ES2402036A1 - Haptens, conjugates and antibodies for the fungicide cyprodinil - Google Patents
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Abstract
Description
La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para ciprodinil. Así mismo, la presente invención 5 también se refiere al uso de conjugados de ciprodinil como antígenos de ensayo o inmunógenos para obtener anticuerpos de este fungicida; y al uso de los derivados marcados de ciprodinil como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a un método de análisis de ciprodinil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de The present invention relates to haptens, conjugates, labeled derivatives and antibodies to cyprodinyl. Likewise, the present invention also relates to the use of cyprodinyl conjugates as test antigens or immunogens to obtain antibodies of this fungicide; and to the use of ciprodinyl labeled derivatives as test antigens. In addition, the present invention also relates to a method of analysis of ciprodinil using the antibodies obtained, sometimes together with antigens of
10 ensayo que son conjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar ciprodinil que comprende anticuerpos de este fungicida, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. 10 assays that are conjugated or labeled derivatives. This invention also provides a kit for analyzing cyprodinyl comprising antibodies to this fungicide, sometimes together with test antigens that are conjugated or labeled derivatives.
15 Los fungicidas son el grupo de plaguicidas que con mayor frecuencia aparece en los programas de vigilancia y control. Esto es así no sólo por su elevado uso, sino principalmente porque estos productos de protección vegetal se emplean para combatir las infecciones causadas por hongos en momentos muy próximos a la cosecha o incluso con posterioridad (fungicidas 15 Fungicides are the group of pesticides that most frequently appear in surveillance and control programs. This is so not only because of its high use, but mainly because these plant protection products are used to fight fungal infections at times close to harvest or even later (fungicides
20 postcosecha). Este hecho incrementa considerablemente la probabilidad de que residuos de dichos tratamientos permanezcan cuando el alimento llegue al consumidor, lo que obliga a los organismos de regulación y control a estar más vigilantes e idealmente a aumentar los controles. Los ataques por hongos en frutos almacenados constituyen uno de los motivos principales de pérdidas 20 postharvest). This fact considerably increases the likelihood that residues from such treatments will remain when the food reaches the consumer, forcing regulatory and control bodies to be more vigilant and ideally to increase controls. Fungal attacks on stored fruits are one of the main reasons for losses
25 económicas en agricultura. El uso intensivo de fungicidas convencionales, como el tiabendazol o el imazalil, ha llevado en los últimos años a la aparición de cepas resistentes y por tanto a una menor eficacia de los tratamientos con estos productos. Ante esta circunstancia, las empresas agroquímicas pusieron en marcha programas de 1+0 encaminados a desarrollar nuevos productos que 25 economic in agriculture. The intensive use of conventional fungicides, such as thiabendazole or imazalil, has led in recent years to the emergence of resistant strains and therefore to a less effective treatment with these products. Given this circumstance, agrochemical companies launched 1 + 0 programs aimed at developing new products that
- presentaran mecanismos de acción innovadores y que permitieran combatir de present innovative mechanisms of action that allow the fight against
- forma eficaz las infecciones fúngicas, al tiempo que fueran seguros y effective fungal infections, while being safe and
- compatibles con los programas de gestión integrada de plagas. Estos compatible with integrated pest management programs. These
- productos están comenzando a sustituir progresivamente a los productos más products are beginning to gradually replace more products
- 5 5
- antiguos, que resultan menos aceptables desde un punto de vista toxicológico y old, which are less acceptable from a toxicological point of view and
- medioambiental. environmental.
- Entre los fungicidas más relevantes desarrollados en la última década Among the most relevant fungicides developed in the last decade
- destaca el ciprodinil [4-ciclopropil-6-metii-N-fenilpirimidin-2-amina]. Este highlights ciprodinil [4-cyclopropyl-6-metii-N-phenylpyrimidin-2-amine]. This
- plaguicida pertenece a la familia de las anilinopirimidinas cuyo modo pesticide belongs to the family of anilinopyrimidines whose mode
- 1 O 1 o
- bioquímico de acción es común y diferente al del resto de fungicidas. El Biochemical action is common and different from other fungicides. He
- ciprodinil, desarrollado por NovartisCropProtection (actualmente Syngenta AG), ciprodinil, developed by NovartisCropProtection (currently Syngenta AG),
- se incluyó en el Anexo 1 de la UE en 2006 y actualmente se comercializa bajo It was included in EU Annex 1 in 2006 and is currently marketed under
- los nombres Unix y Vangard. Pero sin duda su aplicación agronómica de mayor the names Unix and Vangard. But surely its agronomic application of greater
- impacto deriva de su comercialización bajo la denominación Switch, en la que impact derives from its commercialization under the name Switch, in which
- 15 fifteen
- se formula conjuntamente con fludioxonil, otro fungicida pero con un modo de it is formulated together with fludioxonil, another fungicide but with a way of
- acción diferente. Entre los cultivos para los que la UE ha establecido límites different action. Among the crops for which the EU has set limits
- máximos de residuos de forma explícita para ciprodinil se encuentran el trigo maximum residues explicitly for ciprodinil are wheat
- (0.5 ppm), frutas de pepita (1 ppm), frutas de hueso (0.5-2.0 ppm), uva (5 ppm), (0.5 ppm), pome fruits (1 ppm), stone fruits (0.5-2.0 ppm), grapes (5 ppm),
- fresas (5 ppm), solanáceas (0.5-1.0 ppm), cucurbitáceas (0.5 ppm), apionabos Strawberries (5 ppm), Solanaceae (0.5-1.0 ppm), Cucurbitaceae (0.5 ppm), Celeriac
- 20 twenty
- (0.3 ppm) y espinacas (8 ppm), además de una gran variedad de hortalizas de (0.3 ppm) and spinach (8 ppm), in addition to a wide variety of vegetables
- hoja ancha (1 O ppm). broad blade (1 O ppm).
- Las metodologías analíticas empleadas para el análisis de estos fungicidas The analytical methodologies used for the analysis of these fungicides
- son fundamentalmente de tipo instrumental, en especial cromatografía de they are fundamentally instrumental, especially chromatography of
- gases (GC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), acopladas a gases (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC), coupled to
- 25 25
- diferentes detectores según el tipo de compuesto a analizar y la sensibilidad different detectors according to the type of compound to be analyzed and the sensitivity
- requerida. Estas técnicas se caracterizan por su capacidad para analizar required These techniques are characterized by their ability to analyze
- simultáneamente varios residuos con una elevada precisión y exactitud. Sin simultaneously several residues with high precision and accuracy. Without
- embargo, pese a que resultan imprescindibles en muchas circunstancias, con However, although they are essential in many circumstances, with
- frecuencia implican la utilización de metodologías laboriosas y de elevado often involve the use of laborious and high methodologies
- 30 30
- coste, que deben realizarse por personal altamente cualificado en laboratorios cost, which must be carried out by highly qualified personnel in laboratories
- centralizados bien equipados y habitualmente alejados de las zonas de centralized well equipped and usually away from the areas of
- producción. Estas limitaciones condicionan la idoneidad de estas técnicas para production. These limitations condition the suitability of these techniques for
- acometer el análisis de grandes números de muestras y para obtener undertake the analysis of large numbers of samples and to obtain
- resultados en breve plazo, dos aspectos que contribuirían a garantizar la short-term results, two aspects that would contribute to guarantee the
- 5 5
- seguridad de los alimentos comercializados y a la realización de estudios más safety of food marketed and to conduct more studies
- exhaustivos sobre la exposición de los consumidores a estos fungicidas a exhaustive on the exposure of consumers to these fungicides to
- través de los alimentos. through food
- Los inmunoensayos son técnicas bioanalíticas basadas en la interacción de Immunoassays are bioanalytical techniques based on the interaction of
- un antígeno (el analito) con un anticuerpo que lo reconoce específicamente. No an antigen (the analyte) with an antibody that specifically recognizes it. Do not
- 1 O 1 o
- obstante, un plaguicida es una molécula orgánica pequeña que constituye un However, a pesticide is a small organic molecule that constitutes a
- único sitio de unión al anticuerpo, por lo que en este tipo de técnicas analíticas single antibody binding site, so in this type of analytical techniques
- la interacción entre el analito y el anticuerpo se realiza por desplazamiento de the interaction between the analyte and the antibody is performed by displacement of
- la unión entre el anticuerpo y un análogo marcado del analito. De este modo, the binding between the antibody and a labeled analyte analog. In this way,
- en presencia del analito se establece una competencia entre éste y el análogo in the presence of the analyte a competition is established between it and the analogue
- 15 fifteen
- marcado por la unión al anticuerpo. Habitualmente, el marcaje se realiza con labeled by antibody binding. Usually, the marking is done with
- una actividad enzimática, dando así lugar a los enzimoinmunoensayos. Cuando an enzymatic activity, thus giving rise to enzyme immunoassays. When
- además uno de los participantes en la reacción se encuentra inmovilizado in addition one of the participants in the reaction is immobilized
- sobre un soporte sólido, la técnica se denomina ELISA (del inglés Enzymeon a solid support, the technique is called ELISA (Enzyme)
- Linked lmmunosorbent Assay). Los primeros inmunoensayos enzimáticos para Linked lmmunosorbent Assay). The first enzyme immunoassays for
- 20 twenty
- plaguicidas se desarrollaron durante la primera mitad de los años 80. Desde Pesticides developed during the first half of the 80s. Since
- entonces hasta la actualidad el número de plaguicidas para los cuales se han so until today the number of pesticides for which they have been
- desarrollado inmunoensayos ha aumentado espectacularmente, suponiendo developed immunoassays have increased dramatically, assuming
- varias decenas y cubriendo los principales grupos de compuestos: insecticidas, several tens and covering the main groups of compounds: insecticides,
- herbicidas y fungicidas. De hecho, un gran número de estos ensayos están herbicides and fungicides. In fact, a large number of these trials are
- 25 25
- disponibles comercialmente en forma de kits con diferentes formatos. La commercially available in the form of kits with different formats. The
- creciente aceptación de los inmunoensayos como técnicas complementarias a increasing acceptance of immunoassays as complementary techniques to
- las cromatográficas para el análisis de pequeñas moléculas orgánicas se debe Chromatographs for the analysis of small organic molecules must be
- a que se trata de una metodología sencilla, rápida y de bajo coste, exhibiendo which is a simple, fast and low cost methodology, displaying
- al mismo tiempo una elevada sensibilidad y especificidad. Los inmunoensayos at the same time a high sensitivity and specificity. Immunoassays
- 30 30
- permiten detectar específicamente el analito diana en mezclas muy complejas, allow to specifically detect the target analyte in very complex mixtures,
- simplificando considerablemente los laboriosos procedimientos de preparación considerably simplifying the laborious preparation procedures
de la muestra, lo que a su vez redunda en un aumento en la capacidad de muestreo. Además, los inmunoensayos pueden realizarse en formatos portátiles, lo que los independiza de los laboratorios centralizados y los convierte en idóneos para el análisis en los puntos de producción. Las excelencias analíticas atribuidas a los inmunoensayos ya han sido demostradas en muchas aplicaciones prácticas, donde han competido favorablemente con las técnicas cromatográficas [M.C. Hennion, Ana/ysis 1998, 26, 149-155; A. Abad et al., J. Chromatogr. A1999, 833, 3-12; A. Abad et al., J. Agríe. Food Chem.2001, 49, 1707-1712; N.A. Lee y I.R. Kennedy, J. AOAC lnt. 2001, 84, 1393-1406; F.A. Esteve-Turrillas et al., Anal. Chim. Acta 2010, 682, 93-103]. of the sample, which in turn results in an increase in sampling capacity. In addition, immunoassays can be performed in portable formats, which makes them independent of centralized laboratories and makes them ideal for analysis at production points. The analytical excellencies attributed to immunoassays have already been demonstrated in many practical applications, where they have favorably competed with chromatographic techniques [M.C. Hennion, Ana / ysis 1998, 26, 149-155; A. Abad et al., J. Chromatogr. A1999, 833, 3-12; A. Abad et al., J. Agríe. Food Chem. 2001, 49, 1707-1712; N.A. Lee and I.R. Kennedy, J. AOAC lnt. 2001, 84, 1393-1406; FA. Esteve-Turrillas et al., Anal. Chim. Minutes 2010, 682, 93-103].
Sin embargo, hasta la fecha no se ha descrito la utilización de la tecnología de inmunoensayo para analizar el contenido del fungicida ciprodinil en una muestra. However, to date the use of immunoassay technology to analyze the content of the fungicide ciprodinil in a sample has not been described.
Por lo tanto, existe una necesidad, en particular en la industria alimentaria y/o agrícola, de desarrollar un método analítico que permita la determinación o detección mediante la tecnología de inmunoensayo de ciprodinil, fungicida ampliamente utilizado en la actualidad, preferentemente mediante la utilización de un kit que comprenda al menos un anticuerpo de ciprodinil. Therefore, there is a need, in particular in the food and / or agricultural industry, to develop an analytical method that allows the determination or detection by means of the immunoassay technology of ciprodinil, fungicide widely used today, preferably through the use of a kit comprising at least one cyprodinyl antibody.
La presente invención proporciona haptenos de ciprodinil, compuestos de fórmula (1), que presentan una funcionalización adecuada, en diferentes posiciones de la molécula, para la obtención de conjugados de ciprodinil o derivados marcados de ciprodinil. The present invention provides ciprodinyl haptens, compounds of formula (1), which have adequate functionalization, in different positions of the molecule, for obtaining ciprodinyl conjugates or labeled ciprodinyl derivatives.
Los conjugados de ciprodinil, compuestos de fórmula (11), pueden actuar como inmunógenos para la obtención de anticuerpos para ciprodinil o como antígenos de ensayo útiles para detectar este fungicida mediante inmunoensayos competitivos. Los conjugados de ciprodinil funcionalizados en diferentes posiciones presentan características diferentes, así los inventores The ciprodinyl conjugates, compounds of formula (11), can act as immunogens for obtaining antibodies to ciprodinil or as useful test antigens to detect this fungicide by competitive immunoassays. Ciprodinil conjugates functionalized in different positions have different characteristics, thus the inventors
- han encontrado que no todas las posiciones ciprodinil son adecuadas para propiedades inmunogénicas. la obtención They have found that not all cyprodinyl positions are suitable for immunogenic properties. obtaining
- reactivas de la de conjugados molécula de con buenas conjugate reagents molecule with good
- 5 5
- La presente invención también proporciona derivados marcados de ciprodinil, compuestos de fórmula (111), útiles como antígenos de ensayo en inmunoensayos competitivos. The present invention also provides labeled derivatives of cyprodinyl, compounds of formula (111), useful as test antigens in competitive immunoassays.
- 1 O 1 o
- La presente invención también se refiere a anticuerpos con elevada afinidad y selectividad hacia ciprodinil, así como a un método de análisis de ciprodinil utilizando dichos anticuerpos, en ocasiones junto a conjugados o derivados marcados como antígenos de ensayo. The present invention also relates to antibodies with high affinity and selectivity towards ciprodinil, as well as to a method of analysis of ciprodinil using said antibodies, sometimes together with conjugates or derivatives labeled as test antigens.
- Finalmente, la presente invención también proporciona un kit para analizar ciprodinil que comprende anticuerpos de este fungicida, opcionalmente, junto a conjugados o derivados marcados como antígenos de ensayo. Finally, the present invention also provides a kit for analyzing cyprodinyl comprising antibodies of this fungicide, optionally, together with conjugates or derivatives labeled as test antigens.
- 15 fifteen
- Un primer aspecto de la presente invención describe fórmula (1): T-L-Y un compuesto de A first aspect of the present invention describes formula (1): T-L-Y a compound
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- caracterizado porque (1) T se selecciona del grupo que consiste en R-1, R-11, R-111, R-IV y R-V; characterized in that (1) T is selected from the group consisting of R-1, R-11, R-111, R-IV and R-V;
25 H 25 h
R-111R-111
1
one
donde R-1 se selecciona del grupo que consiste en [2-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2 il)amino)fenilo], [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4 ciclopropil-6-metilpirimidin-2-i l)am ino )fen ilo]; R-11 es [4-ciclopropil-6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; R-111 se selecciona del grupo que consiste en [2-((4-ciclopropilpirimidin-2 il)amino)fenilo], [3-((4-ciclopropilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4 ciclopropilpirimidin-2-il)amino )fenilo ]; R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-ciclopropil-2 (fenilamino)pirimidin-4-ilo] y [4-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; y R-V es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre Oy 1O heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N; Y es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en: -COOH, -NH2, -N3, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CHO, -SH, -S03H, -OS02Ph, -NH-NH2, -OS02Ar y -C:=:CH; con la condición de que: a) cuando T es [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo], el fragmento-L-Y es diferente de -SCH2CHNH2COOH; b) cuando T es [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo] y L es -cH2-, Y es diferente a -NH2; y e) cuando T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino], L es una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono, lineal o ramificada, saturada o insaturada, con la condición de que dicha cadena hidrocarbonada no comprende ningún heteroátomo. where R-1 is selected from the group consisting of [2 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2 il) amino) phenyl], [3 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4 - ((4 cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) am ino) phenyl]; R-11 is [4-cyclopropyl-6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl]; R-111 is selected from the group consisting of [2 - ((4-cyclopropylpyrimidin-2 il) amino) phenyl], [3 - ((4-cyclopropylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4 - ((4 cyclopropylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl]; R-IV is selected from the group consisting of [6-cyclopropyl-2 (phenylamino) pyrimidin-4-yl] and [4-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl]; Y R-V is [(4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino]; L is a hydrocarbon chain of 1 to 40 carbon atoms, where the chain is linear or branched, saturated or unsaturated, and said chain hydrocarbon comprises between O and 1O heteroatoms that are selected from the group consisting of S, O and N; And it is a functional group selected from the group consisting of: -COOH, -NH2, -N3, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CHO, -SH, -S03H, -OS02Ph, -NH-NH2, -OS02Ar and -C: =: CH; with the condition of: a) when T is [3 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl], the L-Y-fragment is different from -SCH2CHNH2COOH; b) when T is [6-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl] and L is -cH2-, Y is different from -NH2; Y e) when T is [(4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino], L is a chain hydrocarbon of 1 to 40 carbon atoms, linear or branched, saturated or unsaturated, with the proviso that said hydrocarbon chain does not It comprises no heteroatom.
En la presente solicitud de patente se entiende por arilo (-Ar) un grupo carbocíclico aromático con un único anillo, por ejemplo fenilo, múltiples anillos, por ejemplo bifenilo, o múltiples anillos condensados donde al menos uno de ellos es aromático, por ejemplo 1 ,2,3,4-tetrahidronaftilo, 1-naftilo, 2-naftilo. El grupo arilo puede estar sustituido o no. Preferentemente, el grupo arilo es 4metilfenilo. In the present patent application, aryl (-Ar) is understood as an aromatic carbocyclic group with a single ring, for example phenyl, multiple rings, for example biphenyl, or multiple condensed rings where at least one of them is aromatic, for example 1 , 2,3,4-tetrahydronaphthyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl. The aryl group may be substituted or not. Preferably, the aryl group is 4-methylphenyl.
Según una realización preferida, el compuesto de fórmula (1) se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono. Preferentemente, dicha cadena hidrocarbonada lineal comprende entre 2 y 8 átomos de carbono. According to a preferred embodiment, the compound of formula (1) is characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms. Preferably, said linear hydrocarbon chain comprises between 2 and 8 carbon atoms.
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (1) de la presente invención se caracteriza porque Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (1) objeto de la presente invención se caracteriza porque Y es -COOH. According to another additional preferred embodiment, the compound of formula (1) of the present invention is characterized in that Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH2 and -SH. Preferably, the compound of formula (1) object of the present invention is characterized in that Y is -COOH.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (1) tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es [3-((4ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino )fenilo] o [4-( 4-ciclopropil-6-metilpirimidin2-il)amino)fenilo]; Les una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; e Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (1) de la presente invención se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono. According to another preferred embodiment, the compound of formula (1) as described in this patent application is characterized in that T is [3 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4- ( 4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin2-yl) amino) phenyl]; Les a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms; and Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH2 and -SH. Preferably, the compound of formula (1) of the present invention is characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms.
Según una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (1) de esta invención se selecciona del grupo que consiste en According to an even more preferred embodiment, the compound of formula (1) of this invention is selected from the group consisting of
H yN'r(Y(CH2)5C02H H yN'r (Y (CH2) 5C02H
y Y
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de formula (1) tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es [6ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; Les una cadena hidrocarbonada lineal
According to another additional preferred embodiment, the compound of formula (1) as described in this patent application is characterized in that T is [6-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl]; Les a linear hydrocarbon chain
de 1 a 20 átomos de carbono; e Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (1) de la presente invención se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono. from 1 to 20 carbon atoms; and Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH2 and -SH. Preferably, the compound of formula (1) of the present invention is characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms.
Según una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (1) de esta invención es According to an even more preferred embodiment, the compound of formula (1) of this invention is
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de formula (1) tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es [(4According to another additional preferred embodiment, the compound of formula (1) as described in this patent application is characterized in that T is [(4
10 ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; e Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (1) de la presente invención se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono. Cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino]; L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms; and Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH2 and -SH. Preferably, the compound of formula (1) of the present invention is characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms.
15 Según una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (1) de esta invención es According to an even more preferred embodiment, the compound of formula (1) of this invention is
Un segundo aspecto de la presente invención describe un compuesto de fórmula (11):
A second aspect of the present invention describes a compound of formula (11):
(11) (eleven)
caracterizado porque T se selecciona del grupo que consiste en R-1, R-11, R-111, R-IV y R-V; H H characterized in that T is selected from the group consisting of R-1, R-11, R-111, R-IV and R-V; H H
N V~ \ hN V N V ~ \ hN V
R-1 R-11 R-1 R-11
H H H H
1 l N N~1 l N N ~
N V~ ~-4 hr e N V ~ ~ -4 hr e
R-111 R-IV R-111 R-IV
donde R-1 se selecciona del grupo que consiste en [2-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2 il)amino)fenilo], [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4 ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino )fenilo]; R-11 es [4-ciclopropil-6-metil-2-(fenilamino )pirimidin-5-ilo ]; R-111 se selecciona del grupo que consiste en [2-((4-ciclopropilpirimidin-2 il)amino)fenilo], [3-((4-ciclopropilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4 ciclopropilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-ciclopropil-2 (fenilamino )pirimidin-4-ilo] y [4-ciclopropil-2-(fenilamino )pirimidin-5-ilo ]; y R-V es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 1O heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N; where R-1 is selected from the group consisting of [2 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2 il) amino) phenyl], [3 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4 - ((4 cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl]; R-11 is [4-cyclopropyl-6-methyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl]; R-111 is selected from the group consisting of [2 - ((4-cyclopropylpyrimidin-2 il) amino) phenyl], [3 - ((4-cyclopropylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] and [4 - ((4 cyclopropylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl]; R-IV is selected from the group consisting of [6-cyclopropyl-2 (phenylamino) pyrimidin-4-yl] and [4-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-5-yl]; Y R-V is [(4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino]; L is a hydrocarbon chain of 1 to 40 carbon atoms, where the chain is linear or branched, saturated or unsaturated, and said chain hydrocarbon comprises between O and 1O heteroatoms that are selected from the group consisting of S, O and N;
Z es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -S-, -S-S-, -NH(C=NH)-, -OCO-, -CO-, -CHOH-, -N=N-, -NH-, -NR-, Z is a functional group selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -S-, -S-S-, -NH (C = NH) -, -OCO-, -CO-, -CHOH-, -N = N-, -NH-, -NR-,
- /s0o ~No / s0o ~ No
- y Y
- 5 1 O 15 5 1 or 15
- P es un polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor de 2000 daltons; y n es un número con un valor entre 1 y 500; con la condición de que: a) cuando Tes [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo], el fragmento -L-Zes diferente de -SCH2CHNH2COO-, -SCH2CHNH2-CO-NHo -SCH2CH(COOH)NHCO-; b) cuando T es [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo] y L es -CH2-, Z es diferente a -NHCO-; y e) cuando Tes [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino], Les una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono, lineal o ramificada, saturada o insaturada, con la condición de que dicha cadena hidrocarbonada no comprende ningún heteroátomo. P is a natural or synthetic polypeptide of molecular weight greater than 2000 daltons; and n is a number with a value between 1 and 500; with the proviso that: a) when Tes [3 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl], the -L-Z fragment other than -SCH2CHNH2COO-, -SCH2CHNH2-CO-NHo -SCH2CH (COOH) NHCO-; b) when T is [6-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl] and L is -CH2-, Z is different from -NHCO-; and e) when Tes [(4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino], Les a hydrocarbon chain of 1 to 40 carbon atoms, linear or branched, saturated or unsaturated, with the proviso that said hydrocarbon chain does not comprise any heteroatom.
- 20 twenty
- El valor den indica el grado de conjugación, es decir la relación molar entre la fracción derivada del compuesto de fórmula (1) y P, el polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor de 2000 daltons en el compuesto de fórmula (11) resultante. The den value indicates the degree of conjugation, that is, the molar ratio between the fraction derived from the compound of formula (1) and P, the natural or synthetic polypeptide of molecular weight greater than 2000 daltons in the resulting compound of formula (11).
- El compuesto de fórmula (11) de la presente invención puede utilizarse como inmunógeno para la producción de anticuerpos o como antígeno de ensayo, junto con un anticuerpo de ciprodinil, para determinar o detectar este fungicida en una muestra mediante la tecnología de inmunoensayo competitivo. The compound of formula (11) of the present invention can be used as an immunogen for the production of antibodies or as a test antigen, together with a cyprodinyl antibody, to determine or detect this fungicide in a sample by competitive immunoassay technology.
- 25 25
- Según una realización preferida, el compuesto de fórmula (11) se caracteriza porque Les una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono. Preferentemente, dicha cadena hidrocarbonada lineal comprende entre 2 y 8 átomos de carbono. According to a preferred embodiment, the compound of formula (11) is characterized in that Les has a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms. Preferably, said linear hydrocarbon chain comprises between 2 and 8 carbon atoms.
- Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (11) de la According to another additional preferred embodiment, the compound of formula (11) of the
- presente invención se caracteriza porque Z se selecciona del grupo que The present invention is characterized in that Z is selected from the group that
- consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S/ 50o '--iN-consists of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S / 50o '--iN-
- O OR
- 5 5
- Preferentemente, el compuesto de fórmula (11) objeto de la presente Preferably, the compound of formula (11) object of the present
- invención se caracteriza porque Z es -CONH-. Invention is characterized in that Z is -CONH-.
- Según otra realización preferida de la presente invención, el compuesto de According to another preferred embodiment of the present invention, the compound of
- fórmula (11) descrito en esta solicitud de patente se caracteriza porque P se Formula (11) described in this patent application is characterized in that P is
- selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, {3select from the group consisting of albumin, thyroglobulin, hemocyanin, {3
- 1O 1O
- galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. Preferentemente, cuando P es galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase. Preferably, when P is
- albúmina, es albúmina de huevo o albúmina sérica. albumin, is egg albumin or serum albumin.
- Según otra realización preferida, el compuesto de formula (11) de la presente According to another preferred embodiment, the compound of formula (11) of the present
- invención se caracteriza porque invention is characterized because
- T es [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-(4-ciclopropil-6T is [3 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4- (4-cyclopropyl-6
- 15 fifteen
- metilpirimidin-2-il)amino )fenilo ]; methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl];
- L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms;
- Z se selecciona del grupo que consiste en-CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, Z is selected from the group consisting of-CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
- O N/syJlt;_ y N1' 'N/'--iNr ;y O N / syJlt; _ and N1 '' N / '- iNr; and
- 20 twenty
- o or
- P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin,
- hemocianina, {3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. hemocyanin, {3-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase.
- Según una realización aún más preferida, el compuesto de formula (11) de la According to an even more preferred embodiment, the compound of formula (11) of the
- presente invención se caracteriza porque Tes [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidinThe present invention is characterized in that Tes [3 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin)
- 25 25
- 2-il)amino)fenilo] o [4-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; L es una 2-yl) amino) phenyl] or [4 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl]; L is a
- cadena hidrocarbonada lineal de 5 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se linear hydrocarbon chain of 5 carbon atoms; Z is -CONH-; P se
- selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor select from the group consisting of albumin and peroxidase; and n is a value
- seleccionado entre 1 y 50. selected between 1 and 50.
- 5 5
- Según otra realización preferida, el compuesto de formula (11) de la presente invención se caracteriza porque Tes [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, /s~o ~N;y According to another preferred embodiment, the compound of formula (11) of the present invention is characterized in that Tes [6-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl]; L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms; Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, / s ~ or ~ N; and
- 1O 1O
- O P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, hemocianina, ,8-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. tiroglobulina, O P is selected from the group consisting of albumin, hemocyanin, 8-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase. thyroglobulin,
- 15 fifteen
- Según una realización aún más preferida, el compuesto de formula (11) de la presente invención se caracteriza porque T es [6-ciclopropil-2(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; Les una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. According to an even more preferred embodiment, the compound of formula (11) of the present invention is characterized in that T is [6-cyclopropyl-2 (phenylamino) pyrimidin-4-yl]; Les a linear hydrocarbon chain of 4 carbon atoms; Z is -CONH-; P is selected from the group consisting of albumin and peroxidase; and n is a value selected between 1 and 50.
- 20 twenty
- Según otra realización preferida, el compuesto de formula (11) de la presente invención se caracteriza porque Tes [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; Les una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, According to another preferred embodiment, the compound of formula (11) of the present invention is characterized in that Tes [(4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino]; Les a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms; Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
- /s~o ~N/ s ~ o ~ N
- y ;y Y ;Y
- O OR
- 25 25
- P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, hemocianina, ,8-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. tiroglobulina, P is selected from the group consisting of albumin, hemocyanin, 8-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase. thyroglobulin,
- Según una realización aún más preferida, el compuesto de formula (11) de la presente invención se caracteriza porque T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de According to an even more preferred embodiment, the compound of formula (11) of the present invention is characterized in that T is [(4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino]; L is a linear hydrocarbon chain of 4 atoms of
- carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. carbon; Z is -CONH-; P is selected from the group consisting of albumin and peroxidase; and n is a value selected between 1 and 50.
- 5 5
- Un tercer fórmula (111): aspecto de la presente invención [T-L-Z]m-Q (111) describe un compuesto de A third formula (111): aspect of the present invention [T-L-Z] m-Q (111) describe a compound
- 1O 1O
- caracterizado porque T, L y Z tienen el mismo significado definido anteriormente para el compuesto de fórmula (11); Q es un marcador no isotópico; y m es un número entero con un valor entero entre 1 y 1000. characterized in that T, L and Z have the same meaning defined above for the compound of formula (11); Q is a non-isotopic marker; and m is an integer with an integer value between 1 and 1000.
- 15 fifteen
- En la presente invención se entiende por marcador cualquier molécula o fragmento que dé lugar a una señal medible por cualquier tipo de técnica analítica. En la presente invención, Q del compuesto de fórmula (111) identifica un fragmento o una molécula química detectora, marcadora o trazadora. In the present invention, "marker" means any molecule or fragment that gives rise to a signal measurable by any type of analytical technique. In the present invention, Q of the compound of formula (111) identifies a fragment or a chemical detector, marker or tracer molecule.
- Este compuesto de fórmula (111) puede utilizarse como antígeno de ensayo junto con un anticuerpo de ciprodinil para determinar o detectar este fungicida en una muestra mediante la tecnología de inmunoensayo competitivo. This compound of formula (111) can be used as a test antigen together with a cyprodinyl antibody to determine or detect this fungicide in a sample by competitive immunoassay technology.
- 20 twenty
- Según una realización preferida, el compuesto de fórmula (111) se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono. Preferentemente, L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono. According to a preferred embodiment, the compound of formula (111) is characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms. Preferably, L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms.
- 25 25
- Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (111) de la presente invención se caracteriza porque Z se selecciona del grupo que ' ' ' ' Sconsiste en -CONH-NHCO-NH-S~O y N-rN,N/ / N-r According to another additional preferred embodiment, the compound of formula (111) of the present invention is characterized in that Z is selected from the group that '' '' Consists of -CONH-NHCO-NH-S ~ O and N-rN, N / / Nr
o
or
Preferentemente, el compuesto de fórmula (111) se caracteriza porque Z es -CONH-. Preferably, the compound of formula (111) is characterized in that Z is -CONH-.
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (111) de la presente invención se caracteriza porque Q es biotina, un compuesto 5 luminiscente, un fluoróforo, un marcador acoplado a un sistema de detección According to another additional preferred embodiment, the compound of formula (111) of the present invention is characterized in that Q is biotin, a luminescent compound, a fluorophore, a label coupled to a detection system
indirecta, micro o nanopartículas u otros. indirect, micro or nanoparticles or others.
Preferentemente, Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, Preferably, Q is selected from the group consisting of biotin, fluorescein or any of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a coumarin fluorophore, a ruthenium bipyryl,
1O luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex. 1O luciferin or any of its derivatives, an acridinium ester and micro- or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (111) de la presente invención se caracteriza porque T es [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4-ciclopropil-6According to another preferred embodiment, the compound of formula (111) of the present invention is characterized in that T is [3 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4 - ((4- cyclopropil-6
15 metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, Methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl]; L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms; Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
/S00 y N~N,N_........-; y / S00 and N ~ N, N _........-; Y
o or
Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno Q is selected from the group consisting of biotin, fluorescein or any one of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a coumarin fluorophore, a ruthenium bipyril, luciferin or one
25 cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex. Any of its derivatives, an acridinium ester and micro- or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (111) de la presente invención se caracteriza porque Tes [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; According to another preferred embodiment, the compound of formula (111) of the present invention is characterized in that Tes [6-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms; Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
y N ;y/s~o N.v 'N/ and N; y / s ~ o N.v 'N /
O OR
Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex. Q is selected from the group consisting of biotin, fluorescein or any one of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a coumarin fluorophore, a ruthenium bipyryl, luciferin or any one of its derivatives, an acridinium ester and micro-or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (111) de la presente invención se caracteriza porque T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, According to another preferred embodiment, the compound of formula (111) of the present invention is characterized in that T is [(4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino]; L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms; Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
NN
O Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex. OQ is selected from the group consisting of biotin, fluorescein or any one of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a coumarin fluorophore, a ruthenium bipyryl, luciferin or any one of its derivatives, an acridinium ester and micro-or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex.
Un cuarto aspecto de la presente invención describe un anticuerpo generado en respuesta a un compuesto de fórmula (11) tal como se describe en esta solicitud de patente. A fourth aspect of the present invention describes an antibody generated in response to a compound of formula (11) as described in this patent application.
Según una realización preferida de la invención, el compuesto de fórmula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque According to a preferred embodiment of the invention, the compound of formula (11) that generates an antibody as described in this patent application is characterized in that
- 5 5
- T es [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4-ciclopropil-6metilpirimid in-2-il)amino )fenilo ]; Les una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, /sy-~lt;o ~NO Y N ·yN-7 'N/ ' )=l T is [3 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimid in-2-yl) amino) phenyl]; Les a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms; Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, / sy- ~ lt; or ~ NO Y N · yN-7 'N /') = l
- 1O 1O
- P se selecciona hemocianina. del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina y P hemocyanin is selected. of the group that consists in albumin, thyroglobulin Y
- 15 fifteen
- Preferentemente, el compuesto de formula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente, se caracteriza porque T es [3((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4-ciclopropil-6metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 5 átomos de carbono; Z es-CONH-; Pes albumina; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. Preferably, the compound of formula (11) that generates an antibody as described in this patent application is characterized in that T is [3 ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [ 4 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl]; L is a linear hydrocarbon chain of 5 carbon atoms; Z is-CONH-; Pes albumin; and n is a value selected between 1 and 50.
- 20 25 20 25
- Según otra realización preferida adicional de la invención, el compuesto de fórmula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque Tes [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, /sy-~lt;o ~NO y N ;yN-7 'N/ )=l According to another additional preferred embodiment of the invention, the compound of formula (11) that generates an antibody as described in this patent application is characterized in that Tes [6-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl]; L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms; Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, / sy- ~ lt; or ~ NO and N; yN-7 'N /) = l
- P se selecciona dentro del grupo que consiste hemocianina. P is selected from the group consisting of hemocyanin.
- en albúmina, tiroglobulina y in albumin, thyroglobulin and
Preferentemente, el compuesto de formula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente, se caracteriza porque T es [6ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; Les una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es-CONH-; P es albúmina; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. Preferably, the compound of formula (11) that generates an antibody as described in this patent application, is characterized in that T is [6-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl]; Les a linear hydrocarbon chain of 4 carbon atoms; Z is-CONH-; P is albumin; and n is a value selected between 1 and 50.
Según otra realización preferida adicional de la invención, el compuesto de fórmula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; Les una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, According to another additional preferred embodiment of the invention, the compound of formula (11) that generates an antibody as described in this patent application is characterized in that T is [(4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl )Not me]; Les a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms; Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
/syllt;o/ syllt; or
y Y
o or
P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina y hemocianina. P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin and hemocyanin.
Preferentemente, el compuesto de formula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente, se caracteriza porque T es [(4ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P es albúmina; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. Preferably, the compound of formula (11) that generates an antibody as described in this patent application is characterized in that T is [(4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino]; L is a linear hydrocarbon chain of 4 carbon atoms; Z is -CONH-; P is albumin; and n is a value selected between 1 and 50.
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un método in vitro de análisis de ciprodinil en una muestra que comprende las siguientes etapas: A fifth aspect of the present invention relates to an in vitro method of analyzing cyprodinyl in a sample comprising the following steps:
- a. to.
- poner en contacto una muestra con un anticuerpo generado tal como se describe en esta solicitud de patente; contacting a sample with a generated antibody as described in this patent application;
- b. b.
- incubar la muestra y el anticuerpo del paso (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción inmunoquímica; y incubate the sample and the antibody of step (a) for a suitable period of time for an immunochemical reaction to take place; Y
- c. C.
- determinar la existencia de reacción inmunoquímica tras la incubación del paso (b). determine the existence of immunochemical reaction after the incubation of step (b).
El método de la presente invención permite la determinación cuantitativa o análisis cualitativo del contenido del fungicida ciprodinil en una muestra. The method of the present invention allows quantitative determination or qualitative analysis of the content of the fungicide ciprodinil in a sample.
Según una realización preferida, la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (e) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un antígeno de ensayo que es un compuesto de fórmula (11) tal como se describe en esta solicitud de patente. Preferentemente, el inmunoensayo competitivo es de tipo ELISA. According to a preferred embodiment, the determination of the immunochemical reaction in step (e) is performed by a competitive immunoassay, using as a competitor a test antigen that is a compound of formula (11) as described in this patent application. Preferably, the competitive immunoassay is of the ELISA type.
Según otra realización preferida, la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (e) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un antígeno de ensayo que es un compuesto de fórmula (111) tal como se describe en esta solicitud de patente. Preferentemente, el inmunoensayo competitivo es de tipo ELISA. According to another preferred embodiment, the determination of the immunochemical reaction in step (e) is performed by a competitive immunoassay, using as a competitor a test antigen that is a compound of formula (111) as described in this patent application. Preferably, the competitive immunoassay is of the ELISA type.
El término inmunoensayo hace referencia a un ensayo analítico en el que ocurre una reacción inmunoquímica para la detección o cuantificación de un analito. Los inmunoensayos competitivos son aquellos en los que el analito compite con el antígeno de ensayo por la unión con el anticuerpo. The term "immunoassay" refers to an analytical assay in which an immunochemical reaction occurs for the detection or quantification of an analyte. Competitive immunoassays are those in which the analyte competes with the test antigen for binding with the antibody.
El término antígeno en esta solicitud de patente se refiere a una molécula capaz de interaccionar específicamente con un anticuerpo. La interacción o reacción inmunoquímica consiste en la unión específica y no covalente entre un anticuerpo y un antígeno, pudiendo ser éste el analito o un antígeno de ensayo. En la presente memoria el término antígeno de ensayo, antígeno enzimático o trazador se refiere a un compuesto de fórmula (1) acoplado a una molécula portadora o marcadora que se utiliza en el ensayo competitivo. The term "antigen" in this patent application refers to a molecule capable of interacting specifically with an antibody. The immunochemical interaction or reaction consists of the specific and non-covalent binding between an antibody and an antigen, which may be the analyte or a test antigen. Here the term "test antigen, enzyme or tracer antigen" refers to a compound of formula (1) coupled to a carrier or marker molecule that is used in the competitive assay.
Un sexto aspecto de la presente invención también se refiere a un kit de detección de ciprodinil que utiliza al menos un anticuerpo generado tal como se describe en esta solicitud de patente. Adicionalmente, el kit de detección de ciprodinil puede comprender un antígeno de ensayo que es un compuesto de fórmula (11) o un compuesto de fórmula (111) tal como se describen en la presente solicitud de patente. A sixth aspect of the present invention also relates to a cyprodinyl detection kit that uses at least one antibody generated as described in this patent application. Additionally, the cyprodinyl detection kit may comprise a test antigen that is a compound of formula (11) or a compound of formula (111) as described in the present patent application.
El compuesto de fórmula (11) de la presente invención se puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (1) con P, un polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor a 2000 daltons, por métodos ampliamente conocidos en la técnica. The compound of formula (11) of the present invention can be obtained by a process comprising reacting a compound of formula (1) with P, a natural or synthetic polypeptide of molecular weight greater than 2000 daltons, by methods widely known in the art. technique.
El procedimiento de obtención del compuesto de fórmula (11) también puede comprender, de ser necesario, una etapa adicional de activación del grupo funcional Y. The process for obtaining the compound of formula (11) may also comprise, if necessary, an additional step of activating the functional group Y.
Por otro lado, el compuesto de fórmula (111) de la presente invención se puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (1) con Q, un marcador químico no isotópico, por métodos ampliamente conocidos en la técnica. On the other hand, the compound of formula (111) of the present invention can be obtained by a process comprising reacting a compound of formula (1) with Q, a non-isotopic chemical marker, by methods widely known in the art.
El procedimiento de obtención del compuesto de fórmula (111) también puede comprender, de ser necesario, una etapa adicional de activación del grupo funcional Y. The process for obtaining the compound of formula (111) may also comprise, if necessary, an additional step of activating the functional group Y.
Cuando el compuesto de fórmula (1) se caracteriza porque Y es un grupo carboxílico, la activación mencionada anteriormente puede tener lugar haciendo reaccionar el compuesto de fórmula (1) con N,N'disuccinimidilcarbonato. Este procedimiento de activación puede tener lugar en un disolvente orgánico como por ejemplo acetonitrilo, propanonitrilo, diclorometano, cloroformo, tetrahidrofurano, benceno o tolueno; en presencia de una base como por ejemplotrietilamina, triisopropilamina, piridina, 4-N,Ndimetilaminopiridina, picolina o diazo(1 ,3)biciclo-[5.4.0]undecano; en un intervalo de temperatura entre O y 30 °C. When the compound of formula (1) is characterized in that Y is a carboxylic group, the above-mentioned activation can take place by reacting the compound of formula (1) with N, N'isuccinimidylcarbonate. This activation procedure can take place in an organic solvent such as acetonitrile, propanonitrile, dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran, benzene or toluene; in the presence of a base such as exemplotriethylamine, triisopropylamine, pyridine, 4-N, N-dimethylaminopyridine, picoline or diazo (1, 3) bicyclo- [5.4.0] undecano; in a temperature range between 0 and 30 ° C.
- Así mismo, la obtención de anticuerpos a partir de compuestos de fórmula (11) también puede tener lugar por métodos de inmunización ampliamente conocidos en la técnica. Likewise, obtaining antibodies from compounds of formula (11) can also take place by immunization methods widely known in the art.
- 5 5
- Los términos inmunógeno e inmunogénico tal como se utilizan en la presente invención se refieren a una sustancia que es reconocida como extraña al organismo vivo y por lo tanto es capaz de producir o de generar una respuesta inmune en un huésped. The terms immunogenic and immunogenic as used in the present invention refer to a substance that is recognized as foreign to the living organism and is therefore capable of producing or generating an immune response in a host.
- 1 O 1 o
- El término anticuerpo se refiere a una molécula que presenta afinidad de unión específica para el analito, excluyendo esencialmente otras sustancias no relacionadas. El término incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes y fragmentos de anticuerpo. The term "antibody" refers to a molecule that exhibits specific binding affinity for the analyte, essentially excluding other unrelated substances. The term includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant antibodies and antibody fragments.
- El término analito se refiere a una sustancia o grupo de sustancias cuya presencia o concentración se quiere determinar en la muestra. En el caso de la presente invención, el analito es el fungicida ciprodinil. The term analyte refers to a substance or group of substances whose presence or concentration is to be determined in the sample. In the case of the present invention, the analyte is the fungicide ciprodinil.
- 15 fifteen
- A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra quot;comprendequot; y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Throughout the description and the claims the word quot; comprehequot; and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention.
- 20 25 20 25
- Para preparar anticuerpos frente a ciprodinil se requiere la preparación de derivados funcionalizados de dicho fungicida, es decir, análogos estructurales de ciprodinil que incorporan un grupo funcional susceptible de ser utilizado para la conjugación a un portador P o marcador Q. Este grupo funcional está separado del esqueleto de la molécula de ciprodinil por un espaciador L. La posición de incorporación del grupo funcional a la estructura de ciprodinil para la conjugación no es un aspecto obvio y puede ser determinante para la viabilidad de los inmunógenos como inductores de la producción de anticuerpos de afinidad y selectividad adecuadas frente a ciprodinil e incluso de To prepare antibodies against ciprodinil, the preparation of functionalized derivatives of said fungicide is required, that is, structural analogs of ciprodinil that incorporate a functional group capable of being used for conjugation to a P carrier or Q marker. This functional group is separated from Skeleton of the cyprodinyl molecule by a spacer L. The position of incorporation of the functional group into the ciprodinyl structure for conjugation is not an obvious aspect and can be decisive for the viability of immunogens as inducers of affinity antibody production. and adequate selectivity against ciprodinil and even of
- conjugados de ensayo que permitan el desarrollo de un inmunoensayo sensible y específico para dicho fungicida, objeto último de la presente invención. test conjugates that allow the development of a sensitive and specific immunoassay for said fungicide, the ultimate object of the present invention.
- 5 1o 5 1st
- A continuación se ilustra con algunos ejemplos y dibujos la forma en que puede efectuarse la preparación de varios derivados de ciprodinil que son compuestos de fórmula (1) y los correspondientes compuestos de fórmula (11) inmunogénicos, que no pretenden que sean limitativos de la presente invención, y que sirven para mostrar no solo la forma en que puede efectuarse la preparación de los mismos sino también la importancia que puede tener la naturaleza estructural del inmunógeno para la producción de anticuerpos de afinidad adecuada hacía el analito, aptos para el desarrollo de un buen inmunoensayo. The following illustrates with some examples and drawings how the preparation of various cyprodinyl derivatives which are compounds of formula (1) and the corresponding compounds of formula (11) immunogenic, which are not intended to be limiting of the present can be carried out invention, and which serve to show not only the way in which they can be prepared, but also the importance that the structural nature of the immunogen may have for the production of antibodies of adequate affinity towards the analyte, suitable for the development of a Good immunoassay
- BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
- Figura 1. Esquema de la síntesis del compuesto de fórmula (1) CDm6. Figure 1. Scheme of the synthesis of the compound of formula (1) CDm6.
- Figura 2. Esquema de la síntesis del compuesto de fórmula (1) CDp6. Figure 2. Scheme of the synthesis of the compound of formula (1) CDp6.
- 15 fifteen
- Figura 3. Esquema de la síntesis del compuesto de fórmula (1) CDb5. Figure 3. Scheme of the synthesis of the compound of formula (1) CDb5.
- Figura 4. Esquema de la síntesis del compuesto de fórmula (1) CDn5. Figure 4. Scheme of the synthesis of the compound of formula (1) CDn5.
- Figura 5. Esquema de la preparación de un compuesto de fórmula (11) partir del correspondiente compuesto de fórmula (1). Figure 5. Scheme of the preparation of a compound of formula (11) from the corresponding compound of formula (1).
- a to
- 20 twenty
- Figura 6. Señales obtenidas frente a 0.11Jg de compuesto de fórmula (11) antigénico homólogo inmovilizado con los antisueros anti-ciprodinil a diluciones de 1x106 (negro), 3x105 (gris claro) y 1x105 (gris oscuro). Figure 6. Signals obtained against 0.11Jg of compound of formula (11) homologous antigenic immobilized with anti-cyprodinyl antisera at dilutions of 1x106 (black), 3x105 (light gray) and 1x105 (dark gray).
- Figura 7. Curvas estándar para ciprodinil en diferentes formatos de E LISA competitivo. Figure 7. Standard curves for ciprodinil in different formats of competitive LISA.
- EJEMPLOS EXAMPLES
- 5 5
- A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de fórmula (11) como inmunógenos para la obtención de anticuerpos anti-ciprodinil. En los siguientes ejemplos los números en negrita hacen referencia a la correspondiente estructura que se muestra en los esquemas de las Figuras 1 a 4. Estos ejemplos se presentan a modo de demostración pero de ningún modo pueden suponer un límite a la invención. The invention will now be illustrated by tests carried out by the inventors, which show the specificity and effectiveness of the compounds of formula (11) as immunogens for obtaining anti-cyprodinyl antibodies. In the following examples, the numbers in bold make reference to the corresponding structure shown in the schemes of Figures 1 to 4. These examples are presented by way of demonstration but in no way can they constitute a limit to the invention.
- 1. Preparación de compuestos de fórmula (11) 1. Preparation of compounds of formula (11)
- 1 O 1 o
- 1.1. Síntesis de compuestos de fórmula (1) 1.1. Synthesis of compounds of formula (1)
- Ejemplo 1. Síntesis de CDm6 [radical del tipo T= R-1] Example 1. Synthesis of CDm6 [radical of type T = R-1]
- 15 20 15 20
- La síntesis del compuesto CDm6 (5) se describe en la Figura 1 e implica la elaboración del anillo de pirimidina a través de una reacción de condensación en medio básico de la 1-ciclopropilbutano-1,3-diona (1) con una aril-guanidina, tal como 3, que incorpora la cadena hidrocarbonada de seis átomos de carbono que constituye el espaciador en la posición adecuada del anillo fenílico. Esta aril-guanidina se prepara previamente en forma de nitrato por reacción del éster metílico del ácido 6-(3-aminofenil)hexanóico (E. Moreauet al., Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 1206-1217) con cianamida en medio etanólico ácido. La síntesis del compuesto CDm6 (5) se completa mediante una reacción de hidrólisis del éster metílico obtenido (4) en medio básico. A continuación se ilustran los detalles de la preparación y caracterización de este compuesto de fórmula (1) y los intermedios de su síntesis. The synthesis of compound CDm6 (5) is described in Figure 1 and involves the preparation of the pyrimidine ring through a condensation reaction in basic medium of 1-cyclopropylbutane-1,3-dione (1) with an aryl- guanidine, such as 3, which incorporates the six-carbon hydrocarbon chain that constitutes the spacer in the proper position of the phenyl ring. This aryl guanidine is previously prepared in the form of nitrate by reaction of the 6- (3-aminophenyl) hexanoic acid methyl ester (E. Moreauet al., Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 1206-1217) with cyanamide in Ethanolic acid medium. The synthesis of the CDm6 compound (5) is completed by a hydrolysis reaction of the methyl ester obtained (4) in basic medium. The details of the preparation and characterization of this compound of formula (1) and the intermediates of its synthesis are illustrated below.
- i) Preparación del nitrato de 6-(3-guanidinofeni/)hexanoato de metilo(3). i) Preparation of methyl 6- (3-guanidinopheni /) hexanoate nitrate (3).
- 25 25
- Una mezcla de 6-(3-aminofenil)hexanoato de metilo (2, 188 mg, 0.850 mmol), disolución acuosa de cianamida al 50% (132 J,JL, 1.70 mmol, 2 equiv.) y HN03 concentrado (70% p/v, 84 IJL, 1.13 mmol, 1.3 equiv.) en EtOH (1.6 mL) A mixture of methyl 6- (3-aminophenyl) hexanoate (2, 188 mg, 0.850 mmol), 50% aqueous cyanamide solution (132 J, JL, 1.70 mmol, 2 equiv.) And concentrated HN03 (70% p / v, 84 IJL, 1.13 mmol, 1.3 equiv.) in EtOH (1.6 mL)
se introdujo en una ampolla topacio bajo nitrógeno. La ampolla se cerró a vacío y se calentó con agitación a 78 oc durante toda la noche. El contenido de la ampolla se transfirió a un matraz con la ayuda de EtOH, se concentró a sequedad bajo vacío y el residuo se purificó por cromatografía, usando CHCb-MeOH 9:1 como eluyente, para dar el nitrato de la arilguanidina 3 (242 mg, 87%). 1H NMR (300 MHz, CDCb) 5 (ppm) 9.62 (1 H, s, NH-C(NH)-NH2), 7.92 (2H, s ancho, NH-C(NH)-NH2}, 6.60 (1 H, s ancho, NH-C(NH)-NH2), 7.33 (1 H, dd, J =8.0, 8.0 Hz, H-5 Ph), 7.14 (1 H, d, J =7.5 Hz, H-4 Ph), 7.07 (2H, m, H-2 y H-6 Ph}, 3.64 (3H, s, C02Me), 2.62 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-6), 2.30 (2H, t, J = was introduced into a topaz ampoule under nitrogen. The vial was closed under vacuum and heated with stirring at 78 ° C overnight. The contents of the ampoule were transferred to a flask with the help of EtOH, concentrated to dryness under vacuum and the residue was purified by chromatography, using CHCb-MeOH 9: 1 as eluent, to give arylguanidine 3 nitrate (242 mg, 87%). 1H NMR (300 MHz, CDCb) 5 (ppm) 9.62 (1 H, s, NH-C (NH) -NH2), 7.92 (2H, wide s, NH-C (NH) -NH2}, 6.60 (1 H , s wide, NH-C (NH) -NH2), 7.33 (1 H, dd, J = 8.0, 8.0 Hz, H-5 Ph), 7.14 (1 H, d, J = 7.5 Hz, H-4 Ph ), 7.07 (2H, m, H-2 and H-6 Ph}, 3.64 (3H, s, C02Me), 2.62 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-6), 2.30 (2H, t, J =
7.4 Hz, H-2}, 1.64 (4H, m, H-3 y H-5}, 1.35 (2H, m, H-4); RMN de 13C (75 MHz, CDCb) 5 (ppm) 174.3 (C02Me), 156.4 (NH-C(NH)-NH2}, 145.1 (C-3 Ph), 134.0 (C-1 Ph), 130.0 (C-5 Ph), 128.0 (C-4 Ph}, 125.2 (C-6 Ph}, 122.5 (C-2 Ph), 51.5 (C02Me), 35.3 (C-6), 33.8 (C-2), 30.6 (C-3), 28.5 (C-5), 24.5 (C-4); IR (NaCI) Vmaxlcm-1 3338, 3200, 2940, 1724, 1674, 1600, 1352, 1267, 736; EM (IE)m/z (%) 263 (M+, 100), 262 (13), 246 (4), 233 (3}, 232 (18), 221 (17}, 190 (5), 170 (12), 148 (8}, 132 (38); EMAR m/z calculado para C14H21N302 263.16338, encontrado 263.16271. 7.4 Hz, H-2}, 1.64 (4H, m, H-3 and H-5}, 1.35 (2H, m, H-4); 13C NMR (75 MHz, CDCb) 5 (ppm) 174.3 (C02Me ), 156.4 (NH-C (NH) -NH2}, 145.1 (C-3 Ph), 134.0 (C-1 Ph), 130.0 (C-5 Ph), 128.0 (C-4 Ph}, 125.2 (C- 6 Ph}, 122.5 (C-2 Ph), 51.5 (C02Me), 35.3 (C-6), 33.8 (C-2), 30.6 (C-3), 28.5 (C-5), 24.5 (C-4 ); IR (NaCI) Vmaxlcm-1 3338, 3200, 2940, 1724, 1674, 1600, 1352, 1267, 736; MS (IE) m / z (%) 263 (M +, 100), 262 (13), 246 (4), 233 (3}, 232 (18), 221 (17}, 190 (5), 170 (12), 148 (8}, 132 (38); EMAR m / z calculated for C14H21N302 263.16338, found 263.16271 .
ii) Preparación del 6-(3-(( 4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)feni/)hexanoato de metilo (4). ii) Preparation of methyl 6- (3 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) feni /) hexanoate (4).
Una mezcla del nitrato de arilguanidina 3 (143.1 mg, 0.438 mmol}, 1ciclopropilbutano-1 ,3-diona (1, 110.5 mg, 0.876 mmol, 3 equiv.), Na2C03 (23.2 mg, 0.219 mmol, 0.5 equiv.) y MeOH (1 mL) contenida en una ampolla de vidrio cerrada a vacío se calentó con agitación a 78°C durante 48 h. La ampolla se abrió y el disolvente se evaporó a presión reducida para dar un residuo que fue purificado por cromatografía de columna, usando CHCb como eluyente, para obtener el derivado pirimidínico 4 (96.5 mg, 62%) como un aceite. RMN de 1H (300 MHz, CDCb) 5 (ppm) 7.50 (1 H, dd, J = 1.6, 1.6 Hz, H-2 Ph), 7.39 (1 H, ddd, J =7.7, 1.8, 1.6 Hz, H-4 Ph}, 7.19 (1 H, dd, J =7.7, 7.7 Hz, H-5 Ph), 6.96 (1 H, s ancho, H-NH), 6.80 (1 H, ddd, J = 7.7, 1.6, 1.6 Hz, H-6 Ph), 6.51 (1 H, s, H-5 Pirim), 3.66 (3H, s, C02Me), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.34 (3H, s, Me), 2.31 A mixture of arylguanidine 3 nitrate (143.1 mg, 0.438 mmol}, 1-cyclopropylbutane-1,3-dione (1, 110.5 mg, 0.876 mmol, 3 equiv.), Na2C03 (23.2 mg, 0.219 mmol, 0.5 equiv.) And MeOH (1 mL) contained in a vacuum closed glass vial was heated with stirring at 78 ° C for 48 h. The vial was opened and the solvent was evaporated under reduced pressure to give a residue that was purified by column chromatography, using CHCb as eluent, to obtain the pyrimidine derivative 4 (96.5 mg, 62%) as an oil 1 H NMR (300 MHz, CDCb) 5 (ppm) 7.50 (1 H, dd, J = 1.6, 1.6 Hz, H- 2 Ph), 7.39 (1 H, ddd, J = 7.7, 1.8, 1.6 Hz, H-4 Ph}, 7.19 (1 H, dd, J = 7.7, 7.7 Hz, H-5 Ph), 6.96 (1 H , s wide, H-NH), 6.80 (1 H, ddd, J = 7.7, 1.6, 1.6 Hz, H-6 Ph), 6.51 (1 H, s, H-5 Pirim), 3.66 (3H, s, C02Me), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.34 (3H, s, Me), 2.31
(2H, t, J =7.7 Hz, H-2), 1.85 (1 H, m, CH-ciclopropilo), 1.67 (4H, m, H-3 yH-5), (2H, t, J = 7.7 Hz, H-2), 1.85 (1 H, m, CH-cyclopropyl), 1.67 (4H, m, H-3 and H-5),
1.39 (2H, m, H-4), 1.15 y 0.99 (2H cada uno m, CH2CH2-ciclopropilo); RMN de 13C (75 MHz, CDCb) ó (ppm) 174.2 (C02Me), 172.4 (C-2 Pirim), 166.6 (C-6 Pirim), 159.8 (C-4 Pirim), 143.1 (C-3 Ph), 140.1 (C-1 Ph), 128.6 (C-5 Ph), 121.9 (C-4 Ph), 118.6 (C-6 Ph), 116.0 (C-2 Ph), 110.0 (C-5 Pirim), 51.4 (C02Me), 35.9 (C-6), 34.0 (C-2), 31.0 (C-3), 28.7 (C-5), 24.8 (C-4), 23.8 (Me), 16.8 (CH-ciclopropilo), 10.3 (CH2CH2-ciclopropilo); IR (NaCI) Vmaxlcm-1 3356, 3009, 2932, 2850, 1736, 1588, 1541, 1445, 1171, 789, 695; EM (IE)m/z (%) 353 (M+, 97), 352 (28), 323 (49), 322 (15), 294 (12), 280 (17), 266 (11), 252 (51), 250 (87), 240 (17), 239 (100), 238 (23), 221 (20); EMAR m/z calculado para C21H21N302 353.21033, encontrado 353.21022. 1.39 (2H, m, H-4), 1.15 and 0.99 (2H each m, CH2CH2-cyclopropyl); 13C NMR (75 MHz, CDCb) or (ppm) 174.2 (C02Me), 172.4 (C-2 Pirim), 166.6 (C-6 Pirim), 159.8 (C-4 Pirim), 143.1 (C-3 Ph), 140.1 (C-1 Ph), 128.6 (C-5 Ph), 121.9 (C-4 Ph), 118.6 (C-6 Ph), 116.0 (C-2 Ph), 110.0 (C-5 Pirim), 51.4 ( C02Me), 35.9 (C-6), 34.0 (C-2), 31.0 (C-3), 28.7 (C-5), 24.8 (C-4), 23.8 (Me), 16.8 (CH-cyclopropyl), 10.3 (CH2CH2-cyclopropyl); IR (NaCI) Vmaxlcm-1 3356, 3009, 2932, 2850, 1736, 1588, 1541, 1445, 1171, 789, 695; MS (IE) m / z (%) 353 (M +, 97), 352 (28), 323 (49), 322 (15), 294 (12), 280 (17), 266 (11), 252 (51 ), 250 (87), 240 (17), 239 (100), 238 (23), 221 (20); EMAR m / z calculated for C21H21N302 353.21033, found 353.21022.
iii) Preparación del ácido 6-(3-((4-ciclopropi/-6-metilpyrimidin-2-i/)amino)feni/) hexanoico (5, compuesto CDm6). iii) Preparation of 6- (3 - ((4-cyclopropi / -6-methylpyrimidin-2-i /) amino) feni /) hexanoic acid (5, compound CDm6).
Una mezcla del éster metílico 4 (82.3 mg, 0.233 mmol) en una mezcla de MeOH (2 mL) y una disolución acuosa 2M de NaOH (0.47 mL, 0.932 mmol, 4 equiv.) se calentó a reflujo con agitación durante 2 h. Después de eliminar el disolvente a presión reducida, el residuo sólido obtenido se disolvió en la mínima cantidad de ácido fórmico y la disolución resultante se agitó a la vez que se añadía agua, gota a gota, hasta la aparición de un sólido blanco. La suspensión blanquecina se dejo enfriando en la nevera durante varias horas y se filtró. Los cristales se lavaron con agua fría y se secaron durante toda la noche en un desecador a vacío, para obtener el compuesto CDm6 (5, 57.7 mg, 73%) como un sólido, prácticamente puro por análisis de 1H RMN. Pf. 170-173 °C (cristalizado de DMSO-H20); 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ó (ppm) 11.98 (1 H, sancho, C02H), 9.26 {1 H, s, NH), 7.69 {1 H, sancho, H-2 Ph), 7.45 {1 H, d ancho, J =8.0 Hz, H-4 Ph), 7.11 (1 H, dd, J =7.7, 7.7 Hz, H-5 Ph), 6.71 (1 H, d ancho, J = 7.7 Hz, H-6 Ph), 6.66 (1 H, s, H-5 Pirim), 2.28 (3H, s, Me), 2.56 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.20 (2H, t, J = 7.3 Hz, H-2), 1.94 (1 H, m, CH-ciclopropilo), A mixture of methyl ester 4 (82.3 mg, 0.233 mmol) in a mixture of MeOH (2 mL) and a 2M aqueous solution of NaOH (0.47 mL, 0.932 mmol, 4 equiv.) Was heated at reflux with stirring for 2 h. After removing the solvent under reduced pressure, the solid residue obtained was dissolved in the minimum amount of formic acid and the resulting solution was stirred while adding water, drop by drop, until a white solid appeared. The whitish suspension was allowed to cool in the refrigerator for several hours and filtered. The crystals were washed with cold water and dried overnight in a vacuum desiccator, to obtain the compound CDm6 (5.57.7 mg, 73%) as a solid, practically pure by 1 H NMR analysis. Mp 170-173 ° C (crystallized from DMSO-H20); 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) or (ppm) 11.98 (1 H, sancho, C02H), 9.26 {1 H, s, NH), 7.69 {1 H, sancho, H-2 Ph), 7.45 {1 H, d wide, J = 8.0 Hz, H-4 Ph), 7.11 (1 H, dd, J = 7.7, 7.7 Hz, H-5 Ph), 6.71 (1 H, d wide, J = 7.7 Hz, H -6 Ph), 6.66 (1 H, s, H-5 Pirim), 2.28 (3H, s, Me), 2.56 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.20 (2H, t, J = 7.3 Hz, H-2), 1.94 (1 H, m, CH-cyclopropyl),
1.56 (4H, m, H-3 yH-5), 1.31 (2H, m, H-4), 1.01 (4H, m, CH2CH2-ciclopropilo); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) ó {ppm) 174.4 (C02H), 171.4 (C-2 Pirim), 166.2 1.56 (4H, m, H-3 and H-5), 1.31 (2H, m, H-4), 1.01 (4H, m, CH2CH2-cyclopropyl); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) or {ppm) 174.4 (C02H), 171.4 (C-2 Pirim), 166.2
(C-6 Pirim), 159.8 (C-4 Pirim), 142.1 (C-3 Ph), 140.8 (C-1 Ph), 128.1 (C-5 Ph), (C-6 Pirim), 159.8 (C-4 Pirim), 142.1 (C-3 Ph), 140.8 (C-1 Ph), 128.1 (C-5 Ph),
120.9 (C-4 Ph), 118.2 (C-6 Ph), 115.8 (C-2 Ph), 109.4 (C-5 Pirim), 35.3 (C-6), 120.9 (C-4 Ph), 118.2 (C-6 Ph), 115.8 (C-2 Ph), 109.4 (C-5 Pirim), 35.3 (C-6),
33.5 (C-2), 30.5 (C-5), 28.2 (C-4), 24.3 (C-3), 23.3 (Me), 16.2 (CH-ciclopropilo), 33.5 (C-2), 30.5 (C-5), 28.2 (C-4), 24.3 (C-3), 23.3 (Me), 16.2 (CH-cyclopropyl),
9.8 (CH2CH2-ciclopropilo); IR (K8r) Vmaxfcm-1 3292, 3213, 3101, 3014, 2932, 2853, 1700, 1633, 1604, 1558, 1487, 1452, 1404, 1264, 960, 784; EMAR (TOF EM ES+) miz calculado para C2oH25N302Na[M+Nat 362.18445, encontrado 362.18380. 9.8 (CH2CH2-cyclopropyl); IR (K8r) Vmaxfcm-1 3292, 3213, 3101, 3014, 2932, 2853, 1700, 1633, 1604, 1558, 1487, 1452, 1404, 1264, 960, 784; EMAR (TOF EM ES +) miz calculated for C2oH25N302Na [M + Nat 362.18445, found 362.18380.
Ejemplo 2. Síntesis de CDp6 (9) [radical del tipo T= R-1] Example 2. Synthesis of CDp6 (9) [radical of type T = R-1]
La síntesis del compuesto CDp6 (9) se describe en la Figura 2. Su síntesis parte de la 1-ciclopropilbutano-1 ,3-diona (1) e implica una secuencia de transformaciones idéntica a la descrita en el ejemplo 1 para la preparación del compuesto CDm6 (5), pero utilizando en este caso la aril-guanidina 7, preparada a partir de la reacción del éster metílico del ácido 6-(4-aminofenil)hexanóico (6) (C. Suárez-Pantaleón et al., J.Agric. FoodChem. 2008, 56, 11122-11131) con cianamida en medio etanólico ácido. The synthesis of compound CDp6 (9) is described in Figure 2. Its synthesis starts from 1-cyclopropylbutane-1,3-dione (1) and implies a sequence of transformations identical to that described in example 1 for the preparation of CDm6 compound (5), but in this case using aryl guanidine 7, prepared from the reaction of the 6- (4-aminophenyl) hexanoic acid methyl ester (6) (C. Suárez-Pantaleón et al., J .Agric. FoodChem. 2008, 56, 11122-11131) with cyanamide in an ethanolic acid medium.
A continuación se ilustran los detalles de la preparación y caracterización de este compuesto de fórmula (1) y los intermedios de su síntesis. The details of the preparation and characterization of this compound of formula (1) and the intermediates of its synthesis are illustrated below.
i) Preparación del nitrato de 6-(4-guanidinofeni/)hexanoato de metilo (7) i) Preparation of methyl 6- (4-guanidinopheni /) hexanoate nitrate (7)
Una mezcla de 6-(4-aminofenil)hexanoato de metilo (6, 115 mg, 0.515 mmol), disolución acuosa al 50% de cianamida (75 !JL, 0.780 mmol, 1.5 equiv.) y HN03 concentrado (70% p/v, 40 !JL, 0.517 mmol, 1 equiv.) en EtOH (1 ml) se calentó en una ampolla cerrada con agitación a 78 °C por 22 h. El contenido de la ampolla se concentró a vacío y el aceite anaranjado obtenido se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice, usando CHCb-MeOH 9:1 como eluyente, para obtener la aril-guanidina 7 (134.5 mg, 79%), en forma de nitrato, como un sólido blanco. Pf 119-121 oc (cristalizado de CHCI3-Et0Ac); RMN de 1H (300 MHz, CDCb) 6 (ppm) 9.54 (1H, s, NH-C(NH)-NH2), 7.80 (3H, sa, NH-C(NH)-NH2), 7.20 (2H, aparente d, parte AA' de un sistema AA'88', J =8.1 Hz, H-2/H-6 Ph), 7.13 (2H, aparente d, parte 88' de un sistema AA'88', J = 8.1 A mixture of methyl 6- (4-aminophenyl) hexanoate (6, 115 mg, 0.515 mmol), 50% aqueous solution of cyanamide (75 µL, 0.780 mmol, 1.5 equiv.) And concentrated HN03 (70% w / v, 40! JL, 0.517 mmol, 1 equiv.) in EtOH (1 ml) was heated in a closed vial with stirring at 78 ° C for 22 h. The content of the ampoule was concentrated in vacuo and the orange oil obtained was purified by column chromatography on silica gel, using CHCb-MeOH 9: 1 as eluent, to obtain aryl guanidine 7 (134.5 mg, 79%), in the form of nitrate, as a white solid. Mp 119-121 oc (crystallized from CHCI3-Et0Ac); 1H NMR (300 MHz, CDCb) 6 (ppm) 9.54 (1H, s, NH-C (NH) -NH2), 7.80 (3H, sa, NH-C (NH) -NH2), 7.20 (2H, apparent d, part AA 'of an AA'88' system, J = 8.1 Hz, H-2 / H-6 Ph), 7.13 (2H, apparent d, part 88 'of an AA'88' system, J = 8.1
- Hz, H-3/H-5 Ph), 3.64 (3H, s, C02Me), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.28 (2H, t, Hz, H-3 / H-5 Ph), 3.64 (3H, s, C02Me), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.28 (2H, t,
- J = 7.5 Hz, H-2), 1.61 (4H, m, H-3 y H-5), 1.34 (2H, m, H-4); RMN de 13C (75 J = 7.5 Hz, H-2), 1.61 (4H, m, H-3 and H-5), 1.34 (2H, m, H-4); 13C NMR (75
- MHz, CDCb) ó (ppm) 174.1 (C02Me), 156.6 (NH-C(NH)-NH2), 142.7 (C-1 Ph), MHz, CDCb) or (ppm) 174.1 (C02Me), 156.6 (NH-C (NH) -NH2), 142.7 (C-1 Ph),
- 131.6 (C-4 Ph), 130.1 (C-2/C-6 Ph), 125.5 (C-3/C-5 Ph), 51.5 (C02Me), 35.1 131.6 (C-4 Ph), 130.1 (C-2 / C-6 Ph), 125.5 (C-3 / C-5 Ph), 51.5 (C02Me), 35.1
- 5 5
- (C-6), 33.8 (C-2), 30.8 (C-3), 28.5 (C-5), 24.6 (C-4); EM (IE)m/z (%) 263(M+, 8), (C-6), 33.8 (C-2), 30.8 (C-3), 28.5 (C-5), 24.6 (C-4); MS (IE) m / z (%) 263 (M +, 8),
- 247 (1), 246 (7), 221 (10), 170 (25), 148 (15), 132 (10), 131 (59), 106 (26), 106 247 (1), 246 (7), 221 (10), 170 (25), 148 (15), 132 (10), 131 (59), 106 (26), 106
- (100); EMAR m/z calculado para C14H21N302 263.16338, encontrado (100); EMAR m / z calculated for C14H21N302 263.16338, found
- 263.16446. 263.16446.
- ii) Preparación del 6-( 4-(( 4-ciclopropil-6-meti/pirimidin-2-i/)amino)feni/) ii) Preparation of 6- (4 - ((4-cyclopropyl-6-meti / pyrimidin-2-i /) amino) feni /)
- 1 O 1 o
- hexanoato de metilo (8) methyl hexanoate (8)
- Una mezcla de la arilguanidina 7 (116 mg, 0.355 mmol), 1-ciclopropilbutanoA mixture of arylguanidine 7 (116 mg, 0.355 mmol), 1-cyclopropylbutane
- 1,3-diona (1, 134.5 mg, 1.066 mmol, 3 equiv.), Na2C03 (18.8 mg, 0.177 mmol, 1,3-dione (1,134.5 mg, 1,066 mmol, 3 equiv.), Na2C03 (18.8 mg, 0.177 mmol,
- 0.5 equiv.) y MeOH (1 ml) contenida en una ampolla cerrada a vacío se 0.5 equiv.) And MeOH (1 ml) contained in a vacuum closed vial
- calentó con agitación a 78 oc durante 50 h. El contenido de la ampolla se heated with stirring at 78 oc for 50 h. The contents of the blister are
- 15 fifteen
- concentró a presión reducida y se cromatografió en gel de sílice, usando CHCb concentrated under reduced pressure and chromatographed on silica gel, using CHCb
- como eluyente, para obtener el derivado pirimidílico 8 (95 mg, 76%) como un as eluent, to obtain the pyrimidyl derivative 8 (95 mg, 76%) as a
- aceite viscoso. RMN de 1H (300 MHz, CDCb) ó (ppm) 7.51 (2H, aparente d, viscous oil 1H NMR (300 MHz, CDCb) or (ppm) 7.51 (2H, apparent d,
- parte AA' de un sistema AA'88', J = 8.4 Hz, H-3/H-5 Ph), 7.09 (2H, aparente d, AA 'part of an AA'88' system, J = 8.4 Hz, H-3 / H-5 Ph), 7.09 (2H, apparent d,
- parte 88' de un sistema AA'88', J = 8.4 Hz, H-2/H-6 Ph), 6.94 (1H, sa, H-NH), part 88 'of an AA'88' system, J = 8.4 Hz, H-2 / H-6 Ph), 6.94 (1H, sa, H-NH),
- 20 twenty
- 6.48 (1 H, s, H-5 Pirim), 3.66 (3H, s, C02Me), 2.56 (2H, t, J =7.5 Hz, H-6), 2.30 6.48 (1 H, s, H-5 Pirim), 3.66 (3H, s, C02Me), 2.56 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.30
- (2H, t, J = 7.6 Hz, H-2), 1.84 (1 H, m, CH-ciclopropilo), 1.62 (4H, m, H-3 yH-5), (2H, t, J = 7.6 Hz, H-2), 1.84 (1 H, m, CH-cyclopropyl), 1.62 (4H, m, H-3 and H-5),
- 1.36 (2H, m, H-4), 1.13 y 0.98 (2H cada uno, cada uno m, CH2CH2-ciclopropilo); 1.36 (2H, m, H-4), 1.13 and 0.98 (2H each, each m, CH2CH2-cyclopropyl);
- RMN de 13C (75 MHz, CDCb) ó (ppm) 174.2 (C02Me), 172.4 (C-2 Pirim), 166.5 13C NMR (75 MHz, CDCb) or (ppm) 174.2 (C02Me), 172.4 (C-2 Pirim), 166.5
- (C-6 Pirim), 159.9 (C-4 Pirim), 137.8 (C-1 Ph), 135.8 (C-4 Ph), 128.6 (C-2/C-6 (C-6 Pirim), 159.9 (C-4 Pirim), 137.8 (C-1 Ph), 135.8 (C-4 Ph), 128.6 (C-2 / C-6
- 25 25
- Ph), 118.6 (C-3/C-5 Ph), 109.7 (C-5 Pirim), 51.4 (C02Me), 35.0 (C-6), 34.0 (C Ph), 118.6 (C-3 / C-5 Ph), 109.7 (C-5 Pirim), 51.4 (C02Me), 35.0 (C-6), 34.0 (C
- 2), 31.1 (C-3), 28.7 (C-5), 24.8 (C-4), 23.8 (Me), 16.8 (CH-ciclopropilo), 10.2 2), 31.1 (C-3), 28.7 (C-5), 24.8 (C-4), 23.8 (Me), 16.8 (CH-cyclopropyl), 10.2
- (CH2CH2-ciclopropilo); IR (K8r) Vmaxlcm-1 3361, 3273, 3192, 3008, 2930, 2855, (CH2CH2-cyclopropyl); IR (K8r) Vmaxlcm-1 3361, 3273, 3192, 3008, 2930, 2855,
- 1736, 1595, 1530, 1463, 1405, 1364, 1290, 1248, 959, 818, 757; EM (IE)m/z 1736, 1595, 1530, 1463, 1405, 1364, 1290, 1248, 959, 818, 757; MS (IE) m / z
- (%) 353 (M+, 81), 352 (12), 323 (2), 322 (7), 252 (5), 239 (21), 238 (100), 221 (%) 353 (M +, 81), 352 (12), 323 (2), 322 (7), 252 (5), 239 (21), 238 (100), 221
(6), 187 (6), 106 (58); EMAR m/z calculado para C21H21N302 353.21033, encontrado 353.21057. (6), 187 (6), 106 (58); EMAR m / z calculated for C21H21N302 353.21033, found 353.21057.
iii) Preparación del ácido 6-(4-((4-cic/opropi/-6-metilpirimidin-2-il)amino)feni/) hexanoico (9, compuesto CDp6) iii) Preparation of 6- (4 - ((4-cic / opropi / -6-methylpyrimidin-2-yl) amino) feni /) hexanoic acid (9, compound CDp6)
Una disolución del éster metílico 8 (128.5 mg, 0.364 mmol) en una mezcla de MeOH (4 mL) y NaOH acuoso 2M (0.73 mL, 1.46 mmol, 4 equiv.) se agitó a 60 oc durante 2.5 h. La mezcla de reacción amarillenta formada se transfirió a un matraz y la mayoría del disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo pardusco semisólido obtenido se disolvió en ácido fórmico (aproximadamente A solution of methyl ester 8 (128.5 mg, 0.364 mmol) in a mixture of MeOH (4 mL) and 2M aqueous NaOH (0.73 mL, 1.46 mmol, 4 equiv.) Was stirred at 60 ° C for 2.5 h. The yellowish reaction mixture formed was transferred to a flask and most of the solvent was removed under reduced pressure. The semi-solid brownish residue obtained was dissolved in formic acid (approximately
0.5 mL), se diluyó con agua y se extrajo con CHCb. Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con disolución saturada de NaCI y se secaron sobre MgS04 anhidro. La filtración y evaporación del disolvente a vacío proporcionó el compuesto CDp6 (9, 104.5 mg, 85%) como un sólido blanco y que por análisis de RMN de 1H y cromatografía de capa fina mostró ser prácticamente puro. Pf 146-147 oc (cristalizado deMeOH); 1H RMN de (300 MHz, DMSO-d6) o(ppm) 11.97 (1 H, s, COOH), 9.22 (1 H, s, NH), 7.62 (2H, aparente d, parte AA' de un sistema AA'BB', J = 8.5 Hz, H-3/H-5 Ph), 7.04 (2H, aparente d, parte BB' de un sistema AA'BB', J =8.5 Hz, H-2/H-6 Ph), 6.62 (1 H, s, H-5 Pirim), 2.48 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.19 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-2), 1.92 (1 H, m, CHciclopropilo), 1.52 (4H, m, H-3 yH-5), 1.27 (2H, m, H-4), 0.99 (4H, m, CH2CH2ciclopropilo); 13C RMN de (75 MHz, DMSO-d6) o (ppm) 174.4 (C02Me), 171.4 (C-2 Pirim), 166.1 (C-6 Pirim), 159.8 (C-4 Pirim), 138.6 (C-1 Ph), 134.4(C-4 Ph), 0.5 mL), diluted with water and extracted with CHCb. The combined organic extracts were washed with saturated NaCl solution and dried over anhydrous MgSO4. Filtration and evaporation of the solvent in vacuo provided the CDp6 compound (9, 104.5 mg, 85%) as a white solid and which by 1 H NMR analysis and thin layer chromatography proved to be practically pure. Mp 146-147 oc (crystallized from MeOH); 1 H NMR of (300 MHz, DMSO-d6) or (ppm) 11.97 (1 H, s, COOH), 9.22 (1 H, s, NH), 7.62 (2H, apparent d, part AA 'of an AA system' BB ', J = 8.5 Hz, H-3 / H-5 Ph), 7.04 (2H, apparent d, part BB' of an AA'BB 'system, J = 8.5 Hz, H-2 / H-6 Ph) , 6.62 (1 H, s, H-5 Pirim), 2.48 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.19 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-2), 1.92 (1 H , m, CHcyclopropyl), 1.52 (4H, m, H-3 and H-5), 1.27 (2H, m, H-4), 0.99 (4H, m, CH2CH2cyclopropyl); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) or (ppm) 174.4 (C02Me), 171.4 (C-2 Pirim), 166.1 (C-6 Pirim), 159.8 (C-4 Pirim), 138.6 (C-1 Ph ), 134.4 (C-4 Ph),
128.0 (C-2/C-6 Ph), 118.4 (C-3/C-5 Ph), 109.0 (C-5 Pirim), 34.3 (C-6), 33.5 (C2), 30.8 (C-5), 28.1 (C-4), 24.3 (C-3), 23.3 (Me), 16.3 (CH-ciclopropilo), 9.8 (CH2CH2-ciclopropilo); IR (KBr) Vmaxlcm-1 3306, 3209, 3006, 2968, 2928, 2848, 1684, 1592, 1559, 1517, 1406, 964, 807; EM (IE)m/z (%) 339 (M+, 75), 338 (12), 252 (6), 250 (2), 240 (2), 239 (20), 238 (1 00), 237 (2), 236 (2), 224 (2), 222 (2), 131 (4); EMAR m/z calculado para C2oH2sN302 339.19468, encontrado 339.19430. 128.0 (C-2 / C-6 Ph), 118.4 (C-3 / C-5 Ph), 109.0 (C-5 Pirim), 34.3 (C-6), 33.5 (C2), 30.8 (C-5) , 28.1 (C-4), 24.3 (C-3), 23.3 (Me), 16.3 (CH-cyclopropyl), 9.8 (CH2CH2-cyclopropyl); IR (KBr) Vmaxlcm-1 3306, 3209, 3006, 2968, 2928, 2848, 1684, 1592, 1559, 1517, 1406, 964, 807; MS (IE) m / z (%) 339 (M +, 75), 338 (12), 252 (6), 250 (2), 240 (2), 239 (20), 238 (1 00), 237 ( 2), 236 (2), 224 (2), 222 (2), 131 (4); EMAR m / z calculated for C2oH2sN302 339.19468, found 339.19430.
- Ejemplo 3. Síntesis de CDb5 (18) [radical del tipo T= R-IV] Example 3. Synthesis of CDb5 (18) [radical of type T = R-IV]
- La síntesis del compuesto de fórmula (1) que incorpora el espaciador por el The synthesis of the compound of formula (1) that incorporates the spacer by the
- anillo de pirimidina se basa en la preparación previa de un compuesto 1 ,3Pyrimidine ring is based on the previous preparation of a compound 1, 3
- dicarbonílico que incorpora en la posición adecuada la cadena hidrocarbonada dicarbonyl that incorporates the hydrocarbon chain in the proper position
- 5 5
- carboxilada que constituye el espaciador del compuesto de fórmula (1) en carboxylated constituting the spacer of the compound of formula (1) in
- cuestión. Una vez preparado este intermedio se completa la elaboración del question. Once this intermediate is prepared, the preparation of the
- anillo de pirimidina a través de una reacción de condensación de los grupos pyrimidine ring through a condensation reaction of the groups
- carbonilo con los grupos amino de la fenilguanidina. Tal como se ilustra en la carbonyl with the amino groups of phenylguanidine. As illustrated in the
- Figura 3, la preparación del compuesto 1 ,3-dicarbonílico (15) se lleva a cabo a Figure 3, the preparation of the 1,3-dicarbonyl compound (15) is carried out at
- 1 O 1 o
- través de la reacción de acilación del 3-ciclopropil-3-oxopropanoato de alilo through the acylation reaction of allyl 3-cyclopropyl-3-oxopropanoate
- (12), obtenido vía condensación de Claisen de la ciclopropilmetilcetona (10) (12), obtained via Claisen condensation of cyclopropylmethyl ketone (10)
- con carbonato de dialilo (11) en medio básico, con el 6-cloro-6-oxohexanoato with diallyl carbonate (11) in basic medium, with 6-chloro-6-oxohexanoate
- de metilo (13), seguido de reacción de desalilación-descarboxilativa catalizada methyl (13), followed by catalyzed desalylation-decarboxylation reaction
- por Pd(O). La condensación de la 1 ,3-dicetona (15), que existe en un equilibrio by Pd (O). The condensation of 1,3-diketone (15), which exists in a balance
- 15 fifteen
- tautomérico en el que básicamente predomina la forma enólica, con el nitrato tautomeric in which basically the enol form predominates, with nitrate
- de la fenilguanidina (16) en medio básico genera el esqueleto completo del of the phenylguanidine (16) in basic medium generates the complete skeleton of the
- hapteno cuya síntesis finaliza con la hidrólisis del éster metílico de (17) en hapten whose synthesis ends with the hydrolysis of the methyl ester of (17) in
- medio básico acuoso. A continuación se ilustran los detalles de la preparación y basic watery medium. The details of the preparation are illustrated below and
- caracterización de este compuesto (18) y todos los intermedios de su síntesis. characterization of this compound (18) and all the intermediates of its synthesis.
- 20 twenty
- i) Preparación de/3-cic/opropi/-3-oxopropanoato de alilo (12) i) Preparation of / 3-cic / opropi / -3-allyl oxopropanoate (12)
- Carbonato de dialilo (11, 1.0 g, 2.55 mL, 17.82 mmol, 1.5 equiv.) y Diallyl Carbonate (11.0.0 g, 2.55 mL, 17.82 mmol, 1.5 equiv.) And
- 1-ciclopropiletanona (10, 1.17 mL, 11.88 mmol, 1 equiv.) se añadieron 1-Cyclopropyletanone (10, 1.17 mL, 11.88 mmol, 1 equiv.) Were added
- sucesivamente a una suspensión agitada de HNa (dispersión al 60% en aceite successively to a stirred suspension of HNa (60% dispersion in oil
- mineral, 1.19 g, 29.75 mmol, 2.5 equiv.) en benceno anhidro (5 mL) a mineral, 1.19 g, 29.75 mmol, 2.5 equiv.) in anhydrous benzene (5 mL) at
- 25 25
- temperatura ambiente bajo nitrógeno y la mezcla se refluyó durante 5 h. La room temperature under nitrogen and the mixture was refluxed for 5 h. The
- mezcla de reacción se enfrió a O °C, se trató cuidadosamente con disolución reaction mixture was cooled to 0 ° C, carefully treated with solution
- acuosa de HCI 3 M hasta pH ácido y se extrajo con CH2CI2. Los extractos aqueous 3M HCI until acidic pH and extracted with CH2CI2. Extracts
- orgánicos se lavaron con disolución saturada de NaCI, se secaron con MgS04 The organics were washed with saturated NaCl solution, dried with MgSO4
- anhidro y se concentraron a sequedad. El residuo obtenido se purificó por anhydrous and concentrated to dryness. The obtained residue was purified by
- 30 30
- cromatografía sobre gel de sílice, usando hexano-EhO 9:1 como eluyente, chromatography on silica gel, using hexane-EhO 9: 1 as eluent,
- para proporcionar el {3-cetoéster 12 (1.36 g, 60%) como un aceite. RMN de 1H to provide {3-ketoester 12 (1.36 g, 60%) as an oil. 1H NMR
- (CDCb) 6 (ppm) 5.88 (1H, ddt, J =17.2, 10.4, 5.7 Hz, H-2 alilo), 5.32 (1H, ddt, J (CDCb) 6 (ppm) 5.88 (1H, ddt, J = 17.2, 10.4, 5.7 Hz, H-2 allyl), 5.32 (1H, ddt, J
- = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, H-3 alilo), 5.23 (1H, ddt, J = 10.4, 1.5, 1.4 Hz, H'-3 alilo), = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, H-3 allyl), 5.23 (1H, ddt, J = 10.4, 1.5, 1.4 Hz, H'-3 allyl),
- 4.62 (2H, dt, J = 5.7, 1.4 Hz, H-1 alilo), 3.58 ( 2H, s, H-2), 2.02 (1H, tt, J = 4.5, 4.62 (2H, dt, J = 5.7, 1.4 Hz, H-1 allyl), 3.58 (2H, s, H-2), 2.02 (1H, tt, J = 4.5,
- 5 5
- 4.4 Hz, CH-ciclopropilo), 1.09 y 0.95 (2H cada uno, cada uno m, CH2CH2- 4.4 Hz, CH-cyclopropyl), 1.09 and 0.95 (2H each, each m, CH2CH2-
- ciclopropilo); RMN de 13C (CDCb) 6 (ppm) 202.4 (C-1), 166.6 (C-3), 131.5 (C-2 cyclopropyl); 13C NMR (CDCb) 6 (ppm) 202.4 (C-1), 166.6 (C-3), 131.5 (C-2
- alilo), 118.4 (C-3 alilo), 65.6 (C-1 alilo), 49.6 (C-2), 20.6 (CH-ciclopropilo), 11.5 allyl), 118.4 (C-3 allyl), 65.6 (C-1 allyl), 49.6 (C-2), 20.6 (CH-cyclopropyl), 11.5
- (CH2CH2-ciclopropilo); IR (NaCI) Vmaxlcm-13088, 3012, 2943, 1736, 1707, 1649, (CH2CH2-cyclopropyl); IR (NaCI) Vmaxlcm-13088, 3012, 2943, 1736, 1707, 1649,
- 1442,1385,1312,1271,1151,1074,992,933,735. 1442,1385,1312,1271,1151,1074,992,933,735.
- 1o 1st
- ii) Preparación del (E)-2-( cic/opropanocarbonil)-3-hidroxioct-2-enodioato de ii) Preparation of (E) -2- (cic / opropanocarbonyl) -3-hydroxioct-2-enodioate
- 1-a/i/-8-meti/o (14) 1-a / i / -8-meti / o (14)
- El {3-cetoéster 12 (288.3 mg, 1.5 mmol) se añadió sobre una suspensión The {3-ketoester 12 (288.3 mg, 1.5 mmol) was added on a suspension
- agitada de MgCI2 (142.8 mg, 1.5 mmol) en CH2Cb seco (2 mL) a temperatura Stirring MgCl2 (142.8 mg, 1.5 mmol) in dry CH2Cb (2 mL) at temperature
- ambiente bajo nitrógeno. La mezcla de reacción se enfrió a O °C, se añadió low nitrogen environment. The reaction mixture was cooled to 0 ° C, added
- 15 fifteen
- piridina seca (243 !JL, 3 mmol) y la mezcla resultante se agitó a esta Dry pyridine (243! JL, 3 mmol) and the resulting mixture was stirred at this
- temperatura durante 15 min. A continuación se añadió cloruro de adipoilo (13, temperature for 15 min. Then adipoyl chloride (13,
- 234 !JL, 1.5 mmol) y se agitó a O oc durante 15 min y luego a temperatura 234! JL, 1.5 mmol) and stirred at O oc for 15 min and then at temperature
- ambiente durante 1 h. Después de adicionar HCI 6 M (3 mL) a la suspensión ambient for 1 h. After adding 6M HCI (3 mL) to the suspension
- blanquecina formada, la mezcla se extrajo con EhO, los extractos orgánicos se whitish formed, the mixture was extracted with EhO, the organic extracts were
- 20 twenty
- lavaron con disolución saturada de NaCI y se secaron sobre MgS04 anhidro. washed with saturated NaCl solution and dried over anhydrous MgSO4.
- La purificación cromatográfica del residuo obtenido, utilizando hexano-EtOAc Chromatographic purification of the residue obtained, using hexane-EtOAc
- 9:1 como eluyente, proporcionó un aceite amarillento correspondiente a la 9: 1 as eluent, provided a yellowish oil corresponding to the
- /3-dicetona esperada, la cual existe exclusivamente en la forma tautomérica / 3-expected diketone, which exists exclusively in the tautomeric form
- ceto-enólica 14 (457.5 mg, 98%). RMN de 1H (CDCb) 6 (ppm) 5.98 (1 H, ddt, J keto-enol 14 (457.5 mg, 98%). 1 H NMR (CDCb) 6 (ppm) 5.98 (1 H, ddt, J
- 25 25
- =17.2, 10.4, 5.9 Hz, H-2 alilo), 5.32 (1H, ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, H-3 alilo), = 17.2, 10.4, 5.9 Hz, H-2 allyl), 5.32 (1H, ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, H-3 allyl),
- 5.23 (1 H, ddt, J = 10.4, 1.3, 1.3 Hz, H'-3 alilo), 4.72 (2H, dt, J = 5.9, 1.3 Hz, H-1 5.23 (1 H, ddt, J = 10.4, 1.3, 1.3 Hz, H'-3 allyl), 4.72 (2H, dt, J = 5.9, 1.3 Hz, H-1
- alilo), 2.60 (2H, m, H-7), 2.31 (3H, m, H-4yCH-ciclopropilo), 1.66 (4H, m, Hallyl), 2.60 (2H, m, H-7), 2.31 (3H, m, H-4yCH-cyclopropyl), 1.66 (4H, m, H
- 5yH-6), 1.22 y0.99 (2H cada uno, cada uno m, CH2CH2-ciclopropilo). RMN de 5yH-6), 1.22 and 0.99 (2H each, each m, CH2CH2-cyclopropyl). NMR of
- 13C (CDCb) 6 (ppm) 199.2 (CO-ciclopropilo), 195.0 (C-3), 173.8 (C02Me), 167.4 13C (CDCb) 6 (ppm) 199.2 (CO-cyclopropyl), 195.0 (C-3), 173.8 (C02Me), 167.4
- 30 30
- (C-1), 131.7 (C-2 alilo), 119.1 (C-3 alilo), 108.6 (C-2), 65.7 (C-1 alilo), 51.5 (C-1), 131.7 (C-2 allyl), 119.1 (C-3 allyl), 108.6 (C-2), 65.7 (C-1 allyl), 51.5
(C02Me), 36.6 (C-4), 33.7 (C-7), 25.4 (C-6), 24.5 (C-5), 16.6 (CH-ciclopropilo), (C02Me), 36.6 (C-4), 33.7 (C-7), 25.4 (C-6), 24.5 (C-5), 16.6 (CH-cyclopropyl),
12.1 (CH2CH2-ciclopropilo); IR (NaCI) Vmaxlcm-13087, 3014, 2952, 2873, 1735, 1560, 1437, 1271, 1208, 1101, 1062, 936, 737; EM (lE) m/z(%) 310 (M+, 0.7), 282 (0.6), 252 (1), 253 (0.5), 251 (0.4), 226 (2.5), 220 (0.4), 195 (4), 143 (6.4), 126 (10), 111 (30), 69 (100); EMAR m/z calculado para C16H220s 310.14164, encontrado 310.14148. 12.1 (CH2CH2-cyclopropyl); IR (NaCI) Vmaxlcm-13087, 3014, 2952, 2873, 1735, 1560, 1437, 1271, 1208, 1101, 1062, 936, 737; MS (lE) m / z (%) 310 (M +, 0.7), 282 (0.6), 252 (1), 253 (0.5), 251 (0.4), 226 (2.5), 220 (0.4), 195 (4 ), 143 (6.4), 126 (10), 111 (30), 69 (100); EMAR m / z calculated for C16H220s 310.14164, found 310.14148.
iii) Preparación de (Z)-8-ciclopropil-6-hidroxi-8-oxooct-6-enoato de metilo (15) iii) Preparation of methyl (Z) -8-cyclopropyl-6-hydroxy-8-oxooct-6-enoate (15)
Sobre una disolución del éster alílico 14 (431 mg, 1.388 mmol) en THF (5.8 ml) se añadieron Pd(PPh3)4 (105.6 mg, 0.091 mmol, 0.06 equiv.) y morfolina (254 IJL, 2.916 mmol, 2 equiv.) gota a gota. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó a esta temperatura durante 40 min. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, usando hexano-EhO 9:1 como eluyente, para dar el ceto-enol15 (285.8 mg, 91%), que existe en equilibrio con la forma tautomérica 6,8-dicetónica [aproximadamente una mezcla 4:1 de la forma ceto-enol 15 y el tautómero 6,8-dicetónico]. RMN de 1H (CDCI3) o(ppm) Pd (PPh3) 4 (105.6 mg, 0.091 mmol, 0.06 equiv.) And morpholine (254 IJL, 2,916 mmol, 2 equiv.) Were added on a solution of the allyl ester 14 (431 mg, 1,388 mmol) in THF (5.8 ml). ) drop by drop. The reaction mixture was allowed to warm to room temperature and stirred at this temperature for 40 min. The solvent was removed under reduced pressure and the residue obtained was purified by chromatography on silica gel, using hexane-EhO 9: 1 as eluent, to give the keto-enol15 (285.8 mg, 91%), which exists in equilibrium with the 6,8-diketonic tautomeric form [approximately a 4: 1 mixture of the keto-enol 15 form and the 6,8-diketonic tautomer]. 1H NMR (CDCI3) or (ppm)
15.63 (0.8H, s, OH, forma ceto-enol), 5.60 (0.8H, s, H-7 forma ceto-enol), 3.67 (3H, s, C02Me formas ceto-enol + diceto), 3.66 (0.4H, s, H-7 forma diceto), 2.51 (0.4H, m, H-5 forma ceto), 2.34 (2H, t, J =7.1 Hz, H-2 formas ceto-enol + diceto), 2.26 (1.6H, t, J = 7.1 Hz, H-5 forma ceto-enol), 2.0 (0.2H, m, CHciclopropilo forma diceto), 1.55-1.51 (4.8H, m, H-3 y H-4 formas ceto-enol + diceto y CH-ciclopropilo forma ceto-enol), 1.09 y0.92 (2H cada uno, cada uno m, CH2CH2-ciclopropilo formas ceto-enol + diceto); RMN de 13C (CDCb) (solo se dan las señales del tautómero ceto-enol mayoritario 15) o(ppm) 199.0 (C-8), 15.63 (0.8H, s, OH, keto-enol form), 5.60 (0.8H, s, H-7 keto-enol form), 3.67 (3H, s, C02Me keto-enol + dike form), 3.66 (0.4H , s, H-7 dike form), 2.51 (0.4H, m, H-5 keto form), 2.34 (2H, t, J = 7.1 Hz, H-2 keto-enol forms + dike), 2.26 (1.6H , t, J = 7.1 Hz, H-5 form keto-enol), 2.0 (0.2H, m, CHcyclopropyl form diketo), 1.55-1.51 (4.8H, m, H-3 and H-4 forms keto-enol + diceto and CH-cyclopropyl form keto-enol), 1.09 and 0.92 (2H each, each m, CH2CH2-cyclopropyl forms keto-enol + diketo); 13C NMR (CDCb) (only signals from the major keto-enol tautomer 15) or (ppm) 199.0 (C-8) are given,
187.3 (C-6), 173.7 (C02Me), 98.8 (C-7), 51.5 (C02Me) 36.3 (C-5), 33.6 (C-2), 187.3 (C-6), 173.7 (C02Me), 98.8 (C-7), 51.5 (C02Me) 36.3 (C-5), 33.6 (C-2),
25.3 (C-3), 24.3 (C-4), 18.5 (CH-ciclopropilo), 10.2 (CH2CH2-ciclopropilo); IR (NaCI) Vmaxlcm-1 3008, 2945, 2863, 1735, 1609, 1440, 1377, 932, 777. 25.3 (C-3), 24.3 (C-4), 18.5 (CH-cyclopropyl), 10.2 (CH2CH2-cyclopropyl); IR (NaCI) Vmaxlcm-1 3008, 2945, 2863, 1735, 1609, 1440, 1377, 932, 777.
iv) Preparación de 5-(6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-il)pentanoato de metilo (17) iv) Preparation of methyl 5- (6-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl) pentanoate (17)
Una mezcla del nitrato de la fenilguanidina 16 (289.1 mg, 1.459 mmol, 1.6 equiv.), Na2C03 (76.3 mg, 0.72 mmol, 0.8 equiv.) y el ceto-enol 15 (203.6 mg, A mixture of phenylguanidine 16 nitrate (289.1 mg, 1,459 mmol, 1.6 equiv.), Na2C03 (76.3 mg, 0.72 mmol, 0.8 equiv.) And keto-enol 15 (203.6 mg,
0.90 mmol) en MeOH (2.5 mL) se calentó a 80 oc con agitación en una ampolla cerrada durante 24 h. La mezcla de reacción se vertió sobre agua y se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se lavaron con disolución acuosa saturada de NaCI, se secó sobre Na2S04 anhidro y se concentraron para dar un residuo aceitoso que se purificó cromatográficamente sobre gel de sílice, usando hexano-EtOAc 9:1 como eluyente, proporcionando el derivado pirimidínico 17 0.90 mmol) in MeOH (2.5 mL) was heated to 80 oc with stirring in a closed vial for 24 h. The reaction mixture was poured into water and extracted with EtOAc. The organic extracts were washed with saturated aqueous NaCl solution, dried over anhydrous Na2S04 and concentrated to give an oily residue which was chromatographically purified on silica gel, using 9: 1 hexane-EtOAc as eluent, providing the pyrimidine derivative 17
(231.3 mg, 79%) como un aceite. RMN de 1H (CDCb) 5 (ppm) 7.62 (2H, aparente dd, parte AA' de un sistema AA'88'C, J= 7.5, 0.9 Hz, H-2/H-6 Ph), (231.3 mg, 79%) as an oil. 1H NMR (CDCb) 5 (ppm) 7.62 (2H, apparent dd, part AA 'of an AA'88'C system, J = 7.5, 0.9 Hz, H-2 / H-6 Ph),
7.30 (2H, aparente t, parte 88' de un sistema AA'88'C, J = 7.5 Hz, H-3/H-5 Ph), 7.30 (2H, apparent t, part 88 'of an AA'88'C system, J = 7.5 Hz, H-3 / H-5 Ph),
7.01 (1 H, sa, NH), 6.97 (1 H, aparente tt, parte C de un sistema AA'88'C, J = 7.5, 0.9 Hz, H-4 Ph), 6.49 (1 H, s, H-5 Pirim), 3.67 (3H, s, C02Me), 2.59 (2H, t, J =7.2 Hz, H-5), 2.36 (2H, t, J =7.2 Hz, H-2), 1.86 (1 H, m, CH-ciclopropilo), 1.72 (4H, m, H-3 yH-4), 1.15 y 0.98 (2H cada uno, cada uno m, CH2CH2ciclopropilo); RMN de 13C (CDCb) 5 (ppm) 173.9 (C02Me), 172.5 (C-4 Pirim), 7.01 (1 H, sa, NH), 6.97 (1 H, apparent tt, part C of an AA'88'C system, J = 7.5, 0.9 Hz, H-4 Ph), 6.49 (1 H, s, H -5 Pirim), 3.67 (3H, s, C02Me), 2.59 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-5), 2.36 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-2), 1.86 (1 H , m, CH-cyclopropyl), 1.72 (4H, m, H-3 and H-4), 1.15 and 0.98 (2H each, each m, CH2CH2cyclopropyl); 13C NMR (CDCb) 5 (ppm) 173.9 (C02Me), 172.5 (C-4 Pirim),
169.8 (C-2 Pirim), 159.8 (C-6 Pirim), 140.1 (C-1 Ph), 128.7 (C-3/C-5 Ph), 121.6 (C-4 Ph), 118.4 (C-2/C-6 Ph), 109.5 (C-5 Pirim), 51.5 (C02Me), 37.1 (C-5), 33.8 (C-2), 27.9 (C-4), 24.5 (C-3), 16.8 (CH-ciclopropilo), 10.3 (CH2CH2-ciclopropilo); IR (NaCI)Vmaxlcm-13356, 3002, 2939, 2856, 1730, 1584, 1443, 1249, 1026, 754; EM (lE) m/z(%) 325 (M+, 17), 324 (4), 295 (2), 294 (8), 266 (4), 252 (13), 226 (16), 225 (1 00), 224 (11 ), 178 (3); EMAR m/z calculado para C1sH23N302 325.17903, encontrado 325.17933. 169.8 (C-2 Pirim), 159.8 (C-6 Pirim), 140.1 (C-1 Ph), 128.7 (C-3 / C-5 Ph), 121.6 (C-4 Ph), 118.4 (C-2 / C-6 Ph), 109.5 (C-5 Pirim), 51.5 (C02Me), 37.1 (C-5), 33.8 (C-2), 27.9 (C-4), 24.5 (C-3), 16.8 (CH -cyclopropyl), 10.3 (CH2CH2-cyclopropyl); IR (NaCI) Vmaxlcm-13356, 3002, 2939, 2856, 1730, 1584, 1443, 1249, 1026, 754; MS (lE) m / z (%) 325 (M +, 17), 324 (4), 295 (2), 294 (8), 266 (4), 252 (13), 226 (16), 225 (1 00), 224 (11), 178 (3); EMAR m / z calculated for C1sH23N302 325.17903, found 325.17933.
v) Preparación del ácido 5-(6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-i/) pentanoico (18, compuesto de fórmula(/) CDb5) v) Preparation of 5- (6-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-i /) pentanoic acid (18, compound of formula (/) CDb5)
Una disolución del éster metílico 17 (159 mg, 0.488 mmol) en una mezcla de MeOH (5.3 mL) y disolución acuosa de NaOH 2 M (0.98 mL, 1.96 mmol, 4 equiv.) se agitó a 60 °C durante 1.5 h. La mayor parte del disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo resultante se disolvió en la mínima cantidad de ácido fórmico y la disolución resultante se concentró de nuevo a vacío. El residuo sólido blanco obtenido se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, usando CHCI3-Et0Ac 9:1 como eluyente, para dar el compuesto CDb5 (18, A solution of the methyl ester 17 (159 mg, 0.488 mmol) in a mixture of MeOH (5.3 mL) and 2M aqueous NaOH solution (0.98 mL, 1.96 mmol, 4 equiv.) Was stirred at 60 ° C for 1.5 h. Most of the solvent was removed under reduced pressure and the resulting residue was dissolved in the minimum amount of formic acid and the resulting solution was concentrated again in vacuo. The white solid residue obtained was purified by chromatography on silica gel, using CHCI3-Et0Ac 9: 1 as eluent, to give compound CDb5 (18,
129.3 mg, 85%) como un sólido blanco, prácticamente puro por análisis de RMN de 1H y cromatografía de capa fina. Pf 158-160 oc (cristalizado de benceno); RMN de 1H (DMSO-d6) 5 (ppm) 12.02 (1 H, s, COOH), 9.32 (1 H, s, NH), 7.74 (2H, aparente dd, parte AA' de un sistema AA'88'C, J = 7.7, 0.9 Hz, H-2/H-6 Ph), 7.23 (2H, aparente t, parte 88' de un sistema AA'88'C, J =7.7 Hz, H-3/H-5 Ph), 6.88 (1 H, aparente tt, parte C de un sistema AA'88'C, J =7.3, 0.9 Hz, H-4 Ph), 6.67 (1 H, s, H-5 Pirim), 2.54 (2H, t, J = 7.3 Hz, H-5), 2.25 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-2), 1.95 (1 H, m, CH-ciclopropilo), 1.67 (2H, m, H-4), 1.54 (2H, m, H-3), 1.03-0.97 (4H, m, CH2CH2-ciclopropilo); RMN de 13C (DMSO-ds) 5 (ppm) 129.3 mg, 85%) as a white solid, practically pure by 1 H NMR analysis and thin layer chromatography. Mp 158-160 oc (crystallized from benzene); 1 H NMR (DMSO-d6) 5 (ppm) 12.02 (1 H, s, COOH), 9.32 (1 H, s, NH), 7.74 (2H, apparent dd, part AA 'of an AA'88'C system , J = 7.7, 0.9 Hz, H-2 / H-6 Ph), 7.23 (2H, apparent t, part 88 'of an AA'88'C system, J = 7.7 Hz, H-3 / H-5 Ph ), 6.88 (1 H, apparent tt, part C of an AA'88'C system, J = 7.3, 0.9 Hz, H-4 Ph), 6.67 (1 H, s, H-5 Pirim), 2.54 (2H , t, J = 7.3 Hz, H-5), 2.25 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-2), 1.95 (1 H, m, CH-cyclopropyl), 1.67 (2H, m, H-4 ), 1.54 (2H, m, H-3), 1.03-0.97 (4H, m, CH2CH2-cyclopropyl); 13C NMR (DMSO-ds) 5 (ppm)
174.3 (C02H), 171.6 (C-4 Pirim), 169.7 (C-2 Pirim), 159.8 (C-6 Pirim), 140.9 (C1 Ph), 128.3 (C-3/C-5 Ph), 120.7 (C-4 Ph), 118.3 (C-2/C-6 Ph), 108.8 (C-5 Pirim), 36.4 (C-5), 33.4 (C-2), 27.5 (C-4), 24.1 (C-3), 16.4 (CH-ciclopropilo), 9.9 (CH2CH2-ciclopropilo); IR (K8r) Vmaxlcm-1 3290, 3138, 2936, 2360, 1684, 1590, 1558, 1499, 1386, 1250, 970, 756, 689; EM (lE) m/z(%) 311 (M+, 24), 310(4), 309 (2), 266 (4), 265 (6), 264 (14), 250 (4), 238 (11), 226 (14), 224 (16), 225 (1 00), 21 O(4.5); EMAR m/z calculado para C1aH21 N302 311.16338, encontrado 311.16254. 174.3 (C02H), 171.6 (C-4 Pirim), 169.7 (C-2 Pirim), 159.8 (C-6 Pirim), 140.9 (C1 Ph), 128.3 (C-3 / C-5 Ph), 120.7 (C -4 Ph), 118.3 (C-2 / C-6 Ph), 108.8 (C-5 Pirim), 36.4 (C-5), 33.4 (C-2), 27.5 (C-4), 24.1 (C- 3), 16.4 (CH-cyclopropyl), 9.9 (CH2CH2-cyclopropyl); IR (K8r) Vmaxlcm-1 3290, 3138, 2936, 2360, 1684, 1590, 1558, 1499, 1386, 1250, 970, 756, 689; MS (lE) m / z (%) 311 (M +, 24), 310 (4), 309 (2), 266 (4), 265 (6), 264 (14), 250 (4), 238 (11 ), 226 (14), 224 (16), 225 (1 00), 21 O (4.5); EMAR m / z calculated for C1aH21 N302 311.16338, found 311.16254.
Ejemplo 4. Síntesis de CDn5 (21) [radical del tipo T= R-V] Example 4. Synthesis of CDn5 (21) [radical of type T = R-V]
La síntesis del compuesto de fórmula (1) que incorpora el espaciador por el nitrógeno amínico de ciprodinil se lleva a cabo a través de una reacción de alquilación del anión amiduro derivado del mismo con el w-bromo éster de longitud de cadena adecuada, seguido de hidrólisis básica del grupo éster al correspondiente ácido carboxílico, tal como se ilustra en la Figura 4 y se detalla a continuación. The synthesis of the compound of formula (1) that incorporates the spacer by cyprodinyl amine nitrogen is carried out through an alkylation reaction of the amide anion derived therefrom with the w-bromine ester of suitable chain length, followed by Basic hydrolysis of the ester group to the corresponding carboxylic acid, as illustrated in Figure 4 and detailed below.
i) Preparación del 5-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il) (fenil)amino)pentanoato de metilo (20) i) Preparation of methyl 5 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino) pentanoate (20)
- Una disolución de ciprodinil (170 mg, 0,754 mmol) en DMF anhidra (3 mL) se A solution of ciprodinil (170 mg, 0.754 mmol) in anhydrous DMF (3 mL) is
- añadió gota a gota sobre una disolución agitada de NaOH (60% dispersión en added dropwise on a stirred solution of NaOH (60% dispersion in
- aceite mineral, 36.9 mg, 0.925 mmol, 1.2 equiv., prelavado con pentano seco) mineral oil, 36.9 mg, 0.925 mmol, 1.2 equiv., prewash with dry pentane)
- en DMF (2 mL) a O oc bajo nitrógeno. Después de 30 min de agitación a esta in DMF (2 mL) at O oc under nitrogen. After 30 min stirring at this
- 5 5
- temperatura la mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura temperature the reaction mixture was allowed to warm to temperature
- ambiente y se agitó durante 15 min adicionales. A continuación se añadió 5ambient and stirred for an additional 15 min. Then 5 was added
- bromoisovalerato de metilo (19, 0.224 mL, 1.51 mmol, 2 equiv.) y la mezcla se methyl bromoisovalerate (19, 0.224 mL, 1.51 mmol, 2 equiv.) and the mixture is
- agitó a temperatura ambiente durante 72 h. Transcurrido este tiempo la mezcla stirred at room temperature for 72 h. After this time the mixture
- de reacción se vertió sobre agua y se extrajo con EtOAc. Los extractos The reaction was poured onto water and extracted with EtOAc. Extracts
- 1 O 1 o
- orgánicos combinados se lavaron sucesivamente con disoluciones acuosas combined organics were washed successively with aqueous solutions
- saturadas de LiCI y Na, se secaron sobre Na2S04 y se concentraron a vacío. El saturated with LiCI and Na, dried over Na2S04 and concentrated in vacuo. He
- residuo obtenido se cromatografió sobre gel de sílice, usando hexano-EtOAc residue obtained was chromatographed on silica gel, using hexane-EtOAc
- 9:1 como eluyente, obteniéndose una mezcla aproximadamente 7:3 (basado en 9: 1 as eluent, obtaining a mixture approximately 7: 3 (based on
- el análisis de RMN de 1H) del éster y el material de partida no reaccionado que 1 H NMR analysis) of the ester and the unreacted starting material that
- 15 fifteen
- no pudo separarse por las técnicas cromatográficas convencionales (203.4 could not be separated by conventional chromatographic techniques (203.4
- mg). mg)
- íi) Preparación del ácido 5-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-i/)(fenil)amino) i) Preparation of the acid 5 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-i /) (phenyl) amino)
- pentanoico (21, compuesto de fórmula (/) CDn5) pentanoic (21, compound of formula (/) CDn5)
- Se añadió LiOH·H20 (158.4 mg, 3.80 mmol) a una disolución de la mezcla LiOH · H20 (158.4 mg, 3.80 mmol) was added to a solution of the mixture
- 20 twenty
- previamente obtenida (200 mg, ca. 0.41 mmol de 20) en THF (3.3 mL) y agua previously obtained (200 mg, ca. 0.41 mmol of 20) in THF (3.3 mL) and water
- (1.5 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 hy (1.5 mL). The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h.
- el THF se eliminó a presión reducida en un rotavapor. El residuo obtenido se THF was removed under reduced pressure on a rotary evaporator. The residue obtained is
- diluyó con agua (4 mL), se acidificó por la adición de KHS04 sólido hasta pH 3diluted with water (4 mL), acidified by the addition of solid KHS04 to pH 3
- 4 y se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se secaron 4 and extracted with EtOAc. The combined organic extracts were dried
- 25 25
- sobre Na2S04 anhidro y se concentraron para obtener un residuo que se over anhydrous Na2S04 and concentrated to obtain a residue that
- purificó por cromatografía sobre gel de sílice, usando CHCb-MeOH 9:1 como purified by chromatography on silica gel, using CHCb-MeOH 9: 1 as
- eluyente, para proporcionar, en orden de elución, ciprodinil de partida no eluent, to provide, in order of elution, starting cyprodinyl no
- reaccionado (53 mg) y el compuesto deseado CDn5 (21, 132.6 mg, 54% a reacted (53 mg) and the desired compound CDn5 (21, 132.6 mg, 54% at
- partir de ciprodinil) como un sólido. Pf 118-121 oc (cristalizado de hexanostarting from cyprodinyl) as a solid. Mp 118-121 oc (crystallized hexane
- 30 30
- benceno). RMN de 1H (300 MHz, CDCb) ó (ppm) 10.0 (1 H, sa, COOH), benzene). 1 H NMR (300 MHz, CDCb) or (ppm) 10.0 (1 H, sa, COOH),
7.37-7.17 (5H, m, Ph), 6.37 (1 H, s, H-5 Pirim), 3.99 (2H, t, J = 6.9 Hz, H-5), 2.37 (2H, t, J =6.9 Hz, H-2), 1.67 (4H, m, H-3 y H-4), 1.75 (1 H, m, CH-ciclopropilo), 7.37-7.17 (5H, m, Ph), 6.37 (1 H, s, H-5 Pirim), 3.99 (2H, t, J = 6.9 Hz, H-5), 2.37 (2H, t, J = 6.9 Hz , H-2), 1.67 (4H, m, H-3 and H-4), 1.75 (1 H, m, CH-cyclopropyl),
0.96 y 0.87 (2H cada uno, cada uno m, CH2CH2-ciclopropilo); RMN de 13C (75 MHz, CDCb) ó (ppm) 179.2 (C-1), 171.4 (C-2 Pirim), 166.2 (C-4 Pirim), 161.6 (C-6 Pirim), 144.6 (C-1 Ph), 128.6 (C-3/C-5 Ph), 127.4 (C-2/C-6 Ph), 125.1 (C-4 Ph), 108.5 (C-5 Pirim), 49.6 (C-5), 33.7 (C-2), 27.4 (C-4), 23.9 (Me), 21.9 (C-3), 0.96 and 0.87 (2H each, each m, CH2CH2-cyclopropyl); 13C NMR (75 MHz, CDCb) or (ppm) 179.2 (C-1), 171.4 (C-2 Pirim), 166.2 (C-4 Pirim), 161.6 (C-6 Pirim), 144.6 (C-1 Ph ), 128.6 (C-3 / C-5 Ph), 127.4 (C-2 / C-6 Ph), 125.1 (C-4 Ph), 108.5 (C-5 Pirim), 49.6 (C-5), 33.7 (C-2), 27.4 (C-4), 23.9 (Me), 21.9 (C-3),
16.5 (CH-ciclopropilo), 9.8 (CH2CH2-ciclopropilo); IR (KBr) Vmaxlcm-1 34002600,3009,2940,2861,1698,1574,1558,1473,1398,1307,1236,1100,959, 819, 702; EM (IE)m/z (%) 325 (M+, 25), 324 (11 ), 31 O (2), 253 (6), 252 (33), 250 (2.5), 239 (19), 238 (100), 225 (19), 224 (21), 222 (3), 210 (2), 163 (6); EMAR miz calculado para C1sH23N302 325.17903, encontrado 325.17857. 16.5 (CH-cyclopropyl), 9.8 (CH2CH2-cyclopropyl); IR (KBr) Vmaxlcm-1 34002600,3009,2940,2861,1698,1574,1558,1473,1398,1307,1236,1100,959, 819, 702; MS (IE) m / z (%) 325 (M +, 25), 324 (11), 31 O (2), 253 (6), 252 (33), 250 (2.5), 239 (19), 238 ( 100), 225 (19), 224 (21), 222 (3), 210 (2), 163 (6); EMAR miz calculated for C1sH23N302 325.17903, found 325.17857.
1.2. Activación de los compuestos de fórmula (1) 1.2. Activation of the compounds of formula (1)
Los ejemplos de compuestos de fórmula (1) aquí presentados contienen un grupo carboxilo como grupo químico funcional para su conjugación a proteínas portadoras, concretamente por reacción con los grupos amino libres de la proteína. El grupo carboxilo se activó según el esquema de la Figura 5, utilizando carbonato de N,N'-disuccinimidilo(DSC) siguiendo protocolos previamente publicados [F.A. Esteve-Turrillas et al., Anal. Chim. Acta2010, 682, 93-1 03]. En concreto, se disolvió 0.082 mmol del correspondiente compuesto de fórmula (1) de ciprodinil y 0.14 mmol de DSC en 0.8 mL de acetonitrilo seco en atmósfera de nitrógeno. A continuación, se añadió 0.31 mmol de trietilamina y se agitó a temperatura ambiente hasta la desaparición del material de partida (análisis por cromatografía de capa fina). La disolución se diluyó en cloroformo, se lavó con una disolución saturada de NaHC03 y salmuera y se secó con Na2S04 anhidro. Después de evaporar el disolvente, el residuo restante se purificó por cromatografía en columna, usando cloroformo como eluyente, obteniéndose el éster de N-hidroxisuccinimida del compuesto de fórmula (1) de ciprodinil en forma pura. Examples of compounds of formula (1) presented herein contain a carboxyl group as a functional chemical group for conjugation to carrier proteins, specifically by reaction with the free amino groups of the protein. The carboxyl group was activated according to the scheme of Figure 5, using N, N'-disuccinimidyl carbonate (DSC) following previously published protocols [F.A. Esteve-Turrillas et al., Anal. Chim. Minutes 2010, 682, 93-1 03]. In particular, 0.082 mmol of the corresponding compound of formula (1) of cyprodinyl and 0.14 mmol of DSC was dissolved in 0.8 mL of dry acetonitrile under a nitrogen atmosphere. Then, 0.31 mmol of triethylamine was added and stirred at room temperature until the starting material disappeared (analysis by thin layer chromatography). The solution was diluted in chloroform, washed with a saturated solution of NaHC03 and brine and dried over anhydrous Na2S04. After evaporating the solvent, the remaining residue was purified by column chromatography, using chloroform as eluent, obtaining the N-hydroxysuccinimide ester of the compound of formula (1) of cyprodinyl in pure form.
- 1.3. Conjugación de los compuestos obtener compuestos de fórmula (11) 1.3. Conjugation of the compounds obtain compounds of formula (11)
- de fórmula (1) a proteínas para from formula (one) to protein for
- 5 5
- Tampones y disoluciones: PB: Tampón fosfato sódico 100 mM,pH 7.4; PBS: Tampón fosfato sódico 10 mM, pH 7.4 con NaCI140 mM; PBST: Tampón PBS conteniendo 0.05% (v/v) de polioxietilen (20) sorbitanmonolaurato (conocido como Tween 20); CB: Tampón carbonato sódico 50 mM, pH 9.6; Disolución de lavado:NaCI 150mM conteniendo 0.05% (v/v) de Tween 20. Buffers and solutions: PB: 100 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4; PBS: 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4 with NaCl140 mM; PBST: PBS buffer containing 0.05% (v / v) of polyoxyethylene (20) sorbitanmonolaurate (known as Tween 20); CB: 50 mM sodium carbonate buffer, pH 9.6; Washing solution: 150mM NaCI containing 0.05% (v / v) Tween 20.
- 1o 1st
- Los analitos se disolvieron almacenaron a -20 °C. en N,N-dimetilformamida (DMF) anhidra y se The analytes were dissolved stored at -20 ° C. in Anhydrous N, N-dimethylformamide (DMF) and be
- Los compuestos de fórmula (11) se prepararon como se esquematiza en la Figura 5, según los procedimientos siguientes. The compounds of formula (11) were prepared as schematized in Figure 5, according to the following procedures.
- 1.3.1.1nmunógeno 1.3.1.1 immunogen
- 15 20 15 20
- A 2.0 mL de una disolución de 15 mg/mL de proteína albúmina de suero bovino (BSA) en tampón CB se añadió gota a gota 200 IJL de una disolución 50 mM de compuesto de fórmula (1) activado, obtenido tal como se indica en el apartado 1.2, en DMF. La reacción se llevó a cabo durante 4 h a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación, el conjugado se purificó por cromatografía de exclusión molecular usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación, n tal como se describe en el compuesto de fórmula (11), medido espectrofotométricamente fue de 11, 11, 14 y 14 para CDm6, CDp6, CDb5 y CDn5, respectivamente. At 2.0 mL of a 15 mg / mL solution of bovine serum albumin protein (BSA) in CB buffer, 200 IJL of a 50 mM solution of compound of formula (1) activated, obtained as indicated in Section 1.2, in DMF. The reaction was carried out for 4 h at room temperature with gentle stirring and then, the conjugate was purified by molecular exclusion chromatography using PB buffer as eluent. The degree of conjugation, n as described in the compound of formula (11), measured spectrophotometrically was 11, 11, 14 and 14 for CDm6, CDp6, CDb5 and CDn5, respectively.
- 1.3.2. Compuesto de fórmula (11) como antígeno de ensayo 1.3.2. Compound of formula (11) as test antigen
- 25 25
- A 2.0 mL de una disolución de 15 mg/mL de proteína albúmina de huevo (OVA) en tampón CB se añadió gota a gota 100 IJL de una disolución 100 mM de compuesto de fórmula (1) activado, obtenido tal como se indica en el apartado 1.2, en DMF. La reacción se llevó a cabo durante 2.5 ha temperatura To 2.0 mL of a 15 mg / mL solution of egg albumin protein (OVA) in CB buffer, 100 IJL of a 100 mM solution of activated compound of formula (1) was added dropwise, obtained as indicated in Section 1.2, in DMF. The reaction was carried out for 2.5 h at temperature
ambiente con agitación suave y a continuación, el compuesto de fórmula (11) se purificó por cromatografía de exclusión molecular usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación, n tal como se describe en el compuesto de fórmula (11), medido espectrofotométricamente fue de 8, 8, 8 y 9 para CDm6, CDp6, CDb5 y CDn5, respectivamente. ambient with gentle agitation and then, the compound of formula (11) was purified by molecular exclusion chromatography using PB buffer as eluent. The degree of conjugation, n as described in the compound of formula (11), measured spectrophotometrically was 8, 8, 8 and 9 for CDm6, CDp6, CDb5 and CDn5, respectively.
1.3.3. Trazador o antígeno enzimático 1.3.3. Enzyme tracer or antigen
A 1.0 mL de una disolución de 2.2 mg/mL de proteína peroxidasa de rábano picante (HRP) en tampón CB se añadió gota a gota 100 IJL de una disolución 10 mM (ó 5 mM) de compuesto de fórmula (1) activado, obtenido tal como se indica en el apartado 1.2, en DMF. La reacción se llevó a cabo durante 4 h a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación, el conjugado se purificó por cromatografía de exclusión molecular usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación, n tal como se describe en el compuesto de fórmula (11), medido espectrofotométricamente fue de 4, 6, 5 y 3 para CDm6, CDp6, CDb5 y CDn5, respectivamente. To 1.0 mL of a solution of 2.2 mg / mL of horseradish peroxidase protein (HRP) in CB buffer, 100 IJL of a 10 mM (or 5 mM) solution of compound of formula (1) activated, obtained, was added dropwise as indicated in section 1.2, in DMF. The reaction was carried out for 4 h at room temperature with gentle stirring and then, the conjugate was purified by molecular exclusion chromatography using PB buffer as eluent. The degree of conjugation, n as described in the compound of formula (11), measured spectrophotometrically was 4, 6, 5 and 3 for CDm6, CDp6, CDb5 and CDn5, respectively.
2. Inmunización de conejos 2. Immunization of rabbits
Se inmunizaron, siguiendo protocolos estandarizados, 2 hembras de conejo blancas de la raza New Zealand con cada inmunógeno que son compuestos de fórmula (11) donde P es BSA obtenidos tal como se describe en el apartado Two white rabbit females of the New Zealand breed were immunized following standardized protocols with each immunogen which are compounds of formula (11) where P is BSA obtained as described in section
1.3.1. [C. Suárez-Pantaleón et al., J. Agríe. Food Chem.2010, 58, 8502-8511]. Cada animal recibió 0.3 mg de uno de los inmunógenos disuelto en 1 mL de una mezcla 1:1 de tampón PB y adyuvante de Freund completo. La inmunización prosiguió con la inoculación de una dosis de recuerdo cada 21 días con la misma cantidad de inmunógeno pero empleando adyuvante de Freund incompleto. Diez días después de la cuarta inyección, los animales fueron desangrados y la sangre obtenida se dejó coagular a 4 °C durante toda la noche. Al día siguiente, se recuperaron los sueros por centrifugación, se diluyeron a ~ con PBS frío y se les añadió un volumen de una disolución saturada de sulfato amónico. El precipitado proteico resultante de cada suero se recogió por centrifugación y se redisolvió en tampón PBS frío. Finalmente, las proteínas se reprecipitaron como anteriormente y se almacenaron en este estado a 4°C. Este precipitado contiene una mezcla indeterminada de proteínas que denominamos antisuero, anticuerpo policlonal o simplemente anticuerpo. Se obtuvieron dos antisueros de cada inmunógeno, identificados como #1 y #2. 1.3.1. [C. Suárez-Pantaleón et al., J. Agríe. Food Chem. 2010, 58, 8502-8511]. Each animal received 0.3 mg of one of the immunogens dissolved in 1 mL of a 1: 1 mixture of PB buffer and complete Freund's adjuvant. Immunization continued with the inoculation of a booster dose every 21 days with the same amount of immunogen but using incomplete Freund's adjuvant. Ten days after the fourth injection, the animals were bled and the blood obtained was allowed to clot at 4 ° C overnight. The next day, the sera were recovered by centrifugation, diluted to ~ with cold PBS and a volume of a saturated solution of ammonium sulfate was added. The resulting protein precipitate from each serum was collected by centrifugation and redissolved in cold PBS buffer. Finally, the proteins were reprecipitated as before and stored in this state at 4 ° C. This precipitate contains an indeterminate mixture of proteins that we call antiserum, polyclonal antibody or simply antibody. Two antisera of each immunogen were obtained, identified as # 1 and # 2.
3. Procedimiento ELISA 3. ELISA procedure
Se emplearon placas de poliestireno de 96 pocillos. Cada antisuero se evaluó en los dos formatos clásicos de ELISA competitivo (el de antígeno o conjugado inmovilizado con detección indirecta y el de anticuerpo inmovilizado con detección directa) usando tanto antígenos de ensayo homólogos, es decir un antígeno de ensayo a partir del mismo compuesto de fórmula (1) que el utilizado para obtener el inmunógeno; como antígenos de ensayo heterólogos, es decir obtenidos a partir de un compuesto de fórmula (1) diferente al empleado para obtener el inmunógeno. Se emplearon pipetas electrónicas de 8 canales para la dispensación rápida y precisa de los inmunorreactivos. Después de cada etapa de incubación, las placas se lavaron cuatro veces con una disolución de lavado, usando un lavador de 96 canales ELx405 (Biotek lnstruments, Winooski, USA). La actividad peroxidasa usada como marcador se reveló con 100 1-JL por pocillo de una disolución 2 mg/mL de o-fenilendiamina en tampón 25 mM citrato sódico, 62 mM fosfato sódico, pH 5.4 conteniendo 0.012% (v/v) de H20 2. Este revelado se desarrolló durante 10 min a temperatura ambiente y se paró usando 100 1-JL por pocillo de H2S04 2.5 M. Al finalizar los ensayos, la absorbancia de cada pocillo se leyó a 492 nm usando una longitud de onda de referencia de 650 nm en un lector de microplacas PowerWave HT (Biotek lnstruments, Winooski, USA). Las curvas patrón sigmoideas obtenidas al representar la absorbancia frente a la concentración de analito se ajustaron a una ecuación logística de cuatro parámetros usando el paquete informático SigmaPiot de SPSS (Chicago, USA). El título del antisuero se definió como el recíproco de la dilución del antisuero que proporciona una señal máxima (Amax) de 1.0 en ausencia de analito libre en 96-well polystyrene plates were used. Each antiserum was evaluated in the two classic formats of competitive ELISA (the one of antigen or conjugate immobilized with indirect detection and the one of immobilized antibody with direct detection) using both homologous test antigens, that is to say a test antigen from the same compound of formula (1) than that used to obtain the immunogen; as heterologous test antigens, that is, obtained from a compound of formula (1) different from that used to obtain the immunogen. 8-channel electronic pipettes were used for rapid and accurate dispensing of immunoreactive agents. After each incubation step, the plates were washed four times with a wash solution, using a 96 channel ELx405 washer (Biotek lnstruments, Winooski, USA). The peroxidase activity used as a marker was revealed with 100 1-JL per well of a 2 mg / mL solution of o-phenylenediamine in 25 mM sodium citrate buffer, 62 mM sodium phosphate, pH 5.4 containing 0.012% (v / v) H20 2. This development was developed for 10 min at room temperature and stopped using 100 1-JL per well of H2S04 2.5 M. At the end of the tests, the absorbance of each well was read at 492 nm using a reference wavelength of 650 nm in a PowerWave HT microplate reader (Biotek lnstruments, Winooski, USA). The sigmoid standard curves obtained by representing absorbance versus analyte concentration were adjusted to a four-parameter logistic equation using the SPSS SigmaPiot software package (Chicago, USA). The antiserum titer was defined as the reciprocal of the antiserum dilution that provides a maximum signal (Amax) of 1.0 in the absence of free analyte in
- ensayo de ELISA competitivo en el formato de conjugado inmovilizado homólogo a 0.1 mg/mL con detección indirecta. La afinidad del anticuerpo (IC50) se estimó como la concentración de analito libre capaz de reducir a la mitad la señal máxima. Competitive ELISA assay in the immobilized conjugate format homologous at 0.1 mg / mL with indirect detection. The affinity of the antibody (IC50) was estimated as the concentration of free analyte capable of halving the maximum signal.
- 5 5
- 3.1. Ensayos ELISA competitivos en formato de antígeno inmovilizado con detección indirecta (ensayo indirecto) o conjugado 3.1. Competitive ELISA assays in immobilized antigen format with indirect detection (indirect assay) or conjugate
- 1O 15 20 1O 15 20
- Las placas se tapizaron con 100 ~L por pocillo de una disolución de antígeno de ensayo que es un compuesto de fórmula (11) donde Pes OVA a 0.01 o a 0.1 ~g/mL en tampón CB por incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas, en cada columna se dispensó 50 ~L por pocillo de una curva estándar completa delanalito en PBS seguido de 50 ~L por pocillo de una dilución concreta de un determinado antisuero en PBST. La misma distribución de reactivos se repitió para cada placa con un conjugado diferente. La reacción inmunoquímica se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron las placas. A continuación, cada pocillo recibió 100 ~L de una dilución 1/10000 de GAR-HRP en PBST conteniendo 10% de suero bovino fetal. Esta reacción se dejó a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar las placas, se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancia a 492 nm como se ha descrito anteriormente. The plates were upholstered with 100 µL per well of a test antigen solution which is a compound of formula (11) where Pes OVA at 0.01 or 0.1 ~ g / mL in CB buffer by overnight incubation at room temperature. After washing the plates, 50 ~ L per well of a complete standard delanalite curve in PBS was dispensed in each column followed by 50 ~ L per well of a specific dilution of a given antiserum in PBST. The same reagent distribution was repeated for each plate with a different conjugate. The immunochemical reaction was carried out for 1 h at room temperature and then the plates were washed. Next, each well received 100 ~ L of a 1/10000 dilution of GAR-HRP in PBST containing 10% fetal bovine serum. This reaction was left at room temperature for 1 h. After washing the plates, the retained peroxidase activity was revealed and the absorbance at 492 nm was read as described above.
- 3.2. Ensayos ELISA competitivos en formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa (ensayo directo) 3.2. Competitive ELISA assays in immobilized antibody format with direct detection (direct assay)
- 25 25
- Las placas se tapizaron con 100 ~L por pocillo de una dilución de antisuero en tampón CB por incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas, en cada columna se dispensó 50 ~L por pocillo de una curva estándar completa del analito en PBS seguido de 50 ~L por pocillo de una dilución concreta de un trazador enzimático determinado en PBST. La The plates were upholstered with 100 ~ L per well of a dilution of antiserum in CB buffer by incubation overnight at room temperature. After washing the plates, 50 L per well of a complete standard analyte curve in PBS was dispensed in each column followed by 50 L per well of a specific dilution of a given enzyme tracer in PBST. The
- misma distribución de reactivos se repitió para cada placa diferente. La reacción inmunoquímica se llevó a cabo Same reagent distribution was repeated for each different plate. The immunochemical reaction was carried out.
- con un antisuero durante 1 h a with an antiserum for 1 h at
- temperatura ambiente y después se lavaron las placas. Finalmente, se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancia a 492 nm como se ha descrito. room temperature and then the plates were washed. Finally, the retained peroxidase activity was revealed and the absorbance at 492 nm was read as described.
- 4. Resultados 4. Results
- 5 5
- 4.1. Respuesta inmune 4.1. Immune response
- Los cuatro inmunógenos de ciprodinil produjeron respuestas inmunes semejantes y equivalentes con títulos cercanos a 3x105 . En la Figura 6 se muestran las señales obtenidas con los diferentes antisueros en ensayos con antígeno de ensayo homólogo para diferentes diluciones del antisuero. The four immunogens of ciprodinil produced similar and equivalent immune responses with titers close to 3x105. The signals obtained with the different antisera in tests with homologous test antigen for different dilutions of the antiserum are shown in Figure 6.
- 1 O 1 o
- 4.1.1. Determinación de la afinidad de los anticuerpos 4.1.1. Determination of antibody affinity
- 15 20 25 15 20 25
- Cada uno de los antisueros obtenidos se ensayó frente a su antígeno de ensayo homólogo usando el ensayo de tipo ELISA competitivo, tanto en formato de ensayo de antígeno inmovilizado con detección indirecta como en el formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa. Se ensayaron diferentes concentraciones de antígeno de ensayo frente a diferentes concentraciones de antisuero en ensayo competitivo utilizando como competidor diferentes concentraciones de ciprodinil preparadas por dilución seriada. Solamente a partir de tres de los compuestos de fórmula (1) sintetizados, CDm6, CDp6 y CDb5, se obtuvieron anticuerpos capaces de reconocer al ciprodinil con elevada afinidad. Este resultado confirma que dichas estructuras son idóneas para el objetivo que se persigue y demuestra la dificultad para predecir la posición óptima de funcionalización de los compuestos de fórmula (1). Los valores de la señal máxima, la IC5o y de la pendiente de la curva de inhibición resultante para cada anticuerpo con su antígeno de ensayo homólogo se han incluido en las Tablas 1 (a-d) y las Tablas 2 (a-d). Each of the antisera obtained was tested against its homologous test antigen using the competitive ELISA type assay, both in immobilized antigen assay format with indirect detection and in the immobilized antibody format with direct detection. Different concentrations of test antigen were tested against different concentrations of antiserum in competitive assay using different concentrations of cyprodinyl prepared by serial dilution as a competitor. Only from three of the compounds of formula (1) synthesized, CDm6, CDp6 and CDb5, were antibodies able to recognize ciprodinyl with high affinity. This result confirms that these structures are suitable for the objective pursued and demonstrates the difficulty in predicting the optimal functionalization position of the compounds of formula (1). The maximum signal, IC5o and slope values of the resulting inhibition curve for each antibody with its homologous test antigen have been included in Tables 1 (a-d) and Tables 2 (a-d).
Resultado de los ensayos en formato ELISA competitivo de conjugado inmovilizado con detección indirecta:
Result of tests in competitive ELISA format of immobilized conjugate with indirect detection:
- Tabla 1a Table 1a
- OVA-CDm6 OVA-CDm6
- Antisuero Antiserum
- Conjugado (IJg/mL) Título As. (x103) Amax Pendiente ICso (nM) Conjugate (IJg / mL) Title As. (X103) Amax Pending ICso (nM)
- CDm6#1 CDm6 # 1
- 0.01 10 0.85 0.40 89.2 0.01 10 0.85 0.40 89.2
- 0.1 0.1
- 300 0.84 0.48 60.1 300 0.84 0.48 60.1
- CDm6#2 CDm6 # 2
- 0.01 10 1.04 0.55 36.9 0.01 10 1.04 0.55 36.9
- 0.1 0.1
- 300 0.96 0.52 25.5 300 0.96 0.52 25.5
- Tabla 1b Table 1b
- OVA-CDp6 OVA-CDp6
- Antisuero Antiserum
- Conjugado (IJg/mL) Título As. (x103) Amax Pendiente ICso (nM) Conjugate (IJg / mL) Title As. (X103) Amax Pending ICso (nM)
- CDp6#1 CDp6 # 1
- 0.01 10 0.93 0.58 17.2 0.01 10 0.93 0.58 17.2
- 0.1 0.1
- 100 1.27 0.47 25.8 100 1.27 0.47 25.8
- CDp6#2 CDp6 # 2
- 0.01 10 1.10 0.64 15.1 0.01 10 1.10 0.64 15.1
- 0.1 0.1
- 100 1.24 0.45 23.8 100 1.24 0.45 23.8
- Tabla 1c Table 1c
- OVA-CDb5 OVA-CDb5
- Antisuero Antiserum
- Conjugado (IJg/mL) Título As. (x1 03) Amax Pendiente ICso (nM) Conjugate (IJg / mL) Title As. (X1 03) Amax Pending ICso (nM)
- CDb5#1 CDb5 # 1
- 0.01 10 0.85 0.66 25.4 0.01 10 0.85 0.66 25.4
- 0.1 0.1
- 300 0.73 0.58 15.8 300 0.73 0.58 15.8
- CDb5#2 CDb5 # 2
- 0.01 10 1.04 0.63 31.5 0.01 10 1.04 0.63 31.5
- 0.1 0.1
- 300 0.89 0.56 15.8 300 0.89 0.56 15.8
- Tabla 1d 1d table
- OVA-CDn5 OVA-CDn5
- Antisuero Antiserum
- Conjugado (IJglmL) Título As. (x1 03) Amax Pendiente ICso (nM) Conjugate (IJglmL) Title As. (X1 03) Amax Pending ICso (nM)
- CDn5#1 CDn5 # 1
- 0.01 100 0.97 0.39 3356.7 0.01 100 0.97 0.39 3356.7
- 0.1 0.1
- 300 1.15 0.44 9555.8 300 1.15 0.44 9555.8
- CDn5#2 CDn5 # 2
- 0.01 100 0.95 0.01 100 0.95
- 0.1 0.1
- 300 1.21 0.95 6465.3 300 1.21 0.95 6465.3
Resultado de los ensayos en formato ELISA competitivo de anticuerpo inmovilizado con detección directa:
Result of tests in competitive ELISA format of immobilized antibody with direct detection:
- Tabla 2a Table 2a
- HRP-CDm6 HRP-CDm6
- Antisuero Antiserum
- Trazador (IJg/mL) Título As. (x103) Amax Pendiente ICso (nM) Plotter (IJg / mL) Title As. (X103) Amax Pending ICso (nM)
- CDm6#1 CDm6 # 1
- 3 10 1.18 0.47 19.8 3 10 1.18 0.47 19.8
- 3 3
- 30 0.73 0.40 4.8 30 0.73 0.40 4.8
- CDm6#2 CDm6 # 2
- 3 10 1.19 0.64 31.0 3 10 1.19 0.64 31.0
- 3 3
- 30 0.81 0.62 8.9 30 0.81 0.62 8.9
- Tabla 2b Table 2b
- HRP-CDp6 HRP-CDp6
- Antisuero Antiserum
- Trazador (IJg/mL) Título As. (x103) Amax Pendiente ICso (nM) Plotter (IJg / mL) Title As. (X103) Amax Pending ICso (nM)
- CDp6#1 CDp6 # 1
- 3 10 1.22 0.44 29.6 3 10 1.22 0.44 29.6
- 3 3
- 30 0.74 0.55 9.9 30 0.74 0.55 9.9
- CDp6#2 CDp6 # 2
- 3 10 1.26 0.49 27.3 3 10 1.26 0.49 27.3
- 3 3
- 30 0.92 0.64 7.8 30 0.92 0.64 7.8
- Tabla 2c Table 2c
- HRP-CDb5 HRP-CDb5
- Antisuero Antiserum
- Trazador (IJg/mL) Título As. (x103) Amax Pendiente ICso (nM) Plotter (IJg / mL) Title As. (X103) Amax Pending ICso (nM)
- CDb5#1 CDb5 # 1
- 3 10 1.25 0.66 5.8 3 10 1.25 0.66 5.8
- 3 3
- 30 0.97 0.72 4.2 30 0.97 0.72 4.2
- CDb5#2 CDb5 # 2
- 10 1.15 0.76 3.9 10 1.15 0.76 3.9
- 3 3
- 30 0.73 0.65 2.3 30 0.73 0.65 2.3
- Tabla 2d 2d table
- HRP-CDn5 HRP-CDn5
- Antisuero Antiserum
- Trazador (IJg/mL) Título As. (x103) Amax Pendiente ICso (nM) Plotter (IJg / mL) Title As. (X103) Amax Pending ICso (nM)
- CDn5#1 CDn5 # 1
- 3 10 0.94 0.50 1035.5 3 10 0.94 0.50 1035.5
- 10 10
- 30 1.30 0.59 261.5 30 1.30 0.59 261.5
- CDn5#2 CDn5 # 2
- 3 10 0.91 0.53 1556.0 3 10 0.91 0.53 1556.0
- 10 10
- 30 1.23 0.69 278.5 30 1.23 0.69 278.5
En la Figura 7 se muestran las curvas de inhibición obtenidas con el formato de antígeno de ensayo inmovilizado con detección indirecta y con el formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa. Para el ensayo indirecto se empleó 100 IJL por pocillo del compuesto de fórmula (11) OVA-CDp6 a 0.1 ¡Jg/ml y el antisuero CDp6#1 a una dilución en ensayo de 1/3x104• En el caso del ensayo con formato directo, el pocillo se tapizó con 100 IJL de una dilución del antisuero CDb5#1 a 1/3x1 04 y en la etapa competitiva se usó 0.3 ng de
The inhibition curves obtained with the immobilized assay antigen format with indirect detection and with the immobilized antibody format with direct detection are shown in Figure 7. For the indirect test 100 IJL was used per well of the compound of formula (11) OVA-CDp6 at 0.1 Jg / ml and the CDp6 # 1 antiserum at a test dilution of 1 / 3x104 • In the case of the direct format test , the well was upholstered with 100 IJL of a dilution of the CDb5 # 1 antiserum to 1 / 3x1 04 and in the competitive stage 0.3 ng of
5 trazador enzimático homólogo. 5 homologous enzyme tracer.
Como se desprende de los resultados obtenidos en los ejemplos ilustrados, los inmunógenos en los que el compuesto de fórmula (1) contenía el espaciador situado sobre cualquiera de los dos anillos aromáticos proporcionaron anticuerpos de elevada afinidad para ciprodinil. Por el contrario, el inmunógeno As can be seen from the results obtained in the illustrated examples, the immunogens in which the compound of formula (1) contained the spacer located on either of the two aromatic rings provided high affinity antibodies for cyprodinyl. On the contrary, the immunogen
10 con el espaciador sobre el nitrógeno amínico que une los dos anillos aromáticos proporcionó anticuerpos de baja afinidad hacia dicho fungicida. 10 with the spacer on the amine nitrogen that joins the two aromatic rings provided low affinity antibodies towards said fungicide.
Claims (27)
- 2. 2.
- Un compuesto de fórmula (1) según la reivindicación 1, caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono. A compound of formula (1) according to claim 1, characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms.
- 3. 3.
- Un compuesto de fórmula (1) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. A compound of formula (1) according to any one of the preceding claims, characterized in that Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH2 and -SH.
- 4. Four.
- Un compuesto de fórmula (1) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque T es [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2il)amino)fenilo] o [4-(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2y -SH. A compound of formula (1) according to any one of the preceding claims, characterized in that T is [3 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4- (4-cyclopropyl-6-methylpyrimidine) -2-yl) amino) phenyl]; L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms; and Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH2 and -SH.
- 5. 5.
- Un compuesto de fórmula (1) según la reivindicación 4, caracterizado porque se selecciona dentro del grupo que consiste en A compound of formula (1) according to claim 4, characterized in that it is selected from the group consisting of
- 6. 6.
- Un compuesto de fórmula (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque T es [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. A compound of formula (1) according to any one of claims 1 to 3, characterized in that T is [6-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl]; L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms; and Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH2 and -SH.
- 7. 7.
- Un compuesto de fórmula (1) según la reivindicación 6, caracterizado porque es A compound of formula (1) according to claim 6, characterized in that it is
- 8. 8.
- Un compuesto de fórmula (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH2 y -SH. A compound of formula (1) according to any one of claims 1 to 3, characterized in that T is [(4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino]; L is a linear hydrocarbon chain of 2 to 8 carbon atoms; and Y is selected from the group consisting of -COOH, -CHO, -NH2 and -SH.
- 9. 9.
- Un compuesto de fórmula (1) según la reivindicación 8, caracterizado porque es A compound of formula (1) according to claim 8, characterized in that it is
caracterizado porque T se selecciona del grupo que consiste en R-1, R-11, R-111, R-IV y R-V;
characterized in that T is selected from the group consisting of R-1, R-11, R-111, R-IV and RV;
- 11. eleven.
- Un compuesto de fórmula (11) según la reivindicación 1O, caracterizado porque Les una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono. A compound of formula (11) according to claim 1O, characterized in that Les has a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms.
- 12. 12.
- Un compuesto de fórmula (11) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 O o 11, caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH--NHCO--NH--S-O y ?-N, /A compound of formula (11) according to any one of claims 1 O or 11, characterized in that Z is selected from the group consisting of -CONH-NHCO-NH-S-O and? -N, /
- 13. 13.
- Un compuesto de fórmula (11) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 O a 12, caracterizado porque P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, ¡3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. A compound of formula (11) according to any one of the claims 1 O to 12, characterized in that P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin, hemocyanin, 3-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase
- 14. 14.
- Un compuesto de fórmula (11) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 O a 13, caracterizado porque T es [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-(4-ciclopropil-6 metilpirimidin-2-il)amino )fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; A compound of formula (11) according to any one of the claims 1 or 13, characterized in that T is [3 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4- (4-cyclopropyl-6 methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl]; L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms;
- 15. fifteen.
- Un compuesto de formula (11) según la reivindicación 14, caracterizado porque T es [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4 ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 5 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. A compound of formula (11) according to claim 14, characterized because T is [3 - ((4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl] or [4 - ((4 cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl]; L is a hydrocarbon chain linear of 5 carbon atoms; Z is -CONH-; P is selected from the group that consists of albumin and peroxidase; and n is a value selected between 1 and 50.
- 16. 16.
- Un compuesto de fórmula (11) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 O a 13, caracterizado porque Tes [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; Les una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, A compound of formula (11) according to any one of the claims 1 or 13, characterized in that Tes [6-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl]; Les a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms; Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
- 17. 17.
- Un compuesto de formula (11) según la reivindicación 16, caracterizado porque T es [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. A compound of formula (11) according to claim 16, characterized in that T is [6-cyclopropyl-2- (phenylamino) pyrimidin-4-yl]; L is a linear hydrocarbon chain of 4 carbon atoms; Z is -CONH-; P is selected from the group consisting of albumin and peroxidase; and n is a value selected between 1 and 50.
- 18. 18.
- Un compuesto de fórmula (11) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 O a 13, caracterizado porque Tes [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; A compound of formula (11) according to any one of claims 1 O to 13, characterized in that Tes [(4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino];
- L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms; Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
- 5 5
- /s~o ~Ny O P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, hemocianina, 13-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. tiroglobulina, / s ~ o ~ Ny O P is selected from the group consisting of albumin, hemocyanin, 13-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase. thyroglobulin,
- 1 O 1 o
- 19. Un compuesto de formula (11) según la reivindicación 18, caracterizado porque T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona 19. A compound of formula (11) according to claim 18, characterized in that T is [(4-cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) (phenyl) amino]; L is a linear hydrocarbon chain of 4 carbon atoms; Z is -CONH-; P is selected
- del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50. from the group consisting of albumin and peroxidase; and n is a value selected between 1 and 50.
- 15 fifteen
- 20. Un compuesto de fórmula (111): [T-L-Z]m-Q (111) caracterizado porque T se selecciona del grupo que consiste en R-1, R-11, R-111, R-IV y R-V; 20. A compound of formula (111): [T-L-Z] m-Q (111) characterized in that T is selected from the group consisting of R-1, R-11, R-111, R-IV and R-V;
- 20 twenty
- H 1YN'0N V~ R-1 H \:~NYN'0 hN V R-11 H 1YN'0N V ~ R-1 H \: ~ NYN'0 hN V R-11
30 ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo];
Cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl) amino) phenyl];
- 21. twenty-one.
- Un compuesto de fórmula (111) según la reivindicación 20, caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono. A compound of formula (111) according to claim 20, characterized in that L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms.
- 22. 22
- Un compuesto de fórmula (111) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21, caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, /so y N-7N'N/A compound of formula (111) according to any one of claims 20 or 21, characterized in that Z is selected from the group consisting of -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, / so and N-7N ' N /
- /s0o ~N/ s0o ~ N
- y ;y Y ;Y
- O OR
- Q Q
- se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno be Choose of the group that consists in biotin, fluorescein or one
O Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.
OQ is selected from the group consisting of biotin, fluorescein or any one of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a coumarin fluorophore, a ruthenium bipyryl, luciferin or any one of its derivatives, an acridinium ester and micro-or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex.
25 29. Método de análisis de ciprodinil según la reivindicación 28, caracterizado porque la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (e) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un antígeno de ensayo que es un compuesto de formula (11) tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 O a 19.
29. Method of analysis of ciprodinil according to claim 28, characterized in that the determination of the immunochemical reaction in step (e) is performed by a competitive immunoassay, using as a competitor a test antigen that is a compound of formula (11) as described in any one of claims 1 O to 19.
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