ES2421207A1 - Procedure and diagnostic kit for lissencephaly with cerebellar hypoplasia in sheep (Machine-translation by Google Translate, not legally binding) - Google Patents

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ES2421207A1 ES201330806A ES201330806A ES2421207A1 ES 2421207 A1 ES2421207 A1 ES 2421207A1 ES 201330806 A ES201330806 A ES 201330806A ES 201330806 A ES201330806 A ES 201330806A ES 2421207 A1 ES2421207 A1 ES 2421207A1
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Juan José ARRANZ SANTOS
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Abstract

Procedure and diagnostic kit for lissencephaly with cerebellar hypoplasia in sheep. The method comprises detecting the presence or absence of a dna fragment of the sheep reln gene, identified by the sequence seq id no: 1, in a biological sample obtained from sheep. Said identification can be carried out by amplifying by pcr in said sample a fragment of dna located between the primers with an identity of at least 80% with respect to the sequences seq id no: 2 and 3, determining the number and size of the resulting dna fragments. Said amplification and making a diagnosis of lissencephaly with cerebellar hypoplasia from the information obtained in the previous step. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Description

Procedimiento y kit de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino. Procedure and diagnosis kit for lissencephaly with cerebellar hypoplasia in sheep.

CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la invención es el diagnóstico de enfermedades genéticas de herencia mendeliana simple (monogénica) en animales domésticos. En particular, la presente invención se refiere a la detección de la mutación responsable de la enfermedad genética denominada lisencefalia con hipoplasia cerebelar en el ganado ovino y al método de determinación del estatus genético de un individuo (sano, portador, enfermo) en relación con esta enfermedad. FIELD OF THE INVENTION The field of the invention is the diagnosis of genetic diseases of simple (monogenic) Mendelian inheritance in domestic animals. In particular, the present invention relates to the detection of the mutation responsible for the genetic disease called lisencephaly with cerebellar hypoplasia in sheep and to the method of determining the genetic status of an individual (healthy, carrier, sick) in relation to this disease.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El término lisencefalia significa literalmente “cerebro liso” y engloba a un grupo de malformaciones severas del cerebro causadas por una migración anormal de las neuronas post-mitóticas al córtex en desarrollo. La lisencefalia se caracteriza por la ausencia total (agiria) o parcial (paquigiria) de circunvoluciones cerebrales. Se asocia con un córtex cerebral engrosado y heterotopia neuronal difusa. BACKGROUND OF THE INVENTION The term lissencephaly literally means "smooth brain" and encompasses a group of severe brain malformations caused by abnormal migration of post-mitotic neurons to the developing cortex. Lysencephaly is characterized by total (agiria) or partial absence (pachygyria) of cerebral convolutions. It is associated with a thickened cerebral cortex and diffuse neuronal heterotopia.

Existen diversos tipos de lisencefalia, pero principalmente se clasifican en dos: lisencefalia clásica y lisencefalia pavimentosa. La lisencefalia con hipoplasia cerebelar (LHC) se constituye como una variante de estas, ya que a las malformaciones a nivel del córtex cerebral (que pueden ser de tipo clásica o pavimentosa) se asocia un subdesarrollo del cerebelo. Dentro de la LHC se pueden distinguir seis subtipos. There are several types of lissencephaly, but they are mainly classified in two: classical lissencephaly and pavement lissencephaly. Lysencephaly with cerebellar hypoplasia (LHC) is constituted as a variant of these, since a subdevelopment of the cerebellum is associated with malformations at the level of the cerebral cortex (which may be classical or pavement type). Within the LHC, six subtypes can be distinguished.

La base genética de la LHC ovina no ha sido descrita y por tanto no existe actualmente un marcador genético para esta enfermedad del ganado ovino que pueda utilizarse para predecir el estatus de portador o no portador de animales sanos en rebaños en los que se haya identificado la enfermedad. The genetic basis of ovine LHC has not been described and therefore there is currently no genetic marker for this disease of sheep that can be used to predict the status of carrier or non-carrier of healthy animals in herds in which the disease.

El procedimiento diagnóstico de la LHC descrito en la presente invención se basa en que en la presente invención se ha identificado una mutación asociada a la enfermedad en un fragmento del gen RELN, que codifica para la proteína Reelina. La Reelina es una proteína extracelular implicada en la migración neuronal postmitótica durante el periodo embrionario que juega un papel clave en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). The diagnostic procedure of the LHC described in the present invention is based on the fact that in the present invention a mutation associated with the disease has been identified in a fragment of the RELN gene, which codes for the Reelin protein. Reelin is an extracellular protein involved in postmitotic neuronal migration during the embryonic period that plays a key role in the development of the central nervous system (CNS).

En humanos, mutaciones en el gen RELN provocan una LHC conocida como lisencefalia tipo 2 o síndrome Norman Roberts (OMIM: 257320). En roedores, alteraciones en la reelina o en su cascada de señalización originan el fenotipo reeler. Los roedores reeler han sido ampliamente estudiados tanto por ser un modelo de la enfermedad humana como por su utilidad a la hora del estudio de la migración neuronal y desarrollo del SNC. In humans, mutations in the RELN gene cause an LHC known as lissencephaly type 2 or Norman Roberts syndrome (OMIM: 257320). In rodents, alterations in the reelin or in its signaling cascade originate the reeler phenotype. Reeler rodents have been widely studied both for being a model of human disease and for its usefulness when studying the neuronal migration and development of the CNS.

El gen RELN está situado en el cromosoma ovino 4 (OAR4), en la región 44.668.137- 45.204.609 pb según la versión Oarv3.1 del genoma ovino. La distribución de exones e intrones a lo largo de las 536.472 Kb del ADN que contiene el gen RELN no se ha determinado anteriormente. The RELN gene is located on the sheep chromosome 4 (OAR4), in the region 44.668.137- 45.204.609 bp according to the Oarv3.1 version of the sheep genome. The distribution of exons and introns along the 536,472 Kb of the DNA that contains the RELN gene has not been determined previously.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Una realización es un procedimiento de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino que comprende la detección de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN del gen RELN ovino, identificado por la secuencia SEQ ID NO: 1, en una muestra biológica obtenida de ganado ovino, en adelante procedimiento de la invención. DESCRIPTION OF THE INVENTION An embodiment is a diagnostic procedure of lissencephaly with cerebellar hypoplasia in sheep that comprises the detection of the presence or absence of a DNA fragment of the sheep RELN gene, identified by the sequence SEQ ID NO: 1, in a biological sample obtained from sheep, hereinafter method of the invention.

Los inventores de la presente invención han determinado que el tamaño de la región codificante del gen es de 10383 pb distribuidos en un total de 64 exones. The inventors of the present invention have determined that the size of the gene coding region is 10383 bp distributed over a total of 64 exons.

La secuencia codificante del mARN (CDS) del gen RELN ha sido depositada por los inventores de la presente invención en GenBank con fecha 07/02/2013, obteniéndose para ella el número de acceso KC590614. The mRNA coding sequence (CDS) of the RELN gene has been deposited by the inventors of the present invention in GenBank dated 07/02/2013, obtaining access number KC590614 for it.

El fragmento de ADN identificado por la secuencia SEQ ID NO: 1 corresponde a una deleción de 31 pb entre las posiciones 5.410 y 5.440 de la secuencia codificante del mARN del gen RELN ovino antes referida (GenBank Acc. no KC590614), correspondiente a las posiciones 44752377 y 44752407 pb en la secuencia de ADN del genoma ovino (Oarv3.1), en el exón 36 del gen. Esta deleción se ha identificado por primera vez en la presente invención como responsable de la lisencefalia con hipoplasia cerebelar en oveja, mediante un estudio comparado de la secuencia codificante de este gen en animales enfermos y sanos. The DNA fragment identified by the sequence SEQ ID NO: 1 corresponds to a 31 bp deletion between positions 5.410 and 5.440 of the mRNA coding sequence of the sheep gene referred to above (GenBank Acc. No KC590614), corresponding to the positions 44752377 and 44752407 bp in the DNA sequence of the sheep genome (Oarv3.1), in exon 36 of the gene. This deletion has been identified for the first time in the present invention as responsible for lissencephaly with cerebellar hypoplasia in sheep, by a comparative study of the coding sequence of this gene in sick and healthy animals.

El procedimiento de la invención permite detectar individuos sanos portadores de la enfermedad. Dichos portadores serán heterocigotos para la deleción de 31 pb localizada en el exón 36 del gen, es decir tendrán una copia del gen completa y otra copia portadora de la delecion. The method of the invention allows to detect healthy individuals carrying the disease. Such carriers will be heterozygous for the 31 bp deletion located in exon 36 of the gene, that is, they will have a copy of the complete gene and another carrier copy of the deletion.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha detección se realiza con un biosensor o microarray. Another embodiment is the process of the invention, wherein said detection is performed with a biosensor or microarray.

Otra realización es el procedimiento de la invención, que comprende: Another embodiment is the process of the invention, which comprises:

(a)(to)
amplificar por PCR en dicha muestra biológica un fragmento de ADN situado entre los cebadores con una identidad de al menos 80 % respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3,  PCR amplify in said biological sample a DNA fragment located between the primers with an identity of at least 80% with respect to the sequences SEQ ID NO: 2 and 3,

(b)(b)
determinar el número y tamaño de los fragmentos de ADN resultantes de dicha amplificación y  determine the number and size of the DNA fragments resulting from said amplification and

(c)(C)
realizar un diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar a partir de la información obtenida en el paso (b).  make a diagnosis of lissencephaly with cerebellar hypoplasia based on the information obtained in step (b).

En la presente solicitud, dicho porcentaje de identidad en una secuencia determinada se calcula teniendo en cuenta que un 80% de identidad significa que un 80% de residuos de la secuencia completa de los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3 son idénticos a los residuos de la secuencia determinada. In the present application, said percentage of identity in a given sequence is calculated taking into account that 80% identity means that 80% residues of the complete sequence of the primers identified by the sequences SEQ ID NO: 2 and 3 are identical to the residues of the determined sequence.

Otra realización es el procedimiento de la invención, en el que antes de la etapa (a) se realiza una extracción de ADN de dicha muestra biológica. Another embodiment is the process of the invention, in which prior to step (a) an extraction of DNA of said biological sample.

La extracción del ADN a partir de estas muestras se puede realizar por métodos como el fenol-cloroformo descrito en Sambrook, 1989 (Sambrook, J. et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); por el método “Salting out” descrito en Miller, 1988 (Miller, S.A. et al, 1988. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic acids research, 16(3), pp. 1215) en el caso del semen o la utilización de Chelex-100 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) para la extracción a partir de muestras de pelo. La extracción del ADN también se puede realizar utilizando Kits comerciales de extracción de ADN, sobre todo para muestras de saliva o de muestras de flujo nasal en las que se parte de una escasa cantidad de células nucleadas. DNA extraction from these samples can be performed by methods such as the phenol-chloroform described in Sambrook, 1989 (Sambrook, J. et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); by the "Salting out" method described in Miller, 1988 (Miller, S.A. et al, 1988. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic acids research, 16 (3), pp. 1215) in the case of semen or the use of Chelex-100 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) for extraction from of hair samples. DNA extraction can also be performed using commercial extraction kits. DNA, especially for saliva samples or nasal flow samples in which a small amount is started of nucleated cells.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha identidad de secuencia es de al menos 90%. Another embodiment is the process of the invention, wherein said sequence identity is at least 90%.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dichos cebadores están identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. Another embodiment is the process of the invention, wherein said primers are identified by the sequences. SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha muestra biológica está seleccionada del grupo compuesto por pelo, tejido, célula o fluido biológico. Another embodiment is the process of the invention, wherein said biological sample is selected from the group. composed of hair, tissue, cell or biological fluid.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicho fluido biológico está seleccionado del grupo compuesto por saliva, leche, suero, plasma sanguíneo, sangre, semen y fluido nasal. Another embodiment is the process of the invention, wherein said biological fluid is selected from the group. composed of saliva, milk, serum, blood plasma, blood, semen and nasal fluid.

Otra realización es un kit para realizar el procedimiento de la invención, que comprende los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. Another embodiment is a kit for performing the process of the invention, which comprises the primers identified. for the sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.

El procedimiento de la invención constituye un método sencillo, rápido y económico de detección de animales portadores, evitando que animales heterocigotos puedan seleccionarse para reposición en el rebaño y ser incluidos en el programa de mejora correspondiente, hechos que favorecerían la diseminación de la enfermedad. The process of the invention constitutes a simple, fast and economical method of animal detection. carriers, preventing heterozygous animals from being selected for replacement in the herd and included in the corresponding improvement program, facts that would favor the spread of the disease.

El procedimiento de la invención puede utilizarse también para la detección de animales portadores en el caso de cruzamientos programados para obtener animales que sirvan como modelo animal en el estudio de la enfermedad. The process of the invention can also be used for the detection of carrier animals in the case of Crossings programmed to obtain animals that serve as an animal model in the study of the disease.

El procedimiento de la invención puede aplicarse a corderos que presenten síntomas nerviosos compatibles con la enfermedad con el fin de descartarla sin necesidad de realizar una necropsia. Otras enfermedades con síntomas similares son la colibacilosis nerviosa, que en corderos recién nacidos produce delgadez y ataxia. The method of the invention can be applied to lambs that have nerve symptoms compatible with the disease in order to rule it out without the need for a necropsy. Other diseases with symptoms Similar are colibacillosis nervosa, which in newborn lambs produces thinness and ataxia.

TEXTO LIBRE DE LA LISTA DE SECUENCIAS A continuación se aporta una traducción del texto libre en inglés que aparece en la lista de secuencias. FREE TEXT OF THE LIST OF SEQUENCES Below is a translation of the free text in English that appears in the sequence list.

SEQ ID NO: 1. Fragmento de deleción del gen ovino RELN. SEQ ID NO: 2. Cebador sentido para PCR. SEQ ID NO: 3. Cebador antisentido para PCR. SEQ ID NO: 4. Fragmento del gen salvaje ovino RELN. 188..365 Exón 36 277..307 Fragmento de deleción SEQ ID NO: 5. Fragmento del gen ovino RELN resultante de la deleción. 188..334 Exón 36 SEQ ID NO: 1. Fragment of deletion of the sheep gene RELN. SEQ ID NO: 2. Sense primer for PCR. SEQ ID NO: 3. PCR antisense primer. SEQ ID NO: 4. Fragment of the wild sheep gene RELN. 188..365 Exon 36 277..307 Deletion fragment SEQ ID NO: 5. Fragment of the sheep gene RELN resulting from the deletion. 188..334 Exon 36

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1. Se muestran los resultados para 5 muestras, de izquierda a derecha, en la tercera y cuarta muestras se obtuvo una única banda de 498 pb, que indica genotipo homocigoto para el alelo salvaje (+/+), y por tanto animales sanos y no portadores; en la segunda muestra se obtuvo una única banda de 467 pb, que indica genotipo homocigoto para la deleción de 31 pb (del/del), únicamente identificable en individuos afectados por la enfermedad. Figure 1. The results are shown for 5 samples, from left to right, in the third and fourth samples a single band of 498 bp was obtained, indicating homozygous genotype for the allele wild (+ / +), and therefore healthy and non-carrier animals; in the second sample a single band of 467 bp was obtained, which indicates homozygous genotype for the deletion of 31 bp (del / del), only identifiable in individuals affected by the disease.

En la primera y quinta muestras se obtuvieron dos bandas de 498 y 467 pb, que indican genotipo heterocigoto para la deleción (+/del), correspondiente a animales sanos pero portadores. In the first and fifth samples, two bands of 498 and 467 bp were obtained, indicating heterozygous genotype for deletion (+ / del), corresponding to healthy but carrier animals.

MODOS DE REALIZACIÓN PREFERENTE PREFERRED EMBODIMENTS

Ejemplo 1. Diagnóstico genético de animales afectados por lisencefalia con hipoplasia cerebelar y animales portadores de dicha enfermedad Example 1. Genetic diagnosis of animals affected by lissencephaly with cerebellar hypoplasia and animals carrying said disease

En una explotación ganadera nacieron corderos con incoordinación de movimiento, aunque con un estado de salud bueno. Se examinaron los corderos in vivo y se comprobó que sufrían un proceso neurológico que cursaba con ataxia e incapacidad para mantenerse en la estación. In a cattle farm, lambs were born with incoordination of movement, although with a good state of health. The lambs were examined in vivo and it was found that they suffered a neurological process that involved ataxia and inability to stay at the station.

En la necropsia se observaron alteraciones en el sistema nervioso central. En todos los casos se percibió una marcada ausencia de circunvoluciones cerebrales, con diferencias en cuanto a intensidad entre animales, pero siempre grave, tanto en la cara dorsal como en la ventral del cerebro así como una marcada hipoplasia cerebelar. At necropsy, alterations in the central nervous system were observed. In all cases, there was a marked absence of cerebral convolutions, with differences in intensity between animals, but always serious, both in the dorsal and ventral side of the brain as well as a marked cerebellar hypoplasia.

Se realizaron análisis anatomopatológicos correspondientes y se descartó la posible implicación de agentes infecciosos (como pestivirus y virus de lengua azul). A continuación se realizó un análisis del pedigrí de los animales afectados mediante marcadores microsatélite siguiendo el protocolo descrito en Glowatzki-Mullis, 2007 (Glowatzki-Mullis, M.L. et al, 2007. Cost-effective parentage verification with 17-plex PCR for goats and 19-plex PCR for sheep. Animal Genetics, 38(1), pp. 86-88). Tanto los análisis anatomopatológicos como los genéticos concluyeron que los animales sufrían lisencefalia con hipoplasia cerebelar. Corresponding pathological analyzes were performed and the possible involvement of infectious agents (such as pestivirus and bluetongue virus) was ruled out. A pedigree analysis of the affected animals was then performed using microsatellite markers following the protocol described in Glowatzki-Mullis, 2007 (Glowatzki-Mullis, ML et al, 2007. Cost-effective parentage verification with 17-plex PCR for goats and 19 -plex PCR for sheep Animal Genetics, 38 (1), pp. 86-88). Both pathological and genetic analyzes concluded that the animals suffered lissencephaly with cerebellar hypoplasia.

Extracción del ADN a partir de la muestra biológica obtenida del animal en estudio. DNA extraction from the biological sample obtained from the animal under study.

En el presente ejemplo se utilizaron 4 de los corderos enfermos, las madres de los mismos (clasificadas como portadoras) y 41 machos de los que no se conocía el estatus genético. Las muestras utilizadas para la extracción de DNA fueron de sangre en todos los casos. La extracción de DNA se realizó por el método de “Salting out” descrito en Miller, 1988. In the present example, 4 of the sick lambs, their mothers (classified as carriers) and 41 males whose genetic status was unknown were used. The samples used for DNA extraction were from blood in all cases. DNA extraction was performed by the "Salting out" method described in Miller, 1988.

Diseño de los cebadores Primers Design

Los cebadores se diseñaron específicamente con el programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3), a partir de la secuencia del genoma ovino v3.1, y tras la identificación en la misma de los exones identificados tras el análisis de la secuencia de mARN del gen RELN. Así se partió de una región de 498 pb que incluía el Exon36, y 187 bp de la región intrónica anterior y 133 pb de la región intrónica posterior al mismo. The primers were specifically designed with the Primer3 program (http://frodo.wi.mit.edu/primer3), from the sheep genome sequence v3.1, and after the identification therein of the exons identified after mRNA sequence analysis of the RELN gene. This was based on a region of 498 bp that included Exon36, and 187 bp of the anterior intronic region and 133 bp of the posterior intronic region.

Se seleccionó una pareja de cebadores, cebador sentido, identificado con la secuencia SEQ ID NO: 2 y cebador antisentido, identificado con la secuencia SEQ ID NO: 3. A pair of primers, sense primer, identified with the sequence SEQ ID NO: 2 and antisense primer, identified with the sequence SEQ ID NO: 3 was selected.

El tamaño del fragmento amplificado con esta pareja de cebadores fue 498 bp para la secuencia salvaje o no mutada, dicho fragmento incluye la secuencia completa del exón 36 (178 pb), 187 bp de la región intrónica anterior y 133 pb de la región intrónica posterior al mismo. En el caso de la presencia de la deleción de 31 pb el tamaño del amplicón fue 467 pb. The size of the fragment amplified with this pair of primers was 498 bp for the wild or non-mutated sequence, said fragment includes the complete sequence of exon 36 (178 bp), 187 bp of the anterior intronic region and 133 bp of the posterior intronic region the same. In the case of the presence of the 31 bp deletion, the size of the amplicon was 467 bp.

Amplificación del ADN DNA amplification

Se realizó la amplificación del fragmento de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este estudio, las reacciones de PCR estuvieron constituidas por un 80% de lo que denominamos “mezcla”, mientras que otro 20% fue de ADN total (10-30 ng/ml). La “mezcla” estuvo constituida por un 1X de tampón 10X (Gold Applied Biosystem, AB), MgCl2 (de 1,5 μM a 2,5 μM), dNTPs (480 μM), los cebadores diseñados específicamente para la amplificación del fragmento de ADN de interés (0,5 μM), dH2O y la encima polimerasa (AmpliTaq GoldTM de AB) (5 U/ml). Amplification of the DNA fragment was performed by polymerase chain reaction (PCR). In this study, the PCR reactions were constituted by 80% of what we call "mixture", while another 20% was of total DNA (10-30 ng / ml). The "mixture" consisted of a 1X buffer 10X (Gold Applied Biosystem, AB), MgCl2 (1.5 μM to 2.5 μM), dNTPs (480 μM), primers designed specifically for amplification of the fragment of DNA of interest (0.5 μM), dH2O and the above polymerase (AB AmpliTaq GoldTM) (5 U / ml).

La amplificación se llevó a cabo en un termociclador automático (GeneAmp® PCR System 9700, AB). Los ciclos de temperatura siempre se vieron precedidos de un paso de desnaturalización a 95ºC durante 5 minutos. Posteriormente se realizaron 35 ciclos, estando cada uno compuesto de 3 pasos: The amplification was carried out in an automatic thermal cycler (GeneAmp® PCR System 9700, AB). The temperature cycles were always preceded by a denaturation step at 95 ° C for 5 minutes. Subsequently, 35 cycles were performed, each consisting of 3 steps:

--
Desnaturalización del ADN: 94ºC, 30s.  DNA denaturation: 94 ° C, 30s.

--
Hibridación de los cebadores con el ADN: 58ºC, 40 s.  Hybridization of the primers with the DNA: 58 ° C, 40 s.

--
Síntesis de ADN: 72ºC, 40 s.  DNA synthesis: 72 ° C, 40 s.

El último ciclo finalizó en todos los casos con una extensión final de 10 minutos a 72ºC. The last cycle ended in all cases with a final extension of 10 minutes at 72 ° C.

Separación y visualización del fragmento o fragmentos amplificados por electroforesis en gel de agarosa Separation and visualization of the fragment or fragments amplified by agarose gel electrophoresis

Se utilizó un gel de agarosa al 2% (100 ml de TBE 1X y 2 g de agarosa) al que previamente se añadió 4 μl de RedSafe (iNtRON Biotechnology). El tampón TBE 1X se obtuvo a partir de una preparación previa de TBE 10X (TrisBase 54 g; Ácido Bórico: 27,5 g; EDTA 0.5 M 40 mL y agua mQ hasta 1L). A 2% agarose gel (100 ml of 1X TBE and 2 g of agarose) was used to which 4 µl of RedSafe (iNtRON Biotechnology) was previously added. The 1X TBE buffer was obtained from a previous preparation of 10X TBE (TrisBase 54 g; Boric Acid: 27.5 g; 0.5 M EDTA 40 mL and mQ water up to 1L).

El gel se introdujo en una cubeta horizontal de electroforesis con 700 ml de tampón TBE 1X. The gel was introduced into a horizontal electrophoresis cuvette with 700 ml of 1X TBE buffer.

En cada pocillo del gel se cargaron 8 μl del producto de PCR y 4 μl de tampón de carga Ficoll. Asimismo, se utilizó uno de los pocillos de cada fila para cargar un marcador tamaño que nos permitió determinar con exactitud el tamaño de las muestras. El marcador utilizado fue el XIV de 100 pb (Roche Diagnostic S.L.) que contiene 15 fragmentos de ADN de doble cadena comprendidos entre 100 a 1500 pb y una banda adicional de 2642 pb. 8 µl of the PCR product and 4 µl of Ficoll loading buffer were loaded into each well of the gel. Likewise, one of the wells in each row was used to load a size marker that allowed us to determine the exact size of the samples. The marker used was the XIV of 100 bp (Roche Diagnostic S.L.) containing 15 fragments of double stranded DNA between 100 to 1500 bp and an additional band of 2642 bp.

En el inicio de la electroforesis se aplicó un voltaje de 100 V que se mantuvo constante durante 45 minutos. At the beginning of the electrophoresis, a voltage of 100 V was applied, which remained constant for 45 minutes.

Posteriormente se visualizaron las bandas amplificadas en un transiluminador de luz ultravioleta. Los resultados obtenidos permitieron agrupar las muestras en los siguientes grupos: Subsequently, the amplified bands were visualized in an ultraviolet light transilluminator. The results obtained allowed grouping the samples into the following groups:

--
muestras con una sola banda de 498 pb, correspondientes al genotipo homocigoto no mutado, es decir, a animales sanos y no portadores de la enfermedad.  samples with a single band of 498 bp, corresponding to the homozygous genotype not mutated, that is, to healthy animals and not carriers of the disease.

--
muestras con una sola banda de 467 pb, correspondientes a animales homocigotos para la deleción, es decir, a animales afectados por la enfermedad y  samples with a single band of 467 bp, corresponding to animals homozygous for deletion, that is, animals affected by the disease and

--
muestras con una doble banda de 467 y 498 pb, correspondientes al genotipo heterocigoto para la deleción, es decir, a animales sanos pero portadores de la enfermedad.  samples with a double band of 467 and 498 bp, corresponding to the heterozygous genotype for deletion, that is, to healthy animals but carriers of the disease.

En la Figura 1 se muestran un resultado representativo de este ejemplo, en el que se muestran los resultados obtenidos para muestras obtenidas de 5 animales diferentes. A representative result of this example is shown in Figure 1, in which the results obtained for samples obtained from 5 different animals are shown.

Claims (8)

REIVINDICACIONES 1. Procedimiento de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino que comprende la detección de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN del gen RELN ovino, identificado por la secuencia SEQ ID NO: 1, en una muestra biológica obtenida de ganado ovino. 1. Diagnostic procedure for lissencephaly with cerebellar hypoplasia in sheep that includes the detection of the presence or absence of a DNA fragment of the sheep RELN gene, identified by the sequence SEQ ID NO: 1, in a biological sample obtained from sheep .
5 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende: Method according to claim 1, characterized in that it comprises:
(a)(to)
amplificar por PCR en dicha muestra biológica un fragmento de ADN situado entre los cebadores con una identidad de al menos 80 % respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3,  PCR amplify in said biological sample a DNA fragment located between the primers with an identity of at least 80% with respect to the sequences SEQ ID NO: 2 and 3,
(b)(b)
determinar el número y tamaño de los fragmentos de ADN resultantes de dicha amplificación y  determine the number and size of the DNA fragments resulting from said amplification and
(c)(C)
realizar un diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar a partir de la información obtenida en el paso 10 (b).  Make a diagnosis of lissencephaly with cerebellar hypoplasia based on the information obtained in step 10 (b).
3. 3.
Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que antes de la etapa (a) se realiza una extracción de ADN de dicha muestra biológica. Method according to claim 2, characterized in that prior to step (a) DNA extraction is performed from said biological sample.
4. Four.
Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicha identidad de secuencia es de al menos 90%. Method according to claim 2, characterized in that said sequence identity is at least 90%.
15 5. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que dichos cebadores están identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. Method according to claim 3, characterized in that said primers are identified by the sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha detección se realiza con un biosensor o microarray. Method according to claim 1, characterized in that said detection is carried out with a biosensor or microarray. 7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que dicha muestra biológica 20 está seleccionada del grupo compuesto por pelo, tejido, célula o fluido biológico. Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that said biological sample 20 is selected from the group consisting of hair, tissue, cell or biological fluid.
8. 8.
Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por que dicho fluido biológico está seleccionado del grupo compuesto por saliva, leche, suero, plasma sanguíneo, sangre, semen y fluido nasal. Method according to claim 7, characterized in that said biological fluid is selected from the group consisting of saliva, milk, serum, blood plasma, blood, semen and nasal fluid.
9. 9.
Kit para realizar el procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que comprende los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. Kit for carrying out the method according to claim 2, characterized in that it comprises the primers identified by the sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
SEQUENCE LISTING SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSIDAD DE LEÓN <110> UNIVERSITY OF LEÓN <120> PROCEDIMIENTO Y KIT DE DIAGNÓSTICO DE LISENCEFALIA CON HIPOPLASIA CEREBELAR EN GANADO OVINO <120> LISENCEFALIA DIAGNOSTIC PROCEDURE AND KIT WITH CEREBELLARY HYPOPLASIA IN OVINE LIVESTOCK <130> P3745/2013 <130> P3745 / 2013 <160> 5 <160> 5 <170> BiSSAP 1.2 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <210> 1 <211> 31 <211> 31 <212> DNA <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Artificial Sequence <220> <220> <221> source <221> source <222> 1..31 <222> 1..31 <223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Ovine RELN gene deletion fragment"/organism="Artificial Sequence" <223> / mol_type = "unassigned DNA" / note = "Ovine RELN gene deletion fragment" / organism = "Artificial Sequence" <400> 1 gatgtaagtt cccattgaaa tcatctttaa g 31 <400> 1 gatgtaagtt cccattgaaa tcatctttaa g 31 <210> 2 <210> 2 <211> 20 <211> 20 <212> DNA <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Artificial Sequence <220> <220> <221> source <221> source <222> 1..20 <222> 1..20 <223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Sense PCR primer"/organism="Artificial Sequence" <223> / mol_type = "unassigned DNA" / note = "Sense PCR primer" / organism = "Artificial Sequence" <400> 2 ttgccttctc cggtttaatg 20 <400> 2 ttgccttctc cggtttaatg 20 <210> 3 <210> 3 <211> 20 <211> 20 <212> DNA <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Artificial Sequence <220> <220> <221> source <221> source <222> 1..20 <222> 1..20 <223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Antisense PCR primer"/organism="Artificial Sequence" <223> / mol_type = "unassigned DNA" / note = "Antisense PCR primer" / organism = "Artificial Sequence" <400> 3 <400> 3 agggatttgt gatgctggac 20 agggatttgt gatgctggac 20 <210> 4 <210> 4 <211> 498 <211> 498 <212> DNA <212> DNA <213> Ovis aries <213> Ovis aries <220> <220> <221> source <221> source <222> 1..498 <222> 1,498 <223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Wild type ovine RELN gene fragment"/organism="Ovis aries" <223> / mol_type = "unassigned DNA" / note = "Wild type ovine RELN gene fragment" / organism = "Ovis aries" <220> <220> <221> exon <221> exon <222> 188..365 <222> 188..365 <223> /note="Exon 36" <223> / note = "Exon 36" <220> <220> <221> variation <221> variation <222> 277..307 <222> 277..307 <223> /note="Deletion fragment" <223> / note = "Deletion fragment" <400> 4 ttgccttctc cggtttaatg cccaagtgat cataaaaaat gatctcagtc gatataagag 60 <400> 4 ttgccttctc cggtttaatg cccaagtgat cataaaaaat gatctcagtc gatataagag 60 gaaacatgat atgtgttaga agacagtaac agtatataca ataatatatc atctgaacag 120 gaaacatgat atgtgttaga agacagtaac agtatataca ataatatatc atctgaacag 120 aaatgtatct atgtggagca ttgagaaaag acaggaattt cagtgctagt gaacagtctt 180 aaatgtatct atgtggagca ttgagaaaag acaggaattt cagtgctagt gaacagtctt 180 atctgacccc tttaaaaatg agcgatgttc cagacttgat ggtttcacca ttcagattcc 240 atctgacccc tttaaaaatg agcgatgttc cagacttgat ggtttcacca ttcagattcc 240 ccctctctgc accatacact tcaggccaaa ggtcgggatg taagttccca ttgaaatcat 300 ccctctctgc accatacact tcaggccaaa ggtcgggatg taagttccca ttgaaatcat 300 ctttaagaat cgagggtaga ggaataacag gaacacagta ggctccacca aagccccggt 360 ctttaagaat cgagggtaga ggaataacag gaacacagta ggctccacca aagccccggt 360 cacacctaag gaaaaaaatg agtggagaaa aggcattata tgtcatgaga tcaagatact 420 cacacctaag gaaaaaaatg agtggagaaa aggcattata tgtcatgaga tcaagatact 420 atctttcttt ttgcattaca aaaaaagaaa ctgccaattt cattaactta cacacagcgt 480 atctttcttt ttgcattaca aaaaaagaaa ctgccaattt cattaactta cacacagcgt 480 ccagcatcac aaatccct 498 ccagcatcac aaatccct 498 <210> 5 <210> 5 <211> 467 <211> 467 <212> DNA <212> DNA <213> Ovis aries <213> Ovis aries <220> <220> <221> source <221> source <222> 1..467 <222> 1,467 <223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Ovine RELN gene fragment resulting from deletion"/organism="Ovis aries" <223> / mol_type = "unassigned DNA" / note = "Ovine RELN gene fragment resulting from deletion" / organism = "Ovis aries" <220> <220> <221> exon <221> exon <222> 188..334 <222> 188..334 <223> /note="Exon 36" <223> / note = "Exon 36" <400> 5 ttgccttctc cggtttaatg cccaagtgat cataaaaaat gatctcagtc gatataagag 60 gaaacatgat atgtgttaga agacagtaac agtatataca ataatatatc atctgaacag 120 aaatgtatct atgtggagca ttgagaaaag acaggaattt cagtgctagt gaacagtctt 180 atctgacccc tttaaaaatg agcgatgttc cagacttgat ggtttcacca ttcagattcc 240 ccctctctgc accatacact tcaggccaaa ggtcggaatc gagggtagag gaataacagg 300 aacacagtag gctccaccaa agccccggtc acacctaagg aaaaaaatga gtggagaaaa 360 ggcattatat gtcatgagat caagatacta tctttctttt tgcattacaa aaaaagaaac 420 tgccaatttc attaacttac acacagcgtc cagcatcaca aatccct 467 <400> 5 ttgccttctc cggtttaatg cccaagtgat cataaaaaat gatctcagtc gatataagag 60 gaaacatgat atgtgttaga agacagtaac agtatataca ataatatatc atctgaacag 120 atgtggagca aaatgtatct ttgagaaaag acaggaattt cagtgctagt gaacagtctt 180 atctgacccc tttaaaaatg agcgatgttc cagacttgat ggtttcacca ttcagattcc 240 ccctctctgc accatacact tcaggccaaa ggtcggaatc gagggtagag gaataacagg 300 aacacagtag gctccaccaa agccccggtc acacctaagg gtggagaaaa aaaaaaatga 360 ggcattatat gtcatgagat caagatacta tctttctttt tgcattacaa aaaaagaaac 420 tgccaatttc attaacttac acacagcgtc cagcatcaca aatccct 467 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS SPANISH OFFICE OF THE PATENTS AND BRAND N.º solicitud: 201330806 Application no .: 201330806 ESPAÑA SPAIN Fecha de presentación de la solicitud: 31.05.2013 Date of submission of the application: 05.31.2013 Fecha de prioridad: Priority Date: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA REPORT ON THE STATE OF THE TECHNIQUE 51 Int. Cl. : G01N33/48 (2006.01) 51 Int. Cl.: G01N33 / 48 (2006.01) DOCUMENTOS RELEVANTES RELEVANT DOCUMENTS
Categoría Category
56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas 56 Documents cited Claims Affected
A TO
WO 2012003353 A2 (UNIV YALE et al.) 05.01.2012, reivindicaciones. 1-9 WO 2012003353 A2 (UNIV YALE et al.) 05.01.2012, claims. 1-9
A TO
WO 2008030065 A1 (MACROGEN INC et al.) 13.03.2008, reivindicaciones. 1-9 WO 2008030065 A1 (MACROGEN INC et al.) 13.03.2008, claims. 1-9
A TO
JP 2004081001 A (MITSUBISHI CHEM CORP et al.) 18.03.2004, recuperado de WPI, resumen. 1-9 JP 2004081001 A (MITSUBISHI CHEM CORP et al.) 18.03.2004, retrieved from WPI, summary. 1-9
A TO
WO 03091426 A1 (SPECTRAL GENOMICS INC et al.) 06.11.2003, reivindicaciones. 1-9 WO 03091426 A1 (SPECTRAL GENOMICS INC et al.) 06.11.2003, claims. 1-9
Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the date of priority submission of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application
El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº: This report has been prepared • for all claims • for claims no:
Fecha de realización del informe 08.08.2013 Date of realization of the report 08.08.2013
Examinador I. Rueda Molíns Página 1/4 Examiner I. Rueda Molíns Page 1/4
INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA REPORT OF THE STATE OF THE TECHNIQUE Nº de solicitud: 201330806 Application number: 201330806 Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) G01N Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de Minimum documentation sought (classification system followed by classification symbols) G01N Electronic databases consulted during the search (name of the database and, if possible, terms of búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, STN, TXT search used) INVENES, EPODOC, WPI, STN, TXT Informe del Estado de la Técnica Página 2/4 State of the Art Report Page 2/4 OPINIÓN ESCRITA  WRITTEN OPINION Nº de solicitud: 201330806 Application number: 201330806 Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 08.08.2013 Date of Completion of Written Opinion: 08.08.2013 Declaración Statement
Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986)
Reivindicaciones 1-9 Reivindicaciones SI NO Claims 1-9 Claims IF NOT
Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Inventive activity (Art. 8.1 LP11 / 1986)
Reivindicaciones 1-9 Reivindicaciones SI NO Claims 1-9 Claims IF NOT
Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986). The application is considered to comply with the industrial application requirement. This requirement was evaluated during the formal and technical examination phase of the application (Article 31.2 Law 11/1986). Base de la Opinión.-  Opinion Base.- La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica. This opinion has been made on the basis of the patent application as published. Informe del Estado de la Técnica Página 3/4 State of the Art Report Page 3/4 OPINIÓN ESCRITA  WRITTEN OPINION Nº de solicitud: 201330806 Application number: 201330806 1. Documentos considerados.-1. Documents considered.- A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión. The documents belonging to the state of the art taken into consideration for the realization of this opinion are listed below.
Documento Document
Número Publicación o Identificación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date
D01 D01
WO 2012003353 A2 (UNIV YALE et al.) 05.01.2012 WO 2012003353 A2 (UNIV YALE et al.) 05.01.2012
D02 D02
WO 2008030065 A1 (MACROGEN INC et al.) 13.03.2008 WO 2008030065 A1 (MACROGEN INC et al.) 13.03.2008
D03 D03
JP 2004081001 A (MITSUBISHI CHEM CORP et al.) 18.03.2004 JP 2004081001 A (MITSUBISHI CHEM CORP et al.) 03/18/2004
D04 D04
WO 03091426 A1 (SPECTRAL GENOMICS INC et al.) 06.11.2003 WO 03091426 A1 (SPECTRAL GENOMICS INC et al.) 06.11.2003
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración 2. Statement motivated according to articles 29.6 and 29.7 of the Regulation of execution of Law 11/1986, of March 20, on Patents on novelty and inventive activity; quotes and explanations in support of this statement NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (artículos 6 y 8 Ley 11/1986)  NOVELTY AND INVENTIVE ACTIVITY (articles 6 and 8 Law 11/1986) En las reivindicaciones 1-8, de la solicitud de patente, se reivindica un procedimiento de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino, que comprende la detección de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN del gen RELN ovino, identificado por la secuencia SEQ ID NO:1, en una muestra biológica obtenida de ganado. En la reivindicación 9, se reivindica un kit para la realización de dicho procedimiento. In claims 1-8, of the patent application, a diagnosis procedure of lissencephaly with cerebellar hypoplasia in sheep is claimed, which comprises the detection of the presence or absence of a DNA fragment of the sheep RELN gene, identified by the sequence SEQ ID NO: 1, in a biological sample obtained from cattle. In claim 9, a kit for performing said method is claimed. Se ha efectuado una búsqueda de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1, reivindicada en la solicitud de patente, esa secuencia no se ha encontrado en el estado de la técnica. Los documentos D01-D04 divulgan diferentes métodos de detección de lisencefalia. En ninguno de los citados documentos se refleja un procedimiento de diagnóstico de lisencefalia como el que se reivindica en la solicitud de patente. Por tanto, las reivindicaciones 1-9 presentan novedad y actividad inventiva, según lo establecido en los artículos 6 y 8 de la Ley 11/1986. A search of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, claimed in the patent application, has been performed, that sequence has not been found in the state of the art. Documents D01-D04 disclose different methods of detecting lissencephaly. None of the aforementioned documents reflects a diagnostic procedure for lissencephaly as claimed in the patent application. Therefore, claims 1-9 present novelty and inventive activity, as established in articles 6 and 8 of Law 11/1986. Informe del Estado de la Técnica Página 4/4 State of the Art Report Page 4/4
ES201330806A 2013-05-31 2013-05-31 Procedure and diagnosis kit for lissencephaly with cerebellar hypoplasia in sheep Active ES2421207B1 (en)

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