ES2394338B1

ES2394338B1 - PROCEDURE FOR OBTAINING ALL-TRANS-GERANILGERANIOL

Info

Publication number: ES2394338B1
Application number: ES201231864A
Authority: ES
Inventors: Alejandro FERNÁNDEZ BARRERO; María Del Mar HERRADOR DEL PINO; Pilar ARTEGA BURÓN; Alejandro FERNÁNDEZ ARTEAGA
Original assignee: Universidad de Granada
Current assignee: Universidad de Granada
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2013-12-09
Anticipated expiration: 2032-11-30
Also published as: ES2394338A1

Abstract

Procedimiento de obtención de all-trans-geranilgeraniol.#La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de all-trans-geranilgeraniol a partir de plantas de la clase Magnoliopsida, preferentemente a partir de partes aéreas de Bixa orellana o Bellardia trixago. El procedimiento comprende una fase de extracción y una fase de saponificación. De forma opcional puede realizarse una fase adicional de purificación.Method of obtaining all-trans-geranylgeraniol. # The present invention relates to a process for obtaining all-trans-geranylgeraniol from plants of the Magnoliopsida class, preferably from aerial parts of Bixa orellana or Bellardia trixago. The process comprises an extraction phase and a saponification phase. Optionally an additional purification phase can be performed.

Description

Procedimiento de obtención de all-trans-geranilgeraniol Procedure for obtaining all-trans-geranylgeraniol

SECTOR OF THE TECHNIQUE

La presente invención se encuadra dentro del sector químico en el campo de la obtención de productos a partir de extractos de plantas. La invención tiene su aplicación en el sector farmacéutico y de perfumería ya que el metabolito secundario a obtener, geranilgeraniol, ha mostrado actividad antitumoral, antituberculosa, antimalárica y también puede ser utilizado como sintón de partida para la síntesis de otros productos de interés farmacéutico (vitamina K, vitamina E, antioxidantes, anticancerígenos, etc) y en perfumería. The present invention falls within the chemical sector in the field of obtaining products from plant extracts. The invention has its application in the pharmaceutical and perfumery sector since the secondary metabolite to be obtained, geranylgeraniol, has shown antitumor, antituberculous, antimalarial activity and can also be used as a starting point for the synthesis of other products of pharmaceutical interest (vitamin K, vitamin E, antioxidants, anti-cancer agents, etc.) and in perfumery.

STATE OF THE TECHNIQUE

Geranilgeraniol es un compuesto de alto valor añadido, debido principalmente a sus múltiples actividades biológicas, que han hecho que en los últimos años existan más de 20 patentes acerca de su producción o de sus aplicaciones entre las que se encuentra su uso como intermediario de la síntesis de vitamina E cuya producción excede de las 20000 tm. Geranilgeraniol is a compound with high added value, mainly due to its many biological activities, which have made in recent years there are more than 20 patents on its production or its applications, among which is its use as an intermediary of the synthesis of vitamin E whose production exceeds 20,000 tons.

Entre las propiedades biológicas de geranilgeraniol, cabe destacar su potente capacidad de inducir apoptosis en diferentes líneas tumorales humanas, incluyendo la leucemia mieloide HL-60 y K562 que se caracterizan por resistir la acción de la mayoría de agentes inductores de apoptosis. Se ha descrito también la actividad de geranilgeraniol frente a la leucemia linfoblástica Molt3, la leucemia humana U937, el adenocarcinoma COLO320 D o el adenocarcinoma de pulmón A549. Recientes estudios también han relevado la prometedora actividad anticarcinogénica de geranilgeraniol frente a la hepatocarcinogénesis. Las posibilidades antitumorales de geranilgeraniol se amplían tras encontrarse descrita en la bibliografía la actividad antitumoral de derivados sencillos de geranilgeraniol, como plaunotol, ácido geranilgeranico o geranilgeranilacetona. Por último un nuevo valor añadido de geranilgeraniol se debe a su uso como material de partida en síntesis de moléculas de interés. Among the biological properties of geranylgeraniol, it is worth highlighting its potent ability to induce apoptosis in different human tumor lines, including myeloid leukemia HL-60 and K562 that are characterized by resisting the action of most apoptosis inducing agents. The activity of geranylgeraniol against Molt3 lymphoblastic leukemia, human U937 leukemia, COLO320 D adenocarcinoma or A549 lung adenocarcinoma has also been described. Recent studies have also revealed the promising anticarcinogenic activity of geranylgeraniol against hepatocarcinogenesis. The antitumor possibilities of geranylgeraniol are extended after the antitumor activity of simple derivatives of geranylgeraniol, such as plaunotol, geranylgeranic acid or geranylgeranilacetone, has been described in the literature. Finally, a new added value of geranylgeraniol is due to its use as a starting material in synthesis of molecules of interest.

Se ha descrito el aumento de la producción de geranilgeraniol mediante sobreexpresión de genes en Saccharomyces cerevisiae y Escherichia coli. Se han descrito también diferentes síntesis para la preparación de geranilgeraniol. Algunos ejemplos son: a) reacción de trialquilfosfonoacetatos con farnesilacetona seguido de reducción con hidruro de aluminio, b) reacción de 4-toluensulfonato de geranilo con acetato de 8-bromo geranilo en presencia de n-butillitio seguido de eliminación del resto sulfónico con litio metálico y aminas, c) reacción de acoplamiento alílico entre 8-bromogeraniol protegido con t-butildimetilsililo (TBS) y geranilbario seguido de desprotección del grupo hidroxilo. También se ha obtenido geranilgeraniol a partir de acetato de geranillinalol, vía aminación catalizada por paladio(0) y mediante acoplamiento de Suzuki entre ácido metanborónico y el viniltriflato del enolato potásico del 1-cetoester obtenido por reacción del dianión del ester acetilacético con bromuro de farnesilo, seguido de reducción con DIBAL. El producto obtenido mediante estas síntesis, en la mayoría de los casos, es una mezcla de estereoisómeros geométricos donde uno o más de los dobles enlaces tienen estereoquímica Z, por tanto es necesaria una separación mediante destilación o cromatografía en columna para obtener all-trans-geranilgeraniol puro. Sin embargo el all-trans-geranilgeraniol es termolábil luego la destilación es difícil, mientras la separación de los estereoisómeros por columna es un procedimiento engorroso y tedioso. The increased production of geranylgeraniol by overexpression of genes in Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli has been described. Different syntheses for the preparation of geranylgeraniol have also been described. Some examples are: a) reaction of trialkylphosphonoacetates with farnesyl ketone followed by reduction with aluminum hydride, b) reaction of geranyl 4-toluenesulfonate with 8-bromo geranyl acetate in the presence of n-butyllithium followed by removal of the sulfonic moiety with metallic lithium and amines, c) allylic coupling reaction between 8-bromogeraniol protected with t-butyldimethylsilyl (TBS) and geranylbarium followed by deprotection of the hydroxyl group. Geranylgeraniol has also been obtained from geranillinalol acetate, via palladium catalyzed amination (0) and by Suzuki coupling between methanboronic acid and the 1-ketoester potassium enolate vinyl triflate obtained by reaction of the acetylacetic ester dianion with farnesyl bromide , followed by reduction with DIBAL. The product obtained by these syntheses, in most cases, is a mixture of geometric stereoisomers where one or more of the double bonds have Z stereochemistry, therefore a separation by distillation or column chromatography is necessary to obtain all-trans- pure geranylgeraniol. However, all-trans-geranylgeraniol is thermolabile then distillation is difficult, while the separation of stereoisomers by column is a cumbersome and tedious process.

Bellardia trixago (L.) All., también denominada Trixago apula Steven y Bartsia trixago L. (Scrophulariaceae) es una planta que se encuentra ampliamente distribuida por la Región Mediterránea. Su composición química revela la existencia de diferentes tipos de productos naturales como son glicósidos de iridoides y de lignanos, flavonoides y terpenos. En Andalucía se ha detectado la presencia de hasta tres quimiotipos diferentes de la planta. Uno ellos contiene altas proporciones de monomalonilester de geranilgeraniol [Barrero, A. F.; Sánchez, J. F.; Cuenca, F. G. Phytochemistry 1988, 27, 3676-3678], siendo la mejor fuente conocida en todo el mundo para este tipo de molécula. Bellardia trixago (L.) All., Also called Trixago apula Steven and Bartsia trixago L. (Scrophulariaceae) is a plant that is widely distributed throughout the Mediterranean Region. Its chemical composition reveals the existence of different types of natural products such as glycosides of iridoids and lignans, flavonoids and terpenes. In Andalusia the presence of up to three different chemotypes of the plant has been detected. One of them contains high proportions of geranylgeraniol monomalonilester [Barrero, A. F .; Sánchez, J. F .; Cuenca, F. G. Phytochemistry 1988, 27, 3676-3678], being the best known source worldwide for this type of molecule.

Bixa orellana es una planta que se desarrolla en países de la zona intertropical de América, y que también contiene geranilgeraniol. La patente [ES 2209890 T3] describe un procedimiento para la extracción de este producto y tocotrienoles de subproductos de Bixa orellana. Bixa orellana is a plant that develops in countries of the intertropical zone of America, and also contains geranilgeraniol. Patent [ES 2209890 T3] describes a procedure for the extraction of this product and tocotrienols from by-products of Bixa orellana.

Otras fuentes conocidas de geranilgeraniol son las semillas del lino (Linum usitatissimum), semillas y hojas de Sucupira (Pterodon pubescens) o el crotón (Croton eluteria). Other known sources of geranilgeraniol are flax seeds (Linum usitatissimum), Sucupira seeds and leaves (Pterodon pubescens) or croton (Croton eluteria).

Sin embargo, a pesar de las distintas fuentes y procedimientos de obtención de geranilgeraniol, sigue existiendo en el estado de la técnica la necesidad de una tecnología sencilla, simple y eficaz para la obtención de all-transgeranilgeraniol. Dado que en la mayoría de los procesos para la obtención de all-trans-geranilgeraniol existentes hoy día es necesario una separación de estereoisómeros geométricos mediante procesos difíciles o engorrosos, la presente invención simplifica la obtención de geranilgeraniol utilizando como material de partida material vegetal renovable y obtiene directamente el estereoisómero geométrico all-trans activo. El proceso implica una tecnología sencilla, lo que supone una simplificación y abaratamiento de la obtención del mismo y sus derivados. However, despite the different sources and procedures for obtaining geranylgeraniol, there is still a need in the state of the art for a simple, simple and effective technology for obtaining all-transgeranylgeraniol. Since in most of the processes for obtaining all-trans-geranylgeraniol existing today a separation of geometric stereoisomers by difficult or cumbersome processes is necessary, the present invention simplifies the obtaining of geranylgeraniol using as a starting material renewable plant material and directly obtains the active all-trans geometric stereoisomer. The process involves a simple technology, which means a simplification and lower cost of obtaining it and its derivatives.

Entre otras aplicaciones, los productos obtenidos por este procedimiento se pueden utilizar como antitumorales, antiulcerosos, antivirásicos y cardioprotectores Among other applications, the products obtained by this procedure can be used as antitumor, antiulcer, antiviral and cardioprotective

OBJECT OF THE INVENTION

La presente invención se refiere a un procedimiento (procedimiento de la invención) para la obtención de all-transgeranilgeraniol a partir de plantas de la clase Magnoliopsida. The present invention relates to a process (process of the invention) for obtaining all-transgeranylgeraniol from plants of the Magnoliopside class.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

La presente invención se refiere, en un aspecto, a un procedimiento, en adelante procedimiento de la invención, para la obtención de un compuesto de fórmula general C20H34O[(2E,6E,10E)-3,7,11,15-tetrametilhexadeca2,6,10,14-tetraen-1-ol] que comprende las siguientes etapas: The present invention relates, in one aspect, to a process, hereinafter process of the invention, for obtaining a compound of the general formula C20H34O [(2E, 6E, 10E) -3,7,11,15-tetramethylhexadeca2, 6,10,14-tetraen-1-ol] comprising the following steps:

a) Obtención de un extracto a partir de un material vegetal de partida obtenido de plantas de la clase a) Obtaining an extract from a starting plant material obtained from class plants

Magnoliopsida, preferentemente Bixa orellana o Bellardia trixago. Magnoliopsida, preferably Bixa orellana or Bellardia trixago.

b) Saponificación del extracto obtenido en a) para la obtención esteroespecífica de all-trans-geranilgeraniol. b) Saponification of the extract obtained in a) for the stereospecific obtaining of all-trans-geranylgeraniol.

En una realización particular, el procedimiento de la invención comprende además una etapa c) de purificación del all-trans-geranilgeraniol obtenido en etapa b), de manera que se obtiene un all-trans-geranilgeraniol con un menor contenido de impurezas o libre de impurezas. En otra realización particular dicha purificación se realiza mediante cromatografía en columna. En una realización preferente, la fase de purificación del all-trans-geranilgeraniol obtenido se realiza mediante cromatografía en columna de gel de sílice, eluyendo con mezclas de hexano:t-butilmetiléter de polaridad creciente para obtener all-trans-geranilgeraniol. El rendimiento que se obtiene mediante este último procedimiento está entre 0.8 y 3.5 g de geranilgeraniol puro por cada 100 g de material vegetal de partida. In a particular embodiment, the process of the invention further comprises a step c) of purification of the all-trans-geranylgeraniol obtained in step b), so that an all-trans-geranylgeraniol with a lower impurity content or free of impurities is obtained impurities In another particular embodiment said purification is performed by column chromatography. In a preferred embodiment, the purification phase of the all-trans-geranylgeraniol obtained is performed by silica gel column chromatography, eluting with hexane mixtures: t-butyl methyl ether of increasing polarity to obtain all-trans-geranylgeraniol. The yield obtained by this last procedure is between 0.8 and 3.5 g of pure geranylgeraniol per 100 g of starting plant material.

En el contexto de la presente invención material vegetal de partida se refiere a toda la parte aérea de la planta, incluyendo pero no limitándose a hojas, flores, tallos y semillas. En una realización particular, el material de partida utilizado se obtiene a partir de las partes aéreas secas y pulverizadas. In the context of the present invention, starting plant material refers to the entire aerial part of the plant, including but not limited to leaves, flowers, stems and seeds. In a particular embodiment, the starting material used is obtained from the dried and pulverized aerial parts.

En una realización particular, el material vegetal de partida se obtiene de Bixa orellana o Bellardia trixago. In a particular embodiment, the starting plant material is obtained from Bixa orellana or Bellardia trixago.

En una realización preferente, el material vegetal de partida procede de las partes aéreas de Bellardia trixago, y aún más preferentemente de Bellardia trixago quimiotipo GeGe. El rendimiento en este caso es de aproximadamente el 3.5% de all-trans-gerenilgeraniol sobre el total del peso seco de material vegetal procedente de Bellardia trixago. In a preferred embodiment, the starting plant material comes from the aerial parts of Bellardia trixago, and even more preferably from Bellardia trixago chemotype GeGe. The yield in this case is approximately 3.5% of all-trans-gerenylgeraniol over the total dry weight of plant material from Bellardia trixago.

En otra realización preferente, el material vegetal de partida se obtiene de las partes aéreas de Bixa orellana, y más preferentemente de sus semillas. El rendimiento en este caso es de aproximadamente el 1% de all-transgerenilgeraniol sobre el total del peso seco de material vegetal procedente de Bixa orellana. In another preferred embodiment, the starting plant material is obtained from the aerial parts of Bixa orellana, and more preferably from its seeds. The yield in this case is approximately 1% of all-transgerenylgeraniol over the total dry weight of plant material from Bixa orellana.

La extracción se puede llevar a cabo por técnicas ampliamente conocidas por el experto en la materia. En una realización particular del procedimiento de la invención, el extracto se obtiene, tanto en frío como en caliente, añadiendo un disolvente orgánico, preferentemente apolar, al material vegetal de partida. Dicho disolvente orgánico se selecciona del grupo formado por hexano, t-butilmetiléter, cloroformo, acetato de etilo, etanol, metanol o sus mezclas. El material vegetal de partida se extrae con el disolvente orgánico por maceración a temperatura ambiente The extraction can be carried out by techniques widely known to the person skilled in the art. In a particular embodiment of the process of the invention, the extract is obtained, both cold and hot, by adding an organic solvent, preferably apolar, to the starting plant material. Said organic solvent is selected from the group consisting of hexane, t-butyl methyl ether, chloroform, ethyl acetate, ethanol, methanol or mixtures thereof. The starting plant material is extracted with the organic solvent by maceration at room temperature

o en sistema soxhlet hasta agotamiento del material (4-24 h). Tras filtración se evapora el disolvente bajo presión reducida originándose el extracto. or in soxhlet system until material depletion (4-24 h). After filtration, the solvent is evaporated under reduced pressure, the extract originating.

Aunque la utilización de otro disolvente orgánico no afecta excesivamente al rendimiento, en una realización más preferente, la extracción se realiza con metanol. En otra realización preferente, la extracción se realiza con tbutilmetiléter. Although the use of another organic solvent does not affect performance excessively, in a more preferred embodiment, the extraction is carried out with methanol. In another preferred embodiment, the extraction is performed with t-butyl methyl ether.

En una realización particular del procedimiento de la invención, la saponificación para la obtención esteroespecífica de all-trans-geranilgeraniol se lleva a cabo utilizando diferentes bases, preferiblemente seleccionadas del grupo formado por NaOH, KOH y Na2CO3 y, preferentemente la concentración de la base es del 10% p/v. Tal y como es conocido por el experto en la materia, la saponificación se puede llevar a cabo a distintos tiempos y concentraciones. In a particular embodiment of the process of the invention, the saponification for stereospecific obtaining of all-trans-geranylgeraniol is carried out using different bases, preferably selected from the group consisting of NaOH, KOH and Na2CO3 and, preferably, the concentration of the base is 10% p / v. As is known by the person skilled in the art, saponification can be carried out at different times and concentrations.

En una realización más preferente de esta etapa, la obtención esteroespecífica de all-trans-geranilgeraniol mediante saponificación del extracto, se consigue disolviendo el extracto de Bellardia trixago GeGe en metanol y añadiendo potasa metanólica. In a more preferred embodiment of this stage, the stereospecific obtaining of all-trans-geranylgeraniol by saponification of the extract is achieved by dissolving the Bellardia trixago GeGe extract in methanol and adding methanolic potash.

REALIZATION MODES

En las realizaciones preferidas del procedimiento objeto de la invención se ha utilizado materia vegetal procedente del cultivo de plántulas de Bellardia trixago GeGe en vermiculita suplementada con Nutrichem y en cámara de cultivo a 25ºC, 75% HR, y 16:8 L:O. In preferred embodiments of the process object of the invention, plant material from the cultivation of Bellardia trixago GeGe seedlings has been used in vermiculite supplemented with Nutrichem and in a culture chamber at 25 ° C, 75% RH, and 16: 8 L: O.

Ejemplo 1: a) Fase de extracción: Example 1: a) Extraction phase:

100 g de las partes aéreas secas y pulverizadas de B. trixago se extrajeron con metanol en sistema soxhlet durante 12 h. Transcurrido este tiempo se evaporó el disolvente bajo presión reducida originándose 7 g de extracto. 100 g of the dried and pulverized aerial parts of B. trixago were extracted with methanol in the soxhlet system for 12 h. After this time, the solvent was evaporated under reduced pressure, giving rise to 7 g of extract.

b) Saponification Phase:

El extracto obtenido se disolvió en 400 mL de metanol y a la disolución se le añadió 400 mL de potasa metanólica 10%. La mezcla resultante se dejó a temperatura ambiente durante 12 horas. Transcurrido este tiempo se eliminó el metanol bajo presión reducida, se diluyó con 1 L de agua y se extrajo tres veces con 400 mL de t-butilmetileter cada vez. The extract obtained was dissolved in 400 mL of methanol and 400 mL of 10% methanolic potash was added to the solution. The resulting mixture was left at room temperature for 12 hours. After this time, methanol was removed under reduced pressure, diluted with 1 L of water and extracted three times with 400 mL of t-butyl methyl ether each time.

La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y evaporó bajo presión reducida obteniéndose 4 g de all-trans-geranilgeraniol con una pureza de aproximadamente el 95%. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and evaporated under reduced pressure to obtain 4 g of all-trans-geranylgeraniol with a purity of approximately 95%.

Example 2: a) Extraction phase:

b) Saponification Phase:

El extracto obtenido se disolvió en 400 mL de metanol y a la disolución se le añadió 400 mL de potasa metanólica 10 % p/v. La mezcla resultante se dejó a temperatura ambiente durante 12 horas. The extract obtained was dissolved in 400 mL of methanol and 400 mL of 10% w / v methanolic potash was added to the solution. The resulting mixture was left at room temperature for 12 hours.

Transcurrido este tiempo se eliminó el metanol bajo presión reducida, se diluyó con 1 L de agua y se extrajo tres veces con 400 mL de t-butilmetileter cada vez. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y evaporó bajo presión reducida obteniéndose un producto crudo. After this time, methanol was removed under reduced pressure, diluted with 1 L of water and extracted three times with 400 mL of t-butyl methyl ether each time. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and evaporated under reduced pressure to obtain a crude product.

c) Purification Phase:

El producto crudo obtenido se cromatografió en columna de gel de sílice, eluyendo con hexano:t-butilmetiléter (1:1) originándose 3.5 g de all-trans-geranilgeraniol. The crude product obtained was chromatographed on a silica gel column, eluting with hexane: t-butyl methyl ether (1: 1), giving 3.5 g of all-trans-geranylgeraniol.

Example 3:

La metodología es la misma que en el ejemplo 2, pero en lugar de usar como disolvente metanol para la extracción se usa t-butilmetileter, obteniéndose 5.5 g de extracto. Después de la saponificación se obtienen 3.5 g de all-transgeranilgeraniol. The methodology is the same as in example 2, but instead of using methanol as a solvent for extraction, t-butyl methyl ether is used, obtaining 5.5 g of extract. After saponification, 3.5 g of all-transgeranylgeraniol are obtained.

Ejemplo 4: Example 4:

La metodología es la misma que en el ejemplo 2, pero en lugar de usar en la saponificación como base KOH, se usa NaOH. El rendimiento obtenido a partir de 100 g de las partes aéreas secas es de 3.5 g de all-trans-geranilgeraniol. The methodology is the same as in Example 2, but instead of using saponification as a KOH base, NaOH is used. The yield obtained from 100 g of the dried aerial parts is 3.5 g of all-trans-geranylgeraniol.

Ejemplo 5: Example 5:

La metodología es la misma que en el ejemplo 2, pero en lugar de usar en la saponificación como base KOH, se usa K2CO3. El rendimiento obtenido a partir de 100 g de las partes aéreas secas es de 3.5 g de all-trans-geranilgeraniol. The methodology is the same as in Example 2, but instead of using saponification as a KOH base, K2CO3 is used. The yield obtained from 100 g of the dried aerial parts is 3.5 g of all-trans-geranylgeraniol.

Ejemplo 6: Example 6:

La metodología es la misma que en el ejemplo 3, realizando la extracción con t-butilmetileter, pero en lugar de usar en la saponificación como base KOH, se usa NaOH. El rendimiento obtenido a partir de 100 g de las partes aéreas secas es de 3.5 g de all-trans-geranilgeraniol The methodology is the same as in Example 3, performing the extraction with t-butyl methyl ether, but instead of using saponification as a KOH base, NaOH is used. The yield obtained from 100 g of the dried aerial parts is 3.5 g of all-trans-geranylgeraniol

Ejemplo 7: Example 7:

La metodología es la misma que en el ejemplo 3, realizando la extracción con t-butilmetileter, pero en lugar de usar en la saponificación como base KOH, se usa K2CO3. El rendimiento obtenido a partir de 100 g de las partes aéreas secas es de 3.5 g de all-trans-geranilgeraniol The methodology is the same as in Example 3, performing the extraction with t-butylmethyl ether, but instead of using saponification as a KOH base, K2CO3 is used. The yield obtained from 100 g of the dried aerial parts is 3.5 g of all-trans-geranylgeraniol

Claims

1. Procedure for obtaining all-trans-geranylgeraniol, which comprises the following stages:

a. to.: Obtención de un extracto a partir de un material vegetal de partida obtenido de plantas de la clase Magnoliopsida, Obtaining an extract from a starting plant material obtained from plants of the Magnoliopsida class,

b. b.: Saponificación del extracto obtenido en a) para la obtención esteroespecífica all-trans-geranilgeraniol. Saponification of the extract obtained in a) for stereospecific obtaining all-trans-geranylgeraniol.

2. 2.: Procedimiento según la reivindicación anterior que además comprende una etapa c) de purificación del all-transgeranilgeraniol obtenido en etapa b). Process according to the preceding claim which further comprises a step c) of purification of the all-transgeranylgeraniol obtained in step b).

3. 3.: Procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque la purificación se realiza mediante cromatografía en columna. Method according to the preceding claim characterized in that the purification is carried out by column chromatography.

4. Four.: Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el extracto se obtiene añadiendo un disolvente orgánico a la materia vegetal. Process according to any one of the preceding claims, wherein the extract is obtained by adding an organic solvent to the plant matter.

5. 5.: Procedimiento según la reivindicación anterior, donde el disolvente orgánico se selecciona del grupo formado por hexano, t-butilmetiléter, cloroformo, acetato de etilo, etanol, metanol y sus combinaciones. Process according to the preceding claim, wherein the organic solvent is selected from the group consisting of hexane, t-butyl methyl ether, chloroform, ethyl acetate, ethanol, methanol and combinations thereof.

6. 6.: Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la saponificación se lleva a cabo con un agente básico seleccionado del grupo formado por NaOH, KOH, y Na2CO3. Process according to any one of the preceding claims, wherein the saponification is carried out with a basic agent selected from the group consisting of NaOH, KOH, and Na2CO3.

7. 7.: Procedimiento según la reivindicación anterior donde el agente básico se utiliza a una concentración del 10%. Method according to the preceding claim wherein the basic agent is used at a concentration of 10%.

8. 8.: Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el material vegetal de partida se obtiene a partir de la parte aérea de la planta seca y pulverizada. Process according to any one of the preceding claims, wherein the starting plant material is obtained from the aerial part of the dried and pulverized plant.

9. 9.: Procedimiento según la reivindicación anterior, donde la parte aérea se selecciona del grupo formado por hoja, flor, tallo, semillas y sus combinaciones. Method according to the preceding claim, wherein the aerial part is selected from the group consisting of leaf, flower, stem, seeds and their combinations.

10. 10.: Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el material vegetal de partida se obtiene de Bixa orellana o Bellardia trixago. Method according to any one of the preceding claims wherein the starting plant material is obtained from Bixa orellana or Bellardia trixago.

11. eleven.: Procedimiento según la reivindicación 10 donde el material vegetal de partida se obtiene de Bellardia trixago. Method according to claim 10 wherein the starting plant material is obtained from Bellardia trixago.

12. 12.: Procedimiento según la reivindicación anterior donde el material vegetal de partida se obtiene de Bellardia trixago quimiotipo GeGe. Method according to the preceding claim wherein the starting plant material is obtained from Bellardia trixago chemotype GeGe.

13. 13.: Procedimiento según la reivindicación 10 donde el material vegetal de partida se obtiene de Bixa orellana. Method according to claim 10 wherein the starting plant material is obtained from Bixa orellana.

SPANISH OFFICE OF THE PATENTS AND BRAND

Application no .: 201231864

SPAIN

Date of submission of the application: 30.11.2012

Priority Date:

REPORT ON THE STATE OF THE TECHNIQUE

51 Int. Cl.: C07C29 / 76 (2006.01)

RELEVANT DOCUMENTS

Categoría Category: 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas 56 Documents cited Claims Affected

X X: BARRERO, A. F. et al. "Dramatic variation in diterpenoids of different populations of Bellardia trixago". Phytochemistry, 1988, Vol. 27, No. 11, páginas 3676-3678. Ver Experimental. 1-13 BARRERO, A. F. et al. "Dramatic variation in diterpenoids of different populations of Bellardia trixago". Phytochemistry, 1988, Vol. 27, No. 11, pages 3676-3678. See Experimental. 1-13

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A TO: JP 2007238508 A (TAMA BIOCHEMICAL CO LTD) 20/09/2007, (resumen) Word Patent Index [en línea]. Londres (Reino Unido) Thompson Publications Ltd, DW200781, Nº de acceso 2007877391. 1-13 JP 2007238508 A (TAMA BIOCHEMICAL CO LTD) 09/20/2007, (summary) Word Patent Index [online]. London (United Kingdom) Thompson Publications Ltd, DW200781, Accession No. 2007877391. 1-13

A TO: US 7989006 B2 (AMERICAN RIVER NUTRITION, INC.) 02/08/2011. Ver columna 6, líneas 11-33; columna 7, líneas 31-61. 1-13 US 7989006 B2 (AMERICAN RIVER NUTRITION, INC.) 08/02/2011. See column 6, lines 11-33; column 7, lines 31-61. 1-13

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the date of priority submission of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº: This report has been prepared • for all claims • for claims no:

Fecha de realización del informe 14.01.2013 Date of realization of the report 14.01.2013: Examinador N. Martín Laso Página 1/4 Examiner N. Martín Laso Page 1/4

REPORT OF THE STATE OF THE TECHNIQUE

Application number: 201231864

Minimum documentation sought (classification system followed by classification symbols) C07C Electronic databases consulted during the search (name of the database and, if possible, terms of

search used) INVENES, EPODOC, WPI, NPL, XPESP, CAS.

State of the Art Report Page 2/4

WRITTEN OPINION

Application number: 201231864

Date of the Written Opinion: 14.01.2013

Statement

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986): Reivindicaciones 6, 7, 13 Reivindicaciones 1-5, 8-12 SI NO Claims 6, 7, 13 Claims 1-5, 8-12 IF NOT

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Inventive activity (Art. 8.1 LP11 / 1986): Reivindicaciones Reivindicaciones 1-13 SI NO Claims Claims 1-13 IF NOT

The application is considered to comply with the industrial application requirement. This requirement was evaluated during the formal and technical examination phase of the application (Article 31.2 Law 11/1986).

Opinion Base.-

This opinion has been made on the basis of the patent application as published.

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WRITTEN OPINION

Application number: 201231864

1. Documents considered.-

The documents belonging to the state of the art taken into consideration for the realization of this opinion are listed below.

Documento Document: Número Publicación o Identificación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date

D01 D01: Barrero, A. F. et al. "Dramatic variation in diterpenoids of different populations of Bellardia trixago". Phytochemistry, 1988, Vol. 27, No. 11, páginas 3676-3678. 1988 Barrero, A. F. et al. "Dramatic variation in diterpenoids of different populations of Bellardia trixago". Phytochemistry, 1988, Vol. 27, No. 11, pages 3676-3678. 1988

D02 D02: ES 2209890 T3 (BARRIE, T. et al.) 04.09.2002 ES 2209890 T3 (BARRIE, T. et al.) 04.09.2002

D03 D03: JP 2007238508 A (TAMA BIOCHEMICAL CO LTD) 20.09.2007 JP 2007238508 A (TAMA BIOCHEMICAL CO LTD) 09.20.2007

D04 D04: US 7989006 B2 (AMERICAN RIVER NUTRITION, INC.) 02.08.2011 US 7989006 B2 (AMERICAN RIVER NUTRITION, INC.) 02.08.2011

2. Statement motivated according to articles 29.6 and 29.7 of the Regulations for the execution of Law 11/1986, of March 20, on Patents on novelty and inventive activity; quotes and explanations in support of this statement

The application refers to a process for obtaining all-trans-geranylgeraniol comprising the steps of preparing an extract from plants of the Magnoliopside class and saponification of said extract.

Document D01 discloses obtaining all-trans-geranylgeraniol by extracting hexane from plant material from Bellardia trixago plants and subsequent saponification of the extract resulting from the extraction. Said compound is obtained after the saponification stage together with other compounds, such as trixagol. The all-trans-geranylgeraniol can be isolated and purified from the rest of the products present in the extracts of the plant material by conventional column chromatography on silica gel (Experimental).

The invention defined in claims 1-5 and 8-12 of the application derives directly and unequivocally from what is disclosed in document D01, thus lacking novelty (Art. 6.1 LP 11/1986).

Claims 6 and 7 refer to the use of NaOH, KOH or Na2CO3 as basic agents for carrying out the saponification reaction. Said bases are those commonly used in saponification reactions, therefore it is considered that a person skilled in the art within a routine activity and without the need of an inventive effort could carry out the saponification reaction disclosed in D01 with said bases, giving as a result the procedure set forth in claims 6 and 7.

Consequently, the invention defined in claims 6 and 7 of the application lacks inventive activity (Art. 8.1 LP 11/1986).

In relation to claim 13, related to obtaining all-trans-geranylgeraniol from plant extracts of Bixa orellana plants, novelty is also recognized but not inventive activity. Since no examples are collected in the application with said plant and it is known that Bixa Orellana extracts (Magnoliopsida as well as the Bellardia trixago plants disclosed in document D01), they are a source of all-trans-geranylgeraniol (see for example D02, page 5, lines 20-30; D03, summary; D04, column 6, lines 11-33; column 7, lines 31-61), it is considered that one skilled in the art could obtain the all-trans-geranylgeraniol compound from said plant applying the procedure defined in document D01 with a reasonable expectation of success.

Therefore, the invention defined in claim 13 lacks inventive activity (Art. 8.1 LP 11/1986).

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