ES2370051T3 - Moléculas de unión capaces de neutralizar el virus del nilo occidental y usos de las mismas. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo capaz de unirse específicamente a la proteína E del virus del Nilo occidental (WNV) y que tiene una actividad de neutralización del WNV, en el que dicho anticuerpo comprende una región CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una región CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, una región CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una región CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, una región CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 y una región CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

Description

Moléculas de unión capaces de neutralizar el virus del Nilo occidental y usos de las mismas

5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a la medicina. En particular la invención se refiere al diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento de infección por el virus del Nilo occidental (WNV).

10 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El virus del Nilo occidental (WNV) es un miembro de la familia Flaviviridae, género Flavivirus. Los flavivirus son pequeños virus de ARN de cadena positiva con envoltura esférica. El género Flavivirus comprende más de 60 virus altamente relacionados que incluyen varios patógenos humanos como, entre otros, el virus de la fiebre amarilla, el

15 virus de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis de St. Louis, el virus de la encefalitis del valle del Murray, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y el virus del dengue.

El WNV fue aislado inicialmente en 1937 en la región del Nilo occidental de Uganda pero actualmente tiene una distribución casi mundial que incluye partes de África, Asia, Australia, Europa y, más recientemente, Norteamérica.

20 El WNV fue diagnosticado por primera vez en el área de Nueva York en 1999 y ha seguido extendiéndose rápidamente por Norteamérica causando infecciones en personas de más de 40 estados diferentes hasta llegar hasta California.

El WNV es transmitido principalmente al hombre por mosquitos pero en ocasiones la transmisión se ha vinculado

25 con transfusiones sanguíneas y trasplante de órganos. Las infecciones por el WNV tienen generalmente síntomas leves, que duran generalmente de 3 a 6 días, variando desde una fiebre de inicio súbito, cefalea, temblores y erupción cutánea hasta inflamación de las glándulas linfáticas. Sin embargo, en el 30% de los casos, especialmente en ancianos y pacientes inmunodeprimidos, la enfermedad progresa a un estado más grave (por ejemplo, encefalitis

o meningitis aséptica), que puede conducir a la muerte. En 2002, la mortalidad humana aumentó en más de 150

30 casos. Además de infectar a los seres humanos, se sabe también que el WNV infecta a caballos y varias especies de aves y puede provocar afecciones graves y la muerte en dichas especies.

Las dos estrategias principales para prevenir las infecciones por el WNV son a) controlar la difusión del WNV por el rociado de grandes áreas con insecticidas para destruir los mosquitos que actúan como vectores y b) reducir el

35 contacto entre seres humanos y mosquitos usando protección personal como repelentes antiinsectos. Estas estrategias son, sin embargo, altamente ineficaces. Además, existe inquietud en relación con los efectos tóxicos de los insecticidas. Por otra parte, el rociado requiere aplicaciones repetidas y se considera poco fiable, ya que no proporciona una cobertura completa de las áreas de cría del mosquito o erradicación de los mosquitos.

40 No existe ningún tratamiento específico de la infección por el WNV. El tratamiento ha sido sólo de apoyo, ya que no existen fármacos antivíricos u otros fármacos disponibles con eficacia demostrada. Entre las opciones de tratamiento potenciales más prometedoras disponibles actualmente para seres humanos se incluyen los compuestos antivíricos ribavirina e interferón-alfa2b (Anderson y Rahal, 2002), y las inmunoglobulinas anti-WNV humanas (Ben Nathan y col., 2003). Un inconveniente asociado a la ribavirina y el interferón-alfa2b reside en sus toxicidades importantes. Un

45 inconveniente de las inmunoglobulinas anti-WNV es que no están disponibles en cantidades suficientes y son demasiado caras. Además, la posibilidad de contaminación por patógenos conocidos o desconocidos es una preocupación adicional asociada a las inmunoglobulinas anti-WNV. Además, en el documento WO-02/072.036 se ha sugerido que la proteína E del WNV puede usarse para preparar anticuerpos monoclonales anti-WNV murinos, y se demostró que la inmunización pasiva con sueros que contienen dichos anticuerpos puede alterar la susceptibilidad al

50 WNV en ratones. Sin embargo, los anticuerpos murinos, en formato desnudo o inmunoconjugado, son limitados para su uso in vivo debido a problemas asociados con la administración de anticuerpos murinos a seres humanos, como la corta vida media del suero, la incapacidad para desencadenar ciertas funciones de efector humano y el desencadenamiento de una respuesta inmunitaria espectacular no deseada frente al anticuerpo murino en un ser humano. En consecuencia, existe una necesidad urgente de un medicamento adecuado para detección, prevención

55 y/o tratamiento de infecciones por el WNV.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La fig. 1 muestra el mapa de dominios de la proteína E del WNV que se une a los scFv. En el eje X se muestran los

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scFv sometidos a ensayo y en el eje Y se suministra el valor de DO a 492 nm. Las barras negras muestran ELISA de competición de los scFv con el anticuerpo monoclonal anti-WNV murino 6B6C-1, las barras rayadas (en sentido ascendente de izquierda a derecha) muestran ELISA de competición de los scFv con el anticuerpo monoclonal anti-WNV murino 7H2, las barras rayadas (en sentido ascendente de derecha a izquierda) muestran ELISA de

5 competición de los scFv con el anticuerpo monoclonal anti-WNV 4G2 y las barras sobre fondo blanco muestran ELISA de competición de los scFv con el anticuerpo monoclonal anti-WNV 3A3.

La fig. 2 muestra la valoración del anticuerpo monoclonal anti-WNV CR4374 en un modelo de provocación de WNV murino. Se muestra valoración de arriba abajo del anticuerpo monoclonal anti-WNV CR4374 mediante el uso de 10 dosis de 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 y 0,003 mg/kg y valoración con un anticuerpo de control a una concentración de 10 mg/kg. En el eje X se muestran los días y en el eje Y se representa la probabilidad de supervivencia (%).

La fig. 3 muestra la valoración del anticuerpo monoclonal anti-WNV CR4353 en un modelo de provocación de WNV murino. Se muestra valoración de arriba abajo del anticuerpo monoclonal anti-WNV CR4353 mediante el uso de 15 dosis de 10, 3, 1, 0,1, 0,3 y 0,03 mg/kg y valoración con un anticuerpo de control a una concentración de 10 mg/kg. En el eje X se muestran los días y en el eje Y se representa la probabilidad de supervivencia.

Fig. 4. Clasificación de afinidades de anticuerpos usando resonancia de plasmones superficiales. Los anticuerpos con una afinidad relativamente alta por el virus del Nilo occidental están situados en el ángulo superior derecho de 20 esta representación, lo que indica buena asociación y disociación lenta. Para cada anticuerpo se muestra el promedio de dos medidas.

Fig. 5. Curva de unión de forma IgM de CR4374 (CRM4374) a partículas semejantes a virus (VLP). Se muestran dos tandas de purificación diferentes (▲ y ■, IgM; □ y ◊, control).

25 Fig. 6. Clasificación de afinidades de variantes de CR4374 con maduración de la afinidad que usan resonancia de plasmones superficiales. Los anticuerpos con una afinidad relativamente alta por el virus del Nilo occidental están situados en el ángulo superior derecho de esta representación, lo que indica buena asociación y disociación lenta. Para cada anticuerpo se muestra el promedio de dos medidas.

30 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

A continuación se ofrecen las definiciones de los términos según se usan en la invención.

35 DEFINICIONES

Secuencia de aminoácidos

El término "secuencia de aminoácidos" según se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a moléculas 40 sintéticas o de ocurrencia natural y a una secuencia de péptidos, oligopéptidos, polipéptidos o proteínas.

Molécula de unión

Según se usa en la presente memoria descriptiva el término "molécula de unión" se refiere a una inmunoglobulina

45 intacta que incluye anticuerpos monoclonales, como anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos, o a un dominio de unión a antígeno y/o variable que comprende el fragmento de una inmunoglobulina que compite con la inmunoglobulina intacta por la unión específica al compañero de unión de la inmunoglobulina, por ejemplo el WNV. Con independencia de la estructura, el fragmento de unión a antígeno se une con el mismo antígeno que es reconocido por la inmunoglobulina intacta.

50 El término "molécula de unión", según se usa en la presente memoria descriptiva incluye todas las clases y subclases de inmunoglobulinas conocidas en la técnica. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las moléculas de unión pueden dividirse en las cinco grandes clases de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases

55 (isotipos) como, por ejemplo, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Entre los fragmentos de unión a antígenos se incluyen, entre otros, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de regiones de determinación de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena única (scFv), anticuerpos de cadena única bivalentes, anticuerpos de fagos de cadena única, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, (poli)péptidos

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que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al (poli)péptido, etc. Los fragmentos anteriores pueden producirse sintéticamente o mediante escisión química o enzimática de inmunoglobulinas intactas o pueden diseñarse por ingeniería genética mediante técnicas de ADN recombinante. Los procedimientos de producción son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo,

5 en Antibodies: A Laboratory Manual, Editado por: E. Harlow y D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. Una molécula de unión o un fragmento de unión a antígeno de la misma pueden tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes.

10 La molécula de unión puede ser una molécula de unión desnuda o no conjugada pero puede ser también parte de un inmunoconjugado. Una molécula de unión desnuda o no conjugada pretende referirse a una molécula de unión que no está conjugada, ligada operativamente o asociada física o funcionalmente por otros medios con una fracción

o etiqueta efectora, como, entre otros, una sustancia tóxica, una sustancia radiactiva, un liposoma, una enzima. Se entenderá que las moléculas de unión desnudas o no conjugadas no excluyen moléculas de unión que se han 15 estabilizado, multimerizado, humanizado o manipulado de cualquier otra forma, distinta que por la unión de una fracción o etiqueta efectoras. En consecuencia, se incluyen todas las moléculas de unión desnudas o no conjugadas modificadas después de traducción, incluyendo aquellas en que las modificaciones se realizan en el entorno celular natural de producción de moléculas de unión, por una célula de producción de moléculas de unión recombinante, y se introducen artificialmente después de la preparación de la molécula de unión inicial. Por supuesto, el término

20 molécula de unión desnuda o no conjugada no excluye la capacidad de la molécula de unión de formar asociaciones funcionales con células y/o moléculas efectoras después de la administración al cuerpo, ya que algunas de dichas interacciones son necesarias para ejercer un efecto biológico. La ausencia de grupo o etiqueta efectores se aplica, por tanto, en la definición a la molécula de unión desnuda o no conjugada in vitro, no in vivo.

25 Regiones de determinación de complementariedad (CDR)

El término "regiones de determinación de complementariedad" según se usa en la presente memoria descriptiva significa secuencias dentro de las regiones variables de moléculas de unión, como inmunoglobulinas, que contribuyen normalmente en gran medida al sitio de unión del antígeno que es complementario en forma y

30 distribución de cargas al epítopo reconocido en el antígeno. Las regiones CDR pueden ser específicas de epítopos lineales, epítopos discontinuos o epítopos conformacionales de proteínas o fragmentos de proteínas, ya estén presentes en la proteína en su conformación nativa o, en algunos casos, presentes en las proteínas desnaturalizados, por ejemplo, por solubilización en SDS. Los epítopos pueden consistir también en modificaciones de proteínas después de traducción.

35 Secuencia de ácidos nucleicos de regulación de expresión

El término "secuencia de ácidos nucleicos de regulación de expresión" según se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a secuencias de polinucleótidos necesarias para y/o que afectan a la expresión de una 40 secuencia de codificación ligada operativamente en un organismo hospedador en particular. Las secuencias de ácidos nucleicos de regulación de expresión, como, entre otras, secuencias apropiadas de inicio de transcripción, de terminación, promotoras, potenciadoras; secuencias represoras o activadoras; señales eficaces de procesamiento de ARN como señales de división y poliadenilación; secuencias que estabilizan secuencias de ARNm citoplásmico que potencian la eficacia de traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosomas); secuencias que potencian la

45 estabilidad de proteínas; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción de proteínas, pueden ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que muestre actividad en el organismo hospedador de elección y pueden obtenerse a partir de genes que codifican para proteínas, que son homólogos o heterólogos para el organismo hospedador. La identificación y el empleo de secuencias de regulación de expresión son rutinarios para el experto en la materia.

50 Variante funcional

El término "variante funcional", según se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una molécula de unión que comprende un nucleótido y/o una secuencia de aminoácidos que están alterados por uno o más nucleótidos y/o 55 aminoácidos en comparación con el nucleótido y/o secuencias de aminoácidos de la molécula de unión de origen y que sigue siendo capaz de competir por la unión al compañero de unión, por ejemplo el WNV, con la molécula de unión de origen. En otras palabras, las modificaciones en la secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de la molécula de unión de origen no afectan o alteran significativamente las características de unión de la molécula de unión codificada por la secuencia de nucleótidos o que contiene la secuencia de aminoácidos, es decir, la molécula

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de unión sigue siendo capaz de reconocer y unirse a su objetivo. La variante funcional puede tener modificaciones de secuencias conservadoras que incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Estas modificaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, como mutagenia dirigida al sitio y mutagenia mediada por PCR aleatoria, y pueden comprender nucleótidos y aminoácidos naturales y

5 no naturales.

Entre las sustituciones de aminoácido conservadoras se incluyen aquellas en las que el residuo de aminoácidos se sustituye por un residuo de aminoácidos que tiene propiedades estructurales o químicas similares. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Entre estas familias se

10 incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistina, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano,

15 histidina). Para el experto en la materia será evidente que pueden emplearse también otras clasificaciones de familias de residuos de aminoácidos aparte de las usadas anteriormente. Además, una variante puede tener sustituciones de aminoácidos no conservadoras, por ejemplo, reemplazamiento de un aminoácido por un residuo de aminoácidos que tenga propiedades estructurales o químicas diferentes. Variaciones menores similares pueden incluir también deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Puede encontrarse mayor orientación sobre la

20 determinación de qué residuos de aminoácidos pueden someterse a sustitución, inserción o deleción sin eliminar la actividad inmunológica mediante el uso de programas informáticos bien conocidos en la técnica.

Una mutación en una secuencia de nucleótidos puede ser una alteración única realizada en un locus (una mutación puntual), como mutaciones de transición o transversión, o alternativamente, es posible insertar, borrar o modificar

25 múltiples nucleótidos en un único locus. Además, puede realizarse una o más alteraciones en cualquier número de loci dentro de una secuencia de nucleótidos. Las mutaciones pueden llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica.

Hospedador

30 El término "hospedador", según se usa en la presente memoria descriptiva, pretende referirse a un organismo o una célula en la que se ha introducido un vector como, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El organismo o célula puede ser procariota o eucariota. Debe entenderse que este término pretende referirse no sólo al organismo o célula objeto en particular, sino también a la progenie de dicho organismo o célula. Debido a que

35 algunas modificaciones pueden producir generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica al organismo o célula de origen, aunque aun así se incluyen dentro del ámbito del término "hospedador" según se usa en la presente memoria descriptiva.

Humano

40 El término "humano", cuando se aplica a moléculas de unión según se define en la presente memoria descriptiva, se refiere a moléculas que se obtienen directamente de un ser humano o se basan en una secuencia humana. Cuando una molécula de unión se obtiene de o se basa en una secuencia humana y se modifica posteriormente, sigue considerándose humana según se usa en toda la memoria descriptiva. En otras palabras, el término humano,

45 cuando se aplica a moléculas de unión pretende incluir moléculas de unión que tienen regiones variables y constantes obtenidas de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana o basadas en regiones variables o constantes que se producen en un ser humano o un linfocito humano y modificadas de alguna forma. Así, las moléculas de unión humanas pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana, comprender sustituciones y/o deleciones (por ejemplo, mutaciones

50 introducidas, por ejemplo, por mutagenia aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo). "Basado en" según se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a la situación en la que una secuencia de ácidos nucleicos puede copiarse exactamente a partir de una plantilla, o con mutaciones menores, por ejemplo, procedimientos PCR propensos a errores, o prepararse sintéticamente mediante correspondencia de la plantilla exacta o con modificaciones menores. Las moléculas semisintéticas basadas en secuencias humanas se consideran

55 también humanas según se usa en la presente memoria descriptiva.

Aislado

El término "aislado", cuando se aplica a moléculas de unión según se define en la presente memoria descriptiva, se

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refiere a moléculas de unión que están sustancialmente libres de otras proteínas o polipéptidos, especialmente libres de otras moléculas de unión que tengan especificidades antigénicas diferentes, y están también sustancialmente libres de otro material celular y/o productos químicos. Por ejemplo, cuando las moléculas de unión se producen de forma recombinante, preferentemente están sustancialmente libres de medio de cultivo, y cuando las moléculas de 5 unión son producidas por síntesis química, preferentemente están sustancialmente libres de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, están separadas de precursores químicos u otros productos químicos que participan en la síntesis de la proteína. El término "aislado" cuando se aplica a moléculas de ácidos nucleicos que codifican para moléculas de unión según se define en la presente memoria descriptiva, pretende referirse a moléculas de ácidos nucleicos en las que las secuencias de nucleótidos que codifican para las moléculas de unión 10 están libres de otras secuencias de nucleótidos, especialmente secuencias de nucleótidos que codifican para moléculas de unión que se unen a compañeros de unión distintos al WNV. Además, el término "aislado" se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que están separadas sustancialmente de otros componentes celulares que acompañan naturalmente a la molécula de ácido nucleico nativa en su hospedador natural, por ejemplo, ribosomas, polimerasas o secuencias genómicas con las que está asociada naturalmente. Por otra parte, moléculas de ácidos

15 nucleicos “aisladas”, como moléculas de ADNc, pueden estar sustancialmente libres de otro material celular, o medio de cultivo cuando son producidas por técnicas recombinantes, o sustancialmente libres de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente.

Anticuerpo monoclonal

20 El término "anticuerpo monoclonal" según se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpos de composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad para un epítopo en particular. En consecuencia, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticuerpo que muestra una única especificidad de unión que tiene regiones variables y

25 constantes obtenidas de o basadas en secuencias de inmunoglobulinas de línea germinal humana u obtenidas de secuencias completamente sintéticas. El procedimiento de preparación del anticuerpo monoclonal no es relevante.

Ocurrencia natural

30 El término "ocurrencia natural" según se usa en la presente memoria descriptiva aplicado a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de polinucleótidos que está presente en un organismo que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio es de ocurrencia natural.

35 Molécula de ácido nucleico

El término "molécula de ácido nucleico" según se usa en la presente invención se refiere a una forma polimérica de nucleótidos e incluye hebras codificantes y no codificantes de ARN, ADNc, ADN genómico y formas sintéticas y polímeros mixtos de los anteriores. Un nucleótido se refiere a un ribonucleótido, desoxinucleótido o una forma

40 modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye también formas monocatenarias y bicatenarias de ADN. Además, un polinucleótido puede incluir uno o ambos entre nucleótidos de ocurrencia natural y modificados, unidos conjuntamente por uniones de nucleótidos de ocurrencia natural y/o de ocurrencia no natural. Una referencia a una secuencia de ácidos nucleicos comprende su complemento a no ser que se especifique lo contrario. Así, debe entenderse que una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia en particular comprende

45 su hebra complementaria, con su secuencia complementaria. La hebra complementaria es útil también, por ejemplo, para terapia no codificante, sondas de hibridación y cebadores de PCR.

Unido operativamente

50 El término "unido operativamente" se refiere a dos o más elementos de secuencias de ácidos nucleicos que normalmente están unidos físicamente y mantienen una relación funcional entre sí. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia de codificación, si el promotor es capaz de iniciar o regular la transcripción o expresión de una secuencia de codificación, en cuyo caso debe entenderse que la secuencia de codificación está "bajo el control" del promotor.

55 Excipiente farmacéuticamente aceptable

Por "excipiente farmacéuticamente aceptable" se entiende cualquier sustancia inerte que se combina con una molécula activa como un fármaco, agente o molécula de unión para preparar una forma de dosificación agradable o

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cómoda. El "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un excipiente que no es tóxico para los receptores para las dosis y concentraciones empleadas, y es compatible con otros ingredientes de la formulación que comprenden el fármaco, agente o molécula de unión.

5 De unión específica

El término "de unión específica", según se usa en la presente memoria descriptiva, en referencia a la interacción de una molécula de unión, por ejemplo un anticuerpo, y su compañero de unión, por ejemplo un antígeno, significa que la interacción depende de la presencia de una estructura en particular, por ejemplo, un determinante o epítopo 10 antigénico, en el compañero de unión. En otras palabras, el anticuerpo se une o reconoce preferentemente al compañero de unión incluso cuando el compañero de unión está presente en una mezcla de otras moléculas u organismos. La unión puede estar mediada por interacciones covalentes o no covalentes o por una combinación de ambas. En otras palabras, el término "de unión específica" significa unión inmunoespecífica a un antígeno o un fragmento del mismo y unión no inmunoespecífica a otros antígenos. Una molécula de unión que se une 15 inmunoespecíficamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con menor afinidad según se determina, por ejemplo, por radioinmunoensayos (RIA), ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), BIACORE, u otros ensayos conocidos en la técnica. Las moléculas de unión o fragmentos de las mismas que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno pueden ser interreactivos con antígenos relacionados. Preferentemente, las moléculas de unión o fragmentos de las mismas que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno no

20 interreaccionan con otros antígenos.

Cantidad terapéuticamente eficaz

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de la molécula de unión según se define en

25 la presente memoria descriptiva que es eficaz para prevenir, mejorar y/o tratar una dolencia resultante de una infección con WNV.

Tratamiento

30 El término "tratamiento" se refiere a tratamiento terapéutico, así como a medidas profilácticas o preventivas para curar o detener o al menos retrasar el progreso de la enfermedad. Entre las personas necesitadas de tratamiento se incluyen las ya afectadas por una dolencia resultante de infección con el WNV así como aquellas en las que debe prevenirse la infección con WNV. Los sujetos recuperados parcial o totalmente de la infección con WNV podrían necesitar también tratamiento. La prevención comprende la inhibición o reducción de la extensión del WNV o la

35 inhibición o reducción del inicio, el desarrollo o la progresión de uno o más de los síntomas asociados con infección con WNV.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

40 La invención proporciona moléculas de unión humanas capaces de unirse específicamente al WNV y capaces de neutralizar el WNV. La invención se refiere también a moléculas de ácidos nucleicos que codifican para al menos la región de unión de las moléculas de unión humanas. También se desvela el uso de las moléculas de unión humanas de la invención en la profilaxis y/o el tratamiento de un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, una infección por WNV. Además, también se desvela el uso de las moléculas de unión humanas de la invención en el

45 diagnóstico/detección del WNV.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto la presente invención comprende moléculas de unión capaces de unirse específicamente al

50 WNV. Preferentemente, las moléculas de unión son moléculas de unión humanas. Preferentemente, las moléculas de unión de la invención son capaces de neutralizar el WNV. Más preferentemente, las moléculas de unión de la invención son capaces de unirse a y de neutralizar las variantes del linaje I del WNV como, entre otros, la cepa 38599 y las variantes del linaje II del WNV como, entre otros, la cepa H-442. En la forma de realización más preferida, las moléculas de unión de la invención son capaces de neutralizar esencialmente todas las variantes del WNV

55 conocidas en la actualidad. Las moléculas de unión de la invención pueden ser capaces de unirse específicamente al WNV en forma activada o inactivada/atenuada. Los procedimientos para inactivar/atenuar virus son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, inactivación por calor, inactivación por irradiación UV e inactivación por irradiación gamma.

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Las moléculas de unión de la invención puede también ser capaces de unirse específicamente a uno o más fragmentos del WNV como, entre otros, una preparación de una o más proteínas y/o (poli)péptidos obtenidos del WNV o una o más proteínas y/o polipéptidos del WNV producidos de forma recombinante. Alternativamente, los fragmentos tienen la forma de partículas de tipo WNV. Dichas partículas comprenden proteínas estructurales del 5 WNV que incluyen, pero no se limitan a, la proteína de la envoltura (E) del WNV y/o la proteína de membrana (preM/M) del WNV. Para procedimientos de tratamiento y/o prevención del WNV las moléculas de unión son capaces preferentemente de unirse específicamente a proteínas accesibles en superficie del WNV que incluyen la proteína E y la proteína preM/M. Para fines de diagnóstico las moléculas de unión puede ser capaces también de unirse específicamente a proteínas no presentes en la superficie de WNV incluyendo la proteína (C) de la cápside 10 del WNV y/o las proteínas no estructurales (NS) del WNV NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5. La secuencia de nucleótidos y/o de aminoácidos de proteínas de varias cepas del WNV puede encontrarse en la base de datos GenBank, la base de datos EMBL y/u otras bases de datos. Se han secuenciado los genomas completos o parciales de una serie de aislados de WNV de brotes epidémicos, por ejemplo, en los Estados Unidos. La secuencia completa del WNV aislada de un flamenco chileno muerto (WN-NY99, cepa 382-99) en el zoológico del Bronx puede 15 encontrarse en la base de datos Genbank con el número de acceso AF 196835 (véase Lanciotti y col., 1999). Se secuenció el genoma de un aislado del WNV de víctimas humanas del brote epidémico de Nueva York de 1999 (WNV-NY1999) y puede encontrarse en la base de datos Genbank con el número de acceso AF202541 (véase Jia y col., 1999). Las secuencias parciales de aislados de dos especies de mosquito, un cuervo y un halcón de Connecticut, pueden encontrarse en la base de datos Genbank con los números de acceso AF206517-AF206520,

20 respectivamente (véase Anderson y col., 1999). El experto en la materia tiene a su alcance la localización de secuencias adicionales de aislados y proteínas del WNV en bases de datos.

Preferentemente, el fragmento comprende al menos un determinante antigénico reconocido por las moléculas de unión de la invención. Un "determinante antigénico" según se usa en la presente memoria descriptiva es una

25 fracción, por ejemplo, un (poli)péptido, proteína, glicoproteína, análogo del WNV o un fragmento de los mismos, que sea capaz de unirse a una molécula de unión de la invención con afinidad suficientemente alta para formar un complejo detectable de antígeno-molécula de unión.

En una forma de realización las moléculas de unión de la invención son capaces de unirse específicamente a la

30 proteína E del WNV. Las moléculas de unión humanas de la invención pueden ser capaces de unirse al dominio I, II y/o III de la proteína E. Las moléculas de unión de la invención pueden ser moléculas de inmunoglobulinas intactas como anticuerpos policlonales o monoclonales o las moléculas de unión pueden ser fragmentos de unión a antígenos que incluyen, pero no se limitan a, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de regiones de determinación de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena única (scFv), anticuerpos de cadena única

35 bivalentes, anticuerpos de fagos de cadena única, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y (poli)péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al WNV o a un fragmento del mismo. En una forma de realización preferida las moléculas de unión humanas que tienen actividad de neutralización del WNV se administran en formato IgG1.

40 Las moléculas de unión de la invención pueden usarse en forma aislada o no aislada. Además, las moléculas de unión de la invención pueden usarse en solitario o en una mezcla que comprende al menos una molécula de unión (o variante o fragmento de la misma) de la invención. En otras palabras, las moléculas de unión pueden usarse en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica que comprende dos o más moléculas de unión de la invención, variantes o fragmentos de la misma. Por ejemplo, moléculas de unión que tienen actividades diferentes,

45 pero complementarias, pueden combinarse en una única terapia para conseguir un efecto terapéutico o diagnóstico deseado, pero alternativamente, moléculas de unión que tienen actividades idénticas también pueden combinarse en una única terapia para conseguir un efecto profiláctico, terapéutico o diagnóstico deseado. La mezcla puede comprender además al menos otro agente terapéutico. Preferentemente, el agente terapéutico es útil en la profilaxis y/o tratamiento de una dolencia resultante del WNV.

50 Normalmente, las moléculas de unión según la invención pueden unirse a sus compañeros de unión, es decir, el WNV o fragmentos del mismo, con una constante de afinidad (valor Kd) que es menor que 0,2·10-4 M, 1,0·10-5 M, 1,0·10-6 M, 1,0·10-7 M, preferentemente menor que 1,0·10-8 M, más preferentemente menor que 1,0·10-9 M, más preferentemente menor que 1,0·10-10 M, más preferentemente todavía menor que 1,0·10-11 M, y en particular menor

55 que 1,0·10-12 M. Las constantes de afinidad pueden variar para distintos isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, afinidad de unión para un isotipo de IgM se refiere a una afinidad de unión de al menos 1,0·10-7 M aproximadamente. Las constantes de afinidad pueden medirse, por ejemplo, usando resonancia de plasmones superficiales, es decir, un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real por detección de alteraciones en concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensores, por ejemplo, usando el sistema

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BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia).

Las moléculas de unión según la invención pueden unirse al WNV o un fragmento del mismo en forma soluble como, por ejemplo, en una muestra o pueden unirse al WNV o un fragmento del mismo unido o fijo a un vehículo o

5 sustrato, por ejemplo, placas de microvaloración, membranas y perlas, etc. Los vehículos o sustratos pueden estar hechos de vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno), polisacáridos, nailon, nitrocelulosa o Teflón, etc. La superficie de dichos soportes puede ser sólida o porosa y de cualquier forma conveniente. Además, las moléculas de unión pueden unirse al WNV en forma purificada/aislada o no purificada/no aislada.

10 Las moléculas de unión de la invención son capaces de neutralizar la infectividad del WNV. Esto puede conseguirse impidiendo la fijación del WNV a posibles receptores en células hospedadoras susceptibles o por inhibición de la fusión del WNV y las membranas celulares. La neutralización puede medirse, por ejemplo, según se describe en la presente memoria descriptiva. Se describen ensayos de neutralización alternativos, por ejemplo, en Gollins y Porterfield (1986).

15 Además, las moléculas de unión de neutralización de la invención pueden impedir la replicación del WNV, ser complemento de moléculas de unión humanas de fijación capaces de ayudar a la lisis del WNV, y/o pueden actuar como opsoninas y aumentar la fagocitosis del WNV bien promoviendo su captación por medio de receptores Fc o C3b o aglutinando el WNV para fagocitarlo más fácilmente.

20 Se prefiere especialmente una molécula de unión según la invención que comprenda al menos una región CDR3 de cadena pesada, que comprenda la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Más preferentemente, la molécula de unión según la invención comprende al menos una región CDR1 y CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y 40, respectivamente. En una forma de realización las moléculas de

25 unión de la invención pueden comprender dos, tres, cuatro, cinco o incluso las seis regiones CDR de las moléculas de unión de la invención. En la Tabla 9 se muestran la región CDR1 de cadena pesada, la región CDR2 de cadena pesada, la región CDR1 de cadena ligera, la región CDR2 de cadena ligera y la región CDR3 de cadena ligera de cada molécula de unión de la invención. Las regiones CDR son según Kabat y col. (1991) tal como se describen en Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico. En una forma de realización específica, la molécula de unión que

30 comprende al menos una región CDR3, preferentemente una región CDR3 de cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 comprende una región CDR1 de cadena pesada y una región CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y 40, respectivamente, y una región CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 236-239, una región CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de

35 aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 240-243 y/o una región CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 244-247.

En otra forma de realización más, las moléculas de unión según la invención comprenden una cadena pesada que 40 comprende la cadena pesada variable de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80.

En una forma de realización adicional, las moléculas de unión según la invención comprenden una cadena ligera que comprende la cadena ligera variable de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233 y SEQ ID NO: 235. Las Tablas 8 y 18 especifican, junto a la región CDR3 de cadena

45 pesada, las regiones variables de cadena pesada y ligera de la molécula de unión de la invención.

En una forma de realización adicional, las moléculas de unión de la invención comprenden una cadena pesada que comprende la cadena pesada variable de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131. En otra forma de realización, las moléculas de unión de la invención comprenden una cadena ligera que comprende la cadena ligera

50 variable de la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 151, 221, 223, 225 y 227.

En una forma de realización adicional más las moléculas de unión de la invención comprenden una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131, y comprenden una cadena ligera que comprende

55 la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 151, 221, 223, 225 y 227.

Otro aspecto de la invención incluye variantes funcionales de las moléculas de unión según se define en la presente memoria descriptiva. Las moléculas se consideran variantes funcionales de una molécula de unión según la invención, si las variantes son capaces de competir para unirse específicamente al WNV o a un fragmento del mismo

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con las moléculas de unión humanas de origen. En otras palabras, cuando las variantes funcionales siguen siendo capaces de unirse al WNV o a un fragmento del mismo. Además, las moléculas se consideran variantes funcionales de una molécula de unión según la invención, si tienen actividad de neutralización del WNV. Las variantes funcionales incluyen, pero no se limitan a, derivados que son sustancialmente similares en la secuencia estructural

5 primaria, pero que contienen, por ejemplo, modificaciones in vitro o in vivo, químicas y/o bioquímicas, que no se encuentran en la molécula de unión de origen. Dichas modificaciones incluyen entre otros acetilación, acilación, fijación covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, fijación covalente de un lípido o derivado de lípido, reticulación, formación de enlaces de disulfuro, glucosilación, hidroxilación, metilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación.

10 Alternativamente, las variantes funcionales pueden ser moléculas de unión según se define en la presente invención que comprenden una secuencia de aminoácidos que contiene sustituciones, inserciones, deleciones o combinaciones de las mismas de uno o más aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos de las moléculas de unión de origen. Además, las variantes funcionales pueden comprender truncamientos de la secuencia

15 de aminoácidos en uno o los dos extremos amino o carboxilo. Las variantes funcionales según la invención pueden tener las mismas o diferentes afinidades de unión, superiores o inferiores, en comparación con la molécula de unión de origen pero son capaces todavía de unirse al WNV o a un fragmento del mismo. Por ejemplo, las variantes funcionales según la invención pueden tener afinidades de unión aumentadas o disminuidas para el WNV o un fragmento del mismo en comparación con las moléculas de unión de origen. Preferentemente, las secuencias de

20 aminoácidos de las regiones variables, que incluyen, pero no se limitan a, regiones marco, regiones hipervariables, en particular las regiones CDR3, están modificadas. Generalmente, las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada comprenden tres regiones hipervariables, que comprenden tres CDR, y regiones más conservadas, las denominadas regiones marco (FR). Las regiones hipervariables comprenden residuos de aminoácidos de CDR y residuos de aminoácidos de bucles hipervariables. Las variantes funcionales destinadas a encuadrarse dentro del

25 ámbito de la presente invención tienen al menos de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 99%, preferentemente al menos aproximadamente el 60% a aproximadamente el 99%, más preferentemente de al menos aproximadamente el 70% a aproximadamente el 99%, más preferentemente todavía de al menos aproximadamente el 80% a aproximadamente el 99%, con la máxima preferencia de al menos aproximadamente el 90% a aproximadamente el 99%, en particular de al menos aproximadamente el 95% a aproximadamente el 99%, y en

30 particular de al menos aproximadamente el 97% a aproximadamente el 99% de homología de secuencias de aminoácidos con las moléculas de unión humanas de origen según se define en la presente memoria descriptiva. Pueden usarse algoritmos informáticos como, entre otros, Gap o Bestfit conocidos para el experto en la materia para alinear óptimamente secuencias de aminoácidos para su comparación y para definir residuos de aminoácidos similares o idénticos. Pueden obtenerse variantes funcionales alterando las moléculas de unión de origen o partes

35 de las mismas por procedimientos generales de biología molecular conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, PCR propensa a errores, mutagenia dirigida por oligonucleótidos, mutagenia dirigida al sitio y transposición de cadena pesada o ligera. Preferentemente, las variantes funcionales de la invención tienen actividad de neutralización del WNV. Esta actividad de neutralización puede ser idéntica o ser superior o inferior en comparación con las moléculas de unión de origen. Además, las variantes funcionales que tienen actividad de neutralización

40 pueden inhibir o regular por disminución la replicación del WNV, son moléculas de unión de fijación de complemento capaces de ayudar a la lisis del WNV y/o de actuar como opsoninas y de aumentar la fagocitosis del WNV promoviendo su captación por medio de receptores Fc o C3b o aglutinando el WNV para hacer más fácil su fagocitosis. En lo sucesivo, cuando se use el término molécula de unión (humana), comprende también variantes funcionales de la molécula de unión (humana).

45 En un aspecto adicional, la invención incluye inmunoconjugados, es decir, moléculas que comprenden al menos una molécula de unión según se define en la presente memoria descriptiva y que comprenden además al menos una etiqueta, como, entre otras, una fracción/agente detectable. También se contemplan en la presente invención mezclas de inmunoconjugados según la invención o mezclas de al menos un inmunoconjugado según la invención y

50 otra molécula, como un agente terapéutico u otra molécula de unión o inmunoconjugado. En una forma de realización adicional, los inmunoconjugados de la invención pueden comprender más de una etiqueta. Estas etiquetas pueden ser las mismas o distintas entre sí y pueden unirse/conjugarse de forma no covalente a las moléculas de unión. La(s) etiqueta(s) también puede(n) unirse/conjugarse directamente a las moléculas de unión humanas a través de unión covalente. Alternativamente, la(s) etiqueta(s) puede(n) unirse/conjugarse a las moléculas

55 de unión por medio de uno o más compuestos de unión. Las técnicas para conjugar etiquetas a moléculas de unión son bien conocidas para el experto en la materia.

Las etiquetas de los inmunoconjugados de la presente invención pueden ser agentes terapéuticos, pero preferentemente son fracciones/agentes detectables. Las etiquetas pueden ser también toxinas, como la toxina

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botulínica o partes funcionales de la misma. Los inmunoconjugados que comprenden un agente detectable pueden usarse con fines diagnósticos, por ejemplo, para valorar si un sujeto se ha infectado con WNV o vigilar el desarrollo o progresión de una infección por WNV como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Sin embargo, también pueden usarse para otros fines de 5 detección y/o analíticos y/o diagnósticos. Entre las fracciones/agentes detectables se incluyen, pero no se limitan a, enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales con emisión de positrones y iones de metales paramagnéticos no radiactivos. Las etiquetas usadas para marcar las moléculas de unión para detección y/o fines analíticos y/o diagnósticos dependen de las técnicas específicas de detección/análisis/diagnóstico y/o procedimientos usados como, entre otros, tinción

10 inmunohistoquímica de muestras (de tejidos), detección por citometría de flujo, detección por citometría de barrido por láser, inmunoensayos fluorescentes, ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), bioensayos (por ejemplo, ensayos de neutralización), aplicaciones de transferencia Western, etc. Las etiquetas adecuadas para las técnicas y/o procedimientos de detección/análisis/diagnóstico conocidos en la técnica se enmarcan bien dentro del alcance del experto en la materia.

15 Además, las moléculas de unión humanas o inmunoconjugados de la invención pueden fijarse también a soportes sólidos, que son especialmente útiles para inmunoensayos in vitro o purificación del WNV o un fragmento del mismo. Dichos soportes sólidos podrían ser porosos o no porosos, planos o no planos. Las moléculas de unión de la presente invención pueden fusionarse con secuencias de marcador, como un péptido para facilitar la purificación.

20 Entre los ejemplos se incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de hexahistidina, la etiqueta de hemaglutinina (HA), la etiqueta myc o la etiqueta flag. Alternativamente, un anticuerpo puede conjugarse en un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado. En otro aspecto las moléculas de unión de la invención pueden conjugarse/fijarse a uno o más antígenos. Preferentemente, estos antígenos son antígenos que son reconocidos por el sistema inmunitario de un sujeto al que se administra la molécula de unión-antígeno conjugado. Los antígenos

25 pueden ser idénticos pero también pueden diferir entre sí. Los procedimientos de conjugación para fijar los antígenos y moléculas de unión son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el uso de agentes de reticulación. Las moléculas de unión de la invención se unirán al WNV y los antígenos fijos a las moléculas de unión iniciarán un potente ataque de linfocitos T en el conjugado, que en su caso conducirán a la destrucción del WNV.

30 Después de producir inmunoconjugados químicamente por conjugación, directa o indirectamente, por medio, por ejemplo, de un agente de unión, los inmunoconjugados pueden producirse como proteínas de fusión que comprenden las moléculas de unión de la invención y una etiqueta adecuada. Las proteínas de fusión pueden ser producidas por procedimientos conocidos en la técnica como, por ejemplo, de forma recombinante construyendo

35 moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para las moléculas de unión en marco con secuencias de nucleótidos que codifican para la(s) etiqueta(s) adecuada(s) y a continuación expresan las moléculas de ácidos nucleicos.

Otro aspecto de la presente invención consiste en proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifica para al

40 menos una molécula de unión o inmunoconjugado según la invención. Dichas moléculas de ácidos nucleicos pueden usarse como productos intermedios para fines de clonación, por ejemplo, en el procedimiento de maduración de la afinidad según se describe anteriormente. En una forma de realización preferida, las moléculas de ácidos nucleicos están aisladas o purificadas.

45 El experto en la materia observará que las variantes funcionales de estas moléculas de ácidos nucleicos pretenden también formar parte de la presente invención. Las variantes funcionales son secuencias de ácidos nucleicos que pueden traducirse directamente, usando el código genético estándar, para proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a la traducida a partir de las moléculas de ácidos nucleicos de origen.

50 Preferentemente, las moléculas de ácidos nucleicos codifican para moléculas de unión que comprenden una región CDR3, preferentemente una región CDR3 de cadena pesada, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. En una forma de realización adicional las moléculas de ácidos nucleicos codifican para moléculas de unión que comprenden dos, tres, cuatro, cinco o incluso las seis regiones CDR de las moléculas de unión de la invención.

55 En otra forma de realización, las moléculas de ácidos nucleicos codifican para moléculas de unión que comprenden una cadena pesada que comprende la cadena pesada variable de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80. En otra forma de realización las moléculas de ácidos nucleicos codifican para moléculas de unión que comprenden una cadena ligera que comprende la cadena ligera variable de la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el

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grupo que consiste en SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233 y SEQ ID NO: 235.

En una forma de realización adicional, las moléculas de ácidos nucleicos codifican para moléculas de unión que comprenden una cadena pesada que comprende la cadena pesada variable de la secuencia de aminoácidos de

5 SEQ ID NO: 131. En otra forma de realización, las moléculas de ácidos nucleicos codifican para moléculas de unión que comprenden una cadena ligera que comprende la cadena ligera variable de la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 151, 221, 223, 225 y 227.

En una forma de realización adicional las moléculas de ácidos nucleicos codifican para moléculas de unión que

10 comprenden una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131, y que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 151, 221, 223, 225, y 227.

Otro aspecto de la invención consiste en proporcionar vectores, es decir, construcciones de ácidos nucleicos, que

15 comprenden una o más moléculas de ácidos nucleicos según la presente invención. Los vectores pueden obtenerse de plásmidos como, entre otros, F, R1, RPI, Col, pBR322, TOL, Ti, etc.; cósmidos; fagos como lambda, lambdoide, M13, Mu, P1, P22, Qβ, T uniforme, Todd, T2, T4, T7, etc.; virus de plantas. Los vectores pueden usarse para clonación y/o para expresión de las moléculas de unión de la invención y podrían usarse incluso para fines de terapia génica. Los vectores que comprenden una o más moléculas de ácidos nucleicos según la invención unidas

20 operativamente a una o más moléculas de ácidos nucleicos de regulación de expresión también están cubiertos por la presente invención. La elección del vector depende de los procedimientos recombinantes seguidos y del hospedador usado. La introducción de vectores en células del hospedador puede efectuarse, entre otros, por transfección de fosfato de calcio, infección vírica, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección de lipofectamina o electroporación. Los vectores pueden ser replicantes de forma autónoma o pueden replicarse juntos

25 con el cromosoma en el que se han integrado. Preferentemente, los vectores contienen uno más marcadores de selección. La elección de los marcadores puede depender de las células del hospedador de elección, aunque esto no es crítico para la invención tal como es conocido por los expertos en la materia. Incluyen, pero no se limitan a, kanamicina, neomicina, puromicina, higromicina, zeocina, gen timidin-cinasa del virus del herpes simple (HSV-TK), gen de dihidrofolato-reductasa de ratón (dhfr). Los vectores que comprenden una o más moléculas de ácidos

30 nucleicos que codifican para las moléculas de unión humanas según se describe anteriormente unidas operativamente a una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican para proteínas o péptidos que pueden usarse para aislar las moléculas de unión humanas están cubiertos también por la invención. Estas proteínas o péptidos incluyen, pero no se limitan a, glutatión-S-transferasa, proteína de unión a maltosa, polihistidina de unión a metal, proteína fluorescente verde, luciferasa y beta-galactosidasa.

35 Los hospedadores que contienen una o más copias de los vectores mencionados anteriormente constituyen un objeto adicional de la presente invención. Preferentemente, los hospedadores son células hospedadoras. Las células hospedadoras incluyen, pero no se limitan a, células de origen de mamíferos, plantas, insectos, hongos o bacterias. Las células bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células de bacterias Gram-positivas como varias

40 especies de los géneros Bacillus, Streptomyces y Staphylococcus o células de bacterias Gram-negativas como varias especies de los géneros Escherichia, como E. coli y Pseudomonas. En el grupo de células fúngicas se usan preferentemente células de levadura. La expresión en levadura puede conseguirse usando cepas de levadura como, entre otras, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y Hansenula polimorpha. Además, pueden usarse células de insectos como células de Drosophila y Sf9 como células hospedadoras. Además, las células hospedadoras pueden

45 ser células de plantas como, entre otras, células de plantas de cultivo como plantas forestales, o células de plantas que proporcionan alimento y materias primas como plantas de cereales, o plantas medicinales, o células de plantas ornamentales, o células de cultivos de bulbos con flores. Las plantas transformadas (transgénicas) o las células vegetales son producidas por procedimientos conocidos, por ejemplo, transferencia génica mediada por Agrobacterium, transformación de discos de hoja, transformación de protoplastos por transferencia de ADN inducida

50 por polietilenglicol, electroporación, sonicación, transferencia génica bolística o de microinyección. Además, un sistema de expresión adecuado puede ser un sistema de baculovirus. En la presente invención se prefieren los sistemas de expresión que usan células de mamíferos como células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células BHK o células de melanoma de Bowes. Las células de mamífero proporcionan proteínas expresadas con modificaciones después de traducción que son las más semejantes a moléculas naturales de origen de

55 mamífero. Como la presente invención trata de moléculas que pueden administrarse a seres humanos, se preferiría especialmente un sistema de expresión completamente humano. Por tanto, más preferentemente todavía, las células hospedadoras son células humanas. Los ejemplos de células humanas son, entre otros, células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 y HEK293T. En formas de realización preferidas, las células productoras humanas comprenden al menos una parte funcional de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una región E1 de adenovirus

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en formato expresable. En formas de realización más preferidas todavía, dichas células hospedadoras se obtienen de una retina humana y se inmortalizan con ácidos nucleicos que comprenden secuencias E1 adenovíricas, como células 911 o la línea celular depositada en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca 5 comercial PER.C6® (PER.C6 es una marca comercial registrada de Crucell Holland B.V.). Para los fines de esta solicitud "PER.C6" se refiere a células depositadas con el número 96022940 o sus ancestros, pasos en la dirección 5’ o en la dirección 3’ así como descendientes de los ancestros de células depositadas, así como derivados de cualquiera de los anteriores. La producción de proteínas recombinantes en células hospedadoras puede realizarse según procedimientos bien conocidos en la técnica. El uso de las células comercializadas con el nombre comercial

10 PER.C6® como una plataforma de producción para proteínas de interés se ha descrito en el documento WO00/63.403.

Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión, comprendiendo además la composición farmacéutica al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, es también un aspecto de la presente invención.

15 Los excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para el experto en la materia. La composición farmacéutica según la invención puede comprender además al menos otro agente terapéutico. Los agentes adecuados son bien conocidos también para el experto en la materia.

En un aspecto adicional más, la invención proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula de

20 unión, al menos una variante funcional de la misma, al menos un inmunoconjugado según la invención o una combinación de los mismos. Además de ello, las composiciones pueden comprender, entre otros, moléculas estabilizadoras, como albúmina o polietilenglicol, o sales. Preferentemente, las sales usadas son sales que retienen la actividad biológica deseada de las moléculas de unión y no imparten ningún efecto toxicológico no deseado. En caso necesario, las moléculas de unión humanas de la invención pueden estar recubiertas en o sobre un material

25 para protegerlas de la acción de ácidos u otras condiciones naturales o no naturales que pueden inactivar las moléculas de unión.

En un aspecto adicional más, la invención proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico según se define en la presente invención. Las composiciones pueden comprender soluciones

30 acuosas como soluciones acuosas que contienen sales (por ejemplo, NaCl o sales según se describe anteriormente), detergentes (por ejemplo, SDS) y/u otros componentes adecuados.

Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una molécula de unión (o fragmento funcional o variante de la misma), al menos un inmunoconjugado según la invención, al

35 menos una composición según la invención, o combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica de la invención comprende además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Una composición farmacéutica según la invención puede comprender además al menos otro agente terapéutico, profiláctico y/o diagnóstico. Preferentemente, la composición farmacéutica comprende al menos otro agente 40 profiláctico y/o terapéutico. Preferentemente, dichos agentes terapéuticos y/o profilácticos adicionales son agentes capaces de prevenir y/o tratar una infección y/o una dolencia resultante del WNV. Los agentes terapéuticos y/o profilácticos incluyen, pero no se limitan a, agentes antivíricos. Dichos agentes pueden ser moléculas de unión, moléculas pequeñas, compuestos orgánicos o inorgánicos, enzimas, secuencias de polinucleótidos, etc. Otros agentes que se usan actualmente para tratar a pacientes infectados con WNV son interferón-alfa y ribavirina. Estos

45 pueden usarse en combinación con las moléculas de unión de la invención. También podrían usarse agentes capaces de prevenir y/o tratar una infección con WNV y/o una dolencia resultante de WNV que están en la fase experimental como otros agentes terapéuticos y/o profilácticos útiles en la presente invención.

Las moléculas de unión o composiciones farmacéuticas de la invención pueden someterse a ensayo en sistemas de

50 modelos animales adecuados antes de su uso en seres humanos. Dichos sistemas de modelos animales incluyen, pero no se limitan a, un sistema de modelo murino, modelo de hámster y modelo de gansos.

Normalmente, las composiciones farmacéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las moléculas de unión, inmunoconjugados, moléculas de ácidos nucleicos o composiciones de la

55 presente invención pueden estar en forma de polvo para reconstitución en el excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado antes o en el momento del suministro. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son desecación al vacío y criodesecación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución estéril filtrada previamente del mismo.

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Alternativamente, las moléculas de unión, inmunoconjugados, moléculas de ácidos nucleicos o composiciones de la presente invención pueden estar en solución y el excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado puede añadirse y/o mezclarse antes o en el momento del suministro para proporcionar una forma inyectable de dosificación unidad. 5 Preferentemente, el excipiente farmacéuticamente aceptable usado en la presente invención es adecuado para alta concentración de fármaco, puede mantener una fluidez apropiada y, en caso necesario, puede retardar la absorción.

En la elección de la ruta óptima de administración de las composiciones farmacéuticas influirán varios factores, entre ellos las propiedades fisicoquímicas de las moléculas activas dentro de las composiciones, la urgencia de la 10 situación clínica y la relación entre las concentraciones de plasma de las moléculas activas y el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, en caso necesario, las moléculas de unión de la invención pueden prepararse con vehículos que las protegerán contra la liberación rápida, como una formulación de liberación controlada, lo que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Entre otros, pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, poliácido glicólico,

15 colágeno, poliortoésteres y poliácido láctico. Además, puede ser necesario recubrir las moléculas de unión con, o coadministrar las moléculas de unión con, un material o compuesto que previene la inactivación de las moléculas de unión humanas. Por ejemplo, las moléculas de unión pueden administrarse a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas o un diluyente.

20 Las rutas de administración pueden dividirse en dos categorías principales, administración oral y parenteral. La ruta de administración preferida es intravenosa.

Las formas de dosificación oral pueden formularse, entre otras, como comprimidos, trociscos, tabletas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras, cápsulas de gelatina blanda,

25 siropes o elixires, píldoras, grageas, líquidos, geles o suspensiones espesas. Estas formulaciones pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, agentes de granulación y desintegración, agentes de unión, agentes de lubricación, conservantes, agentes colorantes, aromatizantes o edulcorantes, aceites vegetables o minerales, agentes de humectación y agentes espesantes.

30 Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse también para administración parenteral. Las formulaciones para administración parenteral pueden estar, entre otros, en forma de soluciones o suspensiones de inyección o infusión no tóxicas, estériles, isotónicas y acuosas o no acuosas. Las soluciones o suspensiones pueden comprender agentes que son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas como 1,3-butanodiol, solución de Ringer, solución de Hank, solución de cloruro de sodio

35 isotónico, aceites, ácidos grasos, agentes anestésicos locales, conservantes, tampones, agentes de aumento de la viscosidad o la solubilidad, antioxidantes solubles en agua, antioxidantes solubles en aceite y agentes de quelación de metales.

En un aspecto adicional, las moléculas de unión (fragmentos funcionales y variantes de los mismos),

40 inmunoconjugados, composiciones o composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse como un medicamento. Así, un procedimiento de tratamiento y/o prevención de una infección por WNV usando las moléculas de unión, inmunoconjugados, composiciones, o composiciones farmacéuticas de la descripción es otra parte de la descripción. Las moléculas mencionadas anteriormente pueden usarse, entre otros, en el diagnóstico, profilaxis, tratamiento, o combinación de los mismos, de una o más dolencias resultantes del WNV. Son adecuadas para el

45 tratamiento de pacientes todavía sin tratar que sufren una dolencia resultante del WNV y pacientes que han sido o son tratados por una dolencia resultante del WNV. Protegen contra infección adicional por WNV durante 1 mes aproximadamente y/o retrasarán el inicio o el progreso de los síntomas asociados con el WNV. Pueden usarse también en profilaxis después de la exposición, cuando existe una probabilidad de infección pero los síntomas están ausentes. También pueden usarse como profilaxis en el trasplante de órganos infectados o en otras poblaciones de

50 pacientes con alto riesgo de exposición y progresión a la enfermedad debido a, entre otros, la edad o el estado inmunitario. Se sabe que el WNV provoca enfermedad neuroinvasiva en seres humanos en < 1% de las infecciones con una tasa de letalidad por casos de ±9%. Sin embargo, ±60% de los supervivientes no han recuperado sus funciones neurológicas normales después de 12 meses y muchos del 13% de los casos neuroinvasivos que desarrollan un síndrome de parálisis flácida aguda (PFA) no se recuperan. La persistencia del WNV se ha descrito

55 en diferentes hospedadores vertebrados, entre otros en el encéfalo de monos. En la actualidad no existe terapia específica para encefalitis por WNV.

Las moléculas o composiciones mencionadas anteriormente pueden emplearse en conjunción con otras moléculas útiles en el diagnóstico, la profilaxis y/o el tratamiento. Pueden usarse in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, las

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moléculas de unión, inmunoconjugados o composiciones farmacéuticas de la invención pueden coadministrarse con una vacuna contra el WNV. Alternativamente, la vacuna puede administrarse también antes o después de la administración de las moléculas de la invención. En lugar de una vacuna, puede emplearse también interferón-alfa y/o ribavirina en conjunción con las moléculas de unión de la presente invención.

5 Las moléculas se formulan normalmente en las composiciones y composiciones farmacéuticas de la invención en una cantidad terapéutica o diagnósticamente eficaz. Alternativamente, pueden formularse y administrarse por separado. Por ejemplo, las otras moléculas como interferón-alfa o ribavirina pueden aplicarse sistémicamente, mientras que las moléculas de unión de la invención pueden aplicarse intratecal o intraventricularmente.

10 Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Un intervalo de dosificación adecuado puede ser, por ejemplo, de 0,1-100 mg/kg de peso corporal, preferentemente de 0,5-15 mg/kg de peso corporal. Además, por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas con el tiempo o bien la dosis puede reducirse o aumentarse

15 proporcionalmente según se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Las moléculas y composiciones según la presente invención son preferentemente estériles. Los procedimientos para volver estériles estas moléculas y composiciones son bien conocidos en la técnica. Las otras moléculas útiles en el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento pueden administrarse en un régimen de dosificación similar según se propone para las moléculas de unión de la invención. Si las otras moléculas se administran por separado, pueden administrarse a un paciente antes

20 (por ejemplo, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 7 días, 2 semanas, 4 semanas o 6 semanas antes), al mismo tiempo o después (por ejemplo, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 7 días,

25 2 semanas, 4 semanas o 6 semanas) de la administración de una o más de las moléculas de unión humanas o composiciones farmacéuticas de la invención. El régimen de dosificación exacto se establece normalmente durante ensayos clínicos en pacientes humanos.

Las moléculas de unión y composiciones farmacéuticas humanas que comprenden las moléculas de unión humanas

30 son especialmente útiles, y a menudo se prefieren, cuando se van a administrar a seres humanos como agentes terapéuticos in vivo, ya que la respuesta inmunitaria del receptor al anticuerpo administrado a menudo será sustancialmente menor que la ocasionada por la administración de una molécula de unión monoclonal murina, quimérica o humanizada.

35 En otro aspecto, la invención se refiere al uso de las moléculas de unión (humanas) (fragmentos funcionales y variantes de las mismas), inmunoconjugados, moléculas de ácidos nucleicos, composiciones o composiciones farmacéuticas según la invención en la preparación de un medicamento para el diagnóstico, profilaxis, tratamiento, o combinación de los mismos, de una dolencia resultante de WNV.

40 La invención se refiere además a un procedimiento de detección del WNV en una muestra, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) puesta en contacto de una muestra con una cantidad diagnósticamente eficaz de una molécula de unión (fragmentos funcionales y variantes de los mismos) o un inmunoconjugado según la invención, y b) determinación de si la molécula de unión o inmunoconjugado se une específicamente a una molécula de la muestra. La muestra puede ser una muestra biológica que incluye, pero no se limita a, sangre, suero, orina,

45 tejido u otro material biológico de sujetos (potencialmente) infectados, o una muestra no biológica como agua, bebida, etc. Los sujetos (potencialmente) infectados pueden ser sujetos humanos, pero también los animales que son sospechosos de ser vehículos de WNV podrían someterse a ensayo en cuanto a la presencia de WNV usando las moléculas de unión humanas o inmunoconjugados de la invención. La muestra puede ser manipulada primero para hacerla más adecuada para el procedimiento de detección. Manipulación significa entre otros tratar la muestra

50 sospechosa de contener y/o que contenga WNV de tal forma que el WNV se desintegrará en componentes antigénicos como proteínas, (poli)péptidos u otros fragmentos antigénicos. Preferentemente, las moléculas de unión humanas o inmunoconjugados de la invención están en contacto con la muestra en condiciones que permitan la formación de un complejo inmunológico entre las moléculas de unión humanas y WNV o componentes antigénicos de los mismos que pueden estar presentes en la muestra. La formación de un complejo inmunológico, si existe,

55 indica la presencia de WNV en la muestra, se detecta y se mide a continuación por medios adecuados. Dichos procedimientos incluyen, entre otros, inmunoensayos de unión homogéneos y heterogéneos, como radioinmunoensayos (RIA), ELISA, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, FACS, BIACORE y análisis de transferencia Western.

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Las técnicas de ensayo preferidas, especialmente para cribado clínico a gran escala de suero y sangre de pacientes y productos sanguíneos son técnicas ELISA y de transferencia Western. Las pruebas ELISA son preferidas especialmente. Para su uso como reactivos en estos ensayos, las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención están unidos convenientemente a la superficie interior de pocillos de microvaloración. Las moléculas de 5 unión o inmunoconjugados de la invención pueden estar unidos directamente al pocillo de microvaloración. Sin embargo, la unión máxima de las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención a los pocillos podría conseguirse mediante el pretratamiento de los pocillos con polilisina antes de la adición de las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención. Además, las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención pueden estar unidos covalentemente por medios conocidos a los pocillos. Generalmente, las moléculas de unión o

10 inmunoconjugados se usan entre 0,01 y 100 g/ml para recubrimiento, aunque pueden usarse también cantidades superiores o inferiores. A continuación se añaden muestras a los pocillos recubiertas con las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención.

EJEMPLOS

15 Para ilustrar la invención, se proporcionan los siguientes ejemplos. Los ejemplos no pretenden limitar en ningún modo el ámbito de la invención.

Ejemplo 1

20 Construcción de una biblioteca de expresión de fagos scFv mediante el uso de ARN extraído de sangre periférica de donantes convalecientes de WNV.

A partir de tres pacientes convalecientes de WNV se tomaron muestras de sangre 1, 2 y 3 meses después de la

25 infección. Se aislaron leucocitos de sangre periférica mediante centrifugado y se guardó el suero sanguíneo y se congeló a -80°C. Todos los donantes en todos los puntos temporales tenían altas valoraciones de anticuerpos de neutralización a WNV según se determinó usando un ensayo de neutralización de virus. Se preparó ARN total a partir de las células usando separación de fase orgánica y precipitado en etanol posterior. El ARN obtenido se disolvió en agua libre de ARNasa y se determinó la concentración mediante medida de DO a 260 nm.

30 Posteriormente, el ARN se diluyó a una concentración de 100 ng/l. A continuación, se convirtió 1 g de ARN en ADNc del modo siguiente: a 10 l de ARN total se añadieron 13 l de agua ultrapura tratada con DEPC y 1 l de hexámeros aleatorios (500 ng/l) y se calentó la mezcla obtenida a 65°C durante 5 minutos y se enfrió rápidamente en hielo húmedo. A continuación se añadieron 8 l de tampón 5X First-Strand, 2 l de dNTP (10 mM cada uno), 2 l de DTT (0,1 M), 2 l de inhibidor de ARNasa (40 U/l) y 2 l de transcriptasa inversa MMLV Superscript™III (200

35 U/l) a la mezcla, se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se incubó durante 1 hora a 50°C. Se terminó la reacción por inactivación con calor, es decir, incubando la mezcla durante 15 minutos a 75°C.

Los productos de ADNc obtenidos se diluyeron hasta un volumen final de 200 l con agua ultrapura tratada con DEPC. La DO a 260 nm de una solución diluida 50 veces (en tampón Tris 10 mM) de la dilución de los productos de

40 ADNc obtenidos dio un valor de 0,1.

Para cada donante se usaron de 5 a 10 l de los productos de ADNc diluidos como plantilla para amplificación PCR de las secuencias de la familia de cadena pesada de inmunoglobulina gamma y de cadena ligera kappa o lambda usando cebadores de oligonucleótidos específicos (véanse Tablas 1 a 6). Las mezclas de reacción por PCR

45 contuvieron, además de los productos de ADNc diluidos, 25 pmol de cebador sentido y 25 pmol de cebador antisentido en un volumen final de 50 l de Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCI 50 mM, MgCl2 2,5 mM, dNTP 250 mM y 1,25 unidades de Taq polimerasa. En un ciclador térmico de placa calentada que tiene una temperatura de 96°C, las mezclas obtenidas se fundieron rápidamente durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos de: 30 segundos a 96°C, 30 segundos a 60°C y 60 segundos a 72°C.

50 En una primera amplificación completa, cada uno de los diecisiete cebadores sentido de región variable de cadena ligera (once para la cadena ligera lambda (véase Tabla 1) y seis para la cadena ligera kappa (véase Tabla 2)) se combinó con un cebador antisentido que reconocía la C-kappa denominada HuC 5’-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3’ (véase SEQ ID NO: 81) o región constante C-lambda HuC2 5’

55 TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3’ (véase SEQ ID NO: 82) y HuC7 5’-AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-3’ (véase SEQ ID NO: 83) (los cebadores antisentido HuC2 y HuC7 se mezclaron hasta la equimolaridad antes de su uso), para producir 4 veces 17 productos de aproximadamente 600 pares de bases. Estos productos se purificaron en un gel de agarosa al 2% y se aislaron a partir del gel usando columnas de extracción de gel Qiagen. 1/10 de cada

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uno de los productos aislados se usó en una reacción PCR idéntica según se describe anteriormente usando los mismos diecisiete cebadores sentido, en los que cada cebador sentido de cadena ligera lambda se comparó con uno de los tres cebadores antisentido específicos de región Jlambda y cada cebador sentido de cadena kappa se combinó con uno de los cinco cebadores antisentido específicos de región Jkappa. Los cebadores usados en la 5 segunda amplificación se extendieron con sitios de restricción (véase Tabla 3) para permitir la clonación directa en el vector de expresión de fagos PDV-C06 (véase SEQ ID NO: 84). Esto dio como resultado 4 veces 63 productos de aproximadamente 350 pares de bases que se almacenaron en un total de 10 fracciones. Se eligió este número de fracciones para mantener la distribución natural de las diferentes familias de cadena ligera dentro de la biblioteca y para no representar por exceso o por defecto ciertas familias. El número de alelos dentro de una familia se usó para 10 determinar el porcentaje de representación dentro de una biblioteca (véase Tabla 4). En la siguiente etapa, se digirieron 2,5 g de fracción en reserva y 100 g PDV-C06 de vector con SamlI y NotI y se purificó a partir de gel. Posteriormente, se realizó una unión durante toda la noche a 16°C del modo siguiente. A 500 ng de vector PDV-C06 se añadieron 70 ng de fracción en reserva en un volumen total de 50 l de mezcla de unión que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, 25 g/ml de BSA y 2,5 l de ADN Ligasa T4 (400 U/l). Este 15 procedimiento se siguió para cada fracción en reserva. Las mezclas de unión se purificaron con fenol/cloroformo, seguido por una extracción de cloroformo y precipitado de etanol, procedimientos bien conocidos para el experto en la materia. El ADN obtenido se disolvió en 50 l de agua ultrapura y por mezcla de unión dos veces se sometieron a electroporación 2,5 l de partes alícuotas en 40 l de bacterias E. coli competentes TG1 según el protocolo del fabricante (Stratagene). Se cultivaron los transformantes durante toda la noche a 37°C en un total de 30 cubetas

20 (tres cubetas por fracción en reserva; dimensión de cubeta: 240 mm x 240 mm) que contenían agar 2TY suplementado con 50 g/ml de ampicilina y glucosa al 4,5%. Se obtuvo una (sub)biblioteca de regiones variables de cadena ligera rascando los transformantes de las placas de agar. Esta (sub)biblioteca se usó directamente para preparación de plásmidos ADN usando un kit de preparación Qiagen™ QIAFilter MAXI.

25 Para cada donante las secuencias de inmunoglobulinas de cadena pesada se amplificaron a partir de los mismos preparados de ADNc en un procedimiento PCR de dos tandas similar y parámetros de reacción idénticos según se describe anteriormente para las regiones de cadena ligera con la salvedad de que se usaron los cebadores representados en las Tablas 5 y 6. La primera amplificación se realizó usando un conjunto de nueve cebadores sentido (véase Tabla 5; que cubre todas las familias de regiones variables de cadena pesada), cada una combinada

30 con un cebador antisentido de región constante específico de IgG denominado HuCIgG 5’-GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3’ (SEQ ID NO: 85) para producir cuatro veces nueve productos de 650 pares de bases aproximadamente. Estos productos se purificaron en un gel de agarosa al 2% y se aislaron a partir del gel usando columnas de extracción de gel Qiagen. 1/10 de cada uno de los productos aislados se usó en una reacción PCR idéntica según se describe anteriormente usando los mismos nueve cebadores sentido, en los que cada cebador

35 sentido de cadena pesada se combinó con uno de los cuatro cebadores antisentido específicos de región JH. Los cebadores usados en la segunda tanda se extendieron con sitios de restricción (véase Tabla 6) para permitir la clonación dirigida en el vector de (sub)biblioteca de cadena ligera. Esto dio como resultado para cada donante 36 productos de 350 pares de bases aproximadamente. Estos productos se agruparon en reserva para cada donante mediante cebador sentido fusionado (VH) en nueve fracciones. Los productos obtenidos se purificaron usando

40 columnas de purificación de PCR Qiagen. A continuación, se digirieron las fracciones con SfiI y XhoI y se ligaron en el vector de (sub)biblioteca de cadena ligera, que se cortó con las mismas enzimas de restricción, usando el mismo procedimiento de unión y los mismos volúmenes según se describe anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera. Alternativamente, las fracciones se digirieron con NcoI y XhoI y se ligaron en el vector de cadena ligera, que se cortó con las mismas enzimas de restricción, usando el mismo procedimiento de unión y los mismos volúmenes

45 según se describe anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera. La purificación de la unión y la posterior transformación de la biblioteca definitiva resultante se realizó también según se describe anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera y en este punto se combinaron las mezclas de unión de cada donante mediante reserva VH. Los transformantes se cultivaron en 27 cubetas (tres cubetas por fracción en reserva; dimensión de cubeta: 240 mm x 240 mm) que contenía agar 2TY suplementado con 50 g/ml de ampicilina y glucosa al 4,5%.

50 Todas las bacterias se recogieron en medio de cultivo 2TY que contenía 50 g/ml de ampicilina y glucosa al 4,5%, mezclado con glicerol al 15% (v/v) y congelado en 1,5 ml de partes alícuotas a -80°C. El rescate y selección de cada biblioteca se realizaron según se describe a continuación.

Ejemplo 2

55 Selección de fagos portadores de fragmentos Fv de cadena única que reconocen específicamente proteína (E) de envoltura del WNV

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Se seleccionaron fragmentos de anticuerpo usando bibliotecas de expresión de fagos de anticuerpos, tecnología general de expresión de fagos y tecnología Abstract®, esencialmente según se describe en el documento de patente de EE.UU. 6.265.150 y en el documento WO-98/15.833 (los dos se incorporan como referencia en la presente memoria descriptiva). La biblioteca de fagos de anticuerpos usada estaba formada por dos bibliotecas de fagos scFV 5 semisintéticos diferentes (JK1994 y WT2000) y la biblioteca inmunitaria preparada según se describe en el Ejemplo

1. La primera biblioteca de fagos scFv semisintética (JK1994) ha sido descrita en de Kruif y col., 1995b, la segunda (WT2000) se construyó esencialmente según se describe en de Kruif y col., 1995b. Brevemente, la biblioteca tiene un formato semisintético en el que la variación se incorporó en los genes V de cadena pesada y ligera usando oligonucleótidos degenerados que incorporan variación dentro de las regiones CDR. Se usaron sólo los genes de 10 cadena pesada VH3, en combinación con genes de cadena ligera kappa y lambda. CDR1 y CDR3 de la cadena pesada y CDR3 de la cadena ligera se recrearon sintéticamente en un enfoque basado en PCR similar según se describe en de Kruif y col., 1995b. Los genes de la región V así creados se clonaron en secuencia en formato scFv en un vector fagémido y se amplificaron para generar una biblioteca de fagos según se describe anteriormente. Además, en la presente invención se usaron los procedimientos y los fagos cooperadores según se describe en el

15 documento WO-02/103.012 (incorporado como referencia en la presente memoria descriptiva). Para identificar anticuerpos de fagos que reconocen la proteína E del WNV, se realizaron experimentos de selección de fagos usando WNV entero (denominado cepa USA99b o cepa 385-99) inactivado por irradiación gamma (50 Gy durante 1 hora), proteína E del WNV expresada de forma recombinante (cepa 382-99) y/o partículas de tipo WNV que expresan la proteína E (cepa 382-99) en su superficie.

20 La proteína E expresada de forma recombinante se produjo del modo siguiente. Se sintetizaron la secuencia de nucleótidos que codifican para la proteína preM/M y la proteína E de longitud completa del WNV cepa 382-99 (véase SEQ ID NO: 86 para la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión que comprende los dos polipéptidos WNV). Los aminoácidos 1-93 de la SEQ ID NO: 86 constituyen la proteína preM del WNV, los aminoácidos 94-168

25 de la SEQ ID NO: 86 constituyen la proteína M del WNV, los aminoácidos 169-669 de la SEQ ID NO: 86 constituyen la proteína E del WNV (la proteína E soluble del WNV (ectodominio) constituye los aminoácidos 169-574 de la SEQ ID NO: 86, mientras que la región del tallo y transmembrana de la proteína E del WNV constituye los aminoácidos 575-669 de la SEQ ID NO: 86) La secuencia de nucleótidos sintetizada se clonó en el plásmido pAdapt y el plásmido obtenido se denominó pAdapt.WNV.prM-E (FL).

30 Para producir una forma secretada soluble de la proteína E se preparó una construcción que carecía de las regiones de separación de transmembrana presentes en los 95 aminoácidos finales en el terminal carboxilo de la proteína E de longitud completa (forma truncada). Para ese fin, la construcción de longitud completa pAdapt.WNV.prM-E (FL) se amplificó por PCR con los cebadores CMV-Spe (SEQ ID NO: 87) y WNV-E-95 REV (SEQ ID NO: 88) y el

35 fragmento obtenido se clonó en el plásmido pAdapt.myc.his para crear el plásmido denominado pAdapt.WNV-95. A continuación, la región que codifica para la proteína preM, la proteína E truncada, la etiqueta Myc y la etiqueta His se amplificaron por PCR con los cebadores clefsmaquWNV (SEQ ID NO: 89) y WNVmychis inverso (SEQ ID NO: 90) y se clonaron en el vector pSyn-C03 que contenía el péptido delantero HAVT20 usando los sitios de restricción EcoRI y SpeI. La construcción de expresión obtenida, pSyn-C03-WNV-E-95, se sometió a transfección en células HEK293T

40 confluentes al 90% usando lipofectamina según las instrucciones de los fabricantes. Las células se cultivaron durante 5 días en medio ultra-CHO libre de suero, a continuación se recogió el medio y se purificó mediante el paso sobre columnas de quelación HisTrap (Amersham Bioscience) precargadas con iones de níquel. La proteína E truncada se eluyó con 5 ml de imidazol 250 mM y se purificó adicionalmente por el paso sobre una columna de filtración de gel G-75 equilibrada con solución salina con tampón de fosfato (PBS). Las fracciones obtenidas se

45 analizaron mediante análisis SDS-PAGE y transferencia Western usando el anticuerpo murino específico de proteína E del WNV 7H2 (Biorelience, véase Beasley y Barrett 2002). Tres fracciones de 5 ml que contenían una única banda

de ∼ 45 kDa que era inmunorreactiva con anticuerpo 7H2 se repartieron en partes alícuotas y se almacenaron a 20°C hasta su uso posterior. La concentración de proteínas se determinó mediante DO a 280 nm.

50 Las partículas de tipo WNV se produjeron del modo siguiente. La construcción pSyn-C03-WNV-E-95 descrita anteriormente y pADNc3,1 (Invitrogen) se digirieron con las endonucleasas de restricción MunI y XbaI y la construcción pAdapt. WNV.prM-E (FL) descrita anteriormente se digirió con las endonucleasas de restricción ClaI y XbaI. Los fragmentos resultantes se combinaron en una unión de tres puntos para producir la construcción pSyn-HpreM/E FL. Esta construcción contenía la proteína E de longitud completa y expresaba las dos proteínas

55 estructurales del WNV, la proteína M y la E, requeridas para el ensamblaje de un virión con envoltura. La construcción se sometió a transfección en células HEK293T confluentes al 70% usando lipofectamina según las instrucciones de los fabricantes. Las células se sometieron a cultivo durante 3 días en medio ultra-CHO libre de suero, a continuación se recogió el medio, en capas sobre una solución de glicerol al 30% en una proporción 2:1 y

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se redujo a granos por centrifugado durante 2 horas a 120.000·g a 4°C. Las partículas de tipo WNV se volvieron a suspender en PBS, se repartieron en partes alícuotas y se almacenaron a -80°C. Las partes alícuotas se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western usando el anticuerpo 7H2 murino específico de la proteína E del WNV (Biorelience).

5 Antes de la inactivación, se purificó el WNV entero mediante reducción a grano a través de una solución de glicerol al 30% según se describe anteriormente para partículas de tipo WNV. Se volvió a suspender el WNV purificado en Tris/HCl 10 mM de pH 7,4 que contenía EDTA 10 mM y NaCl 200 mM, la preparación obtenida se guardó en hielo seco durante la inactivación, se sometió a ensayo en cuanto a su infectividad y se almacenó a -80°C en pequeñas

10 partes alícuotas. Las partes alícuotas se analizaron mediante análisis SDS-PAGE y transferencia Western usando el anticuerpo 7H2 murino específico de la proteína E del WNV (Biorelience).

Se diluyó WNV inactivado entero, partículas de tipo WNV o proteína E soluble expresada de forma recombinante en PBS. Se añadieron 2-3 ml de la preparación a Tubos MaxiSorp™ Nunc-Inmuno (Nunc) y se incubó durante toda la 15 noche a 4°C en una rueda giratoria. Se bloqueó una parte alícuota de una biblioteca de fagos (500 l, aproximadamente 1013 ufc, amplificada usando fago cooperador CT (véase documento WO-02/103.012)) en tampón de bloqueo (Protifar al 2% en PBS) durante 1-2 horas a temperatura ambiente. La biblioteca de fagos bloqueada se añadió a los inmunotubos, se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente, y se lavó con tampón de lavado (Tween-20 al 0,1% v/v en PBS) para eliminar los fagos no ligados. Los fagos ligados se eluyeron a partir del 20 antígeno por incubación con 1 ml de glicina-HCl 50 mM de pH 2,2 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, los fagos eluidos se mezclaron con 0,5 ml de Tris-HCl 1 M de pH 7,5 para neutralizar el pH. Esta mezcla se usó para infectar 5 ml de un cultivo de E. coli XL1-Blue que se ha cultivado a 37°C a una DO a 600 nm de aproximadamente 0,3. Se permitió que los fagos infectaran las bacterias XL1-Blue durante 30 minutos a 37°C. A continuación, se centrifugó la mezcla durante 10 minutos a 3200·g a temperatura ambiente y los granos bacterianos 25 se volvieron a suspender en 0,5 ml de medio de extracto de levadura 2-triptón (2TY). La suspensión bacteriana obtenida se dividió en dos placas de agar 2TY suplementadas con tetraciclina, ampicilina y glucosa. Después de incubación durante toda la noche de las placas a 37°C, se rasparon las colonias de las placas y se usaron para preparar una biblioteca de fagos enriquecida, esencialmente según se describe en De Kruif y col. (1995a) y en el documento WO-02/103.012. Brevemente, las bacterias raspadas se usaron para inocular medio 2TY que contenía

30 ampicilina, tetraciclina y glucosa y se cultivó a una temperatura de 37°C para una DO a 600 nm de ∼ 0,3. Se añadieron fagos CT cooperadores y se dejó que infectaran las bacterias después de lo cual se cambió el medio a 2TY que contenía ampicilina, tetraciclina y kanamicina. Se prosiguió con la incubación durante toda la noche a 30°C. Al día siguiente, se retiraron las bacterias del medio 2TY mediante centrifugado después de lo cual se precipitaron los fagos en el medio usando polietilenglicol (PEG) 6000/NaCl. Finalmente, los fagos se disolvieron en 2 ml de PBS

35 con albúmina de suero bovino al 1% (BSA), se esterilizaron con filtro y se usaron para la siguiente tanda de selección.

Normalmente, se realizaron dos tandas de selecciones antes de aislamiento de anticuerpos de fagos individuales. Después de la segunda tanda de selección, se usaron colonias individuales de E. coli para preparar anticuerpos de

40 fagos monoclonales. Esencialmente, se cultivaron colonias individuales en fase logarítmica en formato de placas de 96 pocillos y se infectaron con fagos cooperadores CT después de lo cual se dejó proseguir la producción de anticuerpos de fagos durante toda la noche. Los anticuerpos de fagos producidos se precipitaron con PEG/NaCl y se esterilizaron con filtro y se sometieron a ensayo en ELISA en cuanto a unión a partículas de tipo WNV purificadas según se describe anteriormente.

Ejemplo 3

Validación de los anticuerpos de fagos de cadena única específicos del WNV

50 Los anticuerpos de fagos de cadena única seleccionados que se obtuvieron en los cribados selectivos descritos anteriormente se validaron en ELISA en cuando a su especificidad, es decir, su unión a la proteína E del WNV, el WNV entero inactivado y partículas de tipo WNV, todos purificados según se describe anteriormente. Además, los anticuerpos de fagos de cadena única se sometieron también a ensayo en cuanto a unión a FBS al 5%. Para este fin, el WNV inactivado, la proteína E del WNV, las partículas de tipo WNV o la preparación de FBS al 5% se

55 recubrieron en placas ELISA Maxisorp™. Además, el virus de la rabia inactivado entero se recubrió en las placas como control. Después del recubrimiento, las placas se bloquearon en PBS que contenía Protifar al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos de fagos de cadena única seleccionados se incubaron durante 15 minutos en un volumen igual de PBS que contenía Protifar al 1% para obtener anticuerpos de fagos bloqueados. Las

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placas se vaciaron, y se añadieron los anticuerpos bloqueados de fagos de cadena única a los pocillos. Se permitió que prosiguiera la incubación durante hora, se lavaron las placas en PBS que contenía Tween-20 al 0,1% v/v y se detectaron anticuerpos de fagos unidos (usando medida de DO a 492 nm) usando un anticuerpo anti-M13 conjugado a peroxidasa. Como control, el procedimiento se realizó simultáneamente sin anticuerpo de fago de cadena única, 5 con un anticuerpo de fago de cadena única de control negativo dirigido contra la glicoproteína del virus de la rabia (anticuerpo denominado SC02-447), con un anticuerpo de fago de cadena única de control negativo dirigido contra SARS-CoV (anticuerpo denominado SC03-014) y un anticuerpo de fago de cadena única de control positivo dirigido contra el virus de la rabia. Según se muestra en la Tabla 7, los anticuerpos de fagos seleccionados denominados SC04-271, SC04-274, SC04-283, SC04-289, SC04-299, SC04-311, SC04-325, SC04-353, SC04-361 y SC04-374 10 mostraron unión significativa al WNV entero inactivado inmovilizado (véase Tabla 7) y partículas de tipo WNV (datos no mostrados). Además, para SC04-325, SC04-353, SC04-361 y SC04-374 no se observó unión al virus de la rabia. Cuando se realizó ELISA con proteína E del WNV soluble purificada expresada de forma recombinante preparada según se describe anteriormente, todos los anticuerpos de fagos de cadena única se unieron con la excepción de SC04-283, SC04-299, SC04-353 y SC04-361, lo que sugiere que se unen a una región no presente en la proteína E

15 soluble truncada, se unen a una proteína no relacionada en la superficie del virión, no se unen a la forma monomérica de la proteína E o no se unen debido al formato del anticuerpo de fago.

Ejemplo 4

20 Caracterización de los scFv específicos del WNV

A partir de los clones de anticuerpos de fagos de cadena única (scFv) específicos seleccionados se obtuvo ADN de plásmido y se determinaron secuencias de nucleótidos según técnicas estándar. Las secuencias de nucleótidos de los scFv (incluyendo sitios de restricción para clonación) denominados SC04-271, SC04-274, SC04-283, SC04-289, 25 SC04-299, SC04-311, SC04-325, SC04-353, SC04-361 y SC04-374 se muestran en las SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 79, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de los scFv denominados SC04-271, SC04-274, SC04-283, SC04-289, SC04-299, SC04-311, SC04-325, SC04-353, SC04-361 y SC04-374 se muestran en SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO:

30 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 y SEQ ID NO: 80, respectivamente.

En la Tabla 8 se representa la identidad de los genes VH y VL (véase Tomlinson IM, Williams SC, Ignatovitch O, Corbett SJ, Winter G. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom: MRC Centre for Protein Engineering (1997)) y las secuencias CDR3 de cadena pesada de los scFv de unión específica al WNV. La Tabla 9 muestra las

35 otras regiones CDR de los scFv específicos del WNV.

Ejemplo 5

Construcción de moléculas de inmunoglobulina totalmente humanas (anticuerpos anti-WNV monoclonales humanos) 40 de los FV de cadena única anti-WNV seleccionados

Las regiones variables de cadena pesada y ligera de los scFv denominados SC04-271, SC04-274, SC04-283, SC04299, SC04-311, SC04-325 y SC04-374 se amplificaron por PCR usando oligonucleótidos para añadir sitios de restricción y/o secuencias para expresión en los vectores de expresión IgG pSyn-C18-HC1 (véase SEQ ID NO: 91) 45 pSyn-C05-C (véase SEQ ID NO: 92) y pSyn-C04-C (véase SEQ ID NO: 93). Las regiones variables de cadena pesada de los scFv denominados SC04-271, SC04-274, SC04-283, SC04-299, SC04-311, SC04-325 y SC04-374 se clonaron en el vector pSyn-C18-HC1; las regiones variables de cadena ligera de los scFv denominados SC04-274, SC04-283 y SC04-325 se clonaron en el vector pSyn-C05-C; las regiones variables de cadena ligera de los scFv denominados SC04-271, SC04-299, SC04-311 y SC04-374 se clonaron en el vector pSyn-C04-C. Los genes kappa 50 VL se amplificaron primero usando los siguientes conjuntos de oligonucleótidos; SC04-274, 5K-G (SEQ ID NO: 94) y sy3K-F (SEQ ID NO: 95); SC04-283, 5K-B (SEQ ID NO: 96) y sy3K-F (SEQ ID NO: 95); SC04-325, 5K-J (SEQ ID NO: 97) y sy3K-F (SEQ ID NO: 95) y los productos de PCR clonados en el vector psyn-C05-C. Los genes lambda VL se amplificaron primero usando los siguientes conjuntos de oligonucleótidos; SC04-271, 5L-B (SEQ ID NO: 98) y sy3L-E (SEQ ID NO: 99); SC04-299, 5L-G (SEQ ID NO: 100) y sy3L-Cmod (SEQ ID NO: 101); SC04-311, 5L-C

55 (SEQ ID NO: 102) y sy3L-Cmod (SEQ ID NO: 101); SC04-374, 5L-C (SEQ ID NO: 102) y sy3L-Cmod (SEQ ID NO: 101) y los productos de PCR clonados en el vector pSyn-C04-C. Las secuencias de nucleótidos para todas las construcciones se verificaron según técnicas estándar conocidas por el experto en la materia. Los genes VH se amplificaron primero usando los siguientes conjuntos de oligonucleótidos: SC04-271, 5H-H (SEQ ID NO: 103) y sy3H-A (SEQ ID NO: 104); SC04-274, 5H-H (SEQ ID NO: 103) y sy3H-C (SEQ ID NO: 105); SC04-283, 5H-H (SEQ

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ID NO: 103) y sy3H-A (SEQ ID NO: 104); SC04-299, 5H-C (SEQ ID NO: 106) y sy3H-C (SEQ ID NO: 105); SC04311, 5H-C (SEQ ID NO: 106) y sy3H-A (SEQ ID NO: 104); SC04-325, 5H-A (SEQ ID NO: 107) y sy3H-A (SEQ ID NO: 104); SC04-374; First 5H-N (SEQ ID NO: 108) y sy3HD (SEQ ID NO: 109). Posteriormente, los productos de PCR se clonaron en el vector pSyn-C18-HC1 y las secuencias de nucleótidos se verificaron según técnicas

5 estándar conocidas por el experto en la materia.

Las regiones variables de cadena pesada y ligera de los scFv denominadas SC04-289, SC04-353 y SC04-361 se clonaron directamente por digestión de restricción para expresión en los vectores de expresión de IgG pIg-C911-HCgammal (véase SEQ ID NO: 110) y pIg-C909-Ckappa (véase SEQ ID NO: 111). Las regiones variables de

10 cadena pesada de los scFv denominados SC04-289, SC04-353 y SC04-361 se clonaron en el vector pIg-C911-HCgammal por digestión de restricción usando las enzimas SfiI y XhoI y la región variable de cadena ligera del scFv denominado SC04-289, SC04-353 y SC04-361 se clonaron en el vector pIg-C909-Ckappa por digestión de restricción usando las enzimas SalI y NotI. Posteriormente se verificaron las secuencias de nucleótidos según técnicas estándar conocidas por el experto en la materia.

15 Las construcciones de expresión resultantes pgG104-271C18, pgG104-274C18, pgG104-283C18, pgG104289C911, pgG104-299C18, pgG104-311C18, pgG104-32SC18, pgG104-353C911, pgG104-361C911 y pgG104374C18 que codifican para las cadenas pesadas de IgG1 humanas anti-WNV y pgG104-271C04, pgG104-274C05, pgG104,283C05, pgG104-289C909, pgG104-299C04, pgG104-311C04, pgG104-32SC05, pgG104-353C909,

20 pgG104-361C909 y pgG104-374C04 que codifican para las cadenas ligeras de IgG1 humanas anti-WNV se expresaron de forma transitoria en combinación en células 293T y se obtuvieron sobrenadantes que contienen anticuerpos IgG1 humanos. Las secuencias de nucleótidos de las cadenas pesadas de los anticuerpos denominados CR4271, CR4274, CR4283, CR4289, CR4299, CR4311, CR4325, CDR4353, CR4361 y CR4374 se muestran en las SEQ ID NO: 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128 y 130, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de

25 las cadenas pesadas de los anticuerpos denominados CR4271, CR4274, CR4283, CR4289, CR4299, CR4311, CR4325, CR4353, CR4361 y CR4374 se muestran en las SEQ ID NO: 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129 y 131, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos de la cadena ligera de anticuerpos CR4271, CR4274, CR4283, CR4289, CR4299,

30 CR4311, CR4325, CR4353, CR4361 y CR4374 se muestran en las SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148 y 150, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de anticuerpos CR4271, CR4274, CR4283, CR4289, CR4299, CR4311, CR4325, CR4353, CR4361 y CR4374 se muestran en las SEQ ID NO: 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149 y 151, respectivamente. Un experto en la materia puede determinar las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos anteriores de acuerdo con Kabat y col.

35 (1991) según se describe en Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico. Los anticuerpos IgG1 anti-WNV IgG1 humanos se validaron en cuanto a su capacidad para unirse al WNV irradiado en ELISA esencialmente según se describe para los scFv (véase Tabla 10). Se sometieron a ensayo tres diluciones de los anticuerpos respectivos en tampón de bloqueo. El control positivo fue el anticuerpo 7H2 anti-WNV murino y el control negativo fue el anticuerpo del virus antirrábico.

40 Alternativamente, se produjeron lotes de más de 1 mg de cada anticuerpo y se purificaron usando procedimientos estándar. A continuación se valoraron los anticuerpos en una concentración fija del virus del Nilo occidental irradiado y se sometieron a ensayo en ELISA según se describe anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 11. Como control negativo se usó un anticuerpo del virus antirrábico. Todos los anticuerpos mostraron unión al virus de

45 una manera dependiente de la dosis.

Además, CR4374 se convirtió en un formato IgM totalmente humano eliminando la región Fc gamma de la construcción pgG104-374C18 por digestión de restricción con las endonucleasas Nhel y XbaI. El vector pCR-IgM (SEQ ID NO: 216) que contiene una región Fc mu se digirió con las mismas enzimas de restricción y la región Fc mu 50 obtenida se ligó en el vector pgG104-374C18 y se fusionó en marco con el gen de cadena pesada variable obtenido de SC04-374 para preparar el vector pgM104-374C899. Esta construcción se expresó transitoriamente en combinación con la construcción de cadena ligera pgG104-374C04 (véase más arriba) en células 293T y se obtuvieron sobrenadantes que contienen anticuerpos IgM humanos. La secuencia de nucleótidos del vector pgM104374C899 se muestra en la SEQ ID NO: 217. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo 55 denominado CRM4374 se muestra en la SEQ ID NO: 218. El anticuerpo IgM se purificó a partir del sobrenadante añadiendo sulfato de amonio a una concentración final de 2,4 M e incubando la mezcla durante toda la noche en hielo, mientras se agitaba. El precipitado IgM se recuperó por centrifugado a 10.395xg durante 30 minutos. Los granos volvieron a ponerse en suspensión PBS y se purificaron adicionalmente por filtración de gel. Se cargó una columna de calidad de preparación HiLoad 26/60 Superdex 200 (GE heathcare) equilibrada con PBS con la IgM

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resuspendida y se recogieron las fracciones a partir de la columna, mientras se lavaba a una velocidad de flujo constante con PBS. Se recogió el primer gran pico de elución, que contenía la IgM purificada. La actividad de unión del anticuerpo se confirmó por valoración en partículas semejantes al virus del Nilo occidental (VLP) (véase fig. 5).

5 Ejemplo 6

Neutralización in vitro de WNV por scFv e IgG específicos del WNV (ensayo de neutralización de virus)

Con el fin de determinar si los scFv seleccionados son capaces de bloquear la infección por WNV, se realizan

10 ensayos de neutralización de virus (ENV) in vitro. Los ENV se realizan en células Vero (ATCC CCL 81). La cepa del WNV 385-99 que se usa en el ensayo se diluye a una valoración de 4 x 103 DICT50/ml (dosis infectiva del cultivo tisular al 50% por ml), con la valoración calculada según el procedimiento de Spearman y Kaerber. Las preparaciones de scFv se diluyen en serie 2 veces en PBS a partir de 1:2 (1:2 -1:1024). Se mezclan 25 l de la dilución de scFv respectiva con 25 l de suspensión de virus (100 DICT50/25 l) y se incuba durante una hora a

15 37°C. A continuación se pipetea la suspensión dos veces por triplicado en placas de 96 pocillos. A continuación, se vuelven a suspender 50 l de una suspensión recién tripsinizada y homogénea de células Vero (división 1:3 de la monocapa de células confluentes de un matraz T75) en DMEM con suero de ternera fetal al 10% v/v y se añaden antibióticos. Las células inoculadas se cultivan durante 3-4 días a 37°C y se observan diariamente para ver el desarrollo de efecto citopático (ECP). El ECP se compara con el control positivo (células inoculadas de WNV) y

20 controles negativos (células inoculadas simuladas o células incubadas sólo con scFV). La ausencia completa de ECP en un cultivo celular individual se define como protección (= 100% de reducción de la valoración). La dilución de suero que da protección en el 50% de los pocillos (es decir, tres de cada seis pocillos) se define como la valoración de anticuerpos de neutralización del 50%. El anticuerpo de neutralización 7H2 murino (Biorelience) se usa como un control positivo en el ensayo. Una valoración de neutralización del 50% de < 1:4 (lo que significa que el anticuerpo

25 se diluye 4 veces o más) se contempla como evidencia específica de actividad de neutralización del scFv frente al WNV.

Alternativamente, se realizaron ensayos de neutralización de virus (ENV) in vitro con el fin de determinar si las IgG anti-WNV eran capaces de bloquear la infección por WNV. Los ENV se realizaron esencialmente según se describe

30 para los scFv, con la salvedad de que la dilución de suero que da protección en el 66% de los pocillos (es decir, dos de cada tres pocillos) se definió como la valoración de anticuerpos de neutralización del 66% y una valoración de neutralización del 66% de < 1:2 se contempló como evidencia específica de actividad de neutralización de la IgG frente al WNV.

35 Los sobrenadantes que contienen los anticuerpos anti-WNV humanos denominados CR4271, CR4274, CR4283, CR4289, CR4299, CR4311, CR4325, CR4353, CR4361 y CR374 se expresaron según se describe en el Ejemplo 5 y se sometieron a los ENV descritos anteriormente. Todos los anticuerpos tenían una valoración de neutralización <

1:2. La potencia de los anticuerpos (en g/ml) se suministra en la Tabla 12. Los anticuerpos de neutralización

reconocieron proteína E del WNV por análisis de transferencia Western o inmunoprecipitación de una preparación 40 de WNV inactivada (datos no mostrados).

Ejemplo 7

ELISA de competición de proteína E del WNV con scFv

45 Para identificar anticuerpos que se unen a epítopos no solapados y no en competición, se realiza una ELISA de competición de proteína E del WNV. Las placas Nunc-Inmuno™ Maxisorp F96 (Nunc) se recubren durante toda la noche a 4°C con una dilución 1:100 de proteína E de WNV purificada (100 g/ml) en PBS (50 l). La proteína no recubierta se lava antes de bloquear los pocillos con 100 l de PBS que contiene Protifar al 1% durante 1 hora a

50 temperatura ambiente. Posteriormente, se desecha la solución de bloqueo y se añaden 50 l de los scFv anti-WNV no purificados en PBS que contiene Protifar al 1% (diluida 2x). Los pocillos se lavan cinco veces con 100 l de PBS que contiene Tween-20 al 0,05%. A continuación, se añaden 50 l de IgG monoclonales murinos competidores anti-WNV biotinilados, 7H2 o 6B6C-1, a cada pocillo, se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente, y los pocillos se lavan cinco veces con 100 l de PBS que contiene Tween-20 al 0,05%. Para detectar la unión de 7H2 o 6B6C-1,

55 se añaden 50 l de una dilución 1:2.000 de estreptavidina-anticuerpo HRP (Becton Dickinson) a los pocillos y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan de nuevo como antes y se desarrolla adicionalmente ELISA por adición de 100 l de reactivo OPD (Sigma). La reacción se interrumpe añadiendo 50 l de H2SO4 1M antes de medir la DO a 492 nm.

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Alternativamente, para investigar si los anticuerpos son capaces de unirse a epítopos no en superposición y no competidores, se realizó la siguiente ELISA de competición. Se recubrieron placas Nunc-Inmuno™ Maxisorp F96 (Nunc) durante toda la noche a 4°C con una dilución 1:1.000 con las IgG monoclonales anti-WNV murinas 7H2 5 (véase Beasley y Barrett 2002) o 6B6C-1 (véase Roehrig y col. 1983, Blitvich y col. 2003 y Roehrig y col. 2001). El anticuerpo no recubierto se lavó antes de que se bloquearan los pocillos con 100 l de PBS que contenía Protifar al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se desechó la solución de bloqueo y se añadieron 100 l de proteína E del WNV recombinante purificada en PBS que contenía Protifar al 1% (diluido 2x) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos tres veces con 100 l de PBS que contenía Tween10 20 al 0,05%. A continuación, se añadieron 100 l de scFv anti-WNV a los pocillos y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron a continuación cinco veces con 100 l de PBS que contenía Tween20 al 0,05%. Para detectar la unión de scFV, se añadieron 100 l de una dilución 1:4.000 de anticuerpo anti-VSV-HRP (Boehringer Mannheim) a los pocillos y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron de nuevo como antes y se desarrolló adicionalmente ELISA añadiendo 100 l de reactivo OPD (Sigma). La

15 reacción se detuvo añadiendo 50 l de H2SO4 1 M antes de medir la DO a 492 nm. Los resultados del ensayo se muestran en la fig. 1 para los scFv SC04-283, SC04-289, SC04-299, SC04-311, SC04-325 y SC04-374. Cuando se capturó proteína E del WNV con el anticuerpo 7H2, cuyo epítopo de unión se ha cartografiado en el dominio III, los scFv SC04-299 y SC04-374 se bloquearon para la unión, mientras SC04-289, SC04-311 y SC04-325 pudieron unirse. En cambio, cuando se usó para captura el anticuerpo 6B6C-1, cuyo epítopo de unión se ha cartografiado en

20 el dominio II, SC04-299 y SC04-374 pudieron unirse a la proteína E del WNV recombinante, pero SC04-289, SC04311 y SC04-325 se bloquearon en cuanto a unión. Estos datos indican que SC04-299 y SC04-374 se unen a un epítopo en el dominio III de la proteína E del WNV y SC04-289, SC04-311 y SC04-325 se unen a un epítopo en el dominio II de la proteína E del WNV. SC04-283 no fue bloqueado por ningún anticuerpo, lo que sugiere que podría reconocer un epítopo fuera de las regiones de unión de 7H2 y 6B6C-1. Se observaron resultados similares a los

25 anteriores para los anticuerpos monoclonales denominados 4G2 y 3A3 que reconocen un epítopo en el dominio II y III, respectivamente. Se ha sugerido que el dominio III es el posible sitio de unión receptor responsable de fijación celular, mientras que se ha sugerido que el dominio II de la proteína E del WNV contiene el péptido de fusión necesario para entrada vírica en el citoplasma de la célula infectada. Los scFv SC04-271 y SC04-274 no se unen a proteína E del WNV recombinante ya sea cubierta directamente o cubierta por medio de cualquiera de los dos

30 anticuerpos murinos (datos no mostrados). El control negativo SC04-098 tampoco se unió a la proteína E del WNV recombinante recubierta por medio de cualquiera de los dos anticuerpos murinos.

Ejemplo 8

35 Protección in vivo por anticuerpos monoclonales anti-WNV de infección por WNV letal en un modelo de provocación murino

Se adaptó un modelo de provocación murino a partir de la literatura especializada (véase Ben-Nathan y col. 2003; Beasley y col. 2002; Wang y col. 2001). En Ben-Nathan y col. (2003) se usaron ratones BALB/c de 4 semanas de 40 vida y se inoculó a los animales intraperitonealmente (i.p.) 20 veces la dosis vírica con el resultado de una supervivencia del 50% (DL50) de la cepa de WNV ISR52 (DL50 era equivalente a 5 ufp). Con esta dosificación los ratones sucumbieron a la infección 6-7 días después de la inoculación y alcanzaron una mortalidad del 100% después de 11 días. En otro estudio, la cepa de WNV USA99 (usada en los experimentos descritos en la presente memoria descriptiva) mostró tener una DL50 de 0,5 ufp. Este valor es 10 veces menor que la DL50 de ISR52, lo que

45 puede indicar un mayor grado de neuroinvasividad para esta cepa vírica o diferencias asociadas con la cepa del ratón usada (véase Beasley y col. 2002).

Para determinar la DL50 i.p. de USA99 en ratones BALB/c de 4 semanas, a los animales (5 por grupo) se les inyectó USA99 a DICT50 (dosis infecciosa de cultivo tisular) de 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, el 50% en dos experimentos

50 separados. La DL50 calculada a partir del primer experimento fue de 5,75 DICT50 y del segundo experimento 13,25 DICT50. Para el cálculo de la dosis vírica en experimentos adicionales se calculó la media de los dos experimentos, es decir, 9,5 DICT50, mediante análisis de regresión probit.

Se sometió a ensayo la capacidad protectora de los anticuerpos de neutralización in vitro CR4271, CR4274,

55 CR4283, CR4289, CR4299, CR4311, CR4325, CR4353, CR4361 y CR4374 en el modelo in vivo. Se inyectaron anticuerpos purificados i.p. en ratones BALB/c de 4 semanas (5 animales por grupo) a una concentración de 15 mg/kg. Después de 24 horas se inyectó la cepa de WNV USA99 i.p. a una dosis de 20 veces la DL50 calculada. Se observó a los animales en busca de signos de enfermedad durante 21 días y fueron sacrificados cuando fueron

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evidentes los síntomas de encefalitis. En el modelo, los animales no protegidos sucumbieron generalmente a la infección entre el día 8 y el día 10.

La Tabla 13 muestra que un anticuerpo, CR4374, es protector al 100% in vivo y un anticuerpo adicional CR4353 es

5 protector al 75% a la dosis de 15 mg/kg. El anticuerpo de control positivo 7H2 (un anticuerpo monoclonal murino anti-WNV) fue totalmente protector y el anticuerpo de control negativo (que se une a un antígeno irrelevante) no mostró protección en el experimento.

Para establecer una relación de protección de dosis, los anticuerpos protectores CR4353 y CR4374 se valoraron en

10 el modelo de ratón usando dosis de 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01, 0,003 y 0,001 mg/kg. Se incluyó un anticuerpo de control negativo que se une a un antígeno irrelevante como control a una dosis de 10 mg/kg.

Según se muestra en la fig. 2, el anticuerpo CR4374 es protector al 100% a una dosis de 0,3 mg/kg. Las dosis de 10, 3 y 1 mg/kg también fueron protectoras al 100% (datos no mostrados). La fig. 2 muestra también que existe una

15 correlación directa entre dosis y capacidad protectora. La dosis protectora al 50% calculada mediante análisis de regresión probit es 0,013 mg/kg.

La fig. 3 muestra que el anticuerpo CR4353 es protector al 100% a una dosis de 10 mg/kg. Por otra parte, la fig. 3 muestra que existe una correlación directa entre dosis y capacidad protectora. La dosis protectora al 50% calculada

20 mediante análisis de regresión probit es 0,357 mg/kg.

Los datos de valoración de los anticuerpos se compararon mediante análisis de regresión probit. Los valores para la Prueba de Calidad del Ajuste de Pearson (chi cuadrado = 10,38, GL = 30, p = 1,00) mostró el modelo era válido y los resultados de la Prueba de Paralelismo (chi cuadrado = 3,47, GL = 3, p = 0,324) significaban que las curvas podían

25 compararse con fiabilidad. Los valores para la dosis protectora al 50% y la dosis protectora al 95% se resumen en la Tabla 14.

Ejemplo 9

30 Análisis de afinidad usando Biacore

Se realizaron estudios de afinidad usando análisis de resonancia de plasmones superficiales con un sistema analítico BIAcore3000TM a 25°C, usando HBS-EP (Biacore AB, Suecia) como tampón de migración a una velocidad de flujo de 30 l/min. Se inmovilizó IgG CR4283 en un chip sensor de canal de 4 flujos (Fc) CM5 de calidad de

35 investigación (Biacore AB, Suecia) usando acoplamiento de aminas. A continuación se capturó una cantidad constante de virus del Nilo occidental inactivado y purificado en el chip a través de la CR4283 inmovilizada, seguido de inyección de una cantidad variable del anticuerpo de interés para analizar la interacción de unión entre este anticuerpo y el virus capturado. Se realizó la regeneración usando NaOH 15, 20, 30 ó 40 mM al final de cada medida para eliminar el anticuerpo unido, así como el virus capturado, mientras se deja el CR4283 inmovilizado en el chip.

40 Para estudios de clasificación de afinidades, se inyectaron 60 l de virus del Nilo occidental purificado, seguido por inyección de 40 l de anticuerpo 1.000 nM. A continuación se aplicó tampón de migración durante 770 segundos, seguido por regeneración del chip CM5 con 5 l de NaOH 30 ó 40 mM. Se registraron las señales de resonancia expresadas como unidades de resonancia (UR) en función del tiempo para cada anticuerpo. Se determinó la

45 respuesta después de la fase de asociación, así como la respuesta después de 370 segundos de disociación. A continuación se representó la respuesta de disociación expresada como porcentaje de la respuesta de asociación con respecto a la respuesta de asociación (véase fig. 4). Los anticuerpos CR4368 y CR4375 tienen la misma CDR3 de cadena pesada que CR4374, pero difieren en otras partes de las secuencias. Se incluyeron anticuerpos de ratón monoclonales 7H2, 3A3, 5H10 (todos de BioReliance) y 6B6C-1 (Chemicon) para comparación. Los anticuerpos con

50 una afinidad relativamente alta están situados en el ángulo superior derecho de la representación, lo que indica buena asociación combinada con disociación lenta.

Se determinaron las constantes de afinidad para CR4283, CR4353, CR4374 y anticuerpo de ratón 7H2. Después de la captura de 22, 23 ó 60 l de virus del Nilo occidental, se inyectaron 40 l de anticuerpo, seguido por una fase de

55 disociación de 770 segundos, y regeneración usando 5 l de NaOH 15, 20 ó 30 mM. Se midieron doce concentraciones en diluciones dobles de 1.000 nM a 0,39 nM para cada anticuerpo. Se ajustaron los datos resultantes usando un modelo de analito bivalente y se calculó la constante de disociación KD. Los valores promedio de KD a partir de experimentos duplicados fueron 0,8 ± 0,6 nm para CR4283, 6,5 ± 0,4 nm para CR4353, 56 ± 4 nm para CR4374 y 0,32 ± 0,06 nm para 7H2.

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Ejemplo 10

Potencia de neutralización in vitro por prueba de neutralización de reducción de placas (PNRP)

5 Para investigar adicionalmente la actividad de neutralización de los anticuerpos anti-WNV de la invención se desarrolló una PNRP. Brevemente, se tripsinizaron células Vero-E6 y se contaron. Se añadieron 2,5 x 105 células a cada pocillo de una placa de 12 pocillos y se incubó durante toda la noche a 37°C en una incubadora de CO2 humidificada. Se realizaron diluciones en serie (10 veces) de un stock valorado de virus del Nilo occidental USA99b

10 en medio completo. Se incubaron volúmenes iguales (250 l) de mezclas de virus (100 ufp) y diluciones en serie de anticuerpos IgG1 purificados en duplicado a 37°C durante 1 hora. Las diluciones de virus y anticuerpos se realizaron en medio DMEM. A continuación se añadió la mezcla (400 l) a las placas de 12 pocillos que contenían monocapas de células Vero después de una minuciosa aspiración del medio durante toda la noche. Después de haber incubado las placas a 37°C durante 1 hora, se añadieron 1,5 ml de cubierta de medio de carboximetilcelulosa CMC con FBS al

15 10% (v/v) (CMC:medio completo) por pocillo y se colocaron las placas en una incubadora de CO2 humidificada durante 3 días a 37°C. Un día antes de la tinción se retiró el CMC:medio completo de los pocillos y se sustituyó por una mezcla de CMC:PBS (1:1; v/v) que contenía 8,25 mg/ml de rojo neutro (2 ml de rojo neutro a 3,3 g/l en 80 ml de CMC:PBS). Se incubaron las placas 1 día después a 37°C en una incubadora de CO2 humidificada, después de lo cual se cuantificó el número de placas visibles.

20 Para analizar los datos de potencia de los anticuerpos de la PNRP se usó un modelo de regresión binaria conocido como análisis probit. El análisis probit es válido, si puede suponerse que la probabilidad de neutralizar WNV in vitro sigue una distribución normal en cuanto a la cantidad de anticuerpos usada. La suposición de normalidad se sostiene con la máxima probabilidad en una escala logarítmica, de ahí que la neutralización de virus se modelizara

25 en función del logaritmo de la cantidad de anticuerpos administrada. Los anticuerpos se compararon directamente en el modelo de regresión, con nivel de significación alfa establecido en 0,05. Se estimaron las concentraciones de anticuerpos que produjeron neutralización al 50% y el 90% a partir del modelo, junto con intervalos de confianza del 95%. En la Tabla 15 se ofrece un resumen del análisis final del panel. Teniendo en cuenta los valores PNRP50 y PNRP90, CR4374 es el anticuerpo de neutralización más potente. CR4353 tiene un valor de PNRP50 menor, pero

30 su valor PNRP90 es alto debido al hecho de que conserva la actividad de neutralización a concentraciones muy bajas, pero no es capaz de neutralizar completamente el virus incluso a concentraciones muy altas. Lo anterior puede relacionarse con diferencias en los mecanismos de acción de los dos anticuerpos. Sin embargo, según se muestra anteriormente, CR4374 es más protector que CR4353 en el modelo de provocación murino. Para CR4271, CR4274 y CR4283 no pudieron darse valores para PNRP50, debido a la baja potencia y para CR4368 y CR4361 no

35 pudieron darse valores para PNRP90, debido al alto grado de incertidumbre debido de nuevo a baja potencia. Al convertir CR4374 en formato IgM (CRM4374) la potencia in vitro aumentó espectacularmente (véanse Tablas 15 y 18).

Ejemplo 11

40 Medida de la amplitud de la actividad de neutralización con respecto a diferentes cepas del virus del Nilo occidental y flavivirus por prueba de neutralización de reducción de placas (PNRP)

Usando el ensayo descrito anteriormente, el anticuerpo IgG1 anti-WNV CR4374, que fue protector en el modelo de

45 provocación murino, se sometió a ensayo en cuanto a su potencia de neutralización con respecto a diferentes cepas de virus del Nilo occidental (véase Tabla 16 para la descripción de las cepas de WNV sometidas a ensayo) y otros flavivirus que incluyen virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de St. Louis y virus del dengue 2 y 4. CR4374 no tuvo actividad de neutralización significativa con respecto a cualquiera de los otros flavivirus (datos no mostrados). Sin embargo, CR4374 neutralizó todas las cepas del WNV del linaje I y el linaje

50 II sometidas a ensayo con igual potencia con la excepción de TUN97 que fue neutralizado significativamente mejor todavía que USA99b, la cepa original usada para selección (véase Tabla 17).

Ejemplo 12

55 Análisis de maduración de la afinidad de CR4374 y de la afinidad y la potencia de neutralización usando Biacore y prueba de neutralización de reducción de placas, respectivamente

La maduración de la afinidad de CR4374 se realizó del modo siguiente. Se clonó la región variable de cadena pesada de SC04-374 en la (sub)biblioteca de regiones variables de cadena ligera según el mismo procedimiento tal

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como se describe en el Ejemplo 1 para clonación del repertorio de cadena pesada en la (sub)biblioteca. Se realizaron selecciones de expresión de fagos usando la biblioteca construida, esencialmente según se describe en el Ejemplo 2, seguido por detección selectiva y análisis de clones seleccionados, esencialmente según se describe en los Ejemplos 3 y 4. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los scFv seleccionados SC05-074, SC055 080, SC05-085 y SC05-088, así como las secuencias de aminoácidos de sus regiones CDR, se muestran en las Tablas 18 y 19, respectivamente. Se generaron moléculas de inmunoglobulinas totalmente humanas de clones aislados esencialmente según se describe en el Ejemplo 5, usando vector pIg-C910-Clambda (SEQ ID NO: 219) en lugar de plg-C909-Ckappa para clonación de las cadenas ligeras. Las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas con maduración de la afinidad denominadas CR5074, CR5080, CR5085 y CR5088 10 se muestran en las SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224 y SEQ ID NO: 226. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas con maduración de la afinidad denominadas CR5074, CR5080, CR5085 y CR5088 se muestran en las SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225 y SEQ ID NO:

227. Un experto en la materia puede determinar la región variable de las cadenas ligeras de los anticuerpos anteriores según Kabat y col. (1991) tal como se describe en Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico. Los 15 estudios de clasificación de afinidades con estas inmunoglobulinas con maduración de la afinidad se realizaron usando análisis de resonancia de plasmones superficiales esencialmente según se describe en el Ejemplo 9. Se representó la respuesta de disociación expresada como porcentaje de la respuesta de asociación con respecto a la respuesta de asociación (véase fig. 6). Según se muestra en la fig. 6, la afinidad de todos los anticuerpos mutados (CR5081) menos uno había mejorado claramente. También se determinaron las constantes de afinidad para las

20 inmunoglobulinas mutadas CR5074, CR5080, CR5085 y CR5088 esencialmente según se describe en el Ejemplo 9. Los valores promedio de KD a partir de experimentos duplicados fueron 3,9 ± 0,5 nm para CR5074, 2,7 ± 0,1 nm para CR5080, 3,7 ± 0,7 nm para CR5085 y 1,7 ± 0,1 nm para CR5088. Estos valores de KD están todos en un orden de magnitud mayor en comparación con CR4374.

25 Además de la afinidad, se midió por PNRP la potencia de neutralización de las inmunoglobulinas mutadas con respecto a la cepa USA99b del virus del Nilo occidental. A partir de la Tabla 20 puede deducirse que los valores PNRP50 y PNRP90 de todas las inmunoglobulinas con maduración de la afinidad están en un orden de magnitud mayor en comparación con CR4374. Este resultado concuerda con los datos de afinidad.

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Tabla 1: Cebadores de región variable de cadena lambda humana (sentido).

Nombre de cebador

Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO:

HuV1A

5′-CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACC-3′ SEQ ID NO: 152

HuV1B

5′-CAGTCTGTGYTGACGCAGCCGCC-3′ SEQ ID NO: 153

HuV1C

5′-CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCC-3′ SEQ ID NO: 154

HuV2

5′-CARTCTGCCCTGACTCAGCCT-3′ SEQ ID NO: 155

HuV3A

5′-TCCTATGWGCTGACTCAGCCACC-3′ SEQ ID NO: 156

HuV3B

5′-TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC-3′ SEQ ID NO: 157

HuV4

5′-CACGTTATACTGACTCAACCGCC-3′ SEQ ID NO: 158

HuV5

5′-CAGGCTGTGCTGACTCAGCCGTC-3′ SEQ ID NO: 159

HuV6

5′-AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA-3′ SEQ ID NO: 160

HuV7/8

5′-CAGRCTGTGGTGACYCAGGAGCC-3′ SEQ ID NO: 161

HuV9

5′-CWGCCTGTGCTGACTCAGCCMCC-3′ SEQ ID NO: 162

Tabla 2: Cebadores de región variable de región de cadena kappa humana (sentido).

Nombre de cebador

Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO:

HuV1B

5′-GACATCCAGWTGACCCAGTCTCC-3′ SEQ ID NO: 163

HuV2

5′-GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC-3′ SEQ ID NO: 164

HuV3

5′-GAAATTGTGWTGACRCAGTCTCC-3′ SEQ ID NO: 165

HUV4

5′-GATATTGTGATGACCCACACTCC-3′ SEQ ID NO: 166

HuV5

5′-GAAACGACACTCACGCAGTCTCC-3′ SEQ ID NO: 167

HuV6

5′-GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC-3′ SEQ ID NO: 168

5 Tabla 3: Cebadores de región variable de cadena kappa humana extendidos con sitios de restricción SalI (sentido), cebadores de región J de cadena kappa humana extendidos con sitios de restricción NotI (antisentido), cebadores de región variable de cadena lambda humana extendidos con sitios de restricción SalI (sentido) y cebadores de región J de cadena lambda humana extendidos con sitios de restricción NotI (antisentido).

Nombre de cebador

Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO:

HuV1B-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGGACATCCAGWTGACCCAGTCTCC-3′ SEQ ID NO: 169

HuV2-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCC-3′ SEQ ID NO: 170

HuV3B-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGGAAATTGTGWTGACRCAGTCTCC-3′ SEQ ID NO: 171

HuV4B-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGGATATTGTGATGACCCACACTCC-3′ SEQ ID NO: 172

HuV5-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGGAAACGACACTCACGCAGTCTCC-3′ SEQ ID NO: 173

HuV6-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC-3′ SEQ ID NO: 174

HuJ1-NotI

5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3′ SEQ ID NO: 175

HuJ2-NotI

5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3′ SEQ ID NO: 176

HuJ3-NotI

5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3′ SEQ ID NO: 177

HuJ4-NotI

5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3′ SEQ ID NO: 178

HuJ5-NotI

5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3′ SEQ ID NO: 179

HuV1A-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACC-3′ SEQ ID NO: 180

HuV1B-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGCAGTCTGTGYTGACGCAGCCGCC-3′ SEQ ID NO: 181

HuV1C-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGCAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCC-3′ SEQ ID NO: 182

HuV2-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGCARTCTGCCCTGACTCAGCCT-3′ SEQ ID NO: 183

HuV3A-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGTCCTATGWGCTGACTCAGCCACC-3′ SEQ ID NO: 184

HuV3B-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC-3′ SEQ ID NO: 185

HuV4-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGCACGTTATACTGACTCAACCGCC-3′ SEQ ID NO: 186

HuV5-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGCAGGCTGTGCTGACTCAGCCGTC-3′ SEQ ID NO: 187

HuV6-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGAATTTTATGCTGACTCAGCCCCA-3′ SEQ ID NO: 188

HuV7/8-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGCAGRCTGTGGTGACYCAGGAGCC-3′ SEQ ID NO: 189

HuV9-SalI

5′-TGAGCACACAGGTCGACGCWGCCTGTGCTGACTCAGCCMCC-3′ SEQ ID NO: 190

HuJ1-NotI

5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3′ SEQ ID NO: 191

HuJ2/3-NotI

5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3′ SEQ ID NO: 192

HuJ4/5-NotI

5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACYTAAAACGGTGAGCTGGGTCCC-3′ SEQ ID NO: 193

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Tabla 4: Distribución de los diferentes productos de cadena ligera en las 10 fracciones.

Productos de cadena ligera

Número de alelos Número de fracción alelos/fracción

Vk1B/Jk1-5

19 1 y 2 9,5

Vk2/Jk1-5

9 3 9

Vk3B/Jk1-5

7 4 7

Vk4B/Jk1-5

1 5 5

Vk5/Jk1-5

1

Vk6/Jk1-5

3

V1A/Jl1-3

5 6 5

V1B/Jl1-3

V1C/Jl1-3

V2/Jl1-3

5 7 5

V3A/Jl1-3

9 8 9

V3B/Jl1-3

V4/Jl1-3

3 9 5

V5/Jl1-3

1

V6/Jl1-3

1

V7/8/Jl1-3

3 10 6

V9/Jl1-3

3

Tabla 5: Cebadores de región variable de cadena pesada IgG humana (sentido).

Nombre de cebador

Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO:

HuVH1B/7A

5′-CAGRTGCAGCTGGTGCARTCTGG-3′ SEQ ID NO: 194

HuVH1C

5′-SAGGTCCAGCTGGTRCAGTCTGG-3′ SEQ ID NO: 195

HuVH2B

5′-SAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3′ SEQ ID NO: 196

HuVH3B

5′-SAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3′ SEQ ID NO: 197

HuVH3C

5′-GAGGTGCAGCTGGTGGAGWCYGG-3′ SEQ ID NO: 198

HuVH4B

5′-CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG-3′ SEQ ID NO: 199

HuVH4C

5′-CAGSTGCAGCTGCAGGAGTCSGG-3′ SEQ ID NO: 200

HuVH5B

5′-GARGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3′ SEQ ID NO: 201

HuVH6A

5′-CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3′ SEQ ID NO: 202

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Tabla 6: Cebadores de región variable de cadena pesada IgG humana extendidos con sitios de restricción SfiI/NcoI (sentido) y cebadores de región J de cadena pesada IgG humana cebadores extendidos con sitios de restricción XhoI/BstEII (antisentido).

Nombre de cebador

Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO:

HuVH1B/7A-SfiI

5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTGCAGCT GGTGCARTCTGG-3′ SEQ ID NO: 203

HuVH1C-SfiI

5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTCCAGCT GGTRCAGTCTGG-3′ SEQ ID NO: 204

HuVH2B-SfiI

5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTT GAAGGAGTCTGG-3′ SEQ ID NO: 205

HuVH3B-SfiI

5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTGCAGCT GGTGGAGTCTGG-3′ SEQ ID NO: 206

HuVH3C-SfiI

5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCT GGTGGAGWCYGG-3′ SEQ ID NO: 207

HuVH4B-SfiI

5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCT ACAGCAGTGGGG-3′ SEQ ID NO: 208

HuVH4C-SfiI

5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGSTGCAGCT GCAGGAGTCSGG-3′ SEQ ID NO: 209

HuVH5B-SfiI

5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGCAGCT GGTGCAGTCTGG-3′ SEQ ID NO: 210

HuVH6A-SfiI

5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCT GCAGCAGTCAGG-3′ SEQ ID NO: 211

HuJH1/2-XhoI

5′-GAGTCATTCTCGACTCGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3′ SEQ ID NO: 212

HuJH3-XhoI

5′-GAGTCATTCTCGACTCGAGACGGTGACCATTGTCCC-3′ SEQ ID NO: 213

HuJH4/5-XhoI

5′-GAGTCATTCTCGACTCGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3′ SEQ ID NO: 214

HuJH6-XhoI

5′-GAGTCATTCTCGACTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3′ SEQ ID NO: 215

5 Tabla 7: Unión de anticuerpos de fagos de cadena única (scFv) a virus del Nilo occidental (WNV), proteína E del WNV recombinante, FBS y virus de la rabia medido por ELISA a 492 nm).

Nombre de anticuerpo de fago

Virus del Nilo occidental Proteína E del WNV FBS (5%) Virus de la rabia

SC04-271

0,984 0,608 ND ND

SC04-274

0,961 0,496 ND ND

SC04-283

1,205 0,074 ND ND

SC04-289

0,759 1,389 ND ND

SC04-299

1,075 0,072 ND ND

SC04-311

1,036 1,538 ND ND

SC04-325

1,183 1,397 ND 0,053

SC04-353

1,002 0,099 ND 0,057

SC04-361

0,660 0,076 ND 0,059

SC04-374

0,975 1,360 ND 0,056

SC02-447

0,094 0,057 0,041 ND

SC03-014

0,061 0,060 ND 0,062

Control pos.

0,067 0,056 ND 0,991

ND significa no determinado

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Tabla 8: Datos de los Fv de cadena única específicos del WNV.

Nombre de scFv

SEQ ID NO de secuencia de nucleótidos SEQ ID NO de secuencia de aminoácidos* HCDR3 (SEQ ID NO: ) Locus VH Locus VL

SC04-271

61 62 (Vh 1-122; Vl 139-248) RPGYDYGFYYFDY (SEQ ID NO: 1) 5-51 (DP-73) Vl 2 (2a2 -V1-04)

SC04-274

63 64 (Vh 1-130; Vl 147-259) LRGPYYDFWNGY RETHDAFNV (SEQ ID NO: 2) 5-51 (DP-73) Vk IV (B3 -DPK24)

SC04-283

65 66 (Vh 1-130; Vl 147-253) LTFRRGYSGSDSF LPPGDFDY (SEQ ID NO: 3) 5-51 (DP-73) Vk I (L12)

SC04-289

67 68 (Vh 1-125; Vl 142-250) DVVGVGASDYYYYMDV (SEQ ID NO: 4) 5-51 (DP-73) Vk III (L2 -DPK21)

SC04-299

69 70 (Vh 1-124; Vl 141-250) ESGGPIWYKYYGVDV (SEQ ID NO: 5) 3-30 (DP-49) Vl 1 (la -Vl-11)

SC04-311

71 72 (Vh 1-119; Vl 136-245) GYNSGHYFDY (SEQ ID NO: 6) 3-30 (DP-49) Vl 1 (lb-V1-19)

SC04-325

73 74 (Vh 1-117; Vl 134-246) GGMATTPGLDY (SEQ ID NO: 7) 1-69 (DP-10) Vk IV (B3-DPK24)

SC04-353

75 76 (Vh 1-127; Vl 144-250) DFWSGYSMVDSYYYYMDV (SEQ ID NO: 8) 3-30 (DP-49) Vk III (A27 -DPK22)

SC04-361

77 78 (Vh 1-130; Vl 147-259) LRGPYYDFWNGY RETHDAFNV (SEQ ID NO: 9) 5-51 (DP-73) Vk IV (B3 -DPK24)

SC04-374

79 80 (Vh 1-130; Vl 147-257) HRYYDISGYYRLFSDAFDI (SEQ ID NO: 10) 2-05 Vl 1 (le-V1-13)

* entre paréntesis se muestran los aminoácidos que configuran la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL)

5 Tabla 9: Datos de las regiones CDR de los Fv de cadena única específicos del WNV.

Nombre de scFv

HCDR1 (SEQ ID NO: ) HCDR2 (SEQ ID NO: ) LCDR1 (SEQ ID NO: ) LCDR2 (SEQ ID NO: ) LCDR3 (SEQ ID NO: )

SC04-271

21 31 41 51 11

SC04-274

22 32 42 52 12

SC04-283

23 33 43 53 13

SC04-289

24 34 44 54 14

SC04-299

25 35 45 55 15

SC04-311

26 36 46 56 16

SC04-325

27 37 47 57 17

SC04-353

28 38 48 58 18

SC04-361

29 39 49 59 19

SC04-374

30 40 50 60 20

Tabla 10: Unión de anticuerpos IgG1 a WNV según se mide mediante ELISA (DO a 492 nm).

Anticuerpo

Virus del Nilo occidental (dilución)

1:5*

1:25 1:125

CR4271

1,785 1,853 1,818

CR4274

2,308 2,351 2,164

CR4299

1,477 1,337 0,929

CR4311

1,047 0,817 0,754

CR4374

2,321 2,272 2,121

ctrl pos

2,092 2,122 2,135

ctrl neg

0,062 0,056 0,046

* dilución del anticuerpo

11-10-2011

Tabla 11: Unión de anticuerpos IgG1 a WNV según se mide por ELISA (DO a 492 nm).

Ac

Concentración de anticuerpos (g/ml)

20,000

10,000 5,000 2,500 1,250 0,630 0,310 0,160 0,078 0,039 0,000

CR4271

1,554 1,632 1,585 1,488 1,560 1,580 1,449 1,414 1,199 0,761 0,003

CR4274

1,698 1,645 1,538 1,492 1,538 1,519 1,378 1,146 0,841 0,448 0,003

CR4283

1,678 1,645 1,761 1,621 1,633 1,618 1,542 1,564 1,351 1,019 0,003

CR4289

ND 0,752 0,586 0,492 0,415 0,351 0,313 0,250 0,209 0,147 0,003

CR4299

1,193 1,125 1,073 1,031 0,977 0,891 0,756 0,610 0,446 0,227 0,003

CR4311

0,852 0,773 0,627 0,527 0,444 0,352 0,236 0,174 0,105 0,044 0,003

CR4325

1,545 1,656 1,444 1,245 1,048 0,845 0,597 0,421 0,269 0,132 0,003

CR4353

ND 1,567 1,554 1,432 1,418 1,330 1,169 1,069 0,734 0,595 0,003

CR4374

1,687 1,723 1,645 1,577 1,499 1,451 1,242 0,997 0,729 0,458 0,003

Control neg.

0,051 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

Tabla 12: Potencia de los anticuerpos anti-WNV en el ensayo de valoración del anticuerpo de neutralización al 66%.

Nombre del anticuerpo

g/ml

CR4271

13,50

CR4274

11,00

CR4283

23,44

CR4289

10,13

CR4299

3,00

CR4311

20,00

CR4325

5,25

CR4353

2,11

CR4361

2,50

CR4374

0,34

5 Tabla 13: Protección de prueba de provocación con WNV letal en ratones por anticuerpos monoclonales anti-WNV.

Anticuerpo (15 mg/kg)

Animales supervivientes

CR4271

3/5

CR4274

0/5

CR4283

1/5

CR4289

1/5

CR4299

0/5

CR4311

1/5

CR4325

1/5

CR4353

3/4*

CR4361

1/5

CR4374

5/5

7H2

5/5

Control negativo IgG1

0/5

* Se sometieron a ensayo 4 ratones en vez de 5 debido al error de inyección según se mide por niveles de IgG1 en suero de ratón tomado 24 horas después de la inyección de anticuerpos.

Tabla 14: Análisis Probit de la actividad protectora de IgG1 anti-WNV humana en un modelo de provocación letal 10 murino

Anticuerpo

50% de protección (g/kg) 95% de protección (g/kg)

CR4374

12,9 270

CR4353

357 7475

11-10-2011

Tabla 15: Potencia de neutralización frente al virus del Nilo occidental cepa USA99b según se mide por PNRP.

Anticuerpo

PNRP50 (95% CI) (g/ml) PNRP90 (95% CI) (g/ml)

CR4271

>100 NA

CR4274

>100 NA

CR4283

>100 NA

CR4289

2,62 (1,16-6,10) 37,4 (13,7-241)

CR4299

0,78 (0,28-1,82) 10,3 (3,92-67,7)

CR4311

2,91 (2,26-3,74) 39,6 (27,3-62,3)

CR4325

1,45 (0,66-3,05) 15,8 (6,58-75,6)

CR4353

0,026 (0,012-0,045) 36,4 (19,1-82,6)

CR4361

2,03 (0,90-4,34) >100

CR4368

2,05 (1,07-3,76) >100

CR4374

0,18 (0,17-0,20) 0,95 (0,82-1,12)

CRM4374

<0,1 <0,1

CR4375

0,17 (0,12-0,23) 2,29 (1,59-3,67)

7H2

0,0030 (0,0020-0,0040) 0,026 (0,020-0,037)

6B6C-1

0,70 (0,37-1,55) 6,32 (2,42-106)

5H10

0,016 (0,009-0,024) 0,096 (0,074-0,140)

3A3

0,0062 (0,0044-0,0079) 0,042 (0,031-0,067)

Tabla 16: Descripción de cepas del WNV usadas.

Nombre

Cepa Origen Año Fuente Linaje CHOb*

USA99b

385-99 Estados Unidos 1999 Ave I +

FRA00

PaAn001 Francia 2000 Caballo I +

TUN97

paH001 Túnez 1997 Humano I +

SEN90

ArD-76104 Senegal 1990 Mosquito II −

CAR82

ArB3573/82 República Centroafricana 1982 Garrapata II +

MAD78

DakAnMg798 Madagascar 1978 Ave II −

*CHOb significa glucosilación Tabla 17: Potencia de neutralización de CR4374 frente a las cepas de WNV de linaje I y II.

Virus

PNRP50 (IC 95%) PNRP90 (IC 95%)

USA99b

0,17 (0,11-0,25) 0,82 (0,50-1,77)

TUN97

0,03 (0,02-0,04) 0,22 (0,15-0,39)

FRA00

0,11 (0,08-0,15) 1,36 (0,09-2,33)

SEN90

0,29 (0,11-0,67) 3,92 (1,49-25,37)

MAD78

0,12 (0,09-0,16) 4,12 (2,78-6,68)

CAR82

0,14 (0,08-0,22) 2,90 (1,52-7,49)

Tabla 18: Datos de inmunoglobulinas con maturación de la afinidad.

Nombre de scFv

SEQ ID NO de secuencia de nucl. SEQ ID NO de secuencia de aminoácidos* Locus VH Locus VL

SC05-074

228 229 (Vh 1-130; Vl 147-257) 2-05 Vl 1 (1e -V1-13)

SC05-080

230 231 (Vh 1-130; Vl 147-257) 2-05 Vl 1 (1e -V1-13)

SC05-085

232 233 (Vh 1-130; Vl 147-257) 2-05 Vl 1 (1e -V1-13)

SC05-088

234 235 (Vh 1-130; Vl 147-257) 2-05 Vl 1 (1e -V1-13)

* entre paréntesis se muestran los aminoácidos que configuran la región variable de cadena pesada (VH) y la región 10 variable de cadena ligera (VL)

11-10-2011

Tabla 19: Datos de las regiones CDR de las inmunoglobulinas con maduración de la afinidad.

Nombre de scFv

HCDR1 (SEQ ID NO: ) HCDR2 (SEQ ID NO: ) HCDR3 (SEQ ID NO: ) LCDR1 (SEQ ID NO: ) LCDR2 (SEQ ID NO: ) LCDR3 (SEQ ID NO: )

SC05-074

30 40 10 236 240 244

SC05-080

30 40 10 237 241 245

SC05-085

30 40 10 238 242 246

SC05-088

30 40 10 239 243 247

Tabla 20: Potencia de neutralización de variantes con maduración de la afinidad e IgM de CR4374 frente a WNV USA99b.

Virus

PNRP50 (IC 95%) (g/ml) PNRP90 (IC 95%) (g/ml)

CR5074

0,013 (0,009-0,020) 0,067 (0,044-0,106)

CR5080

0,016 (0,010-0,023) 0,080 (0,052-0,128)

CR5085

0,015 (0,010-0,023) 0,077 (0,050-0,121)

CR5088

0,017 (0,011-0,026) 0,087 (0,057-0,139)

CRM4374

0,011 (0,007-0,017) 0,057 (0,037-0,091)

5 REFERENCIAS

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LISTADO DE SECUENCIAS

55 <110> Crucell Holland B.V. Throsby, Mark de Kruif, John

<120> Moléculas de unión capaces de neutralizar el virus del Nilo occidental y usos de las mismas

11-10-2011

<130> 0112 WO 00 ORD

<150> PCT/EP2004/053609

<151> 2004-12-20

<150> PCT/EP2005/052160 5 <151> 2005-05-12

<150> PCT/EP2005/052648

<151> 2005-06-08

<150> PCT/EP2005/052946

<151> 2005-06-23 10 <150> PCT/EP2005/054002

<151> 2005-08-15

<160> 247

<170> Patent In versión 3,1

15 <210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> HCDR3

<400> 1

25 <210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> HCDR3

<400> 2

35 <210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40 <220>

<223> HCDR3

<400> 3

45 <210> 4

<211> 16

<212> PRT

11-10-2011

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR3 5 <400> 4

<210> 5

<211> 15 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR3 15 <400> 5

<210> 6

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR3 25 <400> 6

<210> 7

<211> 11 30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR3 35 <400> 7

<210> 8

<211> 18 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR3 45 <400> 8

<210> 9

11-10-2011

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> HCDR3

<400> 9

10 <210> 10

<211> 19

<212> PRT

<213>

Secuencia artificial 15

<220>

<223> HCDR3

<400> 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213>

Secuencia artificial 25

<220>

<223> LCDR3

<400> 11

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213>

Secuencia artificial 35

<220>

<223> LCDR3

<400> 12

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213>

Secuencia artificial 45

<220>

11-10-2011

<223> LCDR3

<400> 13

5 <210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> LCDR3

<400> 14

15 <210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> LCDR3

<400> 15

25 <210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> LCDR3

<400> 16

35 <210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40 <220>

<223> LCDR3

<400> 17

45 <210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

50 <220>

11-10-2011

<223> LCDR3

<400> 18

5 <210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> LCDR3

<400> 19

15 <210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> LCDR3

<400> 20

25 <210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> HCDR1

<400> 21

35 <210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 40

<220>

<223> HCDR1

<400> 22

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

11-10-2011

<220>

<223> HCDR1

<400> 23

<210> 24

<211> 5

<212>

PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR1

<210> 25

<211> 5

<212>

PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR1

<210> 26

<211> 5

<212>

PRT 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR1

<400> 26

<210> 27

<211> 5

<212>

PRT 40 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR1

<210> 28

<211> 5

<212>

PRT 50 <213> Secuencia artificial

11-10-2011

<220>

<223> HCDR1

<400> 28

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213>

Secuencia artificial 10

<220>

<223> HCDR1

<400> 29

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213>

Secuencia artificial 20

<220>

<223> HCDR1

<400> 30

<210> 31

<211> 17

<212> PRT

<213>

Secuencia artificial 30

<220>

<223> HCDR2

<400> 31

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213>

Secuencia artificial 40

<220>

<223> HCDR2

<400> 32

<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213>

Secuencia artificial 50

11-10-2011

<220>

<223> HCDR2

<400> 33

<210> 34

<211> 17

<212>

PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR2

<400> 34

<210> 35

<211> 17

<212>

PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR2

<210> 36

<211> 17

<212>

PRT 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR2

<210> 37

<211> 14 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR2 45 <400> 37

<210> 38

<211> 17 50 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

11-10-2011

<220>

<223> HCDR2

<400> 38

<210> 39

<211> 17 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR2 15 <400> 39

<210> 40

<211> 16 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HCDR2 25 <400> 40

<210> 41

<211> 14 30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR1 35 <400> 41

<210> 42

<211> 17 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR1 45 <400> 42

<210> 43

11-10-2011

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> LCDR1

<400> 43

10 <210> 44

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> LCDR1

<400> 44

20 <210> 45

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> LCDR1

<400> 45

30 <210> 46

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> LCDR1

<400> 46

40 <210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> LCDR1

<400> 47

50 <210> 48

<211> 12

11-10-2011

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 5 <223> LCDR1

<400> 48

<210> 49 10 <211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> LCDR1

<400> 49

<210> 50 20 <211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> LCDR1

<400> 50

<210> 51 30 <211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> LCDR2

<400> 51

<210> 52 40 <211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 45 <223> LCDR2

<400> 52

<210> 53 50 <211> 7

<212> PRT

11-10-2011

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2 5 <400> 53

<210> 54

<211> 7 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2 15 <400> 54

<210> 55

<211> 7 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2 25 <400> 55

<210> 56

<211> 7 30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2 35 <400> 56

<210> 57

<211> 7 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2 45 <400> 57

<210> 58

<211> 7 50 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

11-10-2011

<220>

<223> LCDR2

<400> 58

<210> 59

<211> 7

<212>

PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2

<210> 60

<211> 7

<212>

PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2

<210> 61

<211> 747

<212>

ADN 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> SC04-271

<220> 35 <221> CDS

<222> (1) .. (747)

<223>

<400> 61

11-10-2011 E05821472

11-10-2011

<210> 62

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SC04-271 10 <400> 62

11-10-2011

<210> 63

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SC04-274 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(780)

<223>

<400> 63

11-10-2011 E05821472

11-10-2011

<210> 64

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SC04-274 10 <400> 64

<210> 65 15 <211> 762

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

11-10-2011

<220>

<223> SC04-283

<220> 5 <221> CDS

<222> (1)..(762)

<223>

<400> 65

11-10-2011 E05821472

11-10-2011

<210> 66

<211> 254

5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SC04-283 10 <400> 66

11-10-2011

<210> 67

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SC04-289 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(753)

<223>

<400> 67

11-10-2011

<210> 68

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SC04-289 10 <400> 68

11-10-2011 E05821472

11-10-2011

<210> 69

<211> 753

5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SC04-299 10 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (753)

<223>

<400> 69

11-10-2011

<210> 70

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SC04-299 10 <400> 70

11-10-2011

<210> 71

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC04-311 10 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (738)

<223>

<400> 71

<210> 72

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC04-311 10 <400> 72

<210> 73

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC04-325 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(741)

<223>

<400> 73

<210> 74

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC04-325 10 <400> 74

<210> 75

<211> 753 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC04-353 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(753)

<223>

<400> 75

<210> 76

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC04-353 10 <400> 76

<210> 77

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC04-361 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(780)

<223>

<400> 77

<210> 78

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC04-361 10 <400> 78

<210> 79

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC04-374 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(774)

<223>

<400> 79

<210> 80

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC04-374 10 <400> 80

<210> 81 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador HuCkappa <400> 81 cactctccc ctgttgaagc tctt

24

<210> 82 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador HuClambda2 <400> 82 tgaacattct gtaggggcca ctg

23

<210> 83 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador HuClambda7 <400> 83 agagcattct gcaggggcca ctg

23

<210> 84

<211> 4941

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5 <223> Vector PDV-C06

<400> 84

<210> 85

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuCIgG

10 <400> 85 gtccaccttg gtgttgctgg gctt 24

<210> 86

<213> Virus del Nilo occidental

<400> 86

<210> 87 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador CMV-Spe <400> 87 ccatgttgac attgattatt gac

23

<210> 88 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador WNV-E-95 REV <400> 88 gctctagact tgccgatgct gctgcc

26

<210> 89 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador clefsmaquWNV <400> 89 ggaattcagc atggcccagg tgaccctgag caacttccag

40

<210> 90 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso WNVmychis

<400> 90 gactagtcaa ctcaatggtg atggtg 26

5 <210> 91

<211> 6760

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Vector pSyn-C18-HCgammal

<400> 91

<210> 92

<211> 6267 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector pSyn-C05-Ckappa 10 <400> 92

<210> 93

<211>

6283 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector pSyn-C04-Clambda

<400> 93

<210> 111

<211>

8777 5 <212> ADN

<210> 94 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido 5K-G <400> 94 acctgtctcg agttttccat ggctgacatc gtgatgaccc agtctcc

47

<210> 95 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido sy3K-F <400> 95 gctgggggcg gccacggtcc gcttgatctc caccttggtc cc

42

<210> 96 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido 5K-B <400> 96

acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagatgaccc agtc

44

<210> 97 <211> 49 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido 5K-J <400> 97 acctgtctcg agttttccat ggctgacatc gtgatgaccc agtctccag

49

<210> 98 <211> 52 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido 5L-B <400> 98 acctgtctcg agttttccat ggctcagtcc gccctgaccc agccccgctc ag

52

<210> 99 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido sy3L-E <400> 99 ccagcacggt aagcttggtc ccagttcc

28

<210> 100 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido 5L-G <400> 100 acctgtctcg agttttccat ggcttcctac gtgctgactc agcc

44

<210> 101 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido sy3L-Cmod

<400> 101 ccagcacggt aagcttggtg cctccgcc

28

<210> 102 <211> 52 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5L-C <400> 102 acctgtctcg agttttccat ggctcagtcc gtgctgaccc agcctccctc ag

52

<210> 103 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido 5H-H <400> 103 acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctggtgc agtctgg

47

<210> 104 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido sy3H-A <400> 104 gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac cagggtgccc tggcccc

47

<210> 105 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido sy3H-C <400> 105 gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac ggtggtgccc tggcccc

47

<210> 106 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido 5H-C <400> 106 acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctggtgg agtctgg

47

<210> 107 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido 5H-A <400> 107 acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctggtgc agtctgg

47

<210> 108 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido 5H-N <400> 108 acctgtcttg aattctccat ggcccagatc accttgaagg agtctgg

47

<210> 109 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido sy3H-D <400> 109 gcccttggtg ctagcgctgg acacggtcac catggtgccc tggcccc

47

<210> 110 <211> 10515 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> pIg-C911-HCgammal <220> <221> característica misc <222> (1326)..(5076) <223> Relleno <400> 110

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> pIg-C909-Ckappa 10 <220>

<221> característica misc

<222> (1328)..(3860)

<223>

<400> 111

<210> 112

<211> 1356 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4271 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(1356)

<223>

<400> 112

<210> 113

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4271 10 <400> 113

<210> 114

<211> 1380 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4274 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(1380)

<223>

<400> 114

<210> 115

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4274 10 <400> 115

<210> 116

<211> 1380 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4283

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1380) 10 <223>

<400> 116

<210> 117

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4283 10 <400> 117

<210> 118

<211> 1365 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4289 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(1365)

<223>

<400> 118

<210> 119

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4289 10 <400> 119

<210> 120

<211> 1362 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4299 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(1362)

<223>

<400> 120

<210> 121

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4299

<400> 121

<210> 122

<211> 1347

5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4311 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(1347)

<223>

<400> 122

<210> 123

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4311 10 <400> 123

<210> 124

<211> 1341 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4325 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(1341)

<223>

<400> 124

<210> 125

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4325 10 <400> 125

<210> 126

<211> 1371 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4353 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(1371)

<223>

<400> 126

<210> 127

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4353 10 <400> 127

<210> 128

<211> 1380 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5 <223> Cadena pesada CR4361

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1380) 10 <223>

<400> 128

<210> 129

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CR4361 10 <400> 129

<210> 130

<211> 1380 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4374 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(1380)

<223>

<400> 130

<210> 131

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena pesada CR4374 10 <400> 131

<210> 132

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera CR4271 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(648)

<223>

<400> 132 <210> 133

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4271

<400> 133

<210> 134

<211> 660

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4274

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(660) 10 <223>

<400> 134 <210> 135

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera CR4274 10 <400> 135

<210> 136

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera CR4283 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(636)

<223>

<400> 136

<210> 137

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera CR4283 10 <400> 137

<210> 138

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cadena ligera CR4289

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(651)

<223>

<400> 138 <210> 139

5 <211> 217

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Cadena ligera CR4289

<400> 139 <210> 140

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera CR4299 10 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (698)

<223>

<400> 140

<210> 141

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera CR4299 10 <400> 141

<210> 142

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4311

<220>

<221> CDS 5 <222> (1)..(648)

<223>

<400> 142 <210> 143

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera CR4311 10 <400> 143

<210> 144

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera CR4325 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(654)

<223>

<400> 144

<210> 145

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera CR4325 10 <400> 145

<210> 146

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera CR4353 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(645)

<223>

<400> 146 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4353

<400> 147

<210> 148

<211> 663

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4361

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(663)

<223>

<400> 148 <210> 149

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera CR4361 10 <400> 149

<210> 150

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera CR4374 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(651)

<223>

<400> 150 <210> 151

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera CR4374

<400> 151

<210> 152

<211> 23

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda1A <400> 152 cagtctgtgc tgactcagcc acc

23

<210> 153 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda1B <400> 153 cagtctgtgy tgacgcagcc gcc

23

<210> 154 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda1C <400> 154 cagtctgtcg tgacgcagcc gcc

23

<210> 155 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda2 <400> 155 cartctgccc tgactcagcc t

21

<210> 156 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda3A <400> 156 tcctatgwgc tgactcagcc acc

23

<210> 157 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda3B <400> 157 tcttctgagc tgactcagga ccc

23

<210> 158 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda4 <400> 158 cacgttatac tgactcaacc gcc

23

<210> 159 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda5 <400> 159 caggctgtgc tgactcagcc gtc

23

<210> 160 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda6 <400> 160 aattttatgc tgactcagcc cca

23

<210> 161 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda7/8 <400> 161 cagrctgtgg tgacycagga gcc

23

<210> 162 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda9 <400> 162 cwgcctgtgc tgactcagcc mcc

23

<210> 163 <211> 23

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVkappa1B <400> 163

gacatccagw tgacccagtc tcc

23

<210> 164 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVkappa2 <400> 164 gatgttgtga tgactcagtc tcc

23

<210> 165 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVkappa3 <400> 165 gaaattgtgw tgacrcagtc tcc

23

<210> 166 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVkappa4 <400> 166 gatattgtga tgacccacac tcc

23

<210> 167 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVkappa5 <400> 167 gaaacgacac tcacgcagtc tcc

23

<210> 168 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVkappa6 <400> 168 gaaattgtgc tgactcagtc tcc

23

<210> 169 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVkappa1B-SalI

<400> 169 tgagcacaca ggtcgacgga catccagwtg acccagtctc c

41

<210> 170 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVkappa2-SalI <400> 170 tgagcacaca ggtcgacgga tgttgtgatg actcagtctc c

41

<210> 171 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVkappa3B-SalI <400> 171 tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgwtg acrcagtctc c

41

<210> 172 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVkappa4B-SalI <400> 172 tgagcacaca ggtcgacgga tattgtgatg acccacactc c

41

<210> 173 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVkappa5-SalI

<400> 173 tgagcacaca ggtcgacgga aacgacactc acgcagtctc c

41

<210> 174 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVkappa6-SalI <400> 174 tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgctg actcagtctc c

41

<210> 175 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuJkappa1-NotI <400> 175 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatttccacc ttggtccc

48

<210> 176 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuJkappa2-NotI <400> 176 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccagc ttggtccc

48

<210> 177 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuJkappa3-NotI <400> 177 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatatccact ttggtccc

48

<210> 178 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuJkappa4-NotI <400> 178 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccacc ttggtccc

48

<210> 179 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuJkappa5-NotI <400> 179 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt aatctccagt cgtgtccc

48

<210> 180 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda1A-SalI <400> 180 tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgctg actcagccac c

41

<210> 181 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda1B-SalI <400> 181 tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgytg acgcagccgc c

41

<210> 182 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Huvlambda1C-SalI <400> 182 tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtcgtg acgcagccgc c

41

<210> 183 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda2-SalI <400> 183 tgagcacaca ggtcgacgca rtctgccctg actcagcct

39

<210> 184 <211> 41 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> HuV1ambda3A-SalI <400> 184 tgagcacaca ggtcgacgtc ctatgwgctg actcagccac c

41

<210> 185 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda3B-SalI <400> 185 tgagcacaca ggtcgacgtc ttctgagctg actcaggacc c

41

<210> 186 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda4-SalI <400> 186 tgagcacaca ggtcgacgca cgttatactg actcaaccgc c

41

<210> 187 <211> 41

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda5-SalI <400> 187 tgagcacaca ggtcgacgca ggctgtgctg actcagccgt c

41

<210> 188 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda6-SalI <400> 188 tgagcacaca ggtcgacgaa ttttatgctg actcagcccc a

41

<210> 189 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVlambda7/8-SalI <400> 189 tgagcacaca ggtcgacgca grctgtggtg acycaggagc c

41

<210> 190 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVlambda9-SalI <400> 190 tgagcacaca ggtcgacgcw gcctgtgctg actcagccmc c

41

<210> 191 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuJlambda1-NotI <400> 191 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtgacc ttggtccc

48

<210> 192 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuJlambda2/3-NotI <400> 192 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtcagc ttggtccc

48

<210> 193 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuJlambda4/5-NotI <400> 193 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacytaa aacggtgagc tgggtccc

48

<210> 194 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH1B/7A <400> 194 cagrtgcagc tggtgcartc tgg

23

210> 195 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH1C <400> 195 saggtccagc tggtrcagtc tgg

23

<210> 196 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH2B <400> 196 saggtgcagc tggtggagtc tgg

23

<210> 197 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH3B <400> 197 saggtgcagc tggtggagtc tgg

23

<210> 198 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH3C <400> 198

gaggtgcagc tggtggagwc ygg

23

<210> 199 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH4B <400> 199 caggtgcagc tacagcagtg ggg

23

<210> 200 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH4C <400> 200 cagstgcagc tgcaggagtc sgg

23

<210> 201 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH5B <400> 201 gargtgcagc tggtgcagtc tgg

23

<210> 202 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH6A <400> 202 caggtacagc tgcagcagtc agg

23

<210> 203 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH1B/7A-SfiI <400> 203 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtgc agctggtgca rtctgg

56

<210> 204 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH1C-SfiI

<400> 204 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtcc agctggtrca gtctgg

56

<210> 205 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH2B-SfiI <400> 205 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtca ccttgaagga gtctgg

56

<210> 206 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH3B-SfiI <400> 206 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtgc agctggtgga gtctgg

56

<210> 207 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH3C-SfiI <400> 207 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaggtgc agctggtgga gwcygg

56

<210> 208 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH4B-SfiI <400> 208 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtgc agctacagca gtgggg

56

<210> 209 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH4C-SfiI <400> 209 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagstgc agctgcagga gtcsgg

56

<210> 210 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> HuVH5B-SfiI

<400> 210 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgargtgc agctggtgca gtctgg

56

<210> 211 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuVH6A-SfiI <400> 211 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtac agctgcagca gtcagg

56

<210> 212 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuJH1/2-XhoI <400> 212 gagtcattct cgactcgaga cggtgaccag ggtgcc

36

<210> 213 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuJH3-XhoI <400> 213 gagtcattct cgactcgaga cggtgaccat tgtccc

36

<210> 214 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuJH4/5-XhoI <400> 214 gagtcattct cgactcgaga cggtgaccag ggttcc

36

<210> 215 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> HuJH6-XhoI <400> 215 gagtcattct cgactcgaga cggtgaccgt ggtccc

36

<210> 216 <211> 5855 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector pCR-IgM

<400> 216

<210> 217

<211> 2257 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CRM4374 10 <220>

<221> Intrón

<222> (697)..(786)

<223>

<220>

<221> Intrón 5 <222> (1589)..(1867)

<223>

<220>

<221> Intrón

<222> (1123)..(1366) 10 <223>

<400> 217 <210> 218

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada CRM4374 10 <400> 218

<210> 219

<211> 8792 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Vector pIg-C910-Clambda 10 <400> 219

<210> 220

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera de CR5074 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(663)

<223>

<400> 220

<210> 221

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera de CR5074 10 <400> 221

<210> 222

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera de CR5080 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(663)

<223>

<400> 222

<210> 223

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera de CR5080 5 <400> 223

<210> 224

<211> 663

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera de CR5085

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(663)

<223>

<400> 224 <210> 225

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera de CR5085 10 <400> 225

<210> 226

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cadena ligera de CR5088 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(663)

<223>

<400> 226 <210> 227

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera de CR5088

<400> 227 <210> 228

5 <211> 771

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> SC05-074

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(771)

<223>

15 <400> 228

<210> 229

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC05-074 10 <400> 229

<210> 230

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SC05-080

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(771) 5 <223>

<400> 230 <210> 231

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC05-080 10 <400> 231

<210> 232

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC05-085 10 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (771)

<223>

<400> 232

<210> 233

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC05-085 10 <400> 233

<210> 234

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC05-088 10 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (771)

<223>

<400> 234

<210> 235

<211> 257

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

SC05-088 10 <400> 235

<210> 236

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR1

<400> 236

<210> 237

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR1

<400> 237

<210> 238

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR1

<400> 238

<210> 239

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR1

<400> 239

<210> 240

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2

<400> 240

<210> 241

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2

<400> 241

<210> 242

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2

<400> 242

<210> 243

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR2

<400> 243

<210> 244

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR3

<400> 244

<210> 245

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR3

<400> 245

<210> 246

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR3

<400> 246

<210> 247

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> LCDR3

<400> 247

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo capaz de unirse específicamente a la proteína E del virus del Nilo occidental (WNV) y que tiene una actividad de neutralización del WNV, en el que dicho anticuerpo comprende una región CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una región CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, una región CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una región CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, una región CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 y una región CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

2. 2.

   Un anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano.

3. 3.

   Un mutante con maduración de la afinidad de un anticuerpo según la reivindicación 1, que tiene una afinidad superior en comparación con el anticuerpo según la reivindicación 1 y en el que dicho mutante con maduración de la afinidad es capaz de unirse específicamente a la proteína E del WNV y tiene actividad de neutralización del WNV.

4. 4.

   Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, o un mutante con maduración de la afinidad según la reivindicación 3, comprendiendo además el inmunoconjugado al menos una etiqueta.

5. 5.

   Una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, o un mutante con maduración de la afinidad según la reivindicación 3.

6. 6.

   Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, un mutante con maduración de la afinidad según la reivindicación 3 o un inmunoconjugado según la reivindicación 4, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. 7.

   Un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, un mutante con maduración de la afinidad según la reivindicación 3 o un inmunoconjugado según la reivindicación 4, para su uso como medicamento.

8. 8.

   Un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, un mutante con maduración de la afinidad según la reivindicación 3 o un inmunoconjugado según la reivindicación 4, para su uso en el diagnóstico, profilaxis o tratamiento de una dolencia resultante de una infección por el WNV.

9. 9.

   Un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, un mutante con maduración de la afinidad según la reivindicación 3 o un inmunoconjugado según la reivindicación 4, para el diagnóstico in vitro de una infección por el WNV.