ES2392604B1

ES2392604B1 - Método para la identificación del sexo en peces

Info

Publication number: ES2392604B1
Application number: ES201130778A
Authority: ES
Inventors: Iban CANCIO URIARTE; Oihane DIAZ DE CERIO ARRUABARRENA; Iratxe ROJO BARTOLOMÉ; Eider BILBAO CASTELLANOS; Urtzi IZAGUIRRE ARAMAYONA; Amaia ORBEA DEL REY; Manuel SOTO LOPEZ; Juan Antonio MARIGÓMEZ ALLENDE; Miren Pilare CAJARAVILLE BEREZIARTUA; Maren ORTIZ ZARRAGOITIA
Original assignee: Euskal Herriko Unibertsitatea
Current assignee: Euskal Herriko Unibertsitatea
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2011-05-13
Publication date: 2013-09-17
Anticipated expiration: 2031-05-13
Also published as: ES2392604A1; WO2012156563A1

Abstract

Método para la identificación del sexo en peces. La presente invención se relaciona con el uso del ARN ribosómico 5S (ARNr 5S), del ARN ribosómico 18s (ARNr 18S) o del ARN ribosómico 28S (ARNr 28S), como marcador para identificar el sexo en peces. Asimismo, la invención también se relaciona con un método para clasificar por sexos una población de peces que comprende la determinación del nivel de expresión del ARNr 5S.

Description

MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN DEL SEXO EN PECES

CAMPO DE LA INVENCiÓN

5: La presente invención se relaciona con un método para la determinación del sexo en peces mediante la detección de la expresión del ARN ribosómico SS, 18S o 28S en las gónadas de dicho pez,. La presente invención tiene su aplicación en el campo de la pi scicultura (en el manejo y optimización de la cría de peces), en el de las pesquerías (el estudio de las dinámicas de peces comerciales en provisión) y en el de la toxicología ambiental (estudio de los efectos biológicos de xenobióticos ambientales).

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ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

1 S 20 2S: La estimación del estadi o de madurez reproductiva, así como la determinación de la proporción de sexos de las poblaciones de peces en aguas europeas, es un requisito de la DCF (Data Collection Framework) de la Unión Europea como parte de la política para mejorar la gesti ón de las pesquerías. Para ello, es crucial identificar el sexo de los animales incluidos en estudios de mortalidad, crecimiento y de patrones de migración de las provisiones piscí colas, ya que puede haber diferencias importantes asociadas al sexo en estos parámetros. Estas diferencias así mismo, pueden ser decisivas en la determinación del éxito reproductor de di chas provisiones. Hoy en dí a, determinar la madurez reproducti va y el sexo en especies de peces comerciales es muy labori oso y frecuentemente surge la necesidad de anaJizar gónadas de un gran número de individuos medi ante análisis visual o hi sto lógi co en e l lab o rato ri o. Pe ro las camp aña s oceanográficas no siempre coinciden con la época reproductiva y esto dificulta (o imposibilita) la estimación del sexo. Un estudio más preci so de la estructura poblacional (proporción sexual y madurez) de peces comerciales mejoraría significati vamente los modelos de evaluación de estas provisiones.

Por otro lado, los estudios de salud ambiental y biomonitorización de la polución se centran últimamente en descifrar los mecani smos de acción de los compuestos químicos liberados al medio. Las bases moleculares de estos mecanismos vienen siendo

30: estudiados en especi es centinela de la contaminación vía tecnologías denomi nadas " omic"-as (principalmente transcriptómica). La alta sensibilidad de estas introduce

mucho ruido de fondo cuando se estudian machos y hembras por 10 que los estudios en

especies centinela se centran en organismos juveniles o de un sexo en particular

pudiendo perder así mucha información. Por ell o, existe la necesidad de revelar el sexo

del organismo centinela objeto de estudio. Con ello, se lograría reducir el ruido presente

S: en los perfiles de respuesta de muchos biomarcadores de exposición a xenobióticos. Por

otra parte, al gunos xenobióticos y factores abióticos, como por ejemplo la temperatura,

la di sponibilidad de oxigeno o el pH (todos ellos importantes actores en el proceso de

cambio climático global) , pueden llegar a producir cambios relevantes en la

determinación y diferenciación sexual de los organ ismos acuáticos. Por Ejemplo,

ID: recientemente, en la Reserva de la Biosfera de Urdaibai (Gernika) se ha descrito un

porcentaje relativamente alto de machos de peces de la especie Che/ol1/abrosus (muble)

que muestran oocitos entre sus folículos espermáticos. Este fenómeno es denominado

intersex y está asociado en el caso de los mubles de Gernika a la alta biodisponibilidad

de alquilfenol es.

I S: El mayor problema del cultivo de peces en estanques es la distinta velocidad de

crecimiento de los peces machos y hembras. Para prevenir este problema, los estanques

deben sembrarse únicamente con ejemplares de un único sexo, en lo que se denomina

cultivo monosexo. Esta técnica se utili za, por ejemplo, cuando se necesita producir

peces grandes para el mercado y los machos se escogen porque crecen casi el doble que

20: las hembras. El resultado del cultivo monosexo es una mejor fuente de proteína y una

mayor ganancia para el piscicultor.

Así, uno de los mayores problemas a los que se enfrentan las pi scifactorías es el control

poblacional de los peces, para lo cual es necesario separar los peces por sexos,

optimizando el rendimiento del cultivo de peces.

2S: La determinación del sexo en peces puede llevarse a cabo de diferentes maneras, por

ejemplo, mediante el sexado a mano, en donde el sexo del pez se puede distinguir

visualmente inspeccionando la papila genital en la parte ventral del pez, observando los

opérculos (lo que tapa a las branquias) O el orificio cloacal , el tamaño de las aletas

dorsales, la coloración de las escamas, etc. El parámetro a elegir en el sexado dependerá

30: de las características fenotípicas del pez en cuestión. Los piscicultores con experiencia

pueden separar manualmente (sexar) cerca de 2000 peces al día, pero este método no es

100% efectivo.

Otros métodos de sexado incluyen el empleo de dispositivos capaces de medir simultáneamente varias características morfológicas que diferencian machos de hembras, o el empleo de marcadores moleculares que se expresan diferencialmente dependiendo del sexo del individuo.

S: La solicitud de patente US20082 10766 describe un dispositivo para determinar el género de un pez mediante la medida de sus características morfológicas, como son la longitud del cuerpo, la longitud de la cabeza, la longitud del cuerpo, etc.

10: La solicitud de patente W02009063 1 O 1 describe un método para determinar el sexo de los peces basado en la di fe rencia de color entre la s gónadas de los machos y la s hembras, que consiste en la inserción de una sonda en las gónadas del pez y analizar el espectro de luz obtenido tras una radiación electromagnética sobre la gónada.

En la misma línea, la solicitud de patente US3859522 describe un método y un aparato para determinar el sexo de un pez basado en la distinta manera de dispersar la luz de las huevas presentes en el pez hembra y del esperma presente en el pez macho.

15: La solicitud de patente CNI0 1429557 describe un metodo para determinar el sexo de los peces de la familia Pleffrolleclidae, que comprende extraer ADN de la aleta e identificar mediante AFLP (Amplified fragmem /el1glh polymOlphism) marcadores moleculares específicos de las hembras que presentan un peso molecular de 533 pb Y 218 pb.

20: La solicitud de patente CNlOl240348 describe un metodo para el sexado genetico de peces que comprende la extracción del ADN , el diseño y síntesis de cebadores específico de LAMP, y la detección de los productos de amplifi cación de LAMP para determinar el sexo del individuo, siendo la detección de los productos de amplificación indicativos de que el pez pertenece al sexo femenino.

25: Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de desarrollar métodos alternativos a los existentes en el estado de la técnica, que permitan la identificación del sexo en los peces para el establecimiento de cultivos monosexo.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Los inventores de la presente invención han descubierto que una simple electroforesis

del ARN total obtenido a partir de una muestra biológica de las gónadas de un pez,

presenta una di stribución de bandas capaz de diferenciar individuos según el sexo. La

aparición de una banda con un tamaño aproximado de 120 nucleótidos, que tras su

S: secuenciación se vio qu e correspondía al ARN ribosómico SS (ARNr SS), permite

concluir que el pez es de sexo femenino (hembra). Por otro lado, la aparición de una

banda correspondiente al ARN ribosómico ¡SS (ARNr 18S) y/o al ARN ribosómico

18S (ARNr 28S), permite concluir que el pez es de sexo maculino (macho) (Ver

Ejemplo 1 y Figuras 1, 3 Y 4). Por 10 tanto, según la presente in vención, es posible

10: emplear e! ARN ribosómico presente en las gónadas de un pez como marcador para

identificar el sexo de este.

Así. en un aspecto, la invención se relaciona con el uso del ARNr 5S, del ARNr l8S o

del ARNr 28S como marcador para identificar el sexo de los peces.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para determinar el sexo de un

15: pez que comprende detectar la expresión del ARNr 5S, del ARNr lSS y del ARNr 2SS

en una muestra biológica de las gónadas de dicho pez, en donde

si la expresión del ARNr 5S detectada es mayor que la expresión del ARNr l8S

o del ARNr 28S detectada, entonces el pez es de sexo femenino, o

si la expresión del ARNr 18 S o del ARNr 28S detectada es mayor que la

20: expresión del ARNr 5S detectada, entonces el pez es de sexo masculino.

Adicionalmente, los inventores también han descubi erto que el ni vel de expresión de

dicho ARNr 5S es diferente en machos y hembras, pudiendo emplear el ni ve! de

expresión del ARNr 5S como un nuevo marcador molecular para identificar el sexo de

los peces. En concreto, los inventores han observado, tal como se muestra en el Ejemplo

25: l de la presente memoria, que el nivel de expresión del ARNr 5S en las gónadas de

peces macho de muble (incluidos macho intersex) es menor que en las gónadas de peces

hembra, pudiendo desarrollar así un método para el sexado de peces basado en la

cuantificación de ARNr 5S gonadal, puesto que d icho ARNr SS está altamente

conservado en todas las especies de peces. Por otro lado, tal como se muestra en los

30: Ejemplos 2 y 3, los inventores también observaron que los ni veles de expresión de tanto

las moléculas asociadas al ARNr 5S, como las moléculas implicadas en el transporte de

proteínas que intervienen en la regulación de la transcripción del gen que codifica el

ARNr 5S, son similares a los ni veles de expresión del ARNr 5S, es decir, están más

expresados en hembras que en machos, por 10 que también pueden emplearse como marcador en el sexado de peces.

S: Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del ARNr SS, de una molécula asociada al ARNr SS, o de una molécula implicada en el transporte de proteínas que intervienen en la regulación de la transcripción del gen que codifica el ARNr SS, como marcador para identificar el sexo de los peces.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para clasificar por sexos una población de peces, en donde dicho método comprende

10 15: (i) determinar el nivel de expresión del ARNr SS, de una molécula asociada al ARNr SS, o de una molécula implicada en el transporte de proteínas que intervienen en la regulación de la transcripción del gen que codifica el ARNr SS, en las gónadas procedentes de dicha población de peces, y (ii) observar el patrón de distribución de los niveles de expresión obtenidos, en donde si aparecen dos poblaciones muestrales significativamente distintas entre sí, entonces los individuos (peces) que forman parte de la población muestral que presenta el mayor ni vel de expresión son hembras, y los individuos que forman parte de la población muestral que presenta el menor nivel de expresión son machos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

20 25: La Figura l muestra el resultado de l a electroforesis (RNA chip , Agilent 2100 Bionalyzer) de ARN total extraído de la gónada de mubles hembras (F, muestras "1 a 5) y machos (M, muestras 6 a 10), capturados en julio 20 10 en el puerto de Pasaia (GuipÚzcoa). La banda más potente que aparece en las muestras de hembra pertenece al ARNr SS, mientras que las 2 bandas más fuertes de machos pertenecen al ARNr 18S y ARNr 28S. Perfil de fluorescencia del gel indica lo mismo.

30: La Figura 2 muestra el resultado de la cuantificación de los niveles de transcripción de ARNr SS. Rosa=hembra (F), azul = macho (M), amari llo = intersex (1). Los niveles de transcripción de 5S rRNA son mucho mayores en las hembras capturadas en los estuarios de Bilbao (B), Pasaia (P), Plentzia (PL) y Urdaibai (U) que en los machos. En el puerto de Pasaia estas diferencias son demostrables en todos los meses estudiados.

Letras diferentes indican diferencias signifi cativas entre medianas. Pasaia en Julio es donde encontramos menos diferenci a entre hembras y machos. Así y todo, la diferencia es de 6-7 ciclos de amplificación.

S: La Figura 3 mues tra el r esultad o de la ele ctrofo resis (RNA c hip, Agil ent 2 100 Bi onalyzer) de ARN total extraído de la gónada de pez cebra hembras (muestras 1 a S) y machos (muestras 1 a 10). La banda más potente que aparece en las muestras de hembra perte nece al ARNr SS, mi entras qu e las 2 b andas más fue rt es de machos pertenecen al ARNr 18S y 28S. Perlil de flu orescencia del gel indi ca lo mi smo.

10 15: La Figura 4 mues tra el r esult ado de la electroforesis (R NA c hip, Agil ent 2 100 Bionalyzer) de ARN total extraído de la gónada de merluza hembras (H, muestras I a 7, en color rosa) y machos (M, muestras 8 a 10, en color ázul), obtenidos en la lonja de pescadores de Bermeo (Bi zkaia) en el mes en Marzo 20 11. La banda más potente que aparece en las muestras de hembra pertenece al ARNr SS, mi entras que las 2 bandas más fu ertes de machos pertenecen al ARNr 18 y 28 S. Perfil de flu orescencia del gel indi ca lo mi smo.

La Figura S es un grá fi co qu e mu estra la rut a de acumulación y empaquetami ento del ARNr SS.: regul ación transcripcional,

20 2S: La Figura 6 muestra el resultado de la cuantifi cación de los ni veles de transcripción de las proteínas relacionadas con el factor de transcrip ción III (TFHla.) y la proteín a 42sp4 3. Rosa=hembra (F), azul = macho (M), amarill o = intersex (1). Los ni veles de transcripción de ARNr SS son mucho mayores en las hembras capturadas en los estuari os de Bilbao (B), Pasaia (P), Pl entzia (PL) y Urdaib ai (U) que en los machos. En el puerto de Pasaia estas diferencias son demostrables en todos los meses estudi ados. Letras diferentes indi can diferencias signifi cati vas entre medi anas. Pasai a en Juli o es donde encontrarn os menos diferencia entre hembras y machos.

30: La Fi gura 7 muestra los niveles de ex presión de lMPa 1 y 2, pudi end o diferenci ar hembras y machos en los 4 estuari os estudiados, y en todos los meses estudi ados en el puerto de Pasaia. Diferencias relativas de ex presión entre sexos son simil ares a los mostrados por ARN r SS, TF lllA y 42sp43. Asimi smo, sirven como marcadores de machos intersex (asteri scos muestran oocitos dentro de fo lí cul os espermáticos de un

mubl e macho capturado en Noviembre). fMP J32 en cambio no muestra transcripción diferencial entre ambos sexos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

S 10 1 S: Los inventores de la presente invención han descubi erto que una simple electroforesis del ARN total obtenido a partir de un a muestra bi ológica de las gónadas de un pez, presenta una di stribución de bandas capaz de diferen ciar indi viduos según el sexo. La apari ción de un a banda con un tamaño aprox im ado de 120 nucl eótidos, que tra s su secuenciación se vio que corres pond ía al ARN ribosómi co SS (ARNr SS), permite concluir que el pez es sexo femenino (hembra). Por otfO lado, la aparición de una banda correspondi e nte al ARN ribosómi co 1 SS (ARNr 18S) y/o al ARN ribosómi co 28S (ARN r 28S), permite concluir que el pez es de sexo maculino (macho) (Ver Ejemplo 1 y Figuras 1, 3 Y 4). Por lo tanto, según la presente invención, es posibl e empl ear el ARN ribosómi co presente en las gónadas de un pez como marcador para identifi car el sexo de este.

Así, en un aspecto, la in vención se relaciona con el uso del ARNr SS, del ARNr 28S, como marcadores para identifi car el sexo de los peces.: del ARNr 18S o

20 25: En otro aspecto, la invenció n se relaciona con un método para determinar el sexo de un pez que comprend e detectar la expresión del ARNr SS en un a muestra bi ológica de las gónadas de di cho pez, en donde si dicha banda es deleclada, enlonces el pez es de sexo femenino. En otro aspecto, la invenció n se relaciona con un método para determin ar el sexo de un pez, de aquí en adel ante, p rim er método de la in vención, que comprend e detectar la ex presión del ARNr SS, del ARNr l8S y del ARN r 28S en una muestra biológica de las gónadas de di cho pez, en donde

si la expresión del ARNr SS detectada es mayor que la expresión del ARNr 18S o del ARNr 28S detectada, entonces el pez es de sexo femenino, ° si la ex pres ión del ARNr 18S o del ARNr 28S detectada es mayor que la ex presión del ARNr SS detectada, entonces el pez es de sexo masculino.

S 10: En la presente invención, el término "pez" se refi ere a cualqui er animal dentro de una superc1ase de animales vertebrados acuáticos gl1alOslomados (qui ere decir provistos de mandíbulas articuladas), dotados de aletas pares y que respiran por branquias. Los peces son mayoritari amente marinos (incluyen, pero no se limitan a, la sardina, el boquerón, el arenque, el atún, la caballa, la barr3cuda, el rodaballo, ellenguarlo, etc.), aunque existen variadas especies de agua dulce (incluyen, pero no se limitan a, la trucha, el esturi ón, la carpa, el barb o, el1ucio, etc.), y vari edades cuyo ciclo reproducti vo transcurre entre el mar y los ríos (incluyen, pero no se limitan, los salmones y las anguilas). A su vez, los peces se di viden en COf1drictios (de esqueleto cartilaginoso), y Osteictios (de esqueleto óseo).

En una realización particular, el pez se selecciona del grupo que consiste en el muble (Chelof1 labroslIs), el pez cebra (/Jaf1io rerio) y la merluza (Merlllccius merlllccills).

15: La puesta en prácti ca del método de la invención requiere la extracción del AR N total de una muestra biológica procedente de las gónadas del pez, lo cual puede hacerse por cualquiera de los métodos disponibles en el estado de la técnica para la extracción de ácidos nuc1eicos (Sambrook el al., 200 1. " Molecul ar c1 oning: a Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spnng Harbor Laboralo!)' Press, N. Y., Vol. 1-3).

20: Para este propósito, la muestra biológica procedente de las gónadas del pez se puede tratar para di sgregar de forma fi sica o mecánica la estructura del tej ido o célul a para liberar los componentes intracelulares en una solución acuosa u orgánica para preparar los ácidos nucl eicos para análisis adi cionales. Posteri orm ente, los ácidos nucl eicos se extraen de la muestra mediante procedimientos conocidos para el experto en la materi a y di sponibles comercialmente. Como sabe el experto en la materia, se ti ene cuidado para evitar la degradación del ARN durante el proceso de extracción.

25: Una vez extraído y aislado el ARN total de la muestra procedente de las gónadas del pez, es decir, de los órganos reproductores del pez, se procede a detectar la expresión del ARNr SS, del ARNr l8S y del ARNr 28S por cualquiera de los procedimi entos que existen en el estado de la técni ca, como por ejemplo, medi ante electroforesis o un chip de ARN.

30: La electroforesis es una técni ca para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada

de un soporte sólido (por ejemplo, electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o

bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en di solución

(electroforesi s libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en

distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa. La variante de LI SO más

S: común para el análisis de ácidos nuc1eicos utiliza como soporte un gel, habitualmente

de agarosa o de poliacrilamida. La preparación y realización de electroforesis para la

separación de ácidos nuc1eicos es práctica de rutina para el experto en la materia, e

inform ación sobre la mi sma puede encontrarse en Sambrook el al. , 2001 (citado ad

supra). Una vez realizada la electroforesis se procede a la detección de las bandas en el

10: soporte mediante técnicas de tinción y, si se visualizan las bandas correspondientes al

ARNr 5S, al ARNr 18S y al ARNr 28S, se puede entonces concluir que

si la expresión del ARNr SS detectada es mayor que la expresión del ARNr 18S o

del ARNr 28S detectada, entonces el pez es de sexo fem enino, o

si la exp resión del ARNr 18S o del ARNr 28S detectada es mayor que la

1 S: expresión del ARNr SS detectada, entonces el pez es de sexo masculino.

En la presente invención se entiende por " ARN ribosómico SS" O " ARNr SS" a la

molécula de ARN que forma parte de la subunidad mayor del ribosoma eucariota, junto

con el ARNr 28S, el ARNr S.8S y 49 proteínas. Dicho ARNr SS presenta un tamaño de,

aproximadamente, 120 nucleótidos.

20: En la presente invención se entiende por " ARN ribosómico 18S" O "ARNr 18S" a la

molécula de ARN que forma parte de la subunidad menor del ribosoma eucariota, junto

con 33 proteínas.

En la presente invención se entiende por " ARN ribosómico 28S" O "ARNr 28S" a la

25: con el ARNr SS, el ARNr 5.8S y 49 proteínas.

Adicionalmente, los inventores también han descubierto que el nivel de expresión de

dicho ARNr SS es diferente en machos y hembras. En concreto, los inventores han

observado, tal como se muestra en el Ejemplo 1 de la presente memoria, que el nivel de

expresión del ARNr SS en las gónadas de peces macho de muble (incluidos macho

30: intersex) es menor que en las gónadas de peces hembra, pudiendo desarroll ar así un

método para el sexado de peces basado en la cuantificación de ARNr SS gonadal,

puesto que di cho ARNr 5S está altamente conservado en todas las especies de peces.

Por otro lado, tal como se muestra en los Ejemplos 2 y 3, los inventores también

observaron que los niveles de expresión de tanto las molécul as asociadas al ARNr SS

como las molécul as impli cadas en el transporte de proteínas que intervienen en la

S: regul ación de la tran scripción del gen que codifica el ARNr SS, son similares a los

ni veles de expresión del ARNr SS, es decir, están más expresados en hembras que en

machos, por lo que también puede emplearse como marcador molecular en el sexado de

peces.

Por 10 tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para clasificar por

10: sexos una población de peces, de aquí en adelante, segundo método de la invención, en

donde dicho método comprende

(i) determinar el ni vel de expresión del ARNr SS, de una molécula asociada al

ARN r SS, o de una molécula implicada en el transporte de proteínas que

intervienen en la regulación de la transcripción del gen que codifica el ARNr

15: SS, en las gónadas procedentes de di cha población de peces, y

(ii) observar el patrón de distribución de los ni veles de expresión obtenidos,

en donde si aparecen dos poblaciones muestrales significati vamente distintas entre

sí, entonces los individuos que forman parte de la población muestral que presenta

el mayor ni vel de ex presión son hembras, y los individuos que form an parte de la

20: población muestral que presenta el menor nivel de expresión son machos.

Los ténninos " pez" y "ARNr SS", así como los métodos de extracción del ARN a parti r

de una muestra bi ológica procedente de las gónadas del pez, han sido descritos

previamente para el prim er método de la invención y su definici ón es apli cable al

segundo método de la in vención. En una reali zación particular, el pez se selecciona del

25: grupo que consiste en el muble, el pez cebra y la merluza.

Una vez obtenido el ARN, la puesta en práctica del segundo método de la invención

comprende determinar el ni vel de expresión del ARNr SS, de una molécula asociada al

ARNr SS, o de una molécula implicada en el transporte de proteínas que intervienen en

la regulación de la transcri pción del gen que codifica el ARNr SS, en las gónadas del

30: pez.

Los ni veles de expresión del ARNr 5S obtenido según se ha mencionado anteri ormente

pueden ser determinados medi ante ensayos de hibri daci ón o de amplifi cación que

incluyen, sin limitación, ensayos de Nonhern B101 y reacción en cadena de polim erasa

(PCR). Preferibl emente, la detección del ARNr se lleva a cabo tras una reacción previa

S: de transcripció n inversa del ARNr al AONc, utili zando la enzima transcriptasa inversa y

el ADNc resultante es amplifi cado usando técnicas de amplificación ampli amente

conocidas, tales como la reacción en cadena de la polimerasa clásica (PCR), reacción en

cadena de polim erasa en ti empo real (" RT-PCR"), reacción en cadena de ¡igasa

("LCR"), replicación de secuencias auto-sostenida ("3SR") tambi én conocida como

10: amplifi cación basada en secuencias de ácidos nucleicos ("NASBA"), amplificación Q

B-Repli casa, ampli ficación por ci rculo rodante ("RCA"), amplifi cación mediada por

tran scrip ció n ("TM A") , amplifi ca ci ó n asi stid a po r e nlaza do res ("LADA"),

amplificación por desplazamiento múltiple (" MOA"), amplificación por desplazamiento

de la cadena y del invasor ("SDA" ). Otro método para la detección del ARNr SS incluye

1 S: el uso de sondas que son capaces de hibridar específicamente con el ARNr. La sonda

puede ser un ADNc de cadena completa O un fragmento del mi smo como por ej emplo

un oli gonucl eotido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud

capaz de hibiridar con al ARNr o ADNc di ana en condi ciones de estri ctas. En una

reali zación preferida de l a in vención, el ARNr es sometid o a una reacció n de

20: transcripción inversa y el ADNc resultante se ampl inca mediante una reacció n en

cadena de polimerasa en tiempo real.

En la presente invención, se entiende po r "molécula asociada al ARNr SS" a aquellas

molécul as o proteín as qu e se unen al ARNr SS y que, por ej empl o, ayudan a su

almacenamiento en el citosol hasta que el ARNr es requerido para formar los ribosomas

25: (ver Figura 5). En una realización parti cular, la molécula asociada al ARN SS es el

factor de transcripción general I1IA (TFIIIA) o la proteína 42sp43.

En la presente invención, se enti ende por "molécul a implicada en el transporte de

proteínas que intervienen en la regul ación de la transcripción del gen que codifi ca el

ARNr SS" a aquellas molécul as o proteínas que transportan desde el citosol al núcl eo

30: celular (o viceversa) proteínas necesari as para la transcripción, como por ejemplo, los

factores de transcripción. Ej empl os de molécul as impli cadas en el transporte de

proteínas que intervienen en la regulación de la transcripción incluyen, sin limitar a, las

importinas y las exportinas. En una realización particular, molécula implicada en el

transporte de proteínas que interviene en la regul ación de la transcripción del gen que

codifica el ARNr SS, es la proteína importina a -l o la proteína importina 0.-2.

Como enti ende el experto en la materia, los niveles de expresión ti enen que ser

S: normalizados. Para normali zar los val ores de expresión entre las diferentes muestras, es

posible comparar los ni veles de expresión de la molécula de interés (el ARNr SS, una

molécula asociada al ARNr SS, o una molécula implicada en el tran sporte de proteínas

que intervienen en la regulación de la transcripción del gen que codifica el ARNr SS) en

las muestras a ensayar con la expresión de un ARN control. Un "ARN control" como se

1 O: usa, se refiere a un ARN cuyos niveles de expresión no cambian o solo cambian en

cantidades limitadas. Preferiblemente, los ARN control son ARN derivados de genes de

mantenimiento y que codifican proteínas que se expresan de forma constitutiva y que

ll evan a cabo funci ones celulares esencial es. Ejemplos de genes de mantenimi ento

incluyen, pero no se limitan a, j3-2-microglobulina, ubiquitina, ciclofilina, GAPD H y

1 S: actina. En una forma de realización, la cuantificación de la expresión génica relativa se

calcula según el método comparati vo Ct usando j3-actina como control endógeno y

controles de ARN comerciales como calibradores. Los resultados finales se determinan

según la fórmula 2 -(det de la muestra -det del calibrador), donde los valores det

del calibrador y de la muestra se determinan sustrayendo el valor Ct del gen diana del

20: valor del gen de la j3-actina.

Una vez calculado el ni vel de expresión, el segundo método de la invención comprende

observar el patrón de di stribución de los ni veles de expresión obtenidos y, en fun ción de

di cho patrón de distribución, concluir el sexo de los peces anali zados.

En la presente invención, se entiende po r "patrón de distribución" a la posición que

25: presentan un conjunto de valores en función de un parámetro. En el contexto de la

presente invención, el patrón de distribución hace referencia a la posición de cada uno

de los ni veles de expresión obtenidos en función de la concentración de la molécul a que

se está midi endo, por ejemplo, en fun ción de la concentración de ARNr SS. Una vez

obtenido el patrón de di stribuci ón de los ni vel es de ex presión, si aparecen dos

30: poblaciones muestrales significativamente distintas entre sí, entonces los individuos que

forman parte de la población muestral que presenta el mayor ni vel de expresión son

hembras, y los individuos que forman parte de la población muestra! que presenta el menor ni vel de expresión son machos.

S: En la presente invención se entiende por "poblaci ón muestra!" al conjunto de valores que presentan un patrón de distribución si milar, es decir, al conjunto de ni veles de expresión cuya posición en función de la concentración es similar o está cercana uno de otros.

10 15: En la presente invención se entiende que dos poblaciones muestrales (pi y p2) son significativamente distintas entre sí, cuando cada población muestra! presenta un patrón de di stribución cuya mediana (m 1 y m2) es di stinta, y cuando la distancia entre un elemento de una población muestral (por ejemplo, e l) Y la mediana de la otra población muestral (m2) es mayor que la distancia entre el elemento de la población muestral (el) y la mediana de la población muestral a la que pertenece (m 1). En este contexto, la mediana hace referencia al valor de expresión medio de todos los valores de expresión que pertenecen a la misma población muestra!. Como entiende el experto en la materia, existen métodos estadísticos que permiten averiguar si dos poblaciones muestrales son significativamente distintas entre sí.

20: No obstante, es posible que existan valores de expresión que no presenten un patrón de distribución similar a alguna de las poblaciones muestrales y, por lo tanto, dichos valores intermedios no puedan ser clasificados como procedentes de un pez macho o un pez hembra. En este caso, los indi viduos de la población de peces cuyos niveles de expresión estén significativamente desviados de la media de los niveles de expresión de cada una de las poblaciones muestrales, son machos intersex.

25: En la presente invención se entiende por "macho intersex" al pez macho que debido a su exposición a xenoestrogénos ambientales muestran oocitos entre sus folículos espermáticos.

30: Como se ha indicado previamente, en una realización particular del segundo método de la invención, el nivel de expresión se mide preferiblemente mediante una reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (RT -PCR). Si este es el caso, entonces el nivel de expresión viene determinado por la Ct de la RT-PCR. Por lo tanto, en una reali zación particular del segundo método de la invención, el valor Ct de la población que presenta el menor ni vel de expresión medio es igualo mayor en 2, preferiblemente en 3, más

preferiblemente en 4, todavía más preferentemente en 5 unidades que el valor el de la

población que presenta el mayor ni vel de expresión medio.

De form a análoga al segundo método de la invención, la presente invención tambi én

contempla un método para cl asificar por sexos una población de peces, en donde dicho

S: método comprende

(i) determinar el ni vel de expresión del ARNr ¡8S y/o del ARNr 28S, en las

gónadas procedentes de di cha población de peces, y

en donde si aparecen dos poblaciones muestrales significativamente distintas entre sí,

10: entonces los individuos que forman parte de la población muestral que presenta el

mayor ni vel de expresión son machos, y los indi viduos que forman parte de la población

muestral que presenta el menor nivel de expresión son hembras.

La presente invención se basa en la observación de que el ni vel de expresión del ARNr

SS (o de una molécul a asociada al ARNr SS , o de una molécula impli cada en el

1 S: transporte de proteínas que intervienen en la regulación de la transcripción del gen que

codifica el ARNr SS) en las gónadas de peces hembra es mayor que en las gónadas de

peces machos y por lo tanto, en función de di cho parámetro, es posibl e diferenciar

machos de hembras en una población de peces. Como entiende el experto en la materi a,

la determinación de los ni veles de expresión para averiguar si un pez dado es macho o

20: hembra, también puede realizarse mediante la correlación del nivel de expresión con un

val or de referencia, cuya obtención es práctica de rutina para el experto en la materi a.

El valor de referencia puede corresponder, por ejemplo, al valor mediana de los ni veles

de expresión de ARNr SS, de una molécul a asociada al ARNr SS, o de una molécul a

implicada en el transporte de proteínas que intervienen en la regul ación d e la

25: transcripción del gen que codifi ca el ARNr SS, medidos en las gónadas en una

población peces de la misma especie y en el mi smo estado fi siológico que el pez cuyo

sexo de qui ere averi guar. El número de peces que constituye la pobl ación que va ser

empl eada para establ ecer el valor mediana, está constituido por un número de

indi viduos qu e sea 10 suf icientement e alto com o para ser estadísti camente

30: representativo. Una vez establecido este valor medi ana, se puede comparar el ni vel de

expresión obtenido en el pez cuyo sexo se quiere averi guar con dicho valor mediana, y

de esta manera ser asignad o al ni vel de baj o (macho), medio (macho intersex) o alto

(hembra). No obstante, debido a la variabilidad entre los ejempl ares (ciclo reporductor,

sexo, dilución, calidad de la muestra estudiada) resulta muy difi cil establ ecer valores de

referencia absolutos para el ARNr SS, una molécul a asociada al ARNr SS, o una

S: molécul a implicada en el transporte de proteín as que intervienen en la regul ación de la

transcripción del gen que codifi ca el ARNr SS. Por este moti vo, puede ser preferibl e

establ ecer dos valores de referenci a, de aquí en adelante, primer y segundo valor de

referencia, en donde

si el ni vel de ex presión del ARNr SS, de un a molécul a asoci ada al ARNr SS, o una

10: molécul a implicada en el transporte de proteínas que intervi enen en la regulació n de

la transcripción del gen que codifi ca el AR Nr SS, es menor O igual que un primer

valor de referencia, entonces el pez es del sexo femenino,

si el ni vel de ex presión del ARNr SS, de una molécul a asociada al ARNr SS, o una

molécul a implicada en el transporte de proteínas que intervienen en la regulación de

1 S: la tran scripción del gen que codifi ca el ARNr SS, es mayor o igual que un segundo

valor de referencia, entonces el pez es del sexo masculino; y

si el ni vel de expresión del ARNr SS, de una molécul a asociada al ARNr SS, o una

la transcripción del gen que codifi ca el ARNr SS, se encuentra entre el primer y

20: segundo valores de referencia, entonces el pez es un macho intersex.

El primer y segundo valor de referencia se obtendrían medi ante la cuantificació n por

RT-PCR del ni vel de expresión del ARNr SS, de una molécul a asociada al AR Nr SS, o

de un a molécul a impli ca da en el tran sport e de proteínas que intervienen e n la

regul ación de la transcripción del gen que codifi ca el ARNr SS, en las gónadas de un a

25: pobl ación de peces de la mi sma especie y en el mi smo estad o fi siológico que el pez

cuyo sexo de quiere averíguar, y en donde el primer valor de referencia correspo nde a

la pobl ación muestral con el menor número de ciclos, el segundo valor de referencia

correspond e a la población muestral con el mayor núm ero de ciclos, y en dond e la

diferencia entre el primer y segundo valor de referencia es de, al menos, 2, 3, 4 , O S

30: cicl os.

Por lo tanto, alternati vamente al segundo método de la invención, la presente invención

tambi én se relaciona con un método para determinar el sexo de un pez que comprende

medir el nivel de expresión ARNr SS, o de una molécula asociada al ARNr SS, o de una

molécula implicada en la regul aci ón de la transcripción del gen que codifi ca el ARNr

SS, en una muestra biológica procedente de las gónadas de dicho pez, en el que

si el nivel de expresión de la subunidad menor del ARN ribosómico SS, o de

5: una molécula asociada al ARNr SS, o de una molécula implicada en la

regulación de la transcripción del gen que codifi ca el ARNr SS, es mayor que

un valor de referencia, entonces el pez es del sexo femenino,

un a m olécul a asociada al ARN r SS , o de una molécul a impli cada en la

10: regulación de la transcripción del gen que codifica el ARNr SS, es meno r que

un valor de referencia, entonces el pez es del sexo masculino; y

un a molécul a asociada al ARN r SS , o de un a molécula impli cad a en la

regul ación de la transcripción del gen que codifica el ARNr SS, es similar o

15: igual que un valor de referencia, entonces el pez es un macho intersex.

Por otro lado, la invención tambi én se relaciona con un kit que comprende los

reactivos necesarios para poner en práctica los métodos de la invención, entre los

que se incluyen, pero no se lim i tan a , tampones, agentes para prevenir la

contaminación, sondas, controles positi vos y negativos, cebadores, polimerasas,

20: marcadores fluorescentes, marcadores de peso molecular, etc., así como una

muestra control que proporciona un valor de referencia a partir de la cual se puede

determinar si un pez es macho o es hembra. Por otro lado, el kit también puede

incluir todos los sopo rtes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y

optimización. Preferibl emente, el kit comprende además las instrucciones para su

2S: utilización.

TRADUCCiÓN DEL TEXTO DE LA LISTA DE SECUENCIAS

"METHOD FOR IDE NTIFYING T HE SEX OF FISH " método para l a

identificación del sexo en peces

30: "ForJllard primer for amplifying 5S rRNA" -Cebador directo para amplificar el

ARNr SS

"Re verse primer /or amplifying 55 rRNA" -Cebador inverso para amplificar el ARNr 5S

5: Los siguientes ej emplos simpl emente ilustran la invención y limitativos la misma. no pretenden ser

EJEMPLO I

Identificación del sexo de un pez mediante la cuantificación de la subunidad pequeña del ARN ribosomal SS 1.-MATERIAL Y MÉTODOS

10: Ejemplares muestreados

Los análisis se ll evaron a cabo sobre mubles (Che/O/I labroslIs) machos y hembras sexados hi stológicamente, procedentes de cuatro estuarios de la costa vasca (Bilbao, Plentzia, Urdaibai y Pasaia). Se estudiaron seis indi viduos de cada sexo por punto de muestreo.

1 S 20: Para determinar la expresión diferencial a lo largo del ciclo reproductor, se capturan mubles mensualmente desde julio de 2010 en el puerto de Pasaia. Los animales fueron diseccionados in situ inmediatamente tras su captura, y una porción de gónada de cada individuo fue conservada en nitrógeno líquido embebida en RNAlater® (SIGMAALDRJCH), y la otra porción fue fijada químicamente para su inclusión en metacrilato. Las muestras congeladas se almacenaron a -80°C hasta su posterior análisis.

25: Los animales fueron sexados histológica mente, y se analizaron los niveles de expresión de ARNr 5S en 6 individuos macho y 6 individuos hembra, y todos los machos intersex encontrados (machos que por exposición a xenoestrógenos ambientales muestran oocitos entre sus folículos espermáticos), en los meses de julio, septiembre, noviembre, diciembre, enero y marzo.

Aislamiento del ARN total

30: La extracción de RNA total se realizó utilizando TRlzol® (lnvitrogen, Estados Unidos), siguiendo los pasos sugeridos por la casa comercial. Las muestras, alrededor de 50 mg

,.

5: de tejido, fueron homogeni zadas tras la separación del RN Al ater® en un homogenizador HYBAID RiboLyser FPI20-HY-230 utilizando bolas de zireonio/siliea durante 45 segundos a máxima velocidad. La concentración y pureza del RNA se evaluaron mediante espectrofotometría (BioPhotometer, Eppendorf, Alemania). Electroforesis

10: Cargando igual cantidad de ARN total por muestra estudiada en un microchip de ARN de Agilent, se anali zó la distribución de bandas en un analizador Agilent 2 100 Analyser. Alternativamente, se puede cargar igual cantidad de ARN total en un gel de agarosa al 1% Y ver la di stribución de bandas atizando bromuro de elidio.

Reacción en cadena de la po limerasa

1 S: Para sintetizar el ADN complementario se utilizó el kit SuperScriptT~1 First Synthesis Syslem para RT-PCR (lnvilrogen), paniendo de 100 ng de ARN lolal en un termociclador (2720 Thermal Cycler, AppliedBiosystems, Estados Unidos) utili zando hexámeros al azar.

20: Los cebadores específicos se diseñaron con ayuda del programa Pri mer Express® 3.0, Software for Real-Time PCR de AppliedBiosystems. Cebadores específicos generados sobre la secuencia obtenida del GenBank, (Fw: Fom~dfd; Rv: Reverse) pam la amplilícación de ARNr 5&

Gen: N° acceso GenBa nk Secuencia Cebadores

SS rRNA: AM70646 l (SEQ ID NO: 1) Fw 5 '-CTTACGGCCATACCACCCTG-3 , SEQ ro NO: 2

Rv 5' GTATCCCAGGCGGTCTCC 3': SEQ ro NO: 3

2S: Se estandarizaron las condiciones óptimas de amplificación del par de cebadores,

teniendo en cuenta parámetros como la temperatura, la concentración de cONA y la

concentración de cebadores, realizando las amplificaciones durante 3S ciclos, en un

termociclador. Una vez que se demostró que los cebadores diseñados amplifican un solo

transcrito del tamaño esperado, se reali zaron los ensayos para la optimización de los

30: ensayos de PCR cuantitativa utilizando SYBR Green.

Las reacciones de Q-PCR se realizaron con AONc a una concentración de 5 ng/I-ll

utili zando el kit FastStar Universal SYBR Green Master (ROX) (Rache, Alemania), en

un termocic1ador (7300 Real Time PCR System, AppliedBiosystem s). En todos los

casos se hicieron las amplificaciones por triplicado para cada muestra, aceptando como

S: válidas desviaciones estándar inferiores a 0.3 entre las CTs de las tres réplicas.

Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: a: 50°C 2 minutos, b: 95°C 10

minutos, e: 95°C 15 segundos, 60°C 1 minuto, durante 40 ciclos, d: 95°C 15 segundos,

60°C 1 minuto, 95°C 1 S segundos.

10

Análisis Estadístico

El análisis estadístico se realizó utili zando el programa informático SPSS 13 para

Windows usando el test de la U de Mann-Whitney (p<0,05) tras la verificación de la

homogeneidad de varianzas.

15

U,-RESULTADOS

Tras realizar la electroforesis cargando igual cantidad de ARN total en un chip de RNA

de AGILENT y mediante un 2100 BIONALZYZER se puede apreciar que la banda más

potente que aparece en las muestras de hembra pertenece a ARNr 5S, mientras que las 2

20: bandas más fuertes de machos pertenecen a 18S y 28S ARNr (Figura 1).

Por otro lado, una vez realizada la qPCR, se encontraron entre 6 y 10 ciclos de

amplifi cación de diferencia entre machos y hembras en todos los casos (en todos los

estuarios y meses estudiados). Esto significa que las hembras superan a los machos en

más de un millón de moléculas de ARNr 5S. Los machos intersex muestran ni veles de

25: expresión entre machos y hembras, que permiten su diferenciación de ambos sexos en

septiembre y enero, pero no en noviembre (Figura 2).

La aproximación metodológica ll evada a cabo en el presente ejemplo, permite distinguir

por comparación gónadas de machos y hembras. De este modo, realizando el análisis

RT-peR, apaTecen dos poblaciones de muestras significativamente di stintas entre ellas

30: con una difeTencia superior a los 5 ciclos, en donde las de menor número de ciclos

pertenecen a las hembras y las de mayor número de ciclos a los machos. Se observó un

comportamiento parecido en el pez cebra (Daf1io rerio) [Figura 3] y, sobre todo, en la

merluza del cantábrico (Merluccius merluccius) [Figura 4].

EJEMPLO 2

Regulación de la transcripción del ARNr SS ovárico y su acumulación en

subunidades ribosómicas

En eucariotas, la transcripción de ARNr SS es mediada por la RNA polimerasa lII, y es

S: controlada por el factor de transcripción general llIA (TFllIA) que se une a la NTS del

gen ADNr 5S (SzyrnalÍski el al. , 2003 . Inl Rev Cylol , 231: 197-258) [Figura 5]. En

coeites de Xenopus TFlllA se encuentm formando un complejo con los transcritos

ARNr SS (7S RNP) que sirven como partícula de almacenaje de ARNr SS. TFIlJA es

por tanto capaz de reconocer específicamente y unir la secuencia promotora de SS

10: ADNr, al igual que el producto de su transcripción. TFIlIA une pues, tanto ONA como

ARNr. Los niveles de ARN mensajero de TFIIIA reflejan los niveles de ARNr 5S en

Xenopus, siendo alrededor de I millón de veces superiores en oocitos que en células

somáticas o espermáticas (Penberthy el al. , 2003.Gene, 305(2): 205-215). En anuros,

TFIIIA se sobre-expresa durante la oogénesis temprana constituyendo un 10% del total

15: de las proteínas citoplasmáticas. Después su expresión decrece 5-10 veces.

En el muble, gracias a las secuencias anotadas mediante la pirosecuenciación 454 del

transcriptoma multitejido nonnalizado de muble, se identificaron homólogos de TFITIA

de muble. En la presente invención, el análisis de estas secuencias mediante qPCR ha

demostrado por primera vez que su regulación tran scripcional en peces se asemeja

20: cuantitativamente a la de ARNr SS, tal y como ocurre en anuros. TFIllA diferencia de

esta manera machos y hembras en los 4 estuarios muestreados en julio de 2010, y a lo

largo del ciclo anual analizado en el puerto de Pasaia. También diferencia a los intersex

de Septiembre de 2010 y Enero de 2011 . Tal y como sucede con ARNr SS, existen entre

5 y 10 ciclos de amplificación de diferencia entre machos y hembras, con individuos

25: intersex entre ambos sexos (Figura 6).

Algo idéntico se ha demostrado con los ni veles de transcripción de 42sp43 en muble

(Figura 6). También se secuenció parcialmente e l gen de muble mediante

pirosecuenciación, y se vio que sus niveles de transcripción son mucho mayores en

ovario que en testículo. En ooeitos de anfibios, el ARNr SS, además de en 7S RNPs, se

30: acumula en partículas ribonucleoproteicas mayores de 42S RNPs . En Xenopus

aproximadamente el 50% del ARNr SS oocítico está asociado a TFIIIA (7S RNPs) y la

otra mitad se encuentra en partícul as de 42S RNP. Estas partí cul as de 42S consisten en

2 proteínas: 42sp50 (o p48) y 42sp43 (o p43). La proteína 42sp4 3 es estructuralmente

muy parecida a TFIII A, pero al contrario que TFIII A no es capaz de unirse al gen y no

está impli cada en la regulación de la transcripción. Por tanto, tan sólo une la molécul a

S: de ARNr participando en su acumul ació n citoplasmáti ca (al menos en Xenopus). Una

línea transgénica de meda ka construid a con una secuencia relati vamente corta de la

región promotora de 42spSO permitió el marcaje fluorescente de ooeitos. La

flu orescencia comenzaba el dí a 5 tras la puesta del huevo. Esto concuerda con la

expresión de 42sp43 en el estadi o diploteno de los oocitos.

10: Transporte nucleocitoplasmático de proteínas

En células eucari óti cas, e l tran sporte bidireccional de moléculas al núcl eo, que

necesariamente afecta a moléculas como TFIIlA y ARNr SS, se basa en el transporte a

través de los poros nucl eares. Moléculas con un tamaño de 45 kDa no pueden pasar de

manera pasiva, y por como consecuencia deben de ser acti vamente transportadas vía

l S: proteínas como las karioferinas. Estas incluyen mi embros de las familias de las

importinas y las ex portin as. El mecani smo mejor caracteri zado de importación nuclear

esta medi ado por los hete rodím eros de importina-a e importina-p. Las proteínas

nucl eares se unen específicamente a IMPa-s en el citosol y el compl ejo es dirigido por

IMPP-s al po ro nuclear. Las exportinas participarían en el proceso opuesto de

20: exportación de molécul as de RNA y partí culas ribonucl eoproteícas al citosoL

El análi sis medi ante qPCR demostró que lMPal se transcribe en testículo y ovari os

pero no en o tros tejidos. Análi sis sis temáti cos de lMPal y 2 en Xenopus han

demostrado que estas muestran un patrón de expresión similar a TFIllA y ARNr SS. Por

t anto, TF III A puede ser importado en el núcleo medi ante la interacción de estas 2

25: proteínas. En la presente invención, se ha secuenciado lMPal y 2 e lMPp2 en muble

(tambi én por pi rosecuenciación). Ambas ll'v1Pa-s siguen el patrón de transcripción de

TFlll A en mubl e (Figura 7). En cambio lMPp2 y las ex portin as S y 6 (se han

caracterizado 4 exportinas de muble) no. Esto prueba la utilidad de las importinas alfas

como marcadores de genero, así como potentes marcadores (especialmente fMPal ) de

30: machos intersex.

22

Claims

REIVINDICACIONES

l. Uso del ARN ribosómico 5S (ARNr SS) como marcador para identificar el sexo de los peces.
2.

Uso del ARN ribosómico 185 (ARNr 185) o del ARN ribosómico 285 (ARNr 28S), como marcador para identificar el sexo en peces.
3.

Uso según la reivindicación 1 Ó 2, en el que los peces se seleccionan del grupo que consiste en muble, pez cebra, y merluza.
4.

Método para determinar el sexo de un pez que comprende detectar la expresión del ARNr 5S, del ARNr 185 y del ARNr 285 en una muestra biológica de las gónadas de dicho pez, en donde

si la expresión del ARNr 5S detectada es mayor que la expresión del ARNr 18S o del ARNr 28S detectada, entonces el pez es de sexo femenino, o si la expresión del ARNr 18S o del ARNr 28S detectada es mayor que la expresión del ARNr 5S detectada, entonces el pez es de sexo masculino.
5.

Método según la reivindicación 4, en el que la detección de la expresión del ARNr se realiza mediante electroforesis.
6.

Método para clasificar por sexos una población de peces, en donde dicho método comprende

(i) determinar el nivel de expresión del ARNr SS en las gónadas procedentes de dicha población de peces, y

(ii) observar el patrón de distribución de los niveles de expresión obtenidos, en donde si aparecen dos poblaciones muestrales significativamente distintas entre sí, entonces los individuos que forman parte de la población muestral que presenta el mayor nivel de expresión son hembras, y los individuos que forman parte de la población muestral que presenta el menor nivel de expresión son machos.
7.

Método según la reivindicación 6, en el que los individuos de la población de peces cuyos niveles de expresión estén significativamente desviados de la media de los niveles de expresión de cada una de las poblaciones muestrales, son machos intersex.
8. Método según la reivindicación 6 Ó 7, en donde el nivel de expresión se mide mediante el empleo de una reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (RTPCR).

10 9. Método según la reivindicación 8, en el que el valor Ct de la población que presenta el menor nivel de expresión medio es igualo mayor en 5 unidades que el valor et de la población que presenta el mayor nivel de expresión medio.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que el pez o la

15 población de peces se selecciona del grupo que consiste en muble, pez cebra y merluza.