ES2407957T3 - Tratamiento de carcinomas con una combinación de inhibidores de la vía EGF y de la telomerasa - Google Patents

Abstract

El uso de un inhibidor de la telomerasa en la fabricación de un medicamento para tratar un carcinoma en un sujetoque está siendo tratado secuencialmente o simultáneamente con un anticuerpo anti-HER2, donde el inhibidor de latelomerasa es un oligonucleótido que se caracteriza por: (i) uniones internucleosídicas tiofosforoamidato N3'→P5'; (ii) tener la secuencia identificada como SEC. ID Nº: 12; y (iii) un grupo palmitoílo (C16) unido al extremo 5' del oligonucleótido a través de un grupo de unión glicerol oaminoglicerol.

Description

Tratamiento de carcinomas con una combinación de inhibidores de la vía EGF y de la telomerasa.

Campo de la invención

La invención se refiere al tratamiento de carcinomas mediante una combinación de un inhibidor de la vía del EGF (factor de crecimiento epitelial), como un anticuerpo anti-receptor del EGF y un inhibidor de la telomerasa.

Antecedentes

En vista del continuo alto número de muertes anuales debidas a cáncer, existe una necesidad sostenida de identificar regímenes terapéuticos eficaces y menos tóxicos para usar en el tratamiento contra el cáncer.

Se ha propuesto o demostrado un tratamiento con un inhibidor de la vía del factor de crecimiento epitelial (EGF) para diversos tipos de cáncer de células epiteliales o carcinomas. Trastuzumab (Herceptin®), un anticuerpo monoclonal humanizado que se dirige específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2), inhibe la vía de señalización del EGF asociada con HER2. El anticuerpo anti-HER2 se puede indicar particularmente en el tratamiento de tumores malignos, como el de mama y ovario, caracterizados por la sobreexpresión de HER2 en las células del carcinoma.

Cetuximab (Erbitux ®) es un anticuerpo monoclonal quimérico que además actúa como un inhibidor de la vía del EGF al unirse al receptor del factor de crecimiento epidérmico 1 (EGFR, ErbB-1 o HER1) y se puede indicar, por ejemplo, para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico y el cáncer de cabeza y cuello.

También se han propuesto varios antineoplásicos de molécula pequeña que se dirigen a la vía del EGF en el tratamiento contra el cáncer. Erlotinib (Tarceva®) y gefitinib (Iressa®) actúan específicamente sobre la actividad de tirosina quinasa de EGFR, que puede estar altamente expresado y ocasionalmente mutado en diversas formas de cáncer. Las moléculas de fármaco se unen de forma reversible al sitio de unión del trifosfato de adenosina (ATP) del receptor, bloqueando eficazmente la autofosforilación de los homodímeros de EGFR y bloqueando así la cascada de señalización hacia el núcleo. Ambos compuestos han demostrado ser beneficiosos con respecto a la supervivencia, en el tratamiento del cáncer de pulmón en ensayos clínicos de fase III y han sido aprobados para el tratamiento de cáncer de pulmón no microcítico localmente avanzado o metastásico.

Los inhibidores de la vía del EGF no son sino una clase de un gran número de antineoplásicos que se pueden seleccionar para tratar el cáncer. Además, cualquier clase elegida de antineoplásicos se puede probar con uno o varios de otros antineoplásicos en un tratamiento combinado, para determinar si los dos o más antineoplásicos juntos son capaces de producir un efecto terapéutico aditivo u otra ventaja importante, como una reducción de los efectos colaterales no deseados, debido a la reducción de la dosis del componente más tóxico, y/o la reducción en el desarrollo de resistencia a los fármacos del cáncer que se está tratando.

En WO 2006/113470 se dan a conocer terapias de combinación con el inhibidor de la telomerasa GRN163L en el tratamiento contra el cáncer. Kraemer et al informan quimiosensibilización de líneas celulares de cáncer de vejiga por tratamiento antisentido con telomerasa transcriptasa inversa humana utilizando oligonucleótidos antisentido (Journal of Urology, vol. 172, 2023-2028 (2004)).

Sería deseable establecer una terapia contra el cáncer con fármacos combinados para el tratamiento de carcinomas en la cual ambos fármacos sean relativamente específicos contra las células cancerosas, y cada uno actúe a través de un mecanismo que involucre la unión específica del fármaco a un componente celular asociado preferentemente a las células cancerosas.

La invención es como la definen las reivindicaciones.

Resumen de la invención

Se da a conocer un método para inhibir la proliferación de células carcinomatosas que expresan un receptor del EGF mediante, (a) exposición de las células a un inhibidor de la vía del EGF, como un anticuerpo anti-receptor del EGF y (b) antes, a continuación o concomitantemente con el paso (a) exposición de las células a un inhibidor de la telomerasa. En una realización, la cantidad de anticuerpo a la cual se exponen las células es eficaz, en sí misma, para inhibir la proliferación de las células cancerosas. En otra realización, la cantidad tanto de anticuerpo como de inhibidor es eficaz, en sí misma, para inhibir la proliferación de las células cancerosas. La combinación puede proporcionar un mayor efecto inhibitorio de las células cancerosas que cualquiera de los componentes solos.

El inhibidor de la telomerasa incluye un oligonucleótido que tiene uniones entre subunidades resistentes a las nucleasas y una secuencia del oligonucleótido eficaz para unirse mediante hibridación específica de la secuencia a una región plantilla de hTR. Las uniones internucleosídicas en el oligonucleótido son uniones tiofosforamidato N3'3P5'. El inhibidor de la telomerasa incluye una porción lipídica, como un ácido graso, un esterol o uno de sus derivados, que se une covalentemente a uno de los extremos del oligonucleótido. El oligonucleótido tiene 13 a 20 bases de longitud, y la secuencia identificada por SEC. ID Nº: 12 (5'-TAGGGTTAGACAA-3'). Un ejemplo de inhibidor de la telomerasa es el compuesto designado en este documento como GRN163L.

El método se utiliza en el tratamiento de un sujeto que tiene un carcinoma y en las realizaciones de ejemplo, para tratar a un sujeto que tiene cáncer de mama o de ovario caracterizado por niveles elevados de HER2 en la superficie de las células cancerosas, donde el paso de exposición (a) incluye administrar al sujeto el anticuerpo anti-receptor del EGF en una cantidad eficaz, cuando se administra solo, para inhibir la proliferación de células cancerosas en el sujeto. Antes del tratamiento, se puede confirmar que el sujeto tenga elevados niveles de receptor del EGF, como HER2, asociados a las células cancerosas.

En otro método, cada paso de exposición (a) y (b) incluye la administración al sujeto del inhibidor de la vía del EGF y del inhibidor de la telomerasa en una cantidad eficaz, cuando se administran solos, para inhibir la proliferación de células cancerosas en el sujeto. Cuando el inhibidor de la telomerasa es el compuesto GRN163L, se puede administrar al sujeto por infusión intravenosa, en condiciones de infusión eficaces para producir una concentración sanguínea del inhibidor entre 1 nM y 100 !M. El anticuerpo también se puede administrar al sujeto por infusión, en una dosis eficaz para producir una concentración sanguínea del anticuerpo entre aproximadamente 25 y 500 microgramos/ml.

Se da a conocer un método para mejorar la eficacia de un inhibidor de la vía del EGF en el tratamiento de un carcinoma, y en las realizaciones de ejemplo, aumentar la eficacia de los anticuerpos anti-receptor del EGF, como el anticuerpo anti-HER2, en el tratamiento de un carcinoma, y en las realizaciones de ejemplo, de carcinomas como cáncer de mama, de ovario o carcinomas pulmonares no microcíticos, con niveles elevados de HER2 expresado. El método incluye administrar al sujeto, antes, durante o después de la administración del inhibidor de la vía del EGF, un oligonucleótido inhibidor de la telomerasa del tipo compuesto por un oligonucleótido que tiene uniones entre subunidades resistentes a las nucleasas y una secuencia del oligonucleótido eficaz para unirse mediante hibridación específica de la secuencia a una región plantilla de hTR. Preferentemente, la cantidad de inhibidor de la telomerasa es eficaz para inhibir la proliferación de las células cancerosas en el sujeto cuando el inhibidor de la telomerasa se administra solo.

Los dos inhibidores se pueden administrar al sujeto como una composición que contenga ambos compuestos. El aumento de la eficacia del tratamiento se puede evidenciar, por ejemplo, por un aumento en el tiempo de supervivencia del sujeto, o por una inhibición del crecimiento del tumor en el sujeto, en comparación con el tratamiento con el inhibidor de la vía del EGF solo.

Preferentemente, el oligonucleótido tiene 13 a 20 bases de longitud e incluye la secuencia identificada por SEC. ID Nº: 12 (5'-TAGGGTTAGACAA-3'). Un ejemplo de inhibidor de la telomerasa es el compuesto identificado como GRN163L, o un análogo de éste. Este compuesto tiene (i) uniones internucleosídicas tiofosforamidato N3'3P5'; (ii) la secuencia identificada como SEC. 10 N°: 12; y (iii) un grupo palmitoílo (C16) unido al extremo 5' del oligonucleótido a través de un grupo de unión glicerol o aminoglicerol. Un ejemplo de anticuerpo anti-receptor del EGF es el anticuerpo humanizado anti-HER2 Trastuzumab.

También se da a conocer un juego para usar en el tratamiento de carcinomas, que comprende (a) una dosis de un inhibidor de la vía del EGF, como un anticuerpo anti-receptor del EGF, eficaz, cuando se administra solo, para inhibir la proliferación de células carcinomatosas en el sujeto y (b) una dosis de un oligonucleótido inhibidor de la telomerasa que tiene uniones entre subunidades resistentes a las nucleasas, y una secuencia del oligonucleótido eficaz para unirse mediante hibridación específica de la secuencia a una región plantilla de hTR. En una realización, el inhibidor de la telomerasa se proporciona en una cantidad eficaz, cuando se administra solo, para inhibir la proliferación de células cancerosas en el sujeto.

En una realización de ejemplo, el anticuerpo anti-HER2 es trastuzumab y el inhibidor de la telomerasa es el compuesto identificado como GRN163L. El último compuesto tiene (i) uniones internucleosídicas tiofosforamidato N3'3P5' en el oligonucleotido; (ii) la secuencia identificada como SEC. 10 N°: 12; y (iii) un grupo palmitoílo (C16) unido al extremo 5' del oligonucleótido a través de un grupo de unión glicerol o aminoglicerol.

También se proporciona un juego que contiene un inhibidor de la telomerasa y un anticuerpo anti-receptor del EGF, para usar en el tratamiento de un carcinoma. Dicho tratamiento consiste preferentemente en administrar el anticuerpo a un sujeto, antes, a continuación o concomitante con la administración del inhibidor de la telomerasa. El inhibidor de la telomerasa es preferentemente un oligonucleótido resistente a las nucleasas que se une de forma específica de la secuencia a la región plantilla de hTR.

En un aspecto, se proporciona un juego que contiene una dosis de un oligonucleótido inhibidor de la telomerasa que tiene uniones entre subunidades resistentes a las nucleasas, y una secuencia del oligonucleótido eficaz para unirse mediante hibridación específica de la secuencia a una región plantilla de hTR, preferentemente en una cantidad eficaz para inhibir la proliferación de células cancerosas en un sujeto. Preferentemente, el juego incluye un prospecto con instrucciones para la administración del inhibidor de la telomerasa. El prospecto puede proveer al usuario de un conjunto de instrucciones para usar el inhibidor en monoterapia y un conjunto separado de instrucciones para usar el inhibidor en combinación con un inhibidor de la vía del EGF, como un anticuerpo antireceptor del EGF .

El conjunto de instrucciones para la terapia de combinación puede recomendar (i) una dosis menor del inhibidor de la telomerasa, cuando se usa en combinación con el inhibidor de la vía del EGF, (ii) una dosis menor del inhibidor de la vía del EGF, cuando se usa en combinación con el inhibidor de la telomerasa, o (iii) un régimen de dosificación diferente para uno o ambos inhibidores que el que se recomendaría normalmente.

También se proporciona el uso de un inhibidor de la telomerasa para la preparación de un medicamento para usar en el tratamiento de un carcinoma en un sujeto, en donde el tratamiento comprende administrar dicho inhibidor de la telomerasa a un sujeto en combinación con un inhibidor de la vía del EGF, como un anticuerpo anti-receptor del EGF, ejemplificado por trastuzumab un anticuerpo anti-HER2. El tratamiento puede comprender administrar el anticuerpo al sujeto ya sea antes, a continuación o concomitante con el inhibidor de la telomerasa que es preferentemente un oligonucleótido resistente a las nucleasas que se une de forma específica de la secuencia a la región plantilla de hTR.

En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona el uso de un inhibidor de la vía del EGF y un inhibidor de la telomerasa, en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer en un sujeto. Los inhibidores preferidos o de ejemplo y las indicaciones para el cáncer son los establecidos precedentemente.

También se da a conocer el uso de un inhibidor de la telomerasa en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer de mama o de ovario en un sujeto que está siendo tratado con un inhibidor de la vía del EGF, como un anticuerpo anti-receptor del EGF, a efectos de mejorar la eficacia contra el cáncer del anticuerpo en el sujeto.

Éstos y otros objetivos y características de la invención se tornarán más evidentes al leer la descripción detallada siguiente conjuntamente con las figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

Las figs. 1 y 2 muestran el aumento de la actividad inhibitoria de la telomerasa por un oligonucleótido NPS inhibidor de la plantilla de hTR (GRN163) por conjugación a un lípido (para producir GRN163L), en xenoinjertos de tumores de mieloma humano (Fig. 1) y de celulas hepaticas (Fig. 2), respectivamente, en ratones; La figura 3 ilustra el efecto aditivo sobre la inhibición del volumen del tumor (VT) logrado mediante la administración simultánea del anticuerpo anti-HER2 trastuzumab y el inhibidor de la telomerasa GRN163L, en un modelo de carcinoma pulmonar no microcítico A549 (véase la sección IV.A y la sección experimental D más adelante).

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

Los términos siguientes tienen los significados indicados a menos que se indique lo contrario.

Un "polinucleótido" u "oligonucleótido" se refiere a un polímero u oligómero de subunidades nucleosídicas ribosa y/o desoxirribosa que tiene entre aproximadamente 2 y aproximadamente 200 subunidades contiguas. Las subunidades nucleosídicas se pueden unir mediante distintos tipos de uniones entre subunidades, incluidas, pero no exclusivamente, uniones fosfodiéster, fosfotriéster, metilfosfonato, fosforamidato P3'3N5', fosforamidato N3'3P5', tiofosforamidato N3'3P5' y fosforotioato. El término también incluye tales polímeros u oligómeros que tienen modificaciones, conocidas por los expertos en el área, en el azúcar (por ejemplo, sustituciones 2'), la base (véase la definición de "nucleósido" más adelante) y los extremos 3' y 5'. En realizaciones en las que la molécula de oligonucleótido incluye varias uniones entre subunidades, cada unión se puede formar usando la misma unión química, o se puede usar una mezcla de uniones químicas. Cuando un oligonucleótido está representado por una secuencia de letras, como "ATGUCCTG", se entenderá que los nucleótidos se encuentran en orden 5'

33' de izquierda a derecha. La representación de la secuencia de bases del oligonucleótido de esta manera no implica el uso de un determinado tipo de subunidad internucleosídica en el oligonucleótido.

El término "nucleósido" incluye los nucleósidos naturales, como las formas 2'-desoxi y 2'-hidroxilo, por ejemplo, como se describe en Komberg y Baker, DNA Replication, 2ª Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), y análogos. "Análogos", en referencia a los nucleósidos, incluye nucleósidos sintéticos que tienen porciones que son bases nitrogenadas (bases nucleicas) modificadas (véase la definición de "base nitrogenada" más adelante) y/o porciones azúcar modificadas, por ejemplo, las descritas en general por Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, Nueva York, 1980). Dichos análogos incluyen nucleósidos sintéticos diseñados para mejorar las propiedades de unión, por ejemplo, estabilidad, especificidad o similares, como dan a conocer Uhlmann y Peyman (Chemical Reviews 90:543-584, 1990). Un oligonucleótido que contiene dichos nucleósidos, y que por lo general contiene uniones internucleosídicas sintéticas resistentes a las nucleasas, puede en sí mismo ser considerado como un "análogo".

Una "base nitrogenada" incluye (i) bases nitrogenadas de ADN y ARN naturales (uracilo, timina, adenina, guanina y citosina), (ii) bases nitrogenadas modificadas o análogos de bases nitrogenadas (por ejemplo, 5-metilcitosina, 5bromouracilo o inosina) y (iii) análogos de bases nitrogenadas. Un análogo de una base nitrogenada es un compuesto cuya estructura molecular imita a la de una base de ADN o ARN típica.

Un oligonucleótido que tiene "uniones resistentes a las nucleasas" se refiere a uno cuyo esqueleto tiene uniones en las subunidades que son sustancialmente resistentes a la escisión por nucleasas, en forma hibridada o no hibridada, por las nucleasas intracelulares y extracelulares comunes del organismo; es decir, el oligonucleotido no presenta, o presenta muy poca, escisión por nucleasas en las condiciones normales de las nucleasas en el organismo a las cuales está expuesto el oligonucleótido. Las uniones fosforamidato N3'3P5' (NP) o tiofosforamidato N3'3P5' (NPS) descritas a continuación son resistentes a las nucleasas.

El término "lípido" se usa ampliamente en este documento para abarcar sustancias que son solubles en solventes orgánicos, pero escasamente solubles, si lo son, en agua. El término lípido incluye, pero no exclusivamente, hidrocarburos, aceites, grasas (como ácidos grasos y glicéridos), esteroles, esteroides y formas derivadas de estos compuestos. Los lípidos preferidos son los ácidos grasos y sus derivados, hidrocarburos y sus derivados y esteroles, como el colesterol.

Los ácidos grasos, contienen generalmente un número par de átomos de carbono en una cadena lineal (comúnmente 12 a 24 carbones) y pueden ser saturados o insaturados y pueden contener o ser modificados para contener, diversos grupos sustituyentes. Por simplicidad, el término "ácido graso" también abarca derivados de ácidos grasos, como grasas o ésteres.

El término "hidrocarburo" abarca compuestos que constan sólo de hidrógeno y carbono, unidos por enlaces covalentes. El término abarca hidrocarburos de cadena abierta (alifáticos), incluidos hidrocarburos de cadena lineal y ramificada, e hidrocarburos saturados así como hidrocarburos mono y poliinsaturados. El término también abarca hidrocarburos que contienen uno o más anillos aromáticos.

Según se usa en este documento, el término "lípido" incluye también compuestos anfipáticos que contienen tanto porciones lipídicas como hidrófilas.

Un "inhibidor de la plantilla de hTR" es un compuesto que bloquea la región de plantilla (la región que abarca los nucleótidos 30 a 67 de SEC. ID Nº: 1, adjunta) del componente ARN de la telomerasa humana, inhibiendo así la actividad de la enzima. El inhibidor es típicamente un oligonucleótido que es capaz de hibridarse con esta región. Preferentemente, el oligonucleótido incluye una secuencia eficaz para hibridarse a una parte más específica de esta región, que tiene la secuencia 5'-CUAACCCUAAC-3' (SEC. ID Nº: 2), que abarca los nucleótidos 46 a 56 de SEC. ID Nº: 1 adjunta.

Un "carcinoma" es un tumor maligno originado en células epiteliales, es decir, un tumor maligno que se origina en la capa de revestimiento (células epiteliales) de los órganos. Al menos 80% de todos los tipos de cáncer son carcinomas e incluyen el cancer de mama, los carcinomas ductales y lobulares de mama; el cancer de ovario; el carcinoma de celulas basales, el cancer de piel no melanico mas comun; el carcinoma de celulas escamosas, una forma común de cáncer de piel y el tipo mas comun de cancer de pulmon; el carcinoma hepatocelular, la forma mas comun de cancer de higado; el carcinoma de celulas renales, un tumor maligno localizado en los rinones; y el carcinoma de células transicionales, un tipo de cáncer que se desarrolla en el revestimiento de la vejiga, el uréter o la pelvis renal. Las células cancerosas que componen un carcinoma se denominan "células carcinomatosas".

Se dice que un compuesto "inhibe la proliferación de las células carcinomatosas", si la proliferación de las células en presencia del compuesto es menor que la observada en ausencia del mismo. Es decir, la proliferación de las células es enlentecida o detenida en presencia de los compuestos. La inhibición de las células carcinomatosas se puede evidenciar, por ejemplo, mediante la reducción en el número de células o la velocidad de expansión de las células, la reducción de la masa del tumor o la velocidad de crecimiento del tumor, o el aumento de la tasa de supervivencia de un sujeto que se está tratando.

Un "inhibidor de la vía del factor de crecimiento epitelial (EGF)" es un compuesto que inhibe eventos de crecimiento

o división celular provocados por la activación de, y la señalización por, un receptor del EGF, como por la unión de EGF o ATP al receptor. Los receptores del EGF son miembros de la familia de los receptores ErbB, una subfamilia de cuatro receptores tirosina quinasa estrechamente relacionados: EGFR (ErbB-1 o HER1), HER2/c-neu (ErbB-2 o HER2)), Her3 (ErbB-3) y Her4 (ErbB-4). El receptor EGFR (ErbB-1) existe en la superficie celular y se activa mediante la unión de ligandos específicos, que incluyen el factor de crecimiento epidérmico y el factor de crecimiento transformante a (TGFa). Los receptores ErbB3 y ErbB4 relacionados son activados por neuregulinas (NRG). ErbB2 (HER2) no tiene ligando activador directo conocido y puede estar en un estado constitutivamente activado.

Después de la activación, EGFR sufre una transición de una forma monomérica inactiva a un homodímero activo, aunque hay algunas pruebas de que también pueden existir dímeros inactivos preformados antes de la unión del ligando. Además de formar homodímeros después de la unión del ligando, EGFR se puede aparear con otro miembro de la familia de receptores ErbB, como ErbB2/Her2/neu, para crear un heterodímero activado. También hay evidencia para sugerir que se forman agrupamientos de EGFR activados, aunque no queda claro si este agrupamiento es importante para la activación en sí misma o se produce con posterioridad a la activación de dímeros individuales.

La administración de un inhibidor de la telomerasa a un sujeto es eficaz para "aumentar la eficacia del tratamiento contra el cáncer de un inhibidor de la vía del EGF" como un anticuerpo anti-receptor del EGF, si el sujeto muestra una menor velocidad de crecimiento del tumor o una tasa de supervivencia mayor con la terapia combinada respecto al tratamiento con el inhibidor de la vía del EGF solo.

Un anticuerpo anti-receptor del EGF es un anticuerpo que se une específicamente a un receptor del EGF, es decir, EGFR (ErbB-1 o HER1), HER2/c-neu (ErbB-2 o HER2)), Her3 (ErbB-3) o Her4 (ErbB-4), para bloquear la señalización del receptor relacionado con la división y el crecimiento celulares. El anticuerpo puede abarcar una molécula de inmunoglobulina compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro y diversos fragmentos, y sus variantes. Por ejemplo, el anticuerpo puede carecer del fragmento Fc de los anticuerpos formados naturalmente, y puede incluir (i) un fragmento Fab, que es un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv, que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una region determinante de la complementariedad (C0R) aislada. En particular, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes diferentes, se pueden juntar por métodos de recombinación, mediante un grupo de unión sintético que les permita ser preparados como una proteína de una sola cadena en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes conocidas como fragmento variable de una sola cadena o anticuerpos scFv; vease por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883), y la expresión: anticuerpo que carece de fragmento Fc también abarca anticuerpos que tienen este formato scFv.

La expresión anticuerpos humanos o humanizados se refiere a un anticuerpo que tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en ellos de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se mencionan en este documento como residuos "importados", que normalmente se toman de un dominio de anticuerpo "importado", particularmente un dominio variable. Un residuo, una secuencia o un anticuerpo importado tiene una afinidad y/o especificidad deseada u otra actividad biológica del anticuerpo deseable como se explica en este documento. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá prácticamente todo de al menos uno y por lo general dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab').sub.2, Fabc, Fv) en los cuales todas o prácticamente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o prácticamente todas las regiones FR son las de una secuencia de consenso de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también óptimamente al menos una parte de la región constante de una inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Normalmente, el anticuerpo contendrá tanto la cadena liviana como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. Anticuerpos monoclonales humanizados o humanos se refiere a anticuerpos monoclonales.

II. Tratamiento del cáncer con inhibidores de la vía del EGF

Esta sección considera el tratamiento de carcinomas mediante la administración de un inhibidor de la vía del EGF solo, donde el inhibidor puede ser un anticuerpo anti-receptor del EGF o un inhibidor de molécula pequeña de la actividad de tirosina quinasa del receptor.

A. Anticuerpo anti-receptor del EGF.

Varios tratamientos contra el cáncer se basan en la unión de un anti-receptor del EGF mediante un anticuerpo antireceptor del EGF. El anticuerpo anti-HER2 trastuzumab (Herceptin ®) y el anticuerpo anti-EGFR cetuximab (Erbitux ®) han demostrado que la inhibición de la señalización del EGF es un mecanismo eficaz para tratar ciertos tumores sólidos.

Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal murino conocido como muMAb4D5 (Fendly, B. M. et al., Cancer Res. 50:1550-1558 (1990)), dirigido contra el dominio extracelular (ECD) de p185.sup.HER2, inhibe específicamente el crecimiento de las líneas celulares tumorales que sobreexpresan p185.sup.HER2 en cultivo en monocapa o en agar blando (Hudziak, R. M. et al., Molec. Cell. Biol. 9:1165-1172 (1989); Lupu, R. et al., Science 249:1552-1555 (1990)). MuMAb4D5 también tiene el potencial de aumentar la sensibilidad de las células del tumor al factor de necrosis tumoral, una molécula efectora importante en la citotoxicidad de las células del tumor mediada por macrófagos (Hudziak, supra, 1989; Shepard, H. M. y Lewis, G. 0. J. Clinical 1mmunology 8:333-395 (1988)). Por lo tanto, MuMAb4D5 tiene potencial para la intervención clínica y la obtención de imágenes de los carcinomas en los cuales se sobreexpresa p185.sup.HER2. El muMAb4D5 y sus usos se describen en la solicitud PCT WO 89/06692 publicada el 27 de julio de 1989.

Los anticuerpos humanos o humanizados anti-HER2 se pueden obtener mediante el uso de hibridomas humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)). Se pueden usar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312, 604 (1984); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985)) empalmando los genes de una molécula de anticuerpo de ratón con especificidad por el antígeno adecuada, junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica adecuada (como la capacidad de activar el complemento humano y mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos); dichos anticuerpos estan comprendidos por el alcance de esta invención.

Como se ha señalado, un anticuerpo anti-HER2, como trastuzumab, está indicado particularmente para el cáncer de mama caracterizado por niveles elevados de HER2 en la superficie de las células carcinomatosas y para el cáncer de ovario con niveles elevados de receptor HER2 de superficie. Concentraciones detectables del dominio extracelular circulante del receptor HER2 (antígeno circulante) se encuentran en el suero de algunos pacientes con tumores que sobreexpresan HER2. Estudios clínicos en muestras de suero de referencia revelaron que el 64% (286/447) de los pacientes tenían antígeno circulante perceptible, que alcanzaba hasta 1880 ng/mL (mediana = 11 ng/mL). Se puede usar un ensayo clínico (CTA) para la detección inmunohistoquímica de la sobreexpresión de la proteína HER2. Alternativamente, la prueba DAKO HercepTest™ proporciona otra prueba inmunohistoquímica para la sobreexpresión de la proteína HER2 y muestra una fuerte correlación con la prueba CTA. Sin embargo, se puede utilizar el anticuerpo en el tratamiento de una diversidad de otros carcinomas, que en general tienen un receptor HER2 unido a la superficie .

Trastuzumab se administra cada una semana, cada dos semanas o cada tres semanas mediante una aguja colocada en una vena (vía intravenosa). En estudios clínicos, infusiones intravenosas de corta duración de 10 a 500 mg una vez por semana demostraron una farmacocinética dependiente de la dosis. La vida media promedio aumentó y la depuración disminuyó con el aumento de la dosis. La vida media promedió 1.7 y 12 días con las dosis de 10 y 500 mg, respectivamente. El volumen de distribución de trastuzumab fue aproximadamente el del volumen del suero (44 mUkg). A la mayor dosis semanal estudiada (500 mg), el promedio de las concentraciones séricas máximas fue de 377 microgramos/mL. En estudios con una dosis de carga de 4 mg/kg seguida de una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg/kg, se observó un promedio de la vida media de 5.8 días (rango = 1 a 32 días). Entre las semanas 16 y 32, las concentraciones séricas de trastuzumab alcanzaron un estado estacionario con un promedio de las concentraciones mínimas y máximas de aproximadamente 79 microgramos/mL y 123 microgramos/mL, respectivamente.

Los datos sugieren que la absorción de trastuzumab no es alterada por la edad o la creatinina sérica (hasta 2.0 mg/dL). Los pacientes con mayores niveles iniciales de antígeno circulante fueron más propensos a tener concentraciones séricas mínimas más bajas. Sin embargo, con la administración semanal, la mayoría de los pacientes con niveles elevados de antígeno circulante alcanzaron las concentraciones séricas deseadas de Trastuzumab hacia la semana 6.

Cetuximab (Erbitux), un anticuerpo quimérico anti-receptor del EGF específico para EGFR, se puede indicar, por ejemplo, para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico y el cáncer de cabeza y cuello, o para el tratamiento del carcinoma colorrectal metastásico, que expresa EGFR en pacientes resistentes a la quimioterapia a base de irinotecán.

Se puede recomendar el pretratamiento con un antagonista H1 (por ejemplo, 50 mg de difenhidramina IV) en la terapia con cetuximab. La dosis recomendada de cetuximab, en combinación con radioterapia, es de 400 mg/m2 como una dosis de carga inicial (primera infusión) administrada como una infusión IV en 120 minutos (velocidad de infusión máxima de 5 mL/min) una semana antes de la iniciación de un ciclo de radioterapia. La dosis semanal de mantenimiento recomendada (todas las otras infusiones) es de 250 mg/m2 infundida durante 60 minutos (velocidad de infusión máxima de 5 mL/min) semanalmente mientras dure la radioterapia (6 a 7 semanas). En estudios clínicos, se administró cetuximab 1 hora antes de la radioterapia.

El régimen de dosificación recomendado para cetuximab como único agente en el tratamiento del carcinoma de células escamosas recurrente o metastásico de cabeza y cuello, es una dosis inicial de 400 mg/m2, (primera infusión) administrada como una infusión IV en 120 minutos (velocidad de infusión máxima de 5 mL/min). La dosis semanal de mantenimiento recomendada (todas las otras infusiones) es de 250 mg/m2 infundida durante 60 minutos (velocidad de infusión máxima de 5 mL/min).

B. Inhibidores de molécula pequeña de la vía del EGF.

También se han propuesto varios antineoplásicos de molécula pequeña dirigidos a la vía del EGF en el tratamiento contra el cáncer. Erlotinib (Tarceva®) y gefitinib (Iressa®) actúan específicamente sobre la actividad de tirosina quinasa de EGFR, que puede estar altamente expresado y ocasionalmente mutado en diversas formas de cáncer. Las moléculas de fármaco se unen de forma reversible al sitio de unión del trifosfato de adenosina (ATP) del receptor, bloqueando eficazmente la autofosforilación de los homodímeros de EGFR y bloqueando así la cascada de señalización hacia el núcleo. Ambos compuestos han demostrado ser beneficiosos con respecto a la supervivencia, en el tratamiento del cáncer de pulmón en ensayos clínicos de fase III y han sido aprobados para el tratamiento de cáncer de pulmón no microcítico localmente avanzado o metastásico.

Erlotinib es una quinazolinamina con el nombre químico N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)-4-quinazolinamina (Tarceva ®) y se suministra como la sal de clorhidrato con la siguiente fórmula estructural:

10 La solubilidad en agua del clorhidrato de erlotinib es dependiente del pH, con mayor solubilidad a un pH menor de 5 debido a la protonación de la amina secundaria. En el rango de pH de 1.4 a 9.6, se produce una solubilidad máxima de aproximadamente 0.4 mg/mL a un pH de aproximadamente 2. Los comprimidos de Tarceva® están disponibles en dosis de tres concentraciones y contienen clorhidrato de erlotinib (27.3 mg, 109.3 mg y 164 mg) equivalentes a 25 mg, 100 mg y 150 mg de erlotinib. Erlotinib se absorbe aproximadamente en un 60% tras la administración oral y su

15 biodisponibilidad es aumentada substancialmente por los alimentos hasta casi el 100%. Su vida media es de aproximadamente 36 horas y se elimina principalmente mediante el metabolismo por CYP3A4. Los niveles plasmáticos máximos se producen 4 horas después de la administración. Los alimentos aumentan sustancialmente la biodisponibilidad, hasta casi el 100%.

20 El fármaco está indicado para el cáncer pulmonar no microcítico, el cáncer pancreático avanzado y otros varios carcinomas, particularmente los caracterizados por la sobreexpresión de EGFR, como el cáncer colorrectal y los carcinomas de cabeza y cuello.

Gefitinib (Iressa ®) es otro de la clase de fármacos de molécula pequeña que inhiben la actividad de tirosina quinasa

25 del receptor del factor de crecimiento epidérmico. Al igual que erlotinib, el fármaco compite con la unión de ATP al dominio intracelular tirosina quinasa de EGFR, inhibiendo por lo tanto la autofosforilación del receptor y bloqueando la posterior transducción de la señal.

Gefitinib se administra normalmente en una dosis de 250 o 500 mg por vía oral una vez al día. El fármaco está

30 indicado como monoterapia para el tratamiento de pacientes con cáncer pulmonar no microcítico localmente avanzado o metastásico, después del fracaso de las quimioterapias a base de platino y docetaxel.

III. Tratamiento del cáncer con un inhibidor de la telomerasa

35 La telomerasa es una ribonucleoproteína que cataliza la adición de secuencias teloméricas repetidas (que tienen la secuencia 5'-TTAGGG-3' en los seres humanos) a los extremos del cromosoma. Véase por ejemplo Blackburn, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:113-129. La enzima se expresa en la mayoría de las células cancerosas pero no en células somáticas maduras. La pérdida de ADN telomérico puede desempeñar un papel en el desencadenamiento de senescencia celular; vease Harley, 1991, Mutation Research 256:271-282. Se ha demostrado que diversas

40 células cancerosas son telomerasa-positivas, inclusive las células de cáncer de piel, tejido conjuntivo, tejido adiposo, mama, pulmón, estómago, páncreas, ovario, cerviz, útero, riñón, vejiga, colon, próstata, sistema nervioso central (SNC), retina y tumores hematológicos (tales como mieloma, leucemia y linfoma). Apuntar a la telomerasa puede ser eficaz para proporcionar tratamientos que discriminen en un alto grado entre células malignas y normales, evitando muchos de los efectos secundarios nocivos que pueden acompañar los regímenes antineoplásicos que se dirigen

45 indiscriminadamente a células en división.

Los inhibidores de la telomerasa identificados hasta la fecha incluyen oligonucleótidos, preferentemente oligonucleótidos que tienen uniones resistentes a las nucleasas, así como compuestos de molécula pequeña.

50 A. Compuestos de molécula pequeña

Los inhibidores de la telomerasa de molécula pequeña incluyen, por ejemplo, BRACO19 ((9-(4-(N,Ndimetilamino)fenilamino)-3,6-bis(3-pirrolodinopropionamido)acridina (véase Mol. Pharmacol. 61(5):1154-62, 2002); DODC (dietiloxadicarbocianina) y telomestatina. Estos compuestos pueden actuar como estabilizadores de G-quad, 55 que promueven la formación de una configuración de G-quad inactiva en el componente ARN de la telomerasa. Otros inhibidores de la telomerasa de molécula pequeña incluyen BIBR1532 (ácido 2-[(E) -3-naften-2-il-but-2enoilamino]benzoico) (véase Ward & Autexier, Mol. Pharmacol. 68:779-786, 2005; also J. Biol. Chem.

277(18):15566-72, 2002); AZT y otros analogos de nucleosidos, como ddG y ara-G (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nº 5,695,932 y 6,368,789) y algunos derivados de tiopiridina, benzo[b]tiofeno y pirido[b]tiofeno, descritos por Gaeta et al. en las patentes de los Estados Unidos Nº 5,767,278, 5,770,613, 5,863,936, 5,656,638 y 5,760,062. Un ejemplo es 3-clorobenzo[b]tiofeno-2-carboxi-2'-[(2,5-diclorofenilamino)tia]hidrazina, descrita en la patente de los Estados Unidos Nº 5,760,062.

B. Inhibidores de la telomerasa basados en oligonucleótidos: secuencia y composición

Los genes que codifican la proteína y los componentes ARN de la telomerasa humana han sido clonados y secuenciados (véanse las patentes de los Estados Unidos Nº 6,261,836 y 5,583,016, respectivamente). Los oligonucleótidos se pueden dirigir contra el ARNm que codifica el componente proteico de la telomerasa (cuya forma humana se conoce como telomerasa transcriptasa inversa humana o hTERT) o el componente ARN de la holoenzima telomerasa (cuya forma humana se conoce como ARN de la telomerasa humana, o hTR).

La secuencia de nucleótidos del componente ARN de la telomerasa humana (hTR) se muestra en el listado de secuencias más adelante (SEC. ID Nº: 1), en la dirección 5' La secuencia se muestra usando las abreviaturas

33'.estandar para los ribonucleotidos; los expertos en el area reconoceran que la secuencia tambien representa la secuencia del ADNc, en la cual los ribonucleótidos son reemplazados por desoxirribonucleótidos, siendo uridina (U) reemplazada por timidina (T). La secuencia plantilla del componente ARN se encuentra dentro de la región definida por los nucleótidos 46 a 56 (5'-CUAACCCUAAC-3'), que es complementaria de una secuencia telomérica compuesta por aproximadamente una y dos tercios unidades teloméricas repetidas. La región plantilla actúa para especificar la secuencia de las repeticiones teloméricas que la telomerasa añade a los extremos del cromosoma y es esencial para la actividad de la enzima telomerasa (véase por ejemplo Chen et al., Cell 100: 503-514, 2000; Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (14):7982-7987, 2001). El diseño de los agentes antisentido, ribozima o ARN interferente pequeño (ARNip) para inhibir o provocar la destrucción de los ARNm es bien conocido (véase, por ejemplo, Lebedeva, I, et al. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, Vol. 41: 403-419, abril de 2001; Macejak, 0, et al., Journal of Virology, Vol. 73 (9): 7745-7751, septiembre de 1999, y Zeng, Y. et al., PNAS Vol. 100 (17) p. 97799784, 19 de agosto de 2003)) y dichso agentes se pueden diseñar para que se dirijan al ARNm de hTERT y así inhiban la producción de la proteína hTERT en una célula diana, como una célula cancerosa (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nº 6,444,650 y 6,331,399).

Los oligonucleótidos dirigidos al hTR (es decir, el componente ARN de la enzima) actúan como inhibidores de la actividad de la enzima telomerasa bloqueando o interfiriendo de otra forma con la interacción de hTR con la proteína hTERT, donde dicha interacción es necesaria para la función de la telomerasa. Véase, por ejemplo, Villeponteau et al., patente de los Estados Unidos Nº 6,548,298.

Una región diana preferida de hTR es la región plantilla, que abarca los nucleótidos 30 a 67 de SEC. ID Nº: 1. Los oligonucleótidos dirigidos a esta región se denominan en el presente documento como "inhibidores de la plantilla de hTR" (véase por ejemplo Herbert et al., Oncogene 21 (4): 638-42 (2002).) Preferentemente, dicho oligonucleótido incluye una secuencia que es complementaria o casi complementaria de cierta parte de la región de 11 nucleótidos que tiene la secuencia 5'-CUAACCCUAAC-3', que abarca los nucleótidos 46 a 56 de SEC. ID Nº: 12.

Otra región diana preferida es la región que abarca los nucleótidos 137 a 179 de hTR (véase Pruzan et al., Nucl. Acids Research, 30:559-568, 2002). Dentro de esta región, la secuencia que abarca de 141 a 153 es una diana preferida. La publicación PCT WO 98/28442 describe el uso de oligonucleótidos de al menos 7 nucleótidos de longitud para inhibir la telomerasa, donde los oligonucleótidos están diseñados para ser complementarios de las porciones accesibles de la secuencia de hTR fuera de la región plantilla, que incluyen los nucleótidos 137 a 196, 290 a 319 y 350 a 380 de hTR. Las secuencias diana de hTR preferidas se indican a continuación y se identifican mediante SEC. ID Nº: 2 a 22.

La región del oligonucleótido terapéutico que se dirige a la secuencia de hTR, es preferentemente exactamente complementaria de la secuencia de hTR correspondiente. Si bien se pueden tolerar no correspondencias en ciertos casos, se espera que disminuyan la especificidad y la actividad del conjugado del oligonucleótido resultante. En realizaciones particulares, la secuencia de base del oligonucleótido se selecciona de ese modo para que incluya una secuencia de al menos 5 nucleótidos exactamente complementaria de la secuencia diana de hTR, y se puede obtener una mayor inhibición de la telomerasa si se emplean longitudes cada vez más largas de la secuencia complementaria, como al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 13 o al menos 15 nucleótidos exactamente complementarios de la secuencia diana de hTR. En otras realizaciones, la secuencia del oligonucleótido incluye una secuencia de al menos 5 a 20, de al menos 8 a 20, de al menos 10 a 20 o de al menos 10 a 15 nucleótidos exactamente complementaria de la secuencia diana de hTR.

La actividad inhibitoria óptima de la telomerasa se puede obtener cuando toda la longitud del oligonucleótido se selecciona para que sea complementaria de la secuencia diana de hTR. Sin embargo, no es necesario que toda la longitud del oligonucleótido sea exactamente complementaria de la secuencia diana, y la secuencia del oligonucleótido puede incluir regiones que no sean complementarias de dicha secuencia diana. Dichas regiones se pueden añadir, por ejemplo, para conferir otras propiedades al compuesto, como secuencias que faciliten la purificación. Alternativamente, un oligonucleótido puede incluir múltiples repeticiones de una secuencia complementaria de una secuencia diana de hTR. Cuando el oligonucleótido va a incluir regiones que no son complementarias de la secuencia diana, dichas regiones se colocan normalmente en uno o ambos extremos 5' o 3'. Ejemplos de las secuencias dirigidas al ARN de la telomerasa humana (hTR) incluyen las siguientes:

Secuencia dirigida a hTR

Región de SEC. ID Nº: 1 SEC. ID. Nº:

ACATTTTTTGTTTGCTCTAG

160-179 2

GCTCTAGAATGAACGGTGGAAGGCGGCAGG

137-166 3

GTGGAGGCGGCAGG

137-151 4

GGAAGGCGGCAGG

137-149 5

GTGGAAGGCGGCA

139-151 6

GTGGAAGGCGG

141-151 7

CGGTGGAAGGCGG

141-153 8

ACGGTGGAAGGCG

142-154 9

AACGGTGGAAGGCGGC

143-155 10

ATGAACGGTGGAAGGCGG

144-158 11

TAGGGTTAGACAA

42-54 12

CAGTTAGGGTTAG

46-58 13

TAGGGTTAGACA

42-53 14

TAGGGTTAGAC

42-52 15

GTTAGGGTTAG

46-56 16

GTTAGGGTTAGAC

44-56 17

GTTAGGGTTAGACAA

42-56 18

GGGTTAGAC

44-52 19

CAGTTAGGG

50-58 20

CCCTTCTCAGTT

54-65 21

CGCCCTTCTCAG

56-67 22

Las uniones internucleosídicas en el oligonucleótido pueden incluir cualquiera de las uniones químicas de oligonucleótidos disponibles, por ejemplo fosfodiéster, fosfotriéster, metilfosfonato, fosforamidato P3'

3N5', 10 fosforamidato N3'3P5', tiofosforamidato N3'3P5' y fosforotioato . Por lo general, pero no necesariamente, todas las uniones internucleosídicas dentro del oligonucleótido serán del mismo tipo, aunque el oligonucleótido se puede sintetizar con una mezcla de uniones diferentes.

En realizaciones preferidas, el oligonucleótido tiene al menos una unión fosforamidato N3'(NP) o

3P5' 15 tiofosforamidato N3'3P5' (NPS), donde la union puede ser representada por la estructura: 3'-(-NH-P(=O)(-XR)-O-)5', en donde X es O o S y R se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo y arilo; y sus sales farmacéuticamente aceptables, cuando XR es OH o SH. Más preferentemente, el oligonucleótido incluye todas las uniones NP o, muy preferentemente, todas las uniones NPS.

20 Una secuencia particularmente preferida para un oligonucleótido inhibidor de la plantilla de hTR es la secuencia complementaria de los nucleótidos 42 a 54 de SEC. ID Nº: 12 anterior. El oligonucleótido que tiene esta secuencia (TAGGGTTAGACA) y uniones tiofosforamidato N33P5' (NPS) 'se designa en el presente documento como GRN163. Véase, por ejemplo, Asai et al., Cancer Research 63:3931-3939 (2003); Gryaznov et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 22(5-8):577-81 (2003).

25 Como se muestra en la tabla 1 a continuación, este oligonucleótido (primer fila de la tabla) inhibe la telomerasa a concentraciones bajas en un ensayo bioquímico (FlashPlate™, consulte la sección experimental). Una alternativa 13-mer, que tiene la secuencia CAGTTAGGGTTAG, complementaria de los nucleótidos 46 a 58 de SEC. ID Nº: 1 (quinta fila de la tabla), mostró actividad casi equivalente en el ensayo FlashPlate™. El oligonucleótido unido

30 mediante NP correspondiente, y oligonucleótidos más cortos (11-y 12-mer) dirigidos a la misma región (complementaria de los nucleótidos 42 a 53 y 42 a 42, respectivamente, de SEC. ID Nº: 1), demostraron una

actividad moderada. El efecto es claramente específico de la secuencia, como se muestra por las secuencias no correspondientes y no dirigidas de la tabla. El oligonucleótido GRN163 administrado solo ha mostrado actividad inhibitoria in vitro en cultivo celular, incluidas las células cancerosas de carcinoma epidermoide, epitelio mamario, carcinoma renal, adenocarcinoma renal,

5 pancreáticas, cerebro, colon, próstata, leucemia, linfoma, mieloma, epidérmicas, de cuello de útero, ováricas y del hígado.

El oligonucleótido GRN163 también se ha probado y demostró ser terapéuticamente eficaz en diversos modelos animales de tumores, incluidos de ovario y pulmón tanto microcítico como no microcítico. 10 Tabla 1. Inhibición de la telomerasa por oligonucleótidos NPS: análisis bioquímico (FlashPlate)

Secuencia, 5' a 3'

Descripción CI50, nM

TAGGGTTAGACAA SEC. ID Nº: 12

13-mer (GRN163) 0.045 ± 0.007

TAGGTGTAAGCAA (SEC. ID Nº: 23)

No correspondencia de la secuencia de GRN163 80 ± 31

TTGTCTAACCCTA (SEC. ID Nº: 24)

Complemento de la secuencia de GRN163 1000 ± 46

TAGGGTTAGACAA ATCCCAATCTGTT

Dúplex de la secuencia de GRN163 8.9 ± 3.0

CAGTTAGGGTTAG (SEC. ID Nº: 13)

Alternativa dirigida a 13-mer 0.049 ± 0.007

TAGGGTTAGACA (SEC. ID Nº: 14)

12-mer; truncamiento de la secuencia de GRN163 0.36 ± 0.2

TAGGGTTAGAC (SEC. ID Nº: 15)

11-mer; truncamiento de la secuencia de GRN163 0.85 ± 0.35

GTTAGGGTTAG (SEC. ID Nº: 16)

Alternativa dirigida a 11-mer 0.51 ± 0.13

GTTGAGTGTAG (SEC. ID Nº: 25)

No correspondencia de la alternativa dirigida a 11-mer 177 ± 93

TAGGGTTAGACAA (SEC. ID Nº: 12)

13-mer (secuencia de GRN163) con esqueleto NP 0.7 ± 0.1

TAGGTGTAAGCAA (SEC. ID Nº: 23)

No correspondencia de la secuencia de GRN163esqueleto NP con >1000

TTAGGG (SEC. ID Nº: 26)

Unidad telomérica repetida >1000

TTTTTTTTTT (SEC. ID Nº: 27)

Oligo-T 10-mer >1000

C. Conjugados lípido-oligonucleótido

15 Preferentemente, el inhibidor de la enzima basado en el oligonucleótido incluye al menos un grupo lipídico unido covalentemente (véase US Pubn. Nº 2005/0113325). Esta modificación proporciona propiedades de absorción celular superiores, de modo que se puede obtener un efecto biológico equivalente usando cantidades más pequeñas del oligonucleótido conjugado en comparación con la forma sin modificar. Cuando se aplica al entorno terapéutico humano, esto se puede traducir en la reducción de los riesgos de toxicidad y en ahorro de costos.

20 El grupo lipídico L es habitualmente un hidrocarburo alifático o un ácido graso, incluidos los derivados de hidrocarburos y ácidos grasos, siendo ejemplos los compuestos saturados de cadena lineal con 14 a 20 carbonos, como el ácido mirístico (tetradecanoico), ácido palmítico (hexadecanoico), ácido esteárico (octadecanoico) y sus correspondientes formas de hidrocarburo alifático, tetradecano, hexadecano y octadecano. Los ejemplos de otros

25 grupos lipídicos adecuados que se pueden emplear son esteroles, como el colesterol y ácidos grasos e hidrocarburos sustituidos, particularmente formas polifluoradas de estos grupos. El alcance del grupo lipídico L incluye derivados como amina, amida, éster y derivados de carbamato. El tipo de derivado es determinado a menudo por el modo de unión al oligonucleótido, como se ejemplifica a continuación.

30 En una estructura de ejemplo, la porción lipídica es palmitoilamida (derivada del ácido palmítico), conjugada a través de un grupo de unión aminoglicerol al grupo 5' tiofosfato de un oligonucleótido unido por NPS. El oligonucleótido NPS que tiene la secuencia que se muestra para GRN163 y conjugado de esta manera (como se muestra a continuación) se designa en este documento GRN163L. En una segunda estructura de ejemplo, el lípido, como una palmitoilamida, se conjuga a través del grupo amino terminal 3' de un oligonucleótido NPS.

Como se muestra en la tabla 2, la conjugación de un solo lípido tipo ácido graso aumentó significativamente la actividad inhibitoria de la telomerasa en sistemas celulares en relación con el oligonucleótido sin conjugar.

Tabla 2. Inhibición de la telomerasa por oligonucleótidos NPS (basados en GRN163) conjugados a lípidos

Sustitución lipídica

Tm (° C) del dúplex con ARN CI50 in vitro, células HT-3 , nM

Ninguna (GRN163)

70.0 1600

3'-palmítico (GRN163L)

66.5 160

3'-esteárico

67.1 140

3'-(bis)esteárico

�40 1960

3'-oleico

66.8 930

NH-C16 (palmitoil) en el 3er residuo 5' (G)

62.6 500

5'-palmítico

65.5 112

3'-palmítico-5'-palmítico

61.3 �10000

3'-tritilo

66.1 3000

El efecto de la conjugación a lípidos sobre la farmacocinética se ilustra mediante los datos que se muestran en la

5 tabla 3, a continuación, para una dosis de 4 mg/kg administrada a ratas. Las concentraciones en el órgano diana 6 horas después de la administración también fueron más favorables para GRN163L, con aprox. 4-5 μM encontrada en el hígado, riñón y tejido graso, 2-3 μM en la médula ósea y el bazo y aproximadamente 0.5 μM en los ganglios linfáticos. La distribución del oligonucleótido sin conjugar a un lípido, GRN163, fue principalmente en el riñón (aproximadamente 18 μM), con sólo 1 μM o menos en los tejidos de los órganos restantes mencionados antes.

10 La tabla 4 presenta datos adicionales dirigidos a la inhibición de la telomerasa in vitro por GRN163 (no conjugado) y GRN163L (conjugado a lípido) en varias líneas celulares de cáncer.

Tabla 3. Farmacocinética comparativa de oligonucleótido NPS conjugado a lípido (GRN163L) y sin conjugar a lípido 15 (GRN163) (rata, dosis de 4 mg/kg)

GRN163

GRN163L

T1/2a, min

17 20

T1/2�, h

65-86 68-72

AUC0-r, μg-h/g

27 120

CMAX, μg/ml

16 58

% excretado en 24 h

45 13

Tabla 4. Comparación de la actividad inhibitoria de la telomerasa por el oligonucleótido NPS conjugado a lípido (GRN163L) y sin conjugar a lípido (GRN163) in vitro

Línea celular

CI50 (μM) de GRN163 CI50 (μM) de GRN163L

HT-3 (Cuello de útero)

1.62 0.3

U251 (Glioblastoma)

1.75 0.17

U87 (Glioblastoma)

0.75 0.11

Línea celular

CI50 (μM) de GRN163 CI50 (μM) de GRN163L

Hep3B (Hepatoma)

6.5 0.36

HepG2 (Hepatoma)

2.72 0.48

NCI-H522 (Pulmón)

2.59 0.23

RPMI 8226 (Mieloma)

2.67 0.38

Ovcar5 (Ovario)

3.74 0.92

DU 145 (Próstata)

1.4 0.15

El oligonucleótido conjugado GRN163L tuvo una actividad inhibitoria de la telomerasa significativamente mayor in vivo que GRN163 no conjugado, como se demuestra en los xenoinjertos de células de hepatoma (Fig. 1) y xenoinjertos en flanco de tumores de mieloma CAG (Fig. 2) tras la administración i.v.

5 La administración de GRN163L inhibió el crecimiento tumoral en ratones (modelo de metástasis pulmonar A549 luc IV) durante al menos 4 semanas después de la inyección i.v. de las células cancerosas. La dosis fue 1 μM quincenalmente durante 5 semanas antes de la inyección de las células cancerosas, seguida de 5 mg/kg dos veces por semana después de la inyección. Los controles mostraron un crecimiento sustancial del tumor, pero ninguno fue

10 evidente en el ratón tratado con GRN163L.

IV. Terapia de combinación con inhibidores de la vía del EGF y de la telomerasa

Se descubrió que la exposición combinada de las células cancerosas tanto a un inhibidor de la vía del EGF como a

15 un inhibidor de la telomerasa aumenta el grado de inhibición de la proliferación de células carcinomatosas en relación con el inhibidor de la vía del EGF solo o el inhibidor de la telomerasa solo. El efecto se observa tanto para la inhibición in vitro de la proliferación de células carcinomatosas, donde la inhibición se evidencia mediante una menor velocidad de proliferación celular, como para el tratamiento in vivo del cáncer en un sujeto mamífero, donde la inhibición se evidencia por una menor velocidad de crecimiento del tumor y/o un aumento del tiempo de

20 supervivencia del sujeto que se está tratando.

Terapia combinada in vivo

Al poner en práctica el método para el tratamiento in vivo, el sujeto se debe tratar por un carcinoma, como cáncer de

25 mama, que incluye carcinomas ductales y lobulares de mama; cancer de ovario; carcinoma de celulas basales, carcinoma de células escamosas, cáncer pulmonar no microcítico, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células renales o carcinoma de células transicionales, un tipo de cáncer que se desarrolla en el revestimiento de la vejiga, el uréter o la pelvis renal.

30 Al seleccionar el inhibidor de la vía del EGF para el tratamiento, las células carcinomatosas o el suero del sujeto se pueden analizar para determinar la expresión o sobreexpresión de un receptor del EGF, como EGFR o HER2, según métodos conocidos y como se hace referencia antes. El anticuerpo anti-HER2 trastuzumab se puede indicar, por ejemplo, en un paciente que tiene cáncer de mama o de ovario y niveles elevados de HER2 asociados a las células carcinomatosas. Del mismo modo, el anticuerpo anti-EGFR se puede indicar en cáncer pulmonar no microcítico o

35 carcinomas de cabeza y donde se detecte la sobreexpresión de EGFR. Más generalmente, el carcinoma debe ser uno caracterizado por la expresión y en algunos casos, la sobreexpresión de un receptor del EGF.

El carcinoma también debe ser uno que sea sensible a la inhibición de las células cancerosas por inhibición de la telomerasa. Como se señaló anteriormente, los oligonucleótidos inhibidores de la telomerasa, ejemplificados por

40 GRN163 y GRN163L, han demostrado actividad inhibitoria in vitro contra células de cáncer humano de riñón, pulmón, páncreas, cerebro, colon, próstata, mama, leucemia, linfoma, mieloma, epidérmico, cuello de útero, ovario e hígado, e in vivo, a través de la administración local y sistémica, contra células de cáncer humano de cerebro, próstata, linfoma, mieloma, cuello de útero, pulmón e hígado. Otras dianas preferidas incluyen cáncer pulmonar microcítico, esofágico, de cabeza y cuello y de estómago.

45 En un método de tratamiento de ejemplo, se administra al sujeto el inhibidor de la vía del EGF, por ejemplo, un anticuerpo anti-receptor del EGF, en una cantidad que es eficaz para inhibir la proliferación de las células carcinomatosas en el sujeto. La dosis administrada y el programa de administración seguirá, por ejemplo, dosis conocidas o recomendadas para el inhibidor empleado, como se indica, por ejemplo, en el prospecto del fármaco o

50 los datos clínicos o del modelo animal publicados. Una de las ventajas de la presente invención es que se pueden administrar dosis más bajas de lo normal del inhibidor de la vía del EGF, si fuera necesario, debido al efecto de potenciación compensatorio del inhibidor de la telomerasa. Dicho protocolo permite una dosis reducida del inhibidor de la vía del EGF, que puede tener efectos tóxicos importantes en dosis más altas.

55 Por lo tanto, un juego que contenga una dosis del inhibidor de la telomerasa podría contener un prospecto que tenga un conjunto de instrucciones para usar el inhibidor en monoterapia y otro conjunto de instrucciones para usar el inhibidor en una terapia de combinación con un inhibidor de la vía del EGF, como trastuzumab, cetuximab, erlotinib y gefitinib. El conjunto de instrucciones para la terapia de combinación podría recomendar (i) una dosis menor del inhibidor de la telomerasa, cuando se usa en combinación con el inhibidor de la vía del EGF, (ii) una dosis menor del inhibidor de la vía del EGF, cuando se usa en combinación con el inhibidor de la telomerasa, o (iii) un régimen de dosificación diferente para uno o ambos inhibidores que el que se recomendaría normalmente.

El inhibidor de la telomerasa se puede administrar, antes, durante o después de la administración del inhibidor de la vía del EGF. Por lo general, los dos inhibidores se administran en un régimen de doificación común, como se describe a continuación, y los dos inhibidores en sí mismos se pueden administrar en una composición farmacéutica combinada, o por separado, por ejemplo, por administración enteral del inhibidor de la vía del EGF y administración parenteral del inhibidor de la telomerasa. Sin embargo, también se considera un régimen de dosificación en el cual el inhibidor de la telomerasa se administra antes o después de administrar el inhibidor de la vía del EGF. Por ejemplo, una persona en tratamiento con un inhibidor del proteasoma de la vía del EGF se puede pasar posteriormente a una terapia combinada que incluya el inhibidor de la telomerasa.

Alternativamente, se puede administrar al paciente inicialmente el inhibidor de la vía del EGF, seguido uno a varios días más tarde del tratamiento de la telomerasa. En este régimen, el inhibidor de la vía del EGF puede actuar, en parte, sensibilizando a las células cancerosas a la inhibición mediante inhibición de la telomerasa, por ejemplo, sincronizando el ciclo de división celular y/o promoviendo la apoptosis en las células. Los niveles de dosis y los programas de administración preferidos se consideran en más detalle más adelante.

En un método de ejemplo, el inhibidor de la vía del EGF es el anticuerpo anti-HER2 trastuzumab, que se administra en combinación con un oligonucleótido inhibidor de la telomerasa dirigido contra hTR. La fig. 3, por ejemplo, muestra los resultados del método de tratamiento en el cual se administra trastuzumab en combinación con el inhibidor de la telomerasa GRN163L, para el tratamiento del carcinoma pulmonar no microcítico en un modelo de xenoinjerto en ratón que involucra células A549 de carcinoma pulmonar no microcítico. Los detalles de este estudio se describen en la sección experimental D más adelante. Como se ve en la fig. 3, el tratamiento con los dos inhibidores, durante un período de 21 días de tratamiento (GRN163 se administró 3 veces por semana durante el período de tratamiento y trastuzumab, en los tiempos indicados por las flechas) limitó el crecimiento del tumor en mayor medida que cualquier inhibidor solo. Por ejemplo, en el día 21 del tratamiento, el trastuzumab solo produjo una reducción del 38% del tumor y GRN163L, una reducción de 21% del tumor, mientras que la terapia combinada produjo una reducción de 53% en el crecimiento del tumor.

B. Administración

El protocolo terapéutico para administrar los dos inhibidores en la terapia de combinación dependerá de varios factores que incluyen, pero no exclusivamente, el tipo de cáncer, la edad y salud general del paciente, la agresividad del progreso de la enfermedad, la longitud del TRF (longitud del fragmento de restriccion terminal; consulte la sección V más adelante) y la actividad de la telomerasa de las células enfermas a tratar, y la capacidad del paciente para tolerar los agentes que componen la combinación.

En general, está contemplado el tratamiento de todos los carcinomas y tipos de neoplasias hematológicas. En realizaciones elegidas, la enfermedad diana constituye un tumor solido; en otras realizaciones, la enfermedad diana constituye una neoplasia hematológica. Un ciclo de tratamiento de ejemplo consiste en dosis múltiples. La secuencia de tratamientos de combinación se determinará por criterios de acatamiento clínico y/o datos preclínicos o clínicos que respalden estrategias de optimización de dosis para aumentar la eficacia o reducir la toxicidad del tratamiento de combinación. En general, se pueden emplear diversas combinaciones del inhibidor de la telomerasa y el inhibidor de la vía del EGF, ya sea simultáneamente o secuencialmente. Para dosis múltiples, los dos agentes se pueden alternar directamente, o se pueden alternar, por ejemplo, dos o más dosis de un agente con una sola dosis del otro agente. La administración simultánea de ambos agentes también se puede alternar o entremezclar de otra manera con las dosis de los agentes individuales. El tiempo entre dosis puede ser un período entre aproximadamente 1 a 6 horas, y aproximadamente 6 a 12 horas, aproximadamente 12 a 24 horas, aproximadamente 1 a 2 días, aproximadamente 1 a 2 semanas o más, después de la iniciación del tratamiento. Durante el transcurso del tratamiento, se puede reevaluar la necesidad de completar las dosificaciones previstas.

Los compuestos se pueden administrar por inyección directa en un tumor o su vasculatura. Alternativamente, el tumor puede ser infundido o perfundido con los compuestos terapéuticos utilizando cualquier vehículo de administración adecuado. Los compuestos se pueden administrar localmente a un órgano afectado. También se puede realizar la administración sistémica. Se puede aplicar administracion continua cuando corresponda; por ejemplo, cuando un tumor es extirpado y se trata el lecho del tumor para eliminar la enfermedad residual. Se prefiere la administración a través de una jeringa o la cateterización . Dicha perfusión continua puede tener lugar durante un período entre aproximadamente 1 a 6 horas, y aproximadamente 6 a 12 horas, aproximadamente 12 a 24 horas, aproximadamente 1 a 2 días, aproximadamente 1 a 2 semanas o más, después de la iniciación del tratamiento. Generalmente, la dosis de la composición terapéutica a través de la perfusión continua será equivalente a la administrada por una única o varias inyecciones, ajustadas durante el período en el que se produce la perfusión.

Los agentes terapéuticos se administran a un sujeto, como un paciente humano, en una formulación y una cantidad eficaces para lograr un resultado clínico deseable. Para el tratamiento del cáncer, los resultados deseables incluyen la reducción en la masa del tumor (determinada por palpacion o imagenologia; por ejemplo, radiografia, analisis de radionúclidos, TAC o IRM), reducción en la velocidad de crecimiento del tumor, reducción en la velocidad de formación de metástasis (determinada por ejemplo, mediante el análisis histoquímico de muestras de biopsia), reducción en los marcadores bioquímicos (incluidos los marcadores generales como ESR y marcadores específicos del tumor como PSA sérico), y mejora en la calidad de vida (determinada por evaluación clínica, por ejemplo, puntuación de Karnofsky), aumento del tiempo hasta el empeoramiento, del tiempo de supervivencia sin enfermedad y de supervivencia total.

La cantidad de cada agente por dosis y el número de dosis necesarias para lograr estos efectos variarán dependiendo de muchos factores, entre otros, la indicación de la enfermedad, las características del paciente que se está tratando y el modo de administración. Por lo general, la formulación y la vía de administración proporcionarán una concentración local en el sitio de la enfermedad entre 1 nM y 100 μM de cada agente, y cuando el inhibidor de la vía del EGF es un anticuerpo anti-receptor del EGF, una concentración sérica entre 25 y 500 microgramos/ml. El médico podrá variar la cantidad de los compuestos, el vehículo, la frecuencia de dosificación y similares, teniendo en cuenta factores tales como el estado de la enfermedad neoplasica particular y su gravedad; el estado general del paciente; la edad, el genero y el peso del paciente; el modo de administracion; la conveniencia de administrar simultáneamente agentes anti-toxicidad sistemicos; el control de la funcion de organos vitales del paciente; y otros factores típicamente monitoreados durante la quimioterapia antineoplásica. En general, los compuestos se administran en una concentración que produce resultados eficaces sin causar excesivos efectos secundarios nocivos o perjudiciales.

La cantidad del inhibidor anti-vía del EGF utilizado en combinación con un inhibidor de la telomerasa puede ser menor que la que sería necesaria para el agente utilizado en el tratamiento no combinado .

C. Formulaciones

Los vehículos farmacéuticos empleados pueden ser sólidos o líquidos. Los vehículos líquidos se pueden utilizar en la preparación de soluciones, emulsiones, suspensiones y composiciones presurizadas. Los compuestos se disuelven o suspenden en un excipiente líquido farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de vehículos líquidos adecuados para la administración parenteral incluyen agua (que puede contener aditivos, por ejemplo, derivados de celulosa, preferentemente solución de carboximetilcelulosa sódica), solución salina amortiguada con fosfato (PBS), alcoholes (incluidos alcoholes monohídricos y alcoholes polihídricos, por ejemplo, glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo, aceite de coco fraccionado y aceite de maní). El vehículo líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados, incluidos, pero no exclusivamente, los siguientes: solubilizantes, suspendentes, emulsionantes, amortiguadores, espesantes, colorantes, reguladores de la viscosidad, conservadores, estabilizantes y reguladores de la osmolaridad.

Para la administración parenteral, el vehículo también puede ser un éster oleoso como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los vehículos estériles son útiles en composiciones estériles en forma líquida para administración parenteral. Se pueden utilizar composiciones farmacéuticas líquidas, soluciones o suspensiones, estériles, por ejemplo, por inyección intraperitoneal, subcutánea, intravenosa o por vía tópica. Las composiciones también se pueden administrar por vía intravascular o a través de un stent vascular.

El vehículo líquido para composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propelente farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones presurizadas también pueden ser lípidos encapsulados para administrar por inhalación. Para la administración por inhalación intranasal o intrabronquial o insuflación, las composiciones se pueden formular en una solución acuosa o parcialmente acuosa, que luego se puede utilizar en forma de aerosol.

Las composiciones se pueden administrar por vía tópica como una solución, crema o loción, mediante formulación con vehículos farmacéuticamente aceptables que contengan el principio activo. Las composiciones de esta invención se pueden administrar por vía oral en cualquier forma farmacéutica aceptable, incluidas, pero no exclusivamente, formulaciones en cápsulas, comprimidos, polvos o gránulos, y como suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos. Las composiciones y/o formulaciones farmacéuticas que contienen los oligonucleótidos de la presente invención pueden incluir vehículos, lubricantes, diluyentes, espesantes, saborizantes, emulsionantes, auxiliares de dispersión o aglutinantes. En el caso de comprimidos para uso oral, los excipientes que se utilizan comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se agregan habitualmente lubricantes como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsulas, los diluyente útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el principio activo se combina con emulsionantes y suspendentes. Si se desea, también se pueden agregar ciertos edulcorantes, saborizantes o colorantes.

Los modos de administración y formulación pueden ser dependientes del fármaco y su modo aprobado de administración. Por ejemplo, cuando el antineoplásico es un anticuerpo anti-EGF, está indicada la infusión IV, mientras que la administración oral se puede indicar para un inhibidor de la vía del EGF de molécula pequeña. Cuando el inhibidor de la telomerasa es GRN163L, formulación en cloruro de sodio al 0.9% (solución salina normal), la administración i.v. es una vía preferente, preferentemente por infusión durante 4 a 8 horas, por ejemplo una infusión de 6 horas. Si bien los oligonucleótidos conjugados a lípidos descritos en este documento, como GRN163L, tienen características superiores con respecto a la penetración celular y tisular, se pueden formular estos y otros compuestos para proporcionar mayor beneficio en esta área, por ejemplo en liposomas como vehículos. El uso de liposomas para facilitar la absorción celular se describe, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nº 4,897,355 y 4,394,448, y numerosas publicaciones describen la formulación y preparación de liposomas. Las formulaciones liposómicas se pueden preparar también por genotecnología, mediante la unión de ligandos de focalización a la superficie liposómica, para dirigirlos a sitios de neovascularización, como regiones angiogénicas del tumor. Los compuestos también se pueden formular con potenciadores de la penetración o el transporte adicionales, tales como formas no conjugadas de las porciones lipídicas descritas, incluidos los ácidos grasos y sus derivados. Los ejemplos incluyen ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, recinoleato, monooleína (también conocida como 1-monooleoirac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2ona, acilcarnitinas, acilcolinas, mono -y diglicéridos y sus sales fisiológicamente aceptables (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.). Otros adyuvantes útiles incluyen sustratos para la migración transendotelial, como los sistemas de captación de glucosa para egresos facilitados desde el espacio vascular al microambiente tumoral.

V. Medición de la longitud telomérica, la actividad de la telomerasa y/o la proliferación celular

Cuando se emplea un régimen terapéutico que implica la administración de un inhibidor de la telomerasa, puede ser útil determinar la longitud telomérica y/o la actividad de la telomerasa en una muestra de células o tejido. Estos parámetros se pueden medir por ensayos conocidos en el área. La longitud telomérica se puede medir mediante un método de citometría de flujo usando hibridación fluorescente in situ, conocido como flujo FISH (véase por ejemplo

M. Hultdin et al., Nucleic Acids Res. 26(16):3651-6, 1998; N. Rufer et al., Nature Biotechnology 16:743-7, 1998). Otros métodos incluyen análisis (TRF) del fragmento de restricción terminal, en el cual el ADN genómico es digerido con una enzima de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento de cuatro bases que no está presente en las secuencias teloméricas repetidas y los fragmentos de restricción se separan por tamaño, por ejemplo por electroforesis en gel. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos Nº 5,489,508 (West et al.) y Harley et al., Nature 345:458, 1990. La patente de West et al. también describe métodos de medición de la longitud telomérica por un método de "cebador terminal anclado" y por una reacción modificada de Maxam-Gilbert.

Además, se puede predecir una respuesta más rápida a un inhibidor de la telomerasa para células tumorales con ADN telomérico más corto, aunque la telomerasa ha demostrado tener otros efectos inhibitorios independientes de la longitud telomerica. (p. ej. Stewart et al., PNAS 99:12606, 2002; Zhu et al., PNAS 93:6091, 1996; Rubaiyat et al., Oncogene 24(8):1320, 2005); y Folini et al., Curr. Pharm. 0esign 11(9):1105, 2005).

El ensayo TRAP (véase la parte experimental, más adelante) es un método estándar para medir la actividad de la telomerasa en un extracto celular (Kim et al., Science 266:2011, 1997; Weinrich et al., Nature Genetics 17:498, 1997). En resumen, este ensayo mide la cantidad de nucleótidos incorporados en productos de elongación (polinucleótidos) formados mediante adición de nucleótidos a un sustrato de la telomerasa marcado o cebador. El ensayo TRAP se describe detalladamente en las patentes de los Estados Unidos Nº 5,629,154, 5,837,453 y 5,863,726, y su uso para probar la actividad de compuestos inhibidores de la telomerasa se describe en diversas publicaciones, inclusive WO 01/18015. Además, los juegos siguientes están disponibles comercialmente con fines de investigación para medir la actividad de la telomerasa: TRAPeze™ XK Telomerase Detection Kit (Intergen Co., Purchase N.Y.); y TeloTAGGG Telomerase PCR EL1SA plus (Roche 0iagnostics, 1ndianapolis 1nd.).

La actividad anticancerígena de las combinaciones terapéuticas se puede evaluar mediante ensayos estándar in vitro e in vivo. La capacidad de una composición para inhibir específicamente la proliferación de células tumorales se puede probar utilizando líneas celulares tumorales in vitro, o en modelos animales de xenoinjerto in vivo. Un protocolo preferido para dichos ensayos de curva de crecimiento es el ensayo de viabilidad de las células a corto plazo descrito en Asai et al., (2003, citado antes). En modelos de xenoinjerto establecido de tumores humanos, el compuesto de prueba se administra directamente en el sitio del tumor o sistémicamente, y el crecimiento del tumor se sigue por medición física. Un ejemplo preferido de un ensayo adecuado de xenoinjerto de tumor in vivo también se describe en Asai et al., (2003, citado antes). Otros ejemplos se describen en Scorski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 3966-3971 (1997) y Damm et al., EMBO J., 20:6958-6968 (2001).

Parte experimental

A. Preparación y conjugación con lípidos de3P5' N3'tiofosforamidatos

oligonucleótidos fosforamidatos o N3'3P5'

Estos compuestos se pueden preparar del modo indicado, como se describe por ejemplo, en McCurdy et al., Tetrahedron Letters 38:207-210 (1997) o Pongracz & Gryaznov, Tetrahedron Letters 49:7661-7664 (1999). Los

monómeros de nucleósidos 3'-amino de partida ( o que empiezan 3'-amino) se pueden preparar como se describe en Nelson et al., J. Org. Chem. 62:7278-7287 (1997) o por los métodos descritos en Gryaznov et al., US Appn. Pubn. No. 2006/0009636. Se pueden usar diversos métodos de síntesis para conjugar una porción lipídica L al oligonucleótido, dependiendo

5 de la naturaleza de la union seleccionada; vease, por ejemplo, Mishra et al., Biochim. et Biophys. Acta 1264:229-237 (1995), Shea et al., Nucleic Acids Res. 18:3777-3783 (1995), o Rump et al., Bioconj. Chem. 9:341-349 (1995). Por lo general, la conjugación se logra mediante el uso de grupos funcionales adecuados en un extremo del oligonucleótido. Por ejemplo, el grupo 3'-amino presente en el extremo 3' de los oligonucleótidos NP y NPS se puede hacer reaccionar con ácidos carboxílicos, cloruros de ácido, anhídridos y ésteres activos, utilizando catalizadores de

10 acoplamiento adecuados, para formar un enlace amida. Los grupos tiol también son adecuados como grupos funcionales (véase Kupihar et al., Bioorg. Med. Chem. 9:1241-1247 (2001)). Se dispone comercialmente de diversos modificadores con funciones amino y tiol de diferentes longitudes de cadena, para la síntesis de oligonucleótidos.

Los métodos específicos para unir grupos lipídicos al extremo de un oligonucleótido NP o NPS incluyen los descritos

15 en US Appn. Pubn. No. 2005/0113325. Además de las uniones amida mencionadas antes, por ejemplo, los lípidos también se pueden unir a la cadena del oligonucleótido usando un derivado fosforamidita del lípido, para producir una unión fosforamidato o tiofosforamidato que conecte el lípido y el oligonucleótido. El grupo 3'-amino libre del oligonucleótido totalmente protegido unido al soporte, también se puede hacer reaccionar con un aldehído lipídico adecuado, seguido de la reducción con cianoborohidruro de sodio, que produce una unión amina.

20 Para la unión de un lípido al extremo 5', como también se describió en US Appn. Pubn. No. 2005/0113325, el oligonucleótido se puede sintetizar usando un soporte sólido que contenga un lípido, modificado . La reacción de 3amino-1,2-propanodiol con un cloruro de acilo graso (RC(O)Cl), seguida de la dimetoxitritilación del alcohol primario y la succinilación del alcohol secundario, proporciona un intermediario que luego se acopla, a través del grupo

25 succinil carboxilo libre, al soporte sólido. Se muestra un ejemplo de un soporte modificado a continuación, donde S representa un soporte alquil amina CPG de cadena larga y R representa un lípido.

30 Este procedimiento es seguido de la síntesis del oligonucleótido en dirección 5' a 3', como se describe, por ejemplo, en Pongracz & Gryaznov (1999), comenzando con la desprotección y la fosfitilación del grupo -ODMT. Esto es eficaz para producir, por ejemplo, la estructura siguiente, después de la escisión del soporte sólido:

35 La estructura anterior, cuando -R es -(CH2)13CH3 (palmitoílo), se designa en el presente documento como GRN163L.

B. Ensayo FlashPlateTM

40 Este ensayo se llevó a cabo esencialmente como se describe en Asai et al., Cancer Research, 63:3931 3939 (2003). En resumen, el ensayo detecta y/o mide la actividad de la telomerasa midiendo la adición de repeticiones teloméricas TTAGGG a un cebador sustrato de la telomerasa biotinilado. Los productos biotinilados se capturan en placas de microtitulación recubiertas de estreptavidina y se utiliza una sonda de oligonucleótido complementaria de

3.5 repeticiones teloméricas, marcada con 33P, para medir los productos de la telomerasa. La sonda sin unir se

45 elimina mediante lavado, y la cantidad de apareamiento de la sonda con los productos de la telomerasa capturados se determina mediante recuento de centelleo.

C. Ensayo TRAP

50 La capacidad de un compuesto para incrementar o inhibir la actividad de la telomerasa en una célula se puede determinar usando el ensayo TRAP (Protocolo de amplificación de repeticiones teloméricas), que se describe, por ejemplo, en Kim et al., patente de los Estados Unidos N° 5,629,154; Harley et al., patente de los Estados Unidos N° 5,891,639; y Harley et al., PCT Pubn. No. WO 2005/000245. En resumen, las líneas celulares tumorales que expresan la telomerasa se incuban con composiciones de prueba, se lisan y se tratan con un oligonucleótido marcado sustrato de la telomerasa, cebadores adecuados y patrón interno para cuantificación. Dependiendo de la actividad de la telomerasa del medio, las repeticiones teloméricas se añadirán al sustrato para formar los productos

5 extendidos por la telomerasa. La mezcla se incuba a temperatura ambiente, seguida de múltiples ciclos de PCR. La mezcla se separa en un gel, y se detecta y cuantifica el producto de extensión marcado mediante comparación con el estándar interno.

D. Ensayo antitumoral in vivo empleando GRN163L en combinación con trastuzumab.

10 Se implantaron subcutáneamente células A549 de carcinoma no microcítico (aprox. 107; longitud del TRF -4.98 Kb) en ratones atímicos, un día después de la irradiación. El tratamiento se inicio cuando los tumores alcanzaron -100 mm3. Se tratron grupos de doce ratones cada uno de acuerdo con uno de tres protocolos: (1) GRN163L solo, tres veces por semana 15 mg/kg durante cuatro semanas, administrado 1P; (2) Herceptin solo, 2.0 mg/kg por raton

15 durante tres semanas (4 dosis), administrado 1V; y (3) estos tratamientos combinados (vease Fig. 3). Los días en que se administró Herceptin se indican con flechas en la figura 3. Un cuarto grupo recibió sólo solución amortiguadora salina como control. Los resultados se discuten antes.

Aunque la invención se ha descrito con respecto a las realizaciones y aplicaciones particulares, los expertos en el 20 área apreciarán la gama de aplicaciones y de métodos de la invención dados a conocer en este documento.

Listado de secuencias

SEC. ID Nº: 1: el componente ARN de la telomerasa humana (hTR): 25

SEC. ID Nº: 2 a 27, secuencias de nucleótidos de los agentes dirigidos contra SEC. ID Nº: 1

ACATTTTTTGTTTGCTCTAG

2

GCTCTAGAATGAACGGTGGAAGGCGGCAGG

3

GTGGAGGCGGCAGG

4

GGAAGGCGGCAGG

5

GTGGAAGGCGGCA

6

GTGGAAGGCGG

7

CGGTGGAAGGCGG

8

ACGGTGGAAGGCG

9

AACGGTGGAAGGCGGC

10

ATGAACGGTGGAAGGCGG

11

TAGGGTTAGACAA

12

CAGTTAGGGTTAG

13

TAGGGTTAGACA

14

TAGGGTTAGAC

15

GTTAGGGTTAG

16

GTTAGGGTTAGAC

17

GTTAGGGTTAGACAA

18

GGGTTAGAC

19

CAGTTAGGG

20

CCCTTCTCAGTT

21

CGCCCTTCTCAG

22

TAGGTGTAAGCAA

23

TTGTCTAACCCTA

24

GTTGAGTGTAG

25

TTAGGG

26

TTTTTTTTTT

27

Listado de secuencias

<110> Geron Corporation et al. Tressler, Robert J. Go, Ning 5

<120> TRATAMIENTO DE CARCINOMAS CON UNA COMBINACIÓN DE INHIBIDORES DE LA VÍA DEL EGF Y DE LA TELOMERASA

<130> 387978020W00 10

<140> A asignar

<141> Incluido

<150> US 60/905,944 15 <151> 2007-03-09

<160> 27

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0 20

<210> 1

<211> 554

<212> ARN

<213> Homo sapiens 25

<400> 1 <220>

30

<210> 2 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

35

<220> <223> Oligonucleótido <400> 2 acattttttg tttgctctag 20

40

<210> 3 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

19

<223> Oligonucleótido

<400> 3 gctctagaat gaacggtgga aggcggcagg

<210> 4

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 4 gtggaggcgg cagg 14

<210> 5

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 5 ggaaggcggc agg 13

<210> 6

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 6 gtggaaggcg gca 13

<210> 7

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 7 gtggaaggcg g 11

<210> 8

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 8 cggtggaagg cgg 13

<210> 9

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 9 acggtggaag gcg 13

<210> 10

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 10 aacggtggaa ggcggc 16

<210> 11

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 11 atgaacggtg gaaggcgg 18

<210> 12

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 12 tagggttaga caa 13

<210> 13

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 13 cagttagggt tag 13

<210> 14

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 14 tagggttaga ca 12

<210> 15

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleótido

<400> 15 tagggttaga c 11

<210> 16

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 16 gttagggtta g 11

<210> 17

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 17 gttagggtta gac 13

<210> 18

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 18 gttagggtta gacaa 15

<210> 19

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 19 gggttagac 9

<210> 20

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 20 cagttaggg 9

<210> 21

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleótido

<400> 21 cccttctcag tt 12

<210> 22

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 22 cgcccttctc ag 12

<210> 23

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 23 13 taggtgtaag caa 13

<210> 24

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 24 13 ttgtctaacc cta 13

<210> 25

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 25 gttgagtgta g 11

<210> 26

<211> 6

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 26 ttaggg 6

<210> 27

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleótido

<400> 27 tttttttttt 10

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. El uso de un inhibidor de la telomerasa en la fabricación de un medicamento para tratar un carcinoma en un sujeto que está siendo tratado secuencialmente o simultáneamente con un anticuerpo anti-HER2, donde el inhibidor de la telomerasa es un oligonucleótido que se caracteriza por:

   (i)

   uniones internucleosídicas tiofosforoamidato N3'3P5';

   (ii)

   tener la secuencia identificada como SEC. 10 N°: 12; y

   (iii) un grupo palmitoílo (C16) unido al extremo 5' del oligonucleótido a través de un grupo de unión glicerol o aminoglicerol.

2. 2.

   El uso de la reivindicación 1, donde el oligonucleótido tiene 13 a 20 bases de longitud.

3. 3.

   El uso de la reivindicación 1, donde el inhibidor de la telomerasa es el compuesto designado en este documento como GRN163L.

4. 4.

   El uso de un anticuerpo anti-HER2 y de un inhibidor de la telomerasa en la fabricación de un medicamento para tratar un carcinoma en un sujeto, donde el inhibidor de la telomerasa es un oligonucleótido que se caracteriza por:

   (i)

   uniones internucleosídicas tiofosforoamidato N3'3P5';

   (ii)

   tener la secuencia identificada como SEC. 10 N°: 12; y

   (iii) un grupo palmitoílo (C16) unido al extremo 5' del oligonucleótido a través de un grupo de unión glicerol o aminoglicerol.

5. 5.

   El uso de la reivindicación 4, donde el inhibidor de la telomerasa es el compuesto designado en este documento como GRN163L.

6. 6.

   Un inhibidor de la telomerasa para usar en el tratamiento de un carcinoma en un sujeto que está siendo tratado con un anticuerpo anti-HER2, donde el inhibidor de la telomerasa es un oligonucleótido que se caracteriza por:

   (i)

   uniones internucleosídicas tiofosforoamidato N3'3P5';

   (ii)

   tener la secuencia identificada como SEC. 10 N°: 12; y

   (iii) un grupo palmitoílo (C16) unido al extremo 5' del oligonucleótido a través de un grupo de unión glicerol o aminoglicerol.

7. 7.

   El uso de la reivindicación 6, donde el anticuerpo anti-HER2 y el inhibidor de la telomerasa están en una cantidad eficaz, cuando cada compuesto se administra solo, para inhibir la proliferación de células cancerosas en el sujeto.

8. 8.

   El uso de la reivindicación 6, donde el inhibidor de la telomerasa es el compuesto GRN163L, y el inhibidor de la telomerasa se administra al sujeto por vía intravenosa, en condiciones de infusión eficaces para producir una concentración sanguínea del inhibidor de la telomerasa entre 1 nM y 100 !M.

9. 9.

   Un anticuerpo anti-HER2 para usar en el tratamiento de un carcinoma en un sujeto que está siendo tratado con un inhibidor de la telomerasa como se define en la reivindicación 1.

10. 10.

    Un juego de elementos que comprende

    (a)

    un anticuerpo anti-HER2, y

    (b)

    un inhibidor de la telomerasa, donde el inhibidor de la telomerasa es un oligonucleótido que se caracteriza por:

    (i)

    uniones internucleosídicas tiofosforoamidato N3'3P5';

    (ii)

    tener la secuencia identificada como SEC. 10 N°: 12; y

    (iii) un grupo palmitoílo (C16) unido al extremo 5' del oligonucleótido a través de un grupo de unión glicerol o aminoglicerol

    en forma de una preparación combinada para inhibir la proliferación de las células carcinomatosas, donde las células se exponen a (b) ya sea antes, después o concomitante con la exposición de las células a (a).

11. 11.

    El juego de elementos de la reivindicación 10, para usar en el tratamiento de un sujeto que tiene un carcinoma, en el cual el anticuerpo anti-HER2 está en una cantidad eficaz, cuando el anticuerpo se administra solo, para inhibir la proliferación de células cancerosas en el sujeto.

12. 12.

    El juego de elementos de la reivindicación 11, donde cada uno de (a) y (b) está en una cantidad eficaz, cuando cada uno de ellos se administra solo, para inhibir la proliferación de células cancerosas en el sujeto.

13. 13.

    El juego de elementos de la reivindicación 11, donde el inhibidor de la telomerasa es el compuesto GRN163L, y el inhibidor de la telomerasa se administra al sujeto por vía intravenosa, en condiciones de infusión eficaces para producir una concentración sanguínea del inhibidor de la telomerasa entre 1 nM y 100 !M.

    5 14. Un juego para usar en el tratamiento de un carcinoma en un sujeto, que comprende

    (a) una dosis de un anticuerpo anti-HER2, en una cantidad del anticuerpo eficaz, cuando se administra solo, para inhibir la proliferación de células carcinomatosas en el sujeto, y

    (b)

    una dosis de un oligonucleótido inhibidor de la telomerasa que se caracteriza por: 10

    (i)

    uniones internucleosídicas tiofosforoamidato N3'3P5';

    (ii)

    tener la secuencia identificada como SEC. 10 N°: 12; y

    (iii) un grupo palmitoílo (C16) unido al extremo 5' del oligonucleótido a través de un grupo de unión glicerol o

    aminoglicerol. 15
14. 15. El juego de la reivindicación 14, donde el inhibidor de la telomerasa es el compuesto designado en este documento como GRN163L.