ES2417705B1 - RGD BIOMIMETIC PEPTIDE WITH AFFINITY DOMAIN BY TYPE I COLLAGEN AND ITS USES AS OSTEOGENIC FACTOR. - Google Patents

RGD BIOMIMETIC PEPTIDE WITH AFFINITY DOMAIN BY TYPE I COLLAGEN AND ITS USES AS OSTEOGENIC FACTOR. Download PDF

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Abstract

Péptido biomimético RGD con dominio de afinidad por el colágeno tipo I y sus usos como factor osteogénico.#La presente invención proporciona un péptido el cual presenta capacidad osteogénica. La presente invención también se refiere a la secuencia nucleotídica que codifica para dicho péptido así como a una construcción genética que contenga la secuencia nucleotídica, a un vector que contenga la construcción genética o la secuencia y a una célula hospedadora que contenga el vector. La invención también se refiere a composiciones que incluyan el péptido así como a los usos tanto del péptido, como de composiciones o como matrices que puedan incluirlo.RGD biomimetic peptide with affinity domain for type I collagen and its uses as an osteogenic factor. # The present invention provides a peptide which has osteogenic ability. The present invention also relates to the nucleotide sequence encoding said peptide as well as a genetic construct containing the nucleotide sequence, a vector containing the genetic construct or sequence and a host cell containing the vector. The invention also relates to compositions that include the peptide as well as to the uses of both the peptide, as of compositions or as matrices that may include it.

Description

Péptido biomimético RGD con dominio de afinidad por el colágeno tipo I y sus usos como factor osteogénico. RGD biomimetic peptide with affinity domain for type I collagen and its uses as an osteogenic factor.

La presente invención se encuadra en el campo de la biomedicina. Específicamente, se refiere a un péptido, así como a la secuencia nucleotídica que lo codifica, la construcción genética que la comprenda, un vector que comprenda la secuencia o la construcción, o la célula que comprende cualquiera de ellos el vector, y a sus usos como agentes osteogénicos, así como para la elaboración de un medicamento preferiblemente para la regeneración ósea o para el recubrimiento de implantes o prótesis. La presente invención también se refiere a una composición o a una matriz que comprenda el péptido y al uso de la composición o la matriz para la elaboración de un medicamento preferiblemente para la regeneración ósea. También se refiere al uso del péptido o de la matriz o para el recubrimiento de implantes o prótesis. The present invention falls within the field of biomedicine. Specifically, it refers to a peptide, as well as the nucleotide sequence that encodes it, the genetic construction that comprises it, a vector that comprises the sequence or the construction, or the cell that comprises any of them the vector, and its uses as osteogenic agents, as well as for the preparation of a medicament preferably for bone regeneration or for the coating of implants or prostheses. The present invention also relates to a composition or a matrix comprising the peptide and to the use of the composition or matrix for the preparation of a medicament preferably for bone regeneration. It also refers to the use of the peptide or matrix or for the coating of implants or prostheses.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR STATE OF THE PREVIOUS TECHNIQUE

Debido a la incidencia socioeconómica del uso de implantes óseos, la búsqueda de mejoras para evitar rechazos, o una mejor integración en el organismo de estos implantes se ha convertido en un objetivo primordial en la medicina actual. El limitado rendimiento biológico de los implantes ortopédicos existentes en la actualidad hace necesario estudiar nuevos desarrollos que permitan funcionalizar los implantes de forma que se pueda generar tejido alrededor de los mismos permitiendo un buen desarrollo óseo. Due to the socioeconomic incidence of the use of bone implants, the search for improvements to avoid rejections, or a better integration in the organism of these implants has become a primary objective in current medicine. The limited biological performance of the orthopedic implants currently in existence makes it necessary to study new developments that allow the implants to be functionalized so that tissue can be generated around them allowing good bone development.

En el campo de la biología ósea, la adhesión de las células a los sustratos (ya sea la propia matriz extracelular o biomateriales implantados) es fundamental para la diferenciación de células progenitoras hacia el linaje osteoblástico, así como para que se produzca la mineralización de la matriz y, por ello, la formación de hueso nuevo. Diversos grupos han demostrado que el recubrimiento de biomateriales de diversa naturaleza como fibronectina o con péptidos biomiméticos derivados de esta u otras proteínas de la matriz extracelular, favorece su adhesión, crecimiento y/o diferenciación de células del linaje osteoblástico en su superficie, tanto in vitro como in vivo (García et al. 2005, Journal of Dental Research, 84(5): 407-413). In the field of bone biology, the adhesion of cells to substrates (either the extracellular matrix itself or implanted biomaterials) is essential for the differentiation of progenitor cells towards the osteoblastic lineage, as well as for the mineralization of the matrix and, therefore, the formation of new bone. Several groups have shown that the coating of biomaterials of diverse nature such as fibronectin or with biomimetic peptides derived from this or other proteins of the extracellular matrix, favors their adhesion, growth and / or differentiation of osteoblastic lineage cells on their surface, both in vitro as in vivo (García et al. 2005, Journal of Dental Research, 84 (5): 407-413).

Al ser este tipo de péptidos biomiméticos secuencias pequeñas, la funcionalización de materiales con ellas puede llevar a cabo por simple adsorción, la cual es inespecífica, poco eficiente y que provoca la rápida liberación y eliminación de los péptidos de esta superficie, impidiendo su utilización a largo plazo. Además la liberación de estos péptidos puede dar lugar a efectos secundarios en regiones diferentes a la de interés produciendo complicaciones en el tratamiento. La funcionalización de materiales también se puede realizar mediante reacciones químicas o enzimáticas, lo que produce un puente molecular covalente entre la superficie del material y el péptido e interés. Esto también presenta diversas desventajas, fundamentalmente en el campo de la cirugía ya que provoca una alta manipulación del material a implantar con los consiguientes riesgos derivados así como un coste adicional para llevar a cabo la unión. Being this type of biomimetic peptides small sequences, the functionalization of materials with them can be carried out by simple adsorption, which is nonspecific, inefficient and that causes the rapid release and elimination of peptides from this surface, preventing their use to long term. In addition, the release of these peptides can lead to side effects in regions other than those of interest causing complications in the treatment. The functionalization of materials can also be carried out by chemical or enzymatic reactions, which produces a covalent molecular bridge between the surface of the material and the peptide and interest. This also presents several disadvantages, mainly in the field of surgery since it causes high manipulation of the material to be implanted with the consequent derived risks as well as an additional cost to carry out the union.

Para la formación de hueso, alguno de los factores que se han determinado como más relevantes son las proteínas morfogénicas de hueso (BMPs o bone morfogenic proteins). A pesar de la elevada capacidad osteogénica de las BMPs, estos factores presentan diversos problemas como son la elevada cantidad de los mismos que hay que administrar al paciente (alrededor de un millón de veces la concentración local natural alrededor del implante), lo que supone un alto coste y la posible generación de efectos secundarios sistémicos indeseables. Además, en los estudios clínicos se ha descrito la producción de anticuerpos frente a estas proteínas en un porcentaje de los pacientes tratados (Granjeiro et al. 2005, Braz J Med Biol Res, 38(19):1463-73), por lo que no se recomienda un segundo tratamiento con estas proteínas. For bone formation, some of the factors that have been determined as most relevant are bone morphogenic proteins (BMPs or bone morfogenic proteins). Despite the high osteogenic capacity of BMPs, these factors present various problems such as the high amount of them that must be administered to the patient (about a million times the natural local concentration around the implant), which is a high cost and the possible generation of undesirable systemic side effects. In addition, clinical studies have described the production of antibodies against these proteins in a percentage of treated patients (Granjeiro et al. 2005, Braz J Med Biol Res, 38 (19): 1463-73), so A second treatment with these proteins is not recommended.

Por todo lo descrito, resulta necesaria la búsqueda de sustitutos más inocuos para las proteínas BMPs o bien que permitan la reducción en las dosis a emplear, así como que permitan la funcionalización de implantes o prótesis de forma sencilla sin requerir una gran manipulación del material. For all the above, it is necessary to search for more innocuous substitutes for BMP proteins or that allow the reduction in the doses to be used, as well as that allow the functionalization of implants or prostheses in a simple way without requiring a great manipulation of the material.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN DESCRIPTION OF THE INVENTION

El desarrollo de biomateriales que permitan la osteointegración de prótesis e implantes, es uno de los campos que más desarrollo están sufriendo en la actualidad. La necesidad de conseguir elementos que impidan el rechazo de las prótesis e implantes, una mejor integración de los mismos en el paciente tratando de manipularlos lo menos posible para evitar efectos adversos, y una mejora en el desarrollo óseo alrededor de las mismas, hacen necesario el desarrollo de nuevos elementos y técnicas que mejoren los elementos preexistentes y que puedan ser utilizados en clínica humana. The development of biomaterials that allow osseointegration of prostheses and implants, is one of the fields that are currently undergoing more development. The need to obtain elements that prevent the rejection of prostheses and implants, a better integration of them in the patient trying to manipulate them as little as possible to avoid adverse effects, and an improvement in bone development around them, make it necessary to development of new elements and techniques that improve pre-existing elements and that can be used in human clinics.

La presente invención proporciona un péptido (péptido CBD-RGD de secuencia SEQ ID NO:1), el cual consta de una región que presenta la capacidad de unirse al colágeno tipo I mediante un dominio CBD modificado, y que lleva asociado un dominio RGD que permite el anclaje de células osteoblásticas, por lo que promueve la formación ósea allí donde se encuentra. Por ello, este péptido puede utilizarse de forma independiente para el tratamiento de enfermedades que requieran formación ósea como por ejemplo la consolidación de fracturas ya que puede unirse al colágeno tipo I, uno de los elementos mayoritarios en el hueso, y promover la formación ósea mediante el anclaje de células osteoblásticas y promoción de expresión de marcadores osteogénicos, sin necesidad de implantes o prótesis, o bien puede utilizarse unido estos implantes o prótesis, para la formación de hueso alrededor de los mismos, e incluso unido a matrices de colágeno tipo I bien independientes o bien que se asocien a los implantes o prótesis, promoviendo el desarrollo óseo alrededor del implante o prótesis. The present invention provides a peptide (CBD-RGD peptide of sequence SEQ ID NO: 1), which consists of a region that has the ability to bind to type I collagen through a modified CBD domain, and which is associated with an RGD domain that It allows the anchoring of osteoblastic cells, so it promotes bone formation wherever it is found. Therefore, this peptide can be used independently for the treatment of diseases that require bone formation such as fracture consolidation since it can bind to type I collagen, one of the major elements in the bone, and promote bone formation by the anchoring of osteoblastic cells and promotion of expression of osteogenic markers, without the need for implants or prostheses, or these implants or prostheses can be used together for the formation of bone around them, and even attached to type I collagen matrices. independent or associated with implants or prostheses, promoting bone development around the implant or prosthesis.

Los autores de la invención demuestran como el péptido de la invención promueve un aumento del marcador de diferenciación osteoblástica fosfatasa alcalina, tanto en células procedentes de médula ósea de rata, como en la línea preosteoblástica de ratón MC3T3-E1. En la presente invención también se demuestra una mayor producción de tejido óseo en esponjas absorbibles de colágeno tipo I (ACS o absorbable collagen sponges) que contienen el péptido de la invención implantadas en una localización ectópica en ratas, frente a esponjas sin el péptido. The authors of the invention demonstrate how the peptide of the invention promotes an increase in the osteoblastic alkaline phosphatase differentiation marker, both in cells from rat bone marrow, and in the MC3T3-E1 mouse preosteoblast line. The present invention also demonstrates a greater production of bone tissue in absorbable sponges of type I collagen (ACS or absorbable collagen sponges) containing the peptide of the invention implanted in an ectopic location in rats, versus sponges without the peptide.

Por todo lo expuesto, un primer aspecto de la invención se refiere a un péptido aislado que comprende SEQ ID NO:1 (péptido de la invención). En una realización preferida de este aspecto de la invención el péptido de la invención consiste en SEQ ID NO:1. For all of the foregoing, a first aspect of the invention relates to an isolated peptide comprising SEQ ID NO: 1 (peptide of the invention). In a preferred embodiment of this aspect of the invention the peptide of the invention consists of SEQ ID NO: 1.

El péptido de la invención puede presentar variantes. Estas variantes se refieren a variaciones limitadas en la secuencia aminoacídica, que permiten el mantenimiento de la funcionalidad del péptido. Esto quiere decir que la secuencia de referencia y la secuencia de la variante son similares en conjunto, e idénticas en muchas regiones. Estas variaciones se generan por sustituciones, deleciones o adiciones. Dichas sustituciones se dan entre aminoácidos que presentan similares características como por ejemplo en cuanto a polaridad, tamaño o carga, e incluyen, aunque sin limitarse, sustituciones entre ácido glutámico (Glu) y ácido aspártico (Asp), entre lisina (Lys) y arginina (Arg), entre asparagina (Asn) y glutamina (Gln), entre serina (Ser) y treonina (Thr), y entre los aminoácidos que componen el grupo alanina (Ala), leucina (Leu), valina (Val) e isoleucina (Ile). Las variaciones pueden ser generadas artificialmente como por ejemplo mediante mutagénesis o síntesis directa. Estas variaciones no provocan modificaciones esenciales en las características o propiedades esenciales del péptido, por lo que dichas variantes mantienen su actividad biológica. The peptide of the invention may have variants. These variants refer to limited variations in the amino acid sequence, which allow the maintenance of the functionality of the peptide. This means that the reference sequence and the variant sequence are similar as a whole, and identical in many regions. These variations are generated by substitutions, deletions or additions. Such substitutions occur between amino acids that have similar characteristics such as polarity, size or charge, and include, but are not limited to, substitutions between glutamic acid (Glu) and aspartic acid (Asp), between lysine (Lys) and arginine. (Arg), between asparagine (Asn) and glutamine (Gln), between serine (Ser) and threonine (Thr), and between the amino acids that make up the alanine (Ala), leucine (Leu), valine (Val) and isoleucine group (Ile). Variations can be generated artificially as for example by mutagenesis or direct synthesis. These variations do not cause essential modifications in the essential characteristics or properties of the peptide, so said variants maintain their biological activity.

El péptido puede ser producido de forma artificial como por ejemplo, aunque sin limitarse, de forma recombinante, de forma sintética, o mediante la combinación de estos 2 métodos. The peptide can be produced artificially, for example, but not limited, recombinantly, synthetically, or by combining these 2 methods.

Los péptidos adicionalmente pueden encontrarse en forma madura o bien formando parte de una proteína mayor como un precursor o una proteína de fusión. Los péptidos adicionalmente pueden incluir secuencias secretoras, secuencias que permitan su purificación como colas de histidinas, prosecuencias o secuencias que aumenten su estabilidad durante la producción de la proteína. The peptides can additionally be found in mature form or as part of a larger protein such as a precursor or a fusion protein. The peptides may additionally include secretory sequences, sequences that allow their purification as histidine tails, prosequences or sequences that increase their stability during protein production.

Los términos “péptido", “polipéptido”, “proteína” o “secuencia aminoacídica” se usan de forma intercambiable en la presente invención, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden estar o no, química o bioquímicamente modificados. The terms "peptide", "polypeptide", "protein" or "amino acid sequence" are used interchangeably in the present invention, and refer to a polymeric form of amino acids of any length, which may or may not be, chemically or biochemically modified.

El polipéptido de la invención es codificado por, al menos un polinucleótido que da como resultado el péptido de la invención. Un ejemplo de polinucleótido que codifica para el péptido de la invención es por ejemplo, aunque sin limitarse, el polinucleótido de secuencia SEQ ID NO:2. Debido a la degeneración del código genético, en el cual diversos tripletes de nucleótidos dan lugar a un mismo aminoácido, existen diversas secuencias de nucleótidos que dan lugar a una misma secuencia aminoacídica. Estos diferentes tripletes que codifican para un mismo aminoácido son conocidos en el estado de la técnica. Por todo ello otro aspecto de la invención se refiere a una secuencia nucleotídica aislada que codifica para el péptido de la invención (secuencia nucleotídica de la invención), o a una secuencia nucleotídica complementaria a dicha secuencia nucleotídica aislada. En una realización preferida la secuencia nucleotídica aislada comprende SEQ ID NO:2. En otra realización preferida de este aspecto de la invención la secuencia nucleotídica aislada consiste en SEQ ID NO:2. The polypeptide of the invention is encoded by at least one polynucleotide that results in the peptide of the invention. An example of a polynucleotide encoding the peptide of the invention is, for example, but not limited to, the sequence polynucleotide SEQ ID NO: 2. Due to the degeneracy of the genetic code, in which several nucleotide triplets give rise to the same amino acid, there are several nucleotide sequences that give rise to the same amino acid sequence. These different triplets encoding the same amino acid are known in the state of the art. Therefore, another aspect of the invention relates to an isolated nucleotide sequence encoding the peptide of the invention (nucleotide sequence of the invention), or to a nucleotide sequence complementary to said isolated nucleotide sequence. In a preferred embodiment the isolated nucleotide sequence comprises SEQ ID NO: 2. In another preferred embodiment of this aspect of the invention the isolated nucleotide sequence consists of SEQ ID NO: 2.

Los términos “secuencia nucleotídica”, “secuencia de nucleótidos”, “ácido nucleico”, “oligonucleótido” y “polinucleótido” se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que pueden estar o no, química o bioquímicamente modificados. Se refieren por tanto a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, tanto de cadena sencilla como de doble hebra. The terms "nucleotide sequence", "nucleotide sequence", "nucleic acid", "oligonucleotide" and "polynucleotide" are used interchangeably herein and refer to a polymeric form of nucleotides of any length that may or may not be chemical or biochemically modified. They therefore refer to any polyiribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, both single stranded and double stranded.

Cualquiera de las secuencias nucleotídicas de la invención pueden encontrase en la naturaleza y obtenerse por aislamiento mediante métodos conocidos en el estado de la técnica, u obtenerse de manera artificial mediante métodos de clonación y selección convencional, o mediante secuenciación. Any of the nucleotide sequences of the invention can be found in nature and obtained by isolation by methods known in the state of the art, or obtained artificially by conventional cloning and selection methods, or by sequencing.

Adicionalmente a la secuencia codificante, la secuencias de la invención pueden llevar otros elementos como por ejemplo aunque sin limitarse, intrones, secuencias no codificantes en los extremos 5’ o 3’, sitios de unión a ribosomas, In addition to the coding sequence, the sequences of the invention may carry other elements such as, but not limited to, introns, non-coding sequences at the 5 'or 3' ends, ribosome binding sites,

o secuencias estabilizadoras. Estos polinucleótidos adicionalmente también pueden incluir secuencias codificantes para aminoácidos adicionales que puedan ser útiles por ejemplo, aunque sin limitarse, para aumentar la estabilidad del péptido generado a partir de él o permitir una mejor purificación del mismo. or stabilizing sequences. These polynucleotides can additionally also include coding sequences for additional amino acids that may be useful, for example, but not limited to increasing the stability of the peptide generated from it or allowing a better purification thereof.

La secuencia nucleotídica de la invención, para dar lugar al péptido de la invención puede encontrarse incluido en construcciones genéticas. Por ello otro aspecto de la presente invención se refiere a una construcción genética que comprende la secuencia nucleotídica de la invención (construcción genética de la invención). Esta construcción genética puede llevar incluidas secuencias de control unidas operativamente a la secuencia nucleotídica de la invención. The nucleotide sequence of the invention, to give rise to the peptide of the invention can be included in genetic constructs. Therefore, another aspect of the present invention relates to a genetic construct comprising the nucleotide sequence of the invention (genetic construct of the invention). This genetic construct can include control sequences operatively linked to the nucleotide sequence of the invention.

El término “secuencia de control”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a secuencias nucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias a las que están ligadas. Se pretende que el término “secuencias de control” incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa. Ejemplos de secuencias de control, son por ejemplo, pero sin limitarse, promotores, señales de inicio de la transcripción, señales de terminación de la transcripción, señales de poliadenilación o activadores transcripcionales. The term "control sequence", as used herein, refers to nucleotide sequences that are necessary to effect the expression of the sequences to which they are linked. The term "control sequences" is intended to include, at a minimum, all components whose presence is necessary for expression, and may also include additional components whose presence is advantageous. Examples of control sequences are, for example, but not limited to, promoters, transcription initiation signals, transcription termination signals, polyadenylation signals or transcriptional activators.

La expresión “unidos operativamente”, tal y como se utiliza en la presente The term "operably linked", as used herein

descripción, se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control “unida de forma operativa” a un polinucleótido, está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control. description refers to a juxtaposition in which the components thus described have a relationship that allows them to function in the intended way. A control sequence "operatively linked" to a polynucleotide is linked in such a way that the expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.

ES 2 417 705 A1upstream” del punto de inicio de la transcripción, que es capaz de iniciar la transcripción en una célula. Este término incluye, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicos de tipo celular o de tejido o promotores inducibles o reprimibles. Las secuencias de control dependen del origen de la célula en la que se quiere expresar el ácido nucleico. Ejemplos de promotores procariotas incluyen, por ejemplo, pero sin limitarnos, los promotores de los genes trp, recA, lacZ, lacI, tet, gal, trc,o tac de E. coli, o el promotor del gen alfa-amilasa de B. subtilis. Para la expresión de un ácido nucleico en una célula procariota también es necesaria la presencia de un sitio de unión ribosomal situado “upstream” de la secuencia codificante. Secuencias de control apropiadas para la expresión de un polinucleótido en células eucariotas son conocidas en el estado de la técnica. ES 2 417 705 A1upstream ”of the transcription start point, which is capable of initiating transcription in a cell. This term includes, for example, but not limited to, constitutive promoters, cell or tissue specific promoters or inducible or repressible promoters. Control sequences depend on the origin of the cell in which the nucleic acid is to be expressed. Examples of prokaryotic promoters include, for example, but not limited to, promoters of the trp, recA, lacZ, lacI, tet, gal, trc, or tac genes of E. coli, or the promoter of the B-alpha-amylase gene. subtilis For the expression of a nucleic acid in a prokaryotic cell, the presence of an upstream ribosomal binding site of the coding sequence is also necessary. Appropriate control sequences for the expression of a polynucleotide in eukaryotic cells are known in the state of the art.

Tanto la secuencia nucleotídica de la invención como la construcción genética de la invención que comprende la secuencia nucleotídica de la invención, pueden introducirse, por ejemplo, en un vector de clonación o un vector de expresión para permitir su replicación o su expresión. Preferiblemente, dicho vector es un vector apropiado para la expresión y purificación del péptido de la invención. Por todo ello, otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia nucleotídica de la invención, o la construcción genética de la invención (vector de la invención). Both the nucleotide sequence of the invention and the genetic construct of the invention comprising the nucleotide sequence of the invention can be introduced, for example, into a cloning vector or an expression vector to allow replication or expression. Preferably, said vector is an appropriate vector for expression and purification of the peptide of the invention. Therefore, another aspect of the present invention relates to a vector comprising the nucleotide sequence of the invention, or the genetic construction of the invention (vector of the invention).

El término “vector de clonación”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula de ADN en la que se puede integrar otro fragmento de ADN, sin que pierda la capacidad de autorreplicación. Ejemplos de vectores de expresión son, pero sin limitarse, plásmidos, cósmidos, fagos de ADN o cromosomas artificiales de levadura. The term "cloning vector", as used in the present description, refers to a DNA molecule in which another DNA fragment can be integrated, without losing the capacity for self-replication. Examples of expression vectors are, but are not limited to, plasmids, cosmids, DNA phages or artificial yeast chromosomes.

El término “vector de expresión”, tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a un vector de clonación adecuado para expresar un ácido nucleico que ha sido clonado en el mismo tras ser introducido en una célula hospedadora. Dicho ácido nucleico se encuentra, generalmente, unido operativamente a secuencias control. The term "expression vector", as used in the present invention, refers to a cloning vector suitable for expressing a nucleic acid that has been cloned therein after being introduced into a host cell. Said nucleic acid is generally operatively linked to control sequences.

El término “expresión” se refiere al proceso por el cual se sintetiza un polipéptido a partir de un polinucleótido. Incluye la transcripción de la secuencia nucleotídica en un ARN mensajero (ARNm) y la traducción de dicho ARNm en una proteína o polipéptido. La expresión puede tener lugar en una célula hospedadora, pero también mediante cualquier proceso de expresión proteica in vivo. The term "expression" refers to the process by which a polypeptide is synthesized from a polynucleotide. It includes the transcription of the nucleotide sequence in a messenger RNA (mRNA) and the translation of said mRNA into a protein or polypeptide. Expression can take place in a host cell, but also by any process of protein expression in vivo.

El polinucleótido de la invención así como la construcción genética de la invención o el vector de la invención, pueden introducirse en una célula hospedadora para su amplificación o expresión. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a una célula hospedadora que comprende la secuencia nucleotídica de la invención, la construcción genética de la invención o el vector de la invención (célula de la invención). The polynucleotide of the invention as well as the genetic construct of the invention or the vector of the invention can be introduced into a host cell for amplification or expression. Therefore, another aspect of the invention relates to a host cell comprising the nucleotide sequence of the invention, the genetic construct of the invention or the vector of the invention (cell of the invention).

El término “célula hospedadora” o “célula huésped”, tal y como se utilizan en la presente descripción se refieren a cualquier organismo procariota o eucariota que es recipiente de un vector de expresión, de clonación o de cualquier otra molécula de ADN. Las células hospedadoras pueden ser células procariotas como, por ejemplo, pero sin limitarse, E. coli, o eucariotas como por ejemplo, aunque sin limitarse células vegetales, levaduras, células de insectos, células de anfibios o células de mamífero. The term "host cell" or "host cell", as used herein, refers to any prokaryotic or eukaryotic organism that is the recipient of an expression vector, cloning or any other DNA molecule. The host cells may be prokaryotic cells such as, but not limited to, E. coli, or eukaryotes, for example, but not limited to plant cells, yeasts, insect cells, amphibian cells or mammalian cells.

Debido a la capacidad de inducir la formación de hueso que presenta el péptido Due to the ability to induce the formation of bone presented by the peptide

de la invención, este puede ser utilizado como factor osteogénico, preferiblemente “in vitro”, por ejemplo para la formación de hueso de forma que posteriormente este hueso pueda ser implantado en pacientes. Este péptido puede ser utilizado directamente o ser producido mediante la secuencia nucleotídica de la invención, la construcción génica de la invención, el vector de la invención o la célula de la invención para llevar a cabo esta función osteogénica. Por ello, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del péptido de la invención, de la secuencia nucleotídica de la invención, de la construcción genética, del vector de la invención o de la célula de la invención como agente osteogénico. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de la invención, de la secuencia nucleotídica de la invención, de la construcción genética, del vector de la invención o de la célula de la invención como agente osteogénico “in vitroES 2 417 705 A1of the invention, this can be used as an osteogenic factor, preferably "in vitro", for example for bone formation so that later this bone can be implanted in patients. This peptide can be used directly or produced by the nucleotide sequence of the invention, the gene construct of the invention, the vector of the invention or the cell of the invention to carry out this osteogenic function. Therefore, another aspect of the present invention relates to the use of the peptide of the invention, of the nucleotide sequence of the invention, of the genetic construction, of the vector of the invention or of the cell of the invention as an osteogenic agent. A preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of the peptide of the invention, of the nucleotide sequence of the invention, of the genetic construct, of the vector of the invention or of the cell of the invention as an "in vitro" osteogenic agent. 2 417 705 A1

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de la invención, la secuencia nucleotídica de la invención, la construcción genética de la invención, el vector de la invención o la célula de la invención para elaboración de un medicamento. Alternativamente se refiere al péptido de la invención, la secuencia nucleotídica de la invención, la construcción genética de la invención, el vector de la invención o la célula de la invención para su uso como medicamento. Another aspect of the invention relates to the use of the peptide of the invention, the nucleotide sequence of the invention, the genetic construction of the invention, the vector of the invention or the cell of the invention for the preparation of a medicament. Alternatively it refers to the peptide of the invention, the nucleotide sequence of the invention, the genetic construct of the invention, the vector of the invention or the cell of the invention for use as a medicament.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de la invención, la secuencia nucleotídica de la invención, la construcción genética de la invención, el vector de la invención o la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas. Alternativamente se refiere al péptido de la invención, la secuencia nucleotídica de la invención, la construcción genética de la invención, el vector de la invención o la célula de la invención para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas. Another aspect of the invention relates to the use of the peptide of the invention, the nucleotide sequence of the invention, the genetic construction of the invention, the vector of the invention or the cell of the invention for the preparation of a medicament for the treatment and / or the prevention of bone diseases or injuries. Alternatively it refers to the peptide of the invention, the nucleotide sequence of the invention, the genetic construction of the invention, the vector of the invention or the cell of the invention for use as a medicament for the treatment and / or prevention of diseases or bone lesions

Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de la invención, la secuencia nucleotídica de la invención, la construcción genética de la invención, el vector de la invención o la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos. Alternativamente se refiere al péptido de la invención, la secuencia nucleotídica de la invención, la construcción genética de la invención, el vector de la invención o la célula de la invención para su uso como medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos. A preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of the peptide of the invention, the nucleotide sequence of the invention, the genetic construction of the invention, the vector of the invention or the cell of the invention for the preparation of a medicament. for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries where the bone disease or injury is selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses. Alternatively it refers to the peptide of the invention, the nucleotide sequence of the invention, the genetic construction of the invention, the vector of the invention or the cell of the invention for use as a medicament for the treatment and / or prevention of diseases or injuries. Bone where the bone disease or injury is selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses.

El péptido de la invención puede encontrarse para su utilización de forma independiente o incluido dentro de una composición con otros elementos que proporcionen ventajas al péptido de la invención. Por tanto otro aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende el péptido de la invención (composición de la invención). Uno de los elementos más utilizados para promover la osteogénesis es el uso de las proteínas BMPs. En los ejemplos de la invención se demuestra que la combinación del péptido de la invención con proteínas BMPs (proteínas morfogénica ósea o bone morphogenetic proteins), y más concretamente con la proteína BMP-2, presenta un efecto superior al producido por la proteína BMP-2 de forma independiente. El mayor efecto de los péptidos usados en combinación hace que usados juntos se reduzca la cantidad de BMP a utilizar para promover la osteogénesis y por tanto se eliminen los costes y los efectos secundarios del uso de grandes cantidades de estas proteínas, así como la posibilidad de su diseminación sistémica. Esto hace que dentro de los elementos que se pueden incluir dentro de la composición para potenciar el efecto del péptido de la invención se encuentren las proteínas BMP. Por ello, una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP. En una realización más preferida de este aspecto de la invención la proteína BMP es la proteína BMP-2 o la proteína BMP-7. En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención la proteína BMP es la proteína BMP-2. The peptide of the invention can be found for use independently or included within a composition with other elements that provide advantages to the peptide of the invention. Therefore, another aspect of the invention relates to a composition comprising the peptide of the invention (composition of the invention). One of the most used elements to promote osteogenesis is the use of BMPs proteins. In the examples of the invention it is demonstrated that the combination of the peptide of the invention with BMPs (bone morphogenetic proteins or bone morphogenetic proteins), and more specifically with the BMP-2 protein, has a superior effect to that produced by the BMP- protein 2 independently. The greater effect of the peptides used in combination means that, when used together, the amount of BMP to be used to promote osteogenesis is reduced and therefore the costs and side effects of the use of large amounts of these proteins are eliminated, as well as the possibility of its systemic dissemination. This means that BMP proteins are among the elements that can be included in the composition to enhance the effect of the peptide of the invention. Therefore, a preferred embodiment of this aspect of the invention relates to a composition comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein. In a more preferred embodiment of this aspect of the invention the BMP protein is the BMP-2 protein or the BMP-7 protein. In an even more preferred embodiment of this aspect of the invention the BMP protein is the BMP-2 protein.

Debido a la capacidad osteogénica del péptido de la invención o de la combinación del péptido de la invención junto a las proteínas BMPs, otro aspecto de la invención se refiere al uso de una composición que comprende el péptido de la invención como agente osteogénico, `preferiblemente “in vitroES 2 417 705 A1in vitro”. En una más realización preferida de este aspecto de la invención, la proteína BMP es la proteína BMP-2 o la proteína BMP-7. En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención la proteína BMP es la proteína BMP-2. Due to the osteogenic capacity of the peptide of the invention or of the combination of the peptide of the invention together with BMPs proteins, another aspect of the invention relates to the use of a composition comprising the peptide of the invention as an osteogenic agent, `preferably "In vitroES 2 417 705 A1in vitro". In a more preferred embodiment of this aspect of the invention, the BMP protein is the BMP-2 protein or the BMP-7 protein. In an even more preferred embodiment of this aspect of the invention the BMP protein is the BMP-2 protein.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una composición que comprende el péptido de la invención para la elaboración de un medicamento, Another aspect of the invention relates to the use of a composition comprising the peptide of the invention for the preparation of a medicament,

o alternativamente a una composición que comprende el péptido de la invención para su uso como medicamento. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de una composición que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7 y más preferiblemente BMP-2, para la elaboración de un medicamento, or alternatively a composition comprising the peptide of the invention for use as a medicament. A preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of a composition comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7 and more preferably BMP-2, for the preparation of a medicine,

o alternativamente a una composición que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7 y más preferiblemente BMP-2, para su uso como medicamento. or alternatively a composition comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7 and more preferably BMP-2, for use as a medicament.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una composición que comprende el péptido de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas, o alternativamente para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de una composición que comprende el péptido de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos, o alternativamente a una composición que comprende el péptido de la invención para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos. Another aspect of the invention relates to the use of a composition comprising the peptide of the invention for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries, or alternatively for use as a medicament for the treatment and / or the prevention of bone diseases or injuries. A preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of a composition comprising the peptide of the invention for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries where bone disease or injury is selected. from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses, or alternatively a composition comprising the peptide of the invention for use as a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries where Bone disease or injury is selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses.

Otra realización preferida se refiere al uso de una composición que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP2 o BMP-7 y más preferiblemente BMP-2, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas, o alternativamente a una composición que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7 y más preferiblemente BMP-2, para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas. Una realización más preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de una composición que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7 y más preferiblemente BMP-2, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos, o alternativamente a una composición que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7 y más preferiblemente BMP-2, para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos. Another preferred embodiment relates to the use of a composition comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP2 or BMP-7 and more preferably BMP-2, for the preparation of a medicament for the treatment and / or the prevention of bone diseases or injuries, or alternatively a composition comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7 and more preferably BMP-2, for use as a medicament for the treatment and / or the prevention of bone diseases or injuries. A more preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of a composition comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7 and more preferably BMP-2, for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or lesions where the bone disease or injury is selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses, or alternatively a composition comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7 and more preferably BMP-2, for use as a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries where bone disease or injury It is selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses.

Debido a la capacidad del péptido de promover la formación de hueso allí donde se encuentra como se demuestra en la presente invención, una de las aplicaciones del péptido de la invención es el recubrimiento de implantes o prótesis para provocar la osificación alrededor o sobre los mismos de forma que estos queden integrados de forma adecuada en el organismo. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de la invención para el recubrimiento de implantes o prótesis. Además, gracias a la capacidad del péptido de la invención de unirse a colágeno tipo I y permanecer anclado al mismo promoviendo la osificación en la región a la que se encuentra anclado, el péptido de la invención también resulta útil para el recubrimiento de prótesis que previamente han sido recubiertas con colágeno tipo I para mejorar la compatibilidad con el organismo y por su capacidad osteoconductora. Por tanto, una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de la invención para el recubrimiento de implantes o prótesis donde el implante o prótesis ha sido previamente recubierto con colágeno tipo I. Due to the ability of the peptide to promote bone formation where it is found as demonstrated in the present invention, one of the applications of the peptide of the invention is the coating of implants or prostheses to cause ossification around or on them. so that these are properly integrated into the body. Therefore, another aspect of the invention relates to the use of the peptide of the invention for coating implants or prostheses. In addition, thanks to the ability of the peptide of the invention to bind to type I collagen and remain anchored thereto by promoting ossification in the region to which it is anchored, the peptide of the invention is also useful for coating prostheses that previously They have been coated with type I collagen to improve compatibility with the body and for its osteoconductive capacity. Therefore, a preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of the peptide of the invention for coating implants or prostheses where the implant or prosthesis has previously been coated with type I collagen.

Debido a que el péptido se puede encontrar incluido dentro de una composición, estas presentan similar utilidad que el péptido de la invención de forma aislada. Por tanto, una de las aplicaciones fundamentales de la composición de la invención es el recubrimiento de implantes o prótesis para provocar la osificación alrededor o sobre los mismos de forma que estos queden integrados de forma adecuada en el organismo. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso de una composición que comprende el péptido de la invención para el recubrimiento de implantes o prótesis. Una realización preferida se refiere al uso de una composición que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7 y más preferiblemente BMP-2, para el recubrimiento de implantes o prótesis. Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de una composición que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7 y más preferiblemente BMP-2, para el recubrimiento de implantes o prótesis donde el implante o prótesis ha sido previamente recubierto con colágeno tipo I. Because the peptide can be found included in a composition, they have a similar utility as the peptide of the invention in isolation. Therefore, one of the fundamental applications of the composition of the invention is the coating of implants or prostheses to cause ossification around or on them so that they are properly integrated into the body. Therefore, another aspect of the invention relates to the use of a composition comprising the peptide of the invention for coating implants or prostheses. A preferred embodiment relates to the use of a composition comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7 and more preferably BMP-2, for coating implants or prostheses. Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of a composition comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7 and more preferably BMP-2, for implant coating. or prosthesis where the implant or prosthesis has been previously coated with type I collagen.

El recubrimiento de prótesis o implantes en la presente invención puede ser un recubrimiento total o parcial en función de las necesidades de cada caso. The coating of prostheses or implants in the present invention can be a total or partial coating depending on the needs of each case.

Se entiende por “implante” en la presente invención todo aquel objeto o material biocompatible que se inserta o se fija en el organismo y que tiene como función sustituir o mejorar una estructura biológica normal, dañada o ausente. "Implant" is understood in the present invention as any biocompatible object or material that is inserted or fixed in the organism and whose function is to replace or improve a normal, damaged or absent biological structure.

Se entiende por “prótesis” en la presente invención todo aquel elemento artificial que sirve para sustituir una parte del organismo dañada, o bien que proporciona una parte del organismo previamente ausente por cualquier causa. "Prosthesis" in the present invention is understood to mean any artificial element that serves to replace a part of the damaged organism, or that provides a previously absent part of the organism for any cause.

En la presente invención, los medicamentos que comprenden el péptido de la invención, la secuencia nucleotídica de la invención, la construcción genética de la invención, el vector de la invención, o la composición de la invención comprenden estos elementos en una cantidad terapéuticamente efectiva, entendiéndose por "cantidad terapéuticamente efectiva" la cantidad de de estos elementos que produzcan el efecto deseado. La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia del individuo al que le va a ser administrado el medicamento. In the present invention, medicaments comprising the peptide of the invention, the nucleotide sequence of the invention, the genetic construct of the invention, the vector of the invention, or the composition of the invention comprise these elements in a therapeutically effective amount, "therapeutically effective amount" is understood as the amount of these elements that produce the desired effect. The dosage to obtain a therapeutically effective amount depends on a variety of factors, such as the age, weight, sex or tolerance of the individual to whom the medication is to be administered.

Por otro lado, los diferentes elementos de la invención en función de su naturaleza pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Además los diferentes elementos pueden combinarse con otros elementos como por ejemplo otro/s principio/s activo/s, excipiente/s y/o vehículo/s farmacéuticamente aceptable/s. On the other hand, the different elements of the invention depending on their nature can be formulated for administration to an animal, and more preferably to a mammal, including man, in a variety of ways known in the state of the art. In addition, the different elements can be combined with other elements such as another active ingredient (s), excipient (s) and / or pharmaceutically acceptable carrier (s).

El término “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación de la. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los elementos unidos, la función de protección de la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. The term "excipient" refers to a substance that helps the absorption of the elements of the composition of the invention, stabilizes said elements, activates or aids in the preparation of the. Thus, the excipients could have the function of keeping the elements together, the function of protecting the composition, for example, to isolate it from air and / or moisture, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.

El “vehículo farmacéuticamente aceptable”, al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea para diluir cualquiera de los componentes comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición. The "pharmaceutically acceptable carrier", like the excipient, is a substance that is used to dilute any of the components included therein to a certain volume or weight. The function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other elements, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the composition.

Como se emplea aquí, el término “principio activo”, “sustancia activa”, “sustancia farmacéuticamente activa”, “ingrediente activo” ó “ingrediente farmacéuticamente activo” significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto. As used herein, the term "active ingredient", "active substance", "pharmaceutically active substance", "active ingredient" or "pharmaceutically active ingredient" means any component that potentially provides a pharmacological activity or other different effect on the diagnosis, cure, mitigation, treatment, or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of man or other animals. The term includes those components that promote a chemical change in the preparation of the drug and are present therein in a modified form intended to provide the specific activity or effect.

Como se demuestra en los ejemplos el péptido puede llevar a cabo su acción de forma independiente o unido a una matriz de colágeno como son las esponjas absorbibles de colágeno (ACS). Esto se debe a la capacidad que tiene el péptido de la invención de anclarse al colágeno y permanecer unido a él sin producirse apenas dispersión del péptido. De esta forma el efecto se lleva a cabo de forma localizada en la región donde se implanta la matriz de colágeno. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una matriz de colágeno tipo I (matriz de la invención) que comprende el péptido de la invención. As demonstrated in the examples, the peptide can carry out its action independently or attached to a collagen matrix such as collagen absorbable sponges (ACS). This is due to the ability of the peptide of the invention to become anchored to the collagen and remain attached to it without hardly scattering the peptide. In this way the effect is carried out in a localized way in the region where the collagen matrix is implanted. Therefore, another aspect of the invention relates to a type I collagen matrix (matrix of the invention) comprising the peptide of the invention.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una matriz de colágeno tipo I que comprende el péptido de la invención para la elaboración de un medicamento, o alternativamente se refiere a una matriz de colágeno que comprende el péptido de la invención para su uso como medicamento. Another aspect of the invention relates to the use of a type I collagen matrix comprising the peptide of the invention for the preparation of a medicament, or alternatively refers to a collagen matrix comprising the peptide of the invention for use as medicine.

Se entiende por “matriz de colágeno” en la presente invención a cualquier estructura porosa compuesta total o parcialmente por colágeno tipo I, obtenida de cualquier fuente natural o artificial. "Collagen matrix" in the present invention is understood as any porous structure composed entirely or partially of type I collagen, obtained from any natural or artificial source.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una matriz de colágeno tipo I que comprende el péptido de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas, o alternativamente se refiere a una matriz de colágeno que comprende el péptido de la invención para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de una matriz de colágeno tipo I que comprende el péptido de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos, o alternativamente se refiere a una matriz de colágeno que comprende el péptido de la invención para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos. Another aspect of the invention relates to the use of a type I collagen matrix comprising the peptide of the invention for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries, or alternatively refers to a matrix of collagen comprising the peptide of the invention for use as a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries. A preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of a type I collagen matrix comprising the peptide of the invention for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries where the disease or injury Bone is selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses, or alternatively refers to a collagen matrix comprising the peptide of the invention for use as a medicament for the treatment and / or the prevention of bone diseases or injuries where the bone disease or injury is selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una matriz de colágeno tipo I que comprende el péptido de la invención para el recubrimiento de implantes o prótesis. Another aspect of the invention relates to the use of a type I collagen matrix comprising the peptide of the invention for coating implants or prostheses.

El péptido de la invención también presenta utilidad tanto de forma independiente como integrado en matrices de colágeno tipo I para la diferenciación de diversos tipos celulares, como por ejemplo, aunque sin limitarse, diferenciación a cardiomiocitos o fibroblastos. En caso de utilizarse matrices de colágeno que comprenden el péptido y según el tipo celular utilizado, la matriz puede presentar diversas aplicaciones. Por ejemplo, en caso de diferenciarse a cardiomiocitos, la matriz que comprende el péptido de la invención presentaría utilidad para el tratamiento de enfermedades que necesiten regeneración miocárdica, como por ejemplo, aunque sin limitarse, infarto de miocardio, enfermedad isquémica cardiaca. Por otro lado, en caso de diferenciarse a fibroblastos, la matriz que comprende el péptido de la invención presentaría utilidad para el tratamiento de enfermedades que necesiten regeneración corneal, o regeneración de la piel, como por ejemplo, aunque sin limitarse, lesiones corneales, síndrome de ojo seco, quemaduras, úlceras vasculares crónicas. The peptide of the invention also has utility both independently and integrated into matrices of type I collagen for differentiation of various cell types, such as, but not limited to, differentiation to cardiomyocytes or fibroblasts. In case of using collagen matrices comprising the peptide and according to the type of cell used, the matrix can have various applications. For example, in case of differentiation to cardiomyocytes, the matrix comprising the peptide of the invention would be useful for the treatment of diseases that need myocardial regeneration, such as, but not limited to, myocardial infarction, ischemic heart disease. On the other hand, in case of differentiation to fibroblasts, the matrix comprising the peptide of the invention would be useful for the treatment of diseases that need corneal regeneration, or skin regeneration, such as, but not limited to, corneal lesions, syndrome dry eye, burns, chronic vascular ulcers.

La matriz de colágeno además del péptido de la invención puede llevar otros elementos útiles para la osteogénesis, como por ejemplo aunque sin limitarse proteínas BMPs. En los ejemplos de la invención se demuestra como en esponjas de colágeno tipo I cargadas con el péptido de la invención y la proteína morfogénica 2 la formación de hueso es mayor que solo con la proteína BMP, uno de los elementos más utilizados para promover la osificación. Por todo esto, otro aspecto de la invención se refiere a una matriz de colágeno tipo I que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7 y más preferiblemente BMP-2. The collagen matrix in addition to the peptide of the invention can carry other elements useful for osteogenesis, for example, but not limited to BMPs proteins. In the examples of the invention it is demonstrated that in type I collagen sponges loaded with the peptide of the invention and the morphogenic protein 2 bone formation is greater than only with the BMP protein, one of the elements most used to promote ossification . By all this, another aspect of the invention relates to a type I collagen matrix comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7 and more preferably BMP-2.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una matriz de colágeno tipo I que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7, y más preferiblemente BMP-2, para la elaboración de un medicamento, o alternativamente se refiere a una matriz de colágeno que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7, y más preferiblemente BMP-2, para su uso como medicamento. Another aspect of the invention relates to the use of a type I collagen matrix comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7, and more preferably BMP-2, for the preparation of A medicament, or alternatively refers to a collagen matrix comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7, and more preferably BMP-2, for use as a medicament.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una matriz de colágeno tipo I que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7, y más preferiblemente BMP-2, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas, o alternativamente se refiere a una matriz de colágeno que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7, y más preferiblemente BMP-2, para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades Another aspect of the invention relates to the use of a type I collagen matrix comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7, and more preferably BMP-2, for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries, or alternatively refers to a collagen matrix comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7, and more preferably BMP-2, for use as a medicine for the treatment and / or prevention of diseases

o lesiones óseas. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de una matriz de colágeno tipo I que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7, y más preferiblemente BMP-2, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos, o alternativamente se refiere a una matriz de colágeno que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7, y más preferiblemente BMP-2, para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos. or bone lesions. A preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of a type I collagen matrix comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7, and more preferably BMP-2, for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries where the bone disease or injury is selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses, or alternatively refers to a collagen matrix comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7, and more preferably BMP-2, for use as a medicament for the treatment and / or prevention of diseases or Bone lesions where the bone disease or injury is selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una matriz de colágeno tipo I que comprende el péptido de la invención y al menos una proteína BMP, preferiblemente BMP-2 o BMP-7, y más preferiblemente BMP-2, para el recubrimiento de implantes o prótesis. Another aspect of the invention relates to the use of a type I collagen matrix comprising the peptide of the invention and at least one BMP protein, preferably BMP-2 or BMP-7, and more preferably BMP-2, for the coating of implants or prostheses

Debido al recubrimiento de las prótesis o implantes con el péptido de la invención o la matriz de la invención, estas prótesis presentan la capacidad de regenerar hueso y por tanto presentan similar utilidad que el péptido o la matriz de la invención, permitiendo la aplicación del péptido o la matriz de forma localizada minimizando la dispersión, provocando un mejor efecto en su utilización. Por tanto otro aspecto de la invención se refiere a una prótesis o implante recubierto por el péptido de la invención. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una prótesis o implante recubierto por el péptido de la invención para la elaboración de un medicamento o alternativamente para su uso como medicamento. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una prótesis o implante recubierto por el péptido de la invención para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas, o alternativamente para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas. Una realización de este aspecto de la invención se refiere al uso de una prótesis o implante recubierto por el péptido de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos, o alternativamente para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos. Due to the coating of the prostheses or implants with the peptide of the invention or the matrix of the invention, these prostheses have the ability to regenerate bone and therefore have a similar utility as the peptide or matrix of the invention, allowing the application of the peptide or the matrix in a localized way minimizing the dispersion, causing a better effect on its use. Thus, another aspect of the invention relates to a prosthesis or implant coated by the peptide of the invention. Another aspect of the invention relates to the use of a prosthesis or implant coated by the peptide of the invention for the preparation of a medicament or alternatively for use as a medicament. Another aspect of the invention relates to the use of a prosthesis or implant coated by the peptide of the invention for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries, or alternatively for use as a medicament for the treatment and / or prevention. of bone diseases or injuries. An embodiment of this aspect of the invention relates to the use of a prosthesis or implant coated by the peptide of the invention for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries where bone disease or injury is selected. from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses, or alternatively for use as a medicine for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries where bone disease or injury is selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses.

Otro aspecto de la invención se refiere a una prótesis o implante recubierto por una matriz de colágeno tipo I que comprende el péptido de la invención y preferiblemente al menos una proteína BMP, más preferiblemente BMP-2 o BMP-7 y aun más preferiblemente BMP-2.. Another aspect of the invention relates to a prosthesis or implant coated by a type I collagen matrix comprising the peptide of the invention and preferably at least one BMP protein, more preferably BMP-2 or BMP-7 and even more preferably BMP- 2..

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una prótesis o implante recubierto por una matriz de colágeno tipo I que comprende el péptido de la invención y preferiblemente al menos una proteína BMP, más preferiblemente BMP-2 o BMP-7 y aun más preferiblemente BMP-2para la elaboración de un medicamento o alternativamente para su uso como medicamento. Another aspect of the invention relates to the use of a prosthesis or implant coated by a type I collagen matrix comprising the peptide of the invention and preferably at least one BMP protein, more preferably BMP-2 or BMP-7 and even more preferably BMP-2 for the preparation of a medicine or alternatively for use as a medicine.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una prótesis o implante recubierto por una matriz de colágeno tipo I que comprende el péptido de la invención y preferiblemente al menos una proteína BMP, más preferiblemente BMP-2 o BMP-7 y aun más preferiblemente BMP-2 para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas, o alternativamente para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de una prótesis o implante recubierto por una matriz de colágeno tipo I que comprende el péptido de la invención y preferiblemente al menos una proteína BMP, más preferiblemente BMP-2 o BMP-7 y aun más preferiblemente BMP-2 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos, o alternativamente para su uso como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas donde la enfermedad o lesión ósea se selecciona de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos. Another aspect of the invention relates to the use of a prosthesis or implant coated by a type I collagen matrix comprising the peptide of the invention and preferably at least one BMP protein, more preferably BMP-2 or BMP-7 and even more preferably BMP-2 for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries, or alternatively for use as a medicine for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries. A preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of a prosthesis or implant coated by a type I collagen matrix comprising the peptide of the invention and preferably at least one BMP protein, more preferably BMP-2 or BMP-7 and even more preferably BMP-2 for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries where the bone disease or injury is selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and calluses hypertrophic, or alternatively for use as a medicine for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries where the bone disease or injury is selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention. The following figures and examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS DESCRIPTION OF THE FIGURES

Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativo y no limitante, las siguientes figuras: With the intention of complementing the description that has been carried out, as well as helping to better understand the characteristics of the invention, according to some examples made, the following figures are shown here, for illustrative and non-limiting purposes :

Figura 1. Curva de liberación del péptido CBD-RGD de esponjas absorbibles de colágeno tipo I. Figure 1. CBD-RGD peptide release curve of type I collagen absorbable sponges.

Figura 2. Actividad ALP en cultivos de células MC3T3-E1 (A) o células madre mesenquimales de rata (B) en respuesta a CBD-RGD soluble. N = 8; * p=<0,05; *** p=<0,001. Excepto donde se indique, las comparaciones están hechas con la condición control correspondiente al mismo número de días en cultivo. Figure 2. ALP activity in cultures of MC3T3-E1 cells (A) or rat mesenchymal stem cells (B) in response to soluble CBD-RGD. N = 8; * p = <0.05; *** p = <0.001. Except where indicated, comparisons are made with the control condition corresponding to the same number of days in culture.

Figura 3. Mineralización de la matriz extracelular por células madre mesenquimales de rata (A y B) en respuesta a CBD-RGD soluble. N=6; * p=<0,05. Figure 3. Mineralization of the extracellular matrix by rat mesenchymal stem cells (A and B) in response to soluble CBD-RGD. N = 6; * p = <0.05.

Figura 4. Contenido en calcio del hueso ectópico formado por ACSs cargadas con 300 ng BMP-2 ó 300 ng BMP-2 + 5 µg CBD-RGD, 14 y 21 días tras su implantación. N = 6; ** p=<0,01. Nótese que el valor de las barras correspondientes a BMP-2 es cero a ambos tiempos. Figure 4. Calcium content of the ectopic bone formed by ACSs loaded with 300 ng BMP-2 or 300 ng BMP-2 + 5 µg CBD-RGD, 14 and 21 days after implantation. N = 6; ** p = <0.01. Note that the value of the bars corresponding to BMP-2 is zero at both times.

Figura 5. Formación de hueso ectópico in vivo. A, B y C, D: ACSs cargadas con 300 ng BMP-2, recuperadas 14 y 21 días tras la cirugía, respectivamente. E, F and G, H: ACSs cargadas con 300 ng BMP-2 + 5 µg CBD-RGD, recuperadas 14 y 21 días tras la cirugía, respectivamente. Las imágenes b, d, f y h muestran detalles de B, D, F y H, respectivamente. Las muestras fueron teñidas con hematoxilina-eosina (A, B, E y F) o usadas para la detección de osteopontina por immunocitoquímica (C, D, G y H). Flechas: osteocitos; puntas de flecha: trabéculas óseas. Escala figuras A, B, C, D, E, F, G y H 1cm – 400 µm. Escala figuras b, d, f y h 1cm – 100 µm. Figure 5. Formation of ectopic bone in vivo. A, B and C, D: ACSs loaded with 300 ng BMP-2, recovered 14 and 21 days after surgery, respectively. E, F and G, H: ACSs loaded with 300 ng BMP-2 + 5 µg CBD-RGD, recovered 14 and 21 days after surgery, respectively. The images b, d, f and h show details of B, D, F and H, respectively. The samples were stained with hematoxylin-eosin (A, B, E and F) or used for the detection of osteopontin by immunocytochemistry (C, D, G and H). Arrows: osteocytes; arrowheads: bone trabeculae. Scale figures A, B, C, D, E, F, G and H 1cm - 400 µm. Scale figures b, d, f and h 1cm - 100 µm.

EJEMPLOS EXAMPLES

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma. The following specific examples provided in this patent document serve to illustrate the nature of the present invention. These examples are included for illustrative purposes only and should not be construed as limitations on the invention claimed herein. Therefore, the examples described below illustrate the invention without limiting its scope of application.

EJEMPLO 1. Ensayo de pegada del péptido CBD-RGD a esponjas de colágeno tipo I EXAMPLE 1. Bonding test of CBD-RGD peptide to type I collagen sponges

Se cortaron esponjas absorbibles de colágeno tipo I bovino (ACSs) en discos de 5 mm de diámetro y 1 mm de grosor. Las esponjas fueron lavadas con 25 mM tampón fosfato (PB), pH 6,2 y dejadas secar durante varias horas en una cámara de flujo laminar. Una vez secas, se cargaron las esponjas con 5 µg CBD-RGD (2,95 µmol) en 10 µL of PB, pH 6,2 y se volvieron a dejar secar. Para cuantificar la liberación del péptido, las esponjas se lavaron secuencialmente con 15 µL de tampón fosfato salino (PBS), pH 7,2 y la concentración de CBD-RGD en las fracciones de lavado se estimó mediante espectrofotometría a 205 nm. Como control y para realizar el blanco del espectrofotómetro se usaron esponjas cargadas únicamente con vehículo, que fueron lavadas de la misma manera. N=4. Los resultados del experimento se muestran en la figura 1. Absorbable sponges of bovine type I collagen (ACSs) were cut into discs 5 mm in diameter and 1 mm thick. The sponges were washed with 25 mM phosphate buffer (PB), pH 6.2 and allowed to dry for several hours in a laminar flow chamber. Once dried, the sponges were loaded with 5 µg CBD-RGD (2.95 µmol) in 10 µL of PB, pH 6.2 and allowed to dry again. To quantify the release of the peptide, the sponges were washed sequentially with 15 µL of phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 and the concentration of CBD-RGD in the wash fractions was estimated by spectrophotometry at 205 nm. As a control and to perform the spectrophotometer blank, sponges loaded with vehicle only were used, which were washed in the same way. N = 4 The results of the experiment are shown in Figure 1.

EJEMPLO 2. Ensayos de actividad fosfatasa alcalina sobre cultivos celulares EXAMPLE 2. Alkaline phosphatase activity assays on cell cultures

Para determinar el efecto del péptido CBD-RGD en forma soluble sobre células de la línea osteoblástica se cultivaron preosteoblastos de ratón MC3T3-E1 y células madre mesenquimales (MSCs) procedentes de médula ósea de rata en medio alpha-MEM (Sigma–Aldrich) suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS) y 2 mM L-glutamina, a 37ºC en atmósfera húmeda con 5% CO2 (condiciones estándar). Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos (Nunclon, Nunc) a una densidad de 7,5 x 103 células/pocillo e incubadas durante 3 horas bajo condiciones estándar. Una vez adheridas al fondo de los pocillos, las células fueron lavadas con alpha-MEM con 2% FBS y 2 mM Lglutamina e incubadas durante otra hora. Finalmente, el medio fue retirado de los pocillos y sustituido por alpha-MEM con 2% FBS, 2 mM L-glutamina, 0,2 mM L-ascorbato y CBD-RGD (0, 0,25, 1 ó 4 µM). La actividad fosfatasa alcalina (ALP) en los cultivos fue estimada tras 3 y 10 días de cultivo, lavando las células PBS y midiendo la actividad enzimática empleando un método basado en pNPP (Sigma Fast™ p-nitrophenyl phosphate tablets, Sigma–Aldrich). N=8 para cada condición. Los resultados se muestran en las figuras 2A y 2B. To determine the effect of CBD-RGD peptide in soluble form on osteoblastic line cells, MC3T3-E1 mouse preosteoblasts and mesenchymal stem cells (MSCs) from rat bone marrow were supplemented in alpha-MEM (Sigma-Aldrich) medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 2 mM L-glutamine, at 37 ° C in a humid atmosphere with 5% CO2 (standard conditions). The cells were seeded in 96-well plates (Nunclon, Nunc) at a density of 7.5 x 103 cells / well and incubated for 3 hours under standard conditions. Once adhered to the bottom of the wells, the cells were washed with alpha-MEM with 2% FBS and 2 mM Lglutamine and incubated for another hour. Finally, the medium was removed from the wells and replaced by alpha-MEM with 2% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.2 mM L-ascorbate and CBD-RGD (0.25, 1 or 4 µM). The alkaline phosphatase activity (ALP) in the cultures was estimated after 3 and 10 days of culture, washing the PBS cells and measuring the enzymatic activity using a method based on pNPP (Sigma Fast ™ p-nitrophenyl phosphate tablets, Sigma-Aldrich). N = 8 for each condition. The results are shown in Figures 2A and 2B.

EJEMPLO 3. Ensayos de mineralización sobre cultivos celulares EXAMPLE 3. Mineralization assays on cell cultures

Con el fin de determinar si el péptido CBD-RGD es capaz de promover la mineralización de la matriz extracelular en cultivos celulares, se sembraron células MSCs de rata a una densidad de 2 x 105 células/pocillo en placas de 12 pocillos, en medio alpha-MEM con 2% FBS, 2 mM L-glutamina, 0,2 mM Lascorbato y CBD-RGD (0, 0,25, 1 o 4 µM). Las células fueron cultivadas durante 21 días, con cambios completos de medio a los días 7 y 14. A los 21 días, los nódulos mineralizados fueron teñidos con rojo de alizarina S (Sigma-Aldrich) para su visualización y, finalmente, el colorante fue extraído para permitir su cuantificación espectrofotométrica. De forma resumida, las células fueron fijadas con formaldehido tamponado, teñidas con una solución 40 mM de rojo de alizarina S y lavadas abundantemente para eliminar el exceso de colorante. Posteriormente, el colorante fue extraído con ácido acético, neutralizado con hidróxido amónico y cuantificado por medida de la absorbancia a 405 nm. N=6 para cada condición. Los resultados se muestran en la figura 3. In order to determine whether the CBD-RGD peptide is capable of promoting mineralization of the extracellular matrix in cell cultures, rat MSCs cells were seeded at a density of 2 x 105 cells / well in 12-well plates, in alpha medium -MEM with 2% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.2 mM Lascorbate and CBD-RGD (0, 0.25, 1 or 4 µM). The cells were cultured for 21 days, with complete changes of medium at days 7 and 14. At 21 days, the mineralized nodules were stained with alizarin S red (Sigma-Aldrich) for visualization and, finally, the dye was extracted to allow spectrophotometric quantification. In summary, the cells were fixed with buffered formaldehyde, stained with a 40 mM solution of alizarin S red and washed thoroughly to remove excess dye. Subsequently, the dye was extracted with acetic acid, neutralized with ammonium hydroxide and quantified by absorbance measurement at 405 nm. N = 6 for each condition. The results are shown in figure 3.

EJEMPLO 4. Cirugía de animales EXAMPLE 4. Animal surgery

El cuidado de los animales y los procedimientos quirúrgicos se llevaron a cabo siguiendo las directrices de la legislación nacional (RD 1201/2005) e internacional (Directive 2010/63/EU) que regula la protección de animales empleados para fines científicos. Los procedimientos fueron igualmente aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Málaga. Para el estudio se usaron doce ratas macho Wistar de 3 meses de edad y tanto su estabulado como las cirugías se llevaron a cabo en las instalaciones del animalario de la Universidad de Málaga. Se cortaron discos de esponja absorbible de colágeno tipo I de 5 mm de diámetro y 1 mm de grosor, que se cargaron con 300 ng de BMP-2, 5 µg CBD-RGD ó 300 ng BMP-2 + 5 µg CBD-RGD, y se dejaron secar durante una hora en campana de flujo laminar antes de su implantación. Como control negativo se emplearon discos incubados únicamente con vehículo. Los animales fueron anestesiados, se les afeitó y desinfectó la región dorsal y se realizó un corte longitudinal en la piel para implantar las ACSs en bolsillos musculares abiertos en los músculos dorsales. Tras la cirugía, los animales fueron mantenidos en jaulas individuales con acceso ilimitado a agua y comida. La mitad de los animales fueron sacrificados a los 14 días, mientras que la otra mitad se sacrificó en el día 21. En cada extracción, los implantes ectópicos fueron diseccionados de los tejidos circundantes y usados para medir su contenido en calcio (N=6 para cada condición) o ser sometidos a análisis histológico (N=3 para cada condición). Animal care and surgical procedures were carried out following the guidelines of national (RD 1201/2005) and international legislation (Directive 2010/63 / EU) that regulates the protection of animals used for scientific purposes. The procedures were also approved by the Ethics Committee of the University of Malaga. For the study, twelve 3-month-old Wistar male rats were used and both their housing and the surgeries were carried out at the animal facility at the University of Malaga. Type I collagen absorbable sponge discs 5 mm in diameter and 1 mm thick were cut, which were loaded with 300 ng BMP-2, 5 µg CBD-RGD or 300 ng BMP-2 + 5 µg CBD-RGD, and allowed to dry for one hour in laminar flow hood before implantation. As a negative control, disks incubated with vehicle only were used. The animals were anesthetized, the dorsal region was shaved and disinfected and a longitudinal cut was made in the skin to implant the ACSs in open muscle pockets in the dorsal muscles. After surgery, the animals were kept in individual cages with unlimited access to water and food. Half of the animals were sacrificed at 14 days, while the other half was sacrificed on day 21. At each extraction, the ectopic implants were dissected from the surrounding tissues and used to measure their calcium content (N = 6 for each condition) or undergo histological analysis (N = 3 for each condition).

EJEMPLO 5. Medida de calcio en implantes ectópicos EXAMPLE 5. Measurement of calcium in ectopic implants

Las muestras ectópicas extraídas para estimar su contenido en calcio fueron lavados con 0,9% NaCl durante 2 horas con varios cambios para eliminar el exceso de sangre. Cada implante fue incubado posteriormente en 0,5 ml de 10% HCl durante 24 horas a temperatura ambiente para solubilizar todo el calcio contenido. Se tomaron 10 µl de cada muestra para estimar su concentración de calcio empleando un método colorimétrico basado en el uso de o-cresolftaleína complexona (Calcium OCC, Cromatest). Los resultados se muestran en la figura 4. The ectopic samples extracted to estimate their calcium content were washed with 0.9% NaCl for 2 hours with several changes to remove excess blood. Each implant was subsequently incubated in 0.5 ml of 10% HCl for 24 hours at room temperature to solubilize all the calcium content. 10 µl of each sample was taken to estimate its calcium concentration using a colorimetric method based on the use of o-cresolftalein complexone (Calcium OCC, Cromatest). The results are shown in figure 4.

EJEMPLO 6. Análisis histológico de las muestras in vivo EXAMPLE 6. Histological analysis of the samples in vivo

Los implantes ectópicos extraídos para su análisis histológico fueron fijados en 4% formaldehído tamponado neutron durante 18 horas, descalcificadas con Decalcifier II (Surgipath, Richmond, IL, USA) durante 4 horas e incluidas en parafina. Se realizaron cortes transversales de 10 µm de grosor, que fueron teñidos con hematoxilina-eosina (H-E) o mediante immunocitoquímica empleando un anticuerpo anti-osteopontina y un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón biotinilado. Los resultados se muestran en la figura 5 y se detallan en el ejemplo 7. The ectopic implants removed for histological analysis were fixed in 4% neutron buffered formaldehyde for 18 hours, descaled with Decalcifier II (Surgipath, Richmond, IL, USA) for 4 hours and included in paraffin. 10 µm thick cross sections were made, which were stained with hematoxylin-eosin (H-E) or by immunocytochemistry using an anti-osteopontin antibody and a biotinylated mouse anti-IgG secondary antibody. The results are shown in Figure 5 and are detailed in Example 7.

EJEMPLO 7. Evaluación de la osificación ectópica in vivo. EXAMPLE 7. Evaluation of ectopic ossification in vivo.

Las esponjas control, cargadas únicamente con vehículo, no pudieron ser recuperadas en ningún caso debido a la completa reabsorción de las mismas. Aquellas que fueron cargadas únicamente con CBD-RGD dieron lugar a un tejido fibrótico denso sin mostrar señal de osteogénesis en su interior, lo que indicó que el péptido solo no fue capaz de inducir la formación de hueso en un ambiente muscular. Las esponjas cargadas con 300 ng de BMP-2 tampoco mostraron indicios claros de osteogénesis a los 14 ó 21 días tras su implantación. Si bien la apariencia de estos implantes al día 14 mostraba cierta similitud con los primeros estadios de osificación ectópica, con una gran infiltración de células y la formación de material extracelular fuertemente eosinofílico, los implantes no fueron capaces de progresar hacia la formación de hueso y no se pudo apreciar ninguna organización trabecular en el día 21. En estos implantes, la expresión de osteopontina no estaba focalizada en áreas concretas, sino más bien se limitaba a pequeños grupos de células dispersos por las esponjas. Por el contrario, las ACSs que fueron cargadas con BMP-2 + CBD-RGD ya mostraban trabéculas óseas al día 14, con osteocitos claramente definidos dentro de la matriz mineralizada. Si bien estos implantes no experimentaron una gran progresión tras una semana más, aún se podían apreciar trabéculas de aspecto maduro en las esponjas al día 21. Estas observaciones correlacionan bien con la expresión de osteopontina detectada, la cual era mayor al día 14 y disminuía al día 21. Sin embargo, este marcador seguía expresándose abundantemente en las cercanías de las trabéculas óseas remanentes, indicando que en esas áreas seguía teniendo lugar un proceso osteogénico activo. The control sponges, loaded only with vehicle, could not be recovered in any case due to their complete resorption. Those that were loaded solely with CBD-RGD resulted in a dense fibrotic tissue without showing a sign of osteogenesis inside, which indicated that the peptide alone was not able to induce bone formation in a muscular environment. Sponges loaded with 300 ng of BMP-2 also showed no clear signs of osteogenesis at 14 or 21 days after implantation. Although the appearance of these implants at day 14 showed some similarity with the first stages of ectopic ossification, with a large infiltration of cells and the formation of strongly eosinophilic extracellular material, the implants were not able to progress towards bone formation and not no trabecular organization could be seen on day 21. In these implants, osteopontin expression was not focused on specific areas, but rather was limited to small groups of cells dispersed by the sponges. In contrast, ACSs that were loaded with BMP-2 + CBD-RGD already showed bone trabeculae at day 14, with clearly defined osteocytes within the mineralized matrix. Although these implants did not experience a great progression after another week, mature trabeculae could still be seen in the sponges at day 21. These observations correlate well with the osteopontin expression detected, which was greater at day 14 and decreased at day 21. However, this marker was still expressed abundantly in the vicinity of the remaining bone trabeculae, indicating that in these areas an active osteogenic process was still taking place.

Cuando se analizaron los contenidos de calcio de los implantes, no fue posible detectar calcio en las ACSs cargadas únicamente con BMP-2 a ninguno de los tiempos analizados. Por el contrario, los implantes cargados con BMP-2 + CBD-RGD ya contenían cantidades detectables de calcio al día 14, multiplicándose esta cantidad por ocho en la semana siguiente. When the calcium contents of the implants were analyzed, it was not possible to detect calcium in the ACSs loaded only with BMP-2 at any of the times analyzed. In contrast, implants loaded with BMP-2 + CBD-RGD already contained detectable amounts of calcium by day 14, multiplying this amount by eight in the following week.

EJEMPLO 8. Análisis estadísticos EXAMPLE 8. Statistical analyzes

5  Todos los datos fueron representados como la media ± desviación estándar. El análisis estadístico de los datos obtenidos en los ensayos in vitro se realizó mediante t de Student, comparando cada condición con el control correspondiente al mismo tiempo. El análisis de los datos obtenidos de la estimación del contenido de calcio de los implantes ectópicos se realizó 5 All data were represented as mean ± standard deviation. Statistical analysis of the data obtained in the in vitro assays was performed using Student's t, comparing each condition with the corresponding control at the same time. The analysis of the data obtained from the estimation of the calcium content of the ectopic implants was performed

10  mediante t de Student, comparando las dos condiciones a un mismo tiempo. Todos los análisis se llevaron a cabo con el programa SigmaPlot 11.0. 10 using Student's t, comparing the two conditions at the same time. All analyzes were carried out with the SigmaPlot 11.0 program.

ES 2 417 705 Al ES 2 417 705 Al

Claims (24)

REIVINDICACIONES 1. Péptido aislado que comprende SEO ID NO: 1. 1. Isolated peptide comprising SEO ID NO: 1. 5 2. Péptido aislado según la reivindicación 1 que consiste en SEO ID NO: 1. 5. Isolated peptide according to claim 1 consisting of SEO ID NO: 1. 3. Secuencia nucleotídica que codifica para un péptido según cualquiera de 3. Nucleotide sequence encoding a peptide according to any of las reivindicaciones 1 Ó 2.  claims 1 or 2. \O 4. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 3 que comprende SEO ID NO: 2. OR 4. Nucleotide sequence according to claim 3 comprising SEO ID NO: 2. 5. Secuencia nucleotídíca según la reivindicación 4 que consiste en SEO ID 5. Nucleotide sequence according to claim 4 consisting of SEO ID NO:2. 15 NO: 2. fifteen 6. Construcción genética que comprende una secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5. 6. Genetic construct comprising a nucleotide sequence according to any of claims 3 to 5. 7. Vector que comprende una secuencia nucleotídica según cualquiera de las 20 reivindicaciones 3 a 5 o una construcción genética según la reivindicación 6. 7. Vector comprising a nucleotide sequence according to any one of claims 3 to 5 or a genetic construct according to claim 6. 8. Célula hospedadora que comprende una secuencia nucleotídica según 8. Host cell comprising a nucleotide sequence according to cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, una construcción genética según la reivindicación 6 o vector según la reivindicación 7. any one of claims 3 to 5, a genetic construct according to claim 6 or vector according to claim 7. 9. Composición que comprende un péptido según cualquiera de las 9. Composition comprising a peptide according to any of the reivindicaciones 1 Ó 2. claims 1 or 2. 10. Composición según la reivindicación 9 que además comprende al menos 10. Composition according to claim 9 further comprising at least 30 una proteína BMP.  30 a BMP protein. 11. Composición según la reivindicación 10 donde la proteína BMP se selecciona de la lista que comprende BMP-2 y BMP-7. 11. Composition according to claim 10 wherein the BMP protein is selected from the list comprising BMP-2 and BMP-7. 35 12. Composición según la reivindicación 11 donde la proteína BMP es BMP-2. 12. Composition according to claim 11 wherein the BMP protein is BMP-2. ES 2 417 705 Al ES 2 417 705 Al 13. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 Ó 2, de una secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, de una construcción genética según la reivindicación 6, de un vector según la reivindicación 7, de una célula hospedadora según la reivindicación 8 o de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 como agente osteogénico in vitro. 13. Use of a peptide according to any one of claims 1 or 2, of a nucleotide sequence according to any of claims 3 to 5, of a genetic construct according to claim 6, of a vector according to claim 7, of a host cell according to claim 8 or a composition according to any of claims 9 to 12 as an in vitro osteogenic agent. 14. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, de una secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, de una construcción genética según la reivindicación 6, de un vector según la reivindicación 7, de una célula hospedadora según la reivindicación 8 o de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 para la elaboración de un medicamento. 14. Use of a peptide according to any one of claims 1 or 2, of a nucleotide sequence according to any of claims 3 to 5, of a genetic construct according to claim 6, of a vector according to claim 7, of a host cell according to claim 8 or a composition according to any of claims 9 to 12 for the preparation of a medicament. 15. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, de una secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, de una construcción genética según la reivindicación 6, de un vector según la reivindicación 7, de una célula hospedadora según la reivindicación 8 o de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas. 15. Use of a peptide according to any of claims 1 or 2, of a nucleotide sequence according to any of claims 3 to 5, of a genetic construct according to claim 6, of a vector according to claim 7, of a host cell according to claim 8 or a composition according to any of claims 9 to 12 for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries. 16. Uso según la reivindicación 15 donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de enfermedades o lesiones óseas seleccionadas de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, 16. Use according to claim 15 wherein the medicament is for the treatment and / or prevention of bone diseases or lesions selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoartrosis y callos hipertróficos. pseudoarthrosis and hypertrophic calluses. 17.Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 Ó 2 o de una 17. Use of a peptide according to any one of claims 1 or 2 or of a composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 para el composition according to any of claims 9 to 12 for the recubrimiento de implantes o prótesis. implant or prosthetic coating.
18. 18.
Uso según la reivindicación 17 donde el implante o prótesis ha sido previamente recubierto con colágeno tipo 1. Use according to claim 17 wherein the implant or prosthesis has previously been coated with type 1 collagen.
19. 19.
Matriz de colágeno tipo 1 que comprende un péptido según cualquiera de las Type 1 collagen matrix comprising a peptide according to any of the
ES 2 417 705 Al ES 2 417 705 Al reivindicaciones 1 Ó 2.  claims 1 or 2.
20. twenty.
Matriz según la reivindicación 19 que además comprende al menos una proteína BMP. Matrix according to claim 19 further comprising at least one BMP protein.
21. twenty-one.
Matriz según la reivindicación 20 donde la proteína BMP se selecciona de la lista que comprende BMP-2 y BMP-7. Matrix according to claim 20 wherein the BMP protein is selected from the list comprising BMP-2 and BMP-7.
22. 22
Matriz según la reivindicación 21 donde la proteína BMP es BMP-2. Matrix according to claim 21 wherein the BMP protein is BMP-2.
23. 2. 3.
Uso de una matriz según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 para la Use of a matrix according to any of claims 19 to 22 for the
elaboración de un medicamento.  Preparation of a medicine. 24. Uso de una matriz según la reivindicación 23 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o lesiones óseas. 24. Use of a matrix according to claim 23 for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of bone diseases or injuries. 25. Uso de una matriz según la reivindicación 24 donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de enfermedades o lesiones óseas seleccionadas de la lista que comprende: fracturas, fusiones espinales, resecciones óseas, pseudoartrosis y callos hipertróficos. 25. Use of a matrix according to claim 24 wherein the medicament is for the treatment and / or prevention of bone diseases or lesions selected from the list comprising: fractures, spinal fusions, bone resections, pseudoarthrosis and hypertrophic calluses.
26. 26.
Uso de una matriz según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 para el recubrimiento de implantes o prótesis. Use of a matrix according to any of claims 19 to 22 for coating implants or prostheses.
27. 27.
Prótesis o implante recubierto por un péptido según cualquiera de las Prosthesis or implant coated by a peptide according to any of the
reivindicaciones 1 Ó 2, o por una matriz según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22. claims 1 or 2, or by a matrix according to any of claims 19 to 22. Fig. 1 Fig. 1 Fig. 2 Fig 2 0 0,25 1 0 0.25 1 B  B Fig. 4 Fig. 4 Fig. 5 Fig. 5
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