ES2372762A1

ES2372762A1 - Method and kit for the detection of interferon activation and the independent interferon inflammatory response. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Info

Publication number: ES2372762A1
Application number: ES201031026A
Authority: ES
Inventors: Alfredo Berzal Herranz; Jose Antonio Reyes Darias
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2012-01-26
Anticipated expiration: 2030-07-02
Also published as: ES2372762B1

Abstract

Method and kit for the detection of interferon activation and the interferon-independent inflammatory response. The present invention relates to a combination of primers and a method for the detection and/or quantification of interferon activation and the interferon-independent inflammatory response. The amplification is performed by multiplex rt-pcr (mrt-pcr) where the primers used amplify the genes oas2, isg56, il-8 and ifn α or ifn β in addition, the present invention includes a kit with the combination of the mentioned primers and other components. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Description

Método y kit para la detección de la activación de interferón y la respuesta inflamatoria independiente de interferón.Method and kit for detection of activation of interferon and the inflammatory response independent of interferon

La presente invención se refiere a una combinación de cebadores y un método para la detección y/o cuantificación de la activación del sistema interferón y de la respuesta inflamatoria independiente de interferón producida por la liberación de citoquinas proinflamatorias. La amplificación se realiza mediante RT-PCR multiplex (mRT-PCR) donde los cebadores empleados amplifican los genes OAS2, ISG56, IL-8 e IFN\alpha o IFN\beta. Además, la presente invención se refiere a un kit con la combinación de los cebadores mencionados y otros componentes.The present invention relates to a combination of primers and a method for detection and / or quantification of the activation of the interferon system and of the interferon independent inflammatory response produced by the Proinflammatory cytokine release. The amplification is performs using RT-PCR multiplex (mRT-PCR) where the primers used amplify the OAS2, ISG56, IL-8 and IFNα genes or IFNβ. In addition, the present invention relates to a kit with the combination of the mentioned primers and other components.

Prior art

Los ácidos nucleicos pueden inhibir la expresión génica o actuar como agentes terapéuticos. Sin embargo, muchos de los ácidos nucleicos, incluidos los RNAs de cadena simple (ssRNA), RNAs de cadena doble (dsRNA) y oligodesoxirribonucleotidos (ODN) que contienen en su secuencia dinucleótidos CpG no metilados (CpG ODN), pueden estimular el sistema interferón o la respuesta inflamatoria independiente de interferón producida por la liberación de citoquinas proinflamatorias en los mamíferos.Nucleic acids can inhibit expression gene or act as therapeutic agents. However, many of nucleic acids, including single chain RNAs (ssRNA), Double-stranded RNAs (dsRNA) and oligodeoxyribonucleotides (ODN) that contain in its sequence unmethylated CpG dinucleotides (CpG ODN), they can stimulate the interferon system or the inflammatory response interferon independent produced by the release of Proinflammatory cytokines in mammals.

Así, pequeños ssRNA pueden desencadenar una potente inducción de interferón en una variedad de líneas celulares, de la misma forma, pequeños RNA interferentes (siRNA) sintéticos o expresados a partir de plásmidos o vectores virales pueden inducir una importante respuesta mediada por interferón cuando se expresan en determinadas líneas celulares. Los CpG ODN sintéticos activan las células inmunes a través del receptor Toll-like 9 (TLR-9) estimulando el sistema interferón o la respuesta inflamatoria independiente de interferón producida por la liberación de citoquinas proinflamatorias. Estos CpG ODN se han dividido en tres clases, A, B y C, en función de su modo inmunoestimulador y su secuencia. Los CpG ODN de las clases A y C inducen altos niveles de interferón-\alpha (IFN-\alpha), en contraste, los CpG ODN de la clase B inducen preferentemente la producción de las citoquinas inflamatorias IL-6, IL-8 e IL-10, pero son relativamente pobres inductores del IFN-\alpha (Vollmer J et al., 2004 J Endotoxin Res.10(6) pag. 431-438; Agrawal S y Kandimalla ER, 2007. Biochemical Society Transactions 35, 6). A diferencia de las IL-6 e IL-10, la IL-8 (citoquina proinflamatoria) es inducida en células no pertenecientes al sistema inmune, que expresan de forma estable el TLR-9 (Hemmi H et al., 2000 Nature. 7, 408(6813) pag. 740-745).Thus, small ssRNAs can trigger a potent induction of interferon in a variety of cell lines, in the same way, small interfering RNAs (siRNAs) synthetic or expressed from plasmids or viral vectors can induce an important interferon-mediated response when expressed. in certain cell lines. Synthetic ODN CpGs activate immune cells through the Toll-like 9 receptor (TLR-9) by stimulating the interferon system or the interferon-independent inflammatory response produced by the release of pro-inflammatory cytokines. These CpG ODN have been divided into three classes, A, B and C, depending on their immunostimulatory mode and sequence. CpG ODN of classes A and C induce high levels of interferon-? (IFN-?), In contrast, CpG ODN of class B preferably induces the production of inflammatory cytokines IL-6, IL-8 e IL-10, but relatively poor inducers of IFN-? (Vollmer J et al. , 2004 J Endotoxin Res. 10 (6) page 431-438; Agrawal S and Kandimalla ER, 2007. Biochemical Society Transactions 35, 6 ). Unlike IL-6 and IL-10, IL-8 (proinflammatory cytokine) is induced in cells not belonging to the immune system, which stably express TLR-9 (Hemmi H et al. , 2000 Nature. 7 , 408 (6813) p. 740-745).

La inducción de citoquinas proinflamatorias y/o interferón (IFN) por la transfección o la administración in vivo de ácidos nucleicos pueden influir de manera significativa en las aplicaciones ex vivo o in vivo de estas estrategias de inactivación de la expresión génica o terapéuticas, debido a los efectos inespecíficos asociados con la respuesta del sistema interferón y/o a la toxicidad relacionada con la respuesta inflamatoria independiente de interferón desencadenada por la liberación de citoquinas proinflamatorias. Por ello, es recomendable, para cualquier ácido nucleico, que se esté utilizando con fines de inhibición de la expresión génica o terapéutica, mediante algún método eficaz, determinar si se produce o no la activación de la respuesta interferón y la detección de la expresión de citoquinas proinflamatorias. Esta comprobación es esencial para asignar inequívocamente a un determinado ácido nucleico un efecto inhibidor específico o terapéutico.Induction of proinflammatory cytokines and / or interferon (IFN) by transfection or in vivo administration of nucleic acids can significantly influence the ex vivo or in vivo applications of these gene expression or therapeutic inactivation strategies, due to the nonspecific effects associated with the interferon system response and / or toxicity related to the interferon independent inflammatory response triggered by the release of proinflammatory cytokines. Therefore, it is recommended, for any nucleic acid, that is being used for the purpose of inhibiting gene or therapeutic expression, by some effective method, to determine whether or not the activation of the interferon response occurs and the detection of the expression of proinflammatory cytokines. This check is essential to unequivocally assign a specific or therapeutic inhibitory effect to a particular nucleic acid.

La activación del interferón implica la inducción de más de 300 genes estimulados por interferón (ISGs). La forma de saber si existe o no activación de la respuesta del interferón es analizando los niveles de los genes o proteínas inducidos por dicha respuesta. El desarrollo de kits comerciales proporciona un procedimiento para evaluar la existencia o no de efectos no específicos de activación de la respuesta dependiente de interferón, analizando los niveles de algunas proteínas (mediante análisis de western o Elisa) o genes (mediante PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction) que son inducidos como consecuencia de la activación del sistema del interferón.Interferon activation involves the induction of more than 300 interferon stimulated genes (ISGs). The way of knowing whether or not there is activation of the response of the interferon is analyzing the levels of genes or proteins induced by said response. The development of commercial kits provides a procedure to assess the existence or not of non-specific effects of activating the response dependent on interferon, analyzing the levels of some proteins (by Western or Elisa analysis) or genes (by PCR) Polymerase Chain Reaction) that are induced as a result of the Interferon system activation.

Actualmente sólo existe un kit en el mercado capaz de detectar mediante RT-PCR si pequeños siRNAs pueden afectar la respuesta dependiente de interferón, analizando, mediante dos pasos sucesivos, la expresión de los genes OAS1, OAS2, MX1, IFITM1 e ISGF\gamma (System biosciences "Interferón Response Detection Kit for validation of siRNA experiments" (Cat. #SI300A-1) User Manual).There is currently only one kit in the market able to detect by RT-PCR if small siRNAs can affect the interferon-dependent response, analyzing, through two successive steps, the expression of genes OAS1, OAS2, MX1, IFITM1 and ISGF? (System biosciences "Interferon Response Detection Kit for validation of siRNA experiments "(Cat. # SI300A-1) User Manual).

La RT-PCR es la técnica más sensible que existe, para determinar la presencia o ausencia de un determinado RNA molde en una mezcla. La metodología usada para realizar una RT-PCR es realizar una reacción RT bajo óptimas condiciones y luego usar una fracción de la misma como molde para realizar una PCR convencional en un tubo diferente. Este procedimiento ha sido denominado RT-PCR en dos pasos o en dos tubos. Sin embargo, otra posibilidad más sencilla, es añadir todos los componentes necesarios para la RT y la PCR en un mismo tubo para realizar dichas reacciones en un solo paso y sin interrupción. Este procedimiento más simple se denomina RT-PCR en un solo paso o en un solo tubo y decrece considerablemente la probabilidad de la contaminación debida a la manipulación durante el proceso. Esta técnica monoespecífica permite la detección de un RNA diana, requiriendo, por tanto, tantas reacciones como número de RNAs queramos detectar.RT-PCR is the most technique sensitive that exists, to determine the presence or absence of a certain RNA template in a mixture. The methodology used to performing an RT-PCR is to perform a low RT reaction optimal conditions and then use a fraction of it as a mold to perform a conventional PCR in a different tube. This procedure has been called RT-PCR in two steps or in two tubes. However, another simpler possibility is add all the necessary components for RT and PCR in a same tube to perform these reactions in one step and without interruption. This simpler procedure is called RT-PCR in a single step or in a single tube and decreases considerably the probability of contamination due to handling during the process. This monospecific technique allows the detection of a target RNA, therefore requiring so many reactions as number of RNAs we want to detect.

Por otro lado, la mRT-PCR no sólo posee la sensibilidad de la técnica RT-PCR sino que además permite la detección y cuantificación simultánea de dos o más genes diana de una muestra de RNA en una misma reacción haciendo que el procedimiento sea mucho más rápido, de menor coste, y más reproducible debido a que exige una menor manipulación con lo que se minimizan errores y evita contaminaciones en este paso (Koch, 2004. Nat Rev Drug Discov, Vol. 3, 749-761). Sin embargo, debido a la complejidad que supone esta técnica a la hora de encontrar una combinación de cebadores específica que permita la amplificación simultánea de los genes seleccionados para la detección, actualmente sólo se dispone de un kit comercial basado en la mRT-PCR (Hemavision-7 System DNA Technology A/S, Aarhus, Denmark) de aplicación rutinaria en el diagnóstico molecular hematopatológico, el cual detecta simultáneamente las siete translocaciones más frecuente en la leucemia. Un estudio científico demostró una eficacia del 100% de este kit en el análisis de muestras de pacientes (Salto-tellez et al., 2003. Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 5, No. 4, 231-236).On the other hand, mRT-PCR not only has the sensitivity of the RT-PCR technique but also allows the simultaneous detection and quantification of two or more target genes of an RNA sample in the same reaction making the procedure much more fast, lower cost, and more reproducible because it requires less manipulation which minimizes errors and prevents contamination in this step (Koch, 2004. Nat Rev Drug Discov, Vol. 3, 749-761). However, due to the complexity of this technique when it comes to finding a specific primer combination that allows simultaneous amplification of the genes selected for detection, currently there is only one commercial kit based on the mRT-PCR (Hemavision) -7 System DNA Technology A / S, Aarhus, Denmark) for routine application in hematopathological molecular diagnosis, which simultaneously detects the seven most frequent translocations in leukemia. A scientific study demonstrated 100% efficacy of this kit in the analysis of patient samples (Salto-tellez et al. , 2003. Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 5, No. 4, 231-236).

También se debe tener en cuenta que la sensibilidad de las diferentes líneas celulares a la activación de genes inducidos en respuesta a la activación del sistema del interferón puede variar significativamente. El tipo celular, las condiciones de crecimiento y el número de pases pueden afectar la susceptibilidad, nivel y extensión de la activación de la respuesta del interferón. Por tanto, cuanto mayor sea el número de genes o proteínas analizados y cuanto más sensibles sean estos genes a la estimulación, mayor será la probabilidad de asegurarnos si existe o no una activación del interferón.It should also be noted that the sensitivity of different cell lines to the activation of Induced genes in response to system activation Interferon can vary significantly. The cell type, the growth conditions and the number of passes can affect the susceptibility, level and extent of response activation of interferon. Therefore, the higher the number of genes or analyzed proteins and the more sensitive these genes are to the stimulation, the greater the probability of making sure there is or not an activation of interferon.

A todos estos factores, hay que añadir que, además de respuestas dependientes de interferón también se pueden inducir respuestas inflamatorias que inducen la producción de citoquinas proinflamatorias como por ejemplo IL-8, independientes del sistema interferón.To all these factors, we must add that, In addition to interferon-dependent responses you can also induce inflammatory responses that induce the production of proinflammatory cytokines such as IL-8, independent of the interferon system.

En este contexto, es necesario desarrollar un método capaz de identificar de una manera reproducible, rápida y eficaz cualquier respuesta inmunológica asociada con la introducción de ácidos nucleicos y otros productos en los distintos tipos de líneas celulares usadas en tratamientos, como por ejemplo, la terapia génica.In this context, it is necessary to develop a method capable of identifying in a reproducible, fast and effective any immune response associated with the introduction of nucleic acids and other products in different types of cell lines used in treatments, such as the gene therapy.

Description of the invention

La presente invención se refiere a una combinación de cebadores y a un método para la detección y/o cuantificación de la activación del interferón y la respuesta inflamatoria independiente de interferón. La amplificación se realiza mediante RT-PCR (del inglés Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) multiplex (mRT-PCR) donde los cebadores empleados amplifican simultáneamente los genes OAS2, ISG56, IL-8 e IFN\alpha o IFN\beta. Además, la presente invención incluye un kit con la combinación de los cebadores mencionados y otros componentes.The present invention relates to a combination of primers and a method for the detection and / or quantification of interferon activation and the interferon independent inflammatory response. The amplification is performed by RT-PCR (from Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ) multiplex (mRT-PCR) where the primers used simultaneously amplify the OAS2, ISG56, IL-8 and IFN? Or IFN? Genes. In addition, the present invention includes a kit with the combination of the mentioned primers and other components.

La presente invención proporciona, por tanto, un procedimiento capaz de identificar de forma simultánea y en un solo paso, genes que se asocian tanto con la activación de interferón como con la respuesta inflamatoria independiente de interferón, basado en la técnica de mRT-PCR utilizando para ello una combinación de cebadores específica.The present invention therefore provides a procedure capable of identifying simultaneously and in a single step, genes that are associated with both interferon activation as with the interferon independent inflammatory response, based on the mRT-PCR technique using it a specific combination of primers.

El método aquí descrito utiliza una combinación de cebadores definida que proporcionan la ventaja de analizar simultáneamente, en un sólo paso, los niveles de expresión relativa de tres genes implicados en la respuesta mediada por interferón (OAS2, ISG56 e IFN\alpha o IFN\beta), así como del gen de la citoquina proinflamatoria, la interleuquina 8 (IL-8), y de un control interno, reduciendo considerablemente el riesgo de contaminación.The method described here uses a combination of defined primers that provide the advantage of analyzing simultaneously, in a single step, relative expression levels of three genes involved in the interferon-mediated response (OAS2, ISG56 and IFN? Or IFN?), As well as the gene of the proinflammatory cytokine, interleukin 8 (IL-8), and of an internal control, reducing considerably the risk of contamination.

Aunque el número de genes que podrían servir de candidatos y, por tanto, el número de combinaciones de cebadores a utilizar para llevar a cabo de la detección por mRT-PCR es muy amplio, no todas estas combinaciones son posibles, así, por ejemplo se comprobó que si se incluía el gen OAS-1, de características similares a OAS-2, los resultados no eran los correctos en todos los casos, de igual forma se tuvieron que ensayar distintas parejas de cebadores para cada uno de los genes hasta conseguir los resultados esperados, lo que pone de manifiesto la complejidad que requiere encontrar al combinación de cebadores adecuadas para conseguir analizar el efecto inductor de la respuesta del interferón y la citoquina proinflamatoria IL-8 que los distintos tipos de ácidos nucleicos u otras moléculas utilizados, por ejemplo, con fines terapéuticos, son capaces de provocar en los distintos tipos celulares.Although the number of genes that could serve as candidates and therefore the number of combinations of primers to use to carry out the detection by mRT-PCR is very broad, not all of these combinations are possible, so, for example it was found that if the gene was included OAS-1, with characteristics similar to OAS-2, the results were not correct at all In the same way, different couples had to be tested of primers for each of the genes until the expected results, which highlights the complexity that requires finding the right combination of primers to get to analyze the inducing effect of the interferon response and the IL-8 proinflammatory cytokine that different types of nucleic acids or other molecules used, for example, for therapeutic purposes, they are capable of causing different cell types.

Mientras que los genes OAS2, ISG56 e IFN\alpha (o IFN\beta), son tres de los genes de mayor sensibilidad a la inducción por la activación de la respuesta del interferón a ácidos nucleicos, la detección de la citoquina proinflamatoria IL-8 proporciona una gran ventaja adicional a la invención debido a que amplía el espectro de los tipos celulares a los que puede ser aplicado este kit frente a lo ya existente en el estado de la técnica permitiendo determinar si un determinado ácido nucleico u otro producto es inmunoestimulador sin necesidad de utilizar células del sistema inmune, puesto que, como ya se ha comentado anteriormente la IL-8, a diferencia de otras citoquinas, es inducida en células no pertenecientes al sistema inmune.While the OAS2, ISG56 and IFNα genes (or IFN?), are three of the genes most sensitive to induction by activation of the interferon response to acids Nucleic, proinflammatory cytokine detection IL-8 provides a great additional advantage to the invention because it broadens the spectrum of cell types to which can be applied this kit against what already exists in the state of the art allowing to determine if a certain acid nucleic or other product is immunostimulator without the need for use immune system cells, since, as already previously commented on IL-8, unlike other cytokines, is induced in cells not belonging to immune system.

Por tanto, el procedimiento aquí descrito, basado en la mRT-PCR, es útil para analizar la respuesta que provocan en la célula tanto ácidos nucleicos como cualquier otro producto o manipulación celular capaz de inducir en ella una respuesta inmunológica.Therefore, the procedure described here, Based on the mRT-PCR, it is useful for analyzing the response that cause both nucleic acids and any other product or cellular manipulation capable of inducing in She an immune response.

Debido a la complejidad que requiere el método que aquí se propone para dar lugar a una detección efectiva y reproducible en un solo paso de la respuesta inmune que induce un determinado ácido nucleico en una célula, la combinación de cebadores que se emplea es muy específica, de forma que permite la detección simultánea de los 5 genes en una sola reacción. En el apartado de ejemplos de la presente invención se detallan otros parámetros optimizados para llevar a cabo el método como la concentración de Mg^{+2}, la temperatura de anillamiento, el número de ciclos y las cantidades relativas de cada una de las 5 parejas de cebadores que describen el mejor modo de llevar a cabo el método de la invención.Due to the complexity that the method requires which here is proposed to give rise to an effective detection and reproducible in a single step of the immune response that induces a certain nucleic acid in a cell, the combination of primers that are used are very specific, so that it allows Simultaneous detection of the 5 genes in a single reaction. At section of examples of the present invention further details optimized parameters to carry out the method such as Mg + 2 concentration, the banding temperature, the number of cycles and the relative amounts of each of the 5 pairs of primers that describe the best way to carry out the method of the invention

Así, un aspecto de la presente invención se refiere al uso de los cebadores directos SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9 y los cebadores reversos SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 para la detección y/o cuantificación de:Thus, one aspect of the present invention is refers to the use of direct primers SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9 and reverse primers SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 for the detection and / or quantification of:

a.to.: los genes OAS2, ISG56 e IFN\alpha o IFN\beta involucrados en la activación del interferón y,the OAS2, ISG56 and IFN? or IFN? genes involved in the interferon activation and,

b.b.: el gen IL-8 involucrado en la respuesta inflamatoria independiente de interferón producida por la liberación de citoquinas proinflamatorias,he IL-8 gene involved in the inflammatory response interferon independent produced by the release of proinflammatory cytokines,

en una muestra biológica aislada de un sujeto o en un cultivo celular. Preferentemente el sujeto es un mamífero.in an isolated biological sample of a subject or In a cell culture. Preferably the subject is a mammal.

En una realización preferida se usa además el cebador directo SEQ ID NO: 11 y el cebador reverso SEQ ID NO: 12 para la detección y/o cuantificación del gen control GAPDH.In a preferred embodiment, the direct primer SEQ ID NO: 11 and the reverse primer SEQ ID NO: 12 for the detection and / or quantification of the GAPDH control gene.

El término "cebador" tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a un oligonucleótido de secuencia específica y complementaria a una secuencia nucleotídica diana que es capaz de hibridar con esta última y servir como punto de iniciación para una polimerización nucleotídica catalizada por una ARN polimerasa, una ADN polimerasa o una transcriptasa reversa (RT).The term "primer" as used in the present description refers to an oligonucleotide of specific sequence and complementary to a nucleotide sequence target that is able to hybridize with the latter and serve as a point of initiation for a nucleotide polymerization catalyzed by an RNA polymerase, a DNA polymerase or a reverse transcriptase (RT).

Para amplificar un fragmento por PCR son necesarios dos cebadores, uno de ellos se unirá a la hebra molde (cebador directo) y el otro a la hebra complementaria (cebador reverso), en una posición que permita obtener, mediante sucesivas amplificaciones con una enzima ARN/ADN polimerasa termorresistente, un fragmento que pueda ser detectado y/o cuantificado. Un paso previo puede ser la retrotranscripción de la secuencia situada aguas arriba del cebador reverso mediante el empleo de una enzima retrotranscriptasa (RT). Preferentemente, en la presente invención se utiliza la técnica mRT-PCR. Esta técnica consiste en realizar la reacción de RT y la de amplificación por PCR en el mismo paso, de forma que permite analizar fácilmente, en menor tiempo y sin errores debidos a contaminación por manipulación durante el proceso, los tres genes implicados en la respuesta mediada por interferón, el gen de la citoquina proinflamatoria y el control interno.To amplify a fragment by PCR are two primers needed, one of them will join the mold strand (direct primer) and the other to the complementary strand (primer reverse), in a position that allows to obtain, by successive amplifications with a thermo-resistant RNA / DNA polymerase enzyme, a fragment that can be detected and / or quantified. One step previous can be the back transcription of the sequence located waters above the reverse primer by using an enzyme retrotranscriptase (RT). Preferably, in the present invention The mRT-PCR technique is used. This technique consists of in performing the RT reaction and the PCR amplification reaction in the same step, so that you can easily analyze, in less time and without errors due to contamination by manipulation During the process, the three genes involved in the response Interferon-mediated, the pro-inflammatory cytokine gene and the internal control.

Los cebadores que forman parte de los usos descritos, han sido diseñados siguiendo criterios que se detallan en los ejemplos (ver ejemplo 2.1). Mediante estos cebadores es posible detectar tanto los genes que se estimulan si la célula sufre una respuesta mediada por interferón como los que se estimulan si la respuesta de la célula es una respuesta inflamatoria independiente de interferón. Así, los genes que pueden ser detectados son:The primers that are part of the uses described, have been designed following criteria detailed in the examples (see example 2.1). Through these primers it is possible detect both genes that are stimulated if the cell suffers a Interferon-mediated response such as those stimulated if the cell response is an independent inflammatory response of interferon. Thus, the genes that can be detected are:

\bullet?: el gen OAS2, detectado mediante la pareja de cebadores SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2, este gen codifica para una proteína esencial que es inducida por interferón y está implicada en la respuesta inmune innata contra infecciones virales. Estas moléculas activan la RNasa L, dando lugar a la degradación del ARN viral y la inhibición de la replicación viral. Los tres miembros conocidos de esta familia de genes se encuentran en un clúster en el cromosoma 12.the OAS2 gene, detected by primer pair SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2, this gene encodes for an essential protein that is induced by interferon and is involved in the innate immune response against viral infections. These molecules activate RNase L, leading to degradation of the Viral RNA and inhibition of viral replication. The three members acquaintances of this family of genes are found in a cluster in the chromosome 12.

\bullet?: el gen ISG56 o IFIT1, detectado mediante la pareja de cebadores SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4, fuertemente inducido en respuesta a interferón, dsRNAs o infección por virus. En humanos existen cuatro miembros que pertenecen a esta familia de genes: IFIT-1 o ISG56, IFIT-2 o ISG54, IFIT-4 o ISG60 e IFIT-5 o ISG58,the ISG56 or IFIT1 gene, detected via primer pair SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 4, strongly induced in response to interferon, dsRNAs or infection by virus. In humans there are four members that belong to this gene family: IFIT-1 or ISG56, IFIT-2 or ISG54, IFIT-4 or ISG60 e IFIT-5 or ISG58,

\bullet?: el gen IFN\alpha o el gen IFN\beta, detectados mediante la pareja de cebadores SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 8 o la pareja de cebadores SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 10 respectivamente, que constituyen el interferón tipo I. Los interferones de tipo I son una familia de polipéptidos con actividad citoquina que se descubrieron originalmente por su actividad inhibidora en la infección viral de líneas celulares in vitro (Pestka et al, 2004). Dependiendo de la homología de sus secuencias, los interferones de tipo I se clasifican en interferón alfa (IFN\alpha) e interferón beta (IFN\beta), ambos tienen una actividad biológica muy similar siendo ejemplos de la llamada respuesta inmune innata y sus estructuras moleculares son muy parecidas. La función de estas citoquinas es muy importante en la respuesta inmune contra múltiples tipos de infecciones virales, ya que inician mecanismos que activan la muerte inducida por apoptosis de las células infectadas y la inhibición de la replicación viral, a la vez que se favorece la presentación de antígenos. Recientemente, se ha descrito que también llevan a cabo sus funciones mediante la activación directa de células NK, B y T, así como de células dendríticas en la respuesta inmune (Le Bon A et al., 2006; Le Bon A et al., 2003). El IFN\alpha es producido principalmente por los leucocitos infectados por virus, mientras que el IFN\beta es producido por fibroblastos infectados por virus. El IFN\alpha también estimula la síntesis de proteínas clase 1 del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC-I), estas moléculas están presentes en las membranas de todas las células con núcleo y participan en la presentación de antígenos (en particular de antígenos virales) para que sean reconocidos por el sistema inmune y,the IFN? gene or the IFN? gene, detected by the primer pair SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO: 8 or the primer pair SEQ ID NO: 9 / SEQ ID NO: 10 respectively, which constitute the Type I interferon Type I interferons are a family of polypeptides with cytokine activity that were originally discovered by their inhibitory activity in viral infection of cell lines in vitro (Pestka et al , 2004). Depending on the homology of their sequences, type I interferons are classified into interferon alpha (IFN?) And interferon beta (IFN?), Both of which have a very similar biological activity, examples of the so-called innate immune response and their structures Molecular are very similar. The function of these cytokines is very important in the immune response against multiple types of viral infections, since they initiate mechanisms that activate apoptosis-induced death of infected cells and inhibition of viral replication, while promoting presentation of antigens. Recently, it has been described that they also carry out their functions by directly activating NK, B and T cells, as well as dendritic cells in the immune response (Le Bon A et al. , 2006; Le Bon A et al. , 2003). IFN? Is produced primarily by virus-infected leukocytes, while IFN? Is produced by virus-infected fibroblasts. IFNα also stimulates the synthesis of class 1 proteins of the major histocompatibility complex (MHC-I), these molecules are present in the membranes of all nucleus cells and participate in the presentation of antigens (in particular viral antigens) to be recognized by the immune system and,

\bullet?: el gen IL-8, detectado mediante la pareja de cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6, codifica la proteína IL-8 que es una quimioquina de naturaleza proinflamatoria producida por macrófagos y otros tipos de células como fibroblastos, células endoteliales y monocitos, que no se induce en respuesta a interferón. Es un potente factor quimiotáctico de neutrófilos, regula la producción de proteínas de adhesión y la formación de lípidos bioactivos. Amplifica la respuesta inflamatoria local. A través de una cadena de reacciones bioquímicas, IL-8 es secretada actuando como un importante mediador de la respuesta inmune del sistema inmunitario innato.the IL-8 gene, detected by primer pair SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 6, encodes the IL-8 protein which is a chemokine of pro-inflammatory nature produced by macrophages and other types of cells such as fibroblasts, endothelial cells and monocytes, which do not It is induced in response to interferon. It is a powerful factor Neutrophil chemotactic, regulates protein production of Adhesion and formation of bioactive lipids. Amplify the local inflammatory response. Through a chain of reactions biochemistry, IL-8 is secreted acting as a important mediator of the immune response of the immune system innate.

La expresión "detección y/o cuantificación", tal y como se emplea en la descripción de la invención, hace referencia a la detección de la presencia y/o a la medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semicuantitativa o cuantitativa. Preferentemente la detección y/o cuantificación se realiza en cultivos celulares, donde el término "cultivo celular" hace referencia al cultivo de células aisladas. Preferentemente las células proceden de organismos eucariotas pluricelulares, más preferiblemente dichos organismos son mamíferos. Las células pueden proceder, pero sin limitarse, de una muestra biológica aislada, donde la muestra biológica es, pero sin limitarse, un tejido o un fluido biológico como por ejemplo plasma sanguíneo, orina, líquido cefalorraquídeo o pus.The expression "detection and / or quantification ", as used in the description of the invention refers to the presence detection and / or the measurement of the amount or concentration, preferably so semiquantitative or quantitative Preferably detection and / or quantification is performed in cell cultures, where the term "cell culture" refers to cell culture isolated. Preferably the cells come from organisms multicellular eukaryotes, more preferably said organisms are mammals Cells can come, but not limited, from a isolated biological sample, where the biological sample is, but without limited, a tissue or a biological fluid such as plasma blood, urine, cerebrospinal fluid or pus.

Debido a que ácidos nucleicos y otras moléculas usadas como agentes terapéuticos, son capaces de activar el interferón o la respuesta inflamatoria independiente de interferón provocando efectos inespecíficos en las células, resulta necesario evaluar si estas moléculas inducen o no este tipo de respuestas en las células. Por ello, otro aspecto de la presente invención se refiere al método, en adelante primer método de la invención, para determinar la capacidad de un agente para provocar una respuesta inmune que comprende:Because nucleic acids and other molecules used as therapeutic agents, they are able to activate the interferon or the interferon independent inflammatory response causing nonspecific effects on cells, it is necessary evaluate whether or not these molecules induce this type of response in the cells. Therefore, another aspect of the present invention is refers to the method, hereinafter the first method of the invention, for determine the ability of an agent to elicit a response immune comprising:

a.to.: seleccionar un cultivo celular que previamente ha sido tratado con dicho agente,select a cell culture that You have previously been treated with that agent,

b.b.: amplificar de forma simultánea los genes OAS2, ISG56, IL-8 e IFN\alpha o IFN\beta, utilizando los cebadores SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 10 y,simultaneously amplify the OAS2, ISG56, IL-8 and IFN? or IFN? genes, using primers SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 / SEQ ID NO: 10 and,

c.C.: detectar y/o cuantificar los genes OAS2, ISG56, IL-8 e IFN\alpha o IFN\beta, en el cultivo celular seleccionado.detect and / or quantify genes OAS2, ISG56, IL-8 and IFN? Or IFN?, In the selected cell culture.

La expresión "agente", tal y como se emplea en la descripción de la invención, hace referencia a cualquier molécula capaz de activar el interferón o la respuesta inflamatoria independiente de interferón, provocando así una respuesta inmunológica en la célula. A su vez, la expresión "respuesta inmune" o "respuesta inmunológica", según se emplea en la presente descripción hace referencia a la forma en la que el cuerpo reconoce y se defiende de dichos agentes activando el interferón y/o la respuesta inflamatoria independiente de interferón.The expression "agent", as used in the description of the invention, it refers to any molecule capable of activating interferon or inflammatory response interferon independent, thus causing a response Immune in the cell. In turn, the expression "answer immune "or" immune response ", as used in the This description refers to the way in which the body recognizes and defends against said agents by activating interferon and / or the interferon independent inflammatory response.

Los ácidos nucleicos, por ejemplo, se han visto que pueden provocar la inducción del sistema interferón y/o de la respuesta inflamatoria independiente de interferón, desencadenando efectos inespecíficos que pueden afectar sensiblemente a su efectividad como agentes terapéuticos. Además, otros productos o manipulación celular capaces de inducir una respuesta inmunológica en las células también pueden ser detectados.Nucleic acids, for example, have been seen which can cause the induction of the interferon system and / or the interferon independent inflammatory response, triggering nonspecific effects that can significantly affect your effectiveness as therapeutic agents. In addition, other products or cell manipulation capable of inducing an immune response in cells can also be detected.

El agente se puede seleccionar, pero sin limitarse, de entre la lista que comprende: ácidos nucleicos, sustancias transfectantes (como lípidos catiónicos, nanodendrómeros y cualquier otro agente utilizado para introducir ácidos nucleicos en células) y aditivos químicos (como por ejemplo cualquier componente del medio de cultivo o que se añade al mismo para enriquecerlo como fosfato, aminoácidos, entre otros o también cualquier agente químico que pueda acompañar al ácido nucleico o mezcla de transfección como sales). Preferentemente el agente es un ácido nucleico donde este ácido nucleico puede ser, pero sin limitarse, un oligodesoxirribonucleótido, un ssRNA o un dsRNA. Preferentemente el dsRNA es siRNA.The agent can be selected, but without be limited, from the list comprising: nucleic acids, Transfectant substances (such as cationic lipids, nanodendromers and any other agent used to introduce nucleic acids in cells) and chemical additives (such as any component of the culture medium or that is added thereto to enrich it as phosphate, amino acids, among others or also any chemical agent that may accompany the nucleic acid or transfection mixture as salts). Preferably the agent is a nucleic acid where this nucleic acid can be, but without limited, an oligodeoxyribonucleotide, an ssRNA or a dsRNA. Preferably the dsRNA is siRNA.

Por tanto, mediante este primer método de la invención se obtienen datos útiles para evaluar si, por ejemplo pero sin limitarse, un ácido nucleico se podría utilizar en terapia génica sin producir efectos secundarios relacionados con la estimulación del interferón y/o la respuesta inflamatoria independiente de interferón en el sujeto, confirmando de esta manera que los datos que se obtienen al someter a las células a distintos tratamientos, como por ejemplo terapia génica, que implican la introducción de ácidos nucleicos u otras moléculas en las células, son específicos de tales tratamientos y no debidos a una respuesta mediada por la activación de interferón o la respuesta inflamatoria independiente de interferón.Therefore, by this first method of invention useful data are obtained to evaluate whether, for example but without being limited, a nucleic acid could be used in therapy gene without producing side effects related to interferon stimulation and / or inflammatory response independent of interferon in the subject, confirming in this way that the data obtained by subjecting the cells to different treatments, such as gene therapy, which involve introduction of nucleic acids or other molecules into cells, they are specific to such treatments and not due to a response mediated by interferon activation or inflammatory response interferon independent.

Para llevar a cabo la detección y/o cuantificación de la activación del interferón y la respuesta inflamatoria según se describe en el paso (b) del primer método de la invención, se llevan a cabo amplificaciones de forma simultánea utilizando los pares de cebadores SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 (cebador directo/cebador reverso); SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4 (cebador directo/cebador reverso); SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6 (cebador directo/cebador reverso) y o bien SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 8 (cebador directo/cebador reverso) o bien SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 10 (cebador directo/cebador reverso). En una realización preferida, además también se lleva a cabo la amplificación del gen control GAPDH utilizando los pares de cebadores SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO: 12 (cebador directo/cebador reverso).To carry out the detection and / or quantification of interferon activation and response inflammatory as described in step (b) of the first method of the invention, amplifications are carried out simultaneously using primer pairs SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2 (primer direct / reverse primer); SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 4 (primer direct / reverse primer); SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 6 (primer direct / reverse primer) and either SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO: 8 (primer direct / reverse primer) or SEQ ID NO: 9 / SEQ ID NO: 10 (primer direct / reverse primer). In a preferred embodiment, in addition GAPDH control gene amplification is also carried out using primer pairs SEQ ID NO: 11 / SEQ ID NO: 12 (direct primer / reverse primer).

En primer lugar se sintetiza una secuencia de ADN codificante (cDNA) de la región aguas arriba del lugar de hibridación del cebador reverso con el ARN del paso (a) mediante la reacción de retrotranscripción (RT). La síntesis de cDNA se realiza por medio de cualquier enzima retrotranscriptasa o transcriptasa reversa (RT) que utiliza el ARN aislado de la muestra biológica y los cebadores reversos SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 y o bien SEQ ID NO: 8 o bien SEQ ID NO: 10, además del cebador reverso SEQ ID NO: 12, que harán de iniciadores para obtener el cDNA de cadena simple o monocatenario complementario a la secuencia de ARN del gen correspondiente. En segundo lugar se obtienen fragmentos de ADN bicatenarios amplificados mediante PCR utilizando como molde el cDNA descrito y los pares de cebadores SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6 y o bien SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 8 o bien SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 10, además del par de cebadores SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO: 12. Este tipo de PCR se denomina RT-PCR. Debido a que, preferentemente la detección y/o cuantificación simultánea de los genes diana se realiza mediante mRT-PCR, en un solo paso o un solo tubo y sin interrupción, todos los componentes necesarios para ambos procesos (RT y PCR) son añadidos al inicio. Para la síntesis del cDNA y las posteriores amplificaciones es necesaria la presencia de entre otros componentes: ADN polimerasa termorresistente, cloruro de magnesio en una concentración determinada y tampones que creen las condiciones físico-químicas adecuadas para que funcionen todos los componentes y se consiga con ello la amplificación (ver ejemplo 2.1). De esta forma se obtiene una mezcla de reacción que contiene los fragmentos amplificados de cada uno de los genes (si la muestra los contiene), para seguidamente poder ser detectados y/o cuantificados.First, a sequence of Coding DNA (cDNA) from the upstream region of the site of hybridization of the reverse primer with the RNA of step (a) by retrotranscription reaction (RT). CDNA synthesis is performed by means of any enzyme retrotranscriptase or transcriptase reverse (RT) that uses RNA isolated from the biological sample and reverse primers SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 and o either SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, in addition to the reverse primer SEQ ID NO: 12, which will act as initiators to obtain the cDNA of single or single stranded chain complementary to the RNA sequence of the corresponding gene. Secondly, fragments of Double-stranded DNA amplified by PCR using as template the cDNA described and primer pairs SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 6 and or SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 / SEQ ID NO: 10, in addition to the pair of primers SEQ ID NO: 11 / SEQ ID NO: 12. This type of PCR is called RT-PCR. Because, preferably the Simultaneous detection and / or quantification of target genes is performed using mRT-PCR, in a single step or a single tube and without interruption, all the necessary components for both processes (RT and PCR) are added at the beginning. For the synthesis of cDNA and subsequent amplifications the presence of among other components: heat resistant DNA polymerase, chloride magnesium in a given concentration and buffers that create the adequate physical-chemical conditions so that all the components work and with it the amplification (see example 2.1). In this way a mixture is obtained reaction containing the amplified fragments of each of the genes (if the sample contains them), to then be able to be detected and / or quantified.

Para determinar si ácidos nucleicos y otras moléculas usadas como agentes terapéuticos son capaces de activar el interferón y/o la respuesta inflamatoria independiente de interferón se puede además comparar la desviación de los resultados obtenidos en el apartado (c) del primer método de la invención con respecto a unos controles o valores de referencia. En este caso, los controles son aquellas amplificaciones que proceden de muestras no tratadas con el agente terapéutico (ácidos nucleicos u otras moléculas) y que por tanto, los genes involucrados en la activación del interferón y/o la respuesta inflamatoria independiente de interferón están ausentes (controles negativos que corresponden con los carriles control 1, 4, 6 y 8 en la Figura 1). La medida de la desviación de las amplificaciones obtenidas de las muestras problema respecto de los controles, puede llevarse a cabo por ejemplo, pero sin limitarse, mediante comparación de la presencia o ausencia de bandas. Esta desviación puede ser atribuida a la presencia o ausencia de los genes OAS2, ISG56, IL-8 y/o IFN\alpha o IFN\beta en las muestras analizadas.To determine whether nucleic acids and others molecules used as therapeutic agents are able to activate the interferon and / or the inflammatory response independent of interferon you can also compare the deviation of the results obtained in section (c) of the first method of the invention with respect to controls or reference values. In this case, the controls are those amplifications that come from untreated samples with the therapeutic agent (nucleic acids or other molecules) and that therefore, the genes involved in the activation of interferon and / or the interferon independent inflammatory response are absent (negative controls that correspond to lanes control 1, 4, 6 and 8 in Figure 1). The deviation measure of the amplifications obtained from the problem samples with respect to controls, can be carried out for example, but without be limited, by comparing the presence or absence of bands. This deviation can be attributed to the presence or absence of OAS2, ISG56, IL-8 and / or genes IFN? Or IFN? In the analyzed samples.

El método además incluye un control interno (el gen de GAPDH) que indica que las reacciones se han realizado en condiciones óptimas y que no hay activación del interferón ni liberación de IL-8. Este control interno es amplificado gracias al par de cebadores SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO: 12.The method also includes an internal control (the GAPDH gene) which indicates that the reactions have been performed in optimal conditions and that there is no activation of interferon or IL-8 release. This internal control is amplified thanks to the pair of primers SEQ ID NO: 11 / SEQ ID NO: 12.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de obtención de datos útiles, en adelante segundo método de la invención, para la detección y/o cuantificación de la activación del interferón y de la respuesta inflamatoria independiente de interferón que comprende:Another aspect of the present invention relates to to a method of obtaining useful data, hereinafter second method of the invention, for the detection and / or quantification of the interferon activation and inflammatory response interferon independent comprising:

a.to.: obtener una muestra biológica aislada de un sujeto o seleccionar un cultivo celular,obtain an isolated biological sample of a subject or select a cell culture,

c.C.: detectar y/o cuantificar los genes OAS2, ISG56, IL-8 e IFN\alpha o IFN\beta, en la muestra biológica aislada o en el cultivo celular seleccionado.detect and / or quantify genes OAS2, ISG56, IL-8 and IFN? Or IFN?, In the biological sample isolated or in cell culture selected.

La muestra biológica es aislada de un sujeto, donde el sujeto es preferiblemente un mamífero y más preferiblemente humano o animal, para llevar a cabo el resto de pasos del método "in vitro". La muestra biológica puede proceder de cultivos celulares, tejidos y/o fluidos biológicos del sujeto, donde los fluidos biológicos se seleccionan, pero sin limitarse de la lista que comprende plasma sanguíneo, orina, líquido cefalorraquídeo o pus, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia.The biological sample is isolated from a subject, where the subject is preferably a mammal and more preferably human or animal, to carry out the remaining steps of the " in vitro " method. The biological sample may come from cell cultures, tissues and / or biological fluids of the subject, where the biological fluids are selected, but not limited to the list comprising blood plasma, urine, cerebrospinal fluid or pus, obtained by any method known by a skilled.

Otro aspecto de la presente invención, se refiere al método, en adelante tercer método de la invención, de obtención de datos útiles para diagnosticar una respuesta inmunológica en un sujeto o cultivo celular, es decir, se refiere al método de diagnóstico de la respuesta inmunológica en un sujeto o cultivo celular que comprende además de los pasos (a), (b) y (c) del segundo método de la invención:Another aspect of the present invention is refers to the method, hereinafter third method of the invention, of Obtain useful data to diagnose a response immunological in a subject or cell culture, that is, refers to the method of diagnosis of the immune response in a subject or cell culture which comprises in addition to steps (a), (b) and (c) of second method of the invention:

d.d.: comparar los resultados obtenidos en (c) con unos valores de referencia para encontrar una desviación significativa y,compare the results obtained in (c) with reference values to find a deviation significant and,

e.and.: atribuir la desviación a la presencia de respuesta inmunológica en el sujeto o cultivo celular.attribute the deviation to the presence of immune response in the subject or cell culture.

Para encontrar una desviación significativa, se compara la desviación de los resultados obtenidos en el apartado (c) con respecto a unos controles o valores de referencia. Los controles o valores de referencia son, pero sin limitarse, aquellas muestras que no presentan genes involucrados en la activación del interferón o la respuesta inflamatoria independiente de interferón. La medida de la desviación de las amplificaciones obtenidas de las muestras problema respecto de los controles, puede llevarse a cabo por ejemplo, pero sin limitarse, mediante comparación de la presencia o ausencia de bandas. Esta desviación puede ser atribuida a la presencia o ausencia de los genes OAS2, ISG56, IL-8 y/o IFN\alpha o IFN\beta en las muestras analizadas.To find a significant deviation, you compare the deviation of the results obtained in section (c) with respect to controls or reference values. The controls or reference values are, but not limited to, those samples that do not have genes involved in the activation of interferon or the interferon independent inflammatory response. Measure of the deviation of the amplifications obtained from the samples problem regarding controls, can be carried out by example, but not limited, by comparing the presence or absence of bands. This deviation can be attributed to the presence or absence of OAS2, ISG56, IL-8 genes and / or IFN? or IFN? in the samples analyzed.

En una realización preferida del segundo y tercer método de la invención además se amplifica el gen control GAPDH utilizando los cebadores SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12. Como hemos comentado anteriormente, la amplificación se realiza mediante mRT-PCR.In a preferred embodiment of the second and third method of the invention furthermore the control gene is amplified GAPDH using primers SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12. As we have commented previously, the amplification is done by mRT-PCR.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit, en adelante kit de la invención, que comprende los cebadores directos SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9 y los cebadores reversos SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10.Another aspect of the present invention relates to to a kit, hereinafter kit of the invention, comprising the direct primers SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9 and reverse primers SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10.

En una realización preferida, el kit de la invención además comprende el cebador directo SEQ ID NO: 11 y el cebador reverso SEQ ID NO: 12 que permiten la detección de un control interno necesario para comprobar que las reacciones se han realizado en condiciones óptimas y que no hay activación del interferón ni liberación de IL-8.In a preferred embodiment, the kit of the The invention further comprises the direct primer SEQ ID NO: 11 and the reverse primer SEQ ID NO: 12 that allow the detection of a internal control necessary to verify that the reactions have performed under optimal conditions and that there is no activation of the interferon or release of IL-8.

Además de los aspectos anteriormente descritos, el kit puede incluir los reactivos necesarios para la amplificación por mRT-PCR: ADN polimerasa, retrotranscriptasa, nucleótidos, magnesio y otros componentes. También podría incluir instrucciones para llevar a cabo la amplificación por medio de las condiciones adecuadas como por ejemplo concentración de los cebadores, temperatura de alineamiento, hibridación, elongación, número de ciclos de amplificación, etc.In addition to the aspects described above, the kit may include the reagents necessary for amplification by mRT-PCR: DNA polymerase, retrotranscriptase, nucleotides, magnesium and other components. Could also include instructions for carrying out the amplification by means of suitable conditions such as concentration of primers, alignment temperature, hybridization, elongation, number of amplification cycles, etc.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del kit de la invención para la obtención de datos útiles para la detección y/o cuantificación de la activación del interferón y de la respuesta inflamatoria independiente de interferón en una muestra biológica aislada de un sujeto o en un cultivo celular. La detección y/o cuantificación se realiza preferentemente en un cultivo celular.Another aspect of the present invention relates to to the use of the kit of the invention to obtain useful data for the detection and / or quantification of interferon activation and of the independent inflammatory response of interferon in a biological sample isolated from a subject or in a cell culture. The detection and / or quantification is preferably performed in a cell culture.

Y, finalmente, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del kit de la invención para determinar la capacidad de un agente para provocar una respuesta inmune en un cultivo celular que previamente ha sido tratado con dicho agente.And finally another aspect of the present invention refers to the use of the kit of the invention to determine the ability of an agent to elicit an immune response in a cell culture that has previously been treated with said agent.

En una realización preferida, el agente es preferentemente un ácido nucleico donde dicho ácido nucleico es, pero sin limitarse, un oligodesoxirribonucleótido, un ssRNA o un dsRNA, donde preferentemente el dsRNA es siRNA.In a preferred embodiment, the agent is preferably a nucleic acid where said nucleic acid is, but without limitation, an oligodeoxyribonucleotide, an ssRNA or a dsRNA, where preferably the dsRNA is siRNA.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants not they intend to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be partly detached of the description and in part of the practice of the invention. The following figures and examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.

Description of the figures

Fig. 1. Muestra los resultados obtenidos por mRT-PCR en muestras de RNA total extraídas de diferentes líneas celulares (293T, 293T/TLR-9, U87CD4CXCR4 y Namalwa) tratadas con distintos tipos de ácidos nucleicos (ssRNA, dsRNA, siRNA y OD2006). Fig. 1. Shows the results obtained by mRT-PCR in samples of total RNA extracted from different cell lines (293T, 293T / TLR-9, U87CD4CXCR4 and Namalwa) treated with different types of nucleic acids (ssRNA, dsRNA, siRNA and OD2006 ).

Carril 1, Línea celular 293T sin transfectar (control). Carril 2, Línea celular 293T transfectada con 0,5 \mug de ssRNA. Carril 3, Línea celular 293T transfectada con 0,5 \mug de dsRNA. Carril 4, Línea celular 293T expresando establemente el TLR9 (Control). Carril 5, Línea celular 293T expresando establemente TLR9, estimulada con 2,5 \muM de CpG ODN de clase B (OD2006). Carril 6, Línea celular Namalwa sin estimular (control). Carril 7, Línea Namalwa estimulada con 2,5 \muM de CpG ODN de clase B (OD2006). Carril 8, Línea celular U87CD4CXCR4 sin transfectar (control). Carril 9, Línea celular U87CD4CXCR4 transfectada con 0,5 \mug de ssRNA. Carril 10, Marcador de tamaño molecular.Lane 1, 293T cell line without transfecting (control). Lane 2, 293T cell line transfected with 0.5 µg from ssRNA. Lane 3, 293T cell line transfected with 0.5 µg from dsRNA. Lane 4, 293T cell line stably expressing the TLR9 (Control). Lane 5, 293T cell line stably expressing TLR9, stimulated with 2.5 µM CpG ODN class B (OD2006). Lane 6, Namalwa cell line without stimulation (control). Lane 7, Namalwa line stimulated with 2.5 µM CpG ODN class B (OD2006). Lane 8, U87CD4CXCR4 cell line without transfecting (control). Lane 9, U87CD4CXCR4 cell line transfected with 0.5 ssRNA's mug. Lane 10, molecular size marker.

Examples

La invención describe el desarrollo de un procedimiento basado en la técnica de mRT- PCR que permite analizar fácilmente y en un solo paso los niveles de expresión relativa de tres genes implicados en respuesta mediada por interferón (OAS2, ISG56 y IFN\alpha o IFN\beta), así como el gen de la citoquina proinflamatoria, (IL-8). El análisis de todos estos genes más un control interno se realiza simultáneamente en una única reacción, lo cual reduce considerablemente el riesgo de contaminación.The invention describes the development of a procedure based on the mRT-PCR technique that allows analyzing easily and in one step the relative expression levels of three genes involved in interferon-mediated response (OAS2, ISG56 and IFN? Or IFN?), As well as the cytokine gene proinflammatory, (IL-8). The analysis of all these genes plus an internal control is performed simultaneously in a single reaction, which greatly reduces the risk of pollution.

A lo largo de los distintos ejemplos se demuestra que este procedimiento es útil para analizar el efecto que puede tener un determinado ácido nucleico sobre la activación del interferón y la respuesta inflamatoria independiente de interferón producida por la liberación de citoquinas proinflamatorias. Igualmente se pueden detectar las respuestas inmunes provocadas por cualquier otro producto o manipulación celular, no sólo los ácidos nucleicos.Throughout the different examples, demonstrates that this procedure is useful for analyzing the effect that may have a certain nucleic acid upon activation of interferon and the interferon independent inflammatory response produced by the release of proinflammatory cytokines. You can also detect immune responses caused by any other product or cellular manipulation, not just acids nucleic

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ejemplos que describen el diseño de los cebadores de la invención y el método que permite la detección de la activación del interferón y la respuesta inflamatoria independiente de interferón en diferentes situaciones de células transfectadas con ssRNA, dsRNA y/o incubadas con ODN de clase B.The invention will be illustrated below through some examples that describe the design of the primers of the invention and the method that allows the detection of activation of interferon and the inflammatory response independent of interferon in different situations of cells transfected with ssRNA, dsRNA and / or incubated with class B ODN.

Además, también se muestra cómo la utilización de la técnica mRT-PCR pone de manifiesto la especificidad y efectividad del kit propuesto en la invención para evaluar si un determinado ácido nucleico es capaz de inducir una respuesta inmunológica en la célula donde es introducido.In addition, it also shows how the use of the mRT-PCR technique reveals the specificity and effectiveness of the kit proposed in the invention for evaluate whether a particular nucleic acid is capable of inducing a Immune response in the cell where it is introduced.

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones de la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.The following specific examples to be provided in this patent document serve to illustrate the nature of the present invention. These examples are included For illustrative purposes only and should not be construed as limitations of the invention claimed herein. Therefore, the Examples described below illustrate the invention without limiting the field of application of it.

Example 1 Cell lines, transfections and RNA extraction 1.1 Cell lines

Las líneas celulares 293T, obtenida de células embrionarias humanas de riñon y 293T expresando establemente el TLR-9 (293T/TLR-9), fueron crecidas en medio DMEM (de las siglas en inglés Dubelcco's Modified Eagle Medium) suplementado con 10% de suero bovino inactivado, 50 \mug/ml de gentamicina, 0,11 mg/ml de piruvato sódico y 2 mM de L-glutamina. La línea U87CD4CXCR4, procedente de células de astroglioma expresando el receptor CD4 y el correceptor CXCR4, fue crecida en el mismo medio que el anterior, pero adicionalmente suplementado con 300 \mug/ml de G418 (Geneticina (Gico BRL Life Technologies Inc.)) y con 1 \mug/ml de puromicina. La línea celular Namalwa, línea de células B humana de linfoma de Burkit, fue crecida en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino, 2 mM de L-glutamina y 50 \mug/ml de gentamicina. Todas las líneas celulares fueron incubadas a 37ºC, en una atmósfera húmeda conteniendo 5% de CO_{2}.293T cell lines, obtained from human embryonic kidney cells and 293T stably expressing TLR-9 (293T / TLR-9), were grown in DMEM medium ( Dubelcco's Modified Eagle Medium ) supplemented with 10% serum inactivated cattle, 50 µg / ml gentamicin, 0.11 mg / ml sodium pyruvate and 2 mM L-glutamine. The U87CD4CXCR4 line, derived from astroglioma cells expressing the CD4 receptor and the CXCR4 correceptor, was grown in the same medium as above, but additionally supplemented with 300 µg / ml of G418 (Geneticin ( Gico BRL Life Technologies Inc. )) and with 1 µg / ml puromycin. The Namalwa cell line, Burkit lymphoma human B cell line , was grown in RPMI-1640 medium supplemented with 10% bovine serum, 2 mM L-glutamine and 50 µg / ml gentamicin. All cell lines were incubated at 37 ° C, in a humid atmosphere containing 5% CO2.

1.1 Transfections

Las células adherentes 293T, 293T/TLR-9 y U87CD4CXCR4 fueron cosechadas mediante tripsinización (0.25% tripsina, 0.02% EDTA) y sembradas en placa de 24 pocillos a una densidad celular de 8-10x10^{4} células por pocillo mientras que las Namalwa fueron sembradas a una densidad de 5x10^{5} células/ml. Las placas fueron incubadas 24 horas a 37ºC y 5% de CO_{2} antes de transfectarlas o tratarlas.293T adherent cells, 293T / TLR-9 and U87CD4CXCR4 were harvested by trypsinization (0.25% trypsin, 0.02% EDTA) and plated on 24 wells at a cell density of 8-10x10 4 cells per well while the Namalwa were seeded at a density of 5x105 cells / ml. The plates were incubated 24 hours at 37 ° C and 5% CO2 before transfecting them or treat them

Las células 293T fueron transfectadas usando como agente trasfectante la lipofectamina 2000 (Invitrogen) con un siRNA sintético denominado anti-PBS siRNA (SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14) y un ssRNA (SEQ ID NO: 15 ) de 57 ribonucleótidos sintetizados in vitro con la T7 RNA polimerasa (Promega), un dsRNA sintético poli I:C (Sigma) (RNA sintético de cadena doble formado por un polímero de ácido polinosínico y otro polímero de ácido citidílico). Las células U87CD4CXCR4 fueron transfectadas con un 0,5 \mug de ssRNA (SEQ ID NO: 15) y las 293T/TLR-9 con 2,5 \muM del oligonucleótido fosforotioato OD2006 (SEQ ID NO: 16) (Invivogen) perteneciente a la clase B usando como agente transfectante Fugene HD (Roché). Las células Namalwa fueron incubadas con 2,5 \muM del oligonucleótido fosforotioato OD2006 (SEQ ID NO: 16) (Invivogen).293T cells were transfected using lipofectamine 2000 ( Invitrogen ) with a synthetic siRNA called anti-PBS siRNA (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14) and a ssRNA (SEQ ID NO: 15) of 57 ribonucleotides as a transfecting agent synthesized in vitro with T7 RNA polymerase ( Promega ), a synthetic dsRNA poly I: C ( Sigma ) (synthetic double-stranded RNA formed by a polyinosinic acid polymer and another citidyl acid polymer). U87CD4CXCR4 cells were transfected with 0.5 µs of ssRNA (SEQ ID NO: 15) and 293T / TLR-9 with 2.5 µM of oligonucleotide phosphorothioate OD2006 (SEQ ID NO: 16) ( Invivogen ) belonging to class B using Fugene HD ( Roché ) as a transfectant. Namalwa cells were incubated with 2.5 µM of the OD2006 phosphorothioate oligonucleotide (SEQ ID NO: 16) ( Invivogen ).

1.2 RNA extraction

El RNA total de las diferentes líneas celulares fue extraído usando el Trizol (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) siguiendo las indicaciones del propio fabricante. El RNA extraído fue disuelto en 20 \mul de agua estéril y libre de nucleasas. Después del tratamiento con RQ1 DNasa (Promega) la concentración del RNA fue cuantificada usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000. La calidad del RNA fue analizada en un gel de agarosa al 1% en buffer TAE al 0.5 X y también midiendo espectrofotométricamente el ratio OD260/280. El RNA total purificado fue conservado a -80ºC hasta su uso.The total RNA of the different cell lines was extracted using Trizol (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) following the manufacturer's instructions. RNA extracted was dissolved in 20 µl of sterile water and free of nucleases. After treatment with RQ1 DNase (Promega) the RNA concentration was quantified using a spectrophotometer NanoDrop ND-1000. RNA quality was analyzed in a 1% agarose gel in 0.5 X TAE buffer and also measuring the OD260 / 280 ratio spectrophotometrically. Total RNA purified It was stored at -80 until use.

Example 2 Design of the primers of the invention and detection by mRT-PCR 2.1 mRT-PCR

Varios parámetros tales como la concentración de los diferentes cebadores (desde 0.04 a 0.8 \muM), concentración de Mg^{2+} (desde 1 a 5 mM), temperatura de anillamiento (de 50ºC a 60ºC), temperatura de extensión (de 65ºC hasta 72ºC), duración del periodo de extensión (de 30 segundos hasta 5 minutos) y aditivos (BSA de 0.2 a 1.8 \mug/\mul) fueron examinados para establecer las mejores condiciones para la amplificación simultánea de todas las dianas analizadas.Various parameters such as the concentration of the different primers (from 0.04 to 0.8 µM), concentration of Mg 2+ (from 1 to 5 mM), banding temperature (from 50 ° C to 60ºC), extension temperature (from 65ºC to 72ºC), duration of extension period (from 30 seconds to 5 minutes) and additives (BSA from 0.2 to 1.8 / mu) were examined to establish the best conditions for simultaneous amplification of all The targets analyzed.

Para calcular la temperatura de disociación de las diferentes parejas de cebadores y eliminar las posibles interacciones cebador-cebador se utilizó el software Primers 3, para diseñar los cebadores. Para descartar la posibilidad de la existencia de secuencias repetidas a las secuencias dianas dentro del genoma celular a las cuales los cebadores diseñados podrían unirse, los cebadores fueron alineados usando la base de secuencias del National Center for Biotechnology Informtation (NCBI) y la herramienta de alineamiento local (BLAST).To calculate the dissociation temperature of the different pairs of primers and eliminate the possible primer-primer interactions software was used Primers 3, to design the primers. To rule out the possibility from the existence of repeated sequences to the target sequences within the cell genome to which the primers designed could join, the primers were aligned using the base of National Center for Biotechnology Informtation (NCBI) sequences and the local alignment tool (BLAST).

La mRT-PCR fue realizada utilizando el SuperScript^{TM} One-Step RT-PCR con Platinum® Taq (Invitrogen). La reacción fue realizada en un volumen final de 25 \mul, y se usó 1 \mug de RNA total como molde, 12.5 \mul de 2X reaction Mix, 1 \mul RT/Platinum Taq Mix, 5 pmoles del cebador 5' GAPDH (SEQ ID NO: 11) y del 3' GAPDH (SEQ ID NO: 12) específicos para la amplificación del gen GAPDH, 5 pmoles de cada cebador para la amplificación específica del gen IFN\alpha (SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 8) o IFN\beta (SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 10), 5 pmoles de cada cebador para la amplificación específica del gen ISG56 (SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4), 20 pmol de cada cebador para la amplificación específica del gen OAS-2 (SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2) y 10 pmoles de cada cebador para la amplificación específica del gen IL-8 (SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6), 2 mM de MgCl_{2} y 0.8 \mug/\mul BSA. Todas las parejas de cebadores utilizadas vienen recogidas en la Tabla 1.MRT-PCR was performed using SuperScript ™ One-Step RT-PCR with Platinum® Taq (Invitrogen) . The reaction was performed in a final volume of 25 µl, and 1 µg of total RNA was used as a template, 12.5 µl of 2X reaction Mix, 1 µL RT / Platinum Taq Mix, 5 pmoles of the 5 'GAPDH primer ( SEQ ID NO: 11) and 3 'GAPDH (SEQ ID NO: 12) specific for amplification of the GAPDH gene, 5 pmoles of each primer for specific amplification of the IFNα gene (SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO : 8) or IFN? (SEQ ID NO: 9 / SEQ ID NO: 10), 5 pmoles of each primer for specific amplification of the ISG56 gene (SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 4), 20 pmol of each primer for specific amplification of the OAS-2 gene (SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2) and 10 pmoles of each primer for specific amplification of the IL-8 gene (SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 6), 2 mM MgCl2 and 0.8 µg / µ BSA. All pairs of primers used are listed in Table 1.

Después de la RT a 55ºC durante 30 minutos y 3 minutos a 95ºC, la amplificación fue llevada a cabo en 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC y 2 minutos a 68ºC y una extensión final de 10 minutos a 68ºC. La mRT-PCR fue realizada en un termo-ciclador Bio-RAD iCycler.After RT at 55 ° C for 30 minutes and 3 minutes at 95 ° C, the amplification was carried out in 40 cycles of 15 seconds at 95 ° C, 30 seconds at 55 ° C and 2 minutes at 68 ° C and a final extension of 10 minutes at 68 ° C. MRT-PCR It was performed in a thermocycler Bio-RAD iCycler.

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

TABLE 1 Secuencia de los cebadores utilizados en la mRT-PCR semi-quantitativaSequence of the primers used in the mRT-PCR semi-quantitative

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

Se muestra el número de acceso del NCBI de las secuencias utilizadas para el diseño de los cebadores 5' y 3'.The NCBI access number of the sequences used for the design of the 5 'and 3' primers.

1one

2.2 Confirmation of PCR products

Una vez concluida la mRT-PCR, un mismo volumen (2 \mul) de cada una de la reacciones fue mezclado con tampón de carga y los productos de la reacción fueron resueltos en un gel de agarosa al 2% con tampón TAE al 0.5X. La electroforesis fue realizada a 100 v durante 20 minutos a temperatura ambiente. Una vez finalizada la electroforesis, el gel fue teñido en una solución de 0.5 \mug/ml de bromuro de etidio, lavado y los productos de PCR fueron visualizados mediante el uso de un transiluminador de UV.Upon completion of the mRT-PCR, a same volume (2 µl) of each of the reactions was mixed with loading buffer and reaction products were resolved in a 2% agarose gel with 0.5X TAE buffer. Electrophoresis It was performed at 100 v for 20 minutes at room temperature. A Once the electrophoresis was finished, the gel was dyed in a solution 0.5 µg / ml ethidium bromide, wash and PCR products They were visualized by using a UV transilluminator.

Example 3 Detection of the stimulation of the activation of interferon and the interferon independent inflammatory response

La Figura 1 muestra el resultado de la aplicación de la técnica de mRT-PCR a muestras de RNA total extraídas de diferentes líneas celulares (293T, 293T/TLR-9, U87CD4CXCR4 y Namalwa) tratadas con distintos tipos de ácidos nucleicos (ssRNA (SEQ ID NO: 15 ), dsRNA (dsRNA sintético poli I:C), siRNA (SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14) y el oligonucleótido fosforotioato ODN2006 (SEQ ID NO: 16). Los tres genes de respuesta mediada por interferón (OAS2, ISG56, IFN\alpha o IFN\beta), el gen de la interleuquina proinflamatoria (IL-8) y el control interno de la reacción (GAPDH) fueron amplificados simultáneamente mediante mRT-PCR en una sola y única mezcla de reacción. Todos los productos fueron del tamaño esperado. Los niveles de expresión se determinaron por comparación con los obtenidos para el control interno.Figure 1 shows the result of the Application of the mRT-PCR technique to samples of Total RNA extracted from different cell lines (293T, 293T / TLR-9, U87CD4CXCR4 and Namalwa) treated with different types of nucleic acids (ssRNA (SEQ ID NO: 15), dsRNA (synthetic dsRNA poly I: C), siRNA (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14) and oligonucleotide phosphorothioate ODN2006 (SEQ ID NO: 16). The three interferon-mediated response genes (OAS2, ISG56, IFNα) or IFN?), the proinflammatory interleukin gene (IL-8) and internal reaction control (GAPDH) were amplified simultaneously by mRT-PCR in a single reaction mixture. All the products were of the expected size. Expression levels were determined by comparison with those obtained for internal control.

Como se puede comprobar en la Figura 1, los amplicones generados son del tamaño esperado (ver Tabla 1) y productos inespecíficos no fueron detectados.As can be seen in Figure 1, the generated amplicons are the expected size (see Table 1) and Nonspecific products were not detected.

La Figura 1 muestra que en los carriles control no tratados (carriles 1, 4, 6 y 8) sólo se obtuvo una única banda correspondiente al gen de la GAPDH utilizado como control interno, el cual nos indica que la reacciones fueron realizadas en condiciones óptimas y que no hay activación del interferón ni liberación de IL-8. Sin embargo, en los carriles 2, 3, 5, 7 y 9, se observan los diferentes perfiles de expresión de respuesta de las diferentes células cuando son tratadas con diversos tipos de ácidos nucleicos, lo cual permite determinar si existe o no activación de la respuesta del interferón e inducción del gen de la IL-8 de una forma rápida, sensible y sencilla.Figure 1 shows that in the control lanes untreated (lanes 1, 4, 6 and 8) only a single band was obtained corresponding to the GAPDH gene used as internal control, which indicates that the reactions were performed in optimal conditions and that there is no activation of interferon or IL-8 release. However, on lanes 2, 3, 5, 7 and 9, the different expression profiles of response of different cells when treated with various types of nucleic acids, which allows to determine whether or not there is activation of the interferon response and induction of the gene of the IL-8 in a fast, sensitive and simple way.

Los resultados obtenidos, ponen de manifiesto la especificidad y efectividad del procedimiento propuesto en la presente invención, que mediante la técnica de mRT-PCR, permite la detección simultánea de 5 genes en una sola reacción, bajo unas condiciones específicas y no convencionales que fueron optimizadas en cuanto a la concentración de Mg^{+2}, temperatura de anillamiento, número de ciclos, diseño de cebadores y cantidades relativas de cada una de las 5 parejas de cebadores, siendo estas condiciones y no otras, las responsables del funcionamiento correcto y la reproducibilidad de la RT-PCR multiplex, es decir, de la efectividad para detectar de forma rápida y segura si un determinado ácido nucleico u otra molécula provoca activación de interferón y/o respuesta inflamatoria independiente de interferón.The results obtained show the specificity and effectiveness of the procedure proposed in the present invention, which by the technique of mRT-PCR, allows simultaneous detection of 5 genes in a single reaction, under specific conditions and not conventional ones that were optimized in terms of concentration Mg2 +, banding temperature, number of cycles, design of primers and relative amounts of each of the 5 pairs of primers, being these conditions and not others, responsible for the correct operation and reproducibility of the RT-PCR multiplex, that is, of the effectiveness for quickly and safely detect if a certain nucleic acid or another molecule causes interferon activation and / or response Interferon independent inflammatory.

<110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas<110> Higher Research Council Scientists

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<120> Método y kit para la detección de la activación del interferón y la respuesta inflamatoria<120> Method and kit for the detection of interferon activation and inflammatory response

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<130> 1641.722<130> 1641.722

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<140> P201031026<140> P201031026

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<141> 2010-07-02<141> 2010-07-02

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<160> 16<160> 16

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<170> PatentIn version 3.5<170> PatentIn version 3.5

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 1<210> 1

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 24<211> 24

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

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<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

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<223> Cebador directo OAS2<223> OAS2 direct primer

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 1<400> 1

33

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 2<210> 2

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 21<211> 21

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Cebador reverso OAS2<223> OAS2 reverse primer

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 2<400> 2

44

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 3<210> 3

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 20<211> 20

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Cebador directo ISG56<223> ISG56 direct primer

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 3<400> 3

55

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 4<210> 4

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 22<211> 22

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Cebador reverso ISG56<223> ISG56 reverse primer

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 4<400> 4

66

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 5<210> 5

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 24<211> 24

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Cebador directo IL-8<223> Direct primer IL-8

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 5<400> 5

77

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 6<210> 6

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 24<211> 24

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Cebador reverso IL-8<223> Reverse primer IL-8

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 6<400> 6

88

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 7<210> 7

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 21<211> 21

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Cebador directo IFN alfa<223> IFN alpha direct primer

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 7<400> 7

99

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 8<210> 8

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 22<211> 22

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Cebador reverso IFN alfa<223> IFN alpha reverse primer

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 8<400> 8

1010

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 9<210> 9

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 23<211> 23

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Cebador directo IFN beta<223> IFN beta direct primer

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 9<400> 9

11eleven

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 10<210> 10

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 24<211> 24

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Cebador reverso IFN beta<223> IFN beta reverse primer

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 10<400> 10

1212

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 11<210> 11

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 19<211> 19

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Cebador directo GAPDH<223> GAPDH direct primer

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 11<400> 11

1313

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 12<210> 12

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 20<211> 20

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Cebador reverso GAPDH<223> GAPDH reverse primer

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 12<400> 12

1414

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 13<210> 13

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 23<211> 23

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> RNA<212> RNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> anti-PBS siRNA directo<223> anti-PBS siRNA direct

         \newpage\ newpage

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 13<400> 13

15fifteen

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 14<210> 14

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 23<211> 23

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> RNA<212> RNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> anti-PBS siRNA reverso<223> anti-PBS siRNA back

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 14<400> 14

1616

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 15<210> 15

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 57<211> 57

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> RNA<212> RNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> SSRNA<223> SSRNA

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 15<400> 15

1717

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 16<210> 16

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 24<211> 24

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Oligonucleótido fosforotioato ODN-2006<223> Phosphorothioate oligonucleotide ODN-2006

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 16<400> 16

1818

Claims

1. Use of direct primers SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 and, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9, and of the reverse primers SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 and, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, for detection and / or quantification from:

in an isolated biological sample of a subject or In a cell culture.

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

2. Use according to claim 1, wherein it is used in addition the direct primer SEQ ID NO: 11 and the reverse primer SEQ ID NO: 12 for the detection and / or quantification of the control gene GAPDH

3. Use according to any of the claims 1 or 2, where the detection and / or quantification is carried out in a cell culture.

4. Use according to any of the claims 1 or 2 where the isolated biological sample is a tissue or a fluid biological.

5. Use according to any of the claims 1, 2 or 4, where the subject is a mammal.

6. Method of obtaining useful data for determine the ability of an agent to elicit a response immune, comprising:

b.b.: amplificar de forma simultánea los genes OAS2, ISG56, IL-8 e IFN\alpha o IFN\beta, utilizando los cebadores SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6 y, SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 10, ysimultaneously amplify the OAS2, ISG56, IL-8 and IFN? or IFN? genes, using primers SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 6 and, SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 / SEQ ID NO: 10, and

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

7. Method of obtaining useful data for detection and / or quantification of the activation of interferon and the interferon independent inflammatory response that understands:

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

8. Method of obtaining useful data for diagnose immune response in a subject or cell culture, which comprises steps (a), (b) and (c) of the method according to claim 7 and further the following steps:

e.and.: atribuir la desviación a la presencia de respuesta inmune en el sujeto o en el cultivo celular.attribute the deviation to the presence of immune response in the subject or in cell culture.

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

9. Method according to any of the claims 6 to 8, wherein the control gene is also amplified GAPDH using primers SEQ ID NO: 11 / SEQ ID NO: 12.

10. Method according to any of the claims 6 to 9, wherein the amplification of step (b) is performed by mRT-PCR.

11. Method according to claim 6, wherein the Agent is a nucleic acid.

12. Method according to claim 11, wherein the Nucleic acid is an oligodeoxyribonucleotide.

13. Method according to claim 11, wherein the nucleic acid is ssRNA.

14. Method according to claim 11, wherein the nucleic acid is dsRNA

15. Method according to claim 14, wherein the dsRNA is siRNA.

16. Method according to any of the claims 7 to 10 wherein the isolated biological sample is a tissue or a biological fluid.

17. Method according to any of the claims 7 to 10, wherein the subject is a mammal.

18. Kit comprising SEQ direct primers ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 and, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9, and reverse primers SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 and, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10.

19. Kit according to claim 18 which further comprises the direct primer SEQ ID NO: 11 and the reverse primer SEQ ID NO: 12.

20. Use of the kit according to any of the claims 18 or 19, for obtaining useful data for the detection and / or quantification of the activation of interferon and the interferon independent inflammatory response in a sample biological isolated from a subject or in a cell culture.

21. Use of the kit according to claim 20, where the detection and / or quantification is carried out in a culture mobile.

22. Use of the kit according to any of the claims 18 or 19, to determine the capacity of an agent to elicit an immune response in a cell culture that He has previously been treated with that agent.

23. Use according to claim 22, wherein the Agent is a nucleic acid.

24. Use according to claim 23, wherein the Nucleic acid is an oligodeoxyribonucleotide.

25. Use according to claim 24, wherein the nucleic acid is ssRNA.

26. Use according to claim 24, wherein the nucleic acid is dsRNA

27. Use according to claim 26, wherein the dsRNA is siRNA.