ES2397874B2

ES2397874B2 - Líneas celulares y su uso para la identificación de fármacos para el carcinoma tiroideo.

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Publication number: ES2397874B2
Application number: ES201031322A
Authority: ES
Inventors: Susana Belén BRAVO LÓPEZ; María Elena RODRÍGUEZ GARCÍA-RENDUELES; José Manuel CAMESELLE TEIJEIRO; Clara ÁLVAREZ VILLAMARÍN
Original assignee: Universidade de Santiago de Compostela
Current assignee: Universidade de Santiago de Compostela
Priority date: 2010-09-03
Filing date: 2010-09-03
Publication date: 2013-09-27
Anticipated expiration: 2030-09-03
Also published as: WO2012028762A3; ES2397874A1; WO2012028762A2

Abstract

Líneas celulares y su uso para la identificación de fármacos para el carcinoma tiroideo.#La presente invención se refiere al uso un sistema de líneas celulares de carcinoma tiroideo modificadas para expresar p27Kip1 exógeno en niveles estables o niveles inferiores de TNIP2 respecto de los niveles control, y al animal no humano que comprende dichas líneas. Además, la presente invención se refiere al uso de dichas líneas y dicho animal para el cribado de fármacos para el carcinoma tiroideo, así como a un kit que comprende dichas líneas.

Description

Lineas celulares y su uso para la identificacion de farmacos para el carcinoma tiroideo. La presente invencion pertenece al campo de la Biologia Celular, la Biotecnologia y la Biomedicina, y se refiere al uso de lineas celulares de carcinoma tiroideo, modificadas para expresar p27Kip1 exogeno en niveles estables o inferiores de TNlP2 respecto de los niveles control, y al animal no humano que comprende dichas lineas. Ademas, la presente invencion se refiere al uso de dicha linea y dicho animal para el cribado de farmacos para el carcinoma tiroideo.

ESTADO DE LA TECNICA

La busqueda de nuevos farmacos antitumorales esta actualmente determinada por las alteraciones moleculares identificadas en las celulas tumorales. Estas alteraciones definen un contexto molecular que hace que las celulas tumorales sean sensibles a unos compuestos determinados. La combinacion de los abordajes tradicionales con la informacion molecular actual permite el diseno de nuevos modelos celulares y animales para la busqueda de farmacos que eliminen selectivamente las celulas tumorales. Hasta la fecha, existen muchas dificultades para encontrar nuevos farmacos antitumorales especificos para eliminar exclusivamente las celulas con un contexto molecular determinado. En particular, es de especial interes encontrar farmacos antitumorales contra las celulas tumorales con un fenotipo mas agresivo, capaces de invadir otros tejidos y de provocar metastasis. El inhibidor 1B de quinasa dependiente de ciclina (CDKN1B, p27, KlP1 o p27Kip1) es una proteina codificada en humanos por el gen p27Kip1. Esta proteina pertenece a la familia de proteinas inhibidoras de quinasas dependientes de ciclinas. p27Kip1 interacciona con quinasas dependientes de ciclina (CDK, del ingles "eyelindependent kinases"), controla la progresion del ciclo celular en la fase G1 y suele considerarse una proteina inhibidora del ciclo celular, generalmente por inhibicion de CDK2, debido a que su principal funcion es frenar o ralentizar el ciclo de division celular. Sin embargo, p27Kip1 es capaz de activar CDK4. En W003063581 se estudian lineas celulares y animales transgenicos que contienen mutaciones en p27Kip1 que resultan en la perdida del sitio de fosforilacion de CDK2 y que tienen como consecuencia un aumento en el tamano de al menos una porcion del animal, que presenta tejidos agrandados o celulas mas grandes que los tejidos de los animales no transgenicos. En W02001051604 se describen animales recombinantes, entre ellos el raton, que contienen celulas con informacion genetica alterada y que sirven para identificar agentes antitumorales. Ademas, tambien se describe que la identificacion de los compuestos antiproliferativos puede ser realizada utilizando lineas celulares, preferentemente lineas celulares tumorales humanas con informacion genetica alterada, mas particularmente de genes supresores de tumores o de oncogenes, entre los que se incluye p27Kip1, aunque no se proporcionan ejemplos en este caso particular. La alteracion puede ser producida por expresion constitutiva de oncogenes o por interferencia de ARN para genes supresores de tumores. En W09924603 se describe un metodo de cribado de compuestos con actividad antitumoral donde se emplea un organismo con una alteracion en un gen que es analogo u homologo a un defecto primario tumoral. Una de las alteraciones estudiada es la perdida de expresion de p27Kip1 como contexto molecular tumoral para el cribado de farmacos. TNlP2 (de "TNFAIP3 interaeting protein 2"), tambien llamado 2KLlP, ABlN2 o FLlP1, es una proteina que se une al dominio de tipo dedo de zinc en el extremo carboxilo terminar de la proteina A20 (TNFAlP3) y esta involucrada en la activacion de la via de senalizacion de las quinasas ERK y MAPK, en varios tipos celulares. El papel de ABlN2 (TNlP2) en la regeneracion hepatica ha sido estudiada en ratones transgenicos con sobreexpresion de este gen (Li CC. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. 342 (1):300-309) pero hasta la fecha no se ha estudiado el efecto de la represion de TNlP2 en modelos animales. Si se han generado lineas celulares donde la expresion de ABlN2 (TNlP2) esta inhibida mediante ARN de interferencia, con el objetivo de caracterizar la cascada de senalizacion en la que participa dicha molecula (Lang V. et al. Mol. Cell Biol. 2004. 24 (12):5235-5248). La obtencion de una linea celular primaria tiroidea que deriva de un carcinoma tiroideo papilar y su transfeccion para la sobreexpresion de p27Kip1 o la represion de la expresion de p27Kip1 mediante ARN de interferencia se describe en Bravo SB. et al. Anal Biochem 2010. 400 (2):219-228. Sin embargo, este trabajo no estudia la agresividad de las lineas celulares modificadas.

Por tanto, no se ha descrito hasta la fecha ningun modelo celular ni animal como los que aporta la presente invencion para la identificacion de nuevos farmacos antitumorales, especialmente dirigidos a eliminar aquellas celulas que presenten un fenotipo mas agresivo y sean capaces de invadir otros tejidos.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona nuevas lineas celulares y modelos animales basados en dichas lineas, que permiten el cribado de farmacos antitumorales.

Millones de personas sufren bocio, una enfermedad proliferativa de las celulas foliculares del tiroides que puede convertirse en neoplasica. Las neoplasias tiroideas tienen un bajo indice de proliferacion y una alta incidencia de metastasis. Los autores de la presente invencion han establecido cultivos primarios de celulas tiroideas humanas de distintas patologias proliferativas del tiroides, como son la enfermedad de Graves, el bocio multinodular, el adenoma folicular o el carcinoma papilar, ademas de metastasis de los nodulos linfaticos y de muestras de tejido de tiroides normal. El estudio de estos cultivos ha llevado a los autores a conocer el entorno molecular en el que las celulas del tiroides se vuelven cancerosas y adquieren un fenotipo de menor diferenciacion que las hace mas agresivas y les confiere una mayor capacidad metastasica.

Los autores han generado lineas celulares de carcinoma tiroideo papilar que expresan p27Kip1 exogeno o que tienen disminuida la expresion de TNlP2, y estas dos caracteristicas, sorprendentemente, tienen un mismo efecto en el comportamiento celular cuando son introducidas en un modelo animal no humano: provocan un aumento en la invasion de los tejidos adiposo y muscular cercanos. Esta caracteristica es de vital importancia puesto que implica que las celulas han adquirido la capacidad de migrar activamente y de atravesar barreras fisicas entre tejidos, lo que es clave en el pronostico de un cancer.

Es sobradamente conocido en el estado de la tecnica que p27Kip1 frena la inhibicion celular y que su delecion o inactivacion va asociada a mayores niveles de proliferacion celular, mayor tamano de los organos o del cuerpo y/o cancer. Sin embargo, los autores de la presente invencion describen que las celulas de carcinoma tiroideo son mas agresivas, tienen mayor capacidad invasiva y presentan un fenotipo mas maligno (con peor pronostico clinico) cuando son modificadas de forma que los niveles de p27Kip1 no pueden disminuir y se mantienen constantes en la celula.

Por tanto, los autores de la presente invencion presentan un nuevo modelo celular y animal para el cribado y la identificacion de nuevos farmacos antitumorales. Los modelos que aporta la presente invencion permiten discriminar el efecto de nuevas moleculas y compuestos sobre una poblacion de carcinoma tiroideo mas diferenciado, y otra mas agresiva y de mayor capacidad metastasica, es decir, permiten encontrar aquellos farmacos capaces de frenar la metastasis y combatir asi tumores mas agresivos de peor pronostico.

Las lineas celulares de la presente invencion estan modificadas geneticamente para expresar p27Kip1 exogeno y/o una ARN de interferencia de TNlP2. Estas modificaciones son las responsables de que las celulas tumorales presenten un fenotipo mas agresivo y tengan mayor capacidad de invasion de tejidos. Por tanto, la presente invencion proporciona nuevas herramientas para la identificacion de farmacos antitumorales especialmente dirigidos a celulas tumorales en estadios avanzados, con un fenotipo de menor diferenciacion que se asocia a una alta agresividad y capacidad de invadir otros tejidos, con mal pronostico clinico.

Por tanto, un primer aspecto de la invencion se refiere al uso de una linea celular de carcinoma tiroideo que comprende p27Kip1 exogeno, de una linea celular de carcinoma tiroideo caracterizada por expresar niveles inferiores de TNlP2 respecto de los niveles control, o de ambas, para la identificacion de farmacos eficaces para el tratamiento del carcinoma tiroideo. En una realizacion preferida de la invencion, se usa una linea celular de carcinoma tiroideo que comprende p27Kip1 exogeno, es decir, que expresa de manera estable el ARN mensajero del p27Kip1 exogeno y la proteina p27Kip1 exogena. En una realizacion preferida de la invencion, la linea celular de carcinoma tiroideo expresa niveles estables de p27Kip1. Los niveles estables de p27Kip1 son invariables y son los niveles que presenta una linea celular de carcinoma tiroideo control, que no comprende p27Kip1 exogeno. En otra realizacion preferida de la invencion, se usa una linea celular de carcinoma tiroideo que expresa niveles inferiores del ARN mensajero y de proteina de TNlP2, respecto de los niveles control. En otra realizacion preferida de la invencion, se usan ambas lineas celulares.

Una "linea celular de carcinoma tiroideo" es una linea celular obtenida mediante el cultivo de una porcion de tejido de carcinoma tiroideo. Preferiblemente, el tejido de carcinoma tiroideo es de origen humano. Dicho tejido puede ser fresco y proceder de biopsias o cirugias realizadas en pacientes con patologias de la glandula tiroides. Los cultivos celulares pueden realizarse siguiendo cualquier protocolo descrito para este fin en el estado de la tecnica, como son por ejemplo, pero sin limitarse, los protocolos descritos en los ejemplos de la presente memoria.

El termino "exogeno", tal y como se emplea en la presente memoria, se refiere a p27Kip1, mas particularmente se refiere al ARN mensajero o a la proteina p27Kip1 que se expresan en las celulas a partir de la secuencia de ADN introducida en las celulas. El termino "exogeno" se entiende en contraposicion a "endogeno", siendo el p27Kip1 endogeno el expresado de manera natural en las celulas, codificado por el correspondiente gen del genoma celular, sujeto a regulacion. Mientras que los niveles de p27Kip1 endogeno disminuyen en presencia de TGF-� (factor de crecimiento transformante beta, del ingles, "transforming growth faetor beta") los niveles de p27Kip1 exogeno se mantienen estables e invariables y no se ven afectados en presencia de este factor, como se ilustra en la figura 1C

5 de la presente memoria.

La expresion "niveles estables" hace precisamente referencia a lo mostrado en la figura 1C, es decir, a que la expresion de p27Kip1 exogeno permite que los niveles de la proteina p27Kip1 exogena se mantengan estables ante estimulos proapoptoticos, como por ejemplo TGF-�, en las lineas celulares de carcinoma tiroideo de la invencion,

10 transformadas para expresar exogenamente p27Kip1. Estas lineas presentan los niveles de p27Kip1 de una linea sin transformar en ausencia de estimulos, es decir, estas lineas presentan unos niveles de p27Kip1 estables y constantes, imposibles de disminuir mediante factores proapoptoticos.

La transformacion antes mencionada se refiere a la introduccion en las celulas de una secuencia de ADN que

15 comprende al menos un promotor y la secuencia que codifica para p27Kip1. La linea control empleada por los inventores, denominada sencillamente Rc en la presente memoria, fue generada introduciendo, en la misma linea original T-PC2, el vector Rc con el promotor CMV (citomegalovirus) pero sin la secuencia que codifica para p27Kip1, es decir, introduciendo en las celulas el vector vacio.

20 El efecto conseguido mediante la introduccion en la linea celular de p27Kip1 exogeno es una resistencia a la apoptosis, es decir, una induccion de la supervivencia celular.

En las lineas celulares de la invencion que expresan p27Kip1 exogeno de manera estable, esta proteina es capaz de interaccionar con la quinasa dependiente de ciclo CDK4 y activarla.

25 Las lineas celulares de carcinoma tiroideo descritas en la presente invencion que expresan p27Kip1 exogeno en niveles estables, llevan en su genoma un ADN exogeno que comprende al menos un promotor y la secuencia que codifica para p27Kip1. La secuencia que codifica para p27Kip1 puede ser cualquier secuencia nucleotidica que codifica para la proteina p27Kip1 de cualquier especie. Preferiblemente, es una secuencia nucleotidica que codifica

30 para la proteina p27Kip1 de un mamifero, mas preferiblemente, de humano o de perro, gato, vaca, rata o raton. Como se muestra en la tabla 1, la homologia de secuencia entre el ADN que codifica para la proteina p27Kip1 en humano, perro, gato, vaca, rata y raton es de al menos un 84%. La homologia de secuencia entre las proteinas p27Kip1 de estas especies es de al menos un 98%.

35 Por tanto, en lo que respecta a la presente invencion, p27Kip1 es preferiblemente una secuencia nucleotidica con al menos 84% de identidad de secuencia con SEQ lD N0: 6 (secuencia codificante de NP 034005) o una secuencia aminoacidica con al menos un 98% de identidad de secuencia con SEQ lD N0: 7 (NM 009875).

Tabla 1. Porcentajes de identidad entre las secuencias nucleotidicas que codifican para p27Kip1 y las secuencias 40 aminoacidicas de p27Kip1 de humano, perro, gato, rata y vaca frente a las respectivas secuencias de raton.

% de identidad

Especie: ADN proteina

Mus museulus: 100 100

Homo sapiens: 88 99

Canis lupus familiaris: 84 98

Felis eatus: 89 98

Rattus norregieus: 97 100

Bos taurus: 86 99

La expresion "expresa niveles inferiores", tal y como se emplea en la presente memoria, se refiere a que la linea celular esta transformada para expresar niveles inferiores del ARN mensajero y de la proteina TNlP2. Dichos niveles

45 son inferiores cuando se comparan con los niveles control. El termino "niveles control" se refiere a los niveles de dicho ARN mensajero o proteina en la linea celular primaria de carcinoma tiroideo de origen, sin transformar, llamada "linea celular original". La transformacion antes mencionada se refiere a la introduccion en las celulas de una secuencia de ADN que comprende al menos un promotor y la secuencia que codifica para un ARN de interferencia de TNlP2.

Como puede observarse en las figuras 1 y 2 de esta memoria, y como esta descrito en los ejemplos, los autores de la presente invencion han obtenido distintas lineas derivadas de cultivos celulares de carcinoma tiroideo papilar humano, que han transformado mediante la insercion del gen p27Kip1 bajo el promotor de CMV, o mediante la insercion de una secuencia de ADN que codifica para un ARN pequeno en horquilla (shRNA, del ingles "short hairpin RNA"), capaz de inhibir la expresion del gen TNlP2 en estas celulas, respectivamente.

Un segundo aspecto de la invencion se refiere a una linea celular de carcinoma tiroideo, caracterizada por expresar niveles inferiores de TNlP2 respecto de los niveles control.

La linea celular del segundo aspecto de la invencion expresa niveles inferiores del ARN mensajero de TNlP2 que la linea sin transformar, es decir, que la linea control. Los niveles control son los niveles de expresion de TNlP2, es decir, del ARN mensajero y de la proteina TNlP2, en dicha linea celular control. Por tanto, el ARN de transferencia de TNlP2 es capaz de inhibir la expresion de TNlP2 en la linea celular de carcinoma tiroideo humano.

En una realizacion preferida, la inhibicion de la expresion de TNlP2 se realiza mediante: (a) una molecula de ARN;

(b): un oligonucleotido antisentido; o (c) una ribozima.

El termino "oligonucleotidos antisentido" se refiere a cadenas de ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos que pueden inhibir la expresion de TNlP2 por uno de estos tres mecanismos: (a) interfiriendo la transcripcion, al hibridar en el gen o en una region regulatoria del gen que codifica para TNlP2; (b) interfiriendo la traduccion del ARN mensajero de TNlP2 a proteina, al unirse el oligonucleotido antisentido en el citoplasma con dicho ARN mensajero; o

(c): provocando la rapida degradacion del ARN mensajero de TNlP2 por ARNasas (como ARNasa H), al formar un duplex con dicha molecula de ARN mensajero.

El termino "ribozima", tal y como se emplea en la presente memoria, se refiere a un polinucleotido catalitico (tipicamente de ARN), que puede construirse para reconocer especificamente, por hibridacion, un ARN mensajero, provocando asi su fragmentacion y la inhibicion de su expresion. Las ribozimas pueden introducirse en la celula como moleculas de ARN cataliticas o como construcciones geneticas de ADN que, cuando se expresan, dan lugar a moleculas cataliticas de ARN.

En una realizacion preferida, la linea celular esta caracterizada porque expresa un ARN de interferencia de TNlP2. En una realizacion mas preferida, el ARN de interferencia es SEQ lD N0: 1.

La linea del segundo aspecto de la invencion ha sido obtenida por los inventores mediante la introduccion en la linea celular original de carcinoma tiroideo papilar (T-PC2) de un ADN que comprende al menos un promotor y una secuencia que codifica para un ARN de interferencia especifico de TNlP2. Este ARN de interferencia es capaz de hibridar especificamente con el ARN mensajero de TNlP2 endogeno y promover su destruccion, reduciendo asi los niveles de ARN mensajero y de proteina de TNlP2 en las celulas. El ARN de interferencia empleado por los inventores para reducir especificamente la expresion de TNlP2 es un shRNA cuya secuencia es SEQ lD N0: 1. Como esta descrito en los ejemplos de la presente memoria, la linea control empleada por los inventores fue generada introduciendo, en la misma linea original T-PC2, un ARN de interferencia inespecifico, tambien un shRNA, que se denomina "seramble" (shS) y que no esta dirigido especificamente a ningun gen.

Un tercer aspecto de la invencion se refiere a un kit que comprende una linea celular del segundo aspecto de la invencion (a partir de ahora llamado kit de la invencion). En una realizacion preferida, el kit de la invencion ademas comprende una linea celular de carcinoma tiroideo control.

Una linea celular de carcinoma tiroideo control puede ser la linea celular de carcinoma tiroideo original, de la que derivan las lineas transformadas, como esta descrito en la presente memoria, para expresar p27Kip1 exogeno o para expresar niveles inferiores de TNlP2 respecto de los niveles control. Esta linea celular control puede estar transformada, sin embargo, para expresar algun ARN sin sentido o que no afecte el contexto molecular de la celula,

o para expresar algun marcador, como por ejemplo, pero sin limitarse, una proteina fluorescente, un antigeno o una enzima, que permitan identificar facilmente las celulas mediante tecnicas de fluorescencia, colorimetricas o tecnicas inmunologicas. Los marcadores y las tecnicas de deteccion son bien conocidas por el experto en la materia y descritas en el estado de la tecnica.

En otra realizacion preferida, el kit de la invencion ademas comprende una linea celular de carcinoma tiroideo caracterizada por expresar p27Kip1 exogeno en niveles estables.

El kit de la invencion puede comprender tambien otros componentes, como medios de cultivo, suplementos de medios de cultivo, entre los que pueden incluirse, pero sin limitarse, antibioticos, aminoacidos, hormonas o antioxidantes, placas o frascos de cultivo celular, y otros reactivos para el cultivo celular bien conocidos por un experto en la materia.

Un cuarto aspecto de la invencion se refiere al uso del kit de la invencion para la identificacion de farmacos eficaces para el tratamiento del carcinoma tiroideo.

Las lineas celulares de la invencion pueden emplearse en ensayos in ritro para el cribado de farmacos antitumorales. Preferiblemente, para la identificacion de farmacos antitumorales eficaces para el tratamiento del carcinoma tiroideo. Los ensayos de cribado de farmacos permiten ensayar la eficacia de librerias de miles de compuestos de manera muy eficiente, lo que amplia las probabilidades de encontrar una nueva molecula que de resultados positivos, es decir, que elimine selectivamente aquellas celulas que presenten un fenotipo tumoral mas agresivo.

Un quinto aspecto de la invencion se refiere al uso del kit de la invencion para la obtencion de un animal no humano. Un sexto aspecto de la invencion se refiere al uso de una linea celular de carcinoma tiroideo caracterizada por expresar p27Kip1 exogeno en niveles estables, de una linea celular de carcinoma tiroideo del segundo aspecto de la invencion, o de ambas, para la obtencion de un animal no humano, util para la identificacion de farmacos eficaces para el tratamiento del carcinoma tiroideo. Dicho animal no humano constituye un modelo animal para el ensayo de farmacos antitumorales in riro.

Un septimo aspecto de la invencion se refiere a un animal no humano que comprende una linea de carcinoma tiroideo caracterizada por expresar p27Kip1 exogeno en niveles estables, una linea de carcinoma tiroideo caracterizada por expresar niveles inferiores de TNlP2 respecto de los niveles control o ambas. En una realizacion preferida, el animal no humano ademas comprende la linea de carcinoma tiroideo control.

Un octavo aspecto de la presente invencion se refiere al uso del animal no humano del septimo aspecto de la invencion como modelo animal de cancer, especialmente para el cribado de farmacos. En una realizacion preferida, se usa como modelo animal de carcinoma tiroideo.

Preferiblemente, el animal no humano pertenece a la Subfamilia Murinae. Mas preferiblemente, es una rata o un raton.

El animal no humano del septimo aspecto de la invencion puede ser un modelo animal para el cribado de farmacos antitumorales. Las lineas celulares de carcinoma tiroideo pueden ser introducidas en el animal en forma de xenoimplantes o "xenografts", por ejemplo, pero sin limitarse, subcutaneamente. Como han demostrado los inventores, estos xenoimplantes van a invadir el tejido adiposo y muscular adyacente, puesto que su fenotipo es altamente agresivo. Un farmaco capaz de disminuir o eliminar la capacidad invasiva de las celulas de los xenoimplantes, seria un candidato muy prometedor para el tratamiento del cancer, preferiblemente del carcinoma tiroideo.

A lo largo de la descripcion y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteristicas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Selecci6n de los clones que han incorporado el vector de expresi6n ex6genade p27Kip1. A. Se midio el numero de celulas tras el tratamiento con TGF-�. Unicamente Rc-p274, 5 y 6, presentan crecimiento celular con TGF-�, es decir, solo estos clones expresan p27Kip1 exogeno de forma estable en niveles que permiten que TGFno induzca apoptosis pero si proliferacion. B. Se cuantifico el numero de celulas apoptoticas y se calculo el porcentaje de apoptosis en cada clon, observandose que en todos los clones que han incorporado el p27Kip1 exogeno disminuye la apoptosis inducida por TGF-�. C. Inmunoblot donde se observa que los niveles de p27Kip1 disminuyen en presencia de TGF-en la linea control Rc, pero se mantienen estables en las lineas que expresan p27Kip1 exogeno Rc-p274, 5 y 6.

Fig. 2. Silenciamiento de TNIP2: niveles de la proteinaTNIP2 analizados por inmunoblot. El lentivirus con la secuencia 144348 de pequeno ARN en horquilla (shRNA) de TNlP2 (shTNlP2) reduce de manera efectiva los niveles de proteina.

Fig. 3. La expresi6n ex6gena de p27Kip1 y la disminuci6n de la expresi6n de TNIP2 inducen un fenotipo similar de carcinoma pobremente diferenciado. A. Los xenoimplantes procedentes de poblaciones celulares control (T-PC2-Rc, vector vacio), de lineas que expresan p27Kip1 exogeno (T-PC2-Rc-p274, 5 y 6) y de lineas T-PC2shS y T-PC2-shTNlP2, crecieron durante 5 semanas. Los xenoimplantes que expresan p27Kip1 exogeno tienen un volumen menor que los controles, mientras que no se observan diferencias en aquellos que tienen disminuida la expresion de TNlP2. Sin embargo, tanto los que expresan p27Kip1 exogeno, a pesar de su pequeno volumen, como los que tienen TNlP2 reducido son frecuentemente multinodulares e invasivos con infiltracion en el tejido adiposo adyacente y musculo esqueletico. B. Todos los xenoimplantes expresan TTF-1, un factor de transcripcion caracteristico de las celulas foliculares tiroideas y mantienen algunas de las caracteristicas nucleares peculiares de carcinoma papilar, como son alargamiento, forma ovalada y solapamiento nuclear, al igual que contorno irregular del nucleo con surcos. Ademas, muestran un alto indice mitotico.

Fig. 4. Un modelo murino de carcinoma de tiroides humanos reproduce lo encontrado en cultivo e in vivo. Se introdujeron 107 celulas subcutaneamente en el raton y tras 5 semanas se analizaron los tumores resultantes. Los tumores conservaban la expresion de TTF-1, el factor de transcripcion caracteristico de las celulas foliculares de tiroides y conservado en los carcinomas diferenciados, y algunas de las caracteristicas nucleares diferenciales de carcinoma papilar (ver Fig. 3B). Se detecta ademas un mayor indice mitotico. La inmunohistoquimica se realizo en paralelo en los xenoimplantes controles (Rc y shS) y los xenoimplantes con las lineas que expresaban p27Kip1 exogeno o shTNlP2 (Rc-p274, 5 y 6 y shTNlP2). La expresion de TGF-� es abundante en todos los tumores sin diferencias entre los dos grupos. La localizacion de p27Kip1 es principalmente nuclear y, aunque se expresa abundantemente, es mucho mayor en el caso de los tumores que expresan p27Kip1 exogeno en niveles estables (Rc-p274, 5 y 6). p65 y Ciclina D1 se encuentran en todas las celulas y se distribuyen en el nucleo y en el citoplasma. Ciclina D1 tiende a ser mas intensa en los tumores que expresan p27Kip1 exogeno.

EJEMPLOS

A continuacion se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto el efecto de la expresion exogena de p27Kip1 y de la inhibicion de TNlP2 en la agresividad del fenotipo tumoral de lineas de carcinoma tiroideo.

EJEMPLO 1: Obtenci6n de la linea celular Rc-p27.

A partir de tejido humano de carcinoma tiroideo se establecieron cultivos de carcinoma tiroideo papilar como se describe en Bravo et al. 2003. 0ncogene 49, 7819-7830. De las lineas obtenidas, se empleo la T-PC2, de "thyroid papillary eareinoma" para generar distintos clones de lineas que expresan p27Kip1 exogeno. El objetivo es conseguir lineas celulares que expresen niveles estables de p27Kip1, de forma que ante estimulos proapoptoticos como por ejemplo TGF-�, no decrezcan los niveles de p27Kip1 y la celula no entre en apoptosis y pueda seguir dividiendose (Fig. 1 A y B). No se trata de sobreexpresar p27Kip1 en niveles tan elevados que la celula, ademas de no entrar en apoptosis, no pueda proliferar por el bloqueo de la quinasa CDK4 (del ingles "eyelindependent kinase" 4). Para obtener las lineas de carcinoma tiroideo y las lineas de tejido tiroideo control (tirocitos foliculares normales), se diseca la porcion apropiada del tiroides con un bisturi inmerso en medio de crecimiento completo (Ham"s F-12 modificado por Coon suplementado con 5% de suero de ternera recien nacida (NCS, del ingles ("newborn ealf serum"), 2 mM glutamina, una mezcla de 5 hormonas: 1 mlU/ml de TSH (hormona estimuladora del tiroides, del ingles "thyroid stimulating hormone"), 10 ng/ml de somatostatina, 10 mg/ml de insulina, 1 nM de hidrocortisona y 5 mg/ml de transferrina, y 100 lU/ml de penicilina/estreptomicina y 2,5 ng/ml de anfotericina B. El tejido disecado se digiere con colagenasa iV 1 mg/ml (Sigma) y 2,5 mg/ml de tripsina en PBS (tampon salino de fosfato, del ingles "Phosphate buffer saline"), durante 1 hora, y se filtra por una malla de 41 micrometros de tamano de poro para retirar los fragmentos de tejido no digeridos. Las celulas se lavan varias veces y se siembran en medio completo, en placas de poliestireno. Todos los cultivos expresan el marcador de fenotipo tiroideo TTF1 y tiroglobulina en distintos pases, es decir, mantienen el fenotipo tiroideo in ritro.

La secuencia que codifica para p27Kip1 de raton se encuentra insertada en un plasmido vector Rc/CMV. Se realizo una transfeccion con AMAXA en el cultivo de carcinoma papilar T-PC2 (ver Bravo et al. 2010. Anal. Biochem. 219228). Para ello se transfectaron 2 Ig de Rc/CMVp27, linealizado mediante la enzima Scal, en 1x106 celulas y se sembraron en una placa de 60 mm en medio completo. Como control se utilizaron 1x106 celulas de T-PC2 sin transfectar sembradas en una placa de 60 mm. Las celulas se incubaron durante 2 dias. Dado que el plasmido tiene resistencia al antibiotico Neomicina, se anadio Neomicina 500 Ig/ml (G418 Disulphate SALT Solution G8108, SlGMA) y se espero hasta que en la placa control se murieran todas las celulas, lo que ocurrio en aproximadamente 2 dias. Las celulas transfectadas se mantuvieron en medio con Neomicina durante dos semanas cambiandoles el medio cada 2 dias. Para asegurarse de que no quedase ninguna celula que sin transfectar, se dejo de tratar las celulas con Neomicina, se aspiro el medio, se lavaron 2 veces con tampon salino de fosfato (PBS, del ingles "Phosphate Buffer Saline") esteril y se trataron durante una semana con TGF-� (2 ng/ml) para eliminar cualquier residuo de celulas que no hubieran integrado el plasmido, pero hubieran conseguido ser resistentes a la Neomicina.

Las celulas tratadas con TGF-� en medio deprivado (con solo 0,1% de NCS y sin la mezcla de 5 hormonas) murieron a las 24 horas tras el tratamiento, lo cual esta relacionado con un descenso en los niveles de p27Kip1. Si se mantienen los niveles de p27Kip1 mediante transfeccion, las celulas no solo no se mueren sino que ademas proliferan, con lo que al tratar estas celulas (en las que se ha introducido de manera estable p27Kip1 exogeno) con TGF-�, es seguro que las que no hayan integrado el p27Kip1 exogeno de manera estable, entran en apoptosis.

Una vez transcurrido ese tiempo, las celulas se mantuvieron con una dosis muy baja de neomicina (400 ng/ml) en medio completo.

A partir de este cultivo, se obtuvieron tres clones que habian incorporado de manera estable el vector: Rc-p274, Rcp275, Rc-p276. Estos tres clones presentan niveles estables de p27Kip1 en presencia de TGF-�, al contrario del control (Rc) en el que los niveles de p27Kip1 disminuyen en presencia de TGF-�. Esto se comprobo por inmunoblot

o western blot (WB) (Fig. 1C). El numero de celulas vivas y apoptoticas se cuantifico con el marcador de celulas

5 vivas Hoescht (Fig. 1 A y B). Los cultivos fueron fotografiados y se contaron las celulas. Los resultados obtenidos con esta tecnica fueron similares a los obtenidos por citometria de flujo y por tincion con anexina V (Bravo et al. 2003. 0ncogene 49, 7819-7830.).

EJEMPLO 2: Obtenci6n de las lineas shS yshTNIP2.

10 Para inhibir en las celulas la expresion de TNlP2 se empleo un plasmido lentiviral que lleva un ARN de interferencia de TNlP2 (shTNlP2, SEQ lD N0: 1), y otro plasmido que lleva como control un ARN inespecifico (shScramble, SHC002V (Sigma)).

15 En estudios de inhibicion transitoria de TNlP2 se emplearon secuencias de pequenos ARN de interferencia (siRNA, del ingles "small interfering RNA") disenadas por los inventores y transcritas usando el Sileneer siRNA Construetor kit, de Ambion, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se probaron dos pares de oligonucleotidos (S: sentido y AS: antisentido) para silenciar la expresion de TNlP2, que se detallan en la tabla 2.

20 Las infecciones para la introduccion del plasmido en las celulas se realizaron con lentivirus comerciales (MlSSl0N Lentiviral Transduccion Particles, SHVRS, SlGMA) como se describe en Bravo et al. 2010. Anal. Biochem. 219-228. La casa comercial ofrece varios clones con distintas secuencias de ARN de horquilla pequena o shRNA (del ingles "short hairpin ARN") dirigidas al ARN mensajero diana, llamadas shTNlP2. El clon mas efectivo resulto ser el TRCN0000144348, cuya secuencia es SEQ lD N0: 1 (Fig. 2).

25 Tabla 2. 0ligonucleotidos para el silenciamiento de TNlP2 por siRNA.

siTNlP2: 13 S 5'AACGACAGCATGCACAAAGGACCTGTCTC3' (SEQ lD N0: 2)

AS: 5'AATCCTTTGTGCATGCTGTCGCCTGTCTC3' (SEQ lD N0: 3)

34: S 5'AATAAATGACTGTGCCGAAGTCCTGTCTC3' (SEQ lD N0: 4)

AS: 5'AAACTTCGGCACAGTCATTTACCTGTCTC3' (SEQ lD N0: 5)

Los extractos de proteinas celulares totales se obtuvieron por lisis con un tampon con Triton y los inmunoblots se

30 realizaron en membranas de PVDF (fluoruro de polivinilideno) como esta descrito en Bravo et al. 2003. 0ncogene 49, 7819-7830. Los anticuerpos empleados se detallan en la tabla 3.

Tabla 3. Anticuerpos primarios y secundarios empleados para inmunoblot (WB), inmunofluorescencia (lF) e inmunohistoquimica (lH).

Diluci6n

Anticuerpo: Proveedor Generado en WB IF IH

Tubulina: Sigma,T5168 raton 1:2.500

p27Kip1: BD, 610241 raton 1:10.000 1:500

p27Kip1: DAK0, SX53G8 raton 1:500

Ciclina D1 SP4: Master Diagnostica raton prediluido

NFkB p65 (A): Sta Cruz, sc-109 conejo 1:1.000 1:1.000

TTF-1, 8G7G3/1: DAK0 raton 1:20

TGF-�: Sta Cruz, sc-146 conejo 1:50

anti-ratonperoxidasa: DAK0, P0260 conejo 1:5.000

anti-conejoperoxidasa: GE Healthcare NA934V burro 1:5.000

EJEMPLO 3: Los xenoimplantes procedentes de celulas que expresan p27Kip1 ex6geno o shTNIP2 se comportan como carcinomas pobremente diferenciados con un patr6n multinodular e infiltrante.

Para observar la contribucion de p27Kip1 y la ventana temporal de la expresion de TNlP2 en el crecimiento in riro de un tumor tiroideo, se inyectaron subcutaneamente en un raton desnudo 106 celulas provenientes de una poblacion transfectada con el vector vacio (Rc) o tres poblaciones independientes transfectadas con p27Kip1, y ademas aquellas infectadas con shTNlP2 o su control shS. Las masas celulares inyectadas reciben el nombre de xenoimplantes o "xenografts".

Cinco semanas despues se analizaron los xenoimplantes (Fig. 3A-B y 4). Los xenoimplantes crecian como tumores con un patron solido que aun mantenia las caracteristicas de tiroides, demostrando que se comportaba como un carcinoma diferenciado de tiroides. Mantenian el solapamiento nuclear y la forma de los nucleos con surcos, caracteristicos del carcinoma tiroideo papilar (PTC). Sin embargo, ninguno de los xenoimplantes presentaba las tipicas pseudoinclusiones nucleares con forma de grano de cafe del PTC y mostraban una elevada actividad mitotica, indicando un cambio a carcinoma tiroideo pobremente diferenciado (PDTC).

Los tumores procedentes de las poblaciones celulares que expresaban de manera exogena p27Kip1 eran mas pequenos que aquellos con las celulas control T-PC2-Rc. No se encontraron diferencias en el volumen global de los tumores que expresaban shTNlP2 en comparacion con los shS, aunque si parecia que habia una tendencia a aumentar su volumen.

Sorprendentemente, se detecto un patron reproducible en los xenoimplantes que expresaban p27Kip1 exogeno y en aquellos con niveles bajos de TNlP2. Dicho patron consiste en que los xenoimplantes eran frecuentemente multinodulares y capaces de invadir el tejido adyacente, como el tejido adiposo o el musculo esqueletico, a pesar del pequeno tamano de los xenoimplantes con p27Kip1 exogeno (Fig. 3A).

La clasificacion histopatologica llevada a cabo por un experto en cancer de tiroides humano, realizada con un sistema de doble ciego, resulto en la evaluacion de los tumores multifocales e infiltrantes como carcinomas pobremente indiferenciados con mal pronostico.

A nivel inmunohistoquimico, todos los tumores expresaban TGF-�, p65 nuclear y Ciclina D1 sin diferencias significativas. Ademas, como era de esperar, se encontraron mayores niveles de expresion de p27Kip1 en los tumores pequenos infiltrantes que expresaban p27Kip1 exogeno en niveles estables, junto con una tincion mas intensa para Ciclina D1 (Fig. 4). En resumen, los resultados obtenidos in riro fueron similares tanto cuando se mantenian estables los niveles de p27Kip1 como cuando se reducian los de TNlP2.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de una linea celular de carcinoma tiroideo caracterizada por expresar niveles inferiores de TNlP2 respecto de los niveles control o de dicha linea celular y una linea celular de carcinoma tiroideo que comprende p27Kip1 exogeno y expresa niveles estables de p27Kip1, para la identificacion de farmacos eficaces para el tratamiento del carcinoma tiroideo.
2.

Una linea celular de carcinoma tiroideo caracterizada por expresar niveles inferiores de TNlP2 respecto de los niveles control.
3.

La linea celular segun la reivindicacion anterior, caracterizada porque expresa un ARN de interferencia de TNlP2.
4.

La linea celular segun la reivindicacion anterior, donde el ARN de interferencia es SEQ lD N0: 1.
5.

Un kit que comprende una linea celular segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
6.

El kit segun la reivindicacion anterior, que ademas comprende una linea celular de carcinoma tiroideo control.
7.

El kit segun cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, que ademas comprende una linea celular de carcinoma tiroideo que comprende p27Kip1 exogeno y expresa niveles estables de p27Kip1.
8.

Uso del kit segun cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores para la identificacion de farmacos eficaces para el tratamiento del carcinoma tiroideo.
9.

Uso del kit segun cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para la obtencion de un animal no humano.
10.

Uso de una linea celular segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, o de dicha linea celular y una linea celular de carcinoma tiroideo que comprende p27Kip1 exogeno y expresa niveles estables de p27Kip1, para la obtencion de un animal no humano util para la identificacion de farmacos eficaces para el tratamiento del carcinoma tiroideo.
11.

Un animal no humano que comprende una linea de carcinoma tiroideo segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 o que comprende dicha linea celular y una linea celular de carcinoma tiroideo que comprende p27Kip1 exogeno y expresa niveles estables de p27Kip1.
12.

El animal no humano segun la reivindicacion anterior, que ademas comprende una linea de carcinoma tiroideo control.
13.

Uso del animal no humano segun cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores como modelo animal de cancer, especialmente para el cribado de farmacos.
14.

Uso segun la reivindicacion anterior, donde el animal se usa como modelo animal de carcinoma tiroideo.

FIG. 1 A

FIG. 1 C

FIG. 2

FIG. 3 A

FIG. 3 B

FIG. 4

ES 2 397 874 Al

ES 2 397 874 Al

ES 2 397 874 Al

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 201031322

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 03.09.2010

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl.: Ver Hoja Adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoria

@ Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A

HUANG L et al. ABINs inhibit EGF receptor-mediated NF-kappaB activation and growth of EGF receptor-overexpressing tumour cells. Oncogene 16.10.2008 VOL: 27 No: 47 Pags: 6131-6140 ISSN 1476-5594 (Electrónico). Ver todo el documento. 1-14

A

US 2009023650 A1 (BEYAERT RUDI et al.) 22.01.2009, todo el documento, especialmente ejemplos 2,3,4. 1-14

A

PAPOUTSOPOULOU S et al. ABIN-2 is required for optimal activation of Erk MAP kinase in innateimmune responses. Nature Immunology 06.2006 VOL: 7 No: 6 Pags: 606-615 ISSN 1529-2908 (impreso)-ISSN 1529-2916 (electrónico) Doi: doi:10.1038/ni1334. Ver todo el documento. 1-14

A

US 2008199469 A1 (LEY STEVEN) 21.08.2008, todo el documento, especialmente ejemplos 2,4. 1-14

A

BRAVO, S.B., et al. Expression of exogenous proteins and short hairpin RNAs inhuman primary thyrocytes. Analytical Biochemistry. 15.05.2010. Vol. 400, nº 2, páginas 219-228. ISSN 0003-2697. Ver todo el documento, especialmente página 225, columna 2, página 226, página 227, columna 1, párrafo 1 y figura 4. 1,7-14

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

Fecha de realizaci6n del informe 25.02.2013

Examinador B. Pérez Esteban Pagina 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201031322

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

C12N15/12 (2006.01) A61K48/00 (2006.01) C12R1/91 (2006.01) A61P35/00 (2006.01)

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

C12N, A61K, C12R, A61P

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, WPI, TXTUS0, TXTUS1, TXTUS2, TXTUS3, TXTUS4, TXTUS5, TXTEP1, TXTGB1, TXTWO1, TXTAU1, TXTCA1, TCPAT, MEDLINE, BIOSIS, NPL, EMBASE, XPESP, XPESP2, EBI, GeneCards.

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINION ESCRITA

Nº de solicitud: 201031322

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 25.02.2013

Declaraci6n

Novedad (Art. .1 LP 11/198 )

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-14 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/198 )

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-14 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opini6n.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

OPINION ESCRITA

Nº de solicitud: 201031322

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Numero Publicaci6n o Identificaci6n Fecha Publicaci6n

D01

HUANG L et al. Oncogene 16.10.2008 VOL: 27 No: 47 Pags: 6131-6140 ISSN 1476-5594 (Electrónico). 16.10.2008

D02

US 2009023650 A1 (BEYAERT RUDI et al.) 22.01.2009

D03

PAPOUTSOPOULOU S et al. Nature Immunology 06.2006 VOL: 7 No: 6 Pags: 606-615 ISSN 1529-2908 (impreso)-ISSN1529-2916 (electrónico). Doi: doi:10.1038/ni1334. 31.05.2006

D04

US 2008199469 A1 (LEY STEVEN) 21.08.2008

D05

BRAVO, S.B., et al. Analytical Biochemistry. 15.05.2010. Vol. 400, nº 2, páginas 219-228. ISSN 0003-2697. 15.05.2010
2. Declaraci6n motivada segun los articulos 29. y 29.7 del Reglamento de ejecuci6n de la Ley 11/198 , de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraci6n

La presente solicitud internacional describe el uso de una línea celular de carcinoma tiroideo que expresa niveles inferiores del gen TNIP2 respecto de los niveles control (porque expresa un ARN de interferencia de este gen), o de esa línea celular y una línea celular que comprende el gen p27Kip1 exógeno y lo expresa a niveles estables, para la identificación de fármacos eficaces como inhibidores metastásicos útiles en el tratamiento de carcinomas tiroideos altamente invasivos. La solicitud reivindica también un kit que comprende la línea celular; el uso del kit y de la línea celular para la obtención de un animal no humano útil para la identificación de fármacos eficaces para el tratamiento del carcinoma tiroideo; el animal no humano que comprende la línea celular reivindicada; el animal que comprende, además, una línea de carcinoma tiroideo control; y el uso del animal como modelo de cáncer tiroideo.

No se ha encontrado en el estado de la técnica ningún documento que, sólo o en combinación con otros, divulgue el uso reivindicado de estas líneas celulares, ni del kit y del animal derivados de la misma, ni documentos que puedan inducir al experto en la materia a deducir los usos, kit o animal reivindicados, por lo que las reivindicaciones 1 a 14 de la solicitud se consideran nuevas y con actividad inventiva según los artículos 6 y 8 de la Ley de Patentes.

A continuación se comentan los documentos citados en este informe, que, si bien son cercanos a la solicitud, no afectan su novedad ni su actividad inventiva, como se ha indicado anteriormente.

Los documentos D01 y D02 divulgan el uso potencial de ABIN-2 (=TNIP2) y de otras proteínas que se unen a A20, en terapia génica para el tratamiento de tumores de origen epitelial que dependen de ErbB, dado que las proteínas ABIN 1, 2 y 3 inhiben al activación mediada por EGFR del factor nuclear NF-KB, (un inductor de proliferación celular) en líneas celulares de tumores humanos. En estos ensayos, la introducción de los genes ABIN en las células reduce la actividad NF-KB, y con ella, la velocidad de proliferación celular. Esto convierte a los genes ABIN en potenciales agentes para el tratamiento antitumoral.

Los documentos D03 y D04 describen el efecto de la proteína ABIN-2 (TNIP2) sobre la estabilidad de TPL-2, una proteínquinasa implicada en procesos inflamatorios, pero los documentos no mencionan la relación de ABIN-2 con procesos cancerígenos.

En resumen, ninguno de estos cuatro documentos describe la posible relación entre el gen TNIP2 y el carcinoma tiroideo, ni la generación de líneas celulares que expresen este gen a niveles inferiores a los controles, como tampoco menciona la utilidad de este gen para la búsqueda de compuestos útiles en el tratamiento de carcinoma tiroideo, por lo que estos documentos no afectan la novedad ni la actividad inventiva de las reivindicaciones 1 a 14 de la solicitud.

Finalmente, en el documento D05 se describe la introducción del gen p27KIP1 en líneas celulares de carcinoma tiroideo y un método para disminuir la expresión del gen mediante shRNAs, pero no se indica si los niveles de expresión del gen tienen algún efecto en la agresividad del tumor, ni se menciona el gen TNIP2, por lo que el documento D05 no afecta la novedad ni la actividad inventiva de las reivindicaciones 1 a 14 de la solicitud, sino que se trata de un mero documento del estado de la técnica cercano a las reivindicaciones 1 y 7 a 14.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/4