ES2376941B1 - MIXED NANOPARTICLES OF CONTROLLED RELEASE OF ACTIVE PRINCIPLES. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a nanopartículas mixtas de liberación prolongada de principios activos, el uso de dichas nanopartículas para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inflamación y para como antitumorales y al método de síntesis de dichas nanopartículas.The present invention relates to mixed nanoparticles of prolonged release of active ingredients, the use of said nanoparticles for the treatment of diseases related to inflammation and for as antitumor agents and to the method of synthesis of said nanoparticles.
Description
Nanopartículas mixtas de liberación controlada de principios activos. Mixed nanoparticles of controlled release of active ingredients.
Campo de la invención Field of the Invention
La presente invención se encuadra en el campo general de la nanomedicina y en particular se refiere a nanopartículas mixtas de liberación controlada de principios activos. The present invention falls within the general field of nanomedicine and in particular refers to mixed nanoparticles of controlled release of active ingredients.
Estado de la técnica State of the art
La necesidad de encontrar tratamientos eficaces contra el cáncer, ha hecho que se incrementen las líneas de investigación en esta materia. Esto ha permitido un mayor conocimiento de sus orígenes moleculares, con la consiguiente identificación de novedosas líneas terapéuticas y el desarrollo de un amplio arsenal de agentes terapéuticos. Aún así, estas nuevas moléculas suelen presentar las siguientes limitaciones: i) no llegar en cantidad suficiente al lugar donde se localiza el tumor; y, ii) no son suficientemente eficaces en el micro-entorno tumoral. Por estos motivos, el fracaso del tratamiento es muy frecuente incluso en los tipos de cáncer teóricamente más sensibles a los agentes quimioterapéuticos. Un claro ejemplo lo constituye el uso del fármaco antitumoral 5-fluorouracilo en el tratamiento del cáncer colorrectal avanzado, el cuál sólo induce una respuesta global entorno al 10%. Además, se ha descrito que la combinación de este agente con otros antitumorales sólo ha logrado mejorar la eficacia antitumoral entorno al 45% de los casos [Zhang y cols., 2008]. The need to find effective cancer treatments has increased the lines of research in this area. This has allowed a greater knowledge of its molecular origins, with the consequent identification of novel therapeutic lines and the development of a wide arsenal of therapeutic agents. Even so, these new molecules usually have the following limitations: i) they do not arrive in sufficient quantity to the place where the tumor is located; and, ii) they are not sufficiently effective in the tumor micro-environment. For these reasons, treatment failure is very common even in cancer types theoretically more sensitive to chemotherapeutic agents. A clear example is the use of the antitumor drug 5-fl uorouracil in the treatment of advanced colorectal cancer, which only induces a global response around 10%. In addition, it has been described that the combination of this agent with other antitumor agents has only been able to improve the antitumor efficacy around 45% of cases [Zhang et al., 2008].
Entre las principales razones que justifican el fracaso del tratamiento antitumoral destacan: i) la farmacocinética desfavorable de los agentes antitumorales (caracterizada por un rápido aclaramiento y una rápida biodegradación, que dan lugar a una corta vida plasmática) determina el uso de dosis altamente tóxicas y una rigurosa pauta de tratamiento para conseguir el efecto terapéutico deseado; ii) la extensa biodistribución y extravasación de la molécula antitumoral en zonas no deseadas determina su elevada toxicidad; iii) la selectividad de estos fármacos por el tejido tumoral generalmente es muy pobre; iv) la susceptibilidad de desarrollar resistencia a los anticancerosos por parte de las células tumorales; y, v) las propiedades fisicoquímicas desfavorables de los agentes antitumorales, por ejemplo, su hidrofobia, inducen una escasa acumulación en el lugar de acción [Arias, 2008; Durán y cols., 2008]. Among the main reasons that justify the failure of antitumor treatment include: i) the unfavorable pharmacokinetics of antitumor agents (characterized by rapid clearance and rapid biodegradation, which lead to a short plasma life) determines the use of highly toxic doses and a rigorous treatment regimen to achieve the desired therapeutic effect; ii) the extensive biodistribution and extravasation of the antitumor molecule in unwanted areas determines its high toxicity; iii) the selectivity of these drugs by tumor tissue is generally very poor; iv) the susceptibility to develop resistance to anticancer cells by tumor cells; and, v) the unfavorable physicochemical properties of antitumor agents, for example, their hydrophobia, induce poor accumulation at the site of action [Arias, 2008; Durán et al., 2008].
Con el objetivo de solucionar estos problemas se han asociado antitumorales con sistemas coloidales en el tratamiento del cáncer [Reddy, 2005; Arias, 2008], Esta asociación pretende aumentar la acumulación específica del fármaco en la zona tumoral, e incrementar el tiempo de exposición de las células cancerosas a estos agentes activos. Otros beneficios de la localización exclusiva de los agentes quimioterápicos en la región diana son la mejora de su perfil farmacocinético y la disminución de la toxicidad asociada a la extensa biodistribución de estas moléculas. Además, los sistemas coloidales pueden lograr una protección adecuada de estos principios activos in vitro (durante el almacenamiento) e in vivo (frente a fenómenos de biodegradación relacionados principalmente con sistemas enzimáticos), lo que reducirá la formación de productos de degradación potencialmente tóxicos [Arias, 2008; Durán y cols., 2008; Davis y cols., 2008], Es por ello que numerosos esfuerzos se están concentrando en la formulación de coloides, basados principalmente en sistemas vesiculares (liposomas y niosomas) o poliméricos, para conseguir el transporte eficaz de cualquier antitumoral a la zona diana [Arias, 2008; Cho y cols., 2008]. Sin embargo, recientes investigaciones han probado que esta simple asociación no siempre resulta suficiente para lograr dirigir específicamente un fármaco a cualquier zona del organismo, más allá de los órganos pertenecientes al sistema retículo endotelial [Reddy, 2005; Couvreur y Vauthier, 2006], Es por todo esto que actualmente se están desarrollando importantes investigaciones (con resultados muy prometedores) encaminadas al diseño de sistemas transportadores pasivos de fármacos [basados en el efecto de permeación y retención incrementada] y sistemas transportadores activos de fármacos al lugar de acción (fundamentados en las interacciones ligando-receptor, y en el diseño de nanopartículas sensibles a estímulos externos) [Reddy, 2005; Arias, 2008]. With the objective of solving these problems, antitumor agents have been associated with colloidal systems in the treatment of cancer [Reddy, 2005; Arias, 2008], This association aims to increase the specific accumulation of the drug in the tumor area, and increase the exposure time of cancer cells to these active agents. Other benefits of the exclusive location of chemotherapeutic agents in the target region are the improvement of their pharmacokinetic profile and the decrease in toxicity associated with the extensive biodistribution of these molecules. In addition, colloidal systems can achieve adequate protection of these active ingredients in vitro (during storage) and in vivo (against biodegradation phenomena related mainly to enzyme systems), which will reduce the formation of potentially toxic degradation products [Arias , 2008; Durán et al., 2008; Davis et al., 2008], That is why numerous efforts are focusing on the formulation of colloids, based mainly on vesicular systems (liposomes and niosomes) or polymeric, to achieve the efficient transport of any antitumor to the target area [Arias , 2008; Cho et al., 2008]. However, recent research has proven that this simple association is not always sufficient to be able to specifically direct a drug to any area of the organism, beyond the organs belonging to the endothelial reticulum system [Reddy, 2005; Couvreur and Vauthier, 2006], It is for all this that important research (with very promising results) is currently underway aimed at the design of passive drug transport systems [based on the effect of increased permeation and retention] and active drug transport systems to the place of action (based on ligand-receptor interactions, and on the design of nanoparticles sensitive to external stimuli) [Reddy, 2005; Arias, 2008].
Gang J, Park SB, Hyung W, Choi EH, Wen J, Kim HS, Shul YG, Haam S, Song SY. Magnetic poly epsilon-caprolactone nanoparticles containing Fe3O4 and gemcitabine enhance anti-tumor effect in pancreatic cáncer xenograft mouse model. J Drug Target. 2007 Jul;15(6):445-53 y Arias JL, López-Viota M, Sáez-Fernández E, Ruiz MA. Formulation and physicochemical characterization of poly(ε-caprolactone)nanoparticles loaded with ftorafur and diclofenac sodium. Colloids Surf. B: Biointerfaces 2010; 75: 204-208, describen nanopartículas magnéticas de poli-épsilon caprolactona que contienen un fármaco para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, el gran tamaño que presentan dichas partículas hace que su acumulación en la región diana sea pobre, de tal forma que la eficacia del tratamiento se ve mermada. Gang J, Park SB, Hyung W, Choi EH, Wen J, Kim HS, Shul YG, Haam S, Song SY. Magnetic poly epsilon-caprolactone nanoparticles containing Fe3O4 and gemcitabine enhance anti-tumor effect in pancreatic cancer xenograft mouse model. J Drug Target. 2007 Jul; 15 (6): 445-53 and Arias JL, López-Viota M, Sáez-Fernández E, Ruiz MA. Formulation and physicochemical characterization of poly (ε-caprolactone) nanoparticles loaded with ftorafur and diclofenac sodium. Colloids Surf. B: Biointerfaces 2010; 75: 204-208, describe magnetic nanoparticles of polypropsilon caprolactone containing a drug for the treatment of cancer. However, the large size of these particles makes their accumulation in the target region poor, so that the effectiveness of the treatment is impaired.
Existe pues la necesidad de proporcionar unas nanopartículas que sean de un tamaño mínimo que permita una mayor mayor acumulación de las mismas en la región diana, que minimicen los fenómenos de reconocimiento y retirada de las mismas por el sistema inmune y mejore por tanto la eficacia del tratamiento. There is therefore a need to provide nanoparticles that are of a minimum size that allow a greater accumulation of them in the target region, which minimize the phenomena of recognition and withdrawal thereof by the immune system and thereby improve the effectiveness of the treatment.
Descripción de la invención Description of the invention
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a nanopartículas mixtas de liberación prolongada de principios activos caracterizadas porque la nanopartículas tienen un diámetro medio de entre 74-98 nm y comprende un núcleo de óxido de hierro, un recubrimiento biodegradable de poli (ε-caprolactona) y al menos un principio activo. De ahora en adelante nanopartículas de la presente invención. In a first aspect, the present invention relates to mixed nanoparticles of prolonged release of active ingredients characterized in that the nanoparticles have an average diameter between 74-98 nm and comprise an iron oxide core, a biodegradable poly (ε-) coating. caprolactone) and at least one active substance. Hereinafter nanoparticles of the present invention.
En la presente invención principio activo y fármacos son equivalentes y se refiere a cualquier sustancia química utilizada en la prevención, diagnóstico, tratamiento, mitigación y cura de una enfermedad; para evitar la aparición de un proceso fisiológico no deseado; o para modificar condiciones fisiológicas con fines específicos. In the present invention active ingredient and drugs are equivalent and refer to any chemical substance used in the prevention, diagnosis, treatment, mitigation and cure of a disease; to avoid the appearance of an unwanted physiological process; or to modify physiological conditions for specific purposes.
En una realización particular las nanopartículas de la presente invención tienen un diámetro medio de 86 nm. In a particular embodiment the nanoparticles of the present invention have an average diameter of 86 nm.
En una realización particular el núcleo de óxido de hierro de las nanopartículas de la presente invención tiene un diámetro medio de entre 10-14 nm. In a particular embodiment the iron oxide core of the nanoparticles of the present invention has an average diameter between 10-14 nm.
En una realización particular el principio activo de las nanopartículas de la presente invención es un AINE. Más en particular el AINE es diclofenaco sódico. In a particular embodiment the active ingredient of the nanoparticles of the present invention is an NSAID. More particularly the NSAID is diclofenac sodium.
En una realización particular el principio activo de las nanopartículas de la presente invención es un antitumoral. Más en particular el antitumoral es seleccionado de entre la doxorrubicina o 5’-fluorouracilo. In a particular embodiment the active principle of the nanoparticles of the present invention is an antitumor. More particularly the antitumor is selected from among doxorubicin or 5’-fl uorouracil.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere al uso de las nanopartículas mixtas de la presente invención como medicamento. In a second aspect, the present invention relates to the use of the mixed nanoparticles of the present invention as a medicament.
En un tercer aspecto, las nanopartículas de la presente invención son para el tratamiento del cáncer. In a third aspect, the nanoparticles of the present invention are for the treatment of cancer.
En un cuarto aspecto, las nanopartículas de la presente invención son para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inflamación, principalmente en el tratamiento de artritis y artrosis. También se pueden utilizar para el tratamiento de otros procesos inflamatorios como faringitis, laringitis, colitis, conjuntivitis, etc. In a fourth aspect, the nanoparticles of the present invention are for the treatment of diseases related to inflammation, mainly in the treatment of arthritis and osteoarthritis. They can also be used for the treatment of other inflammatory processes such as pharyngitis, laryngitis, colitis, conjunctivitis, etc.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método para la preparación de las nanopartículas de la presente invención que comprende los siguientes pasos: In a fifth aspect, the present invention relates to a method for the preparation of the nanoparticles of the present invention comprising the following steps:
a) síntesis del núcleo de magnetita mediante co-precipitación en solución acuosa, a) synthesis of the magnetite core by co-precipitation in aqueous solution,
b) disposición interfacial de la poli (ε-caprolactona) en diclorometano junto con la nanopartícula de magnetita del paso a) en solución acuosa, b) interfacial arrangement of the poly (ε-caprolactone) in dichloromethane together with the magnetite nanoparticle of step a) in aqueous solution,
c) purificación de la partícula obtenida en el paso b), c) purification of the particle obtained in step b),
d) adición del principio activo. d) addition of the active substance.
En una realización preferente, el paso d) de adición del fármaco se realiza mediante adsorción superficial sobre las nanopartículas obtenidas tras el paso c). In a preferred embodiment, step d) of adding the drug is carried out by surface adsorption on the nanoparticles obtained after step c).
En otra realización preferente, el paso d) de adición del fármaco se realiza mediante absorción en la matriz de las nanopartículas en el paso b). In another preferred embodiment, step d) of adding the drug is performed by absorption in the matrix of the nanoparticles in step b).
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las nanopartículas de la presente invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. De ahora en adelante composición farmacéutica de la presente invención. In a sixth aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the nanoparticles of the present invention and at least one pharmaceutically acceptable excipient. Hereinafter pharmaceutical composition of the present invention.
En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere al uso de la composición farmacéutica de la presente invención como medicamento. In a seventh aspect, the present invention relates to the use of the pharmaceutical composition of the present invention as a medicament.
En un octavo aspecto, la composición farmacéutica de la presente invención es para el tratamiento del cáncer. In an eighth aspect, the pharmaceutical composition of the present invention is for the treatment of cancer.
En un noveno aspecto, la composición farmacéutica de la presente invención es para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inflamación. In a ninth aspect, the pharmaceutical composition of the present invention is for the treatment of diseases related to inflammation.
En un décimo aspecto, la presente invención se refiere al uso de las nanopartículas de la presente invención y/o de la composición farmacéutica de la presente invención en terapia de hipertermia. In a tenth aspect, the present invention relates to the use of the nanoparticles of the present invention and / or the pharmaceutical composition of the present invention in hyperthermia therapy.
Descripción de las figuras Description of the fi gures
La figura 1 muestra las imágenes de HRTEM de las nanopartículas de magnetita (a), poli(ε-caprolactona) (b), y magnetita/poli(ε-caprolactona) (c). Longitud de barra: 100 nm (a y b), y 20 nm (c). Figure 1 shows the HRTEM images of the magnetite (a), poly (ε-caprolactone) (b), and magnetite / poly (ε-caprolactone) nanoparticles (c). Bar length: 100 nm (a and b), and 20 nm (c).
La figura 2 muestra imágenes de FeSEM de las nanopartículas de magnetita (a), poli(ε-caprolactona) (b), y magnetita/poli(ε-caprolactona) (c). (Figura insertada: detalle de la muestra). Longitud de barra: 20 nm (a), y 100 nm (b y c). Figure 2 shows FeSEM images of the magnetite (a), poly (ε-caprolactone) (b), and magnetite / poly (ε-caprolactone) nanoparticles (c). (Figure inserted: detail of the sample). Bar length: 20 nm (a), and 100 nm (b and c).
La figura 3 muestra una microfotografía HRTEM de las nanopartículas compuestas Fe3O4/PCL obtenida partiendo de una relación de masas inicial Fe3O4:PCL de 4:1 (a), 2:4 (b) y 1:4 (c). Figure 3 shows an HRTEM photomicrograph of the Fe3O4 / PCL composite nanoparticles obtained from an initial Fe3O4: PCL mass ratio of 4: 1 (a), 2: 4 (b) and 1: 4 (c).
La figura 4 muestra difractogramas de rayos X de las partículas de magnetita (Fe3O4, línea negra), poli(ε-caprolactona) (PCL, línea azul) y de magnetita /poli(ε-caprolactona) (Fe3O4/PCL, línea magenta). Figura insertada: patrón de difracción de rayos X de la Fe3O4. La intensidad está expresada en unidades normalizadas. Figure 4 shows X-ray diffractograms of the particles of magnetite (Fe3O4, black line), poly (ε-caprolactone) (PCL, blue line) and magnetite / poly (ε-caprolactone) (Fe3O4 / PCL, magenta line) . Figure inserted: X-ray diffraction pattern of Fe3O4. The intensity is expressed in standardized units.
La figura 5 muestra el espectro de infrarrojos de las partículas de magnetita (Fe3O4,-0-), de poli(ε-caprolactona) (PCL, —) y de magnetita/poli(ε-caprolactona) (Fe3O4/PCL, —). Figura insertada: estructura química de la PCL. Figure 5 shows the infrared spectrum of the particles of magnetite (Fe3O4, -0-), poly (ε-caprolactone) (PCL, -) and magnetite / poly (ε-caprolactone) (Fe3O4 / PCL, -) . Figure inserted: chemical structure of the PCL.
La figura 6 muestra el ciclo de histéresis de la partículas de magnetita (Fe3O4, D) y compuestas Fe3O4/poli(εcaprolactona) (Fe3O4/PCL, .). Figure 6 shows the hysteresis cycle of magnetite particles (Fe3O4, D) and Fe3O4 / poly (εcaprolactone) compounds (Fe3O4 / PCL,.).
La figura 7 muestra visualmente la decantación magnética de las partículas de magnetita (Fe3O4) y magnetita/poli (ε-caprolactona) (Fe3O4/PCL) bajo la influencia de un imán permanente de 400 mT, localizado en el lateral (a) o debajo (b) de las muestras. Figure 7 visually shows the magnetic decantation of the particles of magnetite (Fe3O4) and magnetite / poly (ε-caprolactone) (Fe3O4 / PCL) under the influence of a permanent magnet of 400 mT, located on the side (a) or below (b) of the samples.
La figura 8 muestra una microfotografía óptica (magnificación: 40X) de una suspensión acuosa de nanopartículas de magnetita/poli(ε-caprolactona) en ausencia (a) o bajo la influencia (b, c, d, e, f) de un gradiente magnético externo, B= 400 mT, en la dirección de la flecha. Figure 8 shows an optical photomicrograph (magnification: 40X) of an aqueous suspension of magnetite / poly (ε-caprolactone) nanoparticles in the absence (a) or under the in fl uence (b, c, d, e, f) of a gradient external magnetic, B = 400 mT, in the direction of the arrow.
La figura 9 muestra el potencial zeta (ζ) de las nanopartículas de magnetita (Fe3O4, e), poli(ε-caprolactona) (PCL, .), y compuestas magnetita/poli(ε-caprolactona) (Fe3O4/PCL, .) en función del pH, en presencia de 10−3 M KNO3. Figure 9 shows the zeta potential (ζ) of the magnetite (Fe3O4, e), poly (ε-caprolactone) (PCL,), and magnetite / poly (ε-caprolactone) (Fe3O4 / PCL,.) Nanoparticles. as a function of pH, in the presence of 10-3 M KNO3.
La figura 10 muestra el potencial zeta (ζ) (b) de las nanopartículas de magnetita (Fe3O4, e), poli(ε-caprolactona) (PCL, .), y compuestas magnetita/poly(ε-caprolactona) (Fe3O4/PCL, .) en función de la concentración de KNO3 a pH=6. Figure 10 shows the zeta potential (ζ) (b) of the nanoparticles of magnetite (Fe3O4, e), poly (ε-caprolactone) (PCL,.), And compound magnetite / poly (ε-caprolactone) (Fe3O4 / PCL ,.) depending on the concentration of KNO3 at pH = 6.
La figura 11 muestra el histograma de las movilidades electroforéticas (ue) de las nanopartículas compuestas magnetita/poli(ε-caprolactona) (Fe3O4/PCL) en una solución acuosa 10−3 M KNO3, para diferentes relaciones de masas iniciales Fe3O4:PCL. También se incluyen los valores de ue de Fe3O4 y de PCL. Figure 11 shows the histogram of the electrophoretic mobilities (ue) of the magnetite / poly (ε-caprolactone) nanoparticles (Fe3O4 / PCL) in a 10-3 M KNO3 aqueous solution, for different initial mass ratios Fe3O4: PCL. The Eu3 values of Fe3O4 and PCL are also included.
La figura 12 muestra la movilidad electroforética (ue) de las nanopartículas de Fe3O4 (USPIO, .) y de Fe3O4/PCL (USPIO/PCL, D) en función del tiempo, a pH = 7.4 ± 0.1, y a 37.0 ± 0.5ºC. Figure 12 shows the electrophoretic mobility (eu) of the Fe3O4 (USPIO,.) And Fe3O4 / PCL (USPIO / PCL, D) nanoparticles as a function of time, at pH = 7.4 ± 0.1, and at 37.0 ± 0.5 ° C.
La figura 13 muestra los ángulos de contacto (grados) de los líquidos utilizados en las determinaciones con magnetita (Fe3O4), poli(ε-caprolactona) (PCL) y nanopartículas de magnetita/poli(ε-caprolactona) (Fe3O4/PCL). Figure 13 shows the contact angles (degrees) of the liquids used in the determinations with magnetite (Fe3O4), poly (ε-caprolactone) (PCL) and magnetite / poly (ε-caprolactone) nanoparticles (Fe3O4 / PCL).
La figura 14 muestra componentes de la energía libre superficial (mJ/m2) de magnetita (Fe3O4), poli(ε-caprolactona) (PCL) y nanopartículas magnéticas compuestas magnetita/poli(ε-caprolactona) (Fe3O4/PCL). γSLW es la componente de Lifshitz-van der Waals; γS + (γS −) es la componente electrón-aceptor (electrón-donante). Figure 14 shows components of the surface free energy (mJ / m2) of magnetite (Fe3O4), poly (ε-caprolactone) (PCL) and magnetic nanoparticles composed of magnetite / poly (ε-caprolactone) (Fe3O4 / PCL). γSLW is the component of Lifshitz-van der Waals; γS + (γS -) is the electron-acceptor component.
La figura 15 muestra los valores de ΔG121 (mJ/m2) y carácter hidrófilo/hidrófobo de los tres tipos de nanomateriales: magnetita (Fe3O4), poli(ε-caprolactona) (PCL) y nanopartículas magnéticas compuestas magnetita/poli(εcaprolactona) (Fe3O4/PCL). Figure 15 shows the values of ΔG121 (mJ / m2) and hydrophilic / hydrophobic character of the three types of nanomaterials: magnetite (Fe3O4), poly (ε-caprolactone) (PCL) and magnetite / poly (εcaprolactone) magnetic nanoparticles ( Fe3O4 / PCL).
La figura 16 muestra la liberación de doxorrubicina (%) adsorbida (a), y (b) absorbida desde las nanopartículas Fe3O4/PCL en función del tiempo de incubación en una solución tampón NaOH-KH2PO4 (pH = 7.4 ± 0.1) a Figure 16 shows the release of adsorbed doxorubicin (%) (a), and (b) absorbed from the Fe3O4 / PCL nanoparticles as a function of the incubation time in a NaOH-KH2PO4 buffer solution (pH = 7.4 ± 0.1) a
La figura 17 muestra la liberación de 5-fluorouracilo (%) adsorbido (a), y (b) absorbido desde las nanopartículas Fe3O4/PCL en función del tiempo de incubación en una solución tampón NaOH-KH2PO4 (pH = 7.4 ± 0.1) a Figure 17 shows the release of adsorbed 5-fluorouracil (%) (a), and (b) absorbed from the Fe3O4 / PCL nanoparticles as a function of the incubation time in a NaOH-KH2PO4 buffer solution (pH = 7.4 ± 0.1) a
La figura 18 muestra la liberación de diclofenaco sódico (%) adsorbido (a), y (b) absorbido desde las nanopartículas Fe3O4/PCL en función del tiempo de incubación en una solución tampón NaOH-KH2PO4 (pH = 7.4 ± 0.1) a Figure 18 shows the release of adsorbed diclofenac sodium (%) (a), and (b) absorbed from the Fe3O4 / PCL nanoparticles as a function of the incubation time in a NaOH-KH2PO4 buffer solution (pH = 7.4 ± 0.1) a
La figura 19 muestra la curva de calentamiento de una suspensión acuosa de nanopartículas Fe3O4/PCL (10 mg/mL) bajo la exposición a un gradiente electromagnético alterno de alta frecuencia (frecuencia e intensidad: 250 kHz y 4 kA/m, respectivamente). Figure 19 shows the heating curve of an aqueous suspension of Fe3O4 / PCL nanoparticles (10 mg / mL) under exposure to an alternating high frequency electromagnetic gradient (frequency and intensity: 250 kHz and 4 kA / m, respectively).
Descripción detallada de la invención Detailed description of the invention
Ejemplo 1 Example 1
Formulación de las nanopartículas magnetita/poli(ε-caprolactona) Formulation of the magnetite / poly (ε-caprolactone) nanoparticles
El método de síntesis se basa en el método de disposición interfacial de la poli(ε-caprolactona), utilizado en la síntesis de nanopartículas de este polímero. Para ello se provocó la precipitación del polímero en un medio de polimerización en el que se encontraban los núcleos del óxido de hierro (magnetita). De esta manera, la poli(ε-caprolactona) recubrió los núcleos de magnetita que se encontraban presentes en el medio acuoso donde se produjo su precipitación. The synthesis method is based on the interfacial arrangement method of poly (ε-caprolactone), used in the synthesis of nanoparticles of this polymer. For this, the precipitation of the polymer was caused in a polymerization medium in which the iron oxide (magnetite) nuclei were found. In this way, poly (ε-caprolactone) coated the magnetite nuclei that were present in the aqueous medium where precipitation occurred.
En primer lugar, la síntesis de las nanopartículas de magnetita se realizó mediante el método de co-precipitación en solución [Massart, 1981], En concreto, la metodología de síntesis seguida consistió en la adición, a temperatura ambiente y gota a gota, a una solución acuosa de amoniaco (500 mL, 0.7 M) de una solución acuosa de cloruro férrico (40 mL, 1 M) y otra solución acuosa de cloruro ferroso (10 mL, 2 M) que además contenía una concentración 2 M de HCl. En estas condiciones, se produjo la formación espontánea de las nanopartículas de magnetita, las cuáles fueron aisladas mediante sedimentación magnética. La última fase de esta síntesis consistió en la estabilización termodinámica de las nanopartículas de magnetita en una disolución acuosa de ácido perclórico 2 M durante 12 horas. De esta manera, aseguramos que las partículas de este óxido de hierro se mantuvieran aisladas en el medio de dispersión, no formándose agregados de mayor tamaño. Las partículas de magnetita fueron preparadas en el momento de su utilización para la síntesis de los nanopartículas magnetita/poli(ε-caprolactona). First, the synthesis of magnetite nanoparticles was carried out using the solution co-precipitation method [Massart, 1981]. Specifically, the synthesis methodology followed consisted of the addition, at room temperature and drop by drop, to an aqueous solution of ammonia (500 mL, 0.7 M) of an aqueous solution of ferric chloride (40 mL, 1 M) and another aqueous solution of ferrous chloride (10 mL, 2 M) that also contained a 2 M concentration of HCl. Under these conditions, spontaneous formation of magnetite nanoparticles occurred, which were isolated by magnetic sedimentation. The last phase of this synthesis consisted of thermodynamic stabilization of magnetite nanoparticles in a 2M aqueous solution of perchloric acid for 12 hours. In this way, we ensure that the particles of this iron oxide remain isolated in the dispersion medium, not forming aggregates of larger size. The magnetite particles were prepared at the time of their use for the synthesis of the magnetite / poly (ε-caprolactone) nanoparticles.
Por el contrario, si las nanopartículas de este óxido de hierro no eran utilizadas en el momento, se desecaban en una estufa de desecación [P-Selecta, España] a 40.0 ± 0.5ºC, y se conservaron en estado seco hasta su utilización. On the contrary, if the nanoparticles of this iron oxide were not used at the time, they were dried in a drying oven [P-Selecta, Spain] at 40.0 ± 0.5 ° C, and kept in a dry state until use.
El proceso de síntesis de las nanopartículas magnetita/poli(ε-caprolactona) comenzó con la adición de 10 mL de una solución al 0.3% (p/v) de polímero en diclorometano sobre 50 mL de una suspensión acuosa de nanopartículas de magnetita (0.3%, p/v) que contenía una concentración de pluronic® F-68 del 2% (p/v). La adición de la fase orgánica sobre la fase acuosa se realizó bajo agitación mecánica (1200 rpm), la cual se mantuvo durante 1 hora más. Finalmente, la limpieza de las nanopartículas magnéticas compuestas magnetita/poli(ε-caprolactona) se realizó mediante sedimentación magnética. Para ello, la suspensión fue sometida a ciclos consecutivos de exposición a un imán de 400 mT durante 5 minutos, procediendo a la eliminación del sobrenadante tras este tiempo, y redispersión en agua bidestilada. Esta rutina se mantuvo hasta que el sobrenadante obtenido era transparente y presentaba una conductividad inferior a 10 μS/cm. The synthesis process of the magnetite / poly (ε-caprolactone) nanoparticles began with the addition of 10 mL of a 0.3% (w / v) solution of polymer in dichloromethane over 50 mL of an aqueous suspension of magnetite nanoparticles (0.3 %, w / v) containing a concentration of pluronic® F-68 of 2% (w / v). The organic phase was added to the aqueous phase under mechanical agitation (1200 rpm), which was maintained for an additional hour. Finally, the cleaning of the magnetite / poly (ε-caprolactone) composite magnetic nanoparticles was performed by magnetic sedimentation. For this, the suspension was subjected to consecutive cycles of exposure to a 400 mT magnet for 5 minutes, proceeding with the removal of the supernatant after this time, and redispersion in double-distilled water. This routine was maintained until the obtained supernatant was transparent and had a conductivity of less than 10 μS / cm.
Finalmente, con el objetivo de establecer comparaciones durante la caracterización fisicoquímica de las nanopartículas magnetita/poli(ε-caprolactona), realizamos también la síntesis de nanopartículas puras de poli(ε-caprolactona) según la metodología indicada en el párrafo anterior, pero sin la utilización de los núcleos de óxido de hierro. Finally, in order to establish comparisons during the physicochemical characterization of the magnetite / poly (ε-caprolactone) nanoparticles, we also performed the synthesis of pure poly (ε-caprolactone) nanoparticles according to the methodology indicated in the previous paragraph, but without the use of iron oxide cores.
A continuación se realizó una caracterización física, química y fisicoquímica de las nanopartículas. Next, a physical, chemical and physicochemical characterization of the nanoparticles was performed.
La geometría (forma y tamaño) de las partículas de magnetita y magnetita/poli(ε-caprolactona) fue estudiada mediante microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) [STEM PHILIPS CM20, Holanda] y mediante microscopía electrónica de barrido de alta resolución (FeSEM) [Zeiss DSM 950, Alemania], La determinación del tamaño de partícula medio (± desviación estándar) se obtuvo mediante espectroscopia de correlación de fotones (PCS) [Malvern 4700 analyzer, Malvern Instruments, Inglaterra]. The geometry (shape and size) of the magnetite and magnetite / poly (ε-caprolactone) particles was studied by high resolution transmission electron microscopy (HRTEM) [STEM PHILIPS CM20, Netherlands] and by high resolution scanning electron microscopy (FeSEM) [Zeiss DSM 950, Germany], The determination of the average particle size (± standard deviation) was obtained by photon correlation spectroscopy (PCS) [Malvern 4700 analyzer, Malvern Instruments, England].
El tamaño medio de las partículas de magnetita fue de 12 ± 2 nm (figura 1a y 2a), lo que nos hizo pensar que las nanopartículas debían ser superparamagnéticas. The average size of the magnetite particles was 12 ± 2 nm (Figure 1 and 2), which made us think that the nanoparticles should be superparamagnetic.
El tamaño medio de las nanopartículas puras de polímero fue de 97 ± 7 nm. The average size of the pure polymer nanoparticles was 97 ± 7 nm.
En cuanto a las nanopartículas magnetita/poli(ε-caprolactona), tal y como puede apreciarse en la figura 1c, el recubrimiento polimérico de los núcleos magnéticos fue completo. As for the magnetite / poly (ε-caprolactone) nanoparticles, as can be seen in Figure 1c, the polymeric coating of the magnetic cores was complete.
Como muestra la figura 2b, los núcleos de magnetita quedaron recubiertos por un halo blanco/grisáceo que coincidió con el aspecto de las nanopartículas puras de polímero. Es más, las microfotografías de FeSEM (figura 2) muestran cómo externamente las partículas puras de poli(ε-caprolactona) y las partículas compuestas magnetita/poli(ε-caprolactona) son indistinguibles. Este hecho confirmó la eficacia del recubrimiento de los núcleos magnéticos por el polímero biodegradable. As Figure 2b shows, the magnetite cores were coated with a white / grayish halo that coincided with the appearance of the pure polymer nanoparticles. Moreover, FeSEM photomicrographs (Figure 2) show how externally pure poly (ε-caprolactone) particles and magnetite / poly (ε-caprolactone) composite particles are indistinguishable. This fact confirmed the effectiveness of the coating of the magnetic cores by the biodegradable polymer.
Finalmente, el análisis PCS de la nanopartículas magnéticas magnetita/poli(ε-caprolactona) permitió confirmar el pequeño tamaño de éstas (86 ±12 nm), muy adecuado para la vía de administración parenteral. Finally, the PCS analysis of the magnetite / poly (ε-caprolactone) magnetic nanoparticles allowed confirming their small size (86 ± 12 nm), very suitable for the parenteral route of administration.
Las condiciones de síntesis descritas en el ejemplo anterior son las que posibilitan un mayor rendimiento en la obtención de nanopartículas compuestas magnetita/poli(ε-caprolactona) (tabla 1). Sin embargo, para llegar a esta conclusión fue necesario el análisis del efecto que tienen las diferentes proporciones de masa magnetita:poli(ε-caprolactona) (Fe3O4:PCL) en el rendimiento de la síntesis. En concreto, variamos las proporciones de Fe3O4:PCL desde The synthesis conditions described in the previous example are those that allow a higher yield in obtaining magnetite / poly (ε-caprolactone) nanoparticles (table 1). However, to reach this conclusion it was necessary to analyze the effect of the different proportions of magnetite mass: poly (ε-caprolactone) (Fe3O4: PCL) on the synthesis performance. Specifically, we vary the proportions of Fe3O4: PCL from
1:4 a 4:1. 1: 4 to 4: 1.
La figura 3 recoge las microfotografías de HRTEM de las nanopartículas compuestas obtenidas según todas estas variantes del procedimiento de síntesis. Observamos cómo las diferencias más significativas se dieron entre las nanopartículas obtenidas utilizando una relación Fe3O4:PCL 1:4 y 4:1, en comparación con las otras posibilidades investigadas. Si la relación inicial entre las masas era 4:1, el recubrimiento polimérico de los núcleos magnéticos era prácticamente inexistente. Como mucho llegó a apreciarse ocasionalmente en las zonas de contacto entre los núcleos magnéticos (figura 3a). En el caso contrario, cuando la relación era 1:4, las partículas de Fe3O4 quedaban totalmente englobadas por una enorme matriz de polímero. Incluso se apreció la formación de una excesiva cantidad de partículas de polímero puro (figura 3c). Figure 3 shows the HRTEM photomicrographs of the composite nanoparticles obtained according to all these variants of the synthesis procedure. We observe how the most significant differences occurred between the nanoparticles obtained using a Fe3O4: PCL 1: 4 and 4: 1 ratio, compared to the other possibilities investigated. If the initial ratio between the masses was 4: 1, the polymeric coating of the magnetic cores was practically non-existent. At most, it occasionally came to be seen in the contact areas between the magnetic cores (Figure 3a). In the opposite case, when the ratio was 1: 4, the Fe3O4 particles were completely encompassed by a huge polymer matrix. Even the formation of an excessive amount of pure polymer particles was observed (Figure 3c).
El análisis de la influencia de esta relación de masas iniciales Fe3O4:PCL sobre el rendimiento de la síntesis en la obtención de nanopartículas magnéticas compuestas Fe3O4/PCL, permitió comprobar que éste era máximo para una proporción 2:4 (≈ 90%), seguido de la proporción 4:3 (≈ 84%) (tabla 1). El rendimiento de la reacción de síntesis fue calculado mediante la ecuación: The analysis of the in fl uence of this Fe3O4: PCL initial mass ratio on the synthesis performance in obtaining Fe3O4 / PCL composite magnetic nanoparticles, allowed to verify that this was maximum for a 2: 4 ratio (≈ 90%), followed of the 4: 3 ratio (≈ 84%) (table 1). The yield of the synthesis reaction was calculated by the equation:
TABLA 1 TABLE 1
Rendimiento (%) de la reacción de síntesis de las partículas compuestas Fe3O4/PCL para cada una de las proporciones de masas iniciales Fe3O4:PCL. Desde 1:4, hasta 4:1 Yield (%) of the synthesis reaction of the Fe3O4 / PCL composite particles for each of the initial Fe3O4: PCL mass ratios. From 1: 4, to 4: 1
Como muestran los datos, si existe un exceso en la cantidad de núcleos magnéticos sobre la cantidad de polímero mucha Fe3O4 quedó sin recubrir (no formando parte de las partículas compuestas) y, por su particular superparamagnetismo, quedó en el sobrenadante de la suspensión en lugar de formar parte del sedimento magnético atraído por el imán. En estas condiciones, el sobrenadante no magnético presentó un característico color anaranjado (indicativo de la presencia de estos núcleos superparamagnéticos de óxido de hierro). Por el contrario, si la relación era de 1:4 el sobrenadante no magnético obtenido era totalmente blanco, consecuencia de la formación de nanopartículas de polímero puro en exceso. Además, al incrementar la cantidad de PCL con respecto a Fe3O4 el grosor del recubrimiento polimérico de las nanopartículas de magnetita tendía a ser algo mayor. As the data show, if there is an excess in the amount of magnetic cores over the amount of polymer, much Fe3O4 remained uncoated (not being part of the composite particles) and, due to its particular superparamagnetism, it remained in the suspension supernatant instead of being part of the magnetic sediment attracted by the magnet. Under these conditions, the non-magnetic supernatant had a characteristic orange color (indicative of the presence of these superparamagnetic iron oxide nuclei). On the contrary, if the ratio was 1: 4, the obtained non-magnetic supernatant was totally white, as a result of the formation of excess pure polymer nanoparticles. In addition, by increasing the amount of PCL with respect to Fe3O4, the thickness of the polymeric coating of the magnetite nanoparticles tended to be somewhat greater.
El hecho de que el sobrenadante de las nanopartículas compuestas obtenidas con la relación Fe3O4:PCL 2:4 fuera totalmente transparente, significa que toda la cantidad de los materiales utilizados en la formulación de nanopartículas Fe3O4/PCL se transformó en estas nanopartículas magnéticas compuestas. De hecho, como hemos comentado el rendimiento es ≈ 90% (tabla 1). The fact that the supernatant of the composite nanoparticles obtained with the Fe3O4: PCL 2: 4 ratio was totally transparent, means that the entire amount of the materials used in the Fe3O4 / PCL nanoparticle formulation was transformed into these composite magnetic nanoparticles. In fact, as we have commented, the yield is ≈ 90% (table 1).
Por último, cuando hay un exceso de Fe3O4 sobre PCL (en concreto, en la relación 4:3) todo el polímero utilizado pasó a formar parte de los recubrimientos poliméricos biodegradables de las partículas compuestas. Este exceso en Fe3O4 hizo que hubiera núcleos magnéticos no recubiertos que permanecieron aislados en el sobrenadante del medio de dispersión, haciendo que el rendimiento de la reacción de síntesis fuera el menor, en comparación con la relación Finally, when there is an excess of Fe3O4 over PCL (specifically, in the 4: 3 ratio) all the polymer used became part of the biodegradable polymeric coatings of the composite particles. This excess in Fe3O4 caused that there were uncoated magnetic cores that remained isolated in the supernatant of the dispersion medium, making the synthesis reaction yield the lowest, compared to the ratio
2:4 como hemos señalado. 2: 4 as we have pointed out.
La metodología de síntesis implicó la utilización de una relación de masas iniciales Fe3O4:PCL 2:4. Así (figuras 1c y 2c), el rendimiento de la reacción fue el máximo posible (≈ 90%) y se obtuvieron nanopartículas compuestas de tamaño muy pequeño (86 ± 12 nm) y adecuado para la vía de administración parenteral. The synthesis methodology involved the use of an initial mass ratio Fe3O4: PCL 2: 4. Thus (Figures 1c and 2c), the reaction yield was the maximum possible (≈ 90%) and composite nanoparticles of very small size (86 ± 12 nm) and suitable for the parenteral route of administration were obtained.
Este tamaño fue sensiblemente inferior al obtenido en trabajos previos. En concreto, y en función de las condiciones de formulación, se obtuvieron nanopartículas Fe3O4:PCL con un tamaño de 20 a 3 μm, cuando la velocidad de agitación variaba entre 500 y 2000 rpm, respectivamente [Hamoudeh y Fessi, 2006], de 160 ± 5 nm [Yang y cols., 2006], y de 164 ± 3 nm [Gang y cols., 2007]. This size was significantly smaller than that obtained in previous works. Specifically, and depending on the formulation conditions, Fe3O4: PCL nanoparticles with a size of 20 to 3 μm were obtained, when the stirring speed varied between 500 and 2000 rpm, respectively [Hamoudeh and Fessi, 2006], of 160 ± 5 nm [Yang et al., 2006], and 164 ± 3 nm [Gang et al., 2007].
El menor tamaño de las nanopartículas Fe3O4:PCL que hemos sintetizado es realmente interesante en el transporte de fármacos al lugar de acción (masa tumoral, tejido inflamado, etc.), ya que permite estimar una mayor acumulación de las nanopartículas en la región diana al minimizarse los fenómenos de reconocimiento y retirada por el sistema inmune [Decuzzi y cols., 2009]. The smaller size of the Fe3O4: PCL nanoparticles that we have synthesized is really interesting in the transport of drugs to the place of action (tumor mass, inflamed tissue, etc.), since it allows to estimate a greater accumulation of the nanoparticles in the target region at Minimize the phenomena of recognition and withdrawal by the immune system [Decuzzi et al., 2009].
Posteriormente realizamos una caracterización muy exhaustiva de las nanopartículas, en comparación con los trabajos previamente publicados [Hamoudeh y Fessi, 2006; Yang y cols., 2006; Gang y cols., 2007], En concreto, difractometría de rayos X, espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier, propiedades magnéticas (ciclo de histéresis), propiedades eléctricas superficiales (electroforesis: dependencia del potencial zeta con el pH y con la fuerza iónica) y termodinámica superficial (análisis de la naturaleza hidrófila/hidrófoba del nanomaterial). Subsequently, we carried out a very exhaustive characterization of the nanoparticles, compared to previously published works [Hamoudeh and Fessi, 2006; Yang et al., 2006; Gang et al., 2007], Specifically, X-ray diffractometry, Fourier transform infrared spectroscopy, magnetic properties (hysteresis cycle), surface electrical properties (electrophoresis: dependence of zeta potential with pH and ionic strength ) and surface thermodynamics (analysis of the hydrophilic / hydrophobic nature of the nanomaterial).
1.-Difractometría de rayos X 1.-X-ray diffractometry
Realizamos un difractograma de rayos X de los tres tipos de materiales (Fe3O4, PCL y Fe3O4/PCL), empleando el método de Debye-Scherrer. El dispositivo empleado fue un difractómetro Philips PW1710 (Holanda), utilizando una longitud de onda de 1.5405 ˚We made an X-ray diffractogram of the three types of materials (Fe3O4, PCL and Fe3O4 / PCL), using the Debye-Scherrer method. The device used was a Philips PW1710 diffractometer (Holland), using a wavelength of 1.5405 ˚
A (Cu-Kα). La masa utilizada en el análisis fue la misma para todos los materiales (≈ 0.5 g). En la figura 4 se recogen los difractogramas obtenidos para la magnetita, el polímero y las partículas compuestas. Al comparar los difractogramas de la magnetita y de las partículas compuestas con el patrón de la “American Society for Testing and Materials” de la magnetita (figura 4), comprobamos la perfecta coincidencia de las líneas del difractograma con las del patrón, lo que permitió identificar la muestra como magnetita y observar la elevada cristalinidad de ésta (tamaño de gramo ≈ 300 ˚A (Cu-Kα). The mass used in the analysis was the same for all materials (≈ 0.5 g). Figure 4 shows the diffractograms obtained for the magnetite, the polymer and the composite particles. When comparing the diffractograms of the magnetite and of the composite particles with the pattern of the "American Society for Testing and Materials" of the magnetite (Figure 4), we verified the perfect coincidence of the diffractogram lines with those of the pattern, which allowed Identify the sample as magnetite and observe its high crystallinity (gram size ≈ 300 ˚
A), incluso tras ser recubierta por el polímero. Las características semicristalinas de la PCL también quedaron reflejadas en los difractogramas. Destacamos cómo los picos característicos de la PCL se encontraron presentes en el difractograma de rayos X de las partículas magnéticas compuestas, aunque con una menor intensidad. A igualdad de masa utilizada en el análisis, la cantidad de polímero presente en la muestra de partículas compuestas Fe3O4/PCL era menor. Demostrando de nuevo la eficacia de la formación de partículas compuestas Fe3O4/PCL mediante la metodología de síntesis de la presente invención. A), even after being coated by the polymer. The semi-crystalline characteristics of the PCL were also reflected in the diffractograms. We highlight how the characteristic peaks of the PCL were present in the X-ray diffractogram of the composite magnetic particles, although with a lower intensity. With equal mass used in the analysis, the amount of polymer present in the sample of Fe3O4 / PCL composite particles was smaller. Demonstrating again the effectiveness of the formation of Fe3O4 / PCL composite particles by the synthesis methodology of the present invention.
2.-Espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier 2.-Fourier transform infrared spectroscopy
Para la preparación de las muestras a analizar tomamos 1.0 mg de material sólido y se mezclaron con 100 mg de bromuro potásico pulverizado y seco. A continuación, prensamos el material a 15000 kPa para obtener un disco transparente. Como consecuencia de esta manipulación, aparecieron bandas en el espectro de infrarrojos a 3448 cm−1 y 1639 cm−1 debido a la humedad. La obtención del interferograma se realizó utilizando un espectrofotómetro de infrarrojos (Nicolet 20 SXB, EE.UU.), con una resolución de 2 cm−1. To prepare the samples to be analyzed, we took 1.0 mg of solid material and mixed with 100 mg of powdered and dried potassium bromide. Next, we press the material at 15000 kPa to obtain a transparent disk. As a consequence of this manipulation, bands appeared in the infrared spectrum at 3448 cm − 1 and 1639 cm − 1 due to humidity. Interferogram was obtained using an infrared spectrophotometer (Nicolet 20 SXB, USA), with a resolution of 2 cm − 1.
En la figura 5 se recoge el espectro de infrarrojos de nuestros tres tipos de partículas (Fe3O4,PCLyFe3O4/PCL). El análisis permitió la identificación de los grupos funcionales del polímero en las partículas compuestas. Sin embargo, las bandas fueron menos intensas debido a la menor cantidad de polímero presente en las partículas compuestas para el mismo peso de muestra. En concreto, las bandas observadas fueron: Figure 5 shows the infrared spectrum of our three types of particles (Fe3O4, PCLyFe3O4 / PCL). The analysis allowed the identification of the functional groups of the polymer in the composite particles. However, the bands were less intense due to the lower amount of polymer present in the composite particles for the same sample weight. Specifically, the bands observed were:
- A: TO:
- banda debida a la humedad que adquieren las muestras como consecuencia de su proceso de manipulación. Se localiza a 3388 cm−1 . band due to the humidity acquired by the samples as a result of their handling process. It is located at 3388 cm − 1.
- B: B:
- grupo de dos bandas que corresponden a la vibración de estiramiento del enlace C-H de la molécula. En el polímero, a 2937 cm−1 se localiza la banda característica de la vibración de elongación asimétrica del grupo CH2 (uAs CH2) y a 2888 cm−1 observamos la perteneciente a la vibración de elongación simétrica group of two bands that correspond to the stretching vibration of the C-H bond of the molecule. In the polymer, at 2937 cm − 1 the characteristic band of the asymmetric elongation vibration of the CH2 group (uAs CH2) is located and at 2888 cm − 1 we observe the one belonging to the symmetrical elongation vibration
- del CH2 (uAS CH2). of CH2 (uAS CH2).
- C: C:
- banda que corresponde a la vibración molecular del enlaceC=Odel polímero, aparece a 1727 cm−1 . band corresponding to the molecular vibration of the C = O of the polymer bond, appears at 1727 cm − 1.
- D: D:
- banda que corresponde a la vibración de flexión asimétrica del CH2 (uAs CH2). En las partículas poliméricas aparece a 1469 cm−1 . band corresponding to the asymmetric fl exion vibration of CH2 (uAs CH2). In polymeric particles it appears at 1469 cm − 1.
- E: AND:
- grupo de dos bandas correspondientes a la vibración de flexión del enlace O-H (1345 cm−1) y a la vibración de elongación del enlace C-O (1281 cm−1) del ácido carboxílico de la molécula. group of two bands corresponding to the vibration of fl exion of the O-H bond (1345 cm − 1) and to the elongation vibration of the C-O bond (1281 cm − 1) of the carboxylic acid of the molecule.
F: banda perteneciente a la vibración de elongación del enlace C-O del alcohol primario del polímero (1242 cm−1). F: band belonging to the elongation vibration of the C-O bond of the primary alcohol of the polymer (1242 cm − 1).
G: grupo de tres bandas que aparecen a 1150 cm−1, 1111 cm−1 y 1061 cm−1, corresponden a la vibración de elongación y flexión del grupo C-CO-C, y que resulta de la vibración de elongación y flexión de la cadena C-C-C presente en este grupo. G: group of three bands that appear at 1150 cm − 1, 1111 cm − 1 and 1061 cm − 1, correspond to the elongation and fl exion vibration of the C-CO-C group, and which results from the elongation and fl exion vibration of the CCC chain present in this group.
H: en las muestras que contienen polímero, a 961 cm−1 aparece una banda media característica de un alcano. H: in samples containing polymer, at 961 cm − 1 a characteristic middle band of an alkane appears.
I: banda permaneciente a la vibración de oscilación del CH2 (pCH2), se observa a 840 cm−1 y es propia de una cadena larga de CH2. I: permanent oscillation vibration band of CH2 (pCH2), is observed at 840 cm − 1 and is typical of a long chain of CH2.
J: única banda ausente en el espectro de las partículas de polímero. Aparece a 581 cm−1 y es una banda ancha e intensa, característica de la absorción en la magnetita [Lyon, 1967], correspondiente a la frecuencia Restrahl (o rayo residual), de máxima absorbancia de cristales iónicos (o parcialmente iónicos) en el infrarrojo [Gartstein y cols., 1986], J: only absent band in the spectrum of polymer particles. It appears at 581 cm − 1 and is a broad and intense band, characteristic of magnetite absorption [Lyon, 1967], corresponding to the Restrahl frequency (or residual ray), of maximum absorbance of ionic (or partially ionic) crystals in the infrared [Gartstein et al., 1986],
3.-Propiedades magnéticas 3.-Magnetic properties
Se caracterizaron las propiedades magnéticas de los núcleos de Fe3O4 y el efecto que el recubrimiento polimérico podía tener sobre éstas. Además, y con el fin de clarificar las condiciones óptimas para la formulación de nanopartículas magnéticas compuestas Fe3O4/PCL, se investigaron las características magnéticas de las partículas de Fe3O4/PCL obtenidas para cada una de las relaciones de masa inicial Fe3O4:PCL (desde 1:4 hasta 4:1). Las propiedades magnéticas de la magnetita y de las partículas Fe3O4/PCL quedaron perfectamente definidas mediante el ciclo de histéresis. Esta caracterización macroscópica del comportamiento magnético de las partículas coloidales se realizó con la ayuda de un magnetómetro-susceptibilímetro Manics DSM-8 (Francia). Todas las medidas se realizaron a 25.0 ± 0.5ºC, ya que a esta temperatura se realizó la preparación y el almacenamiento de las suspensiones. The magnetic properties of the Fe3O4 nuclei were characterized and the effect that the polymeric coating could have on them. In addition, and in order to clarify the optimal conditions for the formulation of Fe3O4 / PCL composite magnetic nanoparticles, the magnetic characteristics of the Fe3O4 / PCL particles obtained for each of the initial Fe3O4: PCL mass ratios were investigated (from 1 : 4 to 4: 1). The magnetic properties of magnetite and Fe3O4 / PCL particles were perfectly defined by the hysteresis cycle. This macroscopic characterization of the magnetic behavior of colloidal particles was carried out with the help of a Manics DSM-8 magnetometer-susceptibility meter (France). All measurements were performed at 25.0 ± 0.5 ° C, since at this temperature the preparation and storage of the suspensions was carried out.
La figura 6 recoge el ciclo de histéresis de las nanopartículas de Fe3O4 y de las compuestas Fe3O4/PCL. En el caso de los núcleos puros de magnetita, no se observó histéresis por el carácter superparamagnético de éstos. Este superparamagnetismo fue consecuencia del pequeño tamaño de la Fe3O4 (< 20 nm). Figure 6 shows the hysteresis cycle of Fe3O4 nanoparticles and Fe3O4 / PCL compounds. In the case of pure magnetite nuclei, hysteresis was not observed due to their superparamagnetic character. This superparamagnetism was a consequence of the small size of Fe3O4 (<20 nm).
De la región lineal del ciclo de histéresis (zona de campo magnético bajo) se estimó la susceptibilidad magnética inicial (χi) de las partículas compuestas Fe3O4/PCL: 3.13 ± 0.17; y, el valor de la magnetización de saturación 258 ± 7 emu/g. Las partículas compuestas Fe3O4/PCL obtenidas en las mejores condiciones posibles (relación 2:4 de masas iniciales Fe3O4:PCL) tuvieron unas propiedades magnéticas muy superiores a las de coloides de igual composición (Fe3O4/PCL), p. ej., valores de magnetización de saturación: ≈ 8 emu/g [Hamoudeh y Fessi, 2006], ≈ 17.6 emu/g [Yang y cols., 2006], y ≈ 10.2 emu/g [Gang y cols., 2007]. From the linear region of the hysteresis cycle (low magnetic field zone) the initial magnetic susceptibility (χi) of the Fe3O4 / PCL composite particles was estimated: 3.13 ± 0.17; and, the saturation magnetization value 258 ± 7 emu / g. The Fe3O4 / PCL composite particles obtained under the best possible conditions (2: 4 ratio of initial Fe3O4: PCL masses) had magnetic properties far superior to those of colloids of equal composition (Fe3O4 / PCL), p. eg, saturation magnetization values: ≈ 8 emu / g [Hamoudeh and Fessi, 2006], ≈ 17.6 emu / g [Yang et al., 2006], and ≈ 10.2 emu / g [Gang et al., 2007] .
Estas propiedades magnéticas de las nanopartículas compuestas Fe3O4/PCL del sistema coloidal diseñado demuestra que dichas nanopartículas tenían las características adecuadas para su utilización en el transporte de fármacos a un órgano o tejido diana: un recubrimiento polimérico que permitirá el transporte de cantidades suficientes de fármaco y su liberación a una velocidad controlable, y una más que adecuada capacidad para responder a gradientes magnéticos aplicados. Esta respuesta a gradientes magnéticos aplicados debe mejorar notablemente la concentración en el lugar de acción de la dosis de nanopartículas Fe3O4/PCL administradas y, de esta manera, la total acumulación de la dosis de fármaco en la región diana (potenciación del efecto farmacológico y reducción de la toxicidad asociada a una extensa biodistribución). These magnetic properties of the Fe3O4 / PCL composite nanoparticles of the designed colloidal system demonstrate that these nanoparticles had the characteristics suitable for use in transporting drugs to a target organ or tissue: a polymeric coating that will allow the transport of sufficient amounts of drug and its release at a controllable speed, and a more than adequate capacity to respond to applied magnetic gradients. This response to applied magnetic gradients should significantly improve the concentration at the site of action of the Fe3O4 / PCL nanoparticle dose administered and, thus, the total accumulation of the drug dose in the target region (potentiation of the pharmacological effect and reduction of toxicity associated with extensive biodistribution).
De forma adicional, la capacidad de respuesta a campos magnéticos aplicados de las partículas de Fe3O4 yde Fe3O4/PCL fue analizada cualitativamente mediante visualización del efecto que ejerce un imán permanente sobre una suspensión acuosa de estas nanopartículas. En concreto, se prepararon sendas suspensiones acuosas coloidales con una concentración < 0.5% (p/v). A una temperatura de 25.0 ± 0.5ºC, se puso en contacto la suspensión de Fe3O4 ylade Fe3O4/PCL con un campo magnético de 400 mT, y se observó el comportamiento de las nanopartículas en función del tiempo. Como puede apreciarse en la figura 7, las nanopartículas compuestas de Fe3O4/PCL fueron atraídas muy rápidamente por el imán, confirmando las grandes propiedades magnéticas del sistema diseñado. El sobrenadante quedó completamente transparente, en menos de 1 minuto. Por el contrario, la suspensión de nanopartículas de Fe3O4 mantuvo su aspecto homogéneo incluso tras 24 horas de exposición al gradiente magnético aplicado. El carácter superparamagnético de las nanopartículas de Fe3O4 justificó la ausencia de respuesta al gradiente magnético de 400 mT. Additionally, the ability to respond to applied magnetic fields of Fe3O4 and Fe3O4 / PCL particles was analyzed qualitatively by visualizing the effect of a permanent magnet on an aqueous suspension of these nanoparticles. Specifically, two colloidal aqueous suspensions were prepared with a concentration <0.5% (w / v). At a temperature of 25.0 ± 0.5 ° C, the Fe3O4 suspension and Fe3O4 / PCL suspension were contacted with a magnetic field of 400 mT, and the behavior of the nanoparticles was observed as a function of time. As can be seen in Figure 7, the nanoparticles composed of Fe3O4 / PCL were attracted very quickly by the magnet, con fi rming the great magnetic properties of the designed system. The supernatant was completely transparent, in less than 1 minute. In contrast, the Fe3O4 nanoparticle suspension maintained its homogeneous appearance even after 24 hours of exposure to the applied magnetic gradient. The superparamagnetic character of the Fe3O4 nanoparticles justified the absence of a response to the 400 mT magnetic gradient.
Con el fin de analizar el comportamiento microscópico de las suspensiones acuosas de las nanopartículas compuestas Fe3O4/PCL, realizamos un seguimiento mediante microscopía óptica de éstas. Las suspensiones acuosas tenían una concentración del 0.1% (p/v) de nanopartículas y la exposición a un gradiente magnético de 400 mT se realizó a 25.0 ± 0.5ºC. En concreto, una gota de suspensión acuosa de las nanopartículas magnéticas se colocó en un portaobjetos y fue sometida a un imán localizado en diferentes posiciones con respecto a la suspensión magnética. La visualización del efecto que el gradiente magnético aplicado ejerció sobre la suspensión de nanopartículas se realizó utilizando un microscopio óptico (magnificación: 40X). In order to analyze the microscopic behavior of the aqueous suspensions of the Fe3O4 / PCL composite nanoparticles, we monitored them using optical microscopy. The aqueous suspensions had a concentration of 0.1% (w / v) of nanoparticles and exposure to a magnetic gradient of 400 mT was performed at 25.0 ± 0.5 ° C. Specifically, a drop of aqueous suspension of the magnetic nanoparticles was placed on a slide and subjected to a magnet located in different positions with respect to the magnetic suspension. The visualization of the effect that the applied magnetic gradient exerted on the nanoparticle suspension was performed using an optical microscope (magnification: 40X).
Como puede apreciarse en la figura 8a, la suspensión acuosa de nanopartículas de Fe3O4/PCL fue muy homogénea en ausencia de un gradiente magnético aplicado. Sin embargo, cuando la gota de suspensión quedaba bajo la influencia del imán permanente de 400 mT, las partículas formaban agregados en forma de cadenas paralelas a la dirección del gradiente magnético (figura 8b en adelante). As can be seen in Figure 8a, the aqueous suspension of Fe3O4 / PCL nanoparticles was very homogeneous in the absence of an applied magnetic gradient. However, when the suspension droplet was under the in fl uence of the permanent magnet of 400 mT, the particles formed aggregates in the form of chains parallel to the direction of the magnetic gradient (Figure 8b onwards).
El proceso de análisis de las condiciones óptimas de formulación de las nanopartículas de Fe3O4PCL se completó con el estudio de las propiedades magnéticas de las partículas obtenidas según cada una de las relaciones de masa iniciales Fe3O4:PCL (desde 1:4, hasta 4:1). La susceptibilidad inicial y la magnetización de saturación de cada uno de los tipos de partículas magnéticas compuestas quedan recogidas en la tabla 2. Estos parámetros magnéticos fueron calculados a partir del ciclo de histéresis de cada una de las muestras. The process of analysis of the optimal conditions of formulation of the nanoparticles of Fe3O4PCL was completed with the study of the magnetic properties of the particles obtained according to each of the initial mass ratios Fe3O4: PCL (from 1: 4, to 4: 1 ). The initial susceptibility and saturation magnetization of each of the types of composite magnetic particles are shown in Table 2. These magnetic parameters were calculated from the hysteresis cycle of each of the samples.
TABLA 2 TABLE 2
Propiedades magnéticas de las partículas compuestas magnetita/poli(ε-caprolactona) (Fe3O4/PCL) obtenidas a partir de diferentes proporciones de masa inicial magnetita:polímero Magnetic properties of the magnetite / poly (ε-caprolactone) composite particles (Fe3O4 / PCL) obtained from different proportions of initial magnetite mass: polymer
Como puede observarse en la tabla 2, las nanopartículas con mejores propiedades magnéticas fueron aquellas obtenidas a partir de una relación de masas inicial Fe3O4:PCL entre 4:4 y 2:4, debido principalmente a que las partículas así obtenidas albergaban un gran número de núcleos superparamagnéticos en su interior y, por lo tanto, presentaban una mayor capacidad para responder a gradientes magnéticos. Cuando la síntesis de las partículas compuestas se realizó con las proporciones 4:3 a 4:1, el recubrimiento polimérico obtenido fue mucho más delgado y en su interior hubo un menor número de partículas de magnetita (figura 3a). Este efecto fue cada vez más patente conforme se incrementaba el exceso en núcleos superparamagnéticos utilizado en la síntesis. Así, las propiedades magnéticas fueron cada vez menores. Finalmente, cuando el exceso de polímero utilizado en la síntesis de las partículas compuestas era muy grande (relación de pesos iniciales 1:4), las partículas superparamagnéticas quedaban embebidas por una cubierta de polímero tan grande que lograba reducir significativamente la magnetización de la muestra (figura 3c). As can be seen in Table 2, the nanoparticles with the best magnetic properties were those obtained from an initial Fe3O4: PCL mass ratio between 4: 4 and 2: 4, mainly because the particles thus obtained harbored a large number of superparamagnetic nuclei inside and, therefore, had a greater capacity to respond to magnetic gradients. When the synthesis of the composite particles was carried out with the proportions 4: 3 to 4: 1, the polymeric coating obtained was much thinner and in its interior there was a smaller number of magnetite particles (Figure 3a). This effect was increasingly evident as the excess in superparamagnetic nuclei used in the synthesis increased. Thus, the magnetic properties were getting smaller. Finally, when the excess polymer used in the synthesis of the composite particles was very large (ratio of initial weights 1: 4), the superparamagnetic particles were embedded by a polymer shell so large that it was able to significantly reduce the magnetization of the sample ( Figure 3c).
Estos resultados demostraron que con la relación de masas inicial Fe3O4:PCL de 2:4, se conseguían los mejores resultados para obtener unas nanopartículas magnéticas compuestas con las mejores características para su uso en el transporte magnético de fármacos hasta el órgano o tejido diana. These results showed that with the initial Fe3O4: PCL mass ratio of 2: 4, the best results were obtained to obtain composite nanoparticles with the best characteristics for use in the magnetic transport of drugs to the target organ or tissue.
4.-Propiedades eléctricas superficiales 4.-Surface electrical properties
La determinación de las movilidades electroforéticas (ue) de las distintas suspensiones acuosas se llevó a cabo utilizando un dispositivo Malvern Zetasizer 2000 (Malvern Instruments, Inglaterra). La medida estaba basada en el análisis de la autocorrelación de la luz láser dispersada por las nanopartículas en movimiento. El aparato utilizado permitió determinar ue con errores ≤ 5%. La temperatura de medida (25ºC) se mantuvo constante (hasta ± 0.2ºC) utilizando un módulo Peltier. Las suspensiones estudiadas tenían una concentración de nanopartículas ≈ 0.1% (p/v). Antes de preparar la suspensión se fijaba la concentración del electrolito (KNO3) deseada y se ajustaba, en su caso, el pH con HNO3 o KOH. Las medidas se realizaron tras 24 horas de contacto de las nanopartículas con el medio de dispersión a 25.0 ± 0.5ºC y bajo agitación mecánica (50 rpm). Los datos presentados fueron el promedio de 12 determinaciones, cambiando la muestra cada tres. La teoría de O’Brien y White [O’Brien y White, 1978] se utilizó para convertir los valores de ue en potencial zeta (ζ). The electrophoretic mobility (eu) of the various aqueous suspensions was determined using a Malvern Zetasizer 2000 device (Malvern Instruments, England). The measurement was based on the analysis of the autocorrelation of the laser light dispersed by the moving nanoparticles. The device used allowed to determine ue with errors ≤ 5%. The measurement temperature (25ºC) was kept constant (up to ± 0.2ºC) using a Peltier module. The suspensions studied had a concentration of nanoparticles ≈ 0.1% (w / v). Before preparing the suspension, the desired electrolyte concentration (KNO3) was fixed and the pH adjusted, if necessary, with HNO3 or KOH. The measurements were made after 24 hours of contact of the nanoparticles with the dispersion medium at 25.0 ± 0.5 ° C and under mechanical agitation (50 rpm). The data presented were the average of 12 determinations, changing the sample every three. The theory of O'Brien and White [O'Brien and White, 1978] was used to convert the values of ue into zeta potential (ζ).
En el caso del estudio de la estabilidad de las propiedades eléctricas superficiales de las nanopartículas compuestas Fe3O4/PCL, las medidas se realizaron de igual forma. La única diferencia introducida fue la composición del medio de dispersión de las nanopartículas: tampón NaOH-KH2PO4 (pH = 7.4 ± 0.1). In the case of the study of the stability of the surface electrical properties of the Fe3O4 / PCL composite nanoparticles, the measurements were performed in the same way. The only difference introduced was the composition of the nanoparticle dispersion medium: NaOH-KH2PO4 buffer (pH = 7.4 ± 0.1).
Debido a que las propiedades de los óxidos de hierro son extremadamente sensibles a las variaciones del pH, lo cual no es predecible en el caso de la poli(ε-caprolactona) debido a la naturaleza de los grupos responsables de su carga (los ácidos carboxílicos libres), centramos en primer lugar nuestro estudio en el efecto del pH sobre el potencial zeta (ζ) de las nanopartículas. La figura 9 muestra la evolución del ζ de las nanopartículas en función del pH (con una fuerza iónica moderada constante: KNO3 10−3 M). Como puede observarse, las nanopartículas de magnetita presentaron un punto isoeléctrico o pH de potencial zeta zero bien definido en torno a pH 7. En el caso del polímero, el punto isoeléctrico se encontraba en las proximidades del pH 5.5. A partir de estos valores la carga eléctrica superficial fue negativa. Esta diferencia entre el comportamiento electrocinético de las nanopartículas de Fe3O4 y de PCL convirtieron a la electroforesis en una herramienta muy útil para comprobar cualitativamente la eficacia del recubrimiento y, de esta manera la obtención de partículas compuestas Fe3O4/PCL. La figura 9 muestra cómo las nanopartículas Fe3O4/PCL presentaban un comportamiento casi idéntico a las de polímero puro. Por lo tanto, podemos concluir que el recubrimiento polimérico oculta muy eficazmente el núcleo magnético, haciendo que la superficie de las partículas compuestas sea indistinguible de la de las nanopartículas puras de polímero. Because the properties of iron oxides are extremely sensitive to variations in pH, which is not predictable in the case of poly (ε-caprolactone) due to the nature of the groups responsible for their charge (carboxylic acids First, we focus our study on the effect of pH on the zeta potential (ζ) of nanoparticles. Figure 9 shows the evolution of ζ of the nanoparticles as a function of pH (with a constant moderate ionic strength: KNO3 10-3 M). As can be seen, the magnetite nanoparticles had an isoelectric point or pH of zero zeta potential well defined around pH 7. In the case of the polymer, the isoelectric point was in the vicinity of pH 5.5. From these values the surface electric charge was negative. This difference between the electrokinetic behavior of the Fe3O4 and PCL nanoparticles made electrophoresis a very useful tool for qualitatively checking the effectiveness of the coating and, thus, obtaining Fe3O4 / PCL composite particles. Figure 9 shows how the Fe3O4 / PCL nanoparticles exhibited a behavior almost identical to those of pure polymer. Therefore, we can conclude that the polymeric coating very effectively conceals the magnetic core, making the surface of the composite particles indistinguishable from that of the pure polymer nanoparticles.
Para confirmar estos resultados determinamos el ζ de los tres tipos de nanopartículas en función de la concentración de KNO3 a pH = 6 constante, siguiendo la misma metodología. Los resultados de este análisis se muestran en la figura To confirm these results, we determine the ζ of the three types of nanoparticles based on the concentration of KNO3 at constant pH = 6, following the same methodology. The results of this analysis are shown in the figure
10. De nuevo se observa la similitud entre la electrocinética del polímero y de las partículas compuestas Fe3O4/PCL, y las diferencias con respecto a la magnetita. 10. Again, the similarity between the electrokinetics of the polymer and the Fe3O4 / PCL composite particles is observed, and the differences with respect to magnetite.
Con toda la información expuesta sobre las características superficiales de los materiales estudiados, demostramos el mecanismo por el que una matriz de poli(ε-caprolactona) se deposita sobre los núcleos de magnetita y los engloba. En concreto, predecimos una interacción electrostática netamente atractiva entre las nanopartículas de magnetita con carga eléctrica positiva y el polímero con carga eléctrica negativa. Las condiciones ligeramente ácidas en las que se formulan las nanopartículas compuestas Fe3O4/PCL (pH = 6.0) determinaron estas cargas eléctricas superficiales (figura 9). Gracias a esta interacción electrostática de tipo netamente atractivo, fue posible la concentración del polímero en la superficie de la matriz polimérica de la magnetita. Hecho que favoreció la inclusión de los núcleos superparamagnéticos en el interior de la matriz polimérica y, por lo tanto, la formación de las partículas magnéticas compuestas Fe3O4/PCL. With all the information presented on the surface characteristics of the materials studied, we demonstrate the mechanism by which a matrix of poly (ε-caprolactone) is deposited on the magnetite nuclei and encompasses them. Specifically, we predict a clearly attractive electrostatic interaction between magnetite nanoparticles with positive electrical charge and polymer with negative electrical charge. The slightly acidic conditions under which the Fe3O4 / PCL composite nanoparticles are formulated (pH = 6.0) determined these surface electrical charges (Figure 9). Thanks to this purely attractive electrostatic interaction, the concentration of the polymer on the surface of the polymer matrix of the magnetite was possible. Fact that favored the inclusion of superparamagnetic nuclei inside the polymer matrix and, therefore, the formation of the Fe3O4 / PCL composite magnetic particles.
La técnica de electroforesis también fue utilizada, siguiendo la misma metodología y rutina, para analizar las características y la eficacia del recubrimiento cuando cambia la relación de masas iniciales Fe3O4:PCL utilizada en la formulación de las nanopartículas compuestas Fe3O4/PCL. La figura 11 muestra los valores de ue de las nanopartículas compuestas en un medio de dispersión acuoso, en presencia de una fuerza iónica moderada constante (KNO3 10−3 M). The electrophoresis technique was also used, following the same methodology and routine, to analyze the characteristics and effectiveness of the coating when the initial Fe3O4: PCL mass ratio changes in the formulation of the Fe3O4 / PCL composite nanoparticles. Figure 11 shows the eu values of the nanoparticles composed in an aqueous dispersion medium, in the presence of a constant moderate ionic force (KNO3 10-3 M).
De forma muy patente, puede apreciarse cómo los valores de ue característicos de los núcleos magnéticos condujeron hacia los de las partículas de polímero puro al aumentar la cantidad de polímero utilizada en la relación de masas iniciales Fe3O4:PCL, principalmente por encima de 3:4. Por lo tanto, desde un punto de vista electroforético justificamos la utilización de una relación de masas iniciales 2:4 para la formulación de las nanopartículas compuestas Fe3O4/PCL. Sólo así los valores de ue de las nanopartículas compuestas son indistinguibles de los de la PCL y, por lo tanto, el recubrimiento polimérico de los núcleos magnéticos fue óptimo y eficaz. Very clearly, it can be seen how the characteristic eu values of the magnetic cores led to those of the pure polymer particles as the amount of polymer used in the initial mass ratio Fe3O4: PCL increased, mainly above 3: 4 . Therefore, from an electrophoretic point of view we justify the use of an initial 2: 4 mass ratio for the formulation of the Fe3O4 / PCL composite nanoparticles. Only in this way the eu values of the composite nanoparticles are indistinguishable from those of the PCL and, therefore, the polymeric coating of the magnetic cores was optimal and effective.
Las medidas electroforéticas de las suspensiones acuosas (concentración ≈ 0.1%, m/v) de magnetita y de nanocompuestos magnéticos se realizaron reproduciendo las condiciones fisiológicas (pH 7.4 ± 0.1, y 37.0 ± 0.5ºC). El experimento se consideró finalizado cuando los valores de movilidad electroforética (ue) de las nanopartículas Fe3O4/PCL coincidían con los de las nanopartículas puras de Fe3O4, señal inequívoca de la pérdida del recubrimiento polimérico. The electrophoretic measurements of the aqueous suspensions (concentration ≈ 0.1%, m / v) of magnetite and magnetic nanocomposites were performed by reproducing the physiological conditions (pH 7.4 ± 0.1, and 37.0 ± 0.5 ° C). The experiment was considered finalized when the electrophoretic mobility (ue) values of the Fe3O4 / PCL nanoparticles coincided with those of the pure Fe3O4 nanoparticles, an unequivocal sign of the loss of the polymeric coating.
En la figura 12 se aprecia cómo los valores de ue de la magnetita permanecen constantes durante todo el período del estudio (ue ≈ -3.5 μ·s−1/V·cm−1). Este valor negativo de ue tan elevado fue debido a la formación en la superficie de la magnetita de una fina capa de oxidación (maghemita, un estado más oxidado de ésta). De hecho, los valores de ue de nanopartículas de maghemita de igual tamaño a la Fe3O4 (bajo las mismas condiciones experimentales) fueron muy similares (ue ≈ -3.6 μ·s−1/V·cm−1). Figure 12 shows how the values of ue of the magnetite remain constant throughout the period of the study (ue ≈ -3.5 μ · s − 1 / V · cm − 1). This high negative value was due to the formation on the surface of the magnetite of a thin oxidation layer (maghemite, a more oxidized state of it). In fact, the ue values of maghemite nanoparticles of equal size to Fe3O4 (under the same experimental conditions) were very similar (ue ≈ -3.6 μ · s − 1 / V · cm − 1).
En la figura 12 se ve como los valores de ue de las nanopartículas Fe3O4/PCL se aproximan progresivamente a los característicos de los núcleos magnéticos. En concreto, se hacen iguales tras 15 días. A partir de entonces, no se observaron diferencias significativas entre la ue de ambos materiales. Por tanto, la superficie de los núcleos de Fe3O4 de los nanocompuestos quedó cada vez más expuesta al medio de dispersión (de ahí los valores cada vez más negativos de ue), por la degradación progresiva del recubrimiento. Así, cuando la cubierta de polímero se perdía completamente, ambos valores de ue se hacían indistinguibles. Esta evolución tan progresiva de ue hacia los valores típicos de la Fe3O4, puso de manifiesto cualitativamente que la velocidad de degradación del polímero fue lenta, lo que ha sido asociado al alto grado de cristalinidadyala gran hidrofobia de este polímero. In Figure 12 it is seen how the eu values of the Fe3O4 / PCL nanoparticles progressively approximate the characteristics of the magnetic cores. Specifically, they are made equal after 15 days. Thereafter, no significant differences were observed between the eu of both materials. Therefore, the surface of the Fe3O4 nuclei of the nanocomposites was increasingly exposed to the dispersion medium (hence the increasingly negative values of eu), due to the progressive degradation of the coating. Thus, when the polymer shell was completely lost, both values of ue became indistinguishable. This progressive evolution of the EU towards the typical Fe3O4 values showed qualitatively that the polymer degradation rate was slow, which has been associated with the high degree of crystallinity and the great hydrophobicity of this polymer.
5.-Termodinámica superficial 5.-Surface thermodynamics
El análisis termodinámico superficial de los núcleos de magnetita (Fe3O4), el recubrimiento polimérico [poli(εcaprolactona), PCL] y las nanopartículas Fe3O4/PCL, se realizó utilizando agua filtrada y desionizada (sistema Milli-Q Academia, Millipore, Francia), formamida (Cario Erba, Italia) y α-bromonaftaleno (Merck, Alemania). En la aplicación del modelo de van Oss se utilizaron los valores de las componentes de la tensión superficial de los líquidos de prueba utilizados (tabla 3) [van Oss, 2006]. The surface thermodynamic analysis of the magnetite nuclei (Fe3O4), the polymeric coating [poly (εcaprolactone), PCL] and the Fe3O4 / PCL nanoparticles, was performed using filtered and deionized water (Milli-Q Academia system, Millipore, France), formamide (Cario Erba, Italy) and α-bromonaphthalene (Merck, Germany). In the application of the van Oss model, the values of the surface tension components of the test liquids used were used (table 3) [van Oss, 2006].
TABLA 3 TABLE 3
Componentes de la tensión superficial (mJ/m2) de los líquidos utilizados en el experimento de medida del ángulo de contacto a 25.0 ± 0.5ºC Components of the surface tension (mJ / m2) of the liquids used in the contact angle measurement experiment at 25.0 ± 0.5ºC
La medida de los ángulos de contacto se realizó con un goniómetro Ramé-Hart 100-0.7-00 (EE.UU.), que permite observar las gotas de líquido depositadas sobre un sólido. Este aparato dispone de un conjunto de tornillos micrométricos que permiten los desplazamientos verticales y horizontales del sustrato, así como de un limbo graduado para la medida del ángulo con una precisión de ± 1º. El uso de una microjeringa Gimont (EE.UU.) permitió controlar el volumen de la gota depositada entre 2 y 4 μL. Las medidas se realizaron a 25.0 ± 0.5ºC, utilizando una cámara termostática. La captura de las imágenes de las gotas de los líquidos depositados sobre la superficie de los materiales se realizó utilizando una cámara digital que tiene un dispositivo de carga acoplada (“charge-coupled device”, CCD) y un sistema de análisis digital de imágenes. The contact angles were measured with a Ramé-Hart 100-0.7-00 goniometer (USA), which allows to observe the drops of liquid deposited on a solid. This device has a set of micrometric screws that allow vertical and horizontal displacements of the substrate, as well as a graduated blade for angle measurement with an accuracy of ± 1º. The use of a Gimont microjeringa (USA) allowed to control the volume of the drop deposited between 2 and 4 μL. The measurements were made at 25.0 ± 0.5 ° C, using a thermostatic chamber. The images of the drops of the liquids deposited on the surface of the materials were captured using a digital camera that has a charge-coupled device (CCD) and a digital image analysis system.
Los ángulos de contacto de los líquidos seleccionados se determinaron sobre finas capas de los tres tipos de nanopartículas depositadas sobre unos portaobjetos de microscopio (placa de vidrio). Estas superficies lisas se obtuvieron tras la adicción de manera uniforme de una suspensión acuosa de cada tipo de nanomaterial (≈ 10%, p/v) sobre la superficie limpia y seca de una placa de vidrio. En la preparación de la muestra comprobamos que con la adición de 10 mL de suspensión acuosa de nanopartículas se obtenía una capa de material suficientemente gruesa. La desecación de los portaobjetos con cada una de las muestras se realizó a 35.0 ± 0.5ºC, utilizando un horno de desecación durante 24 horas. De esta manera, se obtuvo una capa de material muy uniforme a nivel macroscópico, la cual permitió que la medida de los ángulos de contacto se realizara en gotas muy estables. The contact angles of the selected liquids were determined on thin layers of the three types of nanoparticles deposited on microscope slides (glass plate). These smooth surfaces were obtained after the uniform addition of an aqueous suspension of each type of nanomaterial (≈ 10%, w / v) on the clean and dry surface of a glass plate. In the preparation of the sample we verified that with the addition of 10 mL of aqueous suspension of nanoparticles a sufficiently thick layer of material was obtained. The drying of the slides with each of the samples was carried out at 35.0 ± 0.5 ° C, using a drying oven for 24 hours. In this way, a very uniform layer of material was obtained at the macroscopic level, which allowed the measurement of the contact angles to be carried out in very stable drops.
En la figura 13, se recogen los valores promedio de los ángulos de contacto obtenidos tras realizar 16 determinaciones midiendo sobre una nueva gota después de cada dos medidas. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la existencia de importantes diferencias entre los núcleos de óxido de hierro y las nanopartículas magnéticas compuestas Fe3O4/PCL. In Figure 13, the average values of the contact angles obtained after making 16 determinations are measured by measuring on a new drop after every two measurements. The results obtained show the existence of important differences between the iron oxide nuclei and the Fe3O4 / PCL composite magnetic nanoparticles.
Para aportar una información física veraz sobre la termodinámica de los tres tipos de superficies fue necesaria la evaluación de las componentes γs. Los datos representados en la figura 14 confirman en gran medida nuestras estimaciones sobre la eficacia del recubrimiento de los núcleos magnéticos basadas en las propiedades electrocinéticas anteriormente analizadas. En particular, para cualquier componente de la energía libre superficial considerado, sus valores para las partículas magnéticas compuestas Fe3O4/PCL coinciden casi totalmente con los correspondientes al polímero puro. Además, a pesar de que la componente Lifshitz-van der Waals (γSLW) fue la menos afectada por el tratamiento superficial, su valor para las nanopartículas Fe3O4/PCL fue casi el mismo que para el polímero. A pesar de que la componente electrón-aceptor (γS +) era muy pequeña para los tres tipos de materiales, su magnitud para las nanopartículas Fe3O4/PCL fue virtualmente cero e idéntico al correspondiente a la PCL, adquiriendo valores finitos para la magnetita. La contribución electrón-donante (γS −) muestro una diferencia mucho más notable entre los núcleos de óxido de hierro y las partículas magnéticas compuestas Fe3O4/PCL. El elevado valor de esta última componente en el caso de la magnetita confirma su carácter monopolar electrón-donante. In order to provide truthful physical information on the thermodynamics of the three types of surfaces, the evaluation of the γs components was necessary. The data depicted in Figure 14 largely confirm our estimates of the effectiveness of the coating of magnetic cores based on the electrokinetic properties discussed above. In particular, for any component of the surface free energy considered, its values for the Fe3O4 / PCL composite magnetic particles almost completely coincide with those corresponding to the pure polymer. In addition, although the Lifshitz-van der Waals component (γSLW) was the least affected by the surface treatment, its value for the Fe3O4 / PCL nanoparticles was almost the same as for the polymer. Although the electron-acceptor component (γS +) was very small for the three types of materials, its magnitude for the Fe3O4 / PCL nanoparticles was virtually zero and identical to that corresponding to the PCL, acquiring finite values for magnetite. The electron-donor contribution (γS -) shows a much more noticeable difference between the iron oxide nuclei and the Fe3O4 / PCL composite magnetic particles. The high value of this last component in the case of magnetite confirms its electron-donor monopolar character.
Los resultados mostraron que el recubrimiento de los núcleos magnéticos fue completo bajo las condiciones óptimas de la síntesis. The results showed that the coating of the magnetic nuclei was complete under the optimal conditions of the synthesis.
Las interacciones implicadas en la determinación de la energía libre superficial de los nanomateriales se manifiestan en fenómenos como la agregación de las nanopartículas en suspensión o su adhesión a diferentes sustratos. The interactions involved in determining the surface free energy of nanomaterials are manifested in phenomena such as aggregation of suspended nanoparticles or their adhesion to different substrates.
La idea que subyace en nuestro estudio es que las metodologías empleadas, junto con su base teórica, permiten: i) especificar completamente la componente LW de la energía de interacción entre las partículas dispersas (contemplada, junto con la repulsión electrostática entre dobles capas eléctricas, en la teoría clásica DLVO); y ii) cuantificar igualmente las contribuciones no-DVLO a la energía total del sistema, las cuáles se relacionan con la componente AB de la teoría superficial tanto del sólido en suspensión como del líquido. The idea underlying our study is that the methodologies used, together with their theoretical basis, allow: i) to fully specify the LW component of the interaction energy between the dispersed particles (contemplated, together with the electrostatic repulsion between double electrical layers, in classical theory DLVO); and ii) also quantify non-DVLO contributions to the total energy of the system, which relate to component AB of the surface theory of both the suspended solid and the liquid.
Consideramos aquí la importancia de los términos LW y AB de la energía de interacción entre los materiales descritos (fase 1) en un medio acuoso (fase 2): We consider here the importance of the terms LW and AB of the interaction energy between the described materials (phase 1) in an aqueous medium (phase 2):
y ΔGABand ΔGAB
Los valores obtenidos de ΔGLW se muestran en la tabla 4, donde puede apreciarse que para la magneThe values obtained from ΔGLW are shown in table 4, where it can be seen that for the magne
121 121 121 121
tita, el intercambio energético debido a la componente LW es bastante menor que el asociado a la componente AB, siendo además negativo. Por tanto, la variación de la energía libre de interacción total es debida, principalmente, a la componente AB [Plaza y cols., 1998]. El hecho de que sea positiva la contribución AB en la magnetita, indica que su naturaleza fuertemente monopolar provoca una significativa repulsión entre las nanopartículas. La interacción LW debida a la contribución apolar, siempre atractiva en estos casos, es mucho menos intensa, provocando por ello un valor neto positivo para ΔG121. Por el contrario, tanto las nanopartículas compuestas Fe3O4/PCL como el polímero tienen valores negativos de ΔG121 (atracción hidrófoba), que se añaden a la atracción de van der Waals. tita, the energy exchange due to the LW component is much smaller than that associated with the AB component, being also negative. Therefore, the variation of the energy free of total interaction is mainly due to the AB component [Plaza et al., 1998]. The fact that the AB contribution in the magnetite is positive indicates that its strongly monopolar nature causes a significant repulsion between the nanoparticles. The LW interaction due to the apolar contribution, always attractive in these cases, is much less intense, thus causing a positive net value for ΔG121. In contrast, both the Fe3O4 / PCL composite nanoparticles and the polymer have negative values of ΔG121 (hydrophobic attraction), which are added to the van der Waals attraction.
TABLA 4 TABLE 4
Energía libre de interacción entre las partículas y sus componentes AB y LW en medio acuoso Energy free of interaction between particles and their components AB and LW in aqueous medium
Obviamente, estos cambios en la energía libre superficial se manifiestan en el carácter hidrófobo/hidrófilo de los diferentes nanomateriales estudiados. Podemos utilizar el siguiente criterio para determinar cuándo un material puede considerarse hidrófilo o hidrófobo [van Oss, 2006]: Si ΔG121 resulta ser negativo, las interacciones interfaciales favorecen la atracción entre sí de las nanopartículas, y se consideran hidrófobas. Por el contrario, la hidrofilia se corresponde con valores positivos de ΔG121. Obviously, these changes in surface free energy are manifested in the hydrophobic / hydrophilic character of the different nanomaterials studied. We can use the following criteria to determine when a material can be considered hydrophilic or hydrophobic [van Oss, 2006]: If ΔG121 turns out to be negative, interfacial interactions favor the attraction of nanoparticles to each other, and are considered hydrophobic. On the contrary, hydrophilicity corresponds to positive values of ΔG121.
La figura 15 muestra los resultados obtenidos para los tres tipos de nanomateriales. Como puede apreciarse, la naturaleza hidrófila de la magnetita se pierde al ser recubierta por el polímero hidrófobo, lo que puede considerarse como un indicio muy claro de que dicho recubrimiento es eficaz. Figure 15 shows the results obtained for the three types of nanomaterials. As can be seen, the hydrophilic nature of the magnetite is lost when it is coated by the hydrophobic polymer, which can be considered as a very clear indication that said coating is effective.
Ejemplo 2 Example 2
Evaluación de la capacidad de vehiculización de fármacos Evaluation of drug vehiculization capacity
Evaluamos la vehiculización de dos fármacos antitumorales (doxorrubicina y 5-fluorouracilo) y un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE, diclofenaco sódico) en las nanopartículas compuestas. Se siguieron dos metodologías para la incorporación de estos principios activos. En concreto, la adsorción superficial tras la formación e incubación de las nanopartículas en una disolución de principio activo (método de adsorción), y la adición en el momento en el que se generaban las nanopartículas, de forma que quedaba atrapado el principio activo principalmente en la matriz de éstas (método de absorción). Utilizamos la técnica de espectrofotometría UV-Vis como metodología de cuantificación de la cantidad de fármaco incorporada en las nanopartículas. Los experimentos se repitieron por triplicado para cada una de las concentraciones molares de fármaco. We evaluated the vehiculization of two antitumor drugs (doxorubicin and 5-fl uorouracil) and a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID, diclofenac sodium) in the composite nanoparticles. Two methodologies were followed for the incorporation of these active principles. Specifically, the surface adsorption after the formation and incubation of the nanoparticles in an active principle solution (adsorption method), and the addition at the time at which the nanoparticles were generated, so that the active principle was mainly trapped in their matrix (absorption method). We use the UV-Vis spectrophotometry technique as a methodology for quantifying the amount of drug incorporated into the nanoparticles. The experiments were repeated in triplicate for each of the molar concentrations of the drug.
La cantidad de fármaco incorporado se expresó en términos de eficacia de atrapamiento (entrapment efficiency, EE) (%) [(fármaco vehiculizado (mg)/cantidad total de fármaco utilizado (mg)) x 100] y de carga de fármaco (drug loading, DL) (%) [(fármaco vehiculizado (mg)/masa total utilizada de nanopartículas (mg)) x 100]. The amount of drug incorporated was expressed in terms of entrapment efficiency (EE) (%) [(vehiculized drug (mg) / total amount of drug used (mg)) x 100] and drug loading (drug loading , DL) (%) [(vehiculized drug (mg) / total mass of nanoparticles (mg)) x 100].
La determinación de la adsorción superficial de fármaco sobre las nanopartículas de compuestas Fe3O4/PCL se realizó partiendo de una serie de disoluciones acuosas (10 mL) con diferente concentración molar de principio activo (10−5,10−4,10−3 y10−2), salvo en el caso de la doxorrubicina donde la concentración máxima utilizada fue de 10−3 The determination of the surface adsorption of drug on the nanoparticles of Fe3O4 / PCL compounds was carried out based on a series of aqueous solutions (10 mL) with different molar concentration of active ingredient (10−5, 10, 4.10, 3 and 10− 2), except in the case of doxorubicin where the maximum concentration used was 10-3
M. En todos estos medios de dispersión se fijó una concentración de nanopartículas del 1% (p/v). Tras 24 horas de contacto de las nanopartículas con el fármaco a 25ºC ± 0.1ºC y bajo agitación mecánica (50 rpm), se obtuvieron los sobrenadantes mediante doble centrifugación a 11000 rpm durante 40 minutos y la cantidad de fármaco vehiculizada se evaluó mediante espectrofotometría UV-Vis. La tabla 5 recoge la cantidad vehiculizada en las nanopartículas de cada uno de los principios activos en función de la concentración de éstos fijada en la solución acuosa. Puede apreciarse cómo la concentración utilizada de fármaco influye positivamente en la vehiculización. M. In all these dispersion media a concentration of nanoparticles of 1% (w / v) was fixed. After 24 hours of contact of the nanoparticles with the drug at 25 ° C ± 0.1 ° C and under mechanical stirring (50 rpm), the supernatants were obtained by double centrifugation at 11000 rpm for 40 minutes and the amount of vehicle vehicle was evaluated by UV spectrophotometry. Vis. Table 5 shows the amount of the active ingredients in the nanoparticles of each of the active ingredients as a function of their concentration in the aqueous solution. It can be seen how the concentration of drug used positively influences the vehiculization.
TABLA 5 TABLE 5
Eficacia de atrapamiento (%) y carga del fármaco de los fármacos en la superficie de las nanopartículas de Fe3O4/PCL, en función de la concentración de fármaco Efficiency of entrapment (%) and drug loading of drugs on the surface of nanoparticles of Fe3O4 / PCL, depending on drug concentration
Una vez caracterizada la escasa incorporación de los tres fármacos en la superficie de las nanopartículas compuestas Fe3O4/PCL, estudiamos la contribución del método de vectorización de fármacos en sistemas transportadores: la incorporación del principio activo en el momento en que se produce la formación de las nanopartículas. Para ello, analizamos el efecto del principal factor condicionante de la captación de principio activo en la matriz de las nanopartículas: la propia concentración de fármaco. De esta manera, definimos las condiciones de vehiculización óptimas de estos principios activos en las nanopartículas compuestas magnéticas. Once the scarce incorporation of the three drugs on the surface of the Fe3O4 / PCL composite nanoparticles has been characterized, we study the contribution of the method of drug vectorization in transport systems: the incorporation of the active substance at the moment when the formation of the nanoparticles. For this, we analyze the effect of the main conditioning factor of the capture of active substance in the matrix of the nanoparticles: the drug concentration itself. In this way, we define the optimal vehicle conditions for these active ingredients in magnetic composite nanoparticles.
El análisis de la influencia de la concentración de estos principios activos sobre su incorporación en la matriz de las nanopartículas fue realizado siguiendo la rutina de síntesis y el procedimiento espectrofotométrico UV-Vis ya señalados. Las concentraciones molares utilizadas en el caso de la doxorrubicina fueron: 10−5,10−4 y10−3. Sin embargo, en el caso del 5-fluorouracilo y del diclofenaco sódico, además de las concentraciones citadas, también se utilizó una concentración 10−2 M. Los experimentos se repitieron por triplicado para cada una de las concentraciones molares de fármaco. The analysis of the influence of the concentration of these active ingredients on their incorporation into the nanoparticle matrix was performed following the synthesis routine and the UV-Vis spectrophotometric procedure already indicated. The molar concentrations used in the case of doxorubicin were: 10-5.10-4 and 10-3. However, in the case of 5-fl uorouracil and diclofenac sodium, in addition to the concentrations mentioned, a concentration of 10-2 M was also used. Experiments were repeated in triplicate for each of the molar concentrations of the drug.
La tabla 6 recoge la cantidad vehiculizada en las nanopartículas de cada uno de los principios activos en función de la concentración de éstos fijada en la solución acuosa. Como puede apreciarse, la absorción de estos fármacos en la matriz de las nanopartículas aumenta con la concentración de éstos presente en el medio de síntesis. Los valores obtenidos de incorporación de cada uno de estos fármacos son superiores a los correspondientes mediante el procedimiento de adsorción superficial (a iguales concentraciones de principio activo), lo que justifica la selección del método de vehiculización mediante absorción en matriz como el más adecuado para la síntesis de las partículas compuestas Fe3O4/PCL cargadas con estos fármacos. Table 6 shows the amount of the active ingredients in the nanoparticles of each of the active ingredients as a function of their concentration in the aqueous solution. As can be seen, the absorption of these drugs in the nanoparticle matrix increases with the concentration of these drugs present in the synthesis medium. The values obtained from the incorporation of each of these drugs are higher than those corresponding by the surface adsorption procedure (at the same concentrations of active ingredient), which justifies the selection of the method of vehiculization by matrix absorption as the most suitable for the Synthesis of Fe3O4 / PCL compound particles loaded with these drugs.
TABLA 6 TABLE 6
Eficacia de atrapamiento (%) y carga del fármaco de los fármacos en la matriz de las nanopartículas de Fe3O4/PCL, en función de la concentración de fármaco Efficiency of entrapment (%) and drug loading of drugs in the matrix of nanoparticles of Fe3O4 / PCL, depending on drug concentration
Las nanopartículas compuestas Fe3O4/PCL formuladas bajos las condiciones óptimas de vehiculización de cada uno de los tres fármacos se utilizaron en los ensayos in vitro de liberación. Tales condiciones fueron: adsorción superficial 10−3 M de doxorrubicina, y, 10−2 M para 5-fluorouracilo y diclofenaco sódico. Concentraciones similares se utilizaron el caso de la absorción en matriz, procedimiento con el que se obtiene una mayor vehiculización de fármaco (tablas 5 y 6). El ensayo de liberación in vitro de cada uno de los fármacos desde las nanopartículas compuestas Fe3O4/PCL se realizó por triplicado a 37.0 ± 0.5ºC. Para ello, se utilizó el método de diálisis y un tampón NaOH-KH2PO4 (pH = 7.4 ± 0.1) como medio de liberación. Las bolsas de diálisis se dejaron sumergidas en agua bidestilada durante 12 horas antes de comenzar el ensayo. La bolsa de diálisis utilizada (Spectrum® Spectra/Por® 6, EE.UU.) se caracteriza por un tamaño de poro de 2000 Da, que permite retener las nanopartículas en su interior, dejando sólo el fármaco liberado hasta el medio de liberación. The Fe3O4 / PCL composite nanoparticles formulated under the optimal vehicle conditions of each of the three drugs were used in the in vitro release assays. Such conditions were: 10-3 M surface adsorption of doxorubicin, and 10-2 M for 5-fl uorouracil and sodium diclofenac. Similar concentrations were used in the case of matrix absorption, a procedure with which a greater drug vehiculization is obtained (tables 5 and 6). The in vitro release assay of each drug from the Fe3O4 / PCL composite nanoparticles was performed in triplicate at 37.0 ± 0.5 ° C. For this, the dialysis method and a NaOH-KH2PO4 buffer (pH = 7.4 ± 0.1) were used as the release medium. The dialysis bags were left submerged in double-distilled water for 12 hours before starting the test. The dialysis bag used (Spectrum® Spectra / Por® 6, USA) is characterized by a pore size of 2000 Da, which allows the nanoparticles to be retained inside, leaving only the drug released to the release medium.
Las muestras del medio de liberación (1 mL) se recogieron según el siguiente intervalo de tiempos: 0.08, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 y 12 horas, y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15 días. Las muestras fueron analizadas mediante espectrofotometría UV-Vis a las longitudes de onda de máxima absorbencia de cada uno de los principios activos (doxorrubicina: 481 nm, 5-fluorouracilo: 266 nm, y diclofenaco sódico: 276 nm). Un volumen igual de la solución tampón, mantenido a la misma temperatura, fue añadido al medio de liberación tras cada toma de muestra con el objetivo de mantener las condiciones sink. Samples of the release medium (1 mL) were collected according to the following time interval: 0.08, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 and 12 hours, and 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 and 15 days. The samples were analyzed by UV-Vis spectrophotometry at the maximum absorbency wavelengths of each of the active substances (doxorubicin: 481 nm, 5-fl uorouracil: 266 nm, and sodium diclofenac: 276 nm). An equal volume of the buffer solution, maintained at the same temperature, was added to the release medium after each sampling in order to maintain the sink conditions.
En el caso del antitumoral doxorrubicina (figura 16), cuando se incorporaba esta molécula exclusivamente en la superficie de las nanopartículas mediante adsorción, la liberación de la dosis vehiculizada ocurría en sólo 4 horas. Por el contrario, si la incorporación de doxorrubicina se realizaba mediante el método de absorción en matriz, el 17% de la dosis vehiculizada se liberaba durante la primera hora, mientras que el 83% restante lo hacía mucho más progresivamente durante 11 días. In the case of the antitumor doxorubicin (Figure 16), when this molecule was incorporated exclusively on the surface of the nanoparticles by adsorption, the release of the vehicular dose occurred in only 4 hours. On the contrary, if the incorporation of doxorubicin was carried out using the matrix absorption method, 17% of the vehicular dose was released during the first hour, while the remaining 83% did so much more progressively for 11 days.
En cuanto al agente antineoplásico 5-fluorouracilo (figura 17), si era incorporado en la superficie de las nanopartículas mediante adsorción, su liberación ocurría en tan sólo 3 horas. Por el contrario, si la incorporación del fármaco se realizaba mediante el método de absorción en matriz, el 30% de la dosis vehiculizada se liberaba durante la primera hora y el 70% restante se liberaba en un total de 10 días. As for the 5-fl uorouracil antineoplastic agent (Figure 17), if it was incorporated into the surface of the nanoparticles by adsorption, its release occurred in just 3 hours. On the contrary, if the incorporation of the drug was carried out by the matrix absorption method, 30% of the vehicle dose was released during the first hour and the remaining 70% was released in a total of 10 days.
Finalmente en referencia al AINE diclofenaco sódico (figura 18), cuando se incorporaba esta molécula exclusivamente en la superficie de las nanopartículas mediante adsorción, la liberación de la dosis vehiculizada ocurría en sólo 2 horas. Por el contrario, si la incorporación se realizaba mediante el método de absorción en matriz, el 33% de la dosis vehiculizada se liberaba durante la primera hora y el 67% restante se liberaba en un total de 7 días. Finally, in reference to the diclofenac sodium NSAID (Figure 18), when this molecule was incorporated exclusively on the surface of the nanoparticles by adsorption, the release of the vehicular dose occurred in only 2 hours. On the contrary, if the incorporation was carried out by the matrix absorption method, 33% of the vehicle dose was released during the first hour and the remaining 67% was released in a total of 7 days.
En el caso de los 3 fármacos, el proceso de liberación fue claramente bifásico cuando la dosis de principio activo se incorporaba en las nanopartículas compuestas Fe3O4/PCL mediante el procedimiento de absorción en matriz. En estos casos, la liberación constaba de una fase rápida que significaba la pérdida del principio activo asociado a la superficie In the case of the 3 drugs, the release process was clearly biphasic when the dose of active ingredient was incorporated into the Fe3O4 / PCL composite nanoparticles by the matrix absorption procedure. In these cases, the release consisted of a rapid phase that meant the loss of the active substance associated with the surface
o débilmente atrapado (adsorbido en los poros superficiales). La liberación de fármaco más sostenida en el tiempo que se producía durante la segunda fase, fue debido a un proceso de difusión del fármaco a través de la matriz polimérica. or weakly trapped (adsorbed on surface pores). The more sustained drug release over time that occurred during the second phase was due to a process of diffusion of the drug through the polymer matrix.
Estos resultados demuestran la gran capacidad de las nanopartículas magnéticas de la presente invención para el transporte de una amplia variedad de fármacos y, por lo tanto, su versatilidad como sistema magnético transportador de principios activos. These results demonstrate the great capacity of the magnetic nanoparticles of the present invention for the transport of a wide variety of drugs and, therefore, their versatility as a magnetic system transporter of active ingredients.
Ejemplo 3 Example 3
Capacidad hipertérmica de las nanopartículas de la presente invención Hyperthermic capacity of the nanoparticles of the present invention
La capacidad de generar calor de las nanopartículas de Fe3O4/PCL bajo la acción de un gradiente electromagnético alterno fue ensayada in vitro a 25.0 ± 0.5ºC, por triplicado. Para ello, se prepararon 5 mL de una suspensión acuosa de estas nanopartículas (10 mg/mL). La frecuencia y la intensidad del gradiente magnético utilizado fueron 250 kHz y 4 kA/m, respectivamente. The ability to generate heat of the Fe3O4 / PCL nanoparticles under the action of an alternating electromagnetic gradient was tested in vitro at 25.0 ± 0.5 ° C, in triplicate. For this, 5 mL of an aqueous suspension of these nanoparticles (10 mg / mL) were prepared. The frequency and intensity of the magnetic gradient used were 250 kHz and 4 kA / m, respectively.
La figura 19 muestra el calentamiento in vitro de la suspensión acuosa de nanopartículas en función del tiempo. Bajo la exposición a un gradiente electromagnético alterno de alta frecuencia, la oscilación de los momentos magnéticos de las nanopartículas Fe3O4/PCL provocó que éstas generaran calor, alcanzándose la temperatura mínima de hipertermia (≈ 41ºC) tras 25 minutos. La suspensión alcanzó una temperatura máxima de 45ºC tras 35 minutos. Como puede apreciarse en la figura, esta temperatura fue mantenida de forma estable durante toda la duración del experimento. Esta circunstancia fue especialmente interesante, ya que numerosas investigaciones han puesto de manifiesto que el calentamiento a esta temperatura de una masa de células tumorales durante unos 30 minutos, provoca daños irreversibles en éstas e induce su muerte [Huber, 2005]. Además, la estabilización de la temperatura a 45ºC, demostró el buen control sobre la temperatura y el flujo de calor que ofrecían las nanopartículas, un requisito básico para su aplicación en hipertermia. Esto es especialmente importante si tenemos en cuenta que si la temperatura siguiera creciendo sin control (> 48ºC), los tejidos sanos que rodean la masa tumoral se quemarían y morirían. Figure 19 shows the in vitro heating of the aqueous nanoparticle suspension as a function of time. Under exposure to an alternating high frequency electromagnetic gradient, the oscillation of the magnetic moments of the Fe3O4 / PCL nanoparticles caused them to generate heat, reaching the minimum hyperthermia temperature (≈ 41 ° C) after 25 minutes. The suspension reached a maximum temperature of 45 ° C after 35 minutes. As can be seen in the figure, this temperature was stably maintained for the entire duration of the experiment. This circumstance was especially interesting, since numerous investigations have shown that heating at this temperature of a mass of tumor cells for about 30 minutes causes irreversible damage to them and induces death [Huber, 2005]. In addition, temperature stabilization at 45 ° C demonstrated good control over the temperature and heat flux offered by the nanoparticles, a basic requirement for application in hyperthermia. This is especially important if we consider that if the temperature continues to grow uncontrollably (> 48 ° C), the healthy tissues surrounding the tumor mass would burn and die.
Los resultados de los ejemplos descritos en la presente invención confirmaron que las nanopartículas compuestas magnetita/poli(ε-caprolactona) constituyeron una nanoplataforma ideal para el transporte de fármacos hasta el lugar de acción, proceso facilitado enormemente por su óptima capacidad de respuesta a gradientes magnéticos aplicados. Su versatilidad en el transporte de moléculas activas supuso una mejora de la terapia antitumoral y del tratamiento de enfermedades inflamatorias de diverso origen. Finalmente, y en el caso del cáncer, su capacidad para la hipertermia, permite la terapia combinada (quimioterapia optimizada + hipertermia) mucho más eficaz contra el tumor. The results of the examples described in the present invention confirmed that the magnetite / poly (ε-caprolactone) composite nanoparticles constituted an ideal nanoplatform for transporting drugs to the site of action, a process greatly facilitated by their optimal ability to respond to magnetic gradients Applied Its versatility in the transport of active molecules meant an improvement in antitumor therapy and in the treatment of inflammatory diseases of diverse origin. Finally, and in the case of cancer, its capacity for hyperthermia, allows combined therapy (optimized chemotherapy + hyperthermia) much more effective against the tumor.
Los resultados además demostraron que la técnica de formulación desarrollada en la presente invención simplificó considerablemente otras metodologías propuestas previamente [Hamoudeh y Fessi, 2006; Yang y cols., 2006; Gang y cols., 2007], Ya que como muestra el ejemplo 1 se evita un paso intermedio que conduce a la obtención de partículas de magnetita hidrófoba, la cuál complica las etapas siguientes del proceso (muy difícil manipulación de estas partículas hidrófobas por extremada tendencia a formar agregados) y encarece la obtención de la nanoformulación final. The results also demonstrated that the formulation technique developed in the present invention considerably simplified other previously proposed methodologies [Hamoudeh and Fessi, 2006; Yang et al., 2006; Gang et al., 2007], Since as shown in Example 1, an intermediate step is avoided that leads to the obtaining of hydrophobic magnetite particles, which complicates the following stages of the process (very difficult manipulation of these hydrophobic particles due to an extreme tendency to form aggregates) and the obtaining of the final nanoformulation becomes more expensive.
Claims (22)
- 1. one.
- Nanopartícula mixta de liberación prolongada de principios activos caracterizada porque la nanopartícula tiene un diámetro medio de entre 74-98 nm y comprende un núcleo de óxido de hierro, un recubrimiento biodegradable de poli (ε-caprolactona) y al menos un principio activo. Mixed nanoparticle of prolonged release of active ingredients characterized in that the nanoparticle has an average diameter of between 74-98 nm and comprises an iron oxide core, a biodegradable coating of poly (ε-caprolactone) and at least one active ingredient.
- 3. 3.
- Nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el núcleo de óxido de hierro tiene un diámetro medio de entre 10-14 nm. Mixed nanoparticle according to any of the preceding claims, characterized in that the iron oxide core has an average diameter between 10-14 nm.
- 4. Four.
- Nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el principio activo es un AINE. Mixed nanoparticle according to any of the preceding claims, characterized in that the active ingredient is an NSAID.
- 5. 5.
- Nanopartícula mixta según la reivindicación 4, donde el AINE es diclofenaco sódico. Mixed nanoparticle according to claim 4, wherein the NSAID is diclofenac sodium.
- 6. 6.
- Nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el principio activo es un antitumoral. Mixed nanoparticle according to any of claims 1-3, wherein the active ingredient is an antitumor.
- 7. 7.
- Nanopartícula mixta según la reivindicación 6 donde el antitumoral es seleccionado de entre la doxorrubicina o 5’-fluorouracilo. Mixed nanoparticle according to claim 6 wherein the antitumor is selected from among the doxorubicin or 5’-fl uorouracil.
- 8. 8.
- Nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso como medicamento. Mixed nanoparticle according to any of the preceding claims for use as a medicament.
- 9. 9.
- Nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para el tratamiento del cáncer. Mixed nanoparticle according to any of claims 1-7 for the treatment of cancer.
- 10. 10.
- Nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inflamación. Mixed nanoparticle according to any of claims 1-7 for the treatment of diseases related to inflammation.
- 11. eleven.
- Método para la preparación de una nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) síntesis del núcleo de magnetita mediante co-precipitación en solución acuosa, b) disposición interfacial de la poli (ε-caprolactona) en diclorometano junto con la nanopartícula de magnetita del paso a) en solución acuosa, Method for the preparation of a mixed nanoparticle according to any of the preceding claims characterized in that it comprises the following steps: a) synthesis of the magnetite core by co-precipitation in aqueous solution, b) interfacial arrangement of the poly (ε-caprolactone) in dichloromethane together with the magnetite nanoparticle from step a) in aqueous solution,
- 12. 12.
- Método según la reivindicación 11, donde el paso d) de adición del fármaco se realiza mediante adsorción superficial sobre las nanopartículas obtenidas tras el paso c). Method according to claim 11, wherein step d) of adding the drug is carried out by surface adsorption on the nanoparticles obtained after step c).
- 13. 13.
- Método según la reivindicación 11, donde el paso d) de adición del fármaco se realiza mediante absorción en la matriz de las nanopartículas en el paso b). Method according to claim 11, wherein step d) of adding the drug is carried out by absorption in the matrix of the nanoparticles in step b).
- 14. 14.
- Composición farmacéutica que comprende una nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Pharmaceutical composition comprising a nanoparticle according to any of claims 1-7 and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
- 15. fifteen.
- Composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso como medicamento. Pharmaceutical composition according to claim 14 for use as a medicament.
- 16. 16.
- Composición farmacéutica según la reivindicación 14 para el tratamiento del cáncer. Pharmaceutical composition according to claim 14 for the treatment of cancer.
- 17. 17.
- Composición farmacéutica según la reivindicación 14 para el tratamiento de los procesos inflamatorios. Pharmaceutical composition according to claim 14 for the treatment of inflammatory processes.
- 18. 18.
- Uso de la nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o la composición farmacéutica según reivindicación 14 para la fabricación de un medicamento. Use of the nanoparticle according to any of claims 1-7 or the pharmaceutical composition according to claim 14 for the manufacture of a medicament.
- 19. 19.
- Uso de la nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o la composición farmacéutica según reivindicación 14 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer. Use of the nanoparticle according to any of claims 1-7 or the pharmaceutical composition according to claim 14 for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
- 20. twenty.
- Uso de la nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o la composición farmacéutica según reivindicación 14 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de los procesos inflamatorios. Use of the nanoparticle according to any of claims 1-7 or the pharmaceutical composition according to claim 14 for the manufacture of a medicament for the treatment of inflammatory processes.
- 21. twenty-one.
- Uso de la nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o la composición farmacéutica según reivindicación 14 para la fabricación de un medicamento que se aplica en terapias realizadas mediante hipertermia electromagnética. Use of the nanoparticle according to any of claims 1-7 or the pharmaceutical composition according to claim 14 for the manufacture of a medicament that is applied in therapies performed by electromagnetic hyperthermia.
- Categoría Category
- 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas 56 Documents cited Claims Affected
- X X
- GANG J. et al. Magnetic poly £-caprolactone nanoparticles containing Fe3O4 and gemcitabine enhance anti-tumor effect in pancreatic cancer xenograft mouse model. Journal of Drug Targeting. 07.2007, Vol. 15, Nº 6, páginas 445-453, todo el documento. 1-21 GANG J. et al. Magnetic poly £ -caprolactone nanoparticles containing Fe3O4 and gemcitabine enhance anti-tumor effect in pancreatic cancer xenograft mouse model. Journal of Drug Targeting. 07.2007, Vol. 15, No. 6, pages 445-453, the whole document. 1-21
- X X
- HAMOUDEH M. et al. Preparation, characterization and surface study of poly-epsilon caprolactone magnetic microparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 06.06.2006, Vol. 300, páginas 584-590, todo el documento. 1-21 HAMOUDEH M. et al. Preparation, characterization and surface study of poly-epsilon caprolactone magnetic microparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 06.06.2006, Vol. 300, pages 584-590, the whole document. 1-21
- X X
- YANG J. et al. Preparation of poly £-caprolactone nanoparticles containing magnetite for magnetic drug carrier. International Journal of Pharmaceutics. 23.06.2006, Vol. 324, páginas 185-190, todo el documento. 1-21 YANG J. et al. Preparation of poly £ -caprolactone nanoparticles containing magnetite for magnetic drug carrier. International Journal of Pharmaceutics. 23.06.2006, Vol. 324, pages 185-190, the whole document. 1-21
- X X
- WO 2004096190 A1 (YONSEI UNIVERSITY) 11.11.2004, todo el documento. 1-21 WO 2004096190 A1 (YONSEI UNIVERSITY) 11.11.2004, the whole document. 1-21
- A TO
- SINHA V. R. et al. Poly £-caprolactone microspheres and nanospheres: an overview. International Journal of Pharmaceutics. 27.04.2004, Vol. 278, páginas 1-23, todo el documento. 1-21 SINHA V. R. et al. Poly £ -caprolactone microspheres and nanospheres: an overview. International Journal of Pharmaceutics. 04/27/2004, Vol. 278, pages 1-23, the whole document. 1-21
- A TO
- ARIAS J. L. et al. Formulation and physicochemical characterization of poly(£-caprolactone) nanoparticles loaded with ftorafur and diclofenac sodium. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 26.08.2009, Vol. 75, páginas 204-208, todo el documento. 1-21 ARIAS J. L. et al. Formulation and physicochemical characterization of poly (£ -caprolactone) nanoparticles loaded with ftorafur and diclofenac sodium. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 26.08.2009, Vol. 75, pages 204-208, the whole document. 1-21
- Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the date of priority submission of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application
- El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº: This report has been prepared • for all claims • for claims no:
- Fecha de realización del informe 06.03.2012 Date of realization of the report 06.03.2012
- Examinador M. Cumbreño Galindo Página 1/5 Examiner M. Cumbreño Galindo Page 1/5
- Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-21 SI NO Claims Claims 1-21 IF NOT
- Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Inventive activity (Art. 8.1 LP11 / 1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-21 SI NO Claims Claims 1-21 IF NOT
- Documento Document
- Número Publicación o Identificación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date
- D01 D01
- GANG J. et al. Journal of Drug Targeting Vol. 15, Nº 6, páginas 445-453 07.2007 GANG J. et al. Journal of Drug Targeting Vol. 15, No. 6, pages 445-453 07.2007
- D02 D02
- HAMOUDEH M. et al. Journal of Colloid and Interface Science. Vol. 300, páginas 584-590 06.06.2006 HAMOUDEH M. et al. Journal of Colloid and Interface Science. Vol. 300, pages 584-590 06.06.2006
- D03 D03
- YANG J. et al. International Journal of Pharmaceutics. Vol. 324, páginas 185-190 23.06.2006 YANG J. et al. International Journal of Pharmaceutics. Vol. 324, pages 185-190 06-23.2006
- D04 D04
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- D05 D05
- SINHA V. R. et al. International Journal of Pharmaceutics. Vol. 278, páginas 1-23 27.04.2004 SINHA V. R. et al. International Journal of Pharmaceutics. Vol. 278, pages 1-23 04/27/2004
- D06 D06
- ARIAS J. L. et al. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. Vol. 75, páginas 204-208 26.08.2009 ARIAS J. L. et al. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. Vol. 75, pages 204-208 08/26/2009
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