ES2369982T3

ES2369982T3 - Anticuerpo anti-cd4 humanizado con propiedades inmunosupresoras.

Info

Publication number: ES2369982T3
Application number: ES09153544T
Authority: ES
Inventors: John Wijdenes; Helmut Jonuleit
Original assignee: Biotest AG
Current assignee: Biotest AG
Priority date: 2003-03-21
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2011-12-09
Anticipated expiration: 2024-03-19
Also published as: ZA200506885B

Abstract

Un anticuerpo anti-CD4 humanizado que es capaz de activar los linfocitos T reguladores CD4+ CD25+, donde el anticuerpo anti-CD4 humanizado comprende una secuencia que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo B-F5 monoclonal anti-CD4 de ratón, donde el anticuerpo B-F5 monoclonal anti-CD4 de ratón tiene regiones Vh y Vk codificadas por la SEC ID Nº 5 y la SEC ID Nº 6.

Description

Anticuerpo anti-CD4 humanizado con propiedades inmunosupresoras.

La invención se refiere a un anticuerpo anti-CD4 humanizado, y a su uso para inmunomodulación.

Las enfermedades autoinmunes así como el rechazo de injertos se producen por una respuesta inmune inapropiada a los antígenos tisulares: a los autoantígenos en el primer caso, y a los antígenos del aloinjerto en el segundo.

Las enfermedades autoinmunes incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide, diabetes de tipo I, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, dermatitis atópica, etc.

Los tratamientos convencionales para estos trastornos inmunológicos implican fármacos inmunosupresores. Sin embargo, estos fármacos inducen una inmunosupresión general, dando lugar a la inhibición no sólo de las funciones nocivas del sistema inmune, sino también de las funciones útiles. Como consecuencia, inducen efectos secundarlos, tales como infecciones oportunistas.

Como una estrategia alternativa, se ha propuesto usar anticuerpos monoclonales (mAb) inmunosupresores contra moléculas de la superficie celular, con el fin de eliminar subgrupos específicos de linfocitos (anticuerpos destructores) o para inhibir la función de una molécula de superficie diana sin matar a la célula que la porta (anticuerpos no destructores).

En general, se reconoce que los linfocitos T CD4^{+} desempeñan un papel importante en el inicio y mantenimiento de la autoinmunidad. Por lo tanto, se ha propuesto el uso de mAb contra moléculas de superficie de los linfocitos T CD4^{+}, y en particular mAb anti-CD4, como agentes inmunosupresores. Aunque numerosos estudios clínicos han confirmado el interés potencial de esta estrategia, también se plantearon varias cuestiones a abordar con el fin de hacer que los mAb anti-CD4 sean más adecuados para su uso en la práctica clínica rutinaria.

A modo de ejemplo, el anticuerpo B-F5 (IgG1 murina anti-CD4 humano) se ensayó en diferentes enfermedades autoinmunes:

-: en pacientes con artritis reumatoide, varios estudios abiertos sugirieron un efecto clínico positivo de B-F5 a una dosis diaria de al menos 20 mg (Racadot et. al Clin Exp Rheumatol 10 (4): 375-74; 1992); Wendling et al., Clin Rheumatol, 11 (4): 542-7, 1992). Sin embargo, los resultados observados en un experimento controlado con placebo con una dosis diaria de 20 mg durante 10 días no mostraron una mejora significativa (Wendling et al. J Rheumatol; 25 (8): 1457-61, 1998).

-: en psoriasis, se observó una mejora en las lesiones psoriásicas después de un tratamiento a una dosis de 0,2 mg/kg/día a 0,8 mg/kg/día durante 7 u 8 días (Morel et al. J Autoimmun., 5 (4): 165-77, 1992);

-: en pacientes con esclerosis múltiple (MS), se observaron algunos efectos positivos después de un tratamiento de 10 días en pacientes con formas recurrentes-remitentes, alguna de las cuales estaban libres de recaídas al sexto mes después de la terapia. (Racadot et al., J. Autoimmun, 6 (6): 771-86, 1993); se observaron efectos similares por Rumbach et al. (Mult Sclar, 1 (4): 207-12,1996).

-: en la enfermedad de Crohn grave, no se observó una mejora significativa en pacientes que recibieron B-F5 a una dosis de 0,5 mg/kg/día durante 7 días consecutivos o de 0,5 mg/kg/día el primer día (día 0) y 1 mg/kg/día los días 1-6 (Canva-Delcambre et al., Aliment Pharmacol Ther 10 (5): 721-7, 1996).

-: en la prevención del rechazo de aloinjertos, se describió una modificación de los parámetros biológicos, que indicaba una acción de B-F5 in vivo a una dosis de 30 mg/día. Sin embargo, se notificó que la biodisponibilidad de B-F5 no era suficiente para permitir su uso para la profilaxis del rechazo de aloinjertos (Dantal et. al. Transplantation, 27; 62 (10): 1052-6, 1996).

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Por lo anterior, parece ser que un primer aspecto a resolver es la necesidad de usar dosis altas de mAb para obtener una mejora clínica. Esto se puede producir, entre otras cosas, por la mala accesibilidad al mAb por los linfocitos en los tejidos diana. El uso de dosis mayores puede dar como resultado una acción excesiva sobre linfocitos sanguíneos, induciendo efectos secundarios indeseados.

Otra desventaja de la terapia con anticuerpos monoclonales en seres humanos es que estos anticuerpos se obtienen generalmente a partir de células de ratón y provocan respuestas anti-ratón en los destinatarios humanos. Esto no solamente da como resultado una menor eficacia del tratamiento e, incluso, de cualquier tratamiento futuro con anticuerpos monoclonales de ratón, sino también un riesgo incrementado de anafilaxis.

En principio, esta desventaja se puede evitar mediante el uso de anticuerpos humanizados, obtenidos injertando las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo monoclonal de ratón, que determinan la especificidad de unión a antígeno, en las regiones marco (FR) de una molécula de inmunoglobulina humana. El objetivo de la humanización es obtener un anticuerpo recombinante que tenga las mismas propiedades de unión a antígeno que el anticuerpo monoclonal de ratón del que se han obtenido las secuencias CDR y mucho menos inmunogénico en seres humanos.

En algunos casos, la sustitución de las CDR del anticuerpo de ratón por las CDR humanas en regiones marco es suficiente para transferir las propiedades de unión a antígeno (que incluyen no solo la especificidad, sino también la afinidad por el antígeno). Sin embargo, en muchos anticuerpos, algunos restos FR son importantes para la unión a antígeno, porque se ponen en contacto directamente con el antígeno en el complejo anticuerpo-antígeno, o porque influyen en la confirmación de las CDR y, por lo tanto, en su comportamiento de unión a antígeno.

Por lo tanto, en la mayoría de los casos también es necesario sustituir uno o varios restos marco del anticuerpo de ratón por los restos FR humanos correspondientes. Ya que el número de restos sustituidos tiene que ser tan pequeño como sea posible para evitar reacciones anti-ratón, el problema es determinar qué resto o restos de aminoácidos son críticos para conservar las propiedades de unión a antígeno. Se han propuesto varios métodos para predecir los sitios mas apropiados para la sustitución. Aunque proporcionan principios generales que pueden ser de cierta ayuda en las primeras etapas de humanización, el resultado final varía de un anticuerpo a otro. Por tanto, para un anticuerpo dado, es muy difícil predecir qué sustituciones proporcionarán el resultado deseado.

Sin embargo, los inventores han intentado la humanización de B-F5 de ratón y han tenido éxito produciendo B-F5 humanizado (denominado en lo sucesivo en este documento hB-F5) que tiene las mismas propiedades de unión a CD4 que el B-F5 de ratón parental.

Además, han observado, sorprendentemente, que hB-F5 tiene un efecto inmunosupresor optimo in vivo a dosis bastante menores que las usadas previamente con B-F5 parental y que las usadas actualmente con otros anticuerpos monoclonales anti-CD4.

En realidad, los inventores han observado que hB-F5 proporcionaba una inmunosupresión eficaz, reflejada por un efecto clínico positivo en pacientes con artritis reumatoide, cuando se usó en un tratamiento de 10 días a una dosis tan baja como 1 mg/día y preferentemente a una dosis de 5 mg cada dos días.

Como consecuencia, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-CD4 humanizado que es capaz de activar linfocitos T reguladores CD4^{+} CD25^{+}, donde el anticuerpo anti-CD4 humanizado comprende una secuencia que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD4 B-F5, donde el anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD4 B-F5 tiene regiones V_{h} y V_{k} codificadas por la SEC ID Nº: 5 y la SEC ID Nº: 6. Además, la presente invención proporciona un fragmento de anticuerpo que comprende los dominios V de este anticuerpo anti-CD4 humanizado que es capaz de activar linfocitos T reguladores CD4^{+} CD25^{+}, y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un dominio V de este anticuerpo. La presente invención también proporciona una composición terapéutica que comprende el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo, y proporciona el anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso como un medicamento.

La presente invención proporciona un anticuerpo humanizado (hB-F5) obtenido de MAb B-F5 de ratón, en el que dicho anticuerpo hB-F5 tiene dominios V definidos por las siguientes secuencias polipeptídicas:

1

Generalmente, un anticuerpo hB-F5 de la invención comprende adicionalmente una región constante humana (Fe). Esta región constante se puede seleccionar entre dominios constantes de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las regiones constantes preferidas se seleccionan entre dominios constantes de IgG, en particular, IgG1.

La presente invención también incluye cualquier fragmento de un anticuerpo hB-F5 que comprende las regiones V del mismo. Éste comprende, en particular, fragmentos Fab, Fab', F(ab)'_{2}, Fv y scFv.

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La invención también incluye un polinucleótido seleccionado entre:

-: un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEC ID Nº: 1;

-: un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEC ID Nº: 2.

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Preferentemente, dicho polinucleótido se selecciona entre:

-: un polinucleótido de la SEC ID Nº: 3;

-: un polinucleótido de la SEC ID Nº: 4.

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Los polinucleótidos de la invención se pueden obtener fácilmente por los métodos bien conocidos de la tecnología de ADN recombinante y/o síntesis química de ADN.

Un polinucleótido que codifica el dominio V de la cadena H o de la cadena L de un anticuerpo hB-F5 se puede fusionar con un polinucleótido que codifica la región constante de una cadena humana H o L, con el propósito de expresar las cadenas H y L completas obtenidas de este modo; también se puede añadir una secuencia que codifica un péptido señal que permite la secreción de la proteína. Estos polinucleótidos recombinantes también son parte de la invención.

La invención también proporciona casetes de expresión en los que un polinucleótido de la invención se une a secuencias de control apropiadas que permiten la regulación de su transcripción y traducción en una célula hospedadora seleccionada, y vectores recombinantes que comprenden un polinucleótido o un casete de expresión de la
invención.

Estas construcciones de ADN recombinante se pueden obtener e introducir en células hospedadoras por las técnicas bien conocidas de ADN recombinante e ingeniería genética.

La invención también comprende una célula hospedadora, transformada por un polinucleótido de la invención.

Las células hospedadoras útiles dentro del marco de la presente invención pueden ser células procariotas o eucariotas. Entre las células eucariotas adecuadas se mencionarán, a modo de ejemplo, células vegetales, células de levaduras tales como Saccharomyces, células de insecto tales como Drosophila o Spodoptera y células de mamífero tales como HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, etc.

La construcción de vectores de expresión de la invención y la transformación de células hospedadoras se puede realizar por las técnicas convencionales de biología molecular.

Se puede obtener un anticuerpo hB-F5 de la invención cultivando una célula hospedadora que contiene un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo, en condiciones adecuadas para la expresión de la misma, y recuperando dicho anticuerpo del cultivo de célula hospedadora.

La presente invención también comprende una composición terapéutica que comprende un anticuerpo hB-F5 de la invención o un fragmento del mismo, como se ha definido anteriormente.

Preferentemente, dicha composición es una composición para administración por vía parenteral, formulada para permitir la administración de una dosis de 0,1 a 10 mg, ventajosamente de 1 a 5 mg de hB-F5.

Más específicamente, la invención incluye el uso de un anticuerpo hB-F5 de la invención o un fragmento del mismo, para preparar una composición inmunosupresora. Dicha composición inmunosupresora es útil, en particular, para el tratamiento o la prevención de enfermedades tales como rechazo de injertos, reacción de injerto contra hospedador o reacción de hospedador contra injerto o enfermedades autoinmunes que incluyen, por ejemplo, miocarditis, diabetes mellitus, psoriasis, lupus eritematoso, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, artritis reumatoide,
etc.

Además, los inventores han observado que hB-F5 era capaz de activar un subconjunto particular de células T CD4^{+}, concretamente células CD4^{+}CD25^{+}.

Los linfocitos T reguladores CD25^{+}CD4^{+} (células Treg) constituyen el 5-10% de las células T CD4^{+} periféricas. Se describieron por primera vez en 1995 por Sakaguchi et al. (J. Immunol., 155: 1151-1164) como células reguladoras en ratones. Cuando están activadas, estas células son capaces de suprimir la activación y proliferación de linfocitos T tanto CD4^{+} como CD8^{+}. Más adelante, también se han encontrado linfocitos T supresores CD25^{+}CD4^{+} en seres humanos (Jonuleit et al, J. Exp. Med. 193, 1285-1294, 2001; Levings et al., J. Exp. Med. 193, 1295-1302, 2001; Dieckmann et al., J. Exp. Med. 193, 1303-1310 2001). Se han publicado numerosos artículos que describen el papel inmunosupresor de estas células en diferentes modelos de enfermedad autoinmune y en sistemas in vitro (para una revisión, véase, por ejemplo, Shevach, J. Exp. Med., 193, 11, 41-46, 2001). También se ha demostrado que las células Treg CD4^{+}CD25^{+} activadas ex vivo son eficaces en la prevención de la enfermedad de injerto contra hospedador (Taylor et al., Blood, 99, 3493-3499, 2002; Cohen et al., J. Exp. Med. 196, 401-406, 2002; Hoffmann et al., J. Exp. Med. 196, 389-399, 2002). Por tanto, la proporción de medios para la activación de células Treg CD4^{+}CD25^{+} es de gran interés.

La invención también se refiere al uso del anticuerpo hB-F5 de la invención, o del anticuerpo parental B-F5, para activar linfocitos T reguladores CD25^{+}CD4^{+} in vitro.

Preferiblemente, el anticuerpo hB-F5 de la invención se añade a los linfocitos T reguladores CD25^{+}CD4^{+} a una concentración de 1 \mug/ml a 10 \mug/ml.

La presente invención se ilustrará adicionalmente por la siguiente descripción adicional, que se refiere a ejemplos que ilustran las propiedades de anticuerpos hB-F5 de la invención. Sin embargo, se debe entender que estos ejemplos solamente se muestran a modo de ilustración de la invención y no constituyen de ningún modo una limitación de la misma.

Ejemplo 1 Construcción de B-F5 humanizado Diseño de Regiones V_{H} y V_{K} de B-F5 Humanizado

Las secuencias de ADN que codifican regiones V_{H} y V_{K} de B-F5 de ratón se muestran respectivamente en la Figura 1 y la Figura 2 y con los identificadores de secuencia SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 6. La V_{H} y V_{K} humanas sobre las que se injertaron las CDR de ratón se seleccionaron buscando en bases de datos V_{H} humanas mas parecidas a las V_{H} y V_{K} de B-F5 originales de ratón. La región V_{H} de un anticuerpo humano (M26; Número de Acceso A36006) tenía la mayor homología con V_{H} de B-F5. La región V_{K} de otro anticuerpo humano (FK-001; NAKATANI et al., Biotechnology, 7 (1989), 805-810)) tenía la mayor homología con V_{K} de B-F5.

Se construyeron dos tipos de V_{K} que diferían entre ellos en que el 4º resto era leucina o metionina y se denominaron L4L y L4M. Se construyeron dos tipos de V_{H} que diferían entre ellos en que el 37º resto de aminoácido era leucina o valina y se denominaron H37L y H37V. El alineamiento de las secuencias polipeptídicas de B-F5, FK-001, L4L y L4M se muestra en la Figura 3. El alineamiento de las secuencias polipeptídicas de B-F5, M26, H37L y H37V se muestra en la Figura 4. Los restos de FR de los que se ha descrito previamente que son importantes para el empaquetamiento de las CDR (Chothia et al., Nature, 342(1989), 8777; Foote et al., J. Mol. Biol., 224(1992), 487) están
encuadrados.

Combinando estas V_{H} y V_{K} se diseñaron 4 versiones de regiones V.

Expresión de B-F5 humanizado

Las etapas posteriores para la producción de B-F5 humanizado fueron las mismas que las descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 5.886.152 para B-B10 humanizado.

En resumen, se construyeron por separado plásmidos de expresión para la cadena H (región humanizada de V_{H} fusionada con la región constante de una cadena \gamma-1 humana (TAKAHASHI et al., Cell, 29 (1982), 671-679)) y la cadena L (región humanizada de V_{K} fusionada con la región constante de la cadena \kappa de FK-001) de B-F5 humanizado. En estos plásmidos, la expresión de B-F5 humanizado se dirige por el promotor/potenciador del gen de IgM monoclonal humana, FK-001. Las Figuras 5 y 6 muestran respectivamente los fragmentos de los plásmidos que codifican las regiones V_{H} y V_{K} de BF-5 humanizado. Las secuencias que codifican la región V están subrayadas y las secuencias polipeptídicas correspondientes se indican sobre la secuencia de nucleótidos. Ambos plásmidos y pSV2neo se introdujeron simultáneamente en Sp2/0 de mieloma de ratón (ATCC CRL-1581) usando Lipofectin^{TM}. Los transfectomas que producían IgG humano se seleccionaron por ELISA, usando un anticuerpo anti-IgG humano (cadena \gamma) y un anticuerpo anti-cadena \kappa de Ig humana.

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Ejemplo 2 Caracterización de las diferentes versiones de B-F5 humanizado Estimación de la actividad de unión a CD4

Se recogieron y concentraron los sobrenadantes de cultivo de transfectomas que producían las cuatro versiones de hB-F5. Los diferentes anticuerpos se purificaron de los sobrenadantes del cultivo por cromatografía de afinidad usando proteína A Sepharose y se evaluaron para su actividad de unión a CD4 por medición, mediante ELISA competitivo, de sus actividades inhibidoras frente a la unión de mB-F5 biotinilado a CD4 soluble aplicado como recubrimiento sobre placas de microtitulación. El tiempo de incubación es de 2 horas a 37ºC y durante una noche a 4ºC.

Las actividades de unión relativa de los hB-F5 (la actividad de unión de mB-F5 se tomó como el 100%) se muestran en la siguiente Tabla I.

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TABLA I

2

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A partir de los resultados mostrados en la Tabla I, parece que el 37º resto de V_{H}, Leucina, es crítico para mantener la actividad de unión a CD4 de hB-F5 debido a que la actividad de unión a CD4 se reduce varias veces por conversión de ^{37}Leu en ^{37}Val. Por el contrario, se observa que el 4º resto de V_{K} no es tan importante para la actividad de unión a CD4. Ya que la diferencia estructural entre ^{37}Leu y ^{37}Val de V_{H} no esta demostrada claramente por modelado molecular, la superioridad de H37L con respecto a H37V en la actividad de unión a CD4 fue inesperada.

Se seleccionaron H37L/L4L y H37L/L4M para evaluar las actividades biológicas in vitro.

Investigación de las actividades biológicas in vitro de B-F5 humanizado

Se evaluaron las actividades biológicas in vitro de B-F5 de ratón y B-F5 humanizados (IgG1 H37L/L4M e IgG1 H37L/L4L). También se ensayaron los B-F5 humanizados de tipo IgG2 (IgG2 H37L/L4M e IgG2 H37L/L4L).

Se evaluaron las actividades biológicas in vitro de mB-F5 y los cuatro tipos de hB-F5 usando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos. Las PBMC se activaron por ConA (2,5 \mug/ml, 3 días) o PPD (10 \mug/ml, 4 días) en presencia de B-F5 murino o hB-F5 y se controlaron con respecto a sus respuestas proliferativas por incorporación de ^{3}H-timidina.

Los resultados se muestran en las Figuras 7 y 8. Los B-F5 murinos y hB-F5 podían inhibir de forma moderada la proliferación inducida por ConA, pero las actividades variaban de anticuerpo a anticuerpo y/o de donante a donante (Figura 7). Además, los B-F5 murinos y hB-F5 eran capaces de inhibir la proliferación de PBMC específica de Ag inducida por PPD (Figura 8).

El tipo IgG1 de hB-F5 inhibió la proliferación inducida por PPD de forma mas eficaz (hasta el 70% de inhibición, Figura 7 y 8) que el mB-F5. El tipo IgG1 parecía ser más eficaz que el tipo IgG2, del cual la actividad inhibidora era prácticamente la misma que la de mB-F5. Para el tipo IgG1, H37L/L4M fue más eficaz que H37L/L4L. El tipo IgG2 de H37L/L4M y H37L/L4L tenía casi las mismas actividades inhibidoras. En resumen, las actividades inhibidoras de B-F5 frente a la proliferación de PBMC inducida por PPD fueron las siguientes: IgG1 H37L/L4M > IgG1 H37L/L4L > IgG2 H37L/L4M = IgG2 H37L/L4L = mB-F5.

Considerando la eficacia de la actividad biológica in vitro y el menor número de aminoácidos de ratón, se seleccionó IgG1 de H37L/L4M para evaluación posterior.

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Ejemplo 3 Evaluación preliminar del efecto de hB-F5 sobre pacientes con artritis reumatoide (RA)

El efecto de hB-F5 (IgG1 H37L/L4M) se ensayó en pacientes con RA.

Las condiciones del ensayo fueron las siguientes:

Cada paciente recibió un tratamiento de 10 días que consistía en 5 inyecciones de 5 mg de hB-F5 (una inyección cada 2 días).

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Los resultados para 3 pacientes diferentes se muestran en las siguientes Tablas II-IV:

Paciente 1 (Tabla II):

Diagnóstico: Artritis Reumatoide; Actividad 2

Factor Reumatoide: 2; Estadio: 2

Sexo: F; Edad: 65: Aparición de la enfermedad: 1965

Terapia adicional: Diclofenaco 150 mg/día

TABLA II

3

Paciente 2 (Tabla III):

Diagnóstico: Artritis Reumatoide; Actividad 3

Factor reumatoide: 2; Estadio: 2

Sexo: F; Edad: 48: Aparición de la enfermedad: 2000

Terapia adicional: Diclofenaco 150 mg/día

TABLA III

4

Paciente 3 (Tabla IV):

Diagnóstico: Artritis Reumatoide; Actividad 3

Factor reumatoide: 3; Estadio: 2

Sexo: F; Edad: 49: Aparición de la enfermedad: 1989

Terapia adicional: Diclofenaco 150 mg/día

TABLA IV

5

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Ejemplo 4 Activación de células Treg CD4+CD25+ por hB-F5 Aislamiento de linfocitos T

1) Linfocitos T reguladores (Treg):

-: Se aíslan células CD25+ usando microperlas de CD25;

-: Reducción de contaminaciones: se preparan células positivas CD14^{-}, CD8^{-}, CD19^{-} con DYNALbeads CD14/CD8/CD19;

-: La reducción de células CD45RA^{+} se realiza con mAb CD45RA + DYNALbeads anti-ratón: pureza: > 95% Treg CD4+CD25+

2) Células Efectoras

-: Se aíslan células T CD4+ usando microperlas de CD4

-: La reducción de células CD45RO^{+} se realiza con CD45RO + mAb + DYNALbeads anti-ratón; pureza: > 98% CD4/CD45RA^{+}, linfocitos T CD25-efectores.

3) Sistema de ensayo

Se cultivan conjuntamente Treg CD25+ del donante A durante 2 días con PBMC con reducción de CD2 singénicas sin adiciones (control negativo = sin activación = sin actividad supresora) o en presencia de 0,5 \mug/ml de anti-CD3 (OKT-3 = control positivo = activación completa de Treg) o en presencia de 5 \mug/ml o 30 \mug/ml de hB-F5.

Después de un lavado exhaustivo de las células precultivadas, se aislan y se tratan las células Treg CD25+ por radiación \gamma (3000 rad).

4) Ensayo de actividad supresora:

Se cultivan conjuntamente células Treg CD25^{+} precultivadas durante 4 días con linfocitos T efectores CD4^{+} recién aislados (1:1) del donante B en presencia de APC (PBMC con reducción de CD2) del donante A (singénicas para linfocitos T precultivados (sin activación adicional) alogénicos para linfocitos T efectores (= reacción mixta de linfocitos alogénicos). Después, las células se incuban durante 16 h con ^{3}H-timidina y se detecta la proliferación de linfocitos T efectores.

Los resultados se muestran en la Figura 9.

Leyenda de la Figura 9:

-: control negativo (sin activación) = preCD25;

-: 0,5 \mug/ml de OKT-3 (control positivo, activación completa) = preCD25-CD3;

-: 5 \mug/ml de hB-F5 (Ensayo 1) = preCD25-CD4

-: 30 \mug/ml de hB-F5 (Ensayo 2) = preCD25-CD4.

Cláusulas

1) Un anticuerpo humanizado (hB-F5) derivado de anticuerpo B-F5 monoclonal anti-CD4 de ratón, teniendo dicho anticuerpo humanizado (hB-F5) un dominio V definido por las siguientes secuencias polipeptídicas:

6

2) Un fragmento de un anticuerpo hB-F5 de la cláusula 1, donde dicho fragmento comprende el dominio V de la SEC ID Nº: 1 y de la SEC ID Nº: 2.

3) Un polinucleótido seleccionado entre:

-: un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica el dominio V de cadena H de la SEC ID Nº 1;

-: un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica el dominio V de cadena L de la SEC ID Nº: 2.

4) Un polinucleótido de acuerdo con la cláusula 3 que se selecciona entre:

-: un polinucleótido que comprende la secuencia SEC ID Nº: 3;

-: un polinucleótido que comprende la secuencia SEC ID Nº: 4.

5) Una composición terapéutica que comprende un anticuerpo humanizado de la cláusula 1, o un fragmento de la cláusula 2.

6) El uso de un anticuerpo humanizado de la cláusula 1, o un fragmento de la cláusula 2, para preparar una composición inmunosupresora.

7) El uso de un anticuerpo humanizado de la cláusula 1, para activar linfocitos T reguladores CD25^{+}CD4^{+} in vitro.

<110> DIACLONE WIJDENES, Jhon

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<120> ANTICUERPO ANTI-CD4 HUMANIZADO CON PROPIEDADES INMUNOSUPRESORAS

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<130> MJP/ah-884/5EP

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<160> 6

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<170>PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 124

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Dominio V de la cadena H del anticuerpo hBF-5 humanizado

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<400> 1

7

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<210> 2

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<211> 111

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Dominio V de la cadena K del anticuerpo hBF-5 humanizado

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<400> 2

8

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<210> 3

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<211> 372

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> dominio V de la cadena H del anticuerpo hBF-5 humanizado

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<400> 3

9

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<210> 4

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<211> 336

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Dominio V de la cadena K del anticuerpo hBF-5 humanizado

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<400> 4

10

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<210> 5

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<211> 372

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 5

11

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<210> 6

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<211> 383

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 6

12

Claims

1. Un anticuerpo anti-CD4 humanizado que es capaz de activar los linfocitos T reguladores CD4^{+} CD25^{+}, donde el anticuerpo anti-CD4 humanizado comprende una secuencia que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo B-F5 monoclonal anti-CD4 de ratón, donde el anticuerpo B-F5 monoclonal anti-CD4 de ratón tiene regiones V_{h} y V_{k} codificadas por la SEC ID Nº 5 y la SEC ID Nº 6.

2. Un anticuerpo anti-CD4 humanizado de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo se obtiene a partir de un anticuerpo B-F5 monoclonal anti-CD4 de ratón que tiene regiones V_{h} y V_{k} codificadas por la SEC ID Nº: 5 y la SEC ID Nº 6.

3. Un fragmento de anticuerpo que comprende dominios V del anticuerpo anti-CD4 humanizado de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es capaz de activar los linfocitos T reguladores CD4^{+} CD25^{+}.

4. Un polinucleótido que comprende un secuencia que codifica un dominio V de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

5. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Una composición terapéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, o el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3.

8. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3 para su uso como un medicamento.

9. Un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 8 para el tratamiento o prevención de rechazo de injertos, reacción del injerto contra hospedador o reacción del hospedador contra injerto.

10. Un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 8 para el tratamiento o prevención de enfermedades autoinmunes.

11. Un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 10 en el que la enfermedad autoinmune es miocarditis, diabetes tipo I, psoriasis, lupus eritomatoso, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, colitis ulcerosa o dermatitis atópica.

12. Uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 3, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de rechazo de injertos, reacción de injerto contra huésped o reacción de huésped contra injerto.

13. Uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 3, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades autoinmunes.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13 en el que la enfermedad autoinmune es miocarditis, diabetes tipo I, psoriasis, lupus eritomatoso, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, colitis ulcerosa o dermatitis atópica.

15. Uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, para activar in vitro linfocitos T reguladores CD4^{+} CD25^{+}.