ES2373928T3 - Antígenos de toxoplasma gondii, p35, y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un método para distinguir entre Toxoplasmosis aguda y crónica en un paciente sospechoso de tener dicha Toxoplasmosis aguda o crónica que comprende las etapas de: a) poner en contacto una muestra de ensayo, de dicho paciente, con una composición que comprende los aminoácidos 172-306 de SEC ID Nº: 54; y b) detectar anticuerpos de IgG anti T. gondii, indicando la presencia de dichos anticuerpos de IgG Toxoplasmosis aguda en dicho paciente e indicando la falta de dichos anticuerpos de IgG Toxoplasmosis crónica en dicho paciente.

Description

Antígenos de Toxoplasma gondii, P35, y usos de los mismos

Antecedentes de la invención

Campo técnico

La presente invención se refiere a un antígeno que puede usarse para diferenciar entre infección aguda y crónica.

Información de antecedentes

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que se clasifica entre los Coccidia. Este parásito tiene un intervalo de hospedadores relativamente amplio infectando tanto a mamíferos como a aves. El organismo es ubicuo en la naturaleza y existen tres formas: taquizoito, quiste y ooquiste (Remington, J. S., McLeod, R., Desmonds, G., Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant (J. S. Remington y J. O. Klein, Eds.), pág. 140-267, Saunders, Philadelphia (1995)). Los taquizoitos, hallados durante la infección aguda, son la forma invasiva capaz de invadir todas las células de mamífero nucleadas. Después de la etapa aguda de infección, se forman quistes tisulares llamados bradizoitos dentro de las células hospedadoras y persisten dentro de los organismos hospedadores durante la vida del hospedador. Los quistes son importantes en la transmisión de la infección, especialmente en seres humanos, puesto que la ingestión de carne cruda o poco cocinada puede dar como resultado la ingestión de bradizoitos que pueden infectar al individuo dando como resultado una infección aguda. Los ooquistes representan una etapa de reproducción sexual que aparece solamente en el revestimiento intestinal de la familia de los gatos del que se excreta en las heces.

Una infección de T. gondii adquirida a través de carne contaminada o heces de gato en un adulto sano es con frecuencia asintomática. En mujeres embarazadas y pacientes inmunosuprimidos el resultado clínico puede ser muy grave. Una infección aguda con T. gondii adquirida durante el embarazo, especialmente durante el primer trimestre, puede dar como resultado transmisión intrauterina al feto no nato dando como resultado complicaciones fetales y neonatales graves, incluyendo retraso mental y muerte fetal. La recrudescencia de una infección por T. gondii previa

o una infección aguda en un individuo inmunosuprimido puede ser patogénica. La encefalitis toxoplásmica es una causa principal de morbidez y mortalidad en pacientes con SIDA. También se ha mostrado que la infección por toxoplasma es una causa significativa de coriorretinitis en niños y adultos.

El diagnóstico de infección con T. gondii puede establecerse por el aislamiento de T. gondii de sangre o fluidos corporales, demostración de la presencia del organismo en la placenta o tejidos del feto, demostración de la presencia de antígeno por detección de secuencias de ácido nucleico específicas (por ejemplo, sondas de ADN) o detección de inmunoglobulinas específicas de T. gondii sintetizadas por el hospedador en respuesta a infección usando ensayos serológicos.

La detección de anticuerpos específicos de T. gondii y determinación de la titulación de anticuerpos son herramientas importantes usadas en el diagnóstico de toxoplasmosis. Los ensayos serológicos más ampliamente usados para el diagnóstico de toxoplasmosis son el ensayo de colorante de Sabin-Feldman (Sabin, A. B. y Feldman,

H. A. (1948) Science 108, 660-663), el ensayo de hemaglutinación indirecta (IHA) (Jacobs, L. y Lunde, M. (1957) J. Parasitol. 43, 308-314), el ensayo de IFA (Walton, B. C. et al. (1966) Am. J. Trap. Med. Hyg. 15,149-152), el ensayo de aglutinación (Fondation Merieux, Serologiede I'lnfectionToxoplasmiqueen Particulier a Son Debut: Methodes et Interpretation des Resultants, Lyon, 182 pág. (1975)) y el ELISA (Naot, Y. y Remington, J. S. (1980) J. Infect. Dis. 142, 757-766). El ensayo de ELISA es uno de los ensayos más fáciles de realizar y están disponibles en el mercado muchos ensayos serológicos automáticos para la detección de IgM e IgG específicas de toxoplasma.

Los ensayos actuales para la detección de anticuerpos de IgM e IgG en individuos infectados pueden variar ampliamente en su capacidad para detectar anticuerpos en el suero. Por lo tanto, existe una variación significativa entre ensayos vista entre los kits disponibles en el mercado. Las diferencias observadas entre los diferentes kits comerciales están causadas principalmente por la preparación del antígeno usado para el ensayo serológico. La mayoría de los kits usan taquizoitos completos o sonicados que han crecido en cultivo tisular o en ratones que contienen una alta proporción de material extraparasitario, por ejemplo, células de mamífero, componentes de cultivo tisular, etc. Debido a la falta de un antígeno purificado normalizado o método convencional para preparar el antígeno de taquizoito, no es sorprendente que exista variabilidad entre ensayos que de cómo resultado que diferentes ensayos tengan diferentes características de rendimiento con respecto a sensibilidad y especificidad de ensayo.

Dadas las limitaciones de ensayos serológicos que emplean el antígeno de taquizoito, como se ha descrito anteriormente, así como los problemas persistentes con respecto a determinación de aparición de infección, los antígenos recombinantes purificados obtenidos por biología molecular son una alternativa atractiva porque pueden purificarse y normalizarse. En la bibliografía, se han clonado y expresado varios genes de toxo en un hospedador adecuado para producir antígenos de toxo inmunorreactivos recombinantes. Por ejemplo, se han descrito los antígenos de Toxo P22 (SAG2), P24 (GRA1), P25, P28 (GRA2), P30 (SAG1), P35 (mencionado anteriormente), P41 (GRA4), P54 (ROP2), P66 (ROP1) y el de Toxo P68 (Prince et al. (1990) Mol. Biochem. Parasitol 43, 97-106; Cesbron-Delauw et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 7537-7541; Johnson et al. (1991) Gene 99,127-132; Prince et al. (1989) Mol. Biochem. Parasitol. 34,3-13; Burg et al. (1988) J. Immunol. 141,3584-3591; Knapp et al. (1989) EPA 431541A2; Mevelec et al. (1992) Mol. Biochem. Parasitol. 56, 227-238; Saavedra et al. (1991) J. Immunol. 147, 1975-1982); documento EPA 751 147).

Es plausible que ningún antígeno de Toxo sencillo pueda reemplazar al taquizoito en un inmunoensayo de exploración inicial para la detección de inmunoglobulinas específicas de Toxo. Esto puede deberse a varias razones. En primer lugar, los anticuerpos producidos durante la infección varían con la etapa de la infección, es decir, los anticuerpos producidos por un individuo infectado varían a lo largo del tiempo reaccionando con diferentes epítopos. En segundo lugar, los epítopos presentes en un antígeno recombinante pueden ser diferentes o menos reactivos que el antígeno nativo preparado a partir del taquizoito dependiendo del hospedador usado para expresión y el esquema de purificación empleado. En tercer lugar, pueden necesitarse diferentes antígenos recombinantes para detectar las diferentes clases de inmunoglobulinas producidas en respuesta a una infección, por ejemplo, IgM, IgG, IgA e IgE.

Para superar las limitaciones del antígeno de taquizoito con respecto a especificidad y sensibilidad de ensayo, se comenzó una búsqueda de nuevos antígenos de Toxo que pudieran usarse en combinación con antígenos existentes conocidos para configurar nuevos ensayos para la detección de inmunoglobulinas específicas de Toxo.

Adicionalmente, debería observarse que la presencia de anticuerpos de IgG en una muestra sencilla de suero es suficiente para establecer que el paciente se ha infectado pero no proporciona un indicio de cuando se produjo la infección. En los Estados Unidos, no hay ningún programa de exploración serológica sistemático en mujeres embarazadas, mientras que en países tales como Francia y Austria, se obtienen sueros a intervalos regulares a lo largo de la gestación en mujeres que son seronegativas cuando se ensayan por primera vez. En los Estados Unidos, con frecuencia se toma una decisión con respecto a si la mujer se infectó recientemente, poniendo de este modo su feto en riesgo, a partir de resultados de una muestra sencilla de suero. Sin embargo, es crítico en las mujeres embarazadas determinar de forma tan precisa como sea posible si adquirieron su infección justo antes o durante la gestación. Por esta razón, la presencia de anticuerpos de IgG en una mujer embarazada con frecuencia conduce a ensayos serológicos adicionales para intentar determinar si la infección se adquirió durante el embarazo o en el pasado distante (Remington et al., 1995, Toxoplasmosis, 4ª ed., Coord. Ed., Remington, J. S., W. B. Saunders, Philadelphia, PA). De los ensayos serológicos adicionales recomendados, se usan con más frecuencia los que demuestran la presencia de anticuerpos de IgM. Sin embargo, puesto que los anticuerpos de IgM pueden permanecer detectables durante más de un año de la infección inicial, la demostración de estos anticuerpos no puede usarse para probar una infección recientemente adquirida (Liesebfeld et al., Journal of Clinical Microbiology

35: 174-78 (1997); Wilson et al., Journal of Clinical Microbiology 35: 3112-15 (1997); Wong et al., Clinical Infectious Diseases 18: 853-62 (1994)). Debido a que el diagnóstico preciso de la infección recientemente adquirida en mujeres embarazadas es importante para el tratamiento clínico tanto de la madre como de su feto, se ha continuado una búsqueda de mejores procedimientos de diagnóstico (Remington et al., 1995, Toxoplasmosis, 4ª ed., Coord. Ed., J. S. Remington, W. B. Saunders, Philadelphia, PA; Wong et al., mencionada anteriormente).

En ensayo previos, se observó que se detectaba un antígeno de 35 kDa en manchas de inmunotransferencia de extractos de taquizoitos ensayados con suero de individuos poco después de que se infectaran con T. gondii y se postuló que este antígeno podría tener utilidad para la detección de la etapa aguda de la infección (Potasman et al., Journal of Infectious Diseases 154: 650-57 (1986); Potasman et al., Journal of Clinical Microbiology 25: 1926-31 (1987)). Por lo tanto, un gen en la base de datos de secuencias de GenBank para T. gondii identificado potencialmente como “P35” se seleccionó para clonación, expresión y evaluación de una proteína recombinante correspondiente con respecto a su capacidad para detectar anticuerpos en suero durante la fase temprana de la infección. Este antígeno se describirá en más detalles posteriormente.

Adicionalmente, se determinó que una parte de estos antígenos (es decir, P35) podría utilizarse para diferenciar entre infección aguda y crónica.

Sumario de la invención

La presente invención también incluye un método para distinguir entre toxoplasmosis aguda y crónica en un paciente sospechoso de tener toxoplasmosis aguda o crónica. Este procedimiento comprende las etapas de: a) poner en contacto una muestra de ensayo, del paciente, con una composición que comprende aminoácidos 1-135 de P35; y b) detectar la presencia de anticuerpos de IgG, indicando la presencia de los anticuerpos de IgG toxoplasmosis aguda en el paciente e indicando la falta de los anticuerpos de IgG toxoplasmosis crónica en el paciente.

Todas las patentes de Estados Unidos y publicaciones a las que se hace referencia en este documento se incorporan por la presente en su totalidad por referencia.

Breve descripción de los dibujos

La FIGURA 1 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 23] de los nucleótidos 1-1268 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 24] del plásmido pGM613.

LA FIGURA 2 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 25] de los nucleótidos 1-477 del plásmido pTXG 1-2.

La FIGURA 3 representa la secuencia de ADN compuesta [SEC ID Nº: 26] de los nucleótidos 1-1648 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 27] para el gen P29.

La FIGURA 4 es una representación esquemática de (A) la construcción de plásmido pEE2; (B) la secuencia de nucleótidos [SEC ID Nº: 28] y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 49] del poliligador a retirar de pEE1 por digestión con Bglll; y (C) la secuencia de nucleótidos [SEC ID Nº: 29] y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 50] del ADN sintético a introducir en el sitio Bglll de pEE1 para generar el plásmido pEE2.

La FIGURA 5 es una representación esquemática de (A) la construcción del plásmido pEE3; y (B) la

secuencia de nucleótidos [SEC ID Nº: 32] y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 51]

del poliligador de ADN sintético a introducir en los sitios Stul/Mlul de pEE2 para generar el plásmido pEE3.

La FIGURA 6 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pToxo-P29.

La FIGURA 7 ilustra la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 37] de los nucleótidos 1-4775 y la secuencia de

aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 52] de la proteína de fusión CKS-P29-CKS del plásmido pToxo-

P29.

La FIGURA 8 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pToxo-P30.

La FIGURA 9 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 40] de los nucleótidos 1-4910 y la secuencia de

aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 53] de la proteína de fusión CKS-P30-CKS del plásmido pToxo-

P30.

La FIGURA 10 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pToxo-P35S.

La FIGURA 11 ilustra la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 45] de los nucleótidos 1-4451 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 54] de la proteína de fusión CKS-P35-CKS del plásmido pToxo-P35S. Los primeros 171 aminoácidos representan una parte de CKS, los siguientes 135 aminoácidos representan los aminoácidos 1-135 de P35 y el resto de aminoácidos representan el resto de CKS.

La FIGURA 12 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pToxo-P66g.

La FIGURA 13 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 48] de los nucleótidos 1-5258 y la secuencias

de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 55] de la proteína de fusión CKS-P66-CKS del plásmido

pToxo-P66g.

La FIGURA 14 ilustra la reactividad de anticuerpos de T. gondii con rpToxo-P35S y con preparaciones de CKS. Se tiñeron franjas de la mancha de transferencia de rpToxo-P35S (A) o la mancha de transferencia de CKS (B) con negro de amido (carril 1), anticuerpo monoclonal contra proteína CKS (carril 2), sueros de Grupo I agrupados (carril 3), sueros de Grupo II agrupados (carril 4) o sueros de Grupo III agrupados (carril 5). La posición de rpToxo-P35S (aproximadamente 54 kD) y la proteína CKS (aproximadamente 34 kD) se indican con flechas. Los marcadores de peso molecular se indican en el lateral. Las bandas de reacción cruzada en la preparación de CKS también se indican por flechas.

La FIGURA 15 ilustra lecturas de ELISA en 41 sueros del Grupo I. Las columnas oscuras son lecturas de DO 450 con preparación de rpToxo-P35S y las columnas claras son lecturas con la preparación de CKS.

La FIGURA 16 representa lecturas de ELISA en 50 sueros de Grupo II. Las columnas oscuras son lecturas con preparación de rpToxo-P35S, y las columnas ligeras son lecturas con la preparación de CKS.

La FIGURA 17 ilustra lecturas de ELISA de rpToxo-P35S de 41 sueros de Grupo I después de restar las lecturas de los mismos sueros en el ELISA de control. Las líneas horizontales representan los valores de punto de corte de 0,014 (media + 2 DT) y 0,019 (media + 3 DT) obtenidos como se describe en los Ejemplos.

La FIGURA 18 representa lecturas de ELISA rpToxo-P35S de 50 sueros de Grupo I después de restar las lecturas de los mismos sueros en el ELISA de control. Las líneas horizontales representan los valores de punto de corte como en la FIGURA 17.

Descripción detallada de la invención

Existen dos formatos generales usados habitualmente para controlar la titulación y tipo de anticuerpos específicos en seres humanos: (1) se presenta antígeno en una fase sólida, como se ha descrito anteriormente, se permite que el fluido biológico humano que contiene los anticuerpos específicos reaccionen con el antígeno y después se detecta anticuerpo unido al antígeno con un anticuerpo antihumano acoplado con un compuesto que genera señal y (2) se une un anticuerpo antihumano a la fase sólida, se permite que el fluido biológico humano que contiene anticuerpos específicos reaccione con el anticuerpo unido y después se añade antígeno unido a un compuesto que genera señal para detectar anticuerpo específico presente en la muestra fluida. En ambos formatos, el reactivo de anticuerpo antihumano puede reconocer todas las clases de anticuerpo o, como alternativa, ser específico para una clase o subclase particular de anticuerpo, dependiendo del fin pretendido del ensayo. Se pretende que estos formatos de ensayo así como otros formatos conocidos estén dentro del alcance de la presente invención y se conocen bien por los expertos en la materia.

En particular, dos ejemplos ilustrativos de un inmunoensayo basado en captura de anticuerpo inmunométrico son los ensayos de anticuerpo de IgM de Toxo e IgG de Toxo Imx fabricados por Abbott Laboratories (Abbott Park, IL). Ambos ensayos son Inmunoensayos Enzimáticos de Micropartículas (MEIA) automáticos que miden anticuerpos para Toxoplasma gondii (T. gondii) en suero o plasma humano (Safford et al., J. Clin. Pathol. 44: 238-242 (1991)). Un ensayo mide cuantitativamente anticuerpos de IgM, indicativos de reciente exposición o infección aguda y otro ensayo mide cuantitativamente IgG, indicativo de infección crónica o pasada. Estos ensayos usan micropartículas revestidas con antígenos de T. gondii como la fase sólida. En particular, se añade muestra de ensayo a las micropartículas recubiertas para permitir que se unan anticuerpos específicos para T. gondii. Posteriormente, se añade IgM antihumana (o IgG antihumana) conjugada con fosfatasa alcalina que se une específicamente a anticuerpos de clase IgM (o IgG) en complejo con los antígenos de T. gondii. Después de la adición de un sustrato adecuado (por ejemplo, 4-metiumbeliferil fosfato), se controla la tasa de renovación catalizada por enzima basándose en la fluorescencia.

La presente invención también abarca un método para distinguir entre infección aguda y crónica mediante el uso de una parte del antígeno P35. Puede decirse que un individuo tiene “una infección aguda” si el individuo se ha seroconvertido a IgG de Toxo recientemente, quizás dentro de aproximadamente los últimos 9 meses. Una infección aguda se caracteriza por al menos uno de los siguientes: alta titulación de IgG en el Ensayo de colorante de Sabin Feldman, IgM positiva en un ELISA de IgM de tipo doble sándwich, IgA positiva en un ELISA de IgM de tipo doble sándwich y patrones agudos en un Ensayo de Aglutinación Diferencial (HS/AC). Por el contrario, puede decirse que un individuo tiene “una infección crónica” si el individuo no se ha seroconvertido a IgG de Toxo recientemente. Una infección crónica se caracteriza por al menos uno de los siguientes: baja titulación de IgG en el Ensayo de colorante de Sabin Feldman, presencia o ausencia de anticuerpos de IgM de Toxo (dependiendo del ensayo comercial utilizado) y patrones crónicos en un Ensayo de Aglutinación Diferencial (HS/AC).

Las dificultades y limitaciones de ensayos serológicos convencionales, que detectan anticuerpos de IgM o IgG para

T. gondii usando el antígeno de taquizoito, en la distinción de una toxoplasmosis aguda de una toxoplasmosis crónica, se han descrito, en detalle, anteriormente. Como se ha observado, varios ensayos se emplean con frecuencia (por ejemplo, el ensayo de colorante de Sabin Feldman, ELISA de IgM e IgA y el ensayo de aglutinación diferencial HS/AC) para distinguir entre una infección crónica y aguda. Por lo tanto, ha habido una necesidad de desarrollar un inmunoensayo que pueda distinguir de forma precisa entre una toxoplasmosis aguda y crónica después de un resultado positivo inicial para anticuerpos de T. gondii. La presente invención proporciona un inmunoensayo tal. En particular, la presente invención abarca un inmunoensayo de IgG de P35 de toxorecombinante que comprende una parte de la proteína P35 de Toxo (expresada, por ejemplo, en una célula procariota tal como E. coli), concretamente rPToxo-P35S (véase Figura 11), correspondiente a los aminoácidos 1-135 de P35 (véase Figura 11) (pJ0200-P35S), que detecta anticuerpos de IgG de Toxo presentes en una infección aguda y habitualmente no detecta anticuerpos de IgG de Toxo presentes en una infección crónica. Por lo tanto, es posible, usando el inmunoensayo de IgG de P35 de Toxo determinar si se ha producido o no una toxoplasmosis aguda durante el embarazo. Los resultados de un inmunoensayo tal facilitan de este modo un diagnóstico preciso de la etapa de infección que es importante para el tratamiento clínico tanto de la madre como de su feto.

Los ejemplos y dibujos que se refieren a ensayos distintos de los que usan P35 y se llevan a cabo con el fin de distinguir una infección crónica frente a aguda de T. gondii se proporcionan por referencia.

La presente invención puede ilustrarse mediante el uso de los siguientes ejemplos no limitantes: Ejemplo 1 Metodología General Materiales y Fuentes Enzimas de restricción, ADN ligasa T4, fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIAP), polinucleótido quinasa y el

fragmento de Klenow de ADN Polimerasa I se obtuvieron de New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) o de

Boehringer Mannheim Corp. (Indianapolis, IN). La DNasa I y aprotinina se obtuvieron de Boehringer Mannheim Corp. Los patrones de peso molecular de ADN y proteínas, geles de poliacrilamida de gradiente prefabricados Daiichi se obtuvieron de Separation Systems, Inc. (Natick, MA).

Isopropil-1-D-tiogalactósido (IPTG), Triton X-100, 4-cloro-1-naftol y dodecil sulfato sódico (SDS) se obtuvieron de

BioRad Laboratories (Richmond, CA). El plasma de pacientes con una infección de Toxoplasma aguda se obtuvo de Antibody Systems, Inc., Bedford, Texas.

Los anticuerpos marcados con peroxidasa de rábano rusticano (HRPO) se obtuvieron de Kirkegaard & Perry

Laboratories, Inc. (Gaithersburg, MD). Células E. coli supercompetentes XL-1 BLUE EPICURIAN Coli™ (recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F proAB laclq ZDM15 Tn10 (Tetr)]), un kit de aislamiento de ADN, un kit de aislamiento de ARN, un kit ZAP™- Cdna Gigapack II Gold Cloning, un kit de Inmunoexploración de picoBLUE y membranas de Duralose-UV™ y un kit de síntesis de ADNc ZAP™ se obtuvieron de Stratagene Cloning Systems, Inc. (La Jolla, CA).

Un kit de reactivo GeneAmp y ADN Polimerasa AmpliTaq™ se obtuvieron de Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT). Los desoxinucleótidos trifosfatos usados en los procedimientos generales fueron del kit de reactivos GeneAmp™.

La membrana de nitrocelulosa soportada se obtuvo de Schleicher & Schuell (Keene, NH). Un kit de nucleótidos para secuenciación de ADN con Sequenase™ y 7-deaza-dGTP y ADN Polimerasa Sequenase™ versión 2.0 se obtuvieron de U. S. Biochemical Corp. (Cleveland, OH).

Un kit de marcaje de ADN Multiprime, alfa-32P-dCTP y un a-32P-dATP se obtuvieron de Amersham Corp. (Arlington Heights, Illinois). Un kit de purificación de ARNm PolyA+ se obtuvo de Pharmacia LKB Biotechnology, Inc. (Piscataway, NJ).

Los filtros de cartucho Polygard, tamaño de poro 10 u, se obtuvieron de Millipore Corp., Bedford, MA. Las placas de caldo de cultivo de Luria con ampicilina (placas Lbamp) se obtuvieron de Micro Diagnostics, Inc. (Lombard, IL).

El medio OPTI-MEM™, Medio de Dulbecco Modificado por Iscove, Solución Salina Equilibrada de Hank, suero de ternero fetal, solución salina tamponada con fosfato, E. coli competentes DH5-alfa (F-Ø8OdlacZDM15 D(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 phoA hsdR17(rK-, mK+) supE44 1-thi-1 gyrA96 relA1), y agarosa ultraPURE se obtuvieron de GIBCO BRL, Inc. (Grand Island, NY).

Bacto-Tryptone, Extracto de Bacto-Levadura y Bacto-Agar se obtuvieron de Difco Laboratories (Detroit, Ml). El caldo de cultivo NZY se obtuvo de Becton Dickinson Microbiology Systems (Cockeysville, MD). El ADN de esperma de salmón, lisozima, ampicilina, N-lauroil sarcosina, timerosal, tampones, hidrolisado de ácido

de caseína, TWEEN 20™ (polioxietilensorbitan monolaurato), dietilpirocarbonato (DEPC), fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), albúmina de suero bovino (BSA), urea, glicerol, EDTA, desoxicolato sódico, pirimetamina, sulfametoxazol, kit de isoequipación de anticuerpos monoclonales de ratón y sales inorgánicas se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO).

OPD (O-fenilendiamin dihidrocloruro) y PBS (solución salina tamponada con fosfato) se obtuvieron de Abbott Laboratories (Abbott Park, IL). El Peróxido de Hidrógeno (H2O2) se obtuvo de Mallinkrodt (Paris, KY). El metanol se obtuvo de EM Science (Gibbstown, NJ).

Las placas de Microtitulación Maxisorp se obtuvieron de NUNC, Inc. (Naperville, IL).

Medios, Tampones y Reactivos Generales

“Superbroth II” contenía triptona 11,25 g/l, extracto de levadura 22,5 g/l, fosfato potásico dibásico 11,4 g/l, fosfato potásico monobásico 1,7 g/l, glicerol 10 ml/l, pH ajustado a 7,2 con hidróxido sódico.

“Solución salina tamponada con Tris” o “TBS” consistió en Tris 20 mM, NaCl 500 mM a pH 7,5.

“Solución salina tamponada con Tris TWEEN 20™” o “TBST” consistió en TBS más TWEEN 20 0,05 %.

“Tampón de dilución de muestra de ensayo de Rubazyme” o “SDB” de Rubazyme” consistió en Tris 100 mM a pH 7,5 con NaCl 135 mM, EDTA 10 mM, TWEEN 20™ 0,2 %, timerosal 0,01 % y suero de ternero bovino 4 %.

El “tampón de dilución diluyente conjugado con Rubazyme” consistió en Trisat 100 mM, pH 7,5 con NaCl 135 mM, timerosal 0,01 % y suero de ternero bovino 10 %.

La “solución de bloqueo de membrana” consistió en BSA 1 %, hidrolisado de ácido de caseína 1 %, Tween 20 0,05 % en TBS.

El “tampón de TE” consistió en Tris 10 mM y EDTA 1 mM a pH 8,0.

El “tampón de lisis de TEM” consistió en Tris 50 mM, EDTA 10 mM y cloruro de magnesio 20 mM a pH 8,5.

El “tampón de PTE” consistió en Tris 50 mM y EDTA 10 mM a pH 8,5.

Líneas de Parásito, Células y Ratón

La cepa RH de T. gondii (ATCC 50174) y la línea celular HeLa S3 (ATCC CCL 2.2) se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivo Tipo, Rockville, Maryland. La cepa TS4 de T. gondii también estaba disponible de la Colección Americana de Cultivos Tipo y de otras fuentes. La cepa de ratón Swiss CD1 se obtuvo de Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts. Los parásitos se mantuvieron por pase seriado en la cavidad peritoneal de ratones Swiss. Los taquizoitos se recogieron de la cavidad peritoneal y se usaron para inocular un cultivo de suspensión primaria de células HeLa S3. Este cultivo de suspensión infectado se dejó crecer durante 2-4 días a 37 ºC en medio de Dulbecco Modificado por Iscove y después se usó para inocular un cultivo de suspensión secundario de células HeLa S3 no infectadas. Este cultivo de suspensión infectado secundario se dejó crecer durante 2-4 días a 37 ºC en Medio de Suero Reducido OPTI-MEM y se usó como una fuente de taquizoitos para explorar anticuerpos monoclonales y para la preparación de ADN, ARN y proteína de taquizoitos total.

Métodos Generales

Todas las digestiones enzimáticas de ADN se realizaron de acuerdo con las instrucciones de los proveedores. Se usaron al menos 5 unidades de enzima por microgramo de ADN y se permitió un suficiente tiempo de incubación para digestión completa de ADN. Se siguieron los protocolos del proveedor para los diversos kits usados en la manipulación de ADN y ARN, para síntesis de ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y para secuenciación de ADN. Se usaron procedimientos convencionales para transferencias de Western y Southern, digestión parcial con enzimas de restricción de ADN genómico de Toxoplasma con Sau 3AI, construcción de una biblioteca genómica de Toxoplasma, miniprep y preparación a gran escala de ADN plasmídico de E. coli, preparación de ADN de lisado de fago de células de E. coli infectadas con fago lambda, preparación de lisados de E. coli para la absorción de anticuerpos anti E. coli, extracción con cloroformo-fenol y precipitación con etanol de ADN, análisis de restricción de ADN en geles de agarosa, purificación de fragmentos de ADN de geles de agarosa, llenado de los extremos 3’ terminales cortados creados por digestión con enzimas de restricción usando el fragmento de Klenow de ADN Polimerasa I y ligación de fragmentos de ADN con ADN ligasa T4 (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989)).

Se extrajeron fragmentos de ADN para clonación en plásmidos que se generaron por amplificación de PCR con fenol-cloroformo y se precipitaron con etanol antes de digestión con enzima de restricción de la mezcla de reacción de PCR. Se sintetizaron oligonucleótidos para secuenciación de ADN y PCR en un Sintetizador de Oligonucleótidos Applied Biosystems, modelo 380B o 394, según el protocolo del fabricante.

Se obtuvo anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra la proteína CKS por inmunización de ratones con rpHCV23 purificado (CKS-BCD), descrito en la Solicitud Internacional Nº WO93/04088 por Dailey et al. Las proteínas usadas para inmunización fueron aproximadamente el 90 % puras según se determinó por SDS-PAGE. El procedimiento para la inmunización de ratones, fusión celular, exploración y clonación de anticuerpos monoclonales y caracterización de anticuerpos monoclonales fue como se describe en la Solicitud Internacional Publicada Nº WO92/08138 por Mehta et al.

Ejemplo 2

Aislamiento de ADN, ARN, Proteína de Toxoplasma y Síntesis de ADNc

Se dejó crecer un cultivo en suspensión secundario de 10 l de células HeLa infectadas con la cepa RH de T. gondii a una densidad de taquizoitos de aproximadamente 1 x 107 por ml y se filtró a través de un filtro de cartucho Millipore Polygard de 10 m para retirar células HeLa de los taquizoitos. El filtrado de taquizoitos obtenido contenía menos de 1 % de células HeLa. Los taquizoitos se concentraron después por centrifugación, se lavaron y resuspendieron en tampón de Hank 1X. El concentrado de taquizoitos se pipeteó después en gotas en nitrógeno líquido y los sedimentos de taquizoitos congelados se recuperaron y almacenaron a -80 ºC hasta su uso posterior. Los sedimentos de taquizoitos se convirtieron a polvo de taquizoitos moliendo los sedimentos en un polvo fino usando un mortero enfriado con hielo seco y nitrógeno líquido. Se usó posteriormente un polvo de taquizoitos para el aislamiento de ácido nucleico y proteínas de taquizoitos como se describe posteriormente.

Etapa A: Aislamiento de ADN de Toxoplasma

Se aisló ADN de Toxoplasma total del polvo de taquizoitos usando el kit de extracción de ADN Stratagene. El polvo de taquizoitos se disolvió en Solución 2 y se aisló ADN total siguiendo el protocolo del kit. Después de precipitación con etanol y resuspensión del ADN en tampón TE, se retiró el ADN no disuelto y los polisacáridos contaminantes por centrifugación a 200.000 x g durante 1 hora.

Etapa B: Aislamiento de ARN de Toxoplasma

El ARN de Toxoplasma total se aisló del polvo de taquizoitos usando el kit de aislamiento de ARN de Strategene. El polvo de taquizoitos se disolvió en Solución D y el ARN total se aisló siguiendo el protocolo del kit. Después de precipitación con etanol y resuspensión del ARN en agua tratada con DEPC, se seleccionó ARN polyA+ con una columna oligo-dT usando un kit de aislamiento de ARNm de Pharmacia. El ARNm purificado se concentró por precipitación con etanol y se almacenó en agua tratada con DEPC a -80 ºC hasta su uso posterior.

Etapa C: Aislamiento de Proteína de Toxoplasma Total

Se aisló proteína de Toxoplasma total del polvo de taquizoitos disolviendo el polvo en tampón de carga SDS-PAGE e hirviendo la muestra durante 5 minutos. La preparación de proteína se almacenó a -20 ºC hasta su uso posterior.

Etapa D: Síntesis de ADNc de Toxoplasma

Se usó ARNm de Toxoplasma purificado como un molde para la síntesis de ADNc usando el kit de síntesis de ADNc ZAP de Stratagene. La primer hebra se sintetizó usando Transcriptasa Inversa de Virus de Leucemia Murina de Moloney y un cebador de 50 mer que incluía un sitio de enzima de restricción Xho I y un tramo poli-dT. La mezcla de reacción incluyó el análogo 5-metil CTPd para proteger el ADNc de enzimas de restricción usadas en etapas de clonación posteriores. La segunda hebra se sintetizó usando RNAsa H y ADN polimerasa I. El ADNc se precipitó después con etanol y se resuspendió en agua y se almacenó a -20 ºC hasta su uso posterior como un molde para amplificación por PCR y para construcción de una biblioteca de ADNc de Toxoplasma.

Ejemplo 3

Estrategia de Clonación para Genes que Codifican Antígenos de Toxoplasma

La respuesta inmune que se genera por pacientes humanos con Toxoplasmosis se dirige contra varias proteínas de

T. gondii y varía según el individuo y la etapa de la enfermedad. Por lo tanto, un inmunoensayo de Toxoplasma que se compone completamente de antígenos de proteína purificada requerirá más de una diana serológica proteica para detectar de forma precisa el anticuerpo del suero para T. gondii en una población de individuos infectados con Toxoplasma. Para identificar antígenos de Toxoplasma adicionales que son relevantes para ensayos de diagnóstico humanos, se realizó una estrategia de clonación a dos niveles para genes que codifican antígenos de Toxoplasma. El primer nivel consistió en clonación de genes conocidos que codifican antígenos de Toxoplasma, usando las secuencias de ADN publicadas para estos genes. El segundo nivel consistió en clonación de nuevos genes previamente no descritos que codifican antígenos de Toxoplasma, usando plasma humano agrupado de pacientes con toxoplasmosis para explorar una biblioteca de ADNc de Toxoplasma. Los genes clonados en el primer nivel se usaron después como sondas de ADN para explorar los genes clonados en el segundo nivel con respecto a singularidad.

Etapa A: Clonación de Genes de Toxoplasma que Codifican Antígenos de Toxoplasma Conocidos

El vector de expresión de CKS pJO200 descrito en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 08/742.619 de Maine y Chovan permite la fusión de proteínas recombinantes con la proteína CMP-KDO sintetasa (CKS). La secuencia génica de ADN que codifica la proteína estructural CKS (también conocida como el gen kdsB) está publicado en Goldman et al., J. Biol. Chem. 261: 15831 (1986). La secuencia de aminoácidos de CKS incluye 248 restos aminoacídicos (aa) y se describe en Goldman et al., mencionado anteriormente. El vector pJO200 contenía ADN que codifica la secuencia de los primeros 240 aminoácidos del gen kdsB original seguido de 20 aminoácidos adicionales codificados por la secuencia de ADN de poliligador, para un total de 260 aminoácidos.

Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos para su uso en la amplificación por PCR de genes conocidos que codifican antígenos de Toxoplasma basándose en secuencias de ADN publicadas. Cada par de cebadores de PCR se “siguió” con secuencias de ADN adicionales para incluir sitios de enzima de restricción para clonación posterior en el vector de expresión de CKS Pro200. Se realizó amplificación por PCR de cada gen de Toxoplasma con los cebadores apropiados usando el kit de reactivos GeneAmp y ADN Polimerasa AmpliTaq obtenida de Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, siguiendo el protocolo del kit. Se usaron aproximadamente 20 ng de ADNc de Toxoplasma preparado en el Ejemplo 2D o 20 ng de ADN genómico de Toxoplasma preparado en el Ejemplo 2A (solamente para clon genómico de P66) en cada reacción. Los ciclos de amplificación fueron un ciclo de 95 ºC durante 120 segundos, seguido de 35 ciclos de 95 ºC durante 60 segundos, 55 ºC durante 60 segundos, 72 ºC durante 120 segundos, seguido de un ciclo a 72 ºC durante 300 segundos, seguido de un ciclo de empapado a 4 ºC. Los productos de PCR obtenidos de la reacción de amplificación se digirieron después con las enzimas de restricción apropiadas, se purificaron en geles de agarosa, se ligaron en el vector pJO200 cortado con las enzimas de restricción apropiadas y se transformaron en las células E. coli supercompetentes XL-1 Blue Epicurean Coli siguiendo el protocolo del kit. Los clones correctos se confirmaron por análisis de secuencia de ADN del ADN de Toxoplasma clonado. Las secuencias de ADN de los cebadores oligonucleotídicos usados para la amplificación por PCR de los siguientes genes de Toxoplasma se muestran a continuación y como se clonaron en el vector de CKS pJO200:

Gen P22 (SAG2) de Toxo

(Prince et al. (1990) Mol. Biochem. Parasitol 43, 97-106)

Cebador Sentido [SEC ID Nº:1]:

5'-CGCAGAATTCGATGTCCACCACCGAGACGCCAGCGCCCATTGA-3' (el sitio EcoRI está subrayado)

Cebador Antisentido [SEC ID Nº: 2]:

5'-CCCGGGATCCTTACACAAACGTGATCAACAAACCTGCGAGACC-3' (el sitio BamH-l está subrayado)

Región Clonada: Nucleótidos 260-739 del gen P22 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/BamH-l de pJO200 para producir plásmido pJO200-P22.

Gen P24(GRA1) de Toxo

(Cesbron-Delauw et al. (1989) Proc Nat. Acad. Sci. 86, 7537-7541)

Cebador Sentido [SEC ID Nº: 3]:

5'-GGCCGAATTCGATGGCCGAAGGCGGCGACAACCAGT-3' (el sitio EcoRI está subrayado)

Cebador Antisentido [SEC ID Nº: 4]:

5'-GCCCGGATCCTTACTCTCTCTCTCCTGTTAGGAACCCA-3' (el sitio BamH-l está subrayado)

Región Clonada: Nucleótidos 685-1183 del gen P24 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/BamH-1 de pJO200 para producir plásmido pJO200-P24.

Gen P25 de Toxo

(Johnson et al. (1991) Gene 99, 127-132)

Cebador Sentido [SEC ID Nº: 5]:

5'-GGCGAATTCGATGCAAGAGGAAATCAAAGAAGGGGTGGA-3' (el sitio EcoRI está subrayado)

Cebador antisentido [SEC ID Nº: 6]:

5'-CGCACTCTAGATCACCTCGGAGTCGAGCCCAAC-3' (el sitio Xbal está subrayado) Región Clonada: Nucleótidos 7-288 del gen P25 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/Xbal de pJO200 para producir

plásmido pJO200-P25.

Gen P28 (GRA2) de Toxo

(Prince et al. (1989) Mol. Biochem. Parasitol. 34, 3-13)

Cebador Sentido [SEC ID Nº: 7]:

5'-GGCGAATTCGATGAGCGGTAAACCTCTTGATGAG-3' (el sitio EcoRI está subrayado)

Cebador antisentido [SEC ID Nº: 8]:

5'-CGCTAGGATCCTTACTGCGAAAAGTCTGGGAC-3' (el sitio BamH-l está subrayado) Región Clonada: Nucleótidos 489-924 del gen P28 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/BamH-l de pJO200 para producir plásmido pJO200-P28.

Gen P30 (SAG 1) de Toxo

(Burg et al. (1988) J. Immunol. 141, 3584-3591)

Cebador Sentido [SEC ID Nº: 9]:

5'-GGCGAATTCGATGCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC-3' (el sitio EcoRI está subrayado)

Cebador Antisentido [SEC ID Nº:101]:

5'-CGCTAGGATCCTCACGCGACACAAGCTGCGA-3' (el sitio BamH-l está subrayado)

Región Clonada: Nucleótidos 464-1318 del gen P30 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/BamH-l de pJO200 para

producir el plásmido pJO200-P30. Gen P35 de Toxo (Knapp et al. (1989) EPA 431541A2) Cebador Sentido [SEC ID Nº: 11]: 5'-GACGGCGAATTCGATGAACGGTCCTTTGAGTTATC-3' (el sitio EcoRI está subrayado) Cebador Antisentido [SEC ID Nº: 12]: 5'-CGCTAGGATCCTTAATTCTGCGTCGTTACGGT-3' (el sitio BamH-l está subrayado) Región Clonada: Nucleótidos 91-822 del gen P35 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/BamH-l de pJO200 para

producir el plásmido pJO200-P35. Subclón del Gen P35 de Toxo Nº 1 (1-135aa) (Knapp et al. (1989) EPO 431541A2) Cebador Sentido [SEC ID Nº: 13]: 5'-GACGGCGAATTCGATGAACGGTCCTTTGAGTTATC-3' (el sitio EcoRI está subrayado) Cebador Antisentido [SEC ID Nº:14]: 5'-CGCTAGGATCCTCAATGGTGAACTGCCGGTATCTCC-3' (el sitio BamH-l está subrayado) Región Clonada: Nucleótidos 91-495 del gen P35 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/BamH-l de pJO200 para

producir el plásmido pJO200-P35S. Gen de P41 (GRA4) de Toxo (Mevelec et al. (1992) Mol. Biochem. Parasitol. 56, 227-238)

Cebador Sentido [SEC ID Nº: 15]: 5'-GGCGAATTCGATGGGTGAGTGCAGCTTTGGTTCT-3' (el sitio EcoRI está subrayado) Cebador Antisentido [SEC ID Nº: 16]: 5'-CGCACTCTAGATCACTCTTTGCGCATTCTTTCCA-3' (el sitio Xbal está subrayado) Región Clonada: Nucleótidos 133-1107 del gen de P41 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/Xbal de pJO200 para

producir el plásmido pJO200-P41. Gen de P54 (ROP2) Toxo (Saavedra et al. (1991) J. Immunol. 147, 1975-1982) Cebador Sentido [SEC ID Nº: 17]: 5'-GCCTGAATTCGATGCACGTACAGCAAGGCGCTGGCGTTGT-3' (el sitio EcoRI está subrayado) Cebador Antisentido [SEC ID Nº: 18]: 5'-CGCTAGGATCCTCAGAAGTCTCCATGGCTTGCAATGGGAGGA-3' (Clonado como un extremo romo) Región Clonada: Nucleótidos 85-1620 del gen P54 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/Smal de pJO200 para

producir el plásmido pJO200-P54. Gen P66(ROP1) de Toxo (Knapp et al. (1989) EPA 431541A2) (Ossorio et al. (1992) Mol. Biochem. Parasitol. 50, 1-15) Cebador Sentido [SEC ID Nº: 19]: 5'-GGCGAATTCGATGAGCCACAATGGAGTCCCCGCTTATCCA-3' (el sitio EcoRI está subrayado) Cebador Antisentido [SEC ID Nº: 20]: 5'-CGCTAGGATCCTTATTGCGATCCATCATCCTGCTCTCTTC-3' (el sitio BamH-l está subrayado) Región Clonada: Nucleótidos 122-1330 del gen P66 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/BamH-l de pJO200 para

producir el plásmido pJO200-P66 usando ADNc de Toxoplasma como molde. Nucleótidos 122-1330 del gen P66 de

Toxo clonado en los sitios EcoRI/BamH-l de pJO200 para producir el plásmido pJO200-P66g usando ADN genómico

de Toxoplasma como molde.

Gen P68 de Toxo

(Knapp et al. (1989) EPA 431541A2)

Cebador Sentido [SEC ID Nº: 21]:

5'-ACCCGAATTCGATGACAGCAACCGTAGGATTGAGCCAA-3' (el sitio EcoRI está subrayado)

Cebador Antisentido [SEC ID Nº: 22]:

5'-CGCTGGATCCTCAAGCTGCCTGTTCCGCTAAGAT-3' (el sitio BamH-l está subrayado)

Región Clonada: Nucleótidos 294-1580 del gen P68 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/BamH-l de pJO200 para

producir el plásmido pJO200-P68. Etapa B: Construcción e Inmunoexploración de una Biblioteca de ADNc de Toxoplasma Se construyó una biblioteca de ADNc de Toxoplasma en el vector UNIZAPXR usando el kit de síntesis de ADNc ZAP

y kit de clonación ZAP-Cdna Gigapack II Gold de Stratagene. El ADNc producido en el Ejemplo 2D se procesó

adicionalmente usando los protocolos del kit como se describen brevemente posteriormente. Los extremos de ADNc se hicieron romos con ADN Polimerasa T4 y se ligaron adaptadores del sitio de restricción EcoRI al extremo de ADNc de extremos romos. Los adaptadores de RI ligados al ADNc se cortaron después con polinucleótido quinasa T4. El ADNc se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI y después se ligó a las ramas del vector UNIZAP XR de fago lambda. El ADNc se clona unidireccionalmente en este vector, dando como resultado el extremo 5’ del ADNc localizado cadena abajo del gen lacZ. Si la secuencia codificante del ADNc está en fase con el gen lacZ, se expresará una proteína de fusión lacZ-Toxo. La mezcla de ligación de ADNc de Toxo-UNIZAP XR se empaquetó en fago in vitro y se obtuvo una biblioteca de fagos de ADNc de Toxoplasma primaria con 660.000 miembros. Esta biblioteca se amplificó y se comprobó con respecto a tamaño y frecuencia de los insertos de ADNc clonados convirtiendo una decena de clones de fago aleatorios a clones de fagémido de E. coli (plásmido) usando el protocolo de subclonación in vivo de Stratagene del kit de síntesis de ADNc ZAP. Este procedimiento escinde el inserto de ADNc clonado y el plásmido bluescript del fago dando como resultado un clon de plásmido pBluescript que contiene el ADNc clonado. Se preparó ADN de Miniprep de los clones de fagémido y se analizó con enzimas de restricción en geles de agarosa de ADN. Más del 90 % de los clones de fagémido contenían ADN inserto con un tamaño medio de 0,8 kb. Esta biblioteca se usó para exploración inmunológica con plasma agrupado obtenido de pacientes con Toxoplasmosis como se describe posteriormente.

Se agruparon plasmas obtenidos de individuos en la fase aguda de infección de Toxoplasmosis. Las muestras usadas para este grupo se ensayaron por los inmunoensayos de IgG de Toxo e IgM de Toxo Abbott Imx (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) y sólo se agruparon muestras que contenían anticuerpos de IgM y sin niveles detectables de anticuerpo de IgG. Antes de la inmunoexploración, el plasma agrupado se trató para retirar anticuerpos de reacción cruzada con E. coli. El procedimiento seguido fue una modificación del protocolo descrito en el kit de inmunoexploración picoBLUE de Stratagene. El plasma agrupado se diluyó inicialmente 1:5 en tampón de dilución de muestra de ensayo se Rubazyme y se retiraron los anticuerpos reactivos de forma cruzada con E. coli incubando el plasma del grupo diluido con varios filtros de nitrocelulosa recubiertos con lisado de E. coli como se describe en el protocolo del kit. Después de la absorción de anticuerpos de E. coli, el grupo de plasma se almacenó a 4 ºC hasta su uso posterior.

La biblioteca de ADNc de Toxoplasma se exploró inmunológicamente después de una modificación del protocolo del kit de Inmunoexploración picoBLUE de Stratagene. Brevemente, se sembró fago recombinante absorbido en la cepa XL-1 Blue de E. coli en placas NZY de 150 mm precalentadas a una densidad de 20.000 fagos por placa y se incubó durante 3,5 horas a 42 ºC. Se superpusieron después membranas de UV de Duralose pretratadas con IPTG 10 mM y secadas sobre cada placa y se incubaron durante 4 horas adicionales a 37 ºC. Los filtros se orientaron atravesándolos con una aguja de calibre 18, se retiraron de la placa y se lavaron 3X con tampón TBST a temperatura ambiente 10 minutos por lavado. Los filtros se lavaron después una vez durante 10 minutos con tampón TBS a temperatura ambiente y se bloquearon durante una noche a 4 ºC en una solución de bloqueo de membrana. Al día siguiente los filtros se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con el grupo de plasma de fase aguda (a dilución 1:40 en SDB Rubacyme). Los filtros se lavaron después 2x con TBST durante 10 minutos por lavado y una vez con TBS durante 10 minutos y después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo marcado con peroxidasa de rábano rusticano anti IgM humana (H+L) de cabra. Los filtros se lavaron de nuevo como antes y se desarrollaron durante 10 minutos en solución de revelado de color de HRP. Los filtros se lavaron después exhaustivamente con agua del grifo para detener la reacción de revelado del color y las placas que daban un color azul fuerte se purificaron en placa posteriormente dos veces y se volvieron a ensayar con respecto a inmunorreactividad frente al grupo apropiado de plasma. Se exploraron aproximadamente 130.000 placas con el plasma de fase aguda agrupado con el aislamiento de cuatro clones positivos. Estos clones de fago se convirtieron en clones plasmídicos usando el protocolo de subclonación in vivo de Strategene del Kit de Síntesis de ADNc ZAP y se caracterizaron adicionalmente como se describe posteriormente.

Etapa C: Caracterización de los Clones Inmunopositivos Aislados Con el Grupo de Plasma de Fase Aguda

Los 4 clones inmunopositivos aislados con el grupo de plasma de fase aguda se designaron Pgm610, Pgm611, Pgm612 y Pgm613 y se analizaron con enzimas de restricción en geles de agarosa de ADN. Los clones Pgm610 y Pgm612 contenían un inserto de 1,1 Kb de ADN, el clon Pgm611 contenía un inserto de 0,7 Kb de ADN y el clon Pgm613 contenía un inserto de 1,3 Kb de ADN. Los insertos de ADNc contenidos en estos clones se retiraron del vector pBluescript por digestión con enzima de restricción y se purificaron en geles de agarosa de ADN. Esos 4 insertos de ADNc purificados se marcaron individualmente con alfa-32P-dCTP usando el kit de marcaje de ADN Multiprime y el protocolo de Amersham para hibridación con filtros de colonia y ADN de Toxoplasma genómico. Los filtros para hibridación de colonia se prepararon moliendo clones de E. coli que contenían los genes de toxoplasma clonados descritos en los Ejemplos 3A y 3B en membranas de Duralose UV superpuestas en placas de Lbamp. Estas placas se cultivaron durante una noche a 37 ºC y al día siguiente las colonias de E. coli se lisaron con compuestos alcalinos y se prepararon para hibridación de colonias de ADN como se describe en MÉTODOS GENERALES. Después de hibridación y lavado, la señal de hibridación se visualizó por autorradiografía con el resultado de que los 4 clones inmunopositivos fueron homólogos entre sí y no son homólogos con los otros 10 genes ensayados (véase Ejemplo 3A). Para determinar la homología entre los clones inmunopositivos y entre ADN genómico de Toxoplasma, se realizó el siguiente experimento de transferencia de Southern como se describe enMÉTODOS GENERALES. El ADN genómico de Toxoplasma y dos de los clones inmunopositivos se digirieron con enzimas de restricción, se aplicaron a geles de agarosa de ADN, se transfirieron a nitrocelulosa y se exploraron con insertos de ADNc marcados radiactivamente purificados de los clones Pgm611 y Pgm613. Después de hibridación y lavado, la señal de hibridación se visualizó por autorradiografía con el resultado de que ambos clones fueron homólogos entre sí y todos se hibridaron con la mancha de transferencia genómica de ADN de Toxoplasma.

Por lo tanto, estos 4 clones inmunopositivos contenían el mismo gen de Toxoplasma que codifica un antígeno nuevo que se designó Pnuevo2.

Ejemplo 4

Construcción de Vector de Expresión de CKS-Pnuevo2 Basándose en pJO200

El gen que codifica el antígeno Pnuevo2 se subclonó en el vector pJO200 para producir niveles adecuados de proteína de fusión para análisis adicional. Puesto que la fase de lectura del gen lacZ en el vector pBluescript y en la fase de lectura del gen de CKS en el vector pJO200 son la misma, la presencia del sitio de EcoRI en el punto de unión de los genes de CKS y Toxoplasma aseguró que el gen de Toxoplasma se fusionara traduccionalmente en fase con el gen de CKS. Para retirar el inserto de ADNc del vector pBluescript y subclonarlo en el vector pJO200, se realizaron las siguientes digestiones:

El vector de expresión de CKS pJO200 descrito en el Ejemplo 3A se digirió con EcoRI y Smal y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa en preparación para subclonación. El ADN plasmídico del clon de Pnuevo2 mayor Pgm613 se digirió con Asp718 y después se trató con el fragmento de Klenow de ADN Polimerasa I para hacer los extremos romos. Posteriormente, el ADN se extrajo y se digirió después con EcoRI y el fragmento de ADN de EcoRI/Asp718 (Klenow) de 1,3 Kb de Pgm613 se purificó en un gel de agarosa y se ligó a pJO200/EcoRI/Smal durante una noche a 16 ºC.

Al día siguiente, la mezcla de ligación se transformó en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de Miniprep a partir de los transformantes y se exploró con respecto a la presencia del fragmento de ADN de 1,3 Kb insertado en los sitios EcorRI/SmaI de pJO200. El clon de CKS-Pnuevo2 correcto identificado por análisis de restricción se designó pJO200-Pnuevo2.

Ejemplo 5

Expresión de Antígenos de Toxo Recombinantes y CKS en E. coli

Etapa A: Expresión de genes clonados en E. coli

Los clones bacterianos pJO200-P22, pJO200-P24, pJO200-P25, pJO200-P28, pJO200-P30, pJO200-P35S, pJO200-P41, pJO200-66g, pJO200-68 y pJO200-Pnuevo2 que expresaban las proteínas de fusión de CKS rpJO200-P22, rpJO200-P24, rpJO200-P25, rpJO200-P28, rpJO200-P30, rpJO200-P35S, rpJO200-P41, rpJO200-66g, Rpj0200-68 y rpJO200-Pnuevo2 de los Ejemplos 3 y 4 y la cepa bacteriana de control que expresaba CKS no fusionado se cultivaron en medio “SUPERBROTH II” que contenía ampicilina 100 !g/ml hasta fase logarítmica y la síntesis de la proteína de fusión CKS-Toxo y CKS no fusionado se indujo por la adición de IPTG como se ha descrito previamente (Robinson et al. (1993) J. Clin. Micro. 31, 629-635). Después de 4 horas después de la inducción, las células se recogieron y los sedimentos celulares se almacenaron a -80 ºC hasta que se produjo la purificación.

Etapa B: Purificación de Antígenos de Toxo Recombinantes y Proteína CKS

Los antígenos recombinantes insolubles rpJO200-P22, rpJO200-P25, rpJO200-P30, rpJO200-P35S, rpJO200-P41, rpJO200-66g y rpJO200-Pnuevo2 se purificaron después de lisis de pasta celular por una combinación de lavados con detergente seguido de solubilización en urea 8 M (Robinson et al. (1993) J. Clin. Micro. 31, 629-635). Después de completarse la solubilización, estas proteínas se filtraron a través de un filtro de 0,2 u y se purificaron adicionalmente por cromatografía en columnas de Sephacryl S-300. Se agruparon las fracciones de columna apropiadas para cada proteína y se almacenaron a 2-8 ºC para evaluación por ELISA de microtitulación. Las proteínas solubles rpJO200-P24, rpJO200-P28, rpJO200-P68, y CKS no fusionadas se purificaron después de lisis celular por precipitación con sulfato de amonio seguido de cromatografía de intercambio iónico. Las fracciones de columna apropiadas se agruparon para cada proteína, se dializaron frente al tampón apropiado y se almacenaron a 2-8 ºC para evaluación por ELISA de microtitulación.

Ejemplo 6

Evaluación de Sueros Humanos con los Antígenos de Toxo Recombinantes en ELISA de Microtitulación

Etapa A: Sueros Humanos para Ensayos

Los ensayos usados para determinar la presencia de anticuerpo de IgG e IgM en los sueros fueron los ensayos Abbott Toxo-G y Toxo-M MEIA, respectivamente. Se evaluaron veinticuatro sueros positivos para IgG de Toxo, dieciocho sueros positivos para IgM de Toxo y diecinueve sueros negativos para anticuerpo de IgG e IgM de Toxo usando los antígenos de Toxo recombinantes en ELISA de Microtitulación.

Etapa B: Evaluación de Sueros Humanos en el ELISA de Microtitulación de Antígenos de Toxo Recombinantes

5 Se diluyeron individualmente antígenos de Toxo recombinantes purificados (Ejemplo 5B) a 5,0 !g por ml en PBS y se añadieron 0,1 ml de cada antígeno a pocillos separados de placas Maxisorp de microtitulación. Los pocillos de control para cada suero se recubrieron con lisado de E. coli a 5,0 !g por ml. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 1 hora y se almacenaron durante una noche a 4 ºC. Al día siguiente, las placas se lavaron tres veces con agua

10 destilada y se bloquearon durante 2 horas a 37 ºC con 0,2 ml de solución de bloqueo (gelatina de pescado 3 %, suero de ternero fetal 10 % en PBS, 0,22 u). Las placas se lavaron después tres veces con agua destilada y se prepararon para incubación con suero. Cada muestra de ensayo de suero se ensayó por duplicado con cada antígeno a una dilución 1:200 en Rubazyme SDB que contenía lisado de E. coli 2 %. Después de añadir 0,1 ml de muestra de ensayo diluida a cada pocillo, las placas se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Las placas se lavaron

15 después tres veces con PBS-Tween y tres veces con agua destilada. Se detectaron IgG e IgM humanas unidas usando conjugados de IgG-HRPO e IgM-HRPO antihumanos de cabra, respectivamente, se diluyeron 1:1000 en tampón diluyente conjugado con Rubazyme y se filtraron. Después de adición de 0,1 ml del conjugado diluido apropiado, las placas se incubaron durante 1 hora a 37 ºC y se lavaron tres veces con PBS-Tween y tres veces con agua destilada. El reactivo de revelado de color de OPD se preparó según las instrucciones del fabricante y se

20 añadieron 0,1 ml a cada pocillo. Después de 2 minutos, la reacción de revelado del color se detuvo añadiendo 0,1 ml de ácido sulfúrico 1 N y la placa se leyó en un lector de placa de microtitulación. La DO neta se obtuvo restando la DO para el control de lisado de E. coli de la del ensayo con cada antígeno recombinante. El punto de corte para estos ensayos estuvo entre 2 y 3 desviaciones típicas de la media de la población negativa para cada antígeno.

25 Los resultados de la evaluación de sueros humanos en el ELISA de microtitulación recombinante se muestran en la Tabla 1 para detección de anticuerpo de IgG específico de Toxoplasma y la Tabla 2 para detección de anticuerpo de IgM específico de Toxoplasma. El rendimiento de cada antígeno se clasificó en orden decreciente del antígeno con el mayor número de resultados de muestras de ensayo positivas por número total de muestras de ensayo positivas (IgM o IgG) ensayadas.

30 Tabla 1 Clasificación Relativa de Rendimiento de Antígenos en ELISA de IgG de Microtitulación

Antígeno Inmunorreactividad

IgG- IgG+

Nº de Resultados Positivos/Nº Total Nº de Resultados Positivos/Nº Total

de Muestras de Ensayo de IgG-de Muestras de Ensayo de IgG+

Ensayadas Ensayadas

P68 1/19 16/24

P35S 1/19 14/24

P24 0/19 14/24

P30 2/18 13/24

Pnuevo2(P29) 1/19 13/24

P22 0/19 13/24

P30 2/18 13/24

P41 0/19 10/24

P25 1/19 10/24

P28 1/19 10/24

P66 2/19 9/24

Tabla 2 Clasificación Relativa de Rendimiento de Antígenos en ELISA de IgM de Microtitulación

Antígeno Inmunorreactividad

IgM- IgM+

Nº de Resultados Positivos/Nº Total Nº de Resultados Positivos/Nº Total

de Muestras de Ensayo de IgM-de Muestras de Ensayo de IgM+

Ensayadas Ensayadas

P66 1/18 17/18

P35(1-135) 0/18 15/18

Pnuevo2(P29) 0/19 10/18

P68 0/19 5/18

P22 0/19 5/18

P28 1/18 4/18

P41 0/18 3/18

P25 0/19 3/18

P30 1/18 2/18

P24 1/19 0/18

Como puede verse a partir de la Tabla 1, no hubo ningún antígeno de Toxo recombinante capaz de detectar como positivas las 24 muestras de ensayo positivas para IgG. Por lo tanto, se requiere un inmunoensayo que emplee una 5 combinación de los antígenos enumerados en la Tabla 1 para detectar todas las muestras de ensayo positivas para IgG.

Como puede verse a partir de la Tabla 2, no hubo ningún antígeno de Toxo recombinante capaz de detectar como positivas las 18 muestras de ensayo positivas para IgM. Por lo tanto, se requiere un inmunoensayo que emplee una 10 combinación de los antígenos enumerados en la Tabla 2 para detectar todas las muestras de ensayo positivas para IgM.

Ejemplo 7

15 Generación de un Anticuerpo Monoclonal Sensible a Antígeno CKS-Pnuevo2

Etapa A: Estudio de Respuesta Inmune en Ratones y Generación de Hibridomas

Los animales, incluyendo ratones, ratas, hámsteres, conejos, cabras y ovejas pueden infectarse con una dosis letal

20 de taquizoitos, rescatarse de la muerte con terapia farmacológica y usarse después para desarrollo de hibridomas. Existen dos ventajas del desarrollo de hibridomas para usar este proceso que de otro modo no sería posible. La primera ventaja es que se proporciona tiempo para que se genere un repertorio diverso de anticuerpos frente a T. gondii nativo (o Borrelia burgdorferi, Schistosoma sp., por ejemplo, Schistosoma treponema, o esporozoos distintos de T. gondii, por ejemplo, miembros del género Plasmodium (por ejemplo, P. vivax y P. falciparum) y otros miembros

25 posibles del género Toxoplasma) y la segunda ventaja es que el rescate proporciona tiempo para maduración de afinidad de la respuesta inmune.

En el presente experimento, se infectó a ratones Swiss por vía intraperitoneal con 2,5 x 107 taquizoitos de la cepa de

T. gondii TS4. Cinco días después se trató a los ratones por vía oral con 10 mg de pirimetamina y 200 mg de

30 sulfametoxazol por kg diariamente durante 10 días (Esta técnica puede repetirse cada 6-8 semanas si se desea. Después de 12 semanas adicionales, se inyectó a estos ratones por vía intravenosa 1,2 x 107 taquizoitos sonicados 3 días antes de la fusión para minimizar el estado de peligro biológico. El cien por cien de los ratones sobrevivieron (lo que proporciona pruebas de un método humanitario). Los híbridos resultantes de la fusión mediada por PEG de esplenocitos y el mieloma SP2/0 se exploraron en los taquizoitos sonicados y antígeno CKS-Pnuevo2 (Kohler, G. y

35 Milstein, C. (1975) Nature 256, 495-497; Kohler, G. y Milstein, C. (1976) Eur. J. Immunol. 6, 511 -519; Goding, J. (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. 2ª Ed. Academic Press London).

Debería observarse también que pueden producirse anticuerpos monoclonales inmunizando ratones por infección intraperitoneal con T. gondii (Mineo et al. (1993) J. Immunol. 150, 3951-3964; Handman et al. (1980) J. Immunol.

40 124, 2578-2583; Grimwood y Smith (1992) Exp. Parasitol. 74, 106-111) o con fracciones de T. gondii (Prince et al. (1990) Mol. Biochem. Parasitol. 43, 97-106). La fusión de células de bazo y células de mieloma pueden después llevarse a cabo directamente, después de la inmunización, sin una etapa de terapia farmacológica (véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, mencionado anteriormente (1975)).

Etapa B: Exploración y Aislamiento de un Anticuerpo Monoclonal para rpCKS - Pnuevo2

Se cultivó clon bacteriano pJO200-Pnuevo2 que expresaba la proteína de fusión CKS-Pnuevo2 del Ejemplo 4 (rpJO200-Pnuevo2) y la cepa bacteriana de control que expresaba CKS fusionada en medio Superbroth II que contenía ampicilina 100 !g/ml hasta la fase logarítmica y se indujo la síntesis de la proteína de fusión CKS-Toxo y CKS no fusionada mediante la adición de IPTG como se ha descrito previamente en el Ejemplo 5A. En la preparación para explorar fluidos de hibridoma obtenidos en el Ejemplo 7A, los sedimentos celulares se descongelaron, se resuspendieron en 10 ml de PBS y se sonicaron durante 0,5 minutos en un baño de agua helada. La preparación de antígenos se diluyó 1:40 en bicarbonato-carbonato sódico 0,05 M, pH 9,6, que contenía azida sódica 15 mM después de lo cual se colocaron 0,1 ml de esta suspensión en pocillos de placas de microtitulación NUNC Maxisorb. Cuando se ensayaron taquizoitos, se añadieron 3 x 106 taquizoitos sonicados a los pocillos. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 1 hora, se almacenaron de 1 a 3 días a 4 ºC y se lavaron tres veces con agua destilada. Los fluidos de hibridoma obtenidos en el Ejemplo 7A se diluyeron 1:10 en Rubazyme SDB. El resto del ELISA se realizó como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 6B excepto que se detectó anticuerpo unido por mezcla de IgG e IgM anti ratón de cabra conjugadas con peroxidasa de rábano rusticano, cada una diluida a 1,0 !g por ml en tampón diluyente conjugado con Rubazyme.

Los clones de hibridoma positivos se clonaron por dilución limitante y se volvió a ensayar el fluido de hibridoma por ELISA de microtitulación que contenía rpJO200-Pnuevo2, CKS no fusionada y taquizoitos sonicados. Se aisló un clon nativo monoclonal altamente reactivo que se designó Toxo Mab 5-241-178, que reaccionó muy fuertemente con taquizoitos sonicados y rpJO200-Pnuevo2 pero no mostró reactividad con CKS no fusionada. Se descubrió que este clon de hibridoma producía anticuerpos de tipo IgG como se determinó usando un kit de isotipación de anticuerpo monoclonal de ratón de Sigma.

Etapa C: Identificación del gen de Pnuevo2 que Codifica el Antígeno P29 de Toxoplasma Usando Toxo Mab 5-241-178

Se cargó proteína de Toxoplasma total preparada como se ha descrito en el Ejemplo 2C en un gel de SDS-PAGE Daiichi de gradiente 4-20 % con marcadores de peso molecular de patrón proteico y se transfirió a nitrocelulosa como se describe en los Métodos Generales. La transferencia de Western se exploró con el anticuerpo Toxo Mab 5241-178 y la mancha de transferencia se visualizó con un conjugado de IgG-HRPO anti ratón de cabra seguido de Reactivo de Revelado del Color BioRad (4-cloro-1-naftol y peróxido de hidrógeno) según las instrucciones del fabricante. Una banda proteica sencilla de peso molecular 29.000 de la proteína de Toxoplasma preparada a partir de los taquizoitos fue inmunorreactiva con el Toxo Mab 5-241-178 lo que indica que el gen Pnuevo2 clonado en el plásmido Pgm613 (Ejemplo 3C) y pJO200-Pnuevo2 (Ejemplo 4) codifica el antígeno P29 de Toxoplasma.

Ejemplo 8

Secuencia de ADN de Clon Pgm613 y Secuencia de Aminoácidos Deducida

El inserto EcoRI/Xhol de 1,3 Kb de ADNc de Toxoplasma contenido en Pgm613 se secuenció como se ha descrito en los Métodos Generales. La secuencia de ADN (1268 pb) [SEC ID Nº: 23] y la secuencia de aminoácidos deducida (228 aa) [SEC ID Nº: 24] en fase con el gen lacZ se muestran en la FIGURA 1. La fase abierta de lectura (posiciones de nucleótidos 2 a 685) presente en esta secuencia puede codificar una proteína de aproximadamente 25.000 de peso molecular. El primer ATG presente en la secuencia de ADN se localiza en la posición de nucleótido 80 y no está rodeada por secuencias que cumplen los criterios para el inicio de la traducción (Kozak, M. (1986) Cell 44, 283292) y probablemente no es el resto de metionina iniciador. Por lo tanto, es probable que el inserto de ADNc de Toxoplasma presente en el clon Pgm613 no sea de longitud completa.

Se buscó en las bases de datos de secuencias de proteína no redundantes, de ADN y dbEST/dbSTS (marcadores) y las bases de datos de patentes de proteínas y ADN Derwent homología con la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos deducida del clon Pgm613. Se descubrió homología de la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos deducida entre una parte del clon Pgm613 (posiciones de nucleótidos 461 -684, restos de aminoácidos 153-228) y el clon F29 de Knapp et al. contenido en la Solicitud de Patente Europea 0431541A2. Además, se descubrió también homología entre la secuencia de ADN de Pgm613 y varios marcadores de secuencia expresados en T. gondii de función desconocida aislados por Wan, K.-L. et al. (1996) Molec. And Biochem. Parasitol. 75, 179

186.

Ejemplo 9

Aislamiento y Caracterización de un Clon Genómico que contiene el Gen P29 y Generación de una Secuencia de ADN Compuesta

Puesto que el inserto de ADNc de Pgm613 que codifica el antígeno P29 de Toxoplasma parecía ser menor de longitud completa, se usó una parte de la secuencia de ADNc de Pgm613 como una sonda para aislar un clon genómico del antígeno P29 con el fin de clonar el extremo 5’ restante del gen.

Etapa A: Construcción de una Genoteca de ADN Genómico de Toxoplasma en pJO200

Se construyó una genoteca de ADN genómico de Toxoplasma en el vector pJO200 como sigue. Se trató ADN

5 genómico de Toxoplasma preparado en el Ejemplo 2A por una digestión parcial con la enzima de restricción Sau 3AI como se ha descrito en Métodos Generales. El ADN genómico digerido parcialmente se sometió posteriormente a electroforesis en un gel de agarosa 0,7 % con patrones de peso molecular y el intervalo de peso molecular de 6-15 kb del ADN se aisló, purificó y extrajo como se describe en Métodos Generales. En la preparación para ligación con el ADN genómico, se digirió plásmido pJO200 con BamH-l seguido de desfosforilación con la enzima CIAP. La

10 cadena principal de vector resultante se extrajo y después se ligó durante una noche a 16 ºC con el ADN digerido con Sau 3AI. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes y los transformantes resultantes se agruparon dando como resultado una genoteca genómica de Toxoplasma primaria que contiene 80.000 miembros.

15 Etapa B: Exploración de Genoteca Genómica de Toxoplasma Con Sonda Génica de P29 5’

Para aislar el extremo 5’ del gen P29 de la biblioteca genómica, se seleccionó una parte del extremo 5’ del clon de ADNc presente en Pgm613 como una sonda. Esta parte del ADNc se usó después para explorar la genoteca genómica de Toxoplasma preparada en el Ejemplo 9A con respecto a clones genómicos homólogos con el extremo

20 5’ del ADNc.

Se digirió el plásmido Pgm613 con Sacll e HindIII y se purificó en gel el fragmento Sacll/Hindlll de 326 pb que contenía el extremo 5’ del inserto de ADNc en Pgm613 (posiciones de nucleótidos 55-380, véase Figura 1). Este fragmento génico se marcó radiactivamente y se usó para explorar la genoteca genómica de Toxoplasma por

25 hibridación de colonias como se describe en Métodos Generales. Los clones positivos obtenidos por hibridación se purificaron de colonias y se volvieron a ensayar. Un clon positivo designado Ptxg1-2 que contenía un inserto de 6,5 kb de ADN se caracterizó adicionalmente como se describe posteriormente.

Etapa C: Secuencia de ADN del Clon Genómico Ptxg1-2 y Secuencia de ADN Compuesta para el Gen P29 y la 30 Secuencia de Aminoácidos Deducida

El extremo 5’ del gen P29 contenido en el clon Ptxg1-2 se secuenció como se ha descrito en Métodos Generales usando cebadores de ADN complementarios al extremo 5’ del ADNc contenido en el clon Pgm613. La secuencia de ADN obtenida para el clon Ptxg1-2 [SEC ID Nº: 25] se muestra en la FIGURA 2. Se realizó después un alineamiento

35 de las secuencias de ADN para el clon genómico Ptxg-1 y el clon de ADNc Pgm613 dando como resultado la secuencia de ADN compuesta [SEC ID Nº: 26] y la secuencia de aminoácidos deducida [SEC ID Nº:27] para el gen P29 como se muestra en la FIGURA 3. La secuencia de ADN compuesta se deriva de la secuencia genómica del clon Ptxg-1 (Figura 2, [SEC ID Nº: 25]) y la secuencia de ADNc de Pgm613 (Figura 1, [SEC ID Nº: 23]) como se muestra a continuación en la Tabla 3.

40 Tabla 3

Fuente de Secuencia para la Secuencia de ADN Compuesta para el Gen P29

Posiciones de Nucleótidos de la Posiciones de Nucleótidos de la Posiciones de Nucleótidos de la

Secuencia Compuesta Secuencia Genómica Secuencia de ADNc

1-419 1-419 Ninguna

420-477 420-477 40-97

478-1648 Ninguna 98-1268 El único buen candidato para el resto de metionina iniciador para el comienzo de la traducción del gen P29 es la primera metionina mostrada en la FIGURA 3 comenzando en la posición de nucleótidos 358. Esta es la única metionina en fase con la fase de lectura presente en el clon de ADNc Pgm613. Si se examina la misma fase de

45 lectura más cadena arriba de la metionina en la posición 358, no se hallan más restos de metionina antes de un codón de parada UAA en fase presente en la posición 325. La metionina en la posición de nucleótidos 358 está rodeada de secuencias que cumplen los criterios para inicio de la traducción (Kozak, M. (1986) Cell 44, 283-292) y se sigue de restos aminoacídicos que constituyen un péptido señal (von Heijne, G. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 4683-4690).

50 Ejemplo 10

Construcción de un Vector pEE3 que Incluye Epítopo de CKS Mejorado

55 El vector de expresión que incluye epítopo de CKS pEEI descrito en Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 08/742,619 de Maine y Chovan permite la fusión incluida de proteínas recombinantes con la proteína CMP-KDO sintetasa (CKS). Para facilitar la clonación del gen P29 en el vector que incluye epítopo de CKS, se modificó el vector pEEI en dos etapas. En primer lugar, se retiró un poliligador obsoleto cerca del extremo 3’ del gen de CKS en el vector pEEI generando un vector intermedio pEE2. En segundo lugar, se introdujo un nuevo poliligador en la región codificante de CKS, permitiendo de este modo la inclusión de genes que usan una diversidad de sitios de restricción (Stul, EcoRI, Sacl, BamH-l, Pstl, Mlul) en el gen de CKS.

5 Etapa A: Construcción de pEE2

El plásmido pEE2, un derivado del vector de expresión de CKS pEEI (Figura 4A), se construyó digiriendo pEEI con la enzima de restricción Bgl II y retirando un poliligador localizado en el extremo 3’ del gen de CKS que tenía la

10 secuencia (5’-3’) [SEC ID Nº: 28] (FIGURA 4B) y la secuencia de aminoácidos deducida [SEC ID Nº: 49]

y reemplazándolo con la siguiente secuencia (5’-3’) [SEC ID Nº: 29] (véase Figura 4C) y la secuencia de 15 aminoácidos deducida [SEC ID Nº: 50]

Como se muestra en las Figuras 4B y 4C, este reemplazo de secuencia retira los sitios de restricción Sall, EcoRI, 20 Sacl, Kpnl, Smal, BamH-l, Xbal, Pstl, y Sphl, permitiendo de este modo el uso de estos sitios en un nuevo poliligador a incluir posteriormente dentro del gen de CKS más cadena arriba (Ejemplo 10B).

El plásmido pEEl se digirió con Bgl II y después se trató con la enzima CIAP para retirar los grupos fosfato cinco prima para evitar la autoligación. La cadena principal del vector desfosforilado pEEI/Bgl II se purificó después en gel 25 de agarosa. Se sintetizaron dos oligonucleótidos mostrados a continuación (5’-3’) para ligación en la cadena principal de pEEI/Bgl II.

30 Estos oligonucleótidos se mezclaron juntos, se calentaron a 85 ºC y después se permitió que se enfriaran gradualmente durante una noche a 4 ºC para permitir la hibridación de los oligonucleótidos. Los oligonucleótidos hibridados se digirieron después con la enzima Bgl II, se extrajeron y después se ligaron con la cadena principal de pEEI/Bgl Il durante una noche a 16 ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de Miniprep a partir de los transformantes y se exploró con respecto a la presencia

35 de la nueva secuencia por análisis de enzimas de restricción. Los clones potencialmente correctos se secuenciaron después para verificar la secuencia correcta en la orientación apropiada. Se aisló plásmido pEE2 que contiene la nueva secuencia [SEC ID Nº: 29] en el sitio Bgl II.

Etapa B: Construcción de pEE3

El plásmido pEE3, un derivado del vector de expresión de CKS pEE2 (Figura 5A), se construyó por digestión de pEE2 con Stul y Mlul y clonación en un nuevo poliligador con la siguiente secuencia (5’-3’) [SEC ID Nº: 32] (véase Figura 5B) y secuencia de aminoácidos deducida [SEC ID Nº: 51]

que contiene los sitios de restricción Stul, EcoRI, Sacl, BamH-l, Pstl, y lul.

El plásmido pEE2 se digirió con Stul y Mlul y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron dos oligonucleótidos mostrados a continuación (5’-3’) para ligación en la cadena principal de pEE2/StuI/Mlul.

[SEC ID Nº: 33] CCTGAATTCGAGCTCTGGGATCCGTCTGCAGA

[SEC ID Nº: 34] CGCGTCTGCAGACGGATCCCAGAGCTCGAATTCAGG

Estos oligonucleótidos se mezclaron juntos, se calentaron a 80 ºC durante 10 minutos y después se permitió que se enfriaran gradualmente durante una noche a 4 ºC para permitir la hibridación de los oligonucleótidos. Los oligonucleótidos hibridados se ligaron después con la cadena principal de pEE2/Stul/Mlul durante una noche a 16 ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de Miniprep a partir de los transformantes y se exploró con respecto a la presencia de la nueva secuencia por análisis de enzimas de restricción. Los clones potencialmente correctos se secuenciaron después para verificar la secuencia correcta. Se aisló plásmido pEE3 que contiene la nueva secuencia [SEC ID Nº: 32] en los sitios Stul/Mlul.

Ejemplo 11

Construcción de Vectores de Expresión que Incluyen Epítopo de CKS-Ag de Toxo-CKS

Los vectores de expresión de CKS pJO200, pEEI y pEE3 se utilizaron para la construcción de cuatro construcciones de fusión de gen de CKS-Ag de Toxo-CKS usando los genes P29, P30, P35, y P66 de Toxo.

Etapa A: Construcción de pToxo-P29: CKS-P29 (1-236aa)-CKS

El plásmido pToxo-P29, un derivado del plásmido pEE3 (Figura 6), se construyó clonando un fragmento de ADN que contenía P29 de Toxo, obtenido por amplificación por PCR de ADN de P29 de Toxo contenido en el plásmido Ptxg12 (Ejemplo 9C), en los sitios EcoRI/BamH-I de pEE3. El plásmido pToxo-P29 se depositó en la ATCC según los términos del Tratado de Budapest el 19 de mayo de 1998 y se le concedió el Nº de Acceso ATCC 98758.

Se aislaron ADN plasmídicos a gran escala (Ptxg1-2 y pEE3) por métodos generales. El plásmido pEE3 se digirió con EcoRI y BamH-l y la cadena principal de vector pEE3/EcoRI/BamH-l, se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido, que comienza en el nucleótido 358 del gen P29 (Figura 3) que contenía un sitio EcoRI y un cebador antisentido que contenía un sitio BamH-l, que comienza en el nucleótido 1065 del gen P29, como se muestra a continuación:

Cebador Sentido [SEC ID Nº: 35]

5’-ACTTAGAATTCGATGGCCCGACACGCAATTTTTTCC-3’ (el sitio EcoRI está subrayado)

Cebador Antisentido [SEC ID Nº:36]

5’-ACATGGATCCGCTGGCGGGCATCCTCCCCATCTTC-3’ (el sitio BamH-l está subrayado)

Los cebadores sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido Ptxg1-2. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y BamH-l y el fragmento de ADN de 708 pares de bases que contenía P29 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de ADN de 708 pares de bases purificado se ligó con pEE3/EcoRI/BamH-l durante una noche a 16 ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de Miniprep de los transformantes y se exploró con respecto a la presencia de la secuencia de ADN de P29 por análisis de enzima de restricción. El plásmido pToxo-P29 contenía el gen P29 incluido en los sitios EcoRI/BamH-l de pEE3. Esta construcción de fusión CKS-ToxoP29-CKS se designó:

“CKS(1 -171 aa)-N-S-ToxoP29(1 -236aa)-R-l-R-L-Q-T-R-CKS(17 1 -260aa)” en la que N, S, R, I, R, L, Q, T, R son los restos de asparagina, serina, arginina, isoleucina, arginina, leucina, glutamina, treonina y arginina, respectivamente, codificados por la secuencia de ADN del poliligador del vector. La secuencia completa de ADN [SEC ID Nº: 37] del plásmido pToxo-P29 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 52] de la proteína de fusión CKS-P29-CKS se muestran en la Figura 7.

Etapa B: Construcción de pToxo-P30:CKS-P30(1-236aa)-CKS

El plásmido pToxo-P30, un derivado del plásmido pEEI (Figura 8), se construyó clonando un fragmento de ADN que contenía P30 de Toxo, obtenido por amplificación de PCR de ADN de P30 de Toxo contenido en el plásmido pJO200-P30 (Ejemplo 3A), en los sitios Stul/Mlul de pEEI. El plásmido pToxo-P30 se depositó en la ATCC según los términos del Tratado de Budapest el 19 de mayo de 1998 y se le concedió el Nº de Acceso ATCC 98761.

Se aislaron ADN plasmídicos a gran escala (pJO200-P30 y pEEl) por métodos generales. El plásmido pEEI se digirió con Stul y Mlul y la cadena principal del vector, pEEl/Stul/Mlul, se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido, que comienza en el nucleótido 464 del gen P30 que contenía un sitio StuI y un cebador antisentido que contenía un sitio Mlul, que comienza en el nucleótido 1318 del gen P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141, 3584-3591) como se muestra a continuación:

Cebador Sentido [SEC ID Nº: 38] 5’-TCCTAGGCCTTAATTCGATGCTTGTTGCCAATCAAG-3’ (el sitio Stul está subrayado)

Cebador Antisentido [SEC ID Nº: 39] 5’-ACATACGCGTCGCGACACAAGCTGCGATAGAG-3’ (el sitio Mlul está subrayado)

Los cebadores sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido pJO200-P30. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con Stul y Mlul y el fragmento de ADN de 855 pares de bases que contenía P30 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de ADN de 855 pares de bases purificado se ligó con pEEI/Stul/Mlul durante una noche a 16 ºC. Las mezclas de ligación se transformaron al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de Miniprep a partir de los transformantes y se exploró con respecto a la presencia de la secuencia de ADN de P30 por análisis de enzima de restricción. El plásmido pToxo-P30 contenía el gen P30 incluido en los sitios Stul/Mlul de pEEI. Esta construcción de fusión CKS-ToxoP30-CKS se designó:

“CKS(1 -171 aa)-N-S-M-ToxoP30(5-289aa)-T-R-CKS(171 -260aa)”

en la que N, S, M, T, R son los restos de asparagina, serina, metionina, treonina y arginina, respectivamente, codificados por la secuencia de ADN sintética del vector. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 40] del plásmido pToxo-P30 se muestra en la Figura 9 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 53] de la proteína de fusión CKS-P30-CKS se muestran en la Figura 9.

Etapa C: Construcción de pToxo-P35S:CKS-P35(1-135aa)-CKS

El plásmido pToxo-P35S, un derivado del plásmido pJO200 (Figura 10), se construyó clonando un fragmento de ADN que contenía P35 de Toxo, obtenido por amplificación por PCR de ADN de P35 de Toxo contenido en el plásmido pJO200-P35 (Ejemplo 3A), en el sitio Stul de pJO200. El plásmido pToxo-P35S se depositó en la ATCC según los términos del Tratado de Budapest el 19 de mayo de 1998 y se le concedió en Nº de Acceso ATCC 98759.

Se aislaron ADN plasmídicos de gran escala (pJO200-P35 y pJO200) por métodos generales. El plásmido pJO200 se digirió con Stul y BamH-l y la cadena principal del vector, pJO200/Stul/BamH-l, se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido, comenzando en el nucleótido 91 del gen P35 que contenía un sitio StuI y un cebador antisentido que contenía un sitio Mlul, comenzando en el nucleótido 495 del gen de P35 (Knapp et al., 1989 (EPA 431541A2) como se muestra a continuación:

Cebador Sentido [SEC ID Nº: 41]

5’-GAGCAGAAGGCCTTATGAACGGTCCTTTGAGTTATCATCC-3’ (el sitio Stul está subrayado)

Cebador Antisentido [SEC ID Nº: 42]

5’-TTCGCTCACGCGTATGGTGAACTGCCGGTATCT-3’ (el sitio Mlul está subrayado)

Los cebadores sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido pJO200-P35. Después de amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con Stul y Mlul y el fragmento de ADN de 405 pares de bases que contenía P35 se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido, que comienza en el nucleótido 640 de pJO200 que contenía un sitio Mlul y un cebador antisentido que comienza en el nucleótido 905 de pJO200 como se muestra a continuación:

Cebador Sentido [SEC ID Nº: 43]

5’-GACGGAGACGCGTCTTGAACCGTTGGCGATAACT-3’ (el sitio Mlul está subrayado)

Cebador Antisentido [SEC ID Nº: 44]

5’-GCATGCCTGCAGTCTAGAGGA-3’

Los cebadores sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido pJO200. Después de amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con Mlul y BamH-l y el fragmento de ADN de 266 pares de bases que contenía P35 se purificó en un gel de agarosa.

El fragmento de ADN de 405 pares de bases purificado que contenía el gen P35 y el fragmento de ADN de 266 pares de bases purificado que contenía el extremo 3’ del gen de CKS, se ligaron en pJO200/Stul/BamH-l durante una noche a 16 ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de Miniprep a partir de los transformantes y se exploró con respecto a la presencia de la secuencia de ADN de P35 por análisis de enzimas de restricción. El plásmido pToxo-P35S contenía el gen P35 incluido en los sitios Stul/Mlul de pJO200. Esta construcción de fusión CKS-ToxoP35-CKS se designó:

“CKS(1 -171 aa)-ToxoP35(1 -135aa)-T-R-CKS(171 -260aa)”

en la que T y R son los restos de treonina y arginina, respectivamente, codificados por la secuencia de ADN sintética del vector. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 45] del plásmido pToxo-P35S y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 54] de la proteína de fusión CKS-P35-CKS se muestran en la Figura 11.

Etapa D: Construcción de pToxo-P66g: CKS-P66(26-428aa)-CKS

El plásmido pToxo-66g, un derivado del plásmido pEEI (Figura 12), se construyó clonando un fragmento de ADN que contenía P66 de Toxo, obtenido por amplificación por PCR de ADN de P66 de Toxo contenido en el plásmido pJO200-P66g (Ejemplo 3A), en los sitios Stul/Mlul de pEEI. El plásmido pToxo-P66g se depositó en la ATCC según los términos del Tratado de Budapest el 19 de mayo de 1998 y se le concedió en Nº de Acceso ATCC 98760.

Se aislaron ADN plasmídicos de gran escala (pJO200-P66g y pEEI) por métodos generales. El plásmido pEEI se digirió con Stul y Mlul y la cadena principal del vector, pEEI/Stul/Mlul, se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido, que comienza en el nucleótido 122 del gen P30 que contenía un sitio StuI y un cebador antisentido que contenía un sitio Mlul, que comienza en el nucleótido 1330 del gen P66 (Knapp et al., mencionado anteriormente (1989)) como se muestra a continuación:

Cebador Sentido [SEC ID Nº: 46]

5’-ATATTAGGCCTTATGAGCCACAATGGAGTCCCCGCTTATCC-3’ (el sitio Stul esta subrayado)

Cebador Antisentido [SEC ID Nº: 47]

5’-CAGTGTACGCGTTTGCGATCCATCATCCTGCTCTCTTC-3’ (el sitio Mlul está subrayado)

Los cebadores sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido pJO200-P66g. Después de amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con Stul y Mlul y el fragmento de ADN de 1209 pares de bases que contenía P66 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de ADN de 1209 pares de bases purificado se ligó en pEEI/StuI/Mlul durante una noche a 16 ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de Miniprep a partir de los transformantes y se exploró con respecto a la presencia de la secuencia de ADN de P66 por análisis de enzimas de restricción. El plásmido pToxo-P66g contenía el gen P66 incluido en los sitios Stul/Mlul de pEEI.

Esta construcción de fusión CKS-ToxoP66-CKS se designó:

“CKS(1 -171 aa)-M-ToxoP66(26-428aa)-T-R-CKS(171 -260aa)”

en la que M, T y R son los restos de metionina, treonina y arginina, respectivamente, codificados por la secuencia de ADN sintética del vector. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 48] del plásmido pToxo-P66g y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 55] de la CKS-P66-CKS se muestran en la Figura 13.

Ejemplo 12 Desarrollo de un Cóctel de Antígeno Recombinante de Toxo para la Detección de IgG e IgM Específicas de Toxoplasma

Los resultados en las Tablas 1 y 2 del Ejemplo 6B indican que se requeriría más de un antígeno recombinante para detectar IgG e IgM específicas de Toxoplasma para reemplazar el taquizoito en un inmunoensayo. Se tomaron como fuente sueros adicionales de pacientes con una Toxoplasmosis aguda o crónica y se ensayaron con los antígenos individuales recubriendo pocillos separados enumerados en las Tablas 1 y 2 usando el ELISA de microtitulación de IgG o IgM descrito en el Ejemplo 6B. Estos resultados indicaron que un cóctel de antígenos recombinantes necesarios suficiente para reemplazar el taquizoito en un inmunoensayo debería estar compuesto de los siguientes antígenos de Toxo:

Inmunoensayo de IgG de Toxo: P29+P30+P35

Inmunoensayo de IgM de Toxo: P29-P35+P66

Para demostrar la utilidad de diagnóstico de los antígenos recombinantes de Toxo en las combinaciones anteriormente propuestas en un inmunoensayo, es decir el recubrimiento con los antígenos de Toxo P29, P30 y P35 de un pocillo de placa de microtitulación sencillo (formato de Microtitulación) u otra fase sólida, por ejemplo micropartículas (formato MEIA), para detectar anticuerpos de IgG específicos de Toxoplasma y el recubrimiento con los antígenos de Toxo P29, P35 y P66 en un pocillo de placa de microtitulación sencillo (formato de Microtitulación) u otra fase sólida, por ejemplo micropartículas (formato de MEIA), para detectar anticuerpos de IgM específicos de Toxoplasma, se realizaron los siguientes experimentos:

Etapa A: Expresión de genes clonados en E. coli

Se cultivaron clones bacterianos pToxo-P29, pToxo-P30, pToxo-P35S y pToxo-P66g que expresaban las proteínas de fusión de CKS rpToxo-P29, rpToxo-P30, rpToxo-P35S y rpToxo-P66g, respectivamente, en medio SUPERBROTH II que contenía ampicilina 100 !g/ml hasta fase logarítmica y se indujo la síntesis de la proteína de fusión CKS-Toxo mediante la adición de IPTG como se ha descrito anteriormente (Robinson et al. (1993) J. Clin. Micro. 31, 629-635). Después de 4 horas después de la inducción, las células se recogieron y los sedimentos celulares se almacenaron a -80 ºC hasta la purificación de proteínas.

Etapa B: Purificación de Antígenos de Toxo Recombinantes

Se purificaron los antígenos recombinantes insolubles rpToxo-P29, rpToxo-P30, rpToxo-P35S, y rpToxo-P66g después de lisis de la pasta celular por una combinación de lavados con detergentes seguidos de solubilización en urea 8 M (Robinson et al., mencionado anteriormente (1993)). Después de completarse la solubilización, estas proteínas se filtraron a través de un filtro de 0,2 m y se almacenaron a 2-8 ºC (p/urea) o se dializaron frente a Tris 50 mM, pH 8,5 y después se almacenaron a 2-8 ºC (sin urea).

Etapa C: Sueros Humanos para Ensayos

Se evaluaron cuatro grupos de muestras de ensayo de suero a partir de una población francesa con respecto a la presencia de anticuerpos de IgG e IgM específicos de Toxoplasma usando el ELISA de microtitulación. Estas muestras de ensayo de suero abarcan colectivamente la extensión completa de la infección por Toxoplasma desde seroconversión temprana (Toxoplasmosis aguda) hasta convalecencia (infección latente, toxoplasmosis crónica) y representan los tipos de muestras de ensayo que se encuentran normalmente en serología de Toxoplasma rutinaria.

Grupo 1:- Muestras de Ensayo de Suero Negativas

Este grupo contenía 200 muestras de ensayo de suero negativas para anticuerpos de IgG e IgM de Toxoplasma según se determinó mediante inmunoensayos de IgG e IgM de Toxo Abbott Imx.

Grupo 2: Muestras de Ensayo de Suero “Ancienne”

Este grupo contenía 100 muestras de ensayo de suero negativas para anticuerpos de IgM de Toxoplasma y positivas para anticuerpos de IgG de Toxoplasma por los inmunoensayos de IgG e IgM de Toxo Abbott Imx. Estas muestras de ensayo fueron negativas para anticuerpos de IgA de Toxoplasma según se determinó por un ensayo de inmunocaptura usando una suspensión de taquizoitos (IC-A) (Pinon, J. M. (1986) Diag. Immunol. 4: 223-227).

Grupo 3: Muestras de Ensayo de Suero “Évolutive”

Este grupo contenía 99 muestras de ensayo de suero positivas para anticuerpos de IgG de Toxoplasma por un ensayo de aglutinación directa de alta sensibilidad (HSDA) (Desmonts, G. y Remington, J. S. (1980) J. Clin. Micro.

11: 562-568) y positivas para anticuerpos de IgM e IgA de Toxoplasma usando un ensayo de inmunocaptura específico (IC-M, IC-A).

Grupo 4: Muestras de Ensayo de Suero “Précoce”

Este grupo contenía 66 muestras de ensayo obtenidas de individuos con pruebas de una seroconversión temprana 5 de anticuerpos específicos de Toxoplasma (ausencia o manifestación temprana de anticuerpos de IgG y positivos para anticuerpos de IgM e IgA usando un ensayo de inmunocaptura específico (IC-M, IC-A)).

Etapa D: Evaluación de Sueros Humanos en el ELISA de Microtitulación de Antígeno de Toxo Recombinante

10 Se recubrieron los pocillos de la placa de microtitulación con antígenos de Toxo recombinantes purificados (Ejemplo 12B) como sigue:

Para el ELISA de microtitulación de IgG, los tres antígenos de Toxo rpToxo-P29, rpToxo-P30 y rpToxo-P35S (con o sin urea) se diluyeron juntos en PBS a una concentración final de 5 !g/ml para cada antígeno y las placas se 15 recubrieron y se procesaron como se ha descrito en el Ejemplo 6B usando un conjugado de HRPO-IgG anti humano de cabra para detectar IgG humana unida. Los tres antígenos de Toxo recubrieron juntos el mismo pocillo de microtitulación para detectar IgG específica de Toxoplasma. Para el ELISA de microtitulación de IgM, los tres antígenos de Toxo rpToxo-P29, rpToxo-P35S y rpToxo-P66g (con o sin urea) se diluyeron juntos en PBS a una concentración final de 5 mg/ml para cada antígeno y las placas se recubrieron y se procesaron como se ha descrito

20 en el Ejemplo 6B usando un conjugado de HRPO-IgM anti humano de cabra para detectar IgM humana unida. Los tres antígenos de Toxo recubrieron juntos el mismo pocillo de microtitulación para detectar IgM específica de Toxoplasma. El punto de corte para estos ensayos fue entre 2 y 3 desviaciones típicas de la media de la población negativa.

25 Etapa E: Resultados de la Evaluación de Sueros Humanos en el ELISA de Microtitulación de IgG de Antígeno de Toxo Recombinante (P29+P30+P35)

Las muestras de ensayo de suero de los Grupos 1-4 (Ejemplo 12C) se ensayaron con respecto a la presencia de IgG específico de Toxoplasma usando el ELISA de microtitulación de IgG de antígeno de Toxo (rpToxo-P29 (P29)+ 30 rpToxo-P30 (P30)+rpToxo-P35S (P35)). Los resultados de esta evaluación se presentan en las Tablas 4-8.

Tabla 4 Evaluación de Muestras de Ensayo de Suero Negativas de Grupo 1 por ELISA de Microtitulación de IgG Toxo

Abbott Imx Toxo IgG

Pos Neg

ELISA de Microtitulación de IgG de Toxo Pos

0 8

(P29+P30+P35)

Neg

0 192

Especificidad: 192/200 = 96 %

35 Tabla 5 Evaluación de Muestras de Ensayo de Suero “Ancienne” de Grupo 2 por ELISA de Microtitulación de IgG de Toxo

Abbott Imx Toxo IgG

Pos Neg

ELISA de Microtitulación de IgG de Toxo Pos

97 0

(P29+P30+P35)

Neg

3 0

Sensibilidad: 97/100 = 97 %

Tabla 6 Evaluación de Muestras de Ensayo de Suero “Évolutive” de Grupo 3 por ELISA de Microtitulación de IgG de Toxo

HSDA IgG

Pos Neg

ELISA de Microtitulación de IgG de Toxo Pos

99 0

(P29+P30+P35)

Neg 0 0

Sensibilidad: 99/99 = 100 %

5 Tabla 7 Evaluación de Muestras de Ensayo de Suero “Précoce” de Grupo 4 por ELISA de Microtitulación de Toxo

HSDA IgG

Pos Neg

ELISA de Microtitulación de IgG de Toxo Pos

99 0

(P29+P30+P35)

Neg 0 0

Sensibilidad: 54/55 = 98,1 %

Tabla 8 Sumario de Evaluación de Muestras de Ensayo de Suero de los Grupos 1-4 por ELISA de Microtitulación de IgG de 10 Toxo

Ensayo de Referencia

Pos Neg

ELISA de Microtitulación de IgG de Toxo Pos

250 9

(P29+P30+P35)

Neg 4 202

Especificidad: 209/211 = 95,7 %

Sensibilidad: 250/254 = 98,4 %

Como puede verse a partir de las Tablas 4-8, el ELISA de microtitulación de IgG de Toxo es un ensayo tanto sensible como específico para la detección de IgG específica de Toxoplasma como se demuestra por la especificidad (95,7 %) y sensibilidad (98,4 %) de diagnóstico relativa alta global (Tabla 8) del ensayo. El cóctel de

15 antígenos recombinantes de Toxo comprendido por los antígenos de Toxo P29, P30 y P35 en combinación con el ensayo de IgG de Toxo, es tanto necesario como suficiente para reemplazar el taquizoito para la detección de anticuerpo de IgG específico de Toxoplasma.

Además, existen varias ventajas del cóctel de antígenos recombinantes frente al antígeno de taquizoito para su uso

20 en la detección de anticuerpos de IgG. En primer lugar, los antígenos se purifican y la cantidad de cada antígeno cargada en el inmunoensayo puede determinarse de forma precisa y normalizarse, por ejemplo, concentración proteica. Esto minimiza las diferencias entre lotes habitualmente observadas en kits fabricados con diferentes lotes de antígenos de taquizoitos. Por lo tanto, diferentes lotes de kits fabricados con diferentes lotes de cóctel de antígenos serán muy uniformes de lote a lote. En segundo lugar, los anticuerpos monoclonales de ratón para los

25 antígenos de Toxo recombinantes individuales se usan para controlar el recubrimiento de las proteínas en la fase sólida. Esto asegura además que cada lote producido sea uniforme. En tercer lugar, la verdadera sensibilidad clínica del ensayo usando los antígenos purificados será mayor debido al hecho de la mayor actividad específica de los antígenos purificados. Finalmente, los kits fabricados con el cóctel de antígenos son más estables durante el almacenamiento a lo largo del tiempo y el rendimiento del ensayo usando estos antígenos permanece uniforme

30 durante el periodo de validez del ensayo. Los kits fabricados con el antígeno de taquizoito no son tan estables y su rendimiento puede variar a lo largo del tiempo.

Adicionalmente, existen muchas ventajas del uso de cóctel frente a un antígeno sencillo solamente. Por ejemplo, una respuesta inmune a la infección varía según el individuo. Algunos individuos producen anticuerpos para P35 y

35 no para P66, mientras que algunos individuos producen anticuerpos para P66 y no para P35. Por lo tanto, el cóctel de antígenos de la presente invención detectará ambos grupos de individuos.

Además, las respuestas inmunes varían con el tiempo. Por ejemplo, un individuo puede producir anticuerpos contra P35 primero y después producir más tarde anticuerpos solamente para P66. Por lo tanto, el presente cóctel detectará ambos tipos de individuos “positivos”.

5 Además, los individuos pueden infectarse con diferentes serotipos, cepas o aislados de Toxo. Por lo tanto, la respuesta inmune puede ser tal que se necesiten múltiples antígenos para detectar la presencia de todos los anticuerpos que se producen. De nuevo, el presente cóctel permite dicha detección.

Además, se sabe a partir de experimentos de transferencia de Western previos con proteínas de taquizoitos que la 10 respuesta inmune al Toxoplasma se dirige contra varios antígenos. De nuevo, el presente cóctel de antígenos permitirá la detección de todos los anticuerpos producidos en respuesta a estos antígenos.

Etapa F: Resultados de la Evaluación de Sueros Humanos en el ELISA de Microtitulación de IgM de Antígeno de Toxo Recombinante (P29+P35+P66)

15 Las muestras de ensayo de los Grupos 1-4 (Ejemplo 12C) se ensayaron con respecto a la presencia de IgM específica de Toxoplasma usando el ELISA de microtitulación de IgM de antígenos de Toxo recombinantes (rpToxo-P29 (P29)+ rpToxo-P35S (P35)+rpToxo-P66g (P66)). Los resultados de esta evaluación se presentan en las Tablas 9-13.

20 Tabla 9 Evaluación de Muestras de Ensayo de Suero Negativas de Grupo 1 por ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo

Abbott Imx Toxo IgG

Pos Neg

ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo Pos

0 7

(P29+P35+P66)

Neg 0 193

Especificidad: 193/200 = 96,5 %

Tabla 10 25 Evaluación de Muestras de Ensayo de Suero “Ancienne” de Grupo 2 por ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo

Abbott Imx Toxo IgG

Pos Neg

ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo Pos

0 8

(P29+P35+P66)

Neg 0 92

Especificidad: 92/100 = 92,0 %

Tabla 11 Evaluación de Muestras de Ensayo de Suero “Évolutive” de Grupo 3 por ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo

IC IgM

Pos Neg

ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo Pos

69 0

(P29+P35+P66)

Neg 30 0

Sensibilidad: 69/99 = 70,0 %

Tabla 12 Evaluación de Muestras de Ensayo de Suero “Précoce” de Grupo 4 por ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo

IC IgM

Pos Neg

ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo Pos

53 1

(P29+P35+P66)

Neg

2 10

Sensibilidad: 53/55 = 96,7 %

Tabla 13 5 Sumario de Evaluación de las Muestras de Ensayo de Suero de los Grupos 1-4 por ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo

Ensayo de Referencia

Pos Neg

ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo Pos

122 16

(P29+P35+P66)

Neg

32 295

Especificidad: 295/311 = 94,9 %

Sensibilidad: 122/154 = 79,2 %

Como puede verse a partir de las Tablas 9-13, el ELISA de microtitulación de IgM de Toxo es un ensayo específico para la detección de IgM específica de Toxoplasma como se demuestra por la especificidad de diagnóstico relativa 10 alta global (94,9 %) (Tabla 13) del ensayo. Sin embargo, el ensayo parece ser relativamente insensible a la detección de IgM especifica de Toxoplasma presente en muestras de ensayo del suero del Grupo 3 “Évolutive” (sensibilidad de diagnóstico relativa = 70 %, Tabla 11) pero sensible a la detección de IgM específica de Toxoplasma presente en muestras de ensayo de suero del Grupo 4 “Précoce” (sensibilidad de diagnóstico relativa = 96,7 %, Tabla 12). Estos datos sugieren que el ELISA de microtitulación de IgM de Toxo puede ser más sensible a la

15 detección de IgM específica de Toxoplasma indicativa de una infección aguda o reciente que el ensayo de inmunocaptura de IC-M usado como el ensayo de referencia.

Se realizaron ensayos de resolución adicionales con el ensayo de IgM de Toxo Abbott Imx y un ensayo de avidez de IgG de Toxo en las 30 muestras de ensayo discordantes enumeradas en la Tabla 11 que fueron positivas para 20 anticuerpos de IgM usando el ensayo de inmunocaptura IC-M y negativas para el anticuerpo de IgM por el ELISA de microtitulación de IgM de Toxo. De las 30 muestras de ensayo que fueron falsos negativos por el ensayo de microtitulación de IgM de Toxo, 11 se resolvieron como verdaderos negativos por ensayo de IgM de Toxo Abbott Imx. Además, las 11 muestras de ensayo contenían IgG de Toxoplasma con avidez elevada, representativo de una infección pasada. De las 19 muestras de ensayo restantes que fueron falsos negativos por el ensayo de 25 microtitulación de IgM de Toxo, 11 muestras de ensayo adicionales correspondían a infecciones de Toxoplasma que probablemente sucedieron más de 6 meses antes, según se demuestra por la presencia de anticuerpos de alta avidez de IgG específicos de Toxoplasma. Además, una muestra de ensayo fue de un paciente con reactivación de Toxoplasmosis en la que los anticuerpos de IgM de Toxo normalmente están ausentes (un falso positivo de IC-M e IgM de Toxo Abbott Imx) y una muestra de ensayo de un paciente con Toxoplasmosis congénita. Por lo tanto, 30 después de la resolución por el ensayo de IgM de Toxo Abbott Imx seguido de consideración de los datos de avidez de IgG de Toxo y la historia clínica de las muestras de ensayo, de los 32 falsos negativos de muestras de ensayo por el ensayo de microtitulación de IgM, 11 se resolvieron como verdaderos negativos, 13 muestras de ensayo (de pacientes con infección congénita) se retiraron del cálculo de la especificidad y sensibilidad de diagnóstico relativa y 6 muestras de ensayo permanecieron como falsos negativos. Los datos resueltos y la sensibilidad y especificidad

35 recalculadas para el ensayo de microtitulación de IgM de Toxo se muestran en las Tablas 14 y 15.

Tabla 14 Evaluación de Muestras de Ensayo de Suero “Évolutive” de Grupo 3 por ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo Después de Resolución de Muestras de Ensayo Discordantes

IC IgM

Pos Neg

ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo Pos

69 0

(P29+P35+P66)

Neg

6 11

Sensibilidad: 69/75 = 92,0 %

5 Tabla 15 Sumario de Evaluación de Muestras de Ensayo de Suero de los Grupos 1-4 por ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo Después de Resolución de las Muestras de Ensayo Discordantes

Ensayo de Referencia

Pos Neg

ELISA de Microtitulación de IgM de Toxo Pos

122 16

(P29+P35+P66)

Neg 8 306

Especificidad: 306/322 = 95,8 %

Sensibilidad: 122/130 = 93,8 % Como puede verse a partir de las Tablas 14 y 15 después de la resolución de las muestras de ensayo discordantes, el ELISA de microtitulación de IgM de Toxo configurado con el cóctel de antígenos es un ensayo tanto sensible

10 como específico para la detección de IgM específica de Toxoplasma como se demuestra por la especificidad (95,0 %) y sensibilidad (93,8 %) de diagnóstico relativas globales altas (Tabla 15) del ensayo. El cóctel de antígenos recombinantes de Toxo comprendido por los antígenos de Toxo P29, P35 y P66 es tanto necesario como suficiente para reemplazar el taquizoito para la detección de IgM específico de Toxoplasma indicativa de una reciente Toxoplasmosis.

15 Además, existen varias ventajas de este cóctel de antígenos recombinantes frente al antígeno de taquizoito para su uso en detección de anticuerpos para IgM. En primer lugar, los antígenos se purifican y la cantidad de cada antígeno cargada en el inmunoensayo puede determinarse de forma precisa y normalizarse, por ejemplo, concentración proteica. Esto minimiza las diferencias entre lotes habitualmente observadas en kits fabricados con diferentes lotes

20 de antígenos de taquizoitos. Por lo tanto, diferentes lotes de kits fabricados con diferentes lotes de cóctel de antígenos serán muy uniformes de lote a lote. En segundo lugar, se usan anticuerpos monoclonales de ratón para los antígenos de Toxo recombinantes individuales para controlar el recubrimiento de las proteínas de la fase sólida. Esto asegura además que cada lote producido sea uniforme. En tercer lugar, la verdadera sensibilidad clínica del ensayo usando los antígenos purificados será mayor debido al hecho de la mayor actividad específica de los

25 antígenos purificados. En cuarto lugar, un ensayo de IgM con el cóctel de antígenos detectará preferentemente anticuerpos de IgM producidos en respuesta a una infección reciente. Esto puede verse en las Tablas 11 y 14 en las que las muestras de ensayo con anticuerpos de IgG de alta avidez (indicativo de una infección pasada o crónica) fueron negativas para adición específica de Toxo usando el cóctel de antígenos en un ELISA de microtitulación. Finalmente, los kits fabricados con el cóctel de antígenos son más estables durante el almacenamiento a lo largo del

30 tiempo y el rendimiento del ensayo usando estos antígenos sigue siendo uniforme a lo largo del periodo de validez del ensayo. Los kits fabricados con el antígeno de taquizoito no son tan estables y su rendimiento puede variar a lo largo del tiempo.

Adicionalmente, existen muchas ventajas del uso de un cóctel frente al uso de un antígeno sencillo solamente. Por

35 ejemplo, una respuesta inmune a la infección varía según el individuo. Algunos individuos producen anticuerpos para P35 y no para P30 mientras que algunos individuos producen anticuerpos para P30 y no para P35. Por lo tanto, el cóctel de antígenos de la presente invención detectará ambos grupos de individuos.

Además, las respuestas inmunes varían con el tiempo. Por ejemplo, un individuo puede producir anticuerpos contra 40 P35 primero y después producir más tarde anticuerpos solamente para P30. Por lo tanto, el presente cóctel detectará ambos tipos de individuos “positivos”.

Además, los individuos pueden infectarse con diferentes serotipos, cepas o aislados de Toxo. Por lo tanto, la respuesta inmune puede ser tal que se necesiten múltiples antígenos para detectar la presencia de todos los

45 anticuerpos que se producen. De nuevo, el presente cóctel permite dicha detección.

Además, se sabe a partir de anteriores experimentos de transferencia de Western con proteínas de taquizoitos que la respuesta inmune a Toxoplasma se dirige contra varios antígenos. De nuevo, el presente cóctel de antígenos permitirá la detección de todos los anticuerpos producidos en respuesta a estos antígenos.

Ejemplo 13

Análisis de Inmunotransferencia de Antígenos de Lisado de T. gondii

Se prepararon antígenos de lisado de T. gondii de taquizoitos de la cepa RH. Los parásitos se recogieron de la cavidad peritoneal de ratones Swiss-Webster, como se ha descrito anteriormente (Prince et al., Molecular Biochemical Parasitology 43: 97-106 (1990)). Se preparó un lisado reducido por resuspensión de taquizoitos en tampón de muestra reductor que contenía dodecil sulfato sódico al (SDS) 0,5 %, Tris-HCl 25 mM, pH 6,8, 1mercaptoetanol 170 mM, glicerol 8,4 % y azul de bromofenol 0,01 %. Se prepararon proteínas CKS y rPToxo-P35S no recombinante en tampón de muestra reductor que contenía dodecil sulfato sódico (SD) 0,5 %, Tris-HCl 25 mM, pH 6,8, 2-mercaptoetanol 170 mM, glicerol 8,4 % y azul de bromofenol 0,01 %. Todas las muestras se hirvieron durante 5 minutos. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE en geles en bloque 10 % y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. Para análisis de inmunotransferencia con sueros humanos, las membranas con antígeno de rPToxo-P35S reducido o antígeno de CKS no recombinante se incubaron con grupos de sueros que se habían diluido 1:100 en PBS-Tween 20 0,5 % (PBS-T) que contenía leche en polvo desgrasada 5 % (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). El conjugado usado fue IgG antihumano de cabra conjugado con HRPO (Caltag Laboratories) a una dilución óptima determinada previamente de 1:3000 en PBS-T que contenía albúmina de suero bovino 3 % (BSA). El sustrato, 3,3’-diaminobenzidin tetrahidrocloruro (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) se usó a una concentración final de 0,1 mg/ml en PBS. Las inmunotransferencias de control realizadas para ensayar con respecto a la reactividad de los conjugados al antígeno de rPToxo35-P35S o antígeno de CKS no recombinante no reveló ninguna banda.

Estos resultados demuestran que los anticuerpos de IgG de sueros de seres humanos con una infección de T. gondii reaccionan con una proteína del tamaño correcto para ser la proteína de fusión P35 y no una proteína de E. coli irrelevante.

Ejemplo 14

Preparación de Muestras de Suero y Realización de Muestras de Suero de ELISA: Los sueros se proporcionaron por el Laboratorio de Serología de Toxoplasma de la Fundación Médica de Palo Alto (Palo Alto, CA) y se habían almacenado congelados durante no más de 2 años. Las muestras fueron de 141 mujeres embarazadas y se dividieron en tres grupos basándose en sus resultados de ensayo serológicos: el Grupo I estaba compuesto por sueros de 41 mujeres con un perfil serológico coherente con una infección de T. gondii recientemente adquirida (perfil agudo) y el Grupo II de sueros de 50 mujeres con un perfil serológico coherente con infección crónica. Los ensayos serológicos usados para clasificar estos sueros fueron: ensayos de colorante de Sabin Feldman (DT), el ELISA de IgM de tipo doble sándwich (ELISA de IgM) y el ELISA de IgA de tipo doble sándwich (ELISA de IgA) y el ensayo de AC/HS (Lisenfeld et al., Journal of Clinical Microbiology 34: 2526-30(1996); Lisenfeld et al., Journal of Clinical Microbiology 35: 174-78 (1997); Wong et al., Clinical Infectious Diseases 18: 853-62 (1994)). Estos ensayos comprenden el “perfil serológico de toxoplasma” (Lisenfeld et al., Journal of Clinical Microbiology 35: 174-78 (1997)). Los sueros de las mujeres del Grupo I tenían altas titulaciones de DT (de 1:256 a 1:32.000), titulaciones de ELISA de IgM positivas (de 2,3 a 9,7), titulaciones de ELISA de IgA positivas (de 1 a >28) y patrones agudos en el ensayo de AC/HS. Los sueros de mujeres del Grupo II tenían DT (de 1:16 a 1:512), titulaciones de ELISA de IgM negativas (de 0 a 0,8) y patrones crónicos en el ensayo de AC/HS. La clasificación de perfil agudo crónico se basó en la historia clínica del individuo así como la combinación de los resultados del perfil serológico de toxoplasma (Lisenfeld et al., Journal of Clinical Microbiology 35: 174-78 (1997); Lisenfeld et al., Journal of Clinical Microbiology 35: 174-78 (1997)). Un grupo adicional (Grupo III) estaba compuesto de sueros de 50 mujeres que eran seronegativas para anticuerpos de T. gondii en el DT. Se usó un grupo de muestras de suero de 5 individuos seronegativos, cada uno de los cuales fue negativo cuando sus sueros se ensayaron no diluidos en el DT, como un control negativo para inmunotransferencias y el ELISA. El suero de un paciente con una linfadenopatía toxoplásmica recientemente adquirida se usó como un control positivo en cada placa de ELISA.

ELISA: Cada pocillo de una placa de microtitulación (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se recubrió con 0,1 ml de un antígeno de rPToxo-P35S 10 !g/ml que se determinó que era la concentración óptima con la que recubrir los pocillos de las placas de ELISA. En consecuencia, la preparación de antígenos de CKS no recombinante de control también se usó a 10 pg/ml para recubrir placas. Después de incubación a 4 ºC durante una noche, las placas se lavaron tres veces con PBS-T y se recubrieron posteriormente con 200 !l por pocillo de BSA 3 % en PBS-T a 37 ºC durante 2 horas. Las placas se lavaron después y se aplicaron 100 !l de suero de ensayo o de control diluido 1:50 en BSA a 1 % en PBS-T a cada pocillo con preparación de antígeno de rPToxo-P35S, preparación de antígeno de CKS no recombinante o sin antígeno. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 1 hora, se lavaron y después se añadieron 100 !l de IgG anti humana de cabra conjugada con HRPO a una dilución de 1:1000 a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 1 hora, se lavaron y después se añadieron 100 !l de O-fenilendiamina 0,03 % en H2O2 a cada pocillo. Los valores de densidad óptica se midieron con un lector de ELISA automático (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente. Cada muestra se aplicó a pocillos por duplicado. Los resultados se determinaron para cada paciente tomando el valor medio de las lecturas de absorbancia de pocillos por duplicado.

De los 41 sueros del Grupo I, 40 (97,6 %) tuvieron lecturas de absorbancia mayores en el ELISA de rPToxo-P35S que en el ELISA de control y 1 tuvo lecturas de absorbancia mayores en el ELISA de control que en el ELISA de rpToxo-P35S (Figura 15). Por el contrario, de los 50 sueros del Grupo II, 30 (60 %) tuvieron lecturas en el ELISA de control que eran iguales a o mayores que en el ELISA de rpToxo-P35S y las 20 restantes (40 %) tuvieron lecturas de absorbancia en el ELISA de rpToxo-P35S que eran solamente ligeramente mayores que en las lecturas observadas en el ELISA de control (Figura 16). La media de los sueros del Grupo I (0,0513 +/- 0,0045 de error típico) fue significativamente (p=0,0001) mayor que la media de los sueros del Grupo II (0,0031 +/- 0,0008 de error típico).

Con respecto a determinar si la reactividad de los anticuerpos de IgG con rpToxo-P35S podría usarse para diferenciar los sueros del Grupo I y del Grupo II, se observó que 35 (85,3 %) de 41 sueros del Grupo I tenían lecturas normalizadas mayores que el valor de punto de corte (Figura 17). Por el contrario, solamente 4 (8 %) de los 50 sueros del Grupo II tenían lecturas normalizadas mayores que el valor de punto de corte (Figura 18). Cuando se compara con interpretaciones realizadas basándose en los resultados del perfil serológico de Toxoplasma, la sensibilidad del ELISA de rpToxo-P35S para infección recientemente adquirida fue del 85,3 % y la especificidad fue del 92 %. Usando un valor de punto de corte (0,019) basado en la media más 3 desviaciones típicas de las lecturas del Grupo II, 35 (85,3 %) de 41 sueros del Grupo I (Figura 17) y solamente 1 (2 %) de los 50 sueros del Grupo II (Figura 18) tuvieron lecturas normalizadas mayores que el valor de punto de corte.

Los resultados anteriores demuestran que el antígeno de P35 en el ELISA de IgG puede usarse para distinguir entre sueros de paciente obtenidos de individuos en la etapa aguda de infección frente a individuos en la etapa crónica de infección. En particular, se determinó que los pacientes del Grupo I tenían una infección aguda y los del Grupo II tenían una infección crónica. Por lo tanto, puede usarse P35 para diferenciar entre Toxoplasmosis aguda y crónica.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Abbott Laboratorios MAINE. GregoryT. HUNT. Jeffery C. BROJANAC, Susan JYH-TSING SHEU, Michael CHOVAN, Linda E. TYNER, Joan D. HOWARD, Lawrence V.

<120> CÓCTEL DE ANTÍGENOS, P35 Y USOS DEL MISMO

<130> 6361.US.P1

<140> US 09/303.064

<141>

<150> 09/086.503

<151 >

<160> 55

<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

<210> 1

<211> 43

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 1 cgcagaattc gatgtccacc accgagacgc cagcgcccat tga 43

<210> 2

<211> 43

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 2 cccgggatcc ttacacaaac gtgatcaaca aacctgcgag acc 43

<210> 3

<211> 36

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 3 ggccgaaccc gatggccgaa ggcggcgaca accagt 36

<210> 4

<211> 38

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 4 gcccggaccc ttactctctc tctcctgtta ggaaccca 38

<210> 5

<211> 39

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 5 ggcgaattcg atgcaagagg aaatcaaaga aggggtgga 39

<210> 6

<211> 33

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 6 cgcactctag atcacctcgg agtcgagccc aac 33

<210> 7

<211> 34

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 7 ggcgaattcg atgagcggta aacctcttga tgag 34

<210> 8

<211> 32

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 8 cgctaggatc cttactgcga aaagtctggg ac 32

<210> 9

<211> 37

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 9 ggcgaattcg atgcttgttg ccaatcaagt tgtcacc 37

<210> 10

<211> 31

<213>

ADN

<213>

Toxoplasma gondii

<400> 10 cgctaggatc ctcacgcgac acaagctgcg a 31

<210> 11

<211> 35

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 11 gacggcgaat tcgatgaacg gtcctttgag ttatc 35

<210> 12

<211> 32

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 12 cgctaggatc cttaattctg cgtcgttacg gt 32

<210> 13

<211> 35

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 13 gacggcgaat-tcgatgaacg gtcctttgag ttatc 35

<210> 14

<211> 36

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 14 cgctaggatc ctcaatggtg aactgccggt atctcc 36

<210> 15

<211> 34

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 15 ggcgaattcg atgggtgagt gcagctttgg ctct 34

<210> 16

<211> 34

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 16 cgcactctag atcactcccc gcgcattctt tcca 34

<210> 17

<221> 40

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 17 gcctgaattc gatgcacgta cagcaaggcg ctggcgttgt 40

<210> 18

<211> 42

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 18 cgctaggatc ctcagaagtc tccatggctt gcaatgggag ga 42

<210> 19

<211> 40

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

5 <400> 19 ggcgaattcg atgagccaca atggagtccc cgcttatcca 40

<210> 20

<211> 40 10 <212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 20

cgctaggatc cttattgcga tccatcatcc tgctctcttc 40 15

<210> 21

<211> 38

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii 20

<400> 21 acccgaattc gatgacagca accgtaggat tgagccaa 38

<210> 22 25 <211> 34

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 22 30 cgctggatcc tcaagctgcc tgttccgcta agat 34

<210> 23

<211> 126B

<212> ADN 35 <213> Toxoplasma gondii

<400> 23

40 <210> 24

<211> 228

<212> PRT

<213> Toxoplasma gondii

<400> 24

<210> 25

<211> 477

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 25

15 <210> 26

<211> 1648

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

20 <400> 26

<210> 27

<211> 236

<212> PRT

<213> Toxoplasma gondii

<100> 27

<210> 28

<211> 78

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 28

<210> 29

<211> 78

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 29

<210> 30

<211> 88

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 30

<210> 31

<211> 88

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 31

<210> 32

<211> 40

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 32 aggcctgaac ccgagctctg ggatccgtct gcagacgcgt 40

<210> 33

<211> 32

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 33 cctgaactcg agctccggga tccgtctgca ga 32

<210> 34

<211> 36

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii <400> 34 cgcgtctgca gacggatccc agagctcgaa ttcagg 36

<210> 35

<211> 36

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 35 acttagaatt cgatggcccg acacgcaatt tttccc 36

<210> 36

<211> 35

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 36 acatggatcc gctggcgggc atcctcccca tcttc 35

<210> 37

<211> 4775

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 37

5

<210> 38 <211> 36 <212> ADN <213> Toxoplasma gondii

10 15

<400> 38 tcctaggcct taattcgatg cttgctgcca atcaag <210> 39 <211> 32 <212> ADN <213> Toxoplasma gondii <400> 39 acacacgcgt cgcgacacaa gctgcgatag ag 36 32

20

<210> 40 <211> 4910 <212> ADN <213> Toxoplasma gondii

<400> 40

<210> 41

<211> 40

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 41 gagcagaagg ccttatgaac ggtcctttga gttatcatcc 40

<210> 42

<211> 33

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 42 ttcgctcacg cgtatggtga actgccggta tct 33

<210> 43

<211> 34

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 43 gacggagacg cgtcttgaac cgttggcgat aact 34

<210> 44

<211>

21

<211>

5258

<212> ADN <213> Toxoplasma gondii

5

<400> 44 gcatgcccgc agtctagagg a 21

10

<210> 45 <211> 4451 <212> ADN <213> Toxoplasma gondii

<400> 45

5

<210> 46 <211> 41 <212> ADN <213> Toxoplasma gondii

10 15

<400> 46 atattaggcc ttatgagcca caatggagtc cccgcttatc c <210> 47 <211> 38 <212> ADN <213> Toxoplasma gondii <400> 47 cagtgtacgc gtttgcgatc catcatcctg ctctcttc 38 41

<210> 48

<212> ADN

<213> Toxoplasma gondii

<400> 48

<210> 49

<211> 22

<212> PRT

<213> Toxoplasma gondii

<400> 49

<210> 50

<211> 22

<212> PRT

<213> Toxoplasma gondii

<400> 50

<210> 51

<211> 13

<212> PRT 15 <213> Toxoplasma gondii

<400> 51

<210> 52

<211> 506

<212> PRT

<213> Toxoplasma gondii 25

<400> 52

<210> 53

<211> 551

<212> PRT

<213> Toxoplasma gondii

<400> 53

<210> 54

<211> 398

<212> PRT

<213> Toxoplasma gondii

<400> 54

<210> 55

<211> 667

<212> PRT

<213> Toxoplasma gondii

<400> 55

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para distinguir entre Toxoplasmosis aguda y crónica en un paciente sospechoso de tener dicha Toxoplasmosis aguda o crónica que comprende las etapas de:

   5 a) poner en contacto una muestra de ensayo, de dicho paciente, con una composición que comprende los aminoácidos 172-306 de SEC ID Nº: 54; y b) detectar anticuerpos de IgG anti T. gondii, indicando la presencia de dichos anticuerpos de IgG Toxoplasmosis aguda en dicho paciente e indicando la falta de dichos anticuerpos de IgG Toxoplasmosis

   10 crónica en dicho paciente.

   51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99

   103 104 105 106 107 108 109 110 111 112