineoplásicos de baja citotoxicidad (WO2008109521A2). 25 natural with biological activity described, such as lecanoric, energetic, barbatic, diffractatic and gyrophoric acids and atranorin esters and their chloroatranorin derivative. These natural products have been described as potential drugs against Alzheimer's disease and as low cytotoxicity antineoplastic agents (WO2008109521A2).
La presente invención se refiere al uso de unos compuestos inhibidores de GSK-3 1 y de la caseín-kinasa-1, útiles en el tratamiento de enfermedades neurodegerativas y otras enfermedades relacionadas con la actividad de dichas enzimas, como por ejemplo la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, Huntington, Esclerosis Lateral Amiotrófica The present invention relates to the use of inhibitors of GSK-3 1 and casein-kinase-1, useful in the treatment of neurodegerative diseases and other diseases related to the activity of said enzymes, such as Alzheimer's disease , Parkinson, Huntington, Amyotrophic Lateral Sclerosis
35 (ELA), cáncer, diabetes, obesidad y otras enfermedades relacionadas. Además, estos compuestos se pueden utilizar como agentes antioxidantes. 35 (ALS), cancer, diabetes, obesity and other related diseases. In addition, these compounds can be used as antioxidant agents.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso del compuesto de formula general (I) (a partir de ahora compuestos de invención): Therefore, a first aspect of the present invention relates to the use of the compound of general formula (I) (hereafter compounds of the invention):
(I) (I)
donde: R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se selecciona, de manera independiente, entre hidrógeno o un grupo alquilo C1-C3; R7 se selecciona entre hidrógeno o un grupo alquilo C1-C5; where: R1, R2, R3, R4, R5 and R6 are independently selected from hydrogen or a C1-C3 alkyl group; R7 is selected from hydrogen or a C1-C5 alkyl group;
45 R8 se selecciona entre hidrógeno, un grupo alquilo C1-C3 o -COOR11; R9 es un grupo alquilo C1-C5; R10 se selecciona entre hidrógeno, un grupo alquilo C1-C3 o OR12; R11 y R12 se selecciona, de manera independiente, entre hidrógeno o un grupo alquilo C1-C3; para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad causada por la generación de radicales libres y estrés oxidativo en la célula y/o relacionada con la actividad de GSK3 1 / caseín kinasa-1. R8 is selected from hydrogen, a C1-C3 alkyl group or -COOR11; R9 is a C1-C5 alkyl group; R10 is selected from hydrogen, a C1-C3 or OR12 alkyl group; R11 and R12 are independently selected from hydrogen or a C1-C3 alkyl group; for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of a disease caused by the generation of free radicals and oxidative stress in the cell and / or related to the activity of GSK3 1 / casein kinase-1.
Los compuestos de la presente invención, representados por la fórmula (I) descrita anteriormente, pueden incluir cualquiera sus sales farmacéuticamente aceptables. The compounds of the present invention, represented by the formula (I) described above, may include any pharmaceutically acceptable salts thereof.
El término “alquilo” se refiere, en la presente invención, a cadenas hidrocarbonadas saturadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tercbutilo, sec-butilo, n-pentilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 3 átomos de carbono, aún más preferiblemente es metilo. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituídos por uno o más sustituyentes tales como alquinilo, alquenilo, halo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro The term "alkyl" refers, in the present invention, to saturated, linear or branched hydrocarbon chains having 1 to 5 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl , tert-butyl, sec-butyl, n-pentyl, etc. Preferably the alkyl group has between 1 and 3 carbon atoms, even more preferably it is methyl. The alkyl groups may be optionally substituted by one or more substituents such as alkynyl, alkenyl, halo, hydroxy, alkoxy, carboxyl, cyano, carbonyl, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro
o mercapto. or mercapto.
En una realización preferida, R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan, de manera independiente, entre hidrógeno o metilo. Más preferiblemente, R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son hidrógeno. In a preferred embodiment, R1, R2, R3, R4, R5 and R6 are independently selected from hydrogen or methyl. More preferably, R1, R2, R3, R4, R5 and R6 are hydrogen.
En otra realización preferida, R7 y/o R9 son un grupo alquilo C1-C3, más preferiblemente R7 y/o R9 son metilo. In another preferred embodiment, R7 and / or R9 are a C1-C3 alkyl group, more preferably R7 and / or R9 are methyl.
En otra realización preferida, R8 es hidrógeno. In another preferred embodiment, R8 is hydrogen.
En otra realización preferida R10 se selecciona entre hidrógeno, metilo o OR12 y más preferiblemente R12 se selecciona entre hidrógeno o metilo. Aún más preferiblemente R10 es hidrógeno. In another preferred embodiment R10 is selected from hydrogen, methyl or OR12 and more preferably R12 is selected from hydrogen or methyl. Even more preferably R10 is hydrogen.
En una realización más preferida de la invención, el compuesto de fórmula (I) es el ácido isolecanórico. In a more preferred embodiment of the invention, the compound of formula (I) is isolecaloric acid.
Entre otras, las enfermedades causadas por la generación de radicales libres y estrés oxidativo en la célula y/o relacionadas con la actividad de GSK-3 1 / caseín kinasa-1, se pueden seleccionar de la lista que comprende enfermedades neurodegenerativas, cáncer, diabetes y obesidad. Among others, the diseases caused by the generation of free radicals and oxidative stress in the cell and / or related to the activity of GSK-3 1 / casein kinase-1, can be selected from the list comprising neurodegenerative diseases, cancer, diabetes and obesity
En una realización preferida la enfermedad neurodegenerativa se selecciona entre la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, Huntington y Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), más preferiblemente la enfermedad neurodegenerativa es ELA. In a preferred embodiment the neurodegenerative disease is selected from Alzheimer's disease, Parkinson's, Huntington and Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), more preferably the neurodegenerative disease is ALS.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento o prevención de pacientes afectados por las enfermedades anteriormente descritas mediante el uso de los compuestos de la invención. Este tratamiento consiste en la administración a los individuos afectados por estas enfermedades de cantidades terapéuticamente efectivas de un compuesto de la invención, o una composición farmacéutica que lo incluya. In another aspect, the present invention relates to a method for the treatment or prevention of patients affected by the diseases described above through the use of the compounds of the invention. This treatment consists in the administration to the individuals affected by these diseases of therapeutically effective amounts of a compound of the invention, or a pharmaceutical composition that includes it.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a aquella In the sense used in this description, the term "therapeutically effective amount" refers to that
cantidad de un compuesto de la invención que cuando se administra a un mamífero, con preferencia un humano, es suficiente para producir el tratamiento, tal como se define más abajo, de una enfermedad o condición patológica de interés en el mamífero, con preferencia un humano. La cantidad de un compuesto de la invención que constituye una cantidad terapéuticamente efectiva variará, por ejemplo, según la actividad del compuesto específico empleado; la estabilidad metabólica y duración de la acción del compuesto; la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta del paciente; el modo y el tiempo de administración; la velocidad de excreción, la combinación de fármacos; la gravedad del trastorno o la condición patológica particulares; y el sujeto que se somete a terapia, pero puede ser determinada por un especialista en la técnica según su propio conocimiento y esa descripción. amount of a compound of the invention that when administered to a mammal, preferably a human, is sufficient to produce the treatment, as defined below, of a disease or pathological condition of interest in the mammal, preferably a human . The amount of a compound of the invention that constitutes a therapeutically effective amount will vary, for example, depending on the activity of the specific compound employed; the metabolic stability and duration of action of the compound; the age, body weight, general state of health, sex and diet of the patient; the mode and time of administration; the rate of excretion, the combination of drugs; the severity of the particular disorder or pathological condition; and the subject who undergoes therapy, but can be determined by a specialist in the art according to their own knowledge and that description.
A lo largo de la presente descripción, el término “tratamiento” se refiere a eliminar, reducir o disminuir la causa o Throughout this description, the term "treatment" refers to eliminating, reducing or decreasing the cause or
efectos de la enfermedad. Para los propósitos de esta invención, tratamiento incluye, aunque sin quedar limitados a los mismos, aliviar, disminuir o eliminar uno o más síntomas de la enfermedad; reducir el grado de enfermedad, estabilizar (es decir, no empeorar) el estado de la enfermedad, retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad, aliviar o mejorar el estado de la enfermedad y remitir (ya sea total o parcial). effects of the disease For the purposes of this invention, treatment includes, but is not limited to, alleviating, reducing or eliminating one or more symptoms of the disease; reduce the degree of disease, stabilize (that is, not worsen) the state of the disease, delay or slow the progression of the disease, relieve or improve the disease status and remit (either total or partial).
Los compuestos de la invención tienen un alto poder antioxidante, por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del compuesto de fórmula (I) descrito anteriormente, como antioxidante. The compounds of the invention have a high antioxidant power, therefore, another aspect of the present invention relates to the use of the compound of formula (I) described above, as an antioxidant.
Debido a este poder antioxidante estos compuestos son útiles como aditivo en alimentos funcionales o complemento alimentarios o dietéticos. De esta forma otro aspecto más de la presente invención se refiere al uso del compuesto de fórmula (I) descrito anteriormente, como aditivo en alimentos funcionales o complemento alimentarios o dietéticos. Due to this antioxidant power these compounds are useful as an additive in functional foods or food or dietary supplements. In this way another aspect of the present invention relates to the use of the compound of formula (I) described above, as an additive in functional foods or food or dietary supplements.
De esta manera, los compuestos descritos en la presente invención se pueden utilizar, además de en composiciones farmacéuticas, en alimentos (incluidos los etiquetados como funcionales o nutraceúticos) o en complementos alimentarios o dietéticos no sólo para prevenir la aparición de las enfermedades descritas anteriormente sino también para mejorar las defensas del organismo como parte del sistema inmune. Thus, the compounds described in the present invention can be used, in addition to pharmaceutical compositions, in foods (including those labeled as functional or nutraceutical) or in food or dietary supplements not only to prevent the occurrence of the diseases described above but also to improve the body's defenses as part of the immune system.
En la presente invención se entiende como “alimento funcional” a un alimento o complemento alimenticio incluidos los llamados “nutracéuticos”, que posee un efecto beneficioso sobre la salud. In the present invention, "functional food" is understood as a food or food supplement including so-called "nutraceuticals", which has a beneficial effect on health.
Por “complementos alimentarios o dietéticos” se refieren a composiciones no alimenticias, es decir, que no son alimentos, pero que aportan a la dieta un efecto beneficioso sobre la salud, dichos complementos pueden contener otro tipo de suplementos como vitaminas, antioxidantes, entre otros. Estas composiciones pueden ser administradas de la misma forma que lo descrito para las composiciones farmacéuticas. By "dietary or dietary supplements" refer to non-food compositions, that is, they are not food, but that provide the diet with a beneficial effect on health, these supplements may contain other types of supplements such as vitamins, antioxidants, among others . These compositions can be administered in the same manner as described for pharmaceutical compositions.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un alimento funcional o un complemento alimentario o dietético que comprende un compuesto de fórmula (I) según se ha descrito en la presente invención. Therefore, another aspect of the present invention relates to a functional food or a dietary or dietary supplement comprising a compound of formula (I) as described in the present invention.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un hongo de la especie Glarea lozoyensis para la obtención de ácido isolecanórico. El procedimiento de obtención de dicho compuesto comprende la fermentación de Glarea lozoyensis y posterior extracción mediante un disolvente polar del cultivo obtenido en la fermentación anterior. Another aspect of the present invention relates to the use of a fungus of the Glarea lozoyensis species for obtaining isolecaloric acid. The process for obtaining said compound comprises the fermentation of Glarea lozoyensis and subsequent extraction by a polar solvent of the culture obtained in the previous fermentation.
En una realización preferida del procedimiento de la invención, el disolvente polar puede entre otros ser un alcohol de bajo peso molecular, tal como metanol o etanol, y acetona. Más preferiblemente el disolvente es acetona. In a preferred embodiment of the process of the invention, the polar solvent may, among others, be a low molecular weight alcohol, such as methanol or ethanol, and acetone. More preferably the solvent is acetone.
Una vez que se da la etapa de extracción del producto, los paso posteriores de aislamiento y purificación son los conocidos por cualquier experto en la materia. Once the product extraction stage occurs, the subsequent isolation and purification steps are those known to any person skilled in the art.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del ácido isolecanórico para la elaboración de una composición farmacéutica. Another aspect of the present invention relates to the use of isolecaloric acid for the preparation of a pharmaceutical composition.
Por tanto, un aspecto más de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el ácido isolecanórico, preferiblemente dicha composición farmacéutica además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o otro principio activo. Therefore, a further aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising isolecaloric acid, preferably said pharmaceutical composition further comprising a pharmaceutically acceptable carrier and / or another active ingredient.
Los “vehículos farmacéuticamente aceptables” que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas. The "pharmaceutically acceptable vehicles" that can be used in said compositions are the vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention. The following examples and figures are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
Fig 1: Representación grafica de la capacidad antioxidante del ácido isolecanórico a diferentes concentraciones a lo largo del tiempo tras la adición del generador de radicales libres APPH. Las diferentes formas de los puntos representan valores decrecientes de concentración del ácido isolecanórico que van desde 5 mM hasta 1 nM. El eje Y representa unidades relativas de fluorescencia y el eje X tiempo en minutos. Fig 1: Graphical representation of the antioxidant capacity of isolecanoric acid at different concentrations over time after the addition of the APPH free radical generator. The different shapes of the points represent decreasing values of isolecaloric acid concentration ranging from 5 mM to 1 nM. The Y axis represents relative units of fluorescence and the X axis time in minutes.
Fig 2: Comparación de la capacidad antioxidante del TROLOX® (cuadrados) frente al ácido isolecanórico (rombos). El eje Y representa el sumatorio de unidades relativas de fluorescencia a lo largo del tiempo mientras el eje X el logaritmo de la concentración mM de los compuestos. Fig 2: Comparison of the antioxidant capacity of TROLOX® (squares) against isolecaloric acid (rhombuses). The Y axis represents the sum of relative fluorescence units over time while the X axis logarithm of the mM concentration of the compounds.
Fig 3: Representación del porcentaje de inhibición (ejeY) frente al logaritmo de la concentración μM (eje X) del ácido isolecanórico frente a GSK-3 β (cuadrados), CK-1 δ (círculos) y CDK2 (triángulos). Fig 3: Representation of the percentage of inhibition (Y axis) against the logarithm of the μM concentration (X axis) of the isolecaloric acid against GSK-3 β (squares), CK-1 δ (circles) and CDK2 (triangles).
Fig 4: Dobles recíprocos del ácido isolecanórico a diferentes concentraciones y valores crecientes de ATP marcado. Fig 4: Double reciprocals of isolecanoric acid at different concentrations and increasing values of labeled ATP.
Fig 5: Dobles recíprocos del ácido isolecanórico a diferentes concentraciones y valores crecientes de sustrato. Fig 5: Double reciprocals of isolecanoric acid at different concentrations and increasing substrate values.
Fig 6: Representación gráfica de la muerte celular provocada por el L-BMAA y el efecto protector del acido isolecanórico. Fig 6: Graphical representation of cell death caused by L-BMAA and the protective effect of isolechaloric acid.
EJEMPLOS EXAMPLES
Se utilizaron 10 discos de micelio de la cepa F-160,870, ATCC-20868, Glarea lozoyensis, crecida en placa de malta, extracto de levadura y agar para inocular un matraz de 250 mL que contenía 50 mL de medio SMYA (Difco neopeptona 10 g, maltosa 40 g, Difco extracto de levadura 10 g, agar 4 g, 1 L H2O destilada). Este matraz fue incubado durante 7 días, a 22ºC, con un 70% de humedad relativa y agitación a 220 r.p.m. A partir de éste cultivo se inocularon 20 matraces de 250 mL que contenían 50 mL de medio MV8 (maltosa 75 g, V8 juice 200 mL, harina de soja tipo I (SIGMA) 1 g, L-prolina 3 g, MES 16.2 g, agua destilada 1 L) durante 14 días, a 22ºC, con un 70% de humedad relativa y agitación a 220 r.p.m. Ten mycelium discs of strain F-160,870, ATCC-20868, Glarea lozoyensis, grown in malt plate, yeast extract and agar were used to inoculate a 250 mL flask containing 50 mL of SMYA medium (Difco neopeptone 10 g , maltose 40 g, Difco yeast extract 10 g, agar 4 g, 1 L distilled H2O). This flask was incubated for 7 days, at 22 ° C, with 70% relative humidity and stirring at 220 r.p.m. From this culture, 20 250 mL flasks containing 50 mL of MV8 medium (75 g maltose, V8 juice 200 mL, type I soybean meal (SIGMA) 1 g, L-proline 3 g, MONTH 16.2 g, were inoculated 1 L distilled water) for 14 days, at 22 ° C, with 70% relative humidity and stirring at 220 rpm
Un litro del cultivo de Glarea lozoyensis obtenido en el ejemplo anterior fue extraído por adición de acetona (1 L) mediante agitación durante 1 h y posterior centrifugado a 8500 rpm durante 5 min y filtrado a vacío, descartándose el pellet de micelio. One liter of the Glarea lozoyensis culture obtained in the previous example was extracted by adding acetone (1 L) by stirring for 1 h and subsequent centrifugation at 8500 rpm for 5 min and vacuum filtration, discarding the mycelium pellet.
El líquido resultante se concentró hasta un volumen de 1 L por evaporación bajo corriente de nitrógeno y se filtró de nuevo a vacío a través de celita. El filtrado se cargó a presión en una columna de resina de fase reversa SP207ss (65 g / 20% agua; 90 x 38 mm) con continua adición de agua. La elución de la columna se llevó a cabo en gradiente de agua: acetona (8 mL/min; 10-100% acetona en 12.5 min, 100% acetona hasta 27 min). The resulting liquid was concentrated to a volume of 1 L by evaporation under a stream of nitrogen and filtered from Again empty through celite. The filtrate was loaded under pressure on a SP207ss reverse phase resin column. (65 g / 20% water; 90 x 38 mm) with continuous addition of water. Column elution was carried out in gradient of water: acetone (8 mL / min; 10-100% acetone in 12.5 min, 100% acetone up to 27 min).
Las fracciones resultantes fueron evaporadas a sequedad y analizadas mediante HPLC-MS y ensayo de su actividad frente a GSK-31. Las fracciones bioactivas fueron sometidas a una segunda cromatografía sobre Sephadex LH-20 (22 g / metanol 100%; 120 x 38 mm) eluida con metanol 100% a un flujo de 5 mL/min. The resulting fractions were evaporated to dryness and analyzed by HPLC-MS and assay of their activity against GSK-31. The bioactive fractions were subjected to a second chromatography on Sephadex LH-20 (22 g / 100% methanol; 120 x 38 mm) eluted with 100% methanol at a flow rate of 5 mL / min.
Las fracciones resultantes de esta cromatografía fueron nuevamente analizadas mediante HPLC-MS y bioactividad frente a GSK-31 y repurificadas por HPLC de fase reversa preparativo empleando una columna Agilent Zorbax SB- C8 PrepHT (21.2 × 250 mm) y un gradiente agua: acetonitrilo (20 mL/min, gradiente: 5%-100% acetonitrilo en 40 min), con detección UV a 210 y 280 nm. The resulting fractions of this chromatography were again analyzed by HPLC-MS and bioactivity. against GSK-31 and repurified by preparative reverse phase HPLC using an Agilent Zorbax SB- column C8 PrepHT (21.2 × 250 mm) and a water gradient: acetonitrile (20 mL / min, gradient: 5% -100% acetonitrile in 40 min), with UV detection at 210 and 280 nm.
Una vez evaporadas las fracciones de HPLC que contenían el producto activo frente a GSK-31, se obtuvieron 18 mg de un sólido blanquecino amorfo (rt: 13.3 min) que fue identificado como ácido isolecanórico por comparación de sus datos espectroscópicos con los reportados en la bibliografía (Sakurai, A.; Goto, Y. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1987, 60, 1917-1918) HRMS (Masa exacta): Calculada para C16H15O7, [M+H]+: 319.0812. Encontrada: 319.0817. 1H-RMN (DMSO-d6, 500 MHz): 10.43 (s, 1H, OH), 10.01 (s, 1H, OH), 6.28 (d, 1H, J= 2.3 Hz), 6.21 (sa, 2H), 6.19 (d, 1H, J= 2.3 Hz), 2.53, (s, 3H, OCH3), 2.36, (s, 3H, OCH3) 13C-RMN (DMSO-d6, 125 MHz): 171.4, 167.6, 166.2, 161.1, 160.6, 151.1, 142.0, 140.4, 116.5, 112.0, 110.0, 108.1, 107.1, 100.5, 23.0, 21.6. 1H-RMN (CD3OD, 500 MHz): 6.50 (da, 1H, J= 2.2 Hz), 6.44 (dd, 1H, J= 2.5, 0.7 Hz), 6.29 (dd, 1H, J= 2.5, 0.7 Hz), After evaporating the HPLC fractions containing the active product against GSK-31, 18 mg was obtained. of an amorphous whitish solid (rt: 13.3 min) that was identified as isolecaloric acid by comparison of its spectroscopic data with those reported in the literature (Sakurai, A .; Goto, Y. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1987, 60, 1917-1918) HRMS (Exact Mass): Calculated for C16H15O7, [M + H] +: 319.0812. Found: 319.0817. 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 10.43 (s, 1H, OH), 10.01 (s, 1H, OH), 6.28 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.21 (sa, 2H), 6.19 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 2.53, (s, 3H, OCH3), 2.36, (s, 3H, OCH3) 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz): 171.4, 167.6, 166.2, 161.1, 160.6, 151.1, 142.0, 140.4, 116.5, 112.0, 110.0, 108.1, 107.1, 100.5, 23.0, 21.6. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): 6.50 (da, 1H, J = 2.2 Hz), 6.44 (dd, 1H, J = 2.5, 0.7 Hz), 6.29 (dd, 1H, J = 2.5, 0.7 Hz),
6.21 (da, 1H, J= 2.2 Hz), 2.63 (s, 3H, OCH3), 2.57 (s, 3H, OCH3) 13C-RMN (CD3OD, 125 MHz): 175.7, 171.2, 166.6, 164.6, 164.4, 152.9, 144.8, 144.5, 118.0, 115.7, 112.9, 108.3, 105.5, 101.9, 24.3, 23.5. 6.21 (da, 1H, J = 2.2 Hz), 2.63 (s, 3H, OCH3), 2.57 (s, 3H, OCH3) 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): 175.7, 171.2, 166.6, 164.6, 164.4, 152.9, 144.8, 144.5, 118.0, 115.7, 112.9, 108.3, 105.5, 101.9, 24.3, 23.5.
Para la evaluación de la actividad antioxidante del ácido isolecanórico se emplea el método ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). Se basa en la capacidad del reactivo [2,2’-azobis (2-amidino-propano) dihidrocloruro (AAPH)] de descomponerse a 37ºC para generar radicales libres, que son capaces de interferir en la emisión de fluorescencia que produce la fluoresceína (Cao et al. Free Radical Biol. Med. 1993, 14, 303-311). The ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) method is used to evaluate the antioxidant activity of isolecaloric acid. It is based on the ability of reagent [2,2'-azobis (2-amidino-propane) dihydrochloride (AAPH)] to decompose at 37 ° C to generate free radicals, which are capable of interfering with the fluorescence emission produced by fluorescein ( Cao et al. Free Radical Biol. Med. 1993, 14, 303-311).
Es un método utilizado tanto para muestras complejas (se utiliza para el análisis de alimentos) así como para compuestos puros. It is a method used for both complex samples (used for food analysis) as well as for pure compounds.
Como estándar de la reacción se utiliza el TROLOX®, un análogo soluble en agua de la vitamina E muy estable y cuyas curvas se utilizan para referenciar la actividad antioxidante de otros compuestos a la de este mediante el uso de Equivalentes de TROLOX® (ET). Para calcular este valor se hace la suma de los valores de fluorescencia a las diferentes concentraciones y tiempos y se calcula la pendiente concentraciones /fluorescencia para cada compuesto. A continuación se dividen la pendiente del compuesto a analizar entre la pendiente del TROLOX® obteniéndose así el número de veces que el compuesto a estudiar es más antioxidante que este último compuesto. As a standard of the reaction, TROLOX® is used, a water-soluble analogue of vitamin E that is very stable and whose curves are used to reference the antioxidant activity of other compounds to that of the latter through the use of TROLOX® Equivalents (ET) . To calculate this value, the sum of the fluorescence values at the different concentrations and times is made and the concentration / fluorescence slope for each compound is calculated. Next, the slope of the compound to be analyzed is divided by the slope of the TROLOX®, thus obtaining the number of times that the compound to be studied is more antioxidant than this last compound.
El ensayo se realiza añadiendo 10 !L de una disolución de ácido isolecanórico, haciéndose una curva de dosis respuesta de ocho puntos con diluciones 1:2, siendo la concentración del primer punto 50 μM y 60 !L de The test is performed by adding 10 µL of an isolecaloric acid solution, making an eight-point dose response curve with 1: 2 dilutions, the concentration of the first point being 50 µM and 60 µL of
Fluoresceina 10 nM en PBS, esta mezcla se incuba media hora a 37ºC y a continuación se añade AAPH 60 mM (todos de SIGMA-ALDRICH) y se comienza la lectura en modo cinético (una lectura cada 10 minutos durante 4 horas) (Fig. 1). 10 nM Fluorescein in PBS, this mixture is incubated for half an hour at 37 ° C and then 60 mM AAPH (all from SIGMA-ALDRICH) is added and the reading is started in kinetic mode (one reading every 10 minutes for 4 hours) (Fig. 1 ).
Los compuestos capaces de absorber los radicales libres generados hacen que no se vea afectada la emisión de la fluoresceína. Sin embargo, si los extractos carecen de actividad antioxidante, los radicales libres generados consumen rápidamente la señal fluorescente. Compounds capable of absorbing the free radicals generated do not affect the emission of fluorescein. However, if the extracts lack antioxidant activity, the free radicals generated quickly consume the fluorescent signal.
El valor de ET para el ácido isolecanórico es de 3, siendo 3 veces más antioxidante que el TROLOX® (Fig. 2). The ET value for isolecaloric acid is 3, being 3 times more antioxidant than TROLOX® (Fig. 2).
Dado el importante papel que tanto la glicogeno sintetasa kinasa 3 beta (GSK3- β) (Doble and Woodgett J Cell Sci (2003) 116, 1175-1186) como la casein kinasa (CK) (D. I. Perez et al. Medicinal Research Reviews Medicinal Research Reviews (2011) 31 (6): 924–954) juegan en las enfermedades neurodegenerativas se realizaron ensayos in vitro para evaluar la capacidad de inhibición del ácido isolecanórico sobre estas dos dianas. El kit comercial de PROMEGA KINASE-GLO® es un método basado en la capacidad de la enzima luciferasa de generar oxyluciferina, luminiscente, a partir de ATP (Adenosin Trifosfato) y bettle luciferina. Tras la reacción de fosforilación de la kinasa a estudiar se mide el ATP remanente no utilizado pudiéndose así evaluar la capacidad inhibitoria de los compuestos de interés. Si la kinasa no es inhibida gastará el ATP, y en consecuencia disminuirá la producción de la forma luminiscente de la luciferina y por tanto la señal de luminiscencia medida será baja. En presencia de un inhibidor, al dejar de actuar la enzima, se consumirá muy poco ATP que será utilizado por la lucíferasa aumentando la luminiscencia generada. Given the important role that both glycogen synthetase kinase 3 beta (GSK3- β) (Doble and Woodgett J Cell Sci (2003) 116, 1175-1186) and casein kinase (CK) (DI Perez et al. Medicinal Research Reviews Medicinal Research Reviews (2011) 31 (6): 924–954) play in neurodegenerative diseases in vitro assays were conducted to assess the ability of inhibition of isolecaloric acid on these two targets. The commercial kit of PROMEGA KINASE-GLO® is a method based on the ability of the luciferase enzyme to generate oxyluciferin, luminescent, from ATP (Adenosin Triphosphate) and bettle luciferin. After the phosphorylation reaction of the kinase to be studied, the remaining unused ATP can be measured, thus being able to evaluate the inhibitory capacity of the compounds of interest. If the kinase is not inhibited it will spend the ATP, and consequently the production of the luciferin luminescent form will decrease and therefore the measured luminescence signal will be low. In the presence of an inhibitor, when the enzyme ceases to act, very little ATP will be consumed that will be used by the lucifer to increase the luminescence generated.
Se utiliza la enzima GSK-3 beta humana (MILLIPORE) a una concentración de 0,1 ng/μL disuelta en el buffer de ensayo (HEPES 50 mM-NaOH pH 7,4; EDTA 1 mM, EGTA 1 mM y Acetato Magnésico 15 mM, todos ellos de SIGMA-ALDRICH) al que se añade TWEEN 20 (SIGMA-ALDRICH) 0,0033% volumen final para aumentar la estabilidad de la enzima. The human GSK-3 beta enzyme (MILLIPORE) is used at a concentration of 0.1 ng / μL dissolved in the assay buffer (50 mM HEPES-NaOH pH 7.4; 1 mM EDTA, 1 mM EGTA and Magnesium Acetate 15 mM, all of them from SIGMA-ALDRICH) to which TWEEN 20 (SIGMA-ALDRICH) 0.0033% final volume is added to increase the stability of the enzyme.
Como sustrato se utiliza un péptido (sintetizado por American Peptide) que asemeja el sitio de fosforilación que la enzima glucógeno sintetasa tiene para GSK-3, este sustrato se añade a una concentración final de 25 !M en el buffer de ensayo previamente descrito, junto con el ATP a una concentración final de 1 !M (Baki et al. Assay Drug DevTechnol. 2007, 5:75-83). As a substrate a peptide (synthesized by American Peptide) is used that resembles the phosphorylation site that the glycogen synthetase enzyme has for GSK-3, this substrate is added at a final concentration of 25 µM in the previously described test buffer, together with ATP at a final concentration of 1 µM (Baki et al. Assay Drug DevTechnol. 2007, 5: 75-83).
Como control se utiliza bien alsterpaullone (L Behrend et al. Oncogene (2000) 19, 5303 – 5313), un inhibidor conocido, competitivo del sitio de unión del ATP de GSK-3 o el compuesto TDZD-8 (Martinez et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 1292-1299), que actúa de manera no competitiva con el ATP, sus IC50 se calculan en cada ensayo. As a control, alsterpaullone is well used (L Behrend et al. Oncogene (2000) 19, 5303-5333), a known, competitive inhibitor of the GSP-3 ATP binding site or TDZD-8 compound (Martinez et al. J Med. Chem. 2002, 45, 1292-1299), which acts in a non-competitive manner with the ATP, its IC50 are calculated in each trial.
El procedimiento del ensayo consiste en la adición de 10 !L del ácido isolecanórico, haciéndose curvas de dosis respuesta de 16 puntos con diluciones 1:2 siendo la concentración del primer punto 50 μM, se añaden 10 !L de la solución de enzima y 10 !L de la disolución de sustrato/ATP. La reacción, se incuba a 30ºC durante 30 minutos y a continuación se añaden 30 !L del sistema de revelado, leyendo la luminiscencia generada con el ATP remanente no The test procedure consists of the addition of 10 µL of the isolecaloric acid, with 16-point response dose curves being made with 1: 2 dilutions, the concentration of the first point being 50 μM, 10 µL of the enzyme solution and 10 are added. ! L of the substrate / ATP solution. The reaction is incubated at 30 ° C for 30 minutes and then 30 µL of the development system is added, reading the luminescence generated with the remaining ATP not
gastado en la reacción con el lector Victor2™ de PerkinElmer. spent in reaction with the Victor2 ™ reader from PerkinElmer.
El cálculo de los valores de IC50 se realiza utilizando el programa Screener™ de Genedata, obteniéndose una IC50 de 1,2 !M para GSK-3 β (Fig. 3). The calculation of the IC50 values is performed using the Genedata Screener ™ program, obtaining an IC50 of 1.2 µM for GSK-3β (Fig. 3).
El estudio de la inhibición de casein kinasa 1 delta utiliza el mismo método KINASE-GLO® (PROMEGA). El ensayo comienza con la adición de 10 !L del ácido isolecanórico, haciéndose curvas de dosis respuesta de ocho puntos con diluciones 1:2 siendo la concentración del primer punto 50 μM. Se añaden 10 !L de la solución de enzima (suministrada por MILIIPORE) a 0,16 ng/μL en el siguiente buffer de ensayo (TWEEN 20 0,001%, HEPES 50 mM-NaOH pH 7,4; EGTA 1 mM, MgCl2 10 mM, NaN3 0,01%, todos suministrados por SIGMA-ALDRICH). A continuación se dispensan 10 !L de la mezcla de caseína 0,015% y ATP 3 !M disueltos en buffer de ensayo (suministrados ambos por SIGMA-ALDRICH), se incuba 1 hora a 30ºC y se añaden 30 !L de kit KINASA-GLO®, leyéndose en el The study of casein kinase 1 delta inhibition uses the same KINASE-GLO® method (PROMEGA). The test begins with the addition of 10 µL of the isolecaloric acid, with eight-point dose response curves being made with 1: 2 dilutions, the concentration of the first point being 50 μM. 10 µL of the enzyme solution (supplied by MILIIPORE) is added at 0.16 ng / µL in the following test buffer (TWEEN 20 0.001%, 50 mM HEPES-NaOH pH 7.4; 1 mM EGTA, MgCl2 10 mM, 0.01% NaN3, all supplied by SIGMA-ALDRICH). Next, 10 µL of the 0.015% casein mixture and 3 µM ATP dissolved in test buffer (both supplied by SIGMA-ALDRICH) are dispensed, incubated 1 hour at 30 ° C and 30 µL of KINASA-GLO kit are added ®, reading in the
lector para placas multipocillo Victor2™ de PerkinElmer. Victor2 ™ multiwell plate reader from PerkinElmer.
El cálculo de los valores de IC50 se realiza utilizando el programa Screener™ de Genedata, obteniéndose una IC50 de 12 !M para Casein kinase 1 delta (Fig. 3).The calculation of the IC50 values is performed using the Genedata Screener ™ program, obtaining an IC50 of 12 µM for Casein kinase 1 delta (Fig. 3).
Dada la relación estructural existente entre los sitios activos de GSK-3 β y esta kinasa se ha puesto a punto un método para medir su actividad con el Kit de PROMEGA ADP-GLO®. Es un método no radiométrico basado en la medida del ADP remanente tras la reacción de fosforilación del sustrato. Given the structural relationship between the active sites of GSK-3β and this kinase, a method has been developed to measure its activity with the ADM-GLO® PROMEGA Kit. It is a non-radiometric method based on the measurement of ADP remaining after the phosphorylation reaction of the substrate.
En primer lugar se añade el reactivo ADP-GLO que finaliza la reacción y provoca la depleción del ATP restante. Posteriormente se añade el reactivo de detección que transforma el ADP generado en ATP que participa en la conversión de la luciferina produciendo luz proporcionalmente a la cantidad de ADP remanente. First, the ADP-GLO reagent is added, which ends the reaction and causes the remaining ATP to deplete. Subsequently, the detection reagent that transforms the generated ADP into ATP that participates in the luciferin conversion is produced, producing light proportionally to the amount of remaining ADP.
Para este ensayo se utilizan placas de 384 pocillos de pequeño volumen añadiendo 5 !L del ácido isolecanórico, haciéndose curvas de dosis respuesta de ocho puntos con diluciones 1:2 siendo la concentración del primer punto 50 μM, 5 !L de CDK2/ciclina A, a una concentración final de 0,5 ng/!L en un buffer de reacción 1X al que se añade DTT 50 !M, y 5 !L de la mezcla sustrato Histona H1 (0,1 !g/μL) y ATP 50 !M final (todos suministrados por SIGNALCHEM). For this test, 384 well plates of small volume are used by adding 5 µL of the isolechaloric acid, making dose-response curves of eight points with 1: 2 dilutions, the concentration of the first point being 50 μM, 5 µL of CDK2 / cyclin A , at a final concentration of 0.5 ng /! L in a 1X reaction buffer to which 50 µM DTT is added, and 5 µL of the Histone H1 substrate substrate (0.1 µg / μL) and ATP 50 ! M final (all supplied by SIGNALCHEM).
Se incuba a temperatura ambiente 30 minutos y se añaden 15 !L del reactivo ADP-GLO®, se incuba durante otros 40 minutos y se añade el reactivo de detección, leyendo en el VICTOR2™ de PerkinElmer lumuniscencia 0,5 segundos por pocillo, ganancia 1X. Incubate at room temperature 30 minutes and add 15 µL of ADP-GLO® reagent, incubate for another 40 minutes and add the detection reagent, reading in the VICTOR2 ™ of PerkinElmer luminescence 0.5 seconds per well, gain 1X
El cálculo del porcentaje de actividad se realiza con el programa ScreenerTM, modulo Assay AnalizerTM, y el cálculo de las IC50 con el modulo CondoseoTM ambos de Genedata. The calculation of the percentage of activity is done with the ScreenerTM program, Assay AnalyzerTM module, and the calculation of the IC50 with the Genedata CondoseoTM module both.
El ácido isolecanórico resulta inactivo para el ensayo de inhibición de CDK2 (Fig. 3). El hecho de que el isolecanórico no actúe como inhibidor de CDK2, le confiere una cierta especificidad dentro de quinasas estructuralmente parecidas a GSK-3 como la familia de las CDKs y que comparten con ella inhibidores comunes del sitio del ATP como alsterpaullone. Isolecaloric acid is inactive for the CDK2 inhibition assay (Fig. 3). The fact that the isolecanoric does not act as a CDK2 inhibitor, gives it a certain specificity within GSK-3 structurally similar kinases such as the family of CDKs and that share common ATP site inhibitors such as alsterpaullone.
Este es un ensayo radiométrico basado en la competencia creada por el exceso de ATP con el sitio de unión a éste, en la que se evalúa la capacidad de un inhibidor de desplazar al nucleótido trifosfato de su lugar de unión. This is a competition-based radiometric assay created by excess ATP with its binding site, in which the ability of an inhibitor to displace the nucleotide triphosphate from its binding site is evaluated.
Para este ensayo se utiliza GSK-3 β humana 0,1 ng/!L (MILLIPORE), ATP marcado en el fosfato en posición gamma con 32P (PerkinElmer), ATP no marcado (SIGMA) y el péptido sustrato GS-1 (American Peptide). Estos componentes se disuelven en un buffer compuesto por HEPES 50 mM-NaOH pH 7,4; Acetato Magnésico 15 mM, EGTA 1mM, EDTA 1 mM y TWEEN 20 0,0033% (SIGMA-ALDRICH) todo ello concentraciones finales en agua MilliQ. For this test, human GSK-3 β 0.1 ng /! L (MILLIPORE), phosphate-labeled ATP in 32-gamma position (PerkinElmer), unlabeled ATP (SIGMA) and GS-1 substrate peptide (American) are used Peptide). These components are dissolved in a buffer composed of 50 mM HEPES-NaOH pH 7.4; Magnesium Acetate 15 mM, EGTA 1mM, EDTA 1 mM and TWEEN 20 0.0033% (SIGMA-ALDRICH) all final concentrations in MilliQ water.
El protocolo general consiste en la adición de 10 !L de DMSO, inhibidor control o inhibidor a testar, 10 !L de enzima más 10 !L de la solución de sustrato que incluye valores constantes de ATP marcado si se introducen concentraciones crecientes de sustrato o concentraciones constantes de este último a la vez que se incorporan concentraciones crecientes del ATP marcado. The general protocol consists of the addition of 10 µL of DMSO, control inhibitor or inhibitor to be tested, 10 µL of enzyme plus 10 µL of the substrate solution that includes constant values of labeled ATP if increasing concentrations of substrate or constant concentrations of the latter while increasing concentrations of labeled ATP are incorporated.
Se añaden concentraciones de los diferentes inhibidores según el valor de IC50 obtenido en experimentos previos in vitro con el método KINASE-GLO®. Para el ácido isolecanórico se emplearon concentraciones de 18, 9 y 2,25 μM, manteniéndose este inhibidor a concentración constante para cada una de las curvas de ATP o sustrato (Martinez et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 1292-1299). Concentrations of the different inhibitors are added according to the IC50 value obtained in previous experiments in vitro with the KINASE-GLO® method. For isolecaloric acid, concentrations of 18, 9 and 2.25 μM were used, keeping this inhibitor at a constant concentration for each of the ATP or substrate curves (Martinez et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 1292- 1299).
Esta mezcla de reacción de 30 !L finales se incuba a diferentes tiempos de reacción a 30ºC en un incubador Kuhner y una vez finalizados estos tiempos se pipetean 4 !L sobre filtros previamente cortados en círculos de 0,5 cm de papel de filtro P81 de exclusión iónico de WHATMAN, realizándose este proceso por triplicado y en placas de 96 pocillos. Posteriormente se lava 4 veces con ácido ortofosfórico al 1% dejando 10 minutos entre cada uno de estos lavados. Tras este proceso se pasan los filtros de las placas de ensayo a las placas de lectura de PerkinElmer GF/B que se dejan secar durante toda la noche en un incubador a 40ºC. This final 30 µL reaction mixture is incubated at different reaction times at 30 ° C in a Kuhner incubator and after these times 4 µL are pipetted onto previously cut filters in 0.5 cm circles of P81 filter paper from Ionic exclusion of WHATMAN, this process being carried out in triplicate and in 96-well plates. It is subsequently washed 4 times with 1% orthophosphoric acid leaving 10 minutes between each of these washes. After this process, the filters of the test plates are passed to the PerkinElmer GF / B reading plates that are allowed to dry overnight in an incubator at 40 ° C.
Se añaden 70 !L de líquido de centelleo y tras el sellado de las placas se leen un el lector TopCount™ PerkinElmer. 70 µL of scintillation liquid is added and after the sealing of the plates, a TopCount ™ PerkinElmer reader is read.
El análisis de los datos generados se realiza mediante una curva de calibrado del ATP marcado adicionando diferentes cantidades del compuesto y se calcula la actividad específica del radioisótopo, midiendo las cuentas generadas por picomol de ATP. Se determina la cantidad de picomoles de fosfato incorporado al sustrato retenido en los filtros, por minuto de reacción. The analysis of the generated data is performed by means of a calibration curve of the labeled ATP by adding different amounts of the compound and the specific activity of the radioisotope is calculated, measuring the counts generated by picomol of ATP. The amount of phosphate picomoles incorporated into the substrate retained in the filters is determined, per minute of reaction.
Una vez que se han obtenido estos datos se representan los inversos de la velocidad en el eje de ordenadas y el inverso de la concentración de sustrato en el eje de abscisas, obteniendo el doble reciproco o representación de Lineweaver-Burk (Fig. 4). Once these data have been obtained, the inverse of the velocity in the ordinate axis and the inverse of the substrate concentration in the abscissa axis are represented, obtaining the double reciprocal or representation of Lineweaver-Burk (Fig. 4).
En esta representación un inhibidor competitivo cruzara con el eje Y en el mismo punto sea cual sea su concentración ya que tendrá igual valor de Vmax, mientras que en el eje X cortara en diferentes puntos con distintos valores de Km, mientras que para inhibidores no competitivos el corte en eje Y será en puntos distintos con valores diferentes de Vmax y en el mismo punto del eje X lo que significa igual valor de Km. In this representation a competitive inhibitor will cross with the Y axis at the same point regardless of its concentration since it will have the same value of Vmax, while on the X axis it will cut at different points with different Km values, while for non-competitive inhibitors the cut in Y axis will be in different points with different values of Vmax and in the same point of the X axis which means the same value of Km.
Con el objeto de validar el experimento se eligen dos inhibidores cuyo modo de acción es conocido y previamente descrito en la literatura. El alsterpaullone como un inhibidor competitivo del sitio de unión del ATP e inhibidor no competitivo del sustrato; y el compuesto TDZD-8 como inhibidor no competitivo del sitio del ATP y de igual comportamiento que el anterior para el sustrato. In order to validate the experiment, two inhibitors are chosen whose mode of action is known and previously described in the literature. Alsterpaullone as a competitive inhibitor of the ATP binding site and non-competitive substrate inhibitor; and the TDZD-8 compound as a non-competitive inhibitor of the ATP site and of the same behavior as the previous one for the substrate.
El procesado de los datos se realizo con Excel 2007 y la representación de los datos y la regresión lineal se hizo con Spotfire Silver™ (TIBCO). The data processing was done with Excel 2007 and the data representation and linear regression was done with Spotfire Silver ™ (TIBCO).
El ácido isolecanórico se comporta como inhibidor no competitivo del sustrato y competitivo del sitio del ATP (Fig. 4 y 5). Isolecaloric acid behaves as a non-competitive substrate and competitive inhibitor of the ATP site (Fig. 4 and 5).
La capacidad neuroprotectora del ácido isolecanórico se ha evaluado mediante ensayos celulares. Con este fin se ha utilizado la línea celular de rata PC-12 suministrada por ATCC (CRL-1721, células adrenales de pheocromocitoma) capaz de diferenciarse en neuronas tras el tratamiento con el factor de crecimiento nervioso (NGF). The neuroprotective capacity of isolecanoric acid has been evaluated by cellular assays. To this end, the PC-12 rat cell line supplied by ATCC (CRL-1721, adrenal pheochromocytoma cells) capable of differentiating into neurons after treatment with nerve growth factor (NGF) has been used.
Una vez diferenciadas las células se tratan con L-BMAA (L-beta-metil-amino alanina) que se usa como modelo de daño neuronal en la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA). Once differentiated the cells are treated with L-BMAA (L-beta-methyl-amino alanine) which is used as a model of neuronal damage in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS).
Para la evaluación de sus propiedades neuroprotectoras se probaron diferentes concentraciones del ácido isolecanórico en combinación con 1 mM de BMAA dejándolo actuar durante 24 horas. Para evaluar la viabilidad de las células se utilizó el ensayo colorimétrico de reducción de MTT, basado en la reducción metabólica del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol, MTT (SIGMA-ALDRICH), realizada por el enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa, resultando en un compuesto coloreado de color azul (formazán), permitiendo determinar de esta manera la funcionalidad mitocondrial de las células PC-12 tratadas con L-BMAA. La cantidad de formazán producido es proporcional a la cantidad de células vivas (Liu et al. 2010 J Nat Prod 73,1193-1195). For the evaluation of its neuroprotective properties, different concentrations of isolecaloric acid were tested in combination with 1 mM BMAA, allowing it to act for 24 hours. To evaluate the viability of the cells, the MTT colorimetric reduction test was used, based on the metabolic reduction of 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazole bromide, MTT (SIGMA-ALDRICH ), performed by the mitochondrial enzyme succinate dehydrogenase, resulting in a blue colored compound (formazan), thus allowing to determine the mitochondrial functionality of PC-12 cells treated with L-BMAA. The amount of formazan produced is proportional to the amount of living cells (Liu et al. 2010 J Nat Prod 73,1193-1195).
Tomando como control la muerte inducida por la acción del L-BMAA se calcula la capacidad de los compuestos de reducir la muerte inducida por éste, siendo el ácido isolecanórico capaz de reducir la muerte neuronal hasta un 90% (Fig 6). Taking as a control the death induced by the action of L-BMAA, the ability of the compounds to reduce the death induced by it is calculated, the isolecaloric acid being able to reduce neuronal death up to 90% (Fig 6).
Como control para poder asegurar la veracidad de los resultados y de la actividad, se incubaron conjuntamente el ácido isolecanórico y el L-BMAA durante 24 horas, y se verifico por HPLC que no se producían reacciones químicas entre ellos. As a control to ensure the veracity of the results and activity, isolecaloric acid and L-BMAA were incubated together for 24 hours, and it was verified by HPLC that there were no chemical reactions between them.
Para poder evaluar las características pre-clínicas del ácido isolecanórico se realizaron ensayos, de citotoxicidad (Corine, et al. 1998 J. Pharmacol. Toxicol 39, 143-146), cardiotoxicidad (Beachamet al. 2010 J Biomol Screen 15, 441-446; Felix et al. 2004 Assay Drug Dev Technol 2, 260-268; Xia et al. 2004 Anal Biochem 327, 74-81.) e inhibición de citocromos (Obach et al. 2006 J Pharmacol Exp Ther, 2006. 316(1): p. 336-48), pruebas generalmente empleadas en la industria farmacéutica para evaluar las moléculas con interés terapéutico. In order to evaluate the pre-clinical characteristics of isolecaloric acid, cytotoxicity tests were performed (Corine, et al. 1998 J. Pharmacol. Toxicol 39, 143-146), cardiotoxicity (Beachamet al. 2010 J Biomol Screen 15, 441-446 ; Felix et al. 2004 Assay Drug Dev Technol 2, 260-268; Xia et al. 2004 Anal Biochem 327, 74-81.) And cytochrome inhibition (Obach et al. 2006 J Pharmacol Exp Ther, 2006. 316 (1 ): p. 336-48), tests generally used in the pharmaceutical industry to evaluate molecules with therapeutic interest.
El ácido isolecanórico es una molécula NO citotóxica, NO cardiotóxica y con escasas posibilidades de presentar interacciones medicamentosas in vivo. Isolecaloric acid is a NO cytotoxic, NO cardiotoxic molecule and with little chance of presenting drug interactions in vivo.
Claims (21)
- 5. 5.
- Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R7 es un grupo alquilo C1-C3. Use of the compound according to any of the preceding claims, wherein R7 is a C1-C3 alkyl group.
- 6. 6.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R7 es metilo. Use according to any of the preceding claims, wherein R7 is methyl.
- 9. 9.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R9 es metilo. 35 Use according to any of the preceding claims, wherein R9 is methyl. 35
- 11. eleven.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R10 es hidrógeno. 40 Use according to any of the preceding claims, wherein R10 is hydrogen. 40
- 12. 12.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho compuesto es el ácido isolecanórico. Use according to any of the preceding claims, wherein said compound is isolecaloric acid.
- 13. 13.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, donde la enfermedad neurodegenerativa se selecciona Use according to any of claims 2 to 12, wherein the neurodegenerative disease is selected
- 14. 14.
- Uso según la reivindicación anterior, donde la enfermedad neurodegenerativa es ELA. Use according to the preceding claim, wherein the neurodegenerative disease is ALS.
- 15. fifteen.
- Uso del compuesto de fórmula (I) descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, como antioxidante. Use of the compound of formula (I) described according to any of claims 1 to 12, as an antioxidant.
- 16. 16.
- Uso del compuesto de fórmula (I) descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, como aditivo en alimentos funcionales o complemento alimentarios o dietéticos. Use of the compound of formula (I) described according to any of claims 1 to 12, as an additive in functional foods or food or dietary supplements.
- 23. 2. 3.
- Composición farmacéutica que comprende el ácido isolecanórico. Pharmaceutical composition comprising isolecaloric acid.
- 24. 24.
- Composición farmacéutica que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Pharmaceutical composition further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
- Categoría Category
- 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas 56 Documents cited Claims Affected
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- SCHMEDA-HIRSCHMANN GUILLERMO et al. A new antifungal and antiprotozoal depside from the Andean lichen Protousnea poeppigii. Phytotherapy research: PTR England Mar 2008 03/2008 VOL: 22 No: 3 Págs: 349-355 ISSN 1099-1573 (Electronic) Doi: pubmed:18058986, figura 1, tabla 2. 1-24 SCHMEDA-HIRSCHMANN GUILLERMO et al. A new antifungal and antiprotozoal depside from the Andean lichen Protousnea poeppigii. Phytotherapy research: PTR England Mar 2008 03/2008 VOL: 22 No: 3 Pages: 349-355 ISSN 1099-1573 (Electronic) Doi: pubmed: 18058986, figure 1, table 2. 1-24
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- SAKURAI, A y GOTO, Y.: Chemical studies on the Lichen. I. The structure of isolecanoric acid, a new ortho-depside isolated from Parmelia tinctorum Despr. Bull Chem. Soc. Jpn, 1987, vol. 60, páginas 1917-1918, ISSN 0009-2673, todo el documento. 1-24 SAKURAI, A and GOTO, Y .: Chemical studies on the Lichen. I. The structure of isolecanoric acid, a new ortho-depside isolated from Parmelia tinctorum Despr. Bull Chem. Soc. Jpn, 1987, vol. 60, pages 1917-1918, ISSN 0009-2673, the whole document. 1-24
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- CHILD J J et al. Purification and properties of a phenol carboxylic acid acyl esterase from Aspergillus flavus..Canadian journal of microbiology CANADA Nov 1971 11/1971 VOL: 17 No: 11 Págs: 1455-1463 ISSN 0008-4166 (Print) Doi: pubmed:5003249, figura 1. 1-24 CHILD J J et al. Purification and properties of a phenol carboxylic acid acyl esterase from Aspergillus flavus..Canadian journal of microbiology CANADA Nov 1971 11/1971 VOL: 17 No: 11 Pages: 1455-1463 ISSN 0008-4166 (Print) Doi: pubmed: 5003249, figure one. 1-24
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- TRANCHIMAND S et al. First chemical synthesis of three natural depsides involved in flavonol catabolism and related to quercetinase catalysis. Synthetic Communications 2006 us 2006 VOL: 36 No: 5 Págs: 587-597 ISSN 0039-7911 (print) ISSN 1532-2432 (electronic) Doi: doi:10.1080/00397910500406534, página 589, esquema 4. 1-24 TRANCHIMAND S et al. First chemical synthesis of three natural depsides involved in flavonol catabolism and related to quercetinase catalysis. Synthetic Communications 2006 us 2006 VOL: 36 No: 5 Pages: 587-597 ISSN 0039-7911 (print) ISSN 1532-2432 (electronic) Doi: doi: 10.1080 / 00397910500406534, page 589, scheme 4. 1-24
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- WO 2008109521 A2 (UNIV SOUTH FLORIDA et al.) 12.09.2008, páginas 2,3,4. 1-24 WO 2008109521 A2 (UNIV SOUTH FLORIDA et al.) 12.09.2008, pages 2,3,4. 1-24
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- Reivindicaciones 1-24 Reivindicaciones SI NO Claims 1-24 Claims IF NOT
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- SCHMEDA-HIRSCHMANN GUILLERMO et al. A new antifungal and antiprotozoal depside from the Andean lichen Protousnea poeppigii. Phytotherapy research: PTR England Mar 2008 03/2008 VOL: 22 No: 3 Págs: 349-355 ISSN 1099-1573 (Electronic) Doi: pubmed:18058986, figura 1, tabla 2. 29.02.2008 SCHMEDA-HIRSCHMANN GUILLERMO et al. A new antifungal and antiprotozoal depside from the Andean lichen Protousnea poeppigii. Phytotherapy research: PTR England Mar 2008 03/2008 VOL: 22 No: 3 Pages: 349-355 ISSN 1099-1573 (Electronic) Doi: pubmed: 18058986, figure 1, table 2. 02.29.2008
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- SAKURAI, A y GOTO, Y.: Chemical studies on the Lichen. I. The structure of isolecanoric acid, a new ortho-depside isolated from Parmelia tinctorum Despr. Bull Chem. Soc. Jpn, 1987, vol. 60, páginas 1917-1918, ISSN 0009-2673, todo el documento. SAKURAI, A and GOTO, Y .: Chemical studies on the Lichen. I. The structure of isolecanoric acid, a new ortho-depside isolated from Parmelia tinctorum Despr. Bull Chem. Soc. Jpn, 1987, vol. 60, pages 1917-1918, ISSN 0009-2673, the whole document.
- D03 D03
- CHILD J J et al. Purification and properties of a phenol carboxylic acid acyl esterase from Aspergillus flavus..Canadian journal of microbiology CANADA Nov 1971 11/1971 VOL: 17 No: 11 Págs: 1455-1463 ISSN 0008-4166 (Print) Doi: pubmed:5003249, figura 1. 31.10.1971 CHILD J J et al. Purification and properties of a phenol carboxylic acid acyl esterase from Aspergillus flavus..Canadian journal of microbiology CANADA Nov 1971 11/1971 VOL: 17 No: 11 Pages: 1455-1463 ISSN 0008-4166 (Print) Doi: pubmed: 5003249, figure one. 10/31/1971
- D04 D04
- TRANCHIMAND S et al. First chemical synthesis of three natural depsides involved in flavonol catabolism and related to quercetinase catalysis. Synthetic Communications 2006 us 2006 VOL: 36 No: 5 Págs: 587-597 ISSN 0039-7911 (print) ISSN 1532-2432 (electronic) Doi: doi:10.1080/00397910500406534, página 589, esquema 4. 30.11.2005 TRANCHIMAND S et al. First chemical synthesis of three natural depsides involved in flavonol catabolism and related to quercetinase catalysis. Synthetic Communications 2006 us 2006 VOL: 36 No: 5 Pages: 587-597 ISSN 0039-7911 (print) ISSN 1532-2432 (electronic) Doi: doi: 10.1080 / 00397910500406534, page 589, scheme 4. 11/30/2005
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| CN104531535B (en) * | 2014-10-17 | 2017-08-04 | 南京工业大学 | Production of pneumocandin B0Gene recombination strain, breeding method and application |
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