ES2371394T3

ES2371394T3 - ANTIGENS OF CANCER AND ITS USE.

Info

Publication number: ES2371394T3
Application number: ES03791418T
Authority: ES
Inventors: Tetsuya Nakatsura; Yasuharu Nishimura
Original assignee: Kumamoto Technology and Industry Foundation; Medinet Co Ltd
Current assignee: Kumamoto Technology and Industry Foundation; Medinet Co Ltd
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2011-12-30
Anticipated expiration: 2023-08-29

Abstract

Antígeno de cáncer para usar en la prevención y/o tratamiento terapéutico de cánceres, tal antígeno de cáncer es un péptido de cualquiera de los siguientes (A) o (B): (A) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 29, (B) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 22 y a una adición de uno a 5 aminoácidos, y tiene actividad inmunoestimuladora y activa los linfocitos T citotóxicos que reconocen una proteína del antígeno de cáncer; en el que el antígeno de cáncer tiene actividad estimuladora de células T de estimulación de los linfocitos T citotóxicos.Cancer antigen for use in the prevention and / or therapeutic treatment of cancers, such a cancer antigen is a peptide of any of the following (A) or (B): (A) a peptide consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 3 to 29, (B) a peptide consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 3 to 22 and an addition of one to 5 amino acids, and has immunostimulatory and active activity cytotoxic T lymphocytes that recognize a cancer antigen protein; in which the cancer antigen has stimulatory T cell stimulating activity of cytotoxic T lymphocytes.

Description

Antígenos de cáncer y su utilización Cancer antigens and their use

Campo técnico Technical field

La presente invención se refiere a un nuevo antígeno de cáncer humano que es útil para el diagnóstico de varios 5 tipos de cánceres tales como cáncer pancreático o cáncer de colon y para inmunoterapia, y su uso. The present invention relates to a new human cancer antigen that is useful for the diagnosis of several types of cancers such as pancreatic cancer or colon cancer and for immunotherapy, and its use.

Prior art

En la actualidad, el cáncer es la causa número uno de muerte. Se han desarrollado mecanismos de aparición, procedimientos diagnósticos, y procedimientos terapéuticos para el cáncer. Sin embargo, una gran cantidad de cánceres avanzados aún no se han tratado en las presentes circunstancias. A fin de mejorar la situación actual, se Currently, cancer is the number one cause of death. Onset mechanisms, diagnostic procedures, and therapeutic procedures for cancer have been developed. However, a large number of advanced cancers have not yet been treated in the present circumstances. In order to improve the current situation, it

10 considera necesario desarrollar un nuevo procedimiento de diagnóstico precoz y procedimiento terapéutico 10 considers it necessary to develop a new early diagnosis procedure and therapeutic procedure

Hace tiempo que se ha considerado a la inmunoterapia como un procedimiento para tratar cánceres, y se han realizado diversos intentos respecto de tal terapia. Sin embargo, aun no se han mostrado efectos antitumorales suficientes. En forma convencional, la inmunoterapia para los cánceres se ha centrado específicamente en la inmunoterapia no específica. En años recientes, sin embargo, se ha esclarecido que las células T cumplen un papel Immunotherapy has long been considered a procedure to treat cancers, and various attempts have been made regarding such therapy. However, sufficient antitumor effects have not yet been shown. Conventionally, immunotherapy for cancers has focused specifically on non-specific immunotherapy. In recent years, however, it has been clarified that T cells play a role

15 importante en el rechazo del tumor en los organismos vivos. Como resultado, los esfuerzos se han centrado en el aislamiento de un antígeno de cáncer que reconoce células T que es capaz de inducir a los linfocitos T citotóxicos (CTL) y la determinación de un epitopo de unión al MHC clase I. 15 important in tumor rejection in living organisms. As a result, efforts have focused on the isolation of a cancer antigen that recognizes T cells that is capable of inducing cytotoxic T lymphocytes (CTL) and the determination of an MHC class I binding epitope.

Hasta la fecha, muchos antígenos de cáncer se han aislado por el procedimiento de clonación de ADNc convencional, por medio de los CTL. Este procedimiento requiere el establecimiento de una línea celular del tumor y 20 el establecimiento de los CTL. En consecuencia, es difícil aislar un antígeno tumoral de los carcinomas diferentes de los melanomas. Además, a fin de aumentar los efectos de la inmunoterapia, se considera que un procedimiento de tratamiento que involucra la mezcla de muchos péptidos es efectivo. A fin de establecer tal procedimiento de tratamiento, es necesario aislar una gran cantidad de antígenos. En consecuencia, el procedimiento de clonación de la expresión del ADNc convencional es problemático ya que lleva mucha mano obra y tiempo para aislar incluso un To date, many cancer antigens have been isolated by the conventional cDNA cloning procedure, by means of CTLs. This procedure requires the establishment of a tumor cell line and the establishment of CTLs. Consequently, it is difficult to isolate a tumor antigen from carcinomas other than melanomas. In addition, in order to increase the effects of immunotherapy, a treatment procedure involving the mixing of many peptides is considered effective. In order to establish such a treatment procedure, it is necessary to isolate a large amount of antigens. Consequently, the cloning procedure of conventional cDNA expression is problematic since it takes a lot of work and time to isolate even a

25 solo antígeno. 25 antigen only.

En 1995, Pfreundschuh et al. en Alemania y Old et al. en U.S.A. han informado el procedimiento SEREX, que detecta una proteína del antígeno de cáncer reconocida por un anticuerpo en el suero de un paciente de cáncer (Serological Identification of Recombinant cDNA Expression Cloning; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810-11813, 1995). Se han aislado muchos antígenos de tumores por este procedimiento. Entre los antígenos aislados por este 30 procedimiento, también se han incluido antígenos tales como MAGE-1 o tirosinasa que inducen los CTL. Por consiguiente, se señala que este procedimiento también es útil como un procedimiento para detectar un antígeno reconocido por la inmunidad mediada por células. Además, se ha informado que un antígeno de cáncer reconocido por este anticuerpo IgG de un paciente fue aislado con el procedimiento descripto anteriormente (Int. J. Cancer 72, 965-971, 1997; Cancer Res. 58, 1034-1041, 1998; Int. J. Cancer 29, 652-658, 1998; Int. J. Oncol. 14, 703-708, 1999; In 1995, Pfreundschuh et al. in Germany and Old et al. in USA. have reported the SEREX procedure, which detects a cancer antigen protein recognized by an antibody in the serum of a cancer patient (Serological Identification of Recombinant cDNA Expression Cloning; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810-11813, nineteen ninety five). Many tumor antigens have been isolated by this procedure. Among the antigens isolated by this procedure, antigens such as MAGE-1 or tyrosinase that induce CTLs have also been included. Accordingly, it is noted that this procedure is also useful as a method to detect an antigen recognized by cell-mediated immunity. In addition, it has been reported that a cancer antigen recognized by this IgG antibody from a patient was isolated with the procedure described above (Int. J. Cancer 72, 965-971, 1997; Cancer Res. 58, 1034-1041, 1998; Int. J. Cancer 29, 652-658, 1998; Int. J. Oncol. 14, 703-708, 1999;

35 Cancer Res. 56, 4766-4772, 1996; y Hum. Mol. Genet 6, 33-39, 1997). 35 Cancer Res. 56, 4766-4772, 1996; and hum. Mol. Genet 6, 33-39, 1997).

El documento WO99/04265 desvela un gran cantidad de secuencias de péptidos/proteínas que se hallan expresados en las células tumorales. El abordaje usado para la prueba parece haber sido respaldado por anticuerpos autólogos que reconocen el antígeno respectivo. En el Ejemplo 7 se devela que HSP105 es expresado por las células tumorales y reconocido por los anticuerpos autólogos. Sin embargo, el documento completo no WO99 / 04265 discloses a large number of peptide / protein sequences that are expressed in tumor cells. The approach used for the test appears to have been backed by autologous antibodies that recognize the respective antigen. In Example 7 it is revealed that HSP105 is expressed by tumor cells and recognized by autologous antibodies. However, the entire document does not

40 proporciona ninguna evidencia de que HSP105 tiene efectivamente algún efecto en la prevención y/o tratamiento de los tumores. 40 provides no evidence that HSP105 effectively has any effect on the prevention and / or treatment of tumors.

El documento Nakatsura et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm, vol. 281, 936-944 (2001)) se refiere a estudios de antígenos inmunogénicos sobreexpresados en un cáncer pancreático por medio del procedimiento SEREX. Los autores de este documento hallaron 18 proteínas diferentes sobreexpresadas en las respectivas células cancerosas, The Nakatsura et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm, vol. 281, 936-944 (2001)) refers to studies of immunogenic antigens overexpressed in pancreatic cancer by means of the SEREX procedure. The authors of this document found 18 different proteins overexpressed in the respective cancer cells,

45 que incluyen HSP105. En la sección de discusión de las páginas 941 a 943 los autores afirman que las observaciones realizadas durante sus estudios pueden sugerir la posible utilidad de hsp105 para la inmunoterapia del cáncer. 45 including HSP105. In the discussion section on pages 941 to 943 the authors state that the observations made during their studies may suggest the possible usefulness of hsp105 for cancer immunotherapy.

Disclosure of the invention

Un objeto de la presente invención es proporcionar: un antígeno de cáncer pancreático humano y/o un antígeno de An object of the present invention is to provide: a human pancreatic cancer antigen and / or an antigen of

50 cáncer de colon humano que se pueden aplicar en el diagnóstico y/o tratamiento de varios tipos de cánceres o tumores que incluyen cáncer pancreático y cáncer de colon como ejemplos representativos; un gen que codifica los mismos; y una vacuna anti-cáncer que usa los mismos. 50 human colon cancer that can be applied in the diagnosis and / or treatment of various types of cancers or tumors that include pancreatic cancer and colon cancer as representative examples; a gene that encodes them; and an anti-cancer vaccine that uses them.

La presente invención proporciona un antígeno de cáncer para usar en prevención y/o tratamiento terapéutico de cánceres, tal antígeno de cáncer es un péptido de cualquiera de los siguientes (A) o (B): The present invention provides a cancer antigen for use in prevention and / or therapeutic treatment of cancers, such a cancer antigen is a peptide of any of the following (A) or (B):

(A)(TO): un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NOs: 3 a 29, a peptide consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 3 to 29,

(B)(B): un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NOs: 3 a 22 y una adición de uno a 5 aminoácidos, y tiene actividad inmunoestimuladora y activa los linfocitos T citotóxicos que reconocen una proteína del antígeno de cáncer; a peptide consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 3 to 22 and an addition of one to 5 amino acids, and has immunostimulatory activity and activates cytotoxic T lymphocytes that recognize a cancer antigen protein;

en el que el antígeno de cáncer tiene actividad estimuladora de las células T que estimula los linfocitos T citotóxicos. in which the cancer antigen has T cell stimulating activity that stimulates cytotoxic T lymphocytes.

La presente invención proporciona un péptido como antígeno de cáncer que tiene actividad inmunoestimuladora. El péptido de la presente invención preferentemente puede activar los linfocitos T citotóxicos que reconocen una proteína del antígeno de cáncer. El péptido de la presente invención consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NOS: 3 a 29. The present invention provides a peptide as a cancer antigen that has immunostimulatory activity. The peptide of the present invention can preferably activate cytotoxic T lymphocytes that recognize a cancer antigen protein. The peptide of the present invention consists of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOS: 3 to 29.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un péptido, que consiste en una secuencia de aminoácidos con una adición de uno a 5 aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NOS: 3 a 22, y también tiene actividad inmunoestimuladora. El péptido descripto anteriormente preferentemente puede activar los linfocitos T citotóxicos que reconocen una proteína del antígeno de cáncer. In another aspect, the present invention provides a peptide, which consists of an amino acid sequence with an addition of one to 5 amino acids with respect to the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOS: 3 to 22, and also has activity immunostimulatory The peptide described above may preferably activate cytotoxic T lymphocytes that recognize a cancer antigen protein.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un agente inmunoestimulante usado para los cánceres, que comprende cualquiera de los péptidos descriptos anteriormente. In another aspect, the present invention provides an immunostimulatory agent used for cancers, comprising any of the peptides described above.

En otro aspecto, la presente invención proporciona ADN que codifica el antígeno de cáncer mencionado anteriormente de la presente invención. In another aspect, the present invention provides DNA encoding the aforementioned cancer antigen of the present invention.

En otro aspecto, la presente invención proporciona células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos, o una población de inmunocitos que comprende estas células, que son inducidas por la estimulación in vitro por medio del antígeno o péptido del cáncer mencionado anteriormente de la presente invención, o una mezcla de ellos. In another aspect, the present invention provides auxiliary T cells, cytotoxic T lymphocytes, or a population of immunocytes comprising these cells, which are induced by in vitro stimulation by means of the cancer antigen or peptide mentioned above of the present invention, or A mixture of them.

En otro aspecto, la presente invención proporciona células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos, o una población de inmunocitos que comprende estas células, que son inducidas por la estimulación in vitro por medio del antígeno o péptido del cáncer mencionado anteriormente de la presente invención, o una mezcla de ellos, y un activador inmunológico. El activador inmunológico es preferentemente un factor de crecimiento celular o citoquina. In another aspect, the present invention provides auxiliary T cells, cytotoxic T lymphocytes, or a population of immunocytes comprising these cells, which are induced by in vitro stimulation by means of the cancer antigen or peptide mentioned above of the present invention, or a mixture of them, and an immune activator. The immune activator is preferably a cell growth factor or cytokine.

En otro aspecto, la presente invención proporciona antígenos de cáncer para usar en un procedimiento para suprimir un tumor, que comprende introducir las células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos descriptos anteriormente, o una población de inmunocitos que comprende estas células en un organismo. El procedimiento descripto anteriormente preferentemente se usa para prevenir y/o tratar cánceres. In another aspect, the present invention provides cancer antigens for use in a method of suppressing a tumor, which comprises introducing helper T cells, cytotoxic T lymphocytes described above, or a population of immunocytes comprising these cells in an organism. The procedure described above is preferably used to prevent and / or treat cancers.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una solución del cultivo celular usada para producir las células T auxiliares o linfocitos T citotóxicos de la presente invención o una población de inmunocitos que comprende estas células, que comprende el antígeno o péptido del cáncer mencionado anteriormente de la presente invención, o una mezcla de ellos. In another aspect, the present invention provides a cell culture solution used to produce the helper T cells or cytotoxic T lymphocytes of the present invention or a population of immunocytes comprising these cells, which comprises the cancer antigen or peptide mentioned above of the present invention, or a mixture thereof.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit del cultivo celular para producir las células T auxiliares o linfocitos T citotóxicos de la presente invención o una población de inmunocitos que comprende estas células, que comprende la solución del cultivo celular descrito anteriormente y un recipiente del cultivo celular. In another aspect, the present invention provides a cell culture kit for producing the helper T cells or cytotoxic T lymphocytes of the present invention or a population of immunocytes comprising these cells, which comprises the cell culture solution described above and a container of the cell culture.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna para el cáncer que comprende el antígeno de cáncer mencionado anteriormente y/o al menos un tipo de péptido de la presente invención. La vacuna para el cáncer descrita anteriormente preferentemente también comprende un adyuvante. In another aspect, the present invention provides a cancer vaccine comprising the aforementioned cancer antigen and / or at least one type of peptide of the present invention. The cancer vaccine described above preferably also comprises an adjuvant.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna para el cáncer, que comprende el ADN mencionado anteriormente de la presente invención, o virus recombinante o bacteria recombinante que comprende el ADN descrito anteriormente. La vacuna para el cáncer descrita anteriormente preferentemente también comprende un adyuvante. In another aspect, the present invention provides a cancer vaccine, comprising the aforementioned DNA of the present invention, or recombinant virus or recombinant bacteria comprising the DNA described above. The cancer vaccine described above preferably also comprises an adjuvant.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un agente para prevenir y/o tratar cánceres, que comprende antígeno de cáncer, péptido, y/o células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos mencionados anteriormente, o una población de inmunocitos que comprende estas células de la presente invención. In another aspect, the present invention provides an agent for preventing and / or treating cancers, comprising cancer antigen, peptide, and / or helper T cells, cytotoxic T lymphocytes mentioned above, or a population of immunocytes comprising these cells of the present invention

En la presente invención, cáncer es preferentemente cáncer pancreático, cáncer de colon, tumor cerebral, melanoma maligno, leucemia mielocítica crónica, leucemia mielocítica aguda, linfoma, cáncer esofágico, cáncer renal, cáncer prostático, cáncer de pulmón, cáncer de mamas, cáncer de estómago, cáncer hepático, cáncer de vesícula, cáncer testicular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer tiroideo, cáncer de vejiga, o sarcoma. In the present invention, cancer is preferably pancreatic cancer, colon cancer, brain tumor, malignant melanoma, chronic myelocytic leukemia, acute myelocytic leukemia, lymphoma, esophageal cancer, renal cancer, prostate cancer, lung cancer, breast cancer, breast cancer. stomach, liver cancer, gallbladder cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, bladder cancer, or sarcoma.

Breve descripción de los dibujos Brief description of the drawings

La Figura 1 es una microfotografía que muestra los resultados de un análisis inmunohistoquímico en hsp105 en cáncer pancreático. En la figura, los símbolos tienen los siguientes significados: Figure 1 is a photomicrograph showing the results of an immunohistochemical analysis in hsp105 in pancreatic cancer. In the figure, the symbols have the following meanings:

A: una porción de cáncer pancreático y una porción no cancerosa periférica teñida con hematoxilina y eosina, CA: una porción cancerosa, NP: una porción no cancerosa A: a portion of pancreatic cancer and a peripheral non-cancerous portion stained with hematoxylin and eosin, CA: a cancerous portion, NP: a non-cancerous portion

B: una proteína hsp105 está altamente expresada en células cancerosas. También se expresa débilmente en una porción no cancerosa. B: an hsp105 protein is highly expressed in cancer cells. It is also weakly expressed in a non-cancerous portion.

C: Una porción no cancerosa está significativamente expandida. Una proteína hsp105 se expresa débilmente en el citoplasma. C: A non-cancerous portion is significantly expanded. An hsp105 protein is weakly expressed in the cytoplasm.

D: Una porción cancerosa está significativamente expandida. Una proteína hsp105 se expresa en forma elevada principalmente en el citoplasma de células cancerosas. D: A cancerous portion is significantly expanded. An hsp105 protein is expressed in elevated form mainly in the cytoplasm of cancer cells.

La Figura 2 es una microfotografía que muestra los resultados de un análisis inmunohistoquímico en la hsp105 en el cáncer de colon. En la figura, los símbolos tienen los significados siguientes: Figure 2 is a photomicrograph showing the results of an immunohistochemical analysis in hsp105 in colon cancer. In the figure, the symbols have the following meanings:

A: una porción de cáncer de colon y una porción no cancerosa periférica teñida con hematoxilina y eosina, CA: una porción cancerosa, NP: una porción no cancerosa A: a portion of colon cancer and a peripheral non-cancerous portion stained with hematoxylin and eosin, CA: a cancerous portion, NP: a non-cancerous portion

D: Una porción cancerosa está significativamente expandida. Una proteína hsp105 se expresa en forma elevada principalmente en el citoplasma de células cancerosas. Asimismo, la proteína hsp105 se expresa débilmente en el núcleo de esta. D: A cancerous portion is significantly expanded. An hsp105 protein is expressed in elevated form mainly in the cytoplasm of cancer cells. Also, the hsp105 protein is weakly expressed in its nucleus.

La Figura 3 es un gráfico que muestra los efectos anticáncer de una vacuna de ADN de hsp105, una vacuna de péptido de hsp105, y un control en células de cáncer de colon de ratón Colon-26. A representa el área de una porción cancerosa, B representa la proporción de los ratones en que se ha desarrollado el cáncer, y C representa la proporción de los ratones sobrevivientes. Figure 3 is a graph showing the anti-cancer effects of an hsp105 DNA vaccine, an hsp105 peptide vaccine, and a control in Colon-26 mouse colon cancer cells. A represents the area of a cancerous portion, B represents the proportion of the mice in which the cancer has developed, and C represents the proportion of the surviving mice.

La Figura 4 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos por la medición del ensayo de liberación de 51Cr, las actividades citotóxicas sobre Colon-26 de varios tipos de vacunas peptídicas derivadas de las proteínas hsp105, o las actividades citotóxicas de las vacunas de ADN que codifican tales proteínas hsp105. Figure 4 is a graph showing the results obtained by measuring the 51 Cr release assay, the cytotoxic activities on Colon-26 of various types of peptide vaccines derived from the hsp105 proteins, or the cytotoxic activities of the DNA vaccines that encode such hsp105 proteins.

La Figura 5 muestra los resultados de un análisis inmunohistoquímico sobre hp105 en los tejidos. Figure 5 shows the results of an immunohistochemical analysis on hp105 in tissues.

La Figura 6 muestra los resultados obtenidos por el análisis de la actividad antitumoral in vivo de una línea celular T auxiliar positiva CD4 de ratón inducida por hsp105. Figure 6 shows the results obtained by analyzing the in vivo antitumor activity of a mouse CD4 positive helper T cell line induced by hsp105.

La Figura 7 muestra los resultados obtenidos por la inducción con hsp105, la línea celular T auxiliar positiva CD4 de un paciente con cáncer de colon. Figure 7 shows the results obtained by induction with hsp105, the CD4 positive auxiliary T cell line of a patient with colon cancer.

La Figura 8 muestra los resultados obtenidos al examinar si los linfocitos T citotóxicos (CTL) de ratón BALB/c inducidos por un péptido derivado de hsp105 pueden reducir o no una masa tumoral de la línea celular de cáncer de colon Colon-26 que expresa altamente hsp105. Figure 8 shows the results obtained by examining whether BALB / c mouse cytotoxic T lymphocytes (CTL) induced by an hsp105-derived peptide can reduce or not a tumor mass of the Colon-26 colon cancer cell line that expresses highly hsp105.

La Figura 9 muestra los resultados obtenidos al examinar si los linfocitos T citotóxicos (CTL) de un paciente con cáncer de colon pueden reducir o no una masa tumoral del cáncer de colon sw620, que expresa altamente hsp105. Figure 9 shows the results obtained by examining whether cytotoxic T lymphocytes (CTL) of a patient with colon cancer can reduce or not a tumor mass of colon cancer sw620, which expresses highly hsp105.

Mejor modo de llevar a cabo la invención Best way to carry out the invention

Las formas de realización de la presente invención se describirán en detalle a continuación. The embodiments of the present invention will be described in detail below.

La frase "proteína que tiene actividad inmunoestimuladora" se usa en la presente memoria descriptiva para significar una proteína que tiene actividad de inducir una respuesta inmune tal como generación de un anticuerpo o inmunidad mediada celular. Entre ellos, se prefiere particularmente la actividad estimuladora de células T de estimular los linfocitos T citotóxicos (células T citolíticas/CTL). The phrase "protein that has immunostimulatory activity" It is used herein to mean a protein that has activity of inducing an immune response such as antibody generation or cellular mediated immunity. Among them, the T cell stimulating activity of stimulating cytotoxic T lymphocytes (cytolytic T cells / CTL) is particularly preferred.

La hsp105 es una proteína de choque térmico con un alto peso molecular, que pertenece a la familia hsp110/105, y está compuesta de hsp105a y 105�. La 105a es una proteína de choque térmico de 105 kDa, y es inducida por varios estreses. La 105� es una proteína generada por el empalme de ARNm de 105a, y tiene un peso molecular menor que el de 105a. La hsp105 que es un antígeno del cáncer pancreático o cáncer de colon de la presente invención se puede detectar, por ejemplo, por el procedimiento SEREX como se describe posteriormente en los ejemplos de la presente memoria descriptiva. Hsp105 is a thermal shock protein with a high molecular weight, which belongs to the family hsp110 / 105, and is composed of hsp105a and 105�. 105a is a 105 kDa heat shock protein, and is induced by several stresses. 105� is a protein generated by the mRNA splice of 105a, and has a molecular weight less than that of 105a. The hsp105 which is a pancreatic cancer or colon cancer antigen of the present invention can be detected, for example, by the SEREX method as described later in the examples herein.

En la presente invención, el alcance de "uno a 5" en "una secuencia de aminoácidos que comprende una adición de uno a 5 aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NOs 3-22" por In the present invention, the scope of "one to 5" in " an amino acid sequence comprising an addition of one to 5 amino acids with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs 3-22 " by

ejemplo, significa 1 a 5, y preferentemente 1 a 3 aminoácidos. example, means 1 to 5, and preferably 1 to 3 amino acids.

Un procedimiento de obtener o producir la proteína del antígeno de cáncer de la presente invención no es particularmente limitado. Se puede usar una proteína natural, una proteína sintetizada químicamente, o una proteína recombinante producida por manipulación genética. Desde el punto de vista de que se puede producir en gran volumen por operaciones relativamente fáciles, es preferente una proteína recombinante. A method of obtaining or producing the cancer antigen protein of the present invention is not particularly limited. A natural protein, a chemically synthesized protein, or a recombinant protein produced by genetic manipulation can be used. From the viewpoint that it can be produced in large volume by relatively easy operations, a recombinant protein is preferred.

Cuando se obtiene una proteína natural, se puede aislar de células o tejidos que expresan la proteína por el uso combinado apropiado de procedimientos de aislamiento y purificación de proteína. Cuando se obtiene una proteína sintetizada químicamente, la proteína de la presente invención se puede sintetizar por procedimientos de síntesis química tales como el procedimiento de Fmoc (procedimiento de fluorenilmetiloxicarbonilo) o el procedimiento de tBoc (procedimiento de t-butiloxicarbonilo). Además, la proteína de la presente invención también se puede sintetizar por medio de varios tipos de sintetizadores de péptidos disponibles en el comercio. When a natural protein is obtained, it can be isolated from cells or tissues that express the protein by the appropriate combined use of protein isolation and purification procedures. When a chemically synthesized protein is obtained, the protein of the present invention can be synthesized by chemical synthesis procedures such as the Fmoc procedure (fluorenylmethyloxycarbonyl process) or the tBoc procedure (t-butyloxycarbonyl process). In addition, the protein of the present invention can also be synthesized by means of several types of commercially available peptide synthesizers.

Cuando la proteína del antígeno de cáncer de la presente invención se produce en la forma de una proteína recombinante, se puede producir por la obtención del ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2), una mutante de esta o un homólogo de esta y su introducción en un sistema de expresión preferido. When the cancer antigen protein of the present invention is produced in the form of a recombinant protein, it can be produced by obtaining DNA that has a nucleotide sequence encoding the protein (for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2), a mutant of this or a homologue of this and its introduction into a preferred expression system.

Se puede usar cualquier vector de expresión, a condición de que se pueda replicar en forma autónoma en las células huésped o se puede incorporar en los cromosomas de las células huésped. Se usa vector de expresión que contiene un promotor en un sitio que es capaz de expresar el gen de la presente invención. Un transformante que tiene un gen que codifica la proteína de la presente invención se puede producir por la introducción del vector de expresión mencionado anteriormente en un huésped. Tal huésped usado en la presente puede incluir una bacteria, levadura o células de animal y células de insecto. Además, un vector de expresión se puede introducir en un huésped por procedimientos conocidos, que dependen del tipo de huésped. Any expression vector can be used, provided that it can replicate autonomously in the host cells or it can be incorporated into the host cell chromosomes. Expression vector containing a promoter is used at a site that is capable of expressing the gene of the present invention. A transformant having a gene encoding the protein of the present invention can be produced by the introduction of the aforementioned expression vector into a host. Such a host used herein may include a bacterium, yeast or animal cells and insect cells. In addition, an expression vector can be introduced into a host by known procedures, which depend on the type of host.

En la presente invención, se cultiva el transformante que tiene el gen de la presente invención producido como se describió anteriormente, y la proteína de la presente invención se genera y acumula en el producto de cultivo. A partir de este momento, la proteína de la presente invención se recolecta del producto de cultivo, de este modo se aísla una proteína recombinante. In the present invention, the transformant having the gene of the present invention produced as described above is cultured, and the protein of the present invention is generated and accumulated in the culture product. From this moment on, the protein of the present invention is collected from the culture product, in this way a recombinant protein is isolated.

Cuando el transformante de la presente invención es procariota tal como Escherichia coli o eucariota tal como levadura, se puede usar un medio natural o medio sintético como medio en que se cultivan los microorganismos, a condición de que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y sales inorgánicas que pueden ser asimiladas pos los microorganismos, y el cultivo del transformante se puede llevar a cabo de modo eficiente en este. Además, el cultivo se puede llevar a cabo en condiciones que se usan comúnmente para el cultivo de microorganismos. Después de completar el cultivo, la proteína de la presente invención se puede aislar y purificar del producto de cultivo del transformante por procedimientos de aislamiento y purificación de proteína comunes. When the transformant of the present invention is prokaryotic such as Escherichia coli or eukaryotic such as yeast, a natural medium or synthetic medium can be used as a medium in which microorganisms are grown, provided it contains a carbon source, a source of nitrogen and inorganic salts that can be assimilated after the microorganisms, and the culture of the transformant can be carried out efficiently in this. In addition, the culture can be carried out under conditions that are commonly used for the cultivation of microorganisms. After completing the culture, the protein of the present invention can be isolated and purified from the transformant culture product by common protein isolation and purification procedures.

Una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución, supresión, inserción, y/o adición de uno o varios aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1, puede ser producida y obtenida apropiadamente por los expertos en la técnica sobre la base de la información respecto de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, que es un ejemplo de la secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. A protein having an amino acid sequence comprising a substitution, deletion, insertion, and / or addition of one or more amino acids with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, can be produced and obtained properly. by those skilled in the art based on information regarding the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, which is an example of the DNA sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 .

Es decir, un gen (gen mutante) que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución, supresión, inserción, y/o adición de uno o varios aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, se puede producir por cualquiera de los procedimientos dados que son conocidos por los expertos en la técnica, tales como síntesis química, procedimientos de manipulación genética, o mutagénesis. En forma específica, se introduce una mutación en el ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, de modo de obtener el ADN mutante. That is, a gene (mutant gene) that has a nucleotide sequence encoding a protein that has an amino acid sequence comprising a substitution, deletion, insertion, and / or addition of one or more amino acids with respect to the amino acid sequence. shown in SEQ ID NO: 1, it can be produced by any of the given procedures that are known to those skilled in the art, such as chemical synthesis, genetic manipulation procedures, or mutagenesis. Specifically, a mutation is introduced into the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, so as to obtain the mutant DNA.

Por ejemplo, se puede aplicar un procedimiento de dejar que el ADN se ponga en contacto con un agente que actúa como mutágeno, un procedimiento de irradiación con rayos ultravioleta, un procedimiento de manipulación genética, y similares, al ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. La mutagénesis dirigida al sitio, uno de los procedimientos de manipulación genética, es útil porque es capaz de introducir una mutación específica en un sitio específico. La mutagénesis dirigida al sitio se puede llevar a cabo de acuerdo con los procedimientos descriptos en publicaciones tales como Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989 (de aquí en adelante abreviado como Molecular Cloning 2nd Ed.); y Current Protocols in Molecular Biology, Supplements 1 a 38, John Wiley & Sons (1987-1997) (de aquí en adelante abreviado como Current Protocols in Molecular Biology). For example, a method of allowing the DNA to contact an agent that acts as a mutagen, an ultraviolet irradiation procedure, a genetic manipulation procedure, and the like, can be applied to the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. Site-directed mutagenesis, one of the genetic manipulation procedures, is useful because it is capable of introducing a specific mutation at a specific site. Site-directed mutagenesis can be carried out in accordance with the procedures described in publications such as Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989 (hereinafter abbreviated as Molecular Cloning 2nd Ed.); and Current Protocols in Molecular Biology, Supplements 1 to 38, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter abbreviated as Current Protocols in Molecular Biology).

La presente invención también se refiere a un péptido que es una porción de la proteína anteriormente mencionada de la presente invención y tiene actividad inmunoestimuladora. El péptido de la presente invención preferentemente puede activar linfocitos T citotóxicos que reconocen una proteína del antígeno de cáncer. Los ejemplos específicos de tal péptido consisten en cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: The present invention also relates to a peptide that is a portion of the aforementioned protein of the present invention and has immunostimulatory activity. The peptide of the present invention can preferably activate cytotoxic T lymphocytes that recognize a cancer antigen protein. Specific examples of such a peptide consist of any of the following amino acid sequences:

Asn-Tyr-Gly-Ile-Tyr-Lys-Gln-Asp-Leu (SEQ ID NO: 3) Ala-Phe-Asn-Lys-Gly-Lys-Leu-Lys-Val-Leu (SEQ ID NO: 4) Lys-Tyr-Lys-Leu-Asp-Ala-Lys-Ser-Lys-Ile (SEQ ID NO: 5) Gln-Phe-Glu-Glu-Leu-Cys-Ala-Glu-Leu (SEQ ID NO: 6) Met-Tyr-Ile-Glu-Thr-Glu-Gly-Lys-Met-Ile (SEQ ID NO: 7) Thr-Phe-Leu-Arg-Arg-Gly-Pro-Phe-Glu-Leu (SEQ ID NO: 8) Glu-Tyr-Val-Tyr-Glu-Phe-Arg-Asp-Lys-Leu (SEQ ID NO: 9) His-Tyr-Ala-Lys-Ile-Ala-Ala-Asp-Phe (SEQ ID NO: 10) Lys-Tyr-Asn-His-Ile-Asp-Glu-Ser-Glu-Met (SEQ ID NO: 11) Ser-Leu-Asp-Glu-Lys-Pro-Arg-Ile-Val-Val (SEQ ID NO: 12) Arg-Leu-Tyr-Gln-Glu-Cys-Glu-Lys-Leu (SEQ ID NO: 13) Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Asn-Ser-Thr-Asp-Leu (SEQ ID NO: 14) Leu-Met-Ser-Ser-Asn-Ser-Thr-Asp-Leu (SEQ ID NO: 15) Ser-Gln-Phe-Glu-Glu-Leu-Cys-Ala-Glu-Leu (SEQ ID NO: 16) Lys-Ile-Gly-Arg-Phe-Val-Val-Gln-Asn-Val (SEQ ID NO: 17) Tyr-Val-Tyr-Glu-Phe-Arg-Asp-Lys-Leu (SEQ ID NO: 18) Leu-Leu-Thr-Glu-Thr-Glu-Asp-Trp-Leu (SEQ ID NO: 19) Trp-Leu-Tyr-Glu-Glu-Gly-Glu-Asp-Gln-Ala (SEQ ID NO: 20) Glu-Leu-Met-Lys-Ile-Gly-Thr-Pro-Val (SEQ ID NO: 21) Val-Met-Asn-Ala-Gln-Ala-Lys-Lys-Ser-Leu (SEQ ID NO: 22) Un ejemplo preferido de tal péptido puede ser un péptido capaz de activar linfocitos T citotóxicos que reconocen una Asn-Tyr-Gly-Ile-Tyr-Lys-Gln-Asp-Leu (SEQ ID NO: 3) Ala-Phe-Asn-Lys-Gly-Lys-Leu-Lys-Val-Leu (SEQ ID NO: 4) Lys-Tyr-Lys-Leu-Asp-Ala-Lys-Ser-Lys-Ile (SEQ ID NO: 5) Gln-Phe-Glu-Glu-Leu-Cys-Ala-Glu-Leu (SEQ ID NO: 6) Met-Tyr-Ile-Glu-Thr-Glu-Gly-Lys-Met-Ile (SEQ ID NO: 7) Thr-Phe-Leu-Arg-Arg-Gly-Pro-Phe-Glu-Leu (SEQ ID NO: 8) Glu-Tyr-Val-Tyr-Glu-Phe-Arg-Asp-Lys-Leu (SEQ ID NO: 9) His-Tyr-Ala-Lys-Ile-Ala-Ala-Asp-Phe (SEQ ID NO: 10) Lys-Tyr-Asn-His-Ile-Asp-Glu-Ser-Glu-Met (SEQ ID NO: 11) Ser-Leu-Asp-Glu-Lys-Pro-Arg-Ile-Val-Val (SEQ ID NO: 12) Arg-Leu-Tyr-Gln-Glu-Cys-Glu-Lys-Leu (SEQ ID NO: 13) Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Asn-Ser-Thr-Asp-Leu (SEQ ID NO: 14) Leu-Met-Ser-Ser-Asn-Ser-Thr-Asp-Leu (SEQ ID NO: 15) Ser-Gln-Phe-Glu-Glu-Leu-Cys-Ala-Glu-Leu (SEQ ID NO: 16) Lys-Ile-Gly-Arg-Phe-Val-Val-Gln-Asn-Val (SEQ ID NO: 17) Tyr-Val-Tyr-Glu-Phe-Arg-Asp-Lys-Leu (SEQ ID NO: 18) Leu-Leu-Thr-Glu-Thr-Glu-Asp-Trp-Leu (SEQ ID NO: 19) Trp-Leu-Tyr-Glu-Glu-Gly-Glu-Asp-Gln-Ala (SEQ ID NO: 20) Glu-Leu-Met-Lys-Ile-Gly-Thr-Pro-Val (SEQ ID NO: 21) Val-Met-Asn-Ala-Gln-Ala-Lys-Lys-Ser-Leu (SEQ ID NO: 22) A preferred example of such a peptide may be a peptide capable of activating cytotoxic T lymphocytes that recognize a

proteína del antígeno de cáncer. En la presente invención, el alcance de "uno a 5" en "una secuencia de aminoácidos que comprende una adición de uno a 5 aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las anteriores SEQ ID cancer antigen protein. In the present invention, the scope of "one to 5" in "an amino acid sequence comprising an addition of one to 5 amino acids with respect to the amino acid sequence shown in any of the above SEQ ID

NOS: 3 a 22" es 1 a 5, preferentemente 1 a 4, más preferentemente 1 a 3, además preferentemente 1 o 2, y en particular preferentemente 1. El péptido de la presente invención se puede sintetizar por procedimientos de síntesis química tales como el US: 3 to 22 " it is 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, also preferably 1 or 2, and in particular preferably 1. The peptide of the present invention can be synthesized by chemical synthesis procedures such as the

procedimiento de Fmoc (procedimiento de fluorenilmetiloxicarbonilo) o el procedimiento de tBoc (procedimiento de tbutiloxicarbonilo). Además, el péptido de la presente invención también se puede sintetizar por medio de varios tipos de sintetizadores de péptido disponibles en el comercio. Fmoc procedure (fluorenylmethyloxycarbonyl procedure) or the tBoc procedure (t-butoxycarbonyl process). In addition, the peptide of the present invention can also be synthesized by means of several types of commercially available peptide synthesizers.

El péptido del antígeno de cáncer mencionado anteriormente de la presente invención puede inducir inmunidad contra los cánceres, como se describió posteriormente en los ejemplos. Por consiguiente, la presente invención proporciona un agente inmuno-estimulador contra los cánceres, que comprende la proteína o péptido del antígeno de cáncer de la presente invención. The aforementioned cancer antigen peptide of the present invention can induce immunity against cancers, as described later in the examples. Accordingly, the present invention provides an immuno-stimulatory agent against cancers, comprising the cancer antigen protein or peptide of the present invention.

El agente inmunoestimulante contra los cánceres de la presente invención se usa in vitro o in vivo, y preferentemente in vitro, de modo que induce a las células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos, o una población de inmunocitos que contiene estas células, de este modo proporciona la inmunidad contra cánceres. The immunostimulatory agent against cancers of the present invention is used in vitro or in vivo, and preferably in vitro, so that it induces helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, or a population of immunocytes containing these cells, thus Provides immunity against cancers.

(2) ADN de la presente invención (2) DNA of the present invention

El ADN de la presente invención codifica el antígeno de cáncer de la presente invención descripto en el punto (1) anterior. The DNA of the present invention encodes the cancer antigen of the present invention described in item (1) above.

El ADN incluye el ADN que se está hibridando con el ADN que tiene la secuencia de nucleótidos descripto en (1) en condiciones rigurosas, y que codifica el péptido que tiene actividad inmunoestimuladora como se define en la reivindicación 1. The DNA includes the DNA that is hybridizing with the DNA that has the nucleotide sequence described in (1) under stringent conditions, and that encodes the peptide that has immunostimulatory activity as defined in claim 1.

La frase anterior "ADN que hibrida con ... en condiciones rigurosas" se usa para significar la secuencia de nucleótidos de ADN obtenido por el procedimiento de hibridación de la colonia, el procedimiento de hibridación de la placa o el procedimiento de hibridación Southern, por medio del ADN como una sonda. Por ejemplo, tal ADN se puede identificar por la hibridación de un filtro, sobre el cual se ha inmovilizado ADN derivado de la colonia o placa o un fragmento de ADN de este, a 65°C en presencia de 0,7 a 1,0 M de NaCl, y después se lava el filtro a 65°C con una solución 0,1 a 2 x SSC (en el que una solución de 1 x SSC consiste en 150 mM de cloruro de sodio y 15 mM de citrato de sodio). La hibridación se puede llevar por el procedimiento descripto en el Molecular Cloning 2nd Ed. The previous sentence "DNA that hybridizes with ... under stringent conditions" It is used to mean the DNA nucleotide sequence obtained by the colony hybridization procedure, the plate hybridization procedure or the Southern hybridization procedure, by means of the DNA as a probe. For example, such DNA can be identified by hybridization of a filter, on which DNA derived from the colony or plate or a DNA fragment thereof has been immobilized, at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1.0 M of NaCl, and then the filter is washed at 65 ° C with a 0.1 to 2 x SSC solution (in which a 1 x SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate) . Hybridization can be carried out by the procedure described in the Molecular Cloning 2nd Ed.

El ADN que tiene un nivel determinado de homología con la secuencia de nucleótidos de ADN usado como una sonda es un ejemplo de la hibridación del ADN anterior en condiciones rigurosas. Tal ADN tiene homología de, por ejemplo 70% o más, preferentemente 80% o más, más preferentemente 90% o más, también preferentemente 93% DNA that has a certain level of homology with the DNA nucleotide sequence used as a probe is an example of hybridization of the above DNA under stringent conditions. Such DNA has homology of, for example 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, also preferably 93%

: o más, con particular preferencia 95% o más, y con máxima preferencia 98% o más, con el ADN usado como una sonda. or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more, with the DNA used as a probe.

Un procedimiento de obtener el ADN de la presente invención no está particularmente limitado. Se preparan sondas A method of obtaining the DNA of the present invention is not particularly limited. Probes are prepared

: o cebadores adecuados sobre la base de la información con respecto a la secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NOS: 1 y 2 en el listado de secuencias en la presente memoria descriptiva, y la biblioteca de ADNc de un ser humano y similares se seleccionan por medio de tales sondas o cebadores, de modo de aislar el ADN de la presente invención. Tal biblioteca de ADNc se produce preferentemente de una célula, órgano o tejido, que expresa el ADN de la presente invención. or suitable primers based on information regarding the amino acid sequence and nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 in the sequence listing herein, and the cDNA library of a being human and the like are selected by means of such probes or primers, so as to isolate the DNA of the present invention. Such a cDNA library is preferably produced from a cell, organ or tissue, which expresses the DNA of the present invention.

También es posible producir el ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 por el procedimiento de PCR. Por medio de un ADN cromosómico humano o biblioteca de ADNc como un molde, se realiza la PCR con un par de cebadores que se han diseñado para amplificar la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. La condiciones de reacción de la PCR se pueden determinar según sea apropiado. Por ejemplo, un procedimiento de reacción consiste en 94°C y 30 segundos (desnaturalización), 55°C y 30 segundos a 1 minuto (apareamiento), y 72°C y 2 minutos (elongación) se define como 1 ciclo. Tal procedimiento de reacción se lleva a cabo 30 ciclos, y a partir de este momento, se lleva a cabo una reacción que consiste en 72°C y 7 minutos. A partir de este momento, el fragmento de ADN amplificado se clona en un vector adecuado capaz de replicar en un huésped tal como Escherichia coli. It is also possible to produce the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 by the PCR procedure. By means of a human chromosomal DNA or cDNA library as a template, PCR is performed with a pair of primers that are designed to amplify the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. The reaction conditions of the PCR can be determined as appropriate. For example, a reaction procedure consists of 94 ° C and 30 seconds (denaturation), 55 ° C and 30 seconds at 1 minute (mating), and 72 ° C and 2 minutes (elongation) is defined as 1 cycle. Such a reaction procedure is carried out 30 cycles, and from this moment on, a reaction consisting of 72 ° C and 7 minutes is carried out. From this moment on, the amplified DNA fragment is cloned into a suitable vector capable of replicating in a host such as Escherichia coli.

La preparación de cebadores o sondas anteriormente mencionados, la construcción de una biblioteca de ADNc, selección de una biblioteca de ADNc, y clonación de un gen de interés ya son conocidos por los expertos en la técnica. Estas operaciones se pueden llevar a cabo de acuerdo con los procedimientos descriptos en Molecular Cloning 2nd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, y similares. The preparation of primers or probes mentioned above, the construction of a cDNA library, selection of a cDNA library, and cloning of a gene of interest are already known to those skilled in the art. These operations can be carried out in accordance with the procedures described in Molecular Cloning 2nd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, and the like.

(3) Anticuerpo (3) Antibody

Un anticuerpo se puede preparar por el reconocimiento de una porción o el total del péptido mencionado anteriormente de la presente invención como un epitopo (antígeno), y linfocitos T citotóxicos (citolíticos) inducido por la estimulación in vitro por medio del péptido descrito anteriormente. En general, CTL exhibe actividad antitumoral más fuerte que un anticuerpo. An antibody can be prepared by the recognition of a portion or total of the aforementioned peptide of the present invention as an epitope (antigen), and cytotoxic (cytolytic) T lymphocytes induced by in vitro stimulation by means of the peptide described above. In general, CTL exhibits stronger antitumor activity than an antibody.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Se puede producir por procedimientos comunes. The antibody can be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. It can be produced by common procedures.

Por ejemplo, un anticuerpo policlonal se puede obtener por la inmunización de un mamífero con el péptido de la presente invención como un antígeno, recolección de la sangre del mamífero, y después la separación y purificación de un anticuerpo de la sangre recolectada. Los ejemplos de un mamífero inmunizado pueden incluir un ratón, un hámster, un cobayo, un pollo, una rata, un conejo, un perro, una cabra, una oveja y un bovino. El procedimiento de inmunización es conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un antígeno se puede administrar 2 o 3 veces en intervalos de 7 a 30 días. La dosis se puede ajustar aproximadamente a 0,05 a 2 mg de antígeno por administración. Una vía de administración no está particularmente limitada. Una vía de administración adecuada se puede seleccionar apropiadamente de administración subcutánea, administración intracutánea, administración intraperitoneal, administración intravenosa y administración intramuscular. Además, un antígeno se puede disolver en una solución de buffer adecuada que contiene un adyuvante comúnmente usado tal como adyuvante de Freund completo o hidróxido de aluminio, antes de usar. For example, a polyclonal antibody can be obtained by immunizing a mammal with the peptide of the present invention as an antigen, collecting blood from the mammal, and then separating and purifying an antibody from the collected blood. Examples of an immunized mammal may include a mouse, a hamster, a guinea pig, a chicken, a rat, a rabbit, a dog, a goat, a sheep and a bovine. The immunization procedure is known to those skilled in the art. For example, an antigen can be administered 2 or 3 times at intervals of 7 to 30 days. The dose can be adjusted to approximately 0.05 to 2 mg of antigen per administration. One route of administration is not particularly limited. A suitable route of administration can be appropriately selected from subcutaneous administration, intracutaneous administration, intraperitoneal administration, intravenous administration and intramuscular administration. In addition, an antigen can be dissolved in a suitable buffer solution containing a commonly used adjuvant such as complete Freund's adjuvant or aluminum hydroxide, before use.

Tal mamífero inmunizado se puede criar durante un determinado período de tiempo y cuando su título de anticuerpo comienza a aumentar, se puede realizar un refuerzo por medio de 100 Ig a 1.000 Ig del antígeno, por ejemplo, 1 o 2 meses después de la administración final, la sangre se recolecta del mamífero inmunizado. La sangre recolectada después se separa y purifica por procedimientos comunes que incluyen centrifugación, precipitación por medio de sulfato de amonio o polietilenglicol, o cromatografía tal como cromatografía por filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, o cromatografía de afinidad y, de modo de obtener un anticuerpo policlonal que reconoce la proteína de la presente invención como un antisuero policlonal. Such an immunized mammal can be raised for a certain period of time and when its antibody titer begins to increase, a booster can be performed by means of 100 Ig to 1,000 Ig of the antigen, for example, 1 or 2 months after the final administration. , blood is collected from the immunized mammal. The blood collected is then separated and purified by common procedures including centrifugation, precipitation by means of ammonium sulfate or polyethylene glycol, or chromatography such as gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, or affinity chromatography and, so as to obtain a polyclonal antibody that recognizes the protein of the present invention as a polyclonal antiserum.

A la inversa, un anticuerpo monoclonal se puede obtener por la preparación de hibridomas. Los hibridomas se pueden obtener, por ejemplo, por fusión celular entre las células generadoras de anticuerpo y células de mieloma. Conversely, a monoclonal antibody can be obtained by preparing hybridomas. Hybridomas can be obtained, for example, by cell fusion between antibody generating cells and myeloma cells.

Los hibridomas que generan el anticuerpo monoclonal se puede obtener por el siguiente procedimiento de fusión celular. Hybridomas that generate the monoclonal antibody can be obtained by the following cell fusion procedure.

Las células del bazo, células del ganglio linfático, linfocitos B o similares recolectados del animal inmunizado se usan como células generadoras de anticuerpo. El péptido de la presente invención se usa como antígeno. Se puede usar un ratón, una rata, o similares como animal para inmunizar. La administración de un antígeno a tal animal se lleva a cabo por procedimientos comunes. Por ejemplo, una suspensión o líquido emulsionado de un adyuvante tal como adyuvante de Freund completo o adyuvante de Freund incompleto y el péptido de la presente invención usado como antígeno se administra por vía intravenosa, subcutánea, intracutánea o interperitoneal a un animal varias veces para la inmunización. Por ejemplo, las células del bazo se obtienen del animal inmunizado de este modo como células generadoras de anticuerpo, y las células obtenidas se fusionan con las células del mieloma por un procedimiento conocido (G. Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975)), de modo de producir hibridomas. Spleen cells, lymph node cells, B lymphocytes or the like collected from the immunized animal are used as antibody generating cells. The peptide of the present invention is used as an antigen. A mouse, a rat, or the like can be used as an animal to immunize. The administration of an antigen to such animal is carried out by common procedures. For example, a suspension or emulsified liquid of an adjuvant such as complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant and the peptide of the present invention used as an antigen is administered intravenously, subcutaneously, intracutaneously or interperitoneally to an animal several times for immunization. For example, spleen cells are obtained from the animal immunized in this way as antibody generating cells, and the cells obtained are fused with myeloma cells by a known procedure (G. Kohler et al., Nature, 256, 495 ( 1975)), in order to produce hybridomas.

Los ejemplos de una línea celular de mieloma usada para la fusión celular pueden incluir P3X63Ag8 de ratón, línea P3U1 de ratón, y línea Sp2/0 de ratón. Para la fusión celular, se usan agentes de promoción de fusión tal como polietilenglicol o virus Sendai. Para la selección de los hibridomas después de completar la fusión celular, se usa el medio de hipoxantina anminopterina timidina (HAT) de acuerdo con procedimientos comunes. Los hibridomas por fusión celular se clonan por dilución limitante o similares. A partir de este momento, según sea necesario, se realiza una selección por inmunoensayo enzimático por medio del péptido de la presente invención, de modo de obtener una línea celular que genera un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente el péptido de la presente invención. Examples of a myeloma cell line used for cell fusion can include mouse P3X63Ag8, mouse P3U1 line, and mouse Sp2 / 0 line. For cell fusion, fusion promotion agents such as polyethylene glycol or Sendai virus are used. For the selection of hybridomas after completing cell fusion, the hypoxanthine anminopterin thymidine (HAT) medium is used according to common procedures. Hybridomas by cell fusion are cloned by limiting dilution or the like. From this moment, as necessary, an enzyme immunoassay selection is made by means of the peptide of the present invention, so as to obtain a cell line that generates a monoclonal antibody that specifically recognizes the peptide of the present invention.

A fin de producir un anticuerpo monoclonal de interés a partir del hibridoma así obtenido, el hibridoma se puede cultivar por el procedimiento de cultivo celular común o procedimiento de formación de ascitis y el anticuerpo monoclonal se puede purificar del sobrenadante del cultivo o ascitis. El anticuerpo monoclonal se puede purificar del sobrenadante del cultivo o ascitis por procedimientos comunes. Por ejemplo, se puede usar apropiadamente en combinación fraccionamiento del sulfato de amonio, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, o cromatografía de afinidad y similares. In order to produce a monoclonal antibody of interest from the hybridoma thus obtained, the hybridoma can be cultured by the common cell culture procedure or ascites formation procedure and the monoclonal antibody can be purified from the culture supernatant or ascites. The monoclonal antibody can be purified from the culture supernatant or ascites by common procedures. For example, ammonium sulfate fractionation, gel filtration, ion exchange chromatography, or affinity chromatography and the like can be used appropriately in combination.

Más aún, se puede preparar fragmentos del anticuerpo mencionado anteriormente. Los ejemplos de tal fragmento de anticuerpo puede incluir un fragmento F(ab’)2 y un fragmento Fab’. Moreover, fragments of the aforementioned antibody can be prepared. Examples of such an antibody fragment may include an F (ab ’) 2 fragment and a Fab’ fragment.

Además, se puede preparar un anticuerpo marcado obtenido por el anticuerpo mencionado anteriormente. Es decir, el anticuerpo producido como se describió anteriormente se puede marcar antes de usar. El tipo de una sustancia usada para marcar el anticuerpo de la presente invención y un procedimiento de marcación son conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de tal procedimiento de marcación puede incluir: marcación enzimática con peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina; marcación fluorescente con FITC (isotiocianato de fluoresceína) o TRITC (isotiacianato de tetrametilrodamina B); marcación con sustancias colorantes tales como metal coloidal o látex coloreado; marcación de afinidad con biotina; y marcación isotópica con 125I. El análisis o medición del péptido de la presente invención (que es un antígeno de cáncer) con el anticuerpo marcado se puede realizar de acuerdo con procedimientos ampliamente conocidos en la técnica, tales como la técnica de anticuerpo enzimático, tinción inmunohistológica, inmunotransferencia, el procedimiento del anticuerpo fluorescente directo o el procedimiento del anticuerpo fluorescente indirecto. In addition, a labeled antibody obtained by the aforementioned antibody can be prepared. That is, the antibody produced as described above can be labeled before use. The type of a substance used to label the antibody of the present invention and a labeling procedure are known to those skilled in the art. Examples of such a labeling procedure may include: enzymatic labeling with horseradish peroxidase or alkaline phosphatase; fluorescent labeling with FITC (fluorescein isothiocyanate) or TRITC (tetramethylrodamine B isothiacyanate); marking with coloring substances such as colloidal metal or colored latex; affinity labeling with biotin; and isotopic marking with 125I. The analysis or measurement of the peptide of the present invention (which is a cancer antigen) with the labeled antibody can be performed in accordance with procedures widely known in the art, such as the enzyme antibody technique, immunohistological staining, immunoblotting, the procedure of the direct fluorescent antibody or the indirect fluorescent antibody procedure.

(4) Células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos, o población de inmunocitos que contienen estas células (4) Auxiliary T cells, cytotoxic T lymphocytes, or population of immunocytes containing these cells

La presente invención también se refiere a células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos, o una población de inmunocitos que contienen estas células, que son inducidas por la estimulación in vitro por medio del antígeno de cáncer o péptido de la presente invención o una mezcla de ellos. Por ejemplo, cuando los linfocitos de sangre periférica o linfocitos de infiltración en el tumor se estimulan in vitro con el péptido de la presente invención, se inducen las células T activadas receptivas del tumor. Las células T activadas se pueden usar efectivamente para la inmunoterapia adoptiva. Más aún, el antígeno de cáncer o péptido de la presente invención se deja expresar en células dendríticas que son células que presentan antígenos fuertes in vivo o in vitro, de este modo realiza la estimulación inmunológica por la administración de las células dendríticas en las que se ha expresado el antígeno. The present invention also relates to helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, or a population of immunocytes containing these cells, which are induced by in vitro stimulation by means of the cancer antigen or peptide of the present invention or a mixture thereof. . For example, when peripheral blood lymphocytes or infiltration lymphocytes in the tumor are stimulated in vitro with the peptide of the present invention, the receptive activated T cells of the tumor are induced. Activated T cells can be used effectively for adoptive immunotherapy. Moreover, the cancer antigen or peptide of the present invention is allowed to express in dendritic cells that are cells that have strong antigens in vivo or in vitro, thus performing immunological stimulation by the administration of dendritic cells in which has expressed the antigen.

Preferentemente, las células T auxiliares, los linfocitos T citotóxicos, o una población de inmunocitos que contiene estas células se inducen con estimulación in vitro por medio del antígeno de cáncer o péptido de la presente invención o una mezcla de ellos y un activador inmunológico. Los ejemplos de un activador inmunológico que se usan en la presente pueden incluir un factor de crecimiento celular y citoquina. Preferably, helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, or a population of immunocytes containing these cells are induced with in vitro stimulation by means of the cancer antigen or peptide of the present invention or a mixture thereof and an immune activator. Examples of an immune activator that are used herein may include a cell growth factor and cytokine.

Las células T auxiliares, los linfocitos T citotóxicos, o una población de inmunocitos que contiene estas células obtenidas como se describió anteriormente se transfieren en un cuerpo para suprimir el tumor, de este modo se previenen y/o tratan los cánceres. Auxiliary T cells, cytotoxic T lymphocytes, or a population of immunocytes containing these cells obtained as described above are transferred into a body to suppress the tumor, thereby preventing and / or treating cancers.

Además, las células T auxiliares, los linfocitos T citotóxicos, o una población de inmunocitos que contiene estas células, que pueden suprimir el tumor como se describió anteriormente, se pueden producir usando el antígeno de cáncer o péptido de la presente invención o una mezcla de ellos. Por consiguiente, la presente invención proporciona una solución del cultivo celular que contiene el antígeno de cáncer o péptido de la presente invención o In addition, helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, or a population of immunocytes containing these cells, which can suppress the tumor as described above, can be produced using the cancer antigen or peptide of the present invention or a mixture of they. Accordingly, the present invention provides a cell culture solution containing the cancer antigen or peptide of the present invention or

una mezcla de ellos. Por medio de tal solución del cultivo celular, se pueden producir las células T auxiliares, los linfocitos T citotóxicos, o una población de inmunocitos que contiene estas células, que pueden suprimir el tumor. Además, la presente invención proporciona un kit de cultivo celular para producir las células T auxiliares, los linfocitos T citotóxicos, o una población de inmunocitos que contiene estas células, que comprenden la solución del cultivo celular anteriormente mencionada y un recipiente del cultivo celular. A mixture of them. Through such a cell culture solution, auxiliary T cells, cytotoxic T lymphocytes, or a population of immunocytes containing these cells, which can suppress the tumor can be produced. In addition, the present invention provides a cell culture kit for producing auxiliary T cells, cytotoxic T lymphocytes, or a population of immunocytes containing these cells, which comprise the above-mentioned cell culture solution and a cell culture vessel.

(5) Vacuna para el cáncer de la presente invención (5) Cancer vaccine of the present invention

Debido a que el ADN, antígeno de cáncer, y péptido de la presente invención puede inducir linfocitos T citotóxicos específicos de las células cancerosas, se prevé que ellos se pueden usar como agentes terapéuticos y/o preventivos para los cánceres. Por ejemplo, la bacteria BCG transformada por el ADN recombinante obtenida por la incorporación del ADN de la presente invención en un vector adecuado o virus tales como virus vaccinia en el genoma del cual se ha incorporado el ADN de la presente invención, se puede usar efectivamente como vacuna de virus vivo para tratar y/o prevenir los cánceres humanos. La dosis y el procedimiento de administración de la vacuna para el cáncer son los mismos que los de la vacunación ordinaria o vacuna BCG. Because the DNA, cancer antigen, and peptide of the present invention can induce cytotoxic T lymphocytes specific to cancer cells, it is envisioned that they can be used as therapeutic and / or preventive agents for cancers. For example, BCG bacteria transformed by recombinant DNA obtained by incorporating the DNA of the present invention into a suitable vector or viruses such as vaccinia virus in the genome of which the DNA of the present invention has been incorporated, can be effectively used. as a live virus vaccine to treat and / or prevent human cancers. The dose and procedure for administering the cancer vaccine are the same as those for ordinary BCG vaccination.

A saber, el ADN de la presente invención (como tal, o en forma de ADN plásmido que se incorpora en un vector de expresión), y el virus recombinante o la bacteria recombinante que contienen el ADN anterior se administran como una vacuna para el cáncer a mamíferos que incluyen un ser humano, directamente o en un estado en que se dispersan en un adyuvante. Asimismo, el péptido de la presente invención se puede administrar a estas como una vacuna para el cáncer, en un estado dispersado en un adyuvante. Namely, the DNA of the present invention (as such, or in the form of plasmid DNA that is incorporated into an expression vector), and the recombinant virus or the recombinant bacteria containing the above DNA are administered as a cancer vaccine. to mammals that include a human being, directly or in a state in which they are dispersed in an adjuvant. Also, the peptide of the present invention can be administered to them as a cancer vaccine, in a state dispersed in an adjuvant.

Los ejemplos de un adyuvante usados en la presente invención pueden incluir Adyuvante de Freund incompleto, BCG, dimicolato de trehalosa (TDM), lipopolisacárido (LPS), adyuvante de alumbre, y adyuvante de sílice. Desde el punto de vista de la capacidad de inducir anticuerpos, se usa preferentemente el adyuvante de Freund incompleto (FIA). Examples of an adjuvant used in the present invention may include incomplete Freund's adjuvant, BCG, trehalose dimicolate (TDM), lipopolysaccharide (LPS), alum adjuvant, and silica adjuvant. From the standpoint of the ability to induce antibodies, incomplete Freund's adjuvant (FIA) is preferably used.

(6)Sonda para diagnosticar cánceres, agente para diagnosticar cánceres, y agente preventivo y/o terapéutico contra los cánceres (6) Probe to diagnose cancers, agent to diagnose cancers, and preventive and / or therapeutic agent against cancers

El ADN de la presente invención se puede usar como una sonda de diagnóstico, en que se extraen los ADN de diversos tipos y posteriormente se examina la homología entre ellos. Más aún, esta sonda el anticuerpo descrito anteriormente también se puede usar como un agente para diagnosticar cánceres. The DNA of the present invention can be used as a diagnostic probe, in which DNA of various types are extracted and then the homology between them is examined. Moreover, this probe the antibody described above can also be used as an agent to diagnose cancers.

Es decir, una sonda se puede preparar para diagnosticar cánceres, que comprende el total o una parte de la cadena antisentido de ADN o ARN que codifica el péptido de la presente invención. Se puede preparar un agente para diagnosticar cánceres, que comprende la sonda descrita anteriormente para diagnosticar cánceres o un anticuerpo que reacciona con el péptido de la presente invención. La sonda para diagnosticar cánceres es preferentemente el total o una parte de la cadena antisentido de ADN (cADN) o ARN (ARNc) que codifica el péptido de la presente invención, que preferentemente tiene una longitud demasiado larga como sonda (al menos 20 bases). Por ejemplo, el ARNm del péptido (antígeno de cáncer) de la presente invención obtenida de un analito se detecta por medio de la cadena antisentido descrita anteriormente, de este modo permite el diagnóstico de los cánceres. Los ejemplos de un analito usado para la detección puede incluir el ADN genómico que se puede obtener por la biopsia de las células de un sujeto, tal como sangre, orina, saliva, o tejidos; ARN y ADNc, pero los ejemplos no se limitan a estos. Cuando se usa tal analito, también pueden usar los amplificados por PCR y similares. That is, a probe can be prepared to diagnose cancers, which comprises all or part of the DNA or RNA antisense chain encoding the peptide of the present invention. An agent for diagnosing cancers can be prepared, comprising the probe described above to diagnose cancers or an antibody that reacts with the peptide of the present invention. The probe for diagnosing cancers is preferably all or part of the antisense strand of DNA (cDNA) or RNA (cRNA) encoding the peptide of the present invention, which preferably is too long as a probe (at least 20 bases) . For example, the peptide mRNA (cancer antigen) of the present invention obtained from an analyte is detected by means of the antisense chain described above, thus allowing the diagnosis of cancers. Examples of an analyte used for detection can include genomic DNA that can be obtained by biopsy of a subject's cells, such as blood, urine, saliva, or tissues; RNA and cDNA, but the examples are not limited to these. When such an analyte is used, those amplified by PCR and the like can also be used.

El tipo de cáncer no está particularmente limitado en la presente memoria descriptiva. Los ejemplos específicos de cáncer pueden incluir cáncer pancreático, cáncer de colon, tumor cerebral, melanoma maligno, leucemia mielocítica crónica, leucemia mielocítica aguda, linfoma, cáncer esofágico, cáncer renal, cáncer prostático, cáncer de pulmón, cáncer de mamas, cáncer de estómago, cáncer hepático, cáncer de vesícula, cáncer testicular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer tiroideo, cáncer de vejiga, y sarcoma. The type of cancer is not particularly limited in the present specification. Specific examples of cancer may include pancreatic cancer, colon cancer, brain tumor, malignant melanoma, chronic myelocytic leukemia, acute myelocytic leukemia, lymphoma, esophageal cancer, renal cancer, prostate cancer, lung cancer, breast cancer, stomach cancer , liver cancer, gallbladder cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, bladder cancer, and sarcoma.

La respuesta inmune de un paciente de cáncer a las células cancerosas es inesperadamente activa y se halla que se generan anticuerpos IgG en varios tipos de proteínas. Como se describió posteriormente en los ejemplos, la proteína del antígeno hsp105a está altamente expresada específicamente en el cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de mamas, cáncer esofágico, linfoma maligno, feocromocitoma, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga y seminoma. The immune response of a cancer patient to cancer cells is unexpectedly active and it is found that IgG antibodies are generated in various types of proteins. As described later in the examples, the hsp105a antigen protein is highly specifically expressed in pancreatic cancer, colon cancer, breast cancer, esophageal cancer, malignant lymphoma, pheochromocytoma, thyroid cancer, bladder cancer and seminoma.

El péptido de la presente invención puede inducir linfocitos T citotóxicos específicos de la célula cancerosa como los epitopos de las células T. En consecuencia, es útil como agente preventivo y/o terapéutico usado para los cánceres humanos. Además, el anticuerpo preparado es también efectivo como un agente preventivo y/o terapéutico usado para los cánceres humanos, a condición de que pueda inhibir la actividad del péptido de la presente invención que es un antígeno de cáncer. Como uso practico, el péptido de la presente invención se puede administrar directamente, o en conjunto con un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable, o también en conjunto con los agentes auxiliares mencionados más adelante, según sea necesario, de modo de crear una inyección. Por otra parte, también se puede administrar por absorción percutánea por medio de la mucosa de acuerdo con un procedimiento tal como pulverización. El término "portador” que se usa en la presente significa, por ejemplo, albúmina sérica humana. Los ejemplos de un diluyente pueden incluir PBS y agua destilada. The peptide of the present invention can induce cytotoxic T lymphocytes specific to the cancer cell as the epitopes of the T cells. Consequently, it is useful as a preventive and / or therapeutic agent used for human cancers. In addition, the prepared antibody is also effective as a preventive and / or therapeutic agent used for human cancers, provided that it can inhibit the activity of the peptide of the present invention that is a cancer antigen. As a practical use, the peptide of the present invention can be administered directly, or in conjunction with a pharmaceutically acceptable carrier and / or diluent, or also in conjunction with the auxiliary agents mentioned below, as necessary, so as to create an injection. . On the other hand, it can also be administered by percutaneous absorption by means of the mucosa according to a method such as spraying. The term "carrier" used herein means, for example, human serum albumin. Examples of a diluent may include PBS and distilled water.

Como dosificación, el antígeno de cáncer o péptido de la presente invención se puede administran dentro de un intervalo entre 0,01 mg y 100 mg por una vez por adulto. Sin embargo, una dosis no se limita a al intervalo anterior. Asimismo, la forma de dosis no está particularmente limitada. También se puede usar un producto liofilizado, o gránulos producidos por la adición de un excipiente tal como azúcar al antígeno de cáncer, péptido, o anticuerpo de la presente invención. As a dosage, the cancer antigen or peptide of the present invention can be administered within a range between 0.01 mg and 100 mg once per adult. However, one dose is not limited to the previous interval. Also, the dosage form is not particularly limited. A lyophilized product, or granules produced by the addition of an excipient such as sugar to the cancer antigen, peptide, or antibody of the present invention can also be used.

Los ejemplos de un agente auxiliar que se puede añadir al agente de la presente invención para aumentar la actividad de inducir los linfocitos T citotóxicos pueden incluir componentes fúngicos de la bacteria BCG o similares, ISCOM descrito en Nature, vol. 344, p. 873 (1990), QS-21 de saponinas descrito en J. Immunol, vol. 148, p.1438 (1992), liposoma, e hidróxido de aluminio. Además, también pueden usar activadores inmunológicos tales como lentinano, esquizofilano, o Picibanilo como agentes auxiliares. Además, también se pueden usar citoquinas que promueven el crecimiento o diferenciación de las células T, tales como IL-2, IL-4, IL-12, IL-1, IL-6, o TNF, como agentes auxiliares. Examples of an auxiliary agent that can be added to the agent of the present invention to increase the activity of inducing cytotoxic T lymphocytes may include fungal components of the BCG bacteria or the like, ISCOM described in Nature, vol. 344, p. 873 (1990), QS-21 of saponins described in J. Immunol, vol. 148, p.1438 (1992), liposome, and aluminum hydroxide. In addition, they can also use immunological activators such as lentinan, schizophilane, or picibanil as auxiliary agents. In addition, cytokines that promote the growth or differentiation of T cells, such as IL-2, IL-4, IL-12, IL-1, IL-6, or TNF, can also be used as auxiliary agents.

Además, el péptido antigénico descrito anteriormente se añade a las células recolectadas de un paciente o células que tienen el mismo haplotipo HLA en un tubo de ensayo, de modo de permitir que las células presenten un antígeno. A partir de este momento, se administra en el vaso sanguíneo del paciente, de modo que los linfocitos T citotóxicos pueden ser inducidos efectivamente en el organismo del paciente. Más aún, el péptido descrito anteriormente se añade a los linfocitos de sangre periférica de un paciente, y posteriormente se cultiva en un tubo de ensayo, de modo que se pueden inducir los linfocitos T citotóxicos en el tubo de ensayo y después retornar a los vasos sanguíneos del paciente. Tal tratamiento que involucra una transferencia celular ya se ha realizado como tratamiento de cáncer y en consecuencia, es bien conocido por los expertos en la técnica. In addition, the antigenic peptide described above is added to cells collected from a patient or cells that have the same HLA haplotype in a test tube, so as to allow the cells to present an antigen. From this moment, it is administered in the patient's blood vessel, so that cytotoxic T lymphocytes can be effectively induced in the patient's organism. Moreover, the peptide described above is added to a patient's peripheral blood lymphocytes, and subsequently cultured in a test tube, so that cytotoxic T lymphocytes can be induced in the test tube and then returned to the vessels blood of the patient. Such treatment that involves a cell transfer has already been performed as a cancer treatment and consequently, is well known to those skilled in the art.

En la inmunoterapia antitumoral específica se requiere que un antígeno diana sea un antígeno reconocido por los linfocitos T citotóxicos (células T citolíticas/CTL). El antígeno de la presente invención ha aumentado la actividad estimulante de las células T citolíticas in vitro sobre HLA-A24 ampliamente hallado en los japoneses, o en HLA-A2 ampliamente hallado en todo el mundo. En consecuencia, la inyección del antígeno de la presente invención en un organismo induce la activación de CTL, y como resultado, se puede prever la obtención de efectos antitumorales. Además, cuando los linfocitos se estimulan con el antígeno de la presente invención in vitro, se inducen las células T activadas. Las células T activadas de este modo se inyectan en un área afectada. En consecuencia, este procedimiento se puede usar efectivamente como una inmunoterapia adoptiva. In specific antitumor immunotherapy, a target antigen is required to be an antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes (cytolytic T cells / CTL). The antigen of the present invention has increased the stimulatory activity of cytolytic T cells in vitro on HLA-A24 widely found in the Japanese, or on HLA-A2 widely found throughout the world. Consequently, the injection of the antigen of the present invention into an organism induces the activation of CTL, and as a result, the obtaining of antitumor effects can be anticipated. In addition, when lymphocytes are stimulated with the antigen of the present invention in vitro, activated T cells are induced. T cells activated in this way are injected into an affected area. Consequently, this procedure can be used effectively as an adoptive immunotherapy.

Ejemplos Examples

El antígeno de la presente invención, su procedimiento de producción y sus efectos se describirán en los siguientes ejemplos. The antigen of the present invention, its production process and its effects will be described in the following examples.

Ejemplo 1 Example 1

Recolección de suero Serum collection

El suero se recolectó de un paciente con cáncer pancreático. El suero recolectado se conservó a -80°C. A partir de esta muestra de suero, se eliminaron un anticuerpo que reacciona con Escherichia coli y el fago A por medio de una columna que se llenó con materia disuelta de Escherichia coli y fago y sefarosa 4B. A partir de este momento, el suero resultante se diluyó 100 a 800 veces y posteriormente se usó. The serum was collected from a patient with pancreatic cancer. The collected serum was stored at -80 ° C. From this serum sample, an antibody that reacts with Escherichia coli and phage A was removed by means of a column that was filled with dissolved matter of Escherichia coli and phage and sepharose 4B. From this moment on, the resulting serum was diluted 100 to 800 times and subsequently used.

Biblioteca de ADNc y producción de proteína CDNA and protein production library

Una biblioteca de ADNc de fago producida por la inserción de ADNc de una línea celular de cáncer pancreático CFPAC-1 en un vector de expresión AZAP se adquirió en Stratagene, La Jolla, CA. Escherichia coli se infectó con esta biblioteca de ADNc de fago A y posteriormente se cultivó en un medio de placa NZY a 42°C durante 6 horas, de modo de producir placas. A partir de este momento, la placa se cubrió con una membrana de nitrocelulosa en la que se ha infiltrado isopropil �-D-tiogalactósido (IPTG) a 37°C durante 3 horas, de modo de producir una proteína codificada por el ADNc que se ha incorporado en el fago A en las placas. A phage cDNA library produced by the insertion of cDNA from a CFPAC-1 pancreatic cancer cell line into an AZAP expression vector was purchased from Stratagene, La Jolla, CA. Escherichia coli was infected with this phage A cDNA library and subsequently cultured in a NZY plate medium at 42 ° C for 6 hours, so as to produce plaques. From this moment, the plate was covered with a nitrocellulose membrane into which isopropyl �-D-thiogalactoside (IPTG) has been infiltrated at 37 ° C for 3 hours, so as to produce a protein encoded by the cDNA that is has incorporated in phage A in the plates.

Inmunoselección Immunoselection

La proteína producida por el procedimiento mencionado anteriormente se transfirió en una membrana de nitrocelulosa. Después del bloqueo, la nitrocelulosa se lavó, y después se dejó reaccionar con el suero descrito anteriormente a 4°C durante 15 horas. Después de lavar, se usó un anticuerpo IgG anti-humano de ratón marcado con peroxidasa de rábano (HRP) como anticuerpo secundario, y se dejó reaccionar con la membrana. Después del lavado, se detectó la quimioluminiscencia en una película de rayos X, y se comparó con la placa en una fotografía, de modo que se eligieron las placas positivas junto son las placas negativas periféricas. Las placas correspondientes a los sitios positivos en una reacción de color se recolectaron de una placa de agarosa NZY de 15 cm. Las placas recolectadas posteriormente se disolvieron en una solución buffer SM (100 mM de NaCl, 10 mM de MgSO4, 50 mM de Tris-HCl, y 0,01% de gelatina; pH 7,5). Las placas de positivas a la reacción de color se sometieron a una segunda selección y una tercera selección por el mismo procedimiento anterior, hasta que fueron una colonia única, de este modo se obtiene un clon de fago único con el cual reacciona un anticuerpo IgG en el suero. Por el The protein produced by the aforementioned procedure was transferred on a nitrocellulose membrane. After blocking, the nitrocellulose was washed, and then allowed to react with the serum described above at 4 ° C for 15 hours. After washing, a mouse anti-human IgG antibody labeled with horseradish peroxidase (HRP) was used as the secondary antibody, and allowed to react with the membrane. After washing, chemiluminescence was detected on an X-ray film, and compared to the plate in a photograph, so that the positive plates were chosen together are the peripheral negative plates. The plates corresponding to the positive sites in a color reaction were collected from a 15 cm NZY agarose plate. The plates collected subsequently were dissolved in an SM buffer solution (100 mM NaCl, 10 mM MgSO4, 50 mM Tris-HCl, and 0.01% gelatin; pH 7.5). The color reaction positive plates were subjected to a second selection and a third selection by the same procedure above, until they were a single colony, thus obtaining a single phage clone with which an IgG antibody reacts in the serum For him

procedimiento descripto anteriormente, se aislaron 63 clones positivos del ADNc derivado de la línea celular de cáncer pancreático. procedure described above, 63 positive clones of the cDNA derived from the pancreatic cancer cell line were isolated.

Búsqueda de homología del gen del antígeno aislado Homology search of the isolated antigen gene

El ADN inserto se amplificó por el procedimiento de PCR, y se usó para el análisis posterior. El producto de PCR The inserted DNA was amplified by the PCR procedure, and was used for further analysis. PCR product

5 obtenido se secuenció por medio del kit de secuenciación de ADN Big Dye (PE Biosystems, CA), para determinar una secuencia de nucleótidos de este. Por medio del programa de búsqueda de homología BLAST (Herramienta de búsqueda de alineamiento local básico), se compararon cada una de las secuencias de nucleótidos así determinadas de 63 tipos de genes con la información génica registrada en el banco de datos de NCBI 5 obtained was sequenced by means of the Big Dye DNA sequencing kit (PE Biosystems, CA), to determine a nucleotide sequence thereof. Through the BLAST homology search program (Basic Local Alignment Search Tool), each of the nucleotide sequences thus determined from 63 types of genes were compared with the gene information recorded in the NCBI database

hsp105 hsp105

10 Como resultado, se hallaron 18 clones positivos que se muestran en la Tabla 1. Uno de los clones positivos fue hsp105. 10 As a result, 18 positive clones were found shown in Table 1. One of the positive clones was hsp105.

TABLE 1

Genes aislados por SEREX de una línea celular de adenocarcinoma ductal pancreático Genes isolated by SEREX from a pancreatic ductal adenocarcinoma cell line

Nombre del gen Gen/identidad de secuencia Búsqueda de base de datos SEREXa Gene name Gen / sequence identity SEREXa database search

KM-PA-1 apg-2 (familia de proteína de choque térmico 110) NGO-St-81, NY-CO-40, NY-CO-32 KM-PA-2 EST (KIAA0124) -KM-PA-3 �-actina -KM-PA-4 Proteína tipo coactosina (CLP) -KM-PA-5 HALPHA44 (alfa-tubulina) -KM-PA-6 desconocido -KM-PA-7 Quinasa tipo CDC (CLK3) -KM-PA-8 citoqueratina 18 -KM-PA-9 Proteína de unión poliA -KM-PA-10 acil-CoA-deshidrogenasa de cadena muy larga (VLCAD) -KM-PA-11 desconocido -KM-PA-12 Cadena pesada de HLA-Cw (MHC Clase 1) LONY-BR-26 KM-PA-13 desconocido -KM-PA-14 Proteína CGI 55 -KM-PA-15 Factor inhibidor de la glicosilación(GIF) Mz19-16a, Hom-HD1-21 KM-PA-16 desconocido NGO-St-95, NGO-St-103 KM-PA-17 Proteína A de unión al ADN (dbpA) -KM-PA-18 proteína de choque térmico 105 (KIAA0201) NY-CO-25 KM-PA-1 apg-2 (110 thermal shock protein family) NGO-St-81, NY-CO-40, NY-CO-32 KM-PA-2 EST (KIAA0124) -KM-PA-3 � -actin -KM-PA-4 Coactosin-like protein (CLP) -KM-PA-5 HALPHA44 (alpha-tubulin) -KM-PA-6 unknown -KM-PA-7 CDC-type kinase (CLK3) -KM-PA- 8 cytokeratin 18 -KM-PA-9 PolyA -KM-PA-10 very long chain acyl-CoA-dehydrogenase (VLCAD) -KM-PA-11 unknown -KM-PA-12 HLA-Cw heavy chain binding protein (MHC Class 1) LONY-BR-26 KM-PA-13 unknown -KM-PA-14 Protein CGI 55 -KM-PA-15 Glycosylation inhibitor factor (GIF) Mz19-16a, Hom-HD1-21 KM- Unknown PA-16 NGO-St-95, NGO-St-103 KM-PA-17 DNA binding protein (dbpA) -KM-PA-18 thermal shock protein 105 (KIAA0201) NY-CO-25

a El guión significa sin homología fuerte a The script means without strong homology

15 Confirmación de la expresión de hsp105 15 Confirmation of hsp105 expression

La presencia o ausencia de la expresión de una proteína de hsp105 se analizó por inmunohistoquímica en varios tipos de tejidos de cáncer y en tejidos normales. Como resultado, se halló que hp105 se expresa en tejidos de cáncer pancreático en tejidos de cáncer de colon, como se muestra en las Figuras 1 y 2. The presence or absence of the expression of an hsp105 protein was analyzed by immunohistochemistry in several types of cancer tissues and in normal tissues. As a result, hp105 was found to be expressed in pancreatic cancer tissues in colon cancer tissues, as shown in Figures 1 and 2.

Ejemplo 2 Example 2

<Péptido que constituye hsp105> <Peptide constituting hsp105>

Un motivo de unión para HLA-A24, para el cual el 60% de las personas japonesas son positivas, es casi idéntico a un motivo, se une el Kd del ratón BALB/c. Un péptido es compartido por hsp105 humano y hsp105 de ratón y se A binding motive for HLA-A24, for which 60% of Japanese people are positive, is almost identical to a motive, the Kd of the BALB / c mouse joins. A peptide is shared by human hsp105 and mouse hsp105 and is

5 predice que se une a ambos HLA-A24 y Kd se selecciona de la secuencia de hsp105, por medio de la predicción de unión del péptido HLA (hriv:// bimas/dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/). Se sintetizaron nueve tipos de péptidos que consisten en 9 o 10 aminoácidos por el procedimiento de Fmoc/PyBOP. Las secuencias de los péptidos y los valores de unión estimados para Kd se muestran en la Tabla 2. 5 predicts that it binds to both HLA-A24 and Kd is selected from the sequence of hsp105, by predicting binding of the HLA peptide (hriv: // bimas / dcrt.nih.gov / molbio / hla bind /). Nine types of peptides consisting of 9 or 10 amino acids were synthesized by the Fmoc / PyBOP procedure. The sequences of the peptides and the estimated binding values for Kd are shown in Table 2.

Tabla 2 Table 2

10 Péptidos derivados de hsp105 10 Peptides derived from hsp105

Péptidos derivados de hsp105 Peptides derived from hsp105

No. Posición Secuencia Puntuación de unión No. Position Sequence Union Score

1 hsp105180-188 NYGIYKQDL 2400 2 hsp105 214-223 AFNKGKLKVL 960 3 hsp105 251-260 KYKLDAKSKI 2880 4 hsp105 305-313 QFEELCAEL 1382 5 hsp105 433-442 TFLRRGPFEL 1920 6 hsp105 570-579 MYIETEGKMI 4800 7 hsp105 597-606 ECVYEFRDKL 80 8 hsp105 682-690 HYAKIAADF 60 9 hsp105 696-705 KYNHIDESEM 432 1 hsp105180-188 NYGIYKQDL 2400 2 hsp105 214-223 AFNKGKLKVL 960 3 hsp105 251-260 KYKLDAKSKI 2880 4 hsp105 305-313 QFEELCAEL 1382 5 hsp105 433-442 TFLRRGPFEL7 8107-71077107-7107-7107-577-7107-7107-7107-577-7105-7107-7105-7107-7107-7107-7107-7107-7107-7107-7107-7107-7107-7107-7107-7107-7107-7107-7107-7105 682-690 HYAKIAADF 60 9 hsp105 696-705 KYNHIDESEM 432

Ejemplo 3 Example 3

Vacuna de ADN DNA vaccine

El ADN del plásmido producido por la incorporación del ADNc de hsp105 de ratón en un vector de expresión Plasmid DNA produced by the incorporation of the mouse hsp105 cDNA into an expression vector

15 pCAGGS se ajustó a una concentración adecuada. Posteriormente se usó como vacuna para la siguiente prueba de evaluación de rendimiento. Con respecto a esta vacuna de ADN hsp105 de ratón-pCAGGS, se cultivó Escherichia coli y a partir de este momento, se extrajo el plásmido ADN de Escherichia coli y se purificó, de modo de producir la vacuna en gran escala. 15 pCAGGS was adjusted to an appropriate concentration. It was subsequently used as a vaccine for the next performance evaluation test. With respect to this hsp105 mouse-pCAGGS DNA vaccine, Escherichia coli was cultured and from this moment, the Escherichia coli DNA plasmid was extracted and purified, so as to produce the vaccine on a large scale.

Efectos anticáncer de la vacuna del péptido y la vacuna de ADN Anticancer effects of the peptide vaccine and the DNA vaccine

20 Las siguientes muestras se inyectaron en el músculo de cada ratón BALB/c: (1) una solución salina normal, (2) solo un vector, (3) un vector de ADNc de hsp105, (4) solo un adyuvante, (5) un adyuvante + un péptido. A partir de este momento, a línea celular de cáncer de colon Colon-26 derivada de un ratón singeneico, que expresa altamente hsp105, se trasplantó en forma subcutánea en el lomo del ratón. A partir de este momento, se evaluó el desarrollo del cáncer en los siguientes puntos: (1) el área de una porción cancerosa, (2) la proporción de los ratones en que se The following samples were injected into the muscle of each BALB / c mouse: (1) a normal saline solution, (2) only a vector, (3) an hsp105 cDNA vector, (4) only an adjuvant, (5 ) an adjuvant + a peptide. From this moment on, a colon-26 colon cancer cell line derived from a syngeneic mouse, which expresses highly hsp105, was subcutaneously transplanted into the back of the mouse. From this moment, the development of cancer was evaluated at the following points: (1) the area of a cancerous portion, (2) the proportion of the mice in which

25 desarrolló el cáncer, y (3) la proporción de los ratones sobrevivientes. Los resultados se muestran en las Figuras 3A, 3B, y 3C. 25 developed cancer, and (3) the proportion of surviving mice. The results are shown in Figures 3A, 3B, and 3C.

Como se muestra en las Figuras 3A, 3B, y 3C, cuando se trasplantaron 3 x 104 células de Colon-26, hasta 13 días después de la inmunización, se desarrolló un tumor en los 5 ratones inmunizados con solución salina normal y en los 5 ratones inmunizados solo con pCAGGS. A la inversa, en el caso de los 5 ratones inmunizados con la vacuna 30 hsp105-ADN, se desarrolló un tumor en un ratón 20 días después de la inmunización y en otro ratón 24 días después de la inmunización. Sin embargo, los 3 ratones restantes rechazaron completamente el desarrollo de un tumor. En el caso del grupo de administración con adyuvante, desarrolló un tumor en los 5 ratones hasta 24 días después de la inmunización. Se observó una diferencia significativa entre los grupos de administración con la vacuna de ADN, vacuna de péptido y adyuvante, y los grupos de administración con solución salina normal y vector As shown in Figures 3A, 3B, and 3C, when 3 x 104 Colon-26 cells were transplanted, up to 13 days after immunization, a tumor developed in the 5 mice immunized with normal saline and in the 5 mice immunized only with pCAGGS. Conversely, in the case of the 5 mice immunized with the 30 hsp105-DNA vaccine, a tumor developed in one mouse 20 days after immunization and in another mouse 24 days after immunization. However, the remaining 3 mice completely rejected the development of a tumor. In the case of the adjuvant administration group, a tumor developed in the 5 mice up to 24 days after immunization. A significant difference was observed between the administration groups with the DNA vaccine, peptide vaccine and adjuvant, and the administration groups with normal saline and vector

35 (Figura 3B). Los mismos resultados se obtuvieron con respecto al área de tumor promedio (Figura 3A). 35 (Figure 3B). The same results were obtained with respect to the average tumor area (Figure 3A).

A partir de estos resultados, es evidente que la vacuna de péptido y la vacuna de ADN tienen efectos como agentes From these results, it is clear that the peptide vaccine and the DNA vaccine have effects as agents

anticáncer. En consideración de una curva de supervivencia, 2 de los 5 ratones aún sobrevivieron 45 días después de la inmunización en los grupos de administración de solución salina normal, vector y adyuvante. Además, los 5 ratones sobrevivieron en el grupo de administración de la vacuna de ADN. El grupo de la vacuna de ADN presentó diferencias significativas de los otros 4 grupos. El grupo de la vacuna de péptido presentó un período de supervivencia significativamente más prolongado que los grupos de administración de solución salina normal, vector y adyuvante (Figura 3C). Por otra parte, los ratones que rechazaron el desarrollo de un tumor se observaron patológicamente y se confirmó que no hubo daño en los órganos normales y que una gran cantidad de células inflamatorias se filtraron en los sitios que rechazaron el desarrollo de un tumor. anticancer In consideration of a survival curve, 2 of the 5 mice still survived 45 days after immunization in the normal saline, vector and adjuvant saline administration groups. In addition, the 5 mice survived in the DNA vaccine administration group. The DNA vaccine group presented significant differences from the other 4 groups. The peptide vaccine group had a significantly longer survival period than the normal saline, vector and adjuvant saline administration groups (Figure 3C). On the other hand, mice that rejected the development of a tumor were pathologically observed and it was confirmed that there was no damage to normal organs and that a large number of inflammatory cells were filtered at sites that rejected the development of a tumor.

Determinación del péptido del epitopo CTL de hsp105 Determination of the CTL epitope peptide of hsp105

A fin de identificar un péptido del epitopo CTL, se recuperaron células pancreáticas de los ratones, en las que ha actuado la vacuna de ADN-vacuna de péptido. Las células recuperadas se estimularon una vez con los 9 tipos de péptidos mostrados en la Tabla 2, y se analizó la actividad citotóxica de Colon-26 por el ensayo de liberación de 51Cr. Como resultado, se halló que entre los 9 tipos de péptidos descritos anteriormente, los siguientes 5 tipos de péptidos 1, 2, 3, 4, y 5 son útiles (Figura 4). In order to identify a CTL epitope peptide, pancreatic cells were recovered from the mice, in which the DNA vaccine-peptide vaccine has acted. The recovered cells were stimulated once with the 9 types of peptides shown in Table 2, and the cytotoxic activity of Colon-26 was analyzed by the 51 Cr release assay. As a result, it was found that among the 9 types of peptides described above, the following 5 types of peptides 1, 2, 3, 4, and 5 are useful (Figure 4).

B1Asn-Tyr-Gly-Ile-Tyr-Lys-Gln-Asp-Leu (1) B1Asn-Tyr-Gly-Ile-Tyr-Lys-Gln-Asp-Leu (1)

Ala-Phe-Asn-Lys-Gly-Lys-Leu-Lys-Val-Leu (2) Ala-Phe-Asn-Lys-Gly-Lys-Leu-Lys-Val-Leu (2)

Lys-Tyr-Lys-Leu-Asp-Ala-Lys-Ser-Lys-Ile (3) Lys-Tyr-Lys-Leu-Asp-Ala-Lys-Ser-Lys-Ile (3)

Gln-Phe-Glu-Glu-Leu-Cys-Ala-Glu-Leu (4) Gln-Phe-Glu-Glu-Leu-Cys-Ala-Glu-Leu (4)

Met-Tyr-Ile-Glu-Thr-Glu-Gly-Lys-Met-Ile (5) Met-Tyr-Ile-Glu-Thr-Glu-Gly-Lys-Met-Ile (5)

Agente para diagnosticar cánceres Agent to diagnose cancers

Por medio del anticuerpo hsp105, se puede realizar el diagnóstico patológico de los siguientes cánceres: cáncer pancreático, cáncer de colon, tumor cerebral, melanoma maligno, leucemia mielocítica crónica, leucemia mielocítica aguda, linfoma, cáncer esofágico, cáncer renal, cáncer prostático, cáncer de pulmón, cáncer de mamas, cáncer de estómago, cáncer hepático, cáncer de vesícula, cáncer testicular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer tiroideo, cáncer de vejiga, y sarcoma. Through the hsp105 antibody, the pathological diagnosis of the following cancers can be made: pancreatic cancer, colon cancer, brain tumor, malignant melanoma, chronic myelocytic leukemia, acute myelocytic leukemia, lymphoma, esophageal cancer, renal cancer, prostate cancer, cancer of lung, breast cancer, stomach cancer, liver cancer, gallbladder cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, bladder cancer, and sarcoma.

Agente terapéutico del cáncer CTL CTL cancer therapeutic agent

En el caso de los ratones, se clarificó que las células T citolíticas que reconocen hsp105 y/o un péptido constituye la hsp105 como un antígeno no alteran las células normales y tienen actividad citotóxica solo en cáncer de colon de ratón. En consecuencia, existe una posibilidad de que los CTL se puedan usar como un agente terapéutico o preventivo de cáncer con pocos efectos secundarios en los cánceres pancreáticos y de colon humanos en los que hsp105 se expresa en forma elevada. In the case of mice, it was clarified that cytolytic T cells that recognize hsp105 and / or a peptide constitute hsp105 as an antigen do not alter normal cells and have cytotoxic activity only in mouse colon cancer. Consequently, there is a possibility that CTLs can be used as a therapeutic or preventive agent of cancer with few side effects in human pancreatic and colon cancers in which hsp105 is expressed in elevated form.

Ejemplo 4: Identificación del péptido del epitopo de los CTL de HLA-A24 de hsp105 en los seres humanos Example 4: Identification of the HLA-A24 CTL epitope peptide of hsp105 in humans

A fin de determinar el péptido del epitopo de los CTL de HLA-A24 de la hsp105 en seres humanos, los linfocitos de sangre periférica recolectados de dos pacientes con cáncer de color con HLA-A24 se estimularon 4 veces con 9 tipos de péptidos mostrados en la Tabla 3. A partir de este momento, se analizó la actividad citotóxica en una línea celular de cáncer de colon humano sw620, que expresa altamente hsp105 y también expresa HLA-A24, por el ensayo de liberación de 51Cr. In order to determine the HLA-A24 CTL epitope peptide of hsp105 in humans, peripheral blood lymphocytes collected from two patients with color cancer with HLA-A24 were stimulated 4 times with 9 types of peptides shown in Table 3. From this moment on, cytotoxic activity was analyzed in a sw620 human colon cancer cell line, which expresses highly hsp105 and also expresses HLA-A24, by the 51Cr release assay.

En forma específica, los monocitos se separaron de la sangre periférica. Se cultivaron dos millones de monocitos por pocillo en una placa de 24 pocillos en 2 ml de solución de cultivo que contiene 10% de autosuero, IL-2 (100 IU/ml), y 10 IM de cada péptido durante 1 semana. A partir de este momento, cada semana, el producto del cultivo anterior se estimuló con 200.000 células dendríticas (DC), que han sido inducidas durante 1 semana, pulsadas con 10 mM del péptido anterior y se expusieron a los rayos radiactivos, en forma repetida 3 veces. Seis días después, se analizó su actividad citotóxica. En la presente, se cultivaron dos millones de monocitos en presencia de GM-CSF (100 ng/ml) e IL-4 (100 U/ml) durante 5 días, y posteriormente se añadió TNF-a (20 ng/ml), seguido por el cultivo durante 2 días. El producto del cultivo obtenido se usó como DC. Specifically, monocytes separated from peripheral blood. Two million monocytes were cultured per well in a 24-well plate in 2 ml of culture solution containing 10% autoserum, IL-2 (100 IU / ml), and 10 IM of each peptide for 1 week. From this moment, every week, the product of the previous culture was stimulated with 200,000 dendritic cells (DC), which have been induced for 1 week, pulsed with 10 mM of the previous peptide and exposed to radioactive rays, repeatedly 3 times. Six days later, its cytotoxic activity was analyzed. Here, two million monocytes were cultured in the presence of GM-CSF (100 ng / ml) and IL-4 (100 U / ml) for 5 days, and subsequently TNF-a (20 ng / ml) was added, followed by the culture for 2 days. The crop product obtained was used as DC.

Los CTL que alteran las células C1RA2402 estimuladas con el péptido anterior más que las que no se estimularon con el péptido anterior se definieron como positivos para el péptido específico. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Las figuras en negrita de la Tabla 3 indican que se pueden inducir los CTL que son específicos para el péptido y tienen citotoxicidad para las células cancerosas. CTLs that alter C1RA2402 cells stimulated with the previous peptide more than those that were not stimulated with the previous peptide were defined as positive for the specific peptide. The results are shown in Table 3. The bold figures in Table 3 indicate that CTLs that are specific for the peptide and have cytotoxicity to cancer cells can be induced.

Tabla 3: Péptidos que pueden inducir las células T citolíticas específicos del péptido ycitotóxicas para las células cancerosas por la estimulación de los linfocitos de sangre Table 3: Peptides that can induce cytotoxic peptide-specific cytotoxic T cells for cancer cells by stimulating blood lymphocytes

periférica humana de HLA-A24 HLA-A24 human peripheral

Cada CTL inducido por péptido de Pt1 (HLA- A2402/) Cada CTL inducido por péptido de Pt 2 (HLA- A2402/) Each CTL induced by Pt1 peptide (HLA-A2402 /) Each CTL induced by Pt2 peptide (HLA-A2402 /)

% de lisis para % de lisis para % lysis for% lysis for

sw620 C1RA2402 C1RA2402 sw620 C1RA2402 C1RA2402 sw620 C1RA2402 C1RA2402 sw620 C1RA2402 C1RA2402

Péptido Puntuación de (HLA-Aderivado deunión a HLAhsp105 Posición Secuencia A2402 0201/2402) péptido 10 IM (HLA-A0201) péptido 10 IM Peptide Score of (HLA-Derived binding to HLAhsp105 Position Sequence A2402 0201/2402) 10 IM peptide (HLA-A0201) 10 IM peptide

A24-1 180-188 NYGIYKQDL 240 16 42 31 32 13 26 A24-2 214-223 AFNKGKLKVL 30 0 42 49 40 20 64 A24-3 251-260 KYKLDAKSKI 110 50 29 46 21 33 44 A24-4 305-313 QFEELCAEL 48 48 22 43 16 40 30 A24-5 433-442 TFLRRGPFEL 33 53 33 33 26 33 46 A24-6 613-622 MYIETEGKMI 90 49 22 47 29 28 52 A24-7 640-649 EYVYEFRDKL 330 40 22 45 8 26 31 A24-8 725-733 HYAKIAADF 140 41 25 37 66 28 43 A24-9 739-748 KYNHIDESEM 83 19 36 43 33 24 45 A24-1 180-188 NYGIYKQDL 240 16 42 31 32 13 26 A24-2 214-223 AFNKGKLKVL 30 0 42 49 40 20 64 A24-3 251-260 KYKLDAKSKI 110 50 29 46 21 33 44 A24-4 305-313 QFEELCAEL 48 48 22 43 16 40 30 A24-5 433-442 TFLRRGPFEL 33 53 33 33 26 33 46 A24-6 613-622 MYIETEGKMI 90 49 22 47 29 28 52 A24-7 640-649 EYVYEFRDKL 330 40 22 45 8 26 31 A24- 8 725-733 HYAKIAADF 140 41 25 37 66 28 43 A24-9 739-748 KYNHIDESEM 83 19 36 43 33 24 45

Ejemplo 5: Identificación del péptido del epitopo de CTL de HLA-A2 de hsp105 en seres humnos Example 5: Identification of the HLA-A2 CTL epitope peptide of hsp105 in humans

A fin de determinar el péptido del epitopo de los CTL de HLA- A2 de hsp105 en seres humanos, los linfocitos de sangre periférica de un paciente con cáncer de colon con HLA-A2 y los de un sujeto sano con HLA-2 se estimularon 4 veces con 30 tipos de péptidos que se muestran en la Tabla 4. A partir de este momento, se analizó la actividad citotóxica sobre una línea celular de cáncer de colon humano sw620, que expresa altamente hsp105 y también expresa HLA-A2. Los procedimientos experimentales específicos fueron los mismos que en el Ejemplo 4. In order to determine the HLA-A2 CTL epitope peptide of hsp105 in humans, the peripheral blood lymphocytes of a colon cancer patient with HLA-A2 and those of a healthy subject with HLA-2 were stimulated 4 Times with 30 types of peptides shown in Table 4. From this moment, the cytotoxic activity on a human colon cancer cell line sw620, which expresses highly hsp105 and also expresses HLA-A2, was analyzed. The specific experimental procedures were the same as in Example 4.

Además, las células sw620, cuyo nivel de expresión de hsp105 fue reducido por ARNi, se definieron como las células sw620 hsp105-ARNi. Si los CTL no alteraron las células sw620 hsp105-ARNi, por lo tanto se consideró que tenían actividad citotóxica específica para hsp105. Además, los CTL que alteran las células sw620 hsp105-ARNi estimuladas con el péptido anterior más que las que no estimularon con el péptido anterior se definieron como positivas específicas del péptido. Los resultados se muestran en la Tabla 4. Las cifras en negrita de la Tabla 4 indican que se pueden inducir los CTL que son específicos para el péptido y tienen citotoxicidad para las células cancerosas In addition, sw620 cells, whose expression level of hsp105 was reduced by RNAi, were defined as sw620 hsp105-RNAi cells. If the CTLs did not alter the sw620 hsp105-RNAi cells, therefore they were considered to have specific cytotoxic activity for hsp105. In addition, CTLs that alter sw620 hsp105-RNAi cells stimulated with the above peptide rather than those that did not stimulate with the above peptide were defined as peptide specific positives. The results are shown in Table 4. The bold figures in Table 4 indicate that CTLs that are specific for the peptide and have cytotoxicity to cancer cells can be induced.

Tabla 4: Péptidos que pueden inducir las células T citolíticas específicos del péptido ycitotóxicas para las células cancerosas por la estimulación de los linfocitos de sangre periférica humana de HLA-A2 Table 4: Peptides that can induce cytotoxic peptide-specific cytotoxic T cells for cancer cells by stimulating human peripheral blood lymphocytes of HLA-A2

Péptido derivado de hsp105 Posición Secuencia Peptide derived from hsp105 Position Sequence: Cada CTL inducido por péptido de Pt1 (HLA-A0207/3301) Cada CTL inducido por péptido de HD 1 (HLA-A0201/0207) % de lisis para % de lisis para Puntuación de unión a HLA-A0201 sw620 (HLA-A0201) sw620 hsp105-RNAI sw620 hsp105-RNAI péptido 10μM sw620 (HLA-A0201) sw620 hsp105 RNAI sw620 hsp105-R NAI péptido 10μM Each CTL induced by Pt1 peptide (HLA-A0207 / 3301) Each CTL induced by HD 1 peptide (HLA-A0201 / 0207)% lysis for% lysis for HLA-A0201 sw620 binding score (HLA-A0201) sw620 hsp105-RNAI sw620 hsp105-RNAI peptide 10μM sw620 (HLA-A0201) sw620 hsp105 RNAI sw620 hsp105-R NAI peptide 10μM

A2-1 06-94 NLSYDLVPL A2-1 06-94 NLSYDLVPL: 49 5 68 56 --- 49 5 68 56 ---

A2-2 103-111 VMYMGEEHL A2-2 103-111 VMYMGEEHL: 41 20 41 36 --- 41 20 41 36 ---

A2-3 105-114 YMGEEHLFSV A2-3 105-114 YMGEEHLFSV: 12637 5 0 0 --- 12637 5 0 0 ---

A2-4 120-120 MLLTKLKET A2-4 120-120 MLLTKLKET: 107 0 0 1 6 35 3 107 0 0 1 6 35 3

A2-5 141-149 VISVPSFFT A2-5 141-149 VISVPSFFT: 55 4 0 5 --- 55 4 0 5 ---

A2-6 155-163 SVLCAAQIV A2-7 169-177 RLMNDMTAV A2-6 155-163 SVLCAAQIV A2-7 169-177 RLMNDMTAV: 37 5 7 18 4 0 13 591 4 0 8 2 29 32 37 5 7 18 4 0 13 591 4 0 8 2 29 32

A2-8 190-199 SLDEKPRIVV A2-8 190-199 SLDEKPRIVV: 46 30 18 0 29 9 40 46 30 18 0 29 9 40

A2-9 202-210 DMGHSAFQV A2-10 222-231 VLGTAFDPFL A2-9 202-210 DMGHSAFQV A2-10 222-231 VLGTAFDPFL: 21 26 0 3 ---759 0 29 20 2 0 0 21 26 0 3 --- 759 0 29 20 2 0 0

A2-11 265-273 RLYQECEKL A2-12 275-284 KLMSSNSTDL A2-11 265-273 RLYQECEKL A2-12 275-284 KLMSSNSTDL: 33 18 0 28 15 0 17 276 10 1 13 10 28 58 33 18 0 28 15 0 17 276 10 1 13 10 28 58

A2-13 276-284 LMSSNSTDL A2-13 276-284 LMSSNSTDL: 26 11 0 21 11 0 14 26 11 0 21 11 0 14

A2-14 300-309 KMNRSQFEEL A2-15 304-313 SQFEELCAEL A2-16 313-321 LLQKIEVPL A2-17 323-332 SLLEQTHLKV A2-10 381-389 AILSPAFKV A2-14 300-309 KMNRSQFEEL A2-15 304-313 SQFEELCAEL A2-16 313-321 LLQKIEVPL A2-17 323-332 SLLEQTHLKV A2-10 381-389 AILSPAFKV: 50 11 0 0 44 61 9 32 12 0 4 21 0 9 36 10 21 8 ---1055 1 76 34 32 0 0 205 50 0 0 22 28 9 50 11 0 0 44 61 9 32 12 0 4 21 0 9 36 10 21 8 --- 1055 1 76 34 32 0 0 205 50 0 0 22 28 9

A2-19 434-422 FLRRGPFEL A2-19 434-422 FLRRGPFEL: 43 8 39 3 --- 43 8 39 3 ---

(continuación) (continuation)

Péptido derivado de hsp105 Peptide derived from hsp105: Posición Secuencia Puntuación de unión a HLA-A0201 Cada CTL inducido por péptido de Pt1 (HLA-A0207/3301) % de lisis para sw620 (HLA-A0201) sw620 hsp105-RNAI sw620 hsp105-RNAI péptido 10μM Cada CTL inducido por péptido de HD 1 (HLA-A0201/0207) % de lisis para sw620 (HLA-A0201) sw620 hsp105 RNAI sw620 hsp105-R NAI péptido 10μM Position Sequence HLA-A0201 binding score Each CTL induced by Pt1 peptide (HLA-A0207 / 3301)% lysis for sw620 (HLA-A0201) sw620 hsp105-RNAI sw620 hsp105-RNAI 10μM peptide Each CTL induced by HD 1 peptide (HLA-A0201 / 0207)% lysis for sw620 (HLA-A0201) sw620 hsp105 RNAI sw620 hsp105-R NAI peptide 10μM

A2-20A2-21 A2-22A2-23A2-20A2-21 A2-22A2-23: 458-467 601-610 602-610 641-649 KIGRFVVQNV NLVWQLGKDL LVWQLGKDL YVYEFRDKL 76 21 26 210 24 0 9 7 0 4 19 0 3 26 2 13 32 9 4 5 0 4 ---0 9 23 458-467 601-610 602-610 641-649 KIGRFVVQNV NLVWQLGKDL LVWQLGKDL YVYEFRDKL 76 21 26 210 24 0 9 7 0 4 19 0 3 26 2 13 32 9 4 5 0 4 --- 0 9 23

A2-24 A2-24: 848-657 KLCGPYEKFI 200 9 0 0 42 0 9 848-657 KLCGPYEKFI 200 9 0 0 42 0 9

A2-25A2-25: 668-676 LLTETEDWL 401 32 0 27 23 42 27 668-676 LLTETEDWL 401 32 0 27 23 42 27

A2-26 A2-27A2-26 A2-27: 675-684 694-702 WLYEEGEDQA ELMKIGTPV 146 19 18 0 41 14 0 13 11 21 3 22 0 0 675-684 694-702 WLYEEGEDQA ELMKIGTPV 146 19 18 0 41 14 0 13 11 21 3 22 0 0

A2-27A2-27: 694-702 ELMKIGTPV 19 14 0 13 22 0 0 694-702 ELMKIGTPV 19 14 0 13 22 0 0

A2-28A2-29 A2-28A2-29: 714-723 757-765 KMFEELGQRL EVMEWMNNV 819 15 11 2 0 1 0 0 5 0 0 --- 714-723 757-765 KMFEELGQRL EVMEWMNNV 819 15 11 2 0 1 0 0 5 0 0 ---

A2-30 A2-30: 765-774 VMNAQAKKSL 26 0 0 11 26 765-774 VMNAQAKKSL 26 0 0 11 26

Ejemplo 6: Resultados del análisis inmunohistoquímico de hsp105 en tejidos Example 6: Results of the immunohistochemical analysis of hsp105 in tissues

Se analizó inmunohistoquímicamente la expresión de hsp105 en varios tejidos. En forma específica, se prepararon secciones finas con un tamaño de 3 mm a partir de los bloques obtenidos por la inmovilización de varios tejidos con formalina y su inclusión en parafina. A partir de este momento, mediante el uso del kit ABC-PO coloración VECTOR (IgG de conejo) (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA), estas secciones se sometieron al análisis inmunohistoquímico por el procedimiento ABC (técnica de peroxidasa inmune del complejo avidina-biotina). Se adquirió Ab HSP105 anti-humano policlonal de conejo (SANTACRUZ, Santa Cruz, CA) y posteriormente se diluyó 200 veces. El producto obtenido se usó como un anticuerpo primario. The expression of hsp105 in several tissues was immunohistochemically analyzed. Specifically, thin sections with a size of 3 mm were prepared from the blocks obtained by the immobilization of various tissues with formalin and their inclusion in paraffin. From this moment, using the ABC-PO VECTOR staining kit (rabbit IgG) (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA), these sections were subjected to immunohistochemical analysis by the ABC procedure (complex immune peroxidase technique of the complex avidin-biotin). Ab HSP105 polyclonal rabbit anti-human Ab (SANTACRUZ, Santa Cruz, CA) was acquired and subsequently diluted 200 times. The product obtained was used as a primary antibody.

La Figura 5 es una microfotografía que muestra los resultados del análisis inmunohistoquímico anterior. En la Figura 5, los símbolos tienen los siguientes significados. A: cáncer de colon, B: cáncer de colon en pólipo del colon, C: metástasis hepática del cáncer de colon, D: cáncer pancreático, E: insulinoma, F: adenocarcinoma papilar en cáncer de mamas, G: cáncer escirro de cáncer de mamas, H: cáncer esofágico, I: cáncer de tiroides, J: linfoma maligno gáastrico, K: feocromocitoma, L: cáncer de vejiga, M: testículos, y N: seminoma. Tal como evidente a partir de los resultados que se muestran en la Figura 5, se observó un alto nivel de expresión de hsp105 en A, B, C, D, E, F, H, I, J, K, L, M, y N, es decir, tumores diferentes de G, y también en testículos. Figure 5 is a photomicrograph showing the results of the previous immunohistochemical analysis. In Figure 5, the symbols have the following meanings. A: colon cancer, B: colon cancer in colon polyp, C: liver metastasis of colon cancer, D: pancreatic cancer, E: insulinoma, F: papillary adenocarcinoma in breast cancer, G: escirro cancer cancer breasts, H: esophageal cancer, I: thyroid cancer, J: gastric malignant lymphoma, K: pheochromocytoma, L: bladder cancer, M: testicles, and N: seminoma. As evident from the results shown in Figure 5, a high level of hsp105 expression was observed in A, B, C, D, E, F, H, I, J, K, L, M, and N, that is, tumors other than G, and also in testicles.

Ejemplo 7: Actividad antitumoral in vivo de la línea de células T auxiliares positivas a CD4 de ratón inducidas por hsp105 Example 7: In vivo antitumor activity of the mouse CD4 positive helper T cell line induced by hsp105

Se recolectó el bazo de un ratón BALB/c y se trituró para separar las células del bazo. Se cultivaron 200.000 células del bazo por pocillo en una placa plana de 96 pocillos en 200 μl de una solución de cultivo que contiene IL-2 (100 IU/ml) y 2 μg/ml de proteína de hsp105 recombinante durante 1 semana. A partir de este momento, cada semana, el producto de cultivo se estimuló repetidamente con 200.000 células del bazo, que se habían pulsado con 2 μg/ml de proteína de hsp105 recombinante y posteriormente se expusieron a los rayos radiactivos, de modo de establecer múltiples líneas de células T auxiliares positivas a CD4 (Th). La expresión de CD4 y CD8 en la superficie de las células se confirmó por la realización de la tinción inmunofluorescente con el anticuerpo monoclonal CD4-FITC de ratón, CD8-FITC (IMMUNOTECH, Marseille, Francia), y posteriormente se analizó con FACS (Figura 6A). Se examinó por el ingreso de [3H] timidina, reaccione o no específicamente Th con la proteína hsp105 y se cultive. En forma específica, se colocaron 150.000 células del bazo en cada pocillo de una placa plana de 96 pocillos, y varios The spleen was collected from a BALB / c mouse and triturated to separate the cells from the spleen. 200,000 spleen cells were cultured per well in a 96-well flat plate in 200 μl of a culture solution containing IL-2 (100 IU / ml) and 2 μg / ml of recombinant hsp105 protein for 1 week. From this moment, each week, the culture product was repeatedly stimulated with 200,000 spleen cells, which had been pulsed with 2 μg / ml of recombinant hsp105 protein and subsequently exposed to radioactive rays, so as to establish multiple CD4 (Th) positive helper T cell lines. The expression of CD4 and CD8 on the cell surface was confirmed by performing immunofluorescent staining with the mouse CD4-FITC monoclonal antibody, CD8-FITC (IMMUNOTECH, Marseille, France), and subsequently analyzed with FACS (Figure 6A). It was examined for the entry of [3 H] thymidine, react or not specifically Th with the hsp105 protein and cultured. Specifically, 150,000 spleen cells were placed in each well of a flat 96-well plate, and several

pocillos se pulsaron con la proteína hsp105 toda la noche, y los otros pocillos no se pulsaron con esta. A ambos tipos de pocillos, se añadieron 30.000 células Th, seguido por la reacción durante 72 horas (se añadió 1 μCi de [3H] timidina a cada pocillo durante las últimas 16 horas). A partir de este momento, se midió el ingreso de [3H] timidina con un contador de centelleo líquido. Las células Th reaccionaron específicamente con la proteína hsp105 y crecieron (Figura 6B). Por otra parte, 24 horas después de la adición de Th, se guardó el sobrenadante. En consecuencia, se midieron IFN-y e IL-4 secretadas de Th como resultado de la reacción con ELISA Ready-SET-Gol con IFN-y de ratón, IL-4 (eBioscience). La Th fue del tipo Th1, que genera una gran cantidad de IFN-y como resultado de la reacción específica con la proteína hsp105 (Figura 6C). Se implantó en forma subcutánea Colon-26 en el lomo de un ratón BALB/c para formar un tumor con un tamaño de 3 mm. A partir de este momento, la Th anterior se inyectó en el sitio local, seguido por la observación de la progresión. Como resultado, después de tal tratamiento, el crecimiento del tumor Colon-26 se retardó claramente (Figura 6D). wells were pulsed with the hsp105 protein overnight, and the other wells were not pulsed with it. To both types of wells, 30,000 Th cells were added, followed by the reaction for 72 hours (1 μCi of [3 H] thymidine was added to each well during the last 16 hours). From this moment, the entry of [3 H] thymidine was measured with a liquid scintillation counter. Th cells reacted specifically with the hsp105 protein and grew (Figure 6B). On the other hand, 24 hours after the addition of Th, the supernatant was stored. Accordingly, IFN-y and IL-4 secreted from Th were measured as a result of the reaction with ELISA Ready-SET-Gol with IFN-y mouse, IL-4 (eBioscience). Th was of the Th1 type, which generates a large amount of IFN-y as a result of the specific reaction with the hsp105 protein (Figure 6C). Colon-26 was implanted subcutaneously in the back of a BALB / c mouse to form a tumor with a size of 3 mm. From this moment, the previous Th was injected into the local site, followed by the observation of the progression. As a result, after such treatment, the growth of the Colon-26 tumor was clearly retarded (Figure 6D).

A partir de los resultados descritos anteriormente, se halló que la línea de células T auxiliares positivas a CD4 de ratón BALB/c inducido por la proteína hsp105 crece específicamente en la proteína hsp105 y que retarda el crecimiento de la masa tumoral de la línea celular de cáncer de colon Colon-26 que expresa altamente la hsp105. From the results described above, it was found that the BALB / c mouse CD4 positive helper T cell line induced by the hsp105 protein specifically grows in the hsp105 protein and that retards the growth of the tumor mass of the cell line of Colon-26 colon cancer that highly expresses hsp105.

Ejemplo 8: Línea de células T auxiliares positivas a CD4 de pacientes con cáncer de colon inducida por hsp105 Example 8: CD4 positive helper T cell line of patients with hsp105-induced colon cancer

Los monocitos se separaron de la sangre periférica. Se cultivaron 200.000 monocitos por pocillo en una placa plana de 96 pocillos en 200 μl de una solución de cultivo que contiene IL-2 (100 IU/ml) y 2 μg/ml de proteína de hsp105 recombinante durante 1 semana. A partir de este momento, cada semana, el producto de cultivo se estimuló repetidamente con 200.000 monocitos, que se habían pulsado con 2 μg/ml de proteína de hsp105 recombinante y posteriormente se expusieron a los rayos radiactivos, de modo de establecer múltiples líneas de células T auxiliares positivas a CD4 (Th). La expresión de CD4 y CD8 en la superficie de las células se confirmó por la realización de la tinción inmunofluorescente por medio del uso CD4 anti-humana Pharmingen, CD8-FITC y posteriormente se analizó con FACS. Se examinó de la misma manera que en el Ejemplo 7, reaccione o no específicamente Th con la proteína hsp105 y se cultive. Las células Th reaccionaron específicamente con la proteína hsp105 y crecieron (Figura 7A). Además, de la misma manera que en el Ejemplo 7, se midieron IFN-y e IL-4 secretadas de Th como resultado de la reacción mediante el kit de ELISA US IFN-y humana, IL-4 (BIOSOURCE, Camarillo, CA). La Th fue del tipo Th1, que genera una gran cantidad de IFN-y como resultado de la reacción específica con la proteína hsp105 (Figura 7B). En general, se ha sabido que Th1 actúa de forma favorable para la inducción de los CTL y la inmunidad antitumoral. Se halló que tal Th1 también se puede inducir en los seres humanos por la estimulación de los linfocitos de sangre periférica con la proteína hsp105. Monocytes separated from peripheral blood. 200,000 monocytes were cultured per well in a 96-well flat plate in 200 μl of a culture solution containing IL-2 (100 IU / ml) and 2 μg / ml of recombinant hsp105 protein for 1 week. From this moment, each week, the culture product was repeatedly stimulated with 200,000 monocytes, which had been pulsed with 2 μg / ml of recombinant hsp105 protein and subsequently exposed to radioactive rays, so as to establish multiple lines of CD4 (Th) positive helper T cells. The expression of CD4 and CD8 on the surface of the cells was confirmed by performing immunofluorescent staining through the use of anti-human CD4 Pharmingen, CD8-FITC and subsequently analyzed with FACS. It was examined in the same manner as in Example 7, whether or not Th reacts specifically with the hsp105 protein and is cultured. Th cells reacted specifically with the hsp105 protein and grew (Figure 7A). In addition, in the same manner as in Example 7, IFN-y and IL-4 secreted from Th were measured as a result of the reaction by the human IFN-y US ELISA kit, IL-4 (BIOSOURCE, Camarillo, CA) . Th was of the Th1 type, which generates a large amount of IFN-y as a result of the specific reaction with the hsp105 protein (Figure 7B). In general, it has been known that Th1 acts favorably for the induction of CTL and antitumor immunity. It was found that such Th1 can also be induced in humans by stimulation of peripheral blood lymphocytes with the hsp105 protein.

Ejemplo 9: Actividad antitumoral in vivo de los linfocitos T citotóxicos estimulados con el péptido hsp105 Example 9: In vivo antitumor activity of cytotoxic T lymphocytes stimulated with the hsp105 peptide

Se examinó si los linfocitos T citotóxicos (CTL) de ratón BALB/c inducidos por un péptido derivado de hsp105 Asn-Tyr-Gly-Ile-Tyr-Lys-Gln-Asp-Leu (SEQ ID NO: 3) reducen o no una masa tumoral de la línea celular de cáncer de colon Colon-26 que expresa altamente la hsp105. En forma específica, se implantó en forma subcutánea Colon-26 en el lomo de un ratón BALB/c para formar un tumor con un tamaño de 5 mm. A partir de este momento, se inyectaron CTL en el sitio local. Una semana más tarde, el ratón se sometió a examen de anatomía, y el sitio se observó patológicamente por tinción con HE. Los resultados se muestran en la Figura 8. Como es evidente a partir de los resultados mostrados en la Figura 8, el tumor se redujo claramente por la administración de los CTL inducidos por el péptido derivado de hsp105. It was examined whether the cytotoxic T lymphocytes (CTL) of mouse BALB / c induced by a peptide derived from hsp105 Asn-Tyr-Gly-Ile-Tyr-Lys-Gln-Asp-Leu (SEQ ID NO: 3) reduce or not a Tumor mass of the colon-26 colon cancer cell line that highly expresses hsp105. Specifically, Colon-26 was implanted subcutaneously in the back of a BALB / c mouse to form a tumor with a size of 5 mm. From this moment, CTLs were injected at the local site. One week later, the mouse underwent anatomy examination, and the site was observed pathologically by HE staining. The results are shown in Figure 8. As is evident from the results shown in Figure 8, the tumor was clearly reduced by the administration of CTL induced by the hsp105 derived peptide.

Asimismo, se examinó si los linfocitos T citotóxicos (CTL) de un paciente con cáncer de colon inducidos por un péptido derivado de hsp105 Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Asn-Ser-Thr-Asp-Leu (SEQ ID NO: 14) reducen o no una masa tumoral de la línea celular de cáncer de colon sw620 que expresa altamente la hsp105. En forma específica se implantó en forma subcutánea sw620 en el lomo de un ratón desnudo para formar un tumor con un tamaño de 5 mm, y a partir de este momento, se inyectaron los CTL en el sitio local. Likewise, it was examined whether the cytotoxic T lymphocytes (CTL) of a patient with colon cancer induced by a hsp105-derived peptide Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Asn-Ser-Thr-Asp-Leu (SEQ ID NO: 14) reduce or not a tumor mass of the sw620 colon cancer cell line that highly expresses hsp105. Specifically, sw620 was subcutaneously implanted in the back of a naked mouse to form a tumor with a size of 5 mm, and from this moment, CTLs were injected into the local site.

Una semana más tarde después de la inyección de los CTL, el tumor se redujo. Dos semanas después del tratamiento, el ratón se sometió a examen de anatomía, y el sitio se observó patológicamente por tinción con HE. Los resultados se muestran en la Figura 9. Como es evidente a partir de los resultados mostrados en la Figura 9, el aumento del tumor se retardó claramente por la administración de los CTL. A week later after the CTL injection, the tumor was reduced. Two weeks after the treatment, the mouse underwent anatomy examination, and the site was observed pathologically by HE staining. The results are shown in Figure 9. As is evident from the results shown in Figure 9, tumor growth was clearly delayed by the administration of CTLs.

Aplicabilidad industrial Industrial applicability

La proteína del antígeno de cáncer y el péptido antigénico de la presente invención, o ADN que codifica la proteína o péptido de la presente invención, se pueden usar como una excelente vacuna anticáncer que tiene pocos efectos secundarios tales como auto-lesión. Además, un anticuerpo se puede usar como un agente diagnóstico. Más aún, las células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos, o una población de inmunocitos que contiene estas células, que se estimulan y activan con el antígeno de la presente invención, se pueden usar como agentes anticáncer. The cancer antigen protein and the antigenic peptide of the present invention, or DNA encoding the protein or peptide of the present invention, can be used as an excellent anti-cancer vaccine that has few side effects such as self-injury. In addition, an antibody can be used as a diagnostic agent. Furthermore, auxiliary T cells, cytotoxic T lymphocytes, or a population of immunocytes containing these cells, which are stimulated and activated with the antigen of the present invention, can be used as anticancer agents.

LISTADO DE SECUENCIAS SEQUENCE LIST

<110> Kumamoto Technology & Industry Foundation <110> Kumamoto Technology & Industry Foundation

<120> Antígenos de cáncer y su utilización <120> Cancer antigens and their use

<130> P21550EP 5 <140> EP 03 791 418.1 <130> P21550EP 5 <140> EP 03 791 418.1

<141> 2003-08-29 <141> 2003-08-29

<150> JP2002-255668 <150> JP2002-255668

<151> 2002-08-30 <151> 2002-08-30

<150> JP2002-341168 10 <151> 2002-11-25 <150> JP2002-341168 10 <151> 2002-11-25

<160> 41 <160> 41

<170> PatentIn versión 3.3 <170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <210> 1

<211> 858 15 <212> PRT <211> 858 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<210> 2 <210> 2

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<400> 33 <400> 33

<210> 34 <210> 34

<211> 10 <211> 10

<212> PRT <212> PRT

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> péptido sintético <223> synthetic peptide

<400> 34 <400> 34

<210> 35 <210> 35

<211> 10 <211> 10

<212> PRT <212> PRT

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> péptido sintético <223> synthetic peptide

<400> 35 <400> 35

<210> 36 <210> 36

<211> 9 <211> 9

<212> PRT <212> PRT

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> péptido sintético <223> synthetic peptide

<400> 36 <400> 36

<210> 37 <210> 37

<211> 10 <211> 10

<212> PRT <212> PRT

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> péptido sintético <223> synthetic peptide

<400> 37 <400> 37

<210> 38 <210> 38

<211> 9 <211> 9

<212> PRT <212> PRT

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> péptido sintético <223> synthetic peptide

<400> 38 <400> 38

<210> 39 <210> 39

<211> 9 <211> 9

<212> PRT <212> PRT

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> péptido sintético <223> synthetic peptide

<400> 39 <400> 39

<210> 40 <210> 40

<211> 10 <211> 10

<212> PRT <212> PRT

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> péptido sintético <223> synthetic peptide

<400> 40 <400> 40

<210> 41 5 <211> 9 <210> 41 5 <211> 9

<212> PRT <212> PRT

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> péptido sintético 10 <400> 41 <223> synthetic peptide 10 <400> 41

Claims

1. Cancer antigen for use in the prevention and / or therapeutic treatment of cancers, such a cancer antigen is a peptide of any of the following (A) or (B):

(A)(TO): un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 29, a peptide consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 3 to 29,

(B)(B): un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 22 y a una adición de uno a 5 aminoácidos, y tiene actividad inmunoestimuladora y activa los linfocitos T citotóxicos que reconocen una proteína del antígeno de cáncer; a peptide consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 3 to 22 and an addition of one to 5 amino acids, and has immunostimulatory activity and activates cytotoxic T lymphocytes that recognize a cancer antigen protein;

in which the cancer antigen has stimulatory T cell stimulating activity of cytotoxic T lymphocytes.

2.2.: Un ADN que codifica el antígeno de cáncer de la reivindicación 1 para usar en la prevención y/o tratamiento terapéutico del cáncer, en el que el antígeno de cáncer tiene actividad estimuladora de células T de estimulación de los linfocitos T citotóxicos. A DNA encoding the cancer antigen of claim 1 for use in the prevention and / or therapeutic treatment of cancer, wherein the cancer antigen has stimulatory T cell stimulating activity of cytotoxic T lymphocytes.

3.3.: Las células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos, o una población de inmunocitos que comprende estas células, que son inducidas por la estimulación in vitro mediante el antígeno de cáncer de la reivindicación 1. Auxiliary T cells, cytotoxic T lymphocytes, or a population of immunocytes comprising these cells, which are induced by in vitro stimulation by the cancer antigen of claim 1.

4.Four.: Las células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos, o la población de inmunocitos que comprende estas células de acuerdo con la reivindicación 3, que adicionalmente comprende un activador inmunológico. Auxiliary T cells, cytotoxic T lymphocytes, or the population of immunocytes comprising these cells according to claim 3, which additionally comprises an immune activator.

5.5.: Células dendríticas o una población de inmunocitos que comprende estas células, que se pulsan in vitro con el antígeno de cáncer de la reivindicación 1. Dendritic cells or a population of immunocytes comprising these cells, which are pulsed in vitro with the cancer antigen of claim 1.

6.6.: Las células dendríticas o una población de inmunocitos que comprende estás células de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende adicionalmente un activador inmunológico. Dendritic cells or a population of immunocytes comprising these cells according to claim 5, further comprising an immune activator.

7.7.: Un kit de cultivo celular para producir las células T auxiliares de los linfocitos T citotóxicos o una población de inmunocitos que comprende estas células de la reivindicación 3 a 6, que comprende una solución de cultivo celular y un recipiente del cultivo celular, en el que la solución del cultivo celular usada para producir las células T auxiliares o linfocitos T citotóxicos, o una población de inmunocitos que comprende estas células de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, que comprende el antígeno de cáncer de la reivindicación 1. A cell culture kit for producing the helper T cells of cytotoxic T lymphocytes or a population of immunocytes comprising these cells of claims 3 to 6, comprising a cell culture solution and a cell culture vessel, wherein the cell culture solution used to produce the helper T cells or cytotoxic T lymphocytes, or a population of immunocytes comprising these cells of any of claims 3 to 6, comprising the cancer antigen of claim 1.

8.8.: Un medicamento para usar en la prevención y/o tratamiento de los cánceres, que comprende el péptido de la reivindicación 1, y las células T auxiliares, los linfocitos T citotóxicos, las células dendríticas o la población de inmunocitos que comprende estas células de las reivindicación 3 a 6. A medicament for use in the prevention and / or treatment of cancers, comprising the peptide of claim 1, and the auxiliary T cells, cytotoxic T lymphocytes, dendritic cells or the population of immunocytes comprising these cells of the claims 3 to 6

9.9.: Un medicamento para usar en la prevención y/o tratamiento de los cánceres, que comprende las células T auxiliares, los linfocitos T citotóxicos, las células dendríticas o la población de inmunocitos que comprende estas células de la reivindicación 3 a 6. A medicament for use in the prevention and / or treatment of cancers, comprising auxiliary T cells, cytotoxic T lymphocytes, dendritic cells or the population of immunocytes comprising these cells of claim 3 to 6.

Fig. 1

Fig 2

Fig. 3

Fig. 4

Fig. 5

Fig. 6

Fig. 7

Fig. 8

Fig. 9