ES2369494T3

ES2369494T3 - ANALYTICAL PLATFORM AND DETECTION PROCEDURE WITH ANALYTICS TO BE DETECTED IN A SAMPLE EVENTUALLY AFTER THE FRACTIONING AS UNMOBILIZED SPECIFIC UNION ASSOCIATES.

Info

Publication number: ES2369494T3
Application number: ES03793767T
Authority: ES
Inventors: Michael Pawlak; Eginhard Schick; Peter Oroszlan
Original assignee: Bayer Technology Services GmbH
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2002-09-03
Filing date: 2003-08-28
Publication date: 2011-12-01
Anticipated expiration: 2023-08-28

Abstract

Procedimiento para ensayar una multiplicidad de muestras en lo relativo a los compuestos contenidos en las muestras, biológicamente relevantes como participantes en reacciones de unión específicas, como analitos, caracterizado porque - dichas muestras o fracciones de dichas muestras con los analitos a detectar allí contenidos, como una primera multiplicidad de asociados de unión específicos se aplican directamente o después de diluciones adicionales de las fracciones en al menos una matriz unidimensional o bidimensional en áreas de medición diferenciadas en una plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido, en donde se disponen distintas muestras o fracciones o distintas diluciones de muestras o fracciones en distintos áreas de medición diferenciadas, - una o varias sustancias de detección, como una segunda multiplicidad de asociados de unión específicos, para la detección específica de uno o varios analitos contenidos en las muestras o sus fracciones, a partir de dicha primera multiplicidad de asociados de unión específicos, se ponen en contacto en una única etapa o en varias etapas de una reacción de unión específica con las muestras o fracciones aplicados en dichas áreas de medición diferenciadas o sus diluciones, - modificaciones de señales optoelectrónicas como consecuencia de la unión de sustancias de detección con analitos contenidos en áreas de medición diferenciadas, se miden con resolución local en el campo evanescente de la plataforma sensora de campo evanescente, y a partir del tamaño relativo de las modificaciones de dichas señales optoelectrónicas de los respectivos áreas de medición se determina cualitativa y / o cuantitativamente la presencia de los analitos a detectar allí de forma específica.Procedure for testing a multiplicity of samples in relation to the compounds contained in the samples, biologically relevant as participants in specific binding reactions, such as analytes, characterized in that - said samples or fractions of said samples with the analytes to be detected there contained, such as a first multiplicity of specific binding partners are applied directly or after additional dilutions of the fractions in at least one one-dimensional or two-dimensional matrix in differentiated measurement areas on an evanescent field sensing platform as a solid support, where different samples are arranged or fractions or different dilutions of samples or fractions in different differentiated measurement areas, - one or several detection substances, such as a second multiplicity of specific binding partners, for the specific detection of one or more analytes contained in the samples or their fractions, to from said first multiplicity of specific binding partners, they are contacted in a single stage or in several stages of a specific binding reaction with the samples or fractions applied in said differentiated measurement areas or their dilutions, - modifications of optoelectronic signals as a consequence of the union of detection substances with analytes contained in differentiated measurement areas, they are measured with local resolution in the evanescent field of the evanescent field sensing platform, and from the relative size of the modifications of said optoelectronic signals of the respective Measurement areas are determined qualitatively and / or quantitatively the presence of the analytes to be detected there specifically.

Description

Plataforma analítica y procedimiento de detección con analitos a detectar en una muestra eventualmente después de fraccionamiento como asociados de unión específicos inmovilizados Analytical platform and detection procedure with analytes to be detected in a sample eventually after fractionation as immobilized specific binding partners

La presente invención se refiere a una plataforma analítica y a un procedimiento realizado con ésta para analizar una multiplicidad de muestras en lo relativo a los compuestos contenidos en las muestras, biológicamente relevantes como participantes en reacciones de unión específicas, como analitos, caracterizado porque The present invention relates to an analytical platform and a method performed with it to analyze a multiplicity of samples in relation to the compounds contained in the samples, biologically relevant as participants in specific binding reactions, such as analytes, characterized in that

– -: dichas muestras o fracciones de dichas muestras con los analitos a detectar allí contenidos, como una primera multiplicidad de asociados de unión específicos se aplican directamente o después de diluciones adicionales de las muestras o de las fracciones en al menos una matriz unidimensional o bidimensional en áreas de medición diferenciadas en una plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido, en donde se disponen distintas muestras o fracciones o distintas diluciones de muestras o fracciones en distintos áreas de medición diferenciadas, said samples or fractions of said samples with the analytes to be detected therein, as a first multiplicity of specific binding partners are applied directly or after additional dilutions of the samples or fractions in at least one one-dimensional or two-dimensional matrix in areas of differentiated measurement on an evanescent field sensor platform as a solid support, where different samples or fractions or different dilutions of samples or fractions are arranged in different differentiated measurement areas,

– -: una o varias sustancias de detección, como una segunda multiplicidad de asociados de unión específicos, para la detección específica de uno o varios analitos contenidos en las muestras, a partir de dicha primera multiplicidad de asociados de unión específicos, se ponen en contacto en una única o en varias etapas de una reacción de unión específica con las muestras o sus fracciones o sus diluciones aplicadas en dichas áreas de medición diferenciadas, one or more detection substances, such as a second multiplicity of specific binding partners, for the specific detection of one or more analytes contained in the samples, from said first multiplicity of specific binding partners, are contacted in a single or in several stages of a specific binding reaction with the samples or their fractions or their dilutions applied in said differentiated measurement areas,

– -: modificaciones de señales optoelectrónicas como consecuencia de la unión de sustancias de detección con analitos contenidos en áreas de medición diferenciadas, se miden con resolución local en el campo evanescente de la plataforma sensora de campo evanescente y a partir del tamaño relativo de las modificaciones de dichas señales optoelectrónicas de los respectivos áreas de medición se determina cualitativa y/o cuantitativamente la presencia de los analitos. Modifications of optoelectronic signals as a result of the union of detection substances with analytes contained in differentiated measurement areas, are measured with local resolution in the evanescent field of the evanescent field sensing platform and from the relative size of the modifications of said optoelectronic signals The presence of the analytes is determined qualitatively and / or quantitatively from the respective measurement areas.

Al mismo tiempo dichas modificaciones de señales optoelectrónicas, pueden ser determinadas como consecuencia de la unión de sustancias de detección a analitos contenidos en las muestras en áreas de medición diferenciadas, en el campo evanescente de la plataforma sensora de campo evanescente, por ejemplo, a partir de la comparación de las señales medidas simultáneamente de distintos rangos de medición, las que contienen analitos a detectar correspondientes (en concentración y/o cantidad conocida o desconocida) con las señales de áreas de medición, las que no contienen analitos a detectar correspondientes. Para la determinación de dichas modificaciones de señales también se pueden usar las señales de áreas de medición con concentración desconocida con aquellas áreas de medición con analitos allí contenidos en concentración conocida. Para el caso de la captación continua de señales y durante la adición de las sustancias de detección correspondientes y su unión a las áreas de medición que contienen analitos correspondientes se puede determinar una modificación correspondiente también a partir del transcurso temporal de las señales de las áreas de medición correspondientes. At the same time, said modifications of optoelectronic signals can be determined as a result of the union of detection substances to analytes contained in the samples in differentiated measurement areas, in the evanescent field of the evanescent field sensor platform, for example, from of comparing the signals measured simultaneously from different measuring ranges, those containing corresponding analytes (in concentration and / or known or unknown quantity) with the signals from measurement areas, those containing no corresponding analytes to be detected. For the determination of said signal modifications, signals from measurement areas with unknown concentration can also be used with those measurement areas with analytes contained therein in known concentration. In the case of continuous signal acquisition and during the addition of the corresponding detection substances and their binding to the measurement areas containing corresponding analytes, a corresponding modification can also be determined from the time course of the signals from the areas of corresponding measurement.

A continuación la expresión “una muestra" o “una muestra de inmovilización" o “muestra inmovilizada" se refiere también a dos o más, es decir, a una multiplicidad de tales muestras o “muestras de inmovilización", en tanto no se indique expresamente de otro modo. Then the expression "a sample " or "a sample of immobilization" or "immobilized sample" it also refers to two or more, that is, to a multiplicity of such samples or "immobilization samples", as long as it is not expressly indicated otherwise.

Para numerosos campos de aplicación es necesario determinar una multiplicidad de analitos biológicamente relevantes en una muestra compleja, por ejemplo en procedimientos de diagnóstico para la determinación del estado de salud de un individuo o en la investigación y el desarrollo de productos farmacéuticos para la determinación de la influencia que ejerce un organismo y su funcionamiento complejo por medio de la alimentación de compuestos biológicamente activos. For many fields of application it is necessary to determine a multiplicity of biologically relevant analytes in a complex sample, for example in diagnostic procedures for the determination of the health status of an individual or in the research and development of pharmaceutical products for the determination of the influence exerted by an organism and its complex functioning through the feeding of biologically active compounds.

Mientras que procedimientos de separación analíticos conocidos están optimizados en general para separar, dentro de un tiempo en lo posible corto, una cantidad en lo posible grande, de compuestos contenidos en una muestra dada de acuerdo con un parámetro fisicoquímico predeterminado, como por ejemplo, del peso molecular o del cociente de carga molecular y masa, los procedimientos de detección por bioafinidad se basan en que, con un elemento de detección biológico o bioquímico o sintético, en lo posible de alta especificidad, se detecte y se una el analito correspondiente (único) en forma altamente selectiva en una muestra compuesta en forma compleja. La detección de una multiplicidad de compuestos diferentes requiere por lo tanto el uso de una cantidad correspondiente de diferentes elementos de reconocimiento específicos. While known analytical separation procedures are generally optimized to separate, within a short possible time, a large possible amount of compounds contained in a given sample according to a predetermined physicochemical parameter, such as the molecular weight or molecular weight ratio and mass, the bioaffinity detection procedures are based on the fact that, with a biological or biochemical or synthetic detection element, if possible of high specificity, the corresponding analyte is detected and linked (unique ) in a highly selective way in a sample composed in complex form. The detection of a multiplicity of different compounds therefore requires the use of a corresponding amount of different specific recognition elements.

Un procedimiento de detección que se basa en reacciones de bioafinidad se puede realizar tanto en una solución homogénea como también en la superficie de un soporte sólido. Según la configuración específica del procedimiento, después de la unión de los analitos a los elementos de reconocimiento correspondientes y eventualmente otras sustancias de detección así como también eventualmente entre distintos pasos del procedimiento son necesarios pasos de lavado, para separar los complejos formados a partir de los elementos de reconocimiento y los analitos a detectar así como también eventualmente otras sustancias de detección del resto de la muestra y de los reactivos adicionales usados eventualmente. A detection procedure based on bioaffinity reactions can be performed both in a homogeneous solution and also on the surface of a solid support. Depending on the specific configuration of the procedure, after the binding of the analytes to the corresponding recognition elements and possibly other detection substances as well as possibly between different steps of the procedure, washing steps are necessary, to separate the complexes formed from the recognition elements and analytes to be detected as well as other detection substances from the rest of the sample and from the additional reagents used eventually.

Se han divulgado en forma relativamente amplia procedimientos para la detección simultánea de una multiplicidad de diferentes ácidos nucleicos en una muestra con ayuda de ácidos nucleicos inmovilizados complementarios correspondientes, inmovilizados sobre un soporte sólido en áreas de medición diferenciadas, separados espacialmente, como elementos de reconocimiento. Por ejemplo, se conocen, en base a plaquetas de vidrio o de microscopio, matices de oligonucleótidos como elementos de reconocimiento con una densidad de “feature” muy alta (densidad de áreas de medición sobre un soporte sólido común). Por ejemplo, en la patente US No. 5.445.934 (Affymax Technologies) se describen y reivindican matrices de oligonucleótidos con una densidad de más de 1000 features por centímetro cuadrado. Methods for the simultaneous detection of a multiplicity of different nucleic acids in a sample with the aid of corresponding complementary immobilized nucleic acids, immobilized on a solid support in differentiated, spatially separated measurement areas, as recognition elements, have been disclosed relatively relatively. For example, oligonucleotide shades are known based on glass or microscope platelets as recognition elements with a very high "feature" density (density of measurement areas on a common solid support). For example, in US Patent No. 5,445,934 (Affymax Technologies) oligonucleotide matrices with a density of more than 1000 features per square centimeter are described and claimed.

Desde hace poco se acumulan también las descripciones de matrices y con ello los procedimientos de detección realizados de modo similar para la determinación simultánea de una multiplicidad de proteínas, por ejemplo, en la patente US N.º 6.365.418 B1. Recently, matrix descriptions have also accumulated and with it the detection procedures performed similarly for the simultaneous determination of a multiplicity of proteins, for example, in US Patent No. 6,365,418 B1.

En las patentes para las así llamadas “micromatrices" de este tipo, tanto para la detección de ácidos nucleicos como también para otros biopolímeros, como por ejemplo, proteínas, se describe en cada caso, que una multiplicidad de diferentes elementos de reconocimiento específicos en áreas de medición diferenciadas para la generación de una matriz para la detección de un analito son inmovilizados y a continuación se pone en contacto la muestra a ensayar con los analitos presentes allí en una mezcla (eventualmente compleja). De acuerdo con las descripciones conocidas, se encuentran diferentes elementos de reconocimiento específicos en cada caso en una forma en lo posible muy pura en diferentes áreas de medición diferenciadas, de modo que en las áreas de medición con diferentes elementos de reconocimiento se unen en general diferentes analitos de la muestra. In the patents for the so-called "microarrays" of this type, both for the detection of nucleic acids and also for other biopolymers, such as proteins, it is described in each case that a multiplicity of different specific recognition elements in differentiated measurement areas for the generation of a matrix for The detection of an analyte is immobilized and then the sample to be tested is contacted with the analytes present there in a mixture (possibly complex). According to the known descriptions, different specific recognition elements are found in each case in a very pure way possible in different differentiated measurement areas, so that in the measurement areas with different recognition elements in general different Sample analytes.

Este tipo de ensayos conocidos requiere que los elementos de reconocimiento específicos a inmovilizar en forma en lo posible muy pura sean enriquecidos por medio de pasos de procesamiento en parte muy costosos y complicados. Como los distintos elementos de captación se diferencian más o menos fuertemente en sus propiedades fisicoquímicas (por ejemplo, en su polaridad), existen también diferencias correspondientes en las condiciones para una inmovilización óptima de estos elementos de reconocimiento, por ejemplo por adsorción o unión covalente, en áreas de medición diferenciadas sobre un soporte sólido común, eventualmente sobre una capa que brinda adhesividad aplicada encima. Por consiguiente, las condiciones de inmovilización (como por ejemplo, tipo de la capa de que brinda adhesividad) elegidas para la inmovilización de una multiplicidad de diferentes elementos de reconocimiento, difícilmente puedan representar simultáneamente un óptimo para todos los elementos de reconocimiento, sino simplemente un compromiso entre las propiedades de inmovilización de los diferentes elementos de reconocimiento. This type of known tests requires that the specific recognition elements to be immobilized in a very pure way possible be enriched by means of processing steps that are very expensive and complicated. As the different collection elements differ more or less strongly in their physicochemical properties (for example, in their polarity), there are also corresponding differences in the conditions for optimal immobilization of these recognition elements, for example by adsorption or covalent bonding, in differentiated measurement areas on a common solid support, possibly on a layer that provides adhesiveness applied on top. Therefore, the immobilization conditions (such as, for example, type of the layer that provides adhesiveness) chosen for the immobilization of a multiplicity of different recognition elements, can hardly simultaneously represent an optimum for all the recognition elements, but simply a compromise between the immobilization properties of the different recognition elements.

En este tipo de matrices es además desventajoso que para la detección de analitos en una multiplicidad de diferentes muestras, en general es necesaria la puesta a disposición de una cantidad correspondiente de matrices discretas de elementos de reconocimiento, a las cuales se alimentan las diferentes muestras, sobre portadores comunes o discretos. Para el ensayo de una multiplicidad de diferentes muestras esto significa el requerimiento de una gran cantidad de matrices discretas, cuya elaboración es relativamente costosa y complicada. In this type of matrix it is also disadvantageous that for the detection of analytes in a multiplicity of different samples, it is generally necessary to make available a corresponding amount of discrete matrices of recognition elements, to which the different samples are fed, about common or discrete carriers. For the testing of a multiplicity of different samples this means the requirement of a large number of discrete matrices, whose elaboration is relatively expensive and complicated.

Si bien se ha descrito que, por ejemplo, los híbridos formados por oligonucleótidos inmovilizados y contenidos en una muestra alimentada, complementarios a los oligonucleótidos inmovilizados, pueden ser disociados nuevamente bajo condiciones de disociación adecuadas pueden ser disociadas nuevamente con alta eficacia y así se puede regenerar una superficie de reconocimiento, sin embargo, no se puede garantizar una capacidad de regeneración del 100%. En el caso de los complejos de bioafinidad con proteínas existe frecuentemente incluso no existe una reversibilidad del paso de unión, es decir, no hay una posibilidad de regeneración de la superficie de reconocimiento. While it has been described that, for example, the hybrids formed by immobilized oligonucleotides and contained in a fed sample, complementary to the immobilized oligonucleotides, can be dissociated again under suitable dissociation conditions can be dissociated again with high efficiency and thus can be regenerated A recognition surface, however, cannot guarantee 100% regeneration capacity. In the case of bioaffinity complexes with proteins, there is often even no reversibility of the binding step, that is, there is no possibility of regeneration of the recognition surface.

Existe por lo tanto la necesidad de una estructura de matrices modificada, que posibilite ensayar una multiplicidad de muestras en una matriz sobre un portador común simultáneamente con respecto a los analitos contenidos en las muestras. Para ello sería conveniente aplicar, no los diferentes elementos de reconocimiento específicos, sino las muestras a ensayar directamente, es decir, no tratadas, o después de en lo posible pocos pasos de preparación en áreas de medición diferenciadas en una matriz sobre un portador. Una estructura de matriz como ésta se denominará a continuación “arquitectura de matriz invertida". There is therefore a need for a modified matrix structure, which makes it possible to test a multiplicity of samples in a matrix on a common carrier simultaneously with respect to the analytes contained in the samples. For this, it would be convenient to apply, not the different specific recognition elements, but the samples to be tested directly, that is, untreated, or after possible few preparation steps in differentiated measurement areas in a matrix on a carrier. An array structure like this will be referred to below as "inverted array architecture".

En la patente US N.º 6.316.267, se describe un procedimiento en el cual se aplican poliaminoácidos en una mezcla de muestras (en donde también se puede tratar evidentemente de una muestra compuesta compleja) por ejemplo, sobre una matriz de muestras sólida o casi sólida (“semisólida"). El paso de detección no se realiza sin embargo mediante un ensayo de bioafinidad, sino por coloración con una mezcla de reactivos, la que contiene determinados complejos metálicos mencionados en la patente. No se trata aquí de una detección específica de analitos. In US Patent No. 6,316,267, a process is described in which polyamino acids are applied in a mixture of samples (where a complex composite sample can obviously also be treated) for example, on a solid sample matrix or almost solid ("semi-solid"). However, the detection step is not carried out by means of a bioaffinity test, but by coloring with a mixture of reagents, which contains certain metal complexes mentioned in the patent. This is not a specific analyte detection here.

En la patente US 6.287.768, se describe un procedimiento, de acuerdo con el cual se aíslan diferentes moléculas de ARN a detectar a partir de una muestra biológica, se separan según el tamaño, se aplican sobre un soporte sólido y a continuación se detectan allí, por ejemplo, en un ensayo de hibridación por medio de la hibridación de polinucleótidos complementarios conocidos. De acuerdo con la descripción, las moléculas de ARN a detectar, aisladas de un organismo, puede o bien ser sometidos directamente a un procedimiento de detección adicional, cuando se encuentran en una alta concentración, o tienen que multiplicarse antes del procedimiento de detección propiamente dicho aún con procedimientos de multiplicación conocidos (por ejemplo, por medio de PCR, “Polymerase Chain Reaction"). Esto significa que con el procedimiento allí descripto, sin procedimientos adicionales de multiplicación, no es posible un análisis completo de las diferentes fracciones generadas. In US Patent 6,287,768, a process is described, according to which different RNA molecules to be detected are isolated from a biological sample, separated according to size, applied on a solid support and then detected there. , for example, in a hybridization assay by means of hybridization of known complementary polynucleotides. According to the description, the RNA molecules to be detected, isolated from an organism, can either be subjected directly to an additional detection procedure, when they are in a high concentration, or have to be multiplied before the detection procedure itself. even with known multiplication procedures (for example, by means of PCR, "Polymerase Chain Reaction"). This means that with the procedure described there, without additional multiplication procedures, a complete analysis of the different fractions generated is not possible.

Aún cuando el procedimiento propuesto en la patente US 6.287.768 abre la posibilidad, de determinar el ARN a partir de diferentes muestras simultáneamente, requiere todavía una serie de pasos de procesamiento de muestras complicados y costosos, y especialmente el aislamiento de la matriz de muestras biológica y una separación subsiguiente según el tamaño de las moléculas. Por cuanto el procedimiento reivindicado, el cual sólo se describe por el ejemplo del ARN, presupone como mínimo el aislamiento de la matriz de muestras original y la subsiguiente separación de los biopolímeros a detectar según su tamaño, es evidente, que estos, después de este paso de separación, antes del paso de detección, se encuentran en un medio menos complejo, claramente diferente de la matriz de muestras original (como, por ejemplo, sangre o suero). Even though the procedure proposed in US Patent 6,287,768 opens the possibility, of determining the RNA from different samples simultaneously, it still requires a series of complicated and expensive sample processing steps, and especially the isolation of the sample matrix biological and a subsequent separation according to the size of the molecules. As the claimed procedure, which is only described by the RNA example, presupposes at least the isolation of the original sample matrix and the subsequent separation of the biopolymers to be detected according to their size, it is evident that these, after this Separation step, before the detection step, is in a less complex medium, clearly different from the original sample matrix (such as blood or serum).

La sensibilidad de los procedimientos descritos previamente en el estado de la técnica evidentemente no es suficiente, para determinar una multiplicidad de analitos contenidos en una muestra con una “arquitectura de ensayo inversa" con un límite de detección suficiente. The sensitivity of the procedures previously described in the state of the art is obviously not sufficient, to determine a multiplicity of analytes contained in a sample with a "reverse test architecture " with a sufficient detection limit.

La excitación de los “componentes de detección" usados para la detección de los analitos (como por ejemplo, isótopos radioactivos o cromóforos con una adsorción y/o luminiscencia o fluorescencia características) y la selección de las señales de matrices del tipo mencionado se basa en ordenamientos y métodos de detección clásicos, por ejemplo, ópticos. Los métodos de medición clásicos, como por ejemplo, las mediciones de absorción o fluorescencia, se basan en general en la iluminación directa de un volumen de muestra en un recipiente de muestras The excitation of the "detection components" used for the detection of analytes (such as radioactive isotopes or chromophores with a characteristic adsorption and / or luminescence or fluorescence) and the selection of matrix signals of the aforementioned type is based on classical ordering and detection methods, for example Optical Classic measurement methods, such as absorption or fluorescence measurements, are generally based on the direct illumination of a sample volume in a sample container

o un campo de medición sobre una pared interior de un recipiente de muestras de una muestra líquida. Estos ordenamientos tienen la desventaja, de que además del volumen de excitación o de la superficie de excitación, dentro de la cual se debe generar una señal para la detección de un analito, en general una gran parte de la luz de excitación es captada por el ambiente circundante, lo que puede llevar a la generación desventajosa de señales de fondo de ruidos. or a measurement field on an inner wall of a sample container of a liquid sample. These arrangements have the disadvantage that in addition to the excitation volume or the excitation surface, within which a signal for the detection of an analyte must be generated, in general a large part of the excitation light is captured by the surrounding environment, which can lead to the disadvantageous generation of background noise signals.

Para alcanzar límites de detección más profundos se han desarrollado numerosos ordenamientos de medición, en los cuales la detección del analito se basa sobre su interrelación con el campo evanescente, el cual está conectado con la conducción de luz en un conductor óptico. Si se acopla una onda de luz en un conductor de ondas óptico, el cual está rodado de medios ópticamente más delgados, es decir, medios con un índice de refracción más bajo, entonces es conducida por reflexión total en las superficies límite de la capa conductora de ondas. En los medios ópticamente más delgados entra entonces una fracción de la luz conducida. Esta parte se denomina campo evanescente o campo amortiguado transversalmente. La intensidad del campo evanescente depende mucho del espesor de la capa conductora de ondas propiamente dicha así como de la relación de los índices de refracción de la capa conductora de ondas y de los medios que la rodean. En el caso de los conductores de ondas delgados, es decir, conductores de ondas con espesores de capas del mismo espesor o menor espesor que la longitud de onda a conducir, se pueden diferenciar modos discretos de la luz conducida. Los procedimientos de este tipo tienen la ventaja de que la interacción de la luz de excitación con el analito está limitada a la profundidad de penetración del campo evanescente en el medio adyacente, en el orden de magnitud de algunos cientos de nanómetros y se pueden evitar bastante las señales de ruido de la profundidad del medio. Las primeras disposiciones de medición de este tipo propuestas se basaban en conductores de ondas de una sola capa autoportantes, altamente multimodales, como por ejemplo fibras o plaquetas de plástico o vidrio transparente, con espesores de algunos cientos de micrómetros hasta varios milímetros. To reach deeper detection limits, numerous measurement systems have been developed, in which the detection of the analyte is based on its interrelation with the evanescent field, which is connected to the conduction of light in an optical conductor. If a light wave is coupled into an optical wave conductor, which is rolled by optically thinner media, that is, media with a lower refractive index, then it is conducted by total reflection on the boundary surfaces of the conductive layer of waves. A fraction of the conducted light then enters the optically thinner media. This part is called the evanescent field or transversely damped field. The intensity of the evanescent field is highly dependent on the thickness of the wave conductive layer itself as well as on the ratio of the refractive indices of the wave conducting layer and the surrounding media. In the case of thin wave conductors, that is, wave conductors with thicknesses of layers of the same thickness or less thickness than the wavelength to be conducted, discrete modes can be distinguished from the conducted light. Procedures of this type have the advantage that the interaction of the excitation light with the analyte is limited to the depth of penetration of the evanescent field in the adjacent medium, in the order of magnitude of a few hundred nanometers and can be quite avoided. noise signals from the depth of the medium. The first proposed measurement arrangements of this type were based on self-supporting, highly multimodal single-layer wave conductors, such as plastic or transparent glass or platelet fibers, with thicknesses of a few hundred micrometers to several millimeters.

Para mejorar la sensibilidad y al mismo tiempo poder simplificar la elaboración en la fabricación en masa se propusieron conductores de onda de capa delgada planares. Un conductor de onda de capa delgada planar está compuesto en el caso más sencillo por un sistema de tres capas: material portante, capa conductora de ondas, superstrat (o muestra a ensayar), en donde la capa conductora de ondas posee el índice de refracción más alto. To improve the sensitivity and at the same time to simplify the processing in mass manufacturing, planar thin-layer wave conductors were proposed. A planar thin-layer wave conductor is in the simplest case composed of a three-layer system: carrier material, wave conductive layer, superstrat (or sample to be tested), where the wave conducting layer has the refractive index higher.

Se conocen diversos procedimientos para el acoplamiento de luz de excitación en un conductor de onda planar. Los procedimientos usados anteriormente se basaban en acoplamiento de superficie frontal o acoplamiento de prisma, en donde para la disminución de los reflejos como consecuencia de espacios de aire se aplica en general un líquido entre el prisma y el conductor de ondas. Estos dos métodos son adecuados sobre todo en conexión con conductores de ondas de espesor de capa relativamente grande, es decir, especialmente conductores de ondas autoportantes, así como con un índice de refracción del conductor de ondas de claramente menos de 2. Para el acoplamiento de la luz de excitación en capas conductoras de ondas muy delgadas, con alto índice de refracción, un método mucho más elegante en comparación es el uso de acoplamientos de rejilla. Various methods for coupling excitation light in a planar wave conductor are known. The procedures used above were based on frontal surface coupling or prism coupling, where a liquid between the prism and the wave conductor is generally applied for the reduction of the reflections as a result of air spaces. These two methods are suitable especially in connection with relatively large layer thickness wave conductors, that is, especially self-supporting wave conductors, as well as with a refractive index of the wave conductor of clearly less than 2. For coupling of the excitation light in very thin wave conductive layers, with high refractive index, a much more elegant method in comparison is the use of grid couplings.

Se pueden distinguir diversos métodos para la detección de analitos en el campo evanescente de ondas de luz conducidas en conductores de ondas en capas ópticos. En base al principio de medición usado se puede diferenciar por ejemplo, entre métodos de fluorescencia o luminiscencia general por un lado y métodos de refracción por el otro. Aquí se pueden incluir procedimientos para la generación de una resonancia de plasmón superficial en una capa metálica delgada sobre una capa dieléctrica con un índice de refracción más bajo en el grupo de los métodos de refracción, en tanto sirva como base para la determinación de la magnitud de medición el ángulo de resonancia de la luz de excitación irradiada para la generación de la resonancia de plasmón superficial. Pero la resonancia de plasmón superficial también e puede usar para intensificar una luminiscencia o para mejorar la relación entre señal y fondo en una medición de luminiscencia. Las condiciones para la generación de una resonancia de plasmón superficial así como también para la combinación con mediciones de luminiscencia y con estructuras conductoras de ondas se describen varias veces en la literatura, por ejemplo en las patentes US–P 5.478.755, US–P 5.841.143, US–P 5.006.716 y US–P 4.649.280. Various methods can be distinguished for the detection of analytes in the evanescent field of light waves conducted in wave conductors in optical layers. Based on the measurement principle used, it can be distinguished, for example, between fluorescence or general luminescence methods on the one hand and refraction methods on the other. Here you can include procedures for generating a surface plasmon resonance in a thin metal layer on a dielectric layer with a lower refractive index in the refractive methods group, as long as it serves as a basis for determining the magnitude for measuring the resonance angle of the irradiated excitation light for the generation of surface plasmon resonance. But surface plasmon resonance can also be used to intensify a luminescence or to improve the relationship between signal and background in a luminescence measurement. The conditions for the generation of a surface plasmon resonance as well as for the combination with luminescence measurements and with conductive wave structures are described several times in the literature, for example in US-P 5,478,755, US-P 5,841,143, US-P 5,006,716 and US-P 4,649,280.

Con el término “luminiscencia" se denomina en esta solicitud la emisión espontánea de fotones en el rango ultravioleta a infrarrojo después de la excitación óptica o no óptica, como por ejemplo, eléctrica o química o bioquímica o térmica. Por ejemplo, la quimioluminiscencia, la bioluminiscencia, la electroluminiscencia y especialmente la fluorescencia y la fosforescencia están comprendidas en el concepto de “luminiscencia". With the term “luminescence " The spontaneous emission of photons in the ultraviolet to infrared range after optical or non-optical excitation, such as electrical or chemical or biochemical or thermal, is called in this application. For example, chemiluminescence, bioluminescence, electroluminescence and especially fluorescence and phosphorescence are included in the concept of "luminescence".

En los métodos de medición por refracción se usa la modificación del así llamado índice de refracción efectivo en base a la adsorción o desorción molecular sobre el conductor de ondas para la detección del analito. Esta modificación del índice de refracción efectivo se determina, en el caso de los sensores de acopladores de rejilla, a partir de la modificación del ángulo de acoplamiento para el acoplamiento o desacoplamiento de luz en o del sensor de acoplador de rejilla y en el caso de sensores interferométricos a partir de la modificación de la diferencia de fases entre la luz de medición conducida entre un brazo sensor y un brazo de referencia del interferómetro. In the methods of measurement by refraction, the modification of the so-called effective refractive index is used based on molecular adsorption or desorption on the wave conductor for the detection of the analyte. This modification of the effective refractive index is determined, in the case of grid coupler sensors, from the modification of the coupling angle for the coupling or uncoupling of light in or from the grid coupler sensor and in the case of interferometric sensors from the modification of the phase difference between the measurement light conducted between a sensor arm and an interferometer reference arm.

Los métodos de refracción mencionados tienen la ventaja de que se pueden emplear sin la utilización de moléculas de marcación adicionales, las así llamadas marcas moleculares. Las desventaja de estos métodos libres de marcas es sin embargo, que los límites de detección que se obtienen con estos, debido a la reducida selectividad del principio de medición, están limitados en función del peso molecular del analito a rangos de concentración pico– hasta nanomolares, lo que para muchas aplicaciones del análisis de trazas moderno, por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, no es suficiente. The aforementioned methods of refraction have the advantage that they can be used without the use of additional labeling molecules, the so-called molecular marks. The disadvantage of these brand-free methods is, however, that the detection limits that are obtained with these, due to the reduced selectivity of the measurement principle, are limited depending on the molecular weight of the analyte at ranges of peak concentration - up to nanomolar , which for many applications of modern trace analysis, for example, for diagnostic applications, is not enough.

Para alcanzar límites de detección aún más profundos parecen más adecuados los métodos que se basan en luminiscencia debido a su mayor selectividad de la generación de señales. Para ello la excitación de luminiscencia está limitada a la profundidad de penetración del campo evanescente en el medio ópticamente más delgado, es decir, al medio circundante inmediato del área conductora de ondas con una profundidad de penetración en un orden de magnitud de algunos cientos de nanómetros en el medio. Este principio se denomina excitación de luminiscencia evanescente. To reach even deeper detection limits, methods based on luminescence seem more suitable due to their greater selectivity of signal generation. For this, the luminescence excitation is limited to the depth of penetration of the evanescent field in the optically thinner medium, that is, to the immediate surrounding medium of the wave conducting area with a penetration depth in an order of magnitude of a few hundred nanometers in the middle. This principle is called evanescent luminescence excitation.

Por medio de conductores de ondas de capa delgada de alto índice de refracción, en combinación con la detección de luminiscencia, basada en una película conductora de ondas delgada de sólo algunos cientos de nanómetros sobre un material portante transparente, se pudo aumentar mucho en los últimos años la sensibilidad. Por ejemplo, en la WO 95/33197 se describe un método, en el cual la luz de excitación se acopla a través de una rejilla de relieve como elemento óptico difractivo en la película conductora de ondas. La luminiscencia irradiada en forma isotrópica en la profundidad de penetración de las sustancias capaces de luminiscencia que se encuentran en el campo evanescente se mide por medio de dispositivos de medición adecuados, como por ejemplo, fotodiodos, fotomultiplicadores o cámaras CCD. También es posible desacoplar y medir la parte reacoplada al conductor de ondas de la radiación excitada evanescente a través de un elemento óptico difractivo, por ejemplo, una rejilla. Este método se describe, por ejemplo, en la WO 95/33198. By means of thin-layer wave conductors of high refractive index, in combination with the detection of luminescence, based on a thin wave conductive film of only a few hundred nanometers on a transparent carrier material, much could be increased in recent years sensitivity. For example, in WO 95/33197 a method is described, in which the excitation light is coupled through a relief grid as a diffractive optical element in the wave conducting film. The luminescence irradiated in an isotropic way at the depth of penetration of the substances capable of luminescence that are in the evanescent field is measured by means of suitable measuring devices, such as photodiodes, photomultipliers or CCD cameras. It is also possible to decouple and measure the re-coupled part to the wave conductor of the evanescent excited radiation through a diffractive optical element, for example, a grid. This method is described, for example, in WO 95/33198.

En los últimos años se han conocido desarrollos ulteriores de conductores de ondas de capa delgada planares como plataformas sensoras para “micromatrices", por ejemplo, en las solicitudes de patentes internacionales WO 01/13096, WO 01/43875, parcialmente en combinación con estructuras fluídicas adaptadas correspondientemente. Estas solicitudes de patentes se incorporan de este modo en su totalidad como parte integrante de la presente solicitud. En el documento WO 01/79821 se describe una estructura de conductor de ondas de capa delgada, que posibilita una excitación de dos fotones en la superficie del conductor de ondas. En el documento WO 01/88511 se describen una estructura de conductor de ondas de rejilla y un procedimiento de medición realizado con ésta, los que hacen posible un procedimiento que brinda imágenes para la determinación del analito con ayuda de un método de medición refractivo. Las dos solicitudes de patentes se incorporan a la presente igualmente como parte integrante de la presente solicitud.– Las dos configuraciones tienen en común que elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos conocidos son inmovilizados para la detección de una multiplicidad de analitos en áreas de medición diferenciadas de posición conocida sobre el sustrato portante, como componentes de una o varias matrices de áreas de medición. In recent years, further developments of planar thin-layer wave conductors have been known as sensor platforms for "microarrays", for example, in international patent applications WO 01/13096, WO 01/43875, partially in combination with fluid structures correspondingly adapted. These patent applications are thus incorporated in their entirety as an integral part of this application. In WO 01/79821 a thin layer wave conductor structure is described, which enables two photons to be excited on the surface of the wave conductor. WO 01/88511 describes a grid wave conductor structure and a measurement procedure performed with it, which make possible a procedure that provides images for analyte determination with the aid of a refractive measurement method. The two patent applications are hereby incorporated as an integral part of the present application. - The two configurations have in common that known biological or biochemical or synthetic recognition elements are immobilized for the detection of a multiplicity of analytes in measurement areas. differentiated from known position on the supporting substrate, as components of one or several matrices of measurement areas.

Se halló sorprendentemente que con una selección adecuada de parámetros fisicoquímicos (como espesores de capa, índices de refracción de las capas integrantes) de una plataforma sensora del campo evanescente, como consecuencia de la alta intensidad de luz de excitación en la superficie y la limitación simultánea de este fuerte campo de excitación a la profundidad de penetración del campo evanescente en los medios adyacentes, la sensibilidad que se puede alcanzar para la detección de interacciones moleculares en la superficie de una plataforma sensora de campo evanescente es suficientemente alta para analizar una multiplicidad de muestras, eventualmente después de fraccionamiento y eventualmente diluciones adicionales de estas muestras o fracciones a los analitos allí contenidos, sin pasos de procedimiento adicionales para un aislamiento de la matriz de muestra restante o una multiplicación de los analitos a detectar (con respecto a su cantidad), después de la aplicación directa de estas fracciones o de diluciones de estas fracciones sobre dicha plataforma sensora de campo evanescente. De este modo se proporciona un procedimiento sencillo con una “arquitectura de matriz invertida que hace posible determinar una multiplicidad de analitos en una muestra, sin modificaciones ulteriores de la composición molecular relativa de la muestra después de un paso de fraccionamiento o separación. It was surprisingly found that with an adequate selection of physicochemical parameters (such as layer thicknesses, refractive indexes of the integral layers) of an evanescent field sensing platform, as a consequence of the high intensity of excitation light on the surface and simultaneous limitation From this strong excitation field to the penetration depth of the evanescent field in the adjacent media, the sensitivity that can be achieved for the detection of molecular interactions on the surface of an evanescent field sensing platform is high enough to analyze a multiplicity of samples , possibly after fractionation and possibly additional dilutions of these samples or fractions to the analytes contained therein, without additional procedural steps for an isolation of the remaining sample matrix or a multiplication of the analytes to be detected (with respect to their quantity), after application Direct n of these fractions or dilutions of these fractions on said evanescent field sensing platform. In this way a simple procedure is provided with an "inverted matrix architecture that makes it possible to determine a multiplicity of analytes in a sample, without further modifications of the relative molecular composition of the sample after a fractionation or separation step.

En las muestras a ensayar se puede tratar, por ejemplo (véase también más abajo) de una o varias células que fueron seleccionadas antes de una cantidad más grande de células, por ejemplo, por centrifugación, filtración o por “Laser Capture Microdissection". In the samples to be tested, for example (see also below), one or more cells that were selected before a larger number of cells may be treated, for example, by centrifugation, filtration or by "Laser Capture Microdissection".

A continuación la referencia a una (única) célula se refiere en los pasos de tratamiento de pruebas a realizar también a una multiplicidad de células, en tanto no se indique expresamente de otro modo. Asimismo la referencia a una “muestra" comprende también a sus fracciones preparadas con un procedimiento de separación adecuado. In the following, the reference to a (single) cell refers in the steps of treatment of tests to also be carried out to a multiplicity of cells, as long as it is not expressly indicated otherwise. Also the reference to a “sample " it also comprises its fractions prepared with a suitable separation procedure.

En un primer paso de procesamiento, necesario en general para pasos de análisis ulteriores se puede lisar la célula. El lisado puede estar disuelto en un solvente adecuado, por ejemplo, una solución búfer, y puede contener mezclas de aditivos conocidos, por ejemplo, estabilizantes como inhibidores de enzimas, para evitar una degradación de biopolímeros allí contenidos. Una muestra también puede contener aditivos de compuestos del mismo tipo de concentraciones conocidas (como estándares) como el analitos a detectar, comparable con una “spike" de muestras en la cromatografía. Tales aditivos pueden servir, por ejemplo, para fines de calibración. Las muestras pueden contener además aditivos de compuestos similares a la matriz de muestras, pero diferentes de los analitos a detectar, como por ejemplo, albúmina sérica bovina (BSA), los que pueden servir, por ejemplo, para el ajuste controlado del espesor de capa superficial de moléculas de analitos inmovilizadas en un rango de medición. Los analitos contenidos en las muestras o sus fracciones o las diluciones de dichas muestras o fracciones, es decir, especialmente biopolímeros, como por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas, pueden encontrarse en forma nativa o desnaturalizada, después de tratamiento, por ejemplo, con urea o tensioactivos (por ejemplo, SDS). In a first processing step, necessary in general for subsequent analysis steps, the cell can be lysed. The lysate may be dissolved in a suitable solvent, for example, a buffer solution, and may contain mixtures of known additives, for example, stabilizers such as enzyme inhibitors, to prevent degradation of biopolymers contained therein. A sample may also contain additives of compounds of the same type of known concentrations (as standards) as the analytes to be detected, comparable to a "spike". of samples in chromatography. Such additives may serve, for example, for calibration purposes. The samples may also contain additives of compounds similar to the sample matrix, but different from the analytes to be detected, such as, for example, bovine serum albumin (BSA), which can be used, for example, for the controlled adjustment of the layer thickness surface of immobilized analyte molecules in a measurement range. The analytes contained in the samples or their fractions or the dilutions of said samples or fractions, that is, especially biopolymers, such as nucleic acids or proteins, can be found natively or denatured, after treatment, for example, with urea or surfactants (for example, SDS).

Preferentemente, los analitos contenidos en las muestras o sus fracciones o en las diluciones de dichas muestras o fracciones, es decir, especialmente biopolímeros, como por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas, se encuentran después del tratamiento con urea en forma desnaturalizada, en donde los epítopos de estos analitos se encuentran libremente accesibles para la unión de sus respectivas sustancias de detección, por ejemplo, de anticuerpos. Esto se logra por medio de la destrucción de la estructura terciaria o cuaternaria como consecuencia del tratamiento con urea. Preferably, the analytes contained in the samples or their fractions or in the dilutions of said samples or fractions, that is, especially biopolymers, such as, for example, nucleic acids or proteins, are found after treatment with urea in denatured form, where the Epitopes of these analytes are freely accessible for the binding of their respective detection substances, for example, of antibodies. This is achieved through the destruction of the tertiary or quaternary structure as a result of urea treatment.

Sorprendentemente, la sensibilidad del procedimiento de acuerdo con la invención es tan grande, que una muestra puede ser más diluida aún antes o después del fraccionamiento, y los compuestos contenidos en la mezcla, a pesar de una concentración en parte muy baja y una cantidad disponible correspondientemente más reducida, en un rango de medición individual, aún puede ser detectada con gran exactitud, lo que no es posible con los métodos usuales conocidos. Surprisingly, the sensitivity of the process according to the invention is so great that a sample can be diluted even before or after fractionation, and the compounds contained in the mixture, despite a very low concentration and an available amount. correspondingly smaller, in an individual measurement range, it can still be detected with great accuracy, which is not possible with the usual known methods.

Como “analito" se denomina en el marco de la presente invención a una especie molecular tal que, con ayuda de una sustancia de detección usada para ello, se puede diferenciar de otros compuestos contenidos en la muestra a analizar, y unir. Si se realiza, por ejemplo, la unión de una sustancia a detectar correspondiente sólo a la forma fosforilada, pero no a la no fosforilada de un compuesto o especie a detectar, entonces de acuerdo con esta definición las dos formas de este compuesto o especie representan dos analitos diferentes. Si algunos compuestos o especies, cuando están fosforiladas son reconocidos o se unen a una sustancia de detección correspondiente, bajo esta condición, los compuestos o especies fosforilados correspondientes, representan conjuntamente un analito. Los asociados de unión específicos como sustancias de detección de un analito de acuerdo con esta definición, pueden ser elegidos, por ejemplo, de tal modo que reconozcan exclusivamente a la forma fosforilada o la forma glicosilada (o correspondientemente, la forma no fosforilada o no glicosilada) de un compuesto a detectar, y se unan a ésta. La actividad de un camino de señales biológico en una célula o un organismo puede correlacionarse con la parte de los compuestos fosforilados o glicosilados (dependiendo de la naturaleza del camino de señales), que dirigen este camino de señales. La parte relativa de la forma fosforilada o glicosilada en la cantidad total, es decir, el cociente de la cantidad de un compuesto en su forma fosforilada o glicosilada y del cantidad total de este compuesto en forma fosforilada y no fosforilada o en forma glicosilada y no glicosilada, en una muestra se denomina a continuación grado de fosforilación o grado de glicosilación de este compuesto en la muestra. El grado de fosforilación y el grado de glicosilación pueden ser resumidos bajo el concepto general del grado de activación de un compuesto, cuyo valor numérico, por ejemplo, corresponde al grado de fosforilación o al grado de glicosilación. El grado de activación de un compuesto puede indicar también otras formas químicamente modificadas de un compuesto. Like "analyte" In the context of the present invention, a molecular species is called such that, with the aid of a detection substance used for this, it can be distinguished from other compounds contained in the sample to be analyzed, and bound. If, for example, the binding of a substance to be detected corresponds only to the phosphorylated form, but not to the non-phosphorylated form of a compound or species to be detected, then according to this definition the two forms of this compound or species represent Two different analytes. If some compounds or species, when phosphorylated, are recognized or bind to a corresponding detection substance, under this condition, the corresponding phosphorylated compounds or species together represent an analyte. Specific binding partners as analyte detection substances according to this definition can be chosen, for example, in such a way that they exclusively recognize the phosphorylated form or the glycosylated form (or correspondingly, the non-phosphorylated or non-glycosylated form ) of a compound to be detected, and join it. The activity of a biological signal pathway in a cell or an organism can be correlated with the part of phosphorylated or glycosylated compounds (depending on the nature of the signal pathway), which direct this signal pathway. The relative part of the phosphorylated or glycosylated form in the total amount, that is, the ratio of the amount of a compound in its phosphorylated or glycosylated form and of the total amount of this compound in phosphorylated and non-phosphorylated form or in glycosylated and non-glycosylated form. glycosylated, in a sample it is referred to below as the degree of phosphorylation or the degree of glycosylation of this compound in the sample. The degree of phosphorylation and the degree of glycosylation can be summarized under the general concept of the degree of activation of a compound, whose numerical value, for example, corresponds to the degree of phosphorylation or the degree of glycosylation. The degree of activation of a compound may also indicate other chemically modified forms of a compound.

Los asociados de unión específicos como sustancias de detección también pueden ser seleccionados de tal modo, que sólo se unan a un compuesto a detectar cuando éste se encuentre en una estructura tridimensional determinada. Por ejemplo, muchos anticuerpos reconocen y se unen sólo a sectores parciales especiales (epítopos) de una sustancia a detectar con una estructura tridimensional especial. Según el estado de conformación del compuesto a detectar correspondiente, estos sectores parciales (epítopos) pueden estar accesibles u ocultos para la unión de la sustancia a detectar correspondiente. Los asociados de unión específicos pueden ser elegidos, sin embargo, también de tal modo que se unen a sectores del compuesto a detectar, cuya accesibilidad es independiente de la estructura tridimensional de ese compuesto. Por medio del uso de sustancias de detección elegidas correspondientemente es posible, por lo tanto, determinar una parte relativa de la cantidad total en un compuesto a detectar en una muestra, el que presente un estado de conformación específico. Specific binding partners as detection substances can also be selected in such a way that they only bind a compound to be detected when it is in a given three-dimensional structure. For example, many antibodies recognize and bind only to special partial sectors (epitopes) of a substance to be detected with a special three-dimensional structure. Depending on the conformation state of the corresponding compound to be detected, these partial sectors (epitopes) may be accessible or hidden for the binding of the corresponding substance to be detected. Specific binding partners can, however, be chosen in such a way that they bind to sectors of the compound to be detected, whose accessibility is independent of the three-dimensional structure of that compound. By means of the use of correspondingly chosen detection substances it is therefore possible to determine a relative part of the total amount in a compound to be detected in a sample, which has a specific conformation state.

Como “biológicamente relevante" deben denominarse a aquellos compuestos que son conocidos como participantes en reacciones de unión específicas a moléculas o compuestos de origen biológico o a sus análogos obtenidos por síntesis. Ejemplos de compuestos “biológicamente relevantes" son por lo tanto no sólo proteínas naturales, como anticuerpos o receptores, o ácidos nucleicos, sino también sus asociados de unión, como por ejemplo, antígenos, los que pueden ser también compuestos sintéticos, también de peso molecular muy bajo. As "biologically relevant" those compounds that are known as participants in specific binding reactions to molecules or compounds of biological origin or their analogues obtained by synthesis should be referred to. Examples of "biologically relevant" compounds they are therefore not only natural proteins, such as antibodies or receptors, or nucleic acids, but also their binding partners, such as antigens, which can also be synthetic compounds, also of very low molecular weight.

En el sentido de la presente invención, las áreas de medición diferenciadas o separadas espacialmente deben ser definidas por la superficie cerrada, que ocupan los asociados de unión allí inmovilizados para la detección de uno o varios analitos en una o varias muestras en un ensayo de bioafinidad. Estas superficies pueden tener una geometría cualquiera, por ejemplo, la forma de círculos, cuadrados, triángulos, elipses, etc. Within the meaning of the present invention, the differentiated or spatially separated measurement areas must be defined by the closed surface, which the binding partners there immobilized for the detection of one or more analytes in one or more samples in a bioaffinity test . These surfaces can have any geometry, for example, the shape of circles, squares, triangles, ellipses, etc.

Diferentes áreas de medición de este tipo pueden comprender, por ejemplo, diferentes muestras o diferentes fracciones de una sola muestra separadas, o pueden ser fracciones de diferentes muestras o también una multiplicidad de diferentes diluciones de fracciones. La separación en fracciones se puede realizar con cualquier procedimiento de separación conocido, como por ejemplo, centrifugación, cromatografía líquida (LC), HPLC, cromatografía de capa fina, cromatografía en gel, electroforesis capilar, etc. o por combinación de estos procedimientos de separación. El material para las áreas de medición diferenciadas también puede ser puesto a disposición por micropreparados selectivos, como por ejemplo, la separación selectiva de células individuales de un conjunto de células por “Laser Capture Micro Dissection". Different measurement areas of this type may comprise, for example, different samples or different fractions of a single separate sample, or they may be fractions of different samples or also a multiplicity of different dilutions of fractions. Fraction separation can be performed with any known separation procedure, such as centrifugation, liquid chromatography (LC), HPLC, thin layer chromatography, gel chromatography, capillary electrophoresis, etc. or by combination of these separation procedures. The material for the differentiated measurement areas can also be made available by selective micropreparations, such as the selective separation of individual cells from a set of cells by "Laser Capture Micro Dissection".

En general, la muestra original con los analitos a detectar contenidos en ésta, puede ser elegida entre el grupo de extractos de células sanas o enfermas (por ejemplo, de extractos celulares humanos, animales, bacterianos o vegetales), extractos de tejido animal o humano, como por ejemplo, tejido de órganos, de la piel, del cabello o de los huesos, o de tejido vegetal, así como también de líquidos corporales o sus componentes, como por ejemplo, sangre, suero o plasma, líquidos de las articulaciones, líquido de lágrimas, orina, saliva, líquido de los tejidos, linfa. Una muestra puede ser elegida especialmente también del grupo que comprende extractos de células estimuladas o no tratadas y extractos de tejido sano o enfermo. In general, the original sample with the analytes to be detected in it can be chosen from the group of healthy or diseased cell extracts (for example, from human, animal, bacterial or plant cell extracts), animal or human tissue extracts , for example, tissue of organs, skin, hair or bones, or plant tissue, as well as body fluids or their components, such as blood, serum or plasma, joint fluids, tear fluid, urine, saliva, tissue fluid, lymph. A sample may also be chosen especially from the group comprising extracts from stimulated or untreated cells and extracts from healthy or diseased tissue.

Correspondientemente, aparte de por “Laser Capture Micro Dissection", una “muestra original" de este tipo también se puede extraer de un organismo o conjunto de tejidos o células por medio de un método del grupo de cortes de tejidos, biopsias. Correspondingly, apart from "Laser Capture Micro Dissection", an "original sample" of this type can also be extracted from an organism or set of tissues or cells by means of a method of the group of tissue cuts, biopsies.

En un área de medición se inmovilizan por lo tanto en general varios asociados de unión diferentes al mismo tiempo. Generalmente se encontrará una multiplicidad, es decir, varios cientos o incluso varios miles de analitos diferentes en un área de medición de analitos inmovilizados. In a measurement area, therefore, several different binding partners are generally immobilized at the same time. Generally a multiplicity will be found, that is, several hundred or even several thousand different analytes in a measurement area of immobilized analytes.

El primer objeto de la invención es un procedimiento para el análisis de una multiplicidad de muestras en lo relativo a los compuestos en las muestras, biológicamente relevantes como participantes en reacciones de unión específicas, como analitos, caracterizado porque The first object of the invention is a method for the analysis of a multiplicity of samples in relation to the compounds in the samples, biologically relevant as participants in specific binding reactions, such as analytes, characterized in that

El procedimiento de separación para la separación de una muestra en dichas fracciones puede ser elegido entre el grupo de procedimientos formado por centrifugación, HPLC y micro–HPLC (“High Pressure Liquid Chromatography") por medio del método de cromatografía de “Fase Normal", de “Fase Inversa", de intercambio de iones o de interacción hidrófoba (HIC), “Size Exclusion Chromatography", cromatografía en gel, electroforesis, electroforesis capilar, electrocromatografía, “Free–Flow Electrophoresis", etc. The separation procedure for the separation of a sample in said fractions can be chosen from the group of procedures formed by centrifugation, HPLC and micro-HPLC ("High Pressure Liquid Chromatography") by means of the "Normal Phase" chromatography method. from "Inverse Phase", ion exchange or hydrophobic interaction (HIC), "Size Exclusion Chromatography", gel chromatography, electrophoresis, capillary electrophoresis, electrochromatography, "Free-Flow Electrophoresis", etc.

El procedimiento de acuerdo con la invención se caracteriza por una sensibilidad tan grande que es posible que una muestra o una fracción de una muestra sea diluida antes de la aplicación sobre dicha plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido, por al menos un factor de 10. Incluso es posible diluir una muestra o una fracción de una muestra a ensayar por un factor de 30 o 100 y a pesar de esto, detectar en forma cuantitativa una multiplicidad de analitos en un rango de medición que es generado por la aplicación de una muestra como ésta fuertemente diluida o su fracción. The process according to the invention is characterized by a sensitivity so great that it is possible for a sample or a fraction of a sample to be diluted before application on said evanescent field sensing platform as a solid support, by at least a factor of 10. It is even possible to dilute a sample or a fraction of a sample to be tested by a factor of 30 or 100 and despite this, quantitatively detect a multiplicity of analytes in a measurement range that is generated by the application of a sample such as this strongly diluted or its fraction.

A continuación se resumirán las muestras o sus fracciones a aplicar en áreas de medición diferenciadas y las diluciones a aplicar de muestras o fracciones de muestras, bajo el término “muestras de inmovilización". The samples or their fractions to be applied in differentiated measurement areas and the dilutions to be applied of samples or sample fractions will be summarized below, under the term "immobilization samples".

Las muestras a analizar con los analitos a detectar contenidos en éstas, eventualmente después de un fraccionamiento pueden ser seleccionadas entre el grupo de extractos de células sanas o enfermas, (por ejemplo, de extractos celulares humanos, animales, bacterianos o vegetales), extractos de tejido animal o humano, como por ejemplo tejido de órganos, de la piel, del cabello o de los huesos, o de tejido vegetal, así como de líquidos corporales o sus componentes, como por ejemplo, sangre, suero o plasma, líquidos de las articulaciones, líquido de lágrimas, orina, saliva, líquido de tejidos, linfa. The samples to be analyzed with the analytes to be detected in them, possibly after a fractionation, can be selected from the group of healthy or diseased cell extracts, (for example, from human, animal, bacterial or plant cell extracts), extracts from animal or human tissue, such as organ, skin, hair or bone tissue, or plant tissue, as well as body fluids or their components, such as blood, serum or plasma, body fluids joints, tear fluid, urine, saliva, tissue fluid, lymph.

A efectos de asegurar una óptima accesibilidad de los analitos inmovilizados en las áreas de medición como primera multiplicidad de asociados de unión para las sustancias de detección a ser puestos en contacto con los mismos, es ventajoso que el material de una de las “muestras de inmovilización” a ser aplicadas en un área de medición tenga una dimensión igual o menor de lo que se requiere para la configuración de una monocapa sobre la plataforma sensora del campo evanescente como soporte sólido. Es posible mejorar la accesibilidad en mayor grado aún, disponiendo que una capa de agente de adherencia, anteriormente aplicada (como se describe más adelante en la presente) conduzca a una inmovilización orientada, para lo cual por ejemplo se inmovilizan los anticuerpos contenidos en la muestra unida en su parte Fc, de manera tal que sus epítopos de unión específicos sean accesibles. In order to ensure optimum accessibility of the immobilized analytes in the measurement areas as the first multiplicity of binding partners for the detection substances to be contacted therewith, it is advantageous that the material of one of the “immobilization samples "To be applied in a measurement area having a dimension equal or smaller than what is required for the configuration of a monolayer on the sensor platform of the evanescent field as a solid support. It is possible to improve accessibility to a greater extent, by providing that a layer of adhesion agent, previously applied (as described hereinafter) leads to an oriented immobilization, for which for example the antibodies contained in the sample are immobilized joined in its part Fc, so that its specific binding epitopes are accessible.

Debido a la elevada sensibilidad del procedimiento conforme a la invención es posible analizar también volúmenes y cantidades aplicadas reducidos, con una elevada exactitud. Al respecto, bajo el concepto "cantidad de muestra" debe entenderse la cantidad total, que se aplica en una área de medición discreta. A título de ejemplo una "muestra de inmovilización" puede abarcar el material de menos de 20.000 células. Una "muestra de inmovilización" puede aún abarcar el material de menos de 1.000 células. La cantidad requerida de muestra puede abarcar aún el material de menos de 100 células, o aún de solamente 1 a 10 células, a pesar de lo cual el análisis puede hacerse de manera fiable. El material que se corresponde al contenido de una célula, también ha ser designado como "equivalente de célula". La necesidad de una cantidad tan pequeña para un análisis de equivalente celular está dada cuando en el caso de los analitos a ser detectados se trata de materiales contenidos que se presentan en una concentración relativamente elevada. Por otra parte es posible que una "muestra de inmovilización" tenga un volumen de menos de 1 µl. Una "muestra de inmovilización" hasta puede tener un volumen de menos de 10 nl o aún inferior, de 1 nl. Due to the high sensitivity of the process according to the invention it is also possible to analyze small volumes and applied quantities, with high accuracy. In this regard, under the concept "quantity of sample" The total quantity, which is applied in a discrete measurement area, must be understood. As an example, an "immobilization sample" It can cover the material of less than 20,000 cells. A "sample of immobilization" It can still cover the material of less than 1,000 cells. The required amount of sample may still cover the material of less than 100 cells, or even only 1 to 10 cells, despite which the analysis can be done reliably. The material that corresponds to the content of a cell must also be designated as "equivalent of cell". The need for such a small amount for a cell equivalent analysis is given when in the case of the analytes to be detected it is a matter of contained materials that are presented in a relatively high concentration. On the other hand it is possible that a "sample of immobilization" have a volume of less than 1 µl. A "sample of immobilization" it can even have a volume of less than 10 nl or even less, of 1 nl.

El procedimiento conforme a la invención permite que se determinen las cantidades totales contenidas en una "muestra de inmovilización" de uno o más compuestos en forma de analitos, como suma de su presencia en forma fosforilada o no fosforilada y/o en forma glicosilada y/o no glicosilada. Es preferible que se determinen las cantidades contenidas en una "muestra de inmovilización", de uno o varios compuestos como analitos, en cada caso antes de su presencia en forma fosforilada y/o no fosforilada y/o glicosilada y/o no glicosilada, para una o más formas mencionadas. The method according to the invention allows the total amounts contained in a "immobilization sample" to be determined. of one or more compounds in the form of analytes, as a sum of their presence in phosphorylated or non-phosphorylated form and / or in glycosylated and / or non-glycosylated form. It is preferable that the amounts contained in an "immobilization sample" of one or more compounds as analytes are determined, in each case before their presence in phosphorylated and / or non-phosphorylated and / or glycosylated and / or non-glycosylated form, for one or more mentioned ways.

El procedimiento conforme a la invención permite determinar uno o más analitos contenidos en una "muestra de inmovilización" en función de la definición anteriormente dada, y del grado de activación. En especial, mediante el proceso mencionado anteriormente es posible determinar el grado de fosforilación y/o del grado de glicosilación de uno o varios analitos contenidos en una "muestra de inmovilización". Además, como característica el procedimiento conforme a la invención dispone debido a su elevada sensibilidad y elevada exactitud y reproducibilidad, y en especial gracias a una multiplicidad de métodos de referencia y de calibración, independientes entre sí, aplicables simultáneamente o a título de alternativa, se detectan diferencias de menos de 20 %, preferentemente de menos de 10 %, entre las cantidades relativas en una "muestra de inmovilización" y en una o más muestras de comparación, de uno o más compuestos en forma fosforilada y/o no fosforilada y/o glicosiladas y/o no glicosilada como analitos, para una o más formas mencionadas. The method according to the invention allows one or more analytes contained in a "immobilization sample" to be determined. depending on the definition given above, and the degree of activation. In particular, by means of the process mentioned above it is possible to determine the degree of phosphorylation and / or the degree of glycosylation of one or more analytes contained in an "immobilization sample". In addition, as a feature the process according to the invention provides due to its high sensitivity and high accuracy and reproducibility, and especially thanks to a multiplicity of reference and calibration methods, independent of each other, applicable simultaneously or alternatively, are detected differences of less than 20%, preferably less than 10%, between the relative amounts in a "immobilization sample" and in one or more comparison samples, of one or more compounds in phosphorylated and / or non-phosphorylated and / or glycosylated and / or non-glycosylated form as analytes, for one or more mentioned forms.

Una gran ventaja del procedimiento conforme a la invención debido a su elevada sensibilidad inherente, específica para el método, y las múltiples posibilidades de la referenciación y/o calibración bajo la utilización de una sola e idéntica plataforma analítica (o bien plataforma sensora de campo evanescente), es que la variación de los resultados de medición así obtenidos es muy bajo. Por ello el procedimiento conforme a la invención es también adecuado parta la investigación del desarrollo temporal (es decir, de las modificaciones) de las cantidades o concentraciones relativas de sustancias biológicamente relevantes bajo la influencia del avance de la enfermedad de un organismo biológico o de un cultivo de células y/o de la influencia del entorno exterior de un organismo o de un cultivo de células. A great advantage of the process according to the invention due to its high inherent sensitivity, specific to the method, and the multiple possibilities of referencing and / or calibration under the use of a single and identical analytical platform (or evanescent field sensor platform ), is that the variation in the measurement results thus obtained is very low. Therefore, the method according to the invention is also suitable for the investigation of the temporal development (that is, of the modifications) of the relative amounts or concentrations of biologically relevant substances under the influence of the disease progression of a biological organism or of a cell culture and / or the influence of the external environment of an organism or a cell culture.

Por ello, otra forma de realización del procedimiento conforme a la invención se caracteriza porque la mencionada muestra "idéntica a la natural" y una o más muestras de comparación del mismo lugar de origen han sido extraídas en diferentes momentos de tiempo y porque se determinan modificaciones temporales de la cantidades relativas contenidas en dichas muestras, de uno o más compuestos en forma fosforilada y/o no fosforilada y/o glicosilada y/o no glicosilada, como analitos. Al respecto, bajo la expresión "del mismo lugar de origen" debe entenderse el mismo organismo o un organismo del mismo tipo o el mismo cultivo de células o bien cultivo de células similar (en cada caso después de una enfermedad o influencia del mismo tipo, de distinta duración). Es preferible que el procedimiento de acuerdo con la invención permita detectar modificaciones temporales de la concentración o bien cantidad, relativa, de los analitos mencionados, de menos del 20 %, preferentemente de menos del 10%. Therefore, another embodiment of the process according to the invention is characterized in that said sample shows "identical to the natural one" and one or more comparison samples from the same place of origin have been extracted at different times of time and because temporary modifications of the relative quantities contained in said samples are determined, of one or more compounds in phosphorylated and / or non-phosphorylated form and / or glycosylated and / or non-glycosylated, as analytes. In this regard, under the expression "from the same place of origin" the same organism or an organism of the same type or the same cell culture or similar cell culture should be understood (in each case after a disease or influence of the same type, of different duration). It is preferable that the process according to the invention makes it possible to detect temporary changes in the concentration or relative amount of the mentioned analytes of less than 20%, preferably less than 10%.

Es posible extraer muestras distintas del mismo organismo o del mismo cultivo de células. De esta manera es posible obtener mediante el análisis en varios áreas de medición con el material contenido en las mismas procedente del mismo organismo (o de un organismo del mismo tipo) o bien del mismo cultivo de células (o bien de cultivos de células del mismo tipo), por ejemplo informaciones estadísticas acerca de la reproducibilidad de la composición molecular relativa, determinada en estos regiones de medición, de las muestras aplicadas. It is possible to extract different samples from the same organism or from the same cell culture. In this way it is possible to obtain, by means of the analysis in several measurement areas, the material contained therein from the same organism (or an organism of the same type) or from the same cell culture (or from cell cultures thereof) type), for example statistical information about the reproducibility of the relative molecular composition, determined in these measurement regions, of the applied samples.

Es posible extraer muestras diferentes en especial en distintas posiciones del mismo organismo. En este caso, a partir de los análisis en las correspondientes áreas de medición diferenciadas es posible obtener por ejemplo información sobre las faltas de homogeneidad de la composición molecular relativa de los analitos detectados en el organismo, a partir de las muestras mencionadas. Un procedimiento este tipo es de gran importancia, por ejemplo para la investigación de organismos afectados de cáncer. It is possible to extract different samples especially in different positions of the same organism. In this case, from the analysis in the corresponding differentiated measurement areas it is possible, for example, to obtain information on the lack of homogeneity of the relative molecular composition of the analytes detected in the organism, from the mentioned samples. Such a procedure is of great importance, for example for the investigation of organisms affected by cancer.

Empero, también es posible extraer muestras diferentes a partir de distintos organismos o de distintos cultivos celulares. En este caso puede tratarse por ejemplo de muestras de organismos tratados y no tratados con un sustancia activa farmacéutica. De manera similar a un análisis de expresión en la analítica de ácidos nucleicos es entonces posible investigar la influencia de la correspondiente sustancia activa sobre la composición molecular relativa de las muestras. However, it is also possible to extract different samples from different organisms or different cell cultures. In this case, for example, it may be samples of organisms treated and not treated with a pharmaceutical active substance. Similar to an expression analysis in nucleic acid analytics, it is then possible to investigate the influence of the corresponding active substance on the relative molecular composition of the samples.

La forma más sencilla de la inmovilización de asociados de unión específicos para la detección de analitos, de una reacción de unión específica consiste en la adsorción física, por ejemplo debido a interacciones hidrófobas entre los asociados de unión específicos inmovilizados y la plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido. Sin embargo, dichas interacciones pueden ser modificadas considerablemente en su extensión o amplitud por la composición del medio y sus propiedades fisicoquímicas, como por ejemplo la polaridad y la intensidad iónica. En especial en el caso de un adición consecutiva o secuencial de diversos reactivos en un ensayo de múltiples etapas la capacidad de adherencia de los elementos de reconocimiento después de una inmovilización puramente por adsorción es frecuentemente insuficiente, porque la plataforma sensora de campo evanescente, para mejorar la capacidad de adherencia de la "muestra de inmovilización" a ser aplicada en áreas de medición diferenciadas, abarca una capa adhesiva, sobre la cual se aplican las fracciones mencionadas de muestras o diluciones de estas fracciones. The simplest form of immobilization of specific binding partners for the detection of analytes, of a specific binding reaction consists of physical adsorption, for example due to hydrophobic interactions between specific immobilized binding partners and the evanescent field sensing platform as solid support. However, such interactions can be modified considerably in their extent or amplitude by the composition of the medium and its physicochemical properties, such as polarity and ionic intensity. Especially in the case of a consecutive or sequential addition of various reagents in a multistage test, the adhesion capacity of the recognition elements after purely adsorption immobilization is frequently insufficient, because the evanescent field sensing platform, to improve The adhesion capacity of the "immobilization sample" to be applied in differentiated measurement areas, it covers an adhesive layer, on which the aforementioned fractions of samples or dilutions of these fractions are applied.

Al respecto, es preferible que el espesor de la capa adhesiva sea de menos de 200 nm, más preferentemente inferior a 20 nm. In this regard, it is preferable that the thickness of the adhesive layer is less than 200 nm, more preferably less than 20 nm.

Para la ejecución de la capa adhesiva son adecuados una multiplicidad de materiales. A título de ejemplo la capa adhesiva puede abarcar materiales del grupo de los silanos, silanos funcionalizados, epóxidos, polímeros funcionalizados, cargados o polares y "monocapas o multicapas pasivas o funcionalizadas autoorganizadas", tioles, fosfatos de alquilo y fosfonatos de alquilo, copolímeros de bloque funcionalizados como por ejemplo poli(L)lisina/polietilenglicoles. A multiplicity of materials are suitable for the execution of the adhesive layer. By way of example, the adhesive layer may include materials from the group of silanes, functionalized silanes, epoxides, functionalized, charged or polar polymers and "self-organized passive or functionalized monolayers or multilayers", thiols, alkyl phosphates and alkyl phosphonates, copolymers of functionalized block such as poly (L) lysine / polyethylene glycols.

También es posible que la mencionada capa adhesiva comprende compuestos del grupo de ácidos organofosfóricos de la fórmula general I (A) It is also possible that said adhesive layer comprises compounds of the group of organophosphoric acids of the general formula I (A)

Y–B–OPO3 H2 (IA) o de ácidos organosfosfónicos de la fórmula general I (B) Y – B – OPO3 H2 (IA) or organosphophonic acids of the general formula I (B)

Y–B–PO3 H2 (IB) y sus sales, en las que B significa un radical alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, hetarilo o hetarilalquilo e Y hidrógeno o un grupo funcional de la serie hidroxi, carboxi, amino, mono o dialquilamino eventualmente sustituido por alquilo inferior, tiol, alquilamino, o un grupo ácido negativo de la serie éster, fosfato, fosfonatos, sulfato, sulfonato, maleimida, succimidilo, epoxi o acrilato. Estos compuestos han sido descritos con más detenimiento en la Solicitud de Patente internacional PCT/EP 01/10077, incorporada en la presente en su totalidad como parte componente de esta solicitud. Y – B – PO3 H2 (IB) and its salts, in which B means an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl or hetarylalkyl radical and Y hydrogen or a functional group of the hydroxy, carboxy, amino, mono or dialkylamino series optionally substituted by lower alkyl, thiol, alkylamino, or a negative acid group of the series ester, phosphate, phosphonates, sulfate, sulphonate, maleimide, succinimidyl, epoxy or acrylate. These compounds have been described in more detail in International Patent Application PCT / EP 01/10077, incorporated herein in its entirety as a component part of this application.

Una forma de realización especial del procedimiento conforme a la invención se caracteriza porque un o más "muestras de inmovilización", antes de su aplicación sobre la plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido (para mejorar la capacidad de adherencia sobre el soporte sólido mencionado y para elevar la uniformidad de la aplicación) son mezcladas con una solución de polímeros o de monómeros polimerizables, eventualmente en la presencia de de iniciadores, o de "reticulantes" químicos (por ejemplo, glutaraldehído). Esta variante del procedimiento puede contribuir por ejemplo a que evitar la configuración de faltas de homogeneidad de la distribución del material de la muestra dentro de un intervalo de medición durante el proceso de la evaporación del fluido de la muestra, lo que conduce a una mejor morfología "Spot" y con ello facilita la evaluación de los resultados. Al respecto se prefiere que la solución mencionada de polímeros o monómeros polimerizables o de "reticulantes" químicos se seleccione del grupo que abarca soluciones de polisacáridos, como por ejemplo la agarosa, o de acrilamidas o de glutaraldehído, etc. A special embodiment of the process according to the invention is characterized in that one or more "immobilization samples" before being applied on the evanescent field sensing platform as a solid support (to improve the adhesion capacity on the mentioned solid support and to increase the uniformity of the application) they are mixed with a solution of polymers or polymerizable monomers, possibly in the presence of initiators, or "crosslinkers". chemicals (for example, glutaraldehyde). This variant of the process can contribute, for example, to preventing the configuration of the lack of homogeneity of the distribution of the sample material within a measurement interval during the process of evaporation of the sample fluid, which leads to a better morphology "Spot" and with it facilitates the evaluation of the results. In this regard, it is preferred that the aforementioned solution of polymerizable polymers or monomers or "crosslinkers" Chemicals are selected from the group comprising polysaccharide solutions, such as agarose, or acrylamides or glutaraldehyde, etc.

Esta variante especial del procedimiento conforme a la invención se caracteriza también porque la mezcla de una o más muestras con una solución de polímeros o de monómeros polimerizables, eventualmente en la presencia de iniciadores o de "reticulantes" químicos (por ejemplo, glutaraldehído) da lugar a la inmovilización de una estructura de red tridimensional con componentes de muestra accesibles para sustancias de detección en el paso siguiente de una reacción de bioafinidad, en la plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido. Con ello es posible lograr un grado más elevado del recubrimiento superficial de la plataforma sensora de campo evanescente como una monocapa, lo que puede conducir a otra elevación de las señales medibles durante el paso de la detección del analito. Al respecto es importante que la estructura de red de polímeros creada no se extienda sobre la profundidad de penetración del campo evanescente hacia dentro del medio, ya que no es posible la detección de un analito más allá de este alejamiento con respecto a la superficie de la plataforma sensora de campo evanescente. This special variant of the process according to the invention is also characterized in that the mixing of one or more samples with a solution of polymerizable polymers or monomers, possibly in the presence of initiators or "crosslinking agents". Chemicals (eg, glutaraldehyde) results in the immobilization of a three-dimensional network structure with sample components accessible for detection substances in the next step of a bioaffinity reaction, on the evanescent field sensing platform as a solid support. With this, it is possible to achieve a higher degree of surface coating of the evanescent field sensing platform like a monolayer, which can lead to another elevation of the measurable signals during the analyte detection step. In this regard it is important that the polymer network structure created does not extend over the depth of penetration of the evanescent field into the medium, since it is not possible to detect an analyte beyond this distance with respect to the surface of the evanescent field sensing platform.

Las "muestras de inmovilización" pueden aplicarse en áreas de medición diferenciadas sobre la plataforma sensora de campo evanescente directamente o sobre una capa adhesiva aplicado sobre el mismo espacialmente de manera selectiva con ayuda de un procedimiento, que se selecciona del grupo de procedimientos formados por "Inkjet spotting”, spotting mecánico con varilla, resorte o capilares, “Micro contact printing”, puesta en contacto fluida de la área de medición con las muestras mencionadas mediante el aporte de las mismas en microcanales paralelos y cruzados, bajo la acción de diferencias de impresión o potenciales eléctricos o electromagnéticos así como procedimientos de inmovilización fotoquímicos o fotolitográficos. The "immobilization samples" they can be applied in differentiated measurement areas on the evanescent field sensing platform directly or on a spatially applied adhesive layer on it selectively with the aid of a procedure, which is selected from the group of procedures formed by "Inkjet spotting", spotting mechanical with rod, spring or capillaries, "Micro contact printing", fluid contact of the measurement area with the samples mentioned by providing them in parallel and crossed microchannels, under the action of printing differences or electrical potentials or electromagnetic as well as photochemical or photolithographic immobilization procedures.

Es ventajoso que las regiones entre las áreas de medición diferenciadas "se pasiven" para minimizar la unión no específica de sustancias de detección, es decir, que entre las regiones de medición espacialmente separadas entre sí se apliquen componentes "químicamente neutros" frente a los analitos y otras sustancias contenidas de las muestras aplicadas así como con respecto a las sustancias de detección para los analitos mencionados, es decir que no unen los mismos. It is advantageous that the regions between the differentiated measurement areas "are passed" to minimize non-specific binding of detection substances, that is to say that "chemically neutral" components are applied between the spatially separated measurement regions. against the analytes and other substances contained in the applied samples as well as with respect to the detection substances for the mentioned analytes, that is to say that they do not bind them.

Las "muestras de inmovilización" mencionadas con respecto a los analitos y otros materiales contenidos de las "muestras de inmovilización" así como con respecto a las sustancias de detección de las "muestras de inmovilización" así con respecto a las "químicamente neutros , es decir los componentes que no unen los mismos pueden elegirse de los grupos formados por albúminas, en especial albúmina de suero bovino o albúmina de suero humano, caseína, anticuerpos no específicos, policlonales o monoclonales, extraños o no específicos para los analitos a ser detectados (en especial para inmuno ensayos). Los detergentes – por ejemplo Tween 20 –, ADN natural o sintético, fragmentado, que hibridan con polinucleótidos a ser analizados, como por ejemplo un extracto de esperma de arenque o de salmón (en especial para ensayos de hibridación de polinucleótidos), o también polímeros no cargados, pero hidrófilos, como por ejemplo polietilenglicoles o dextranos. The "immobilization samples" mentioned with respect to analytes and other materials contained in the "immobilization samples" as well as with respect to the detection substances of the "immobilization samples" thus with respect to the chemically neutral, that is to say the components that do not bind them, can be chosen from the groups formed by albumin, especially bovine serum albumin or human serum albumin, casein, non-specific, polyclonal or monoclonal antibodies, strange or non-specific for the analytes to be detected (especially for immunoassays). Detergents - for example Tween 20 -, natural or synthetic DNA, fragmented, that hybridize with polynucleotides to be analyzed, such as a herring or salmon sperm extract (especially for polynucleotide hybridization assays), or also polymers not loaded, but hydrophilic, such as polyethylene glycols or dextrans.

Sin restricción en cuanto a la generalidad, en el caso de los analitos a ser detectados, contenidos en las "muestras de inmovilización" aplicadas en áreas de medición diferenciadas, puede tratarse por ejemplo de compuestos del grupo formado por proteínas, por ejemplo anticuerpos y fragmentos de anticuerpos mono y policlonales, péptidos, enzimas, glicopéptidos, oligosacáridos, lectinas, antígenos para anticuerpos, con lugares de unión adicionales de proteínas funcionalizadas (Proteínas "Tag" como por ejemplo proteínas "histidina–Tag") así como ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN). En cuanto a los analitos a ser detectados, contenidos en regiones de medición discretas, también puede tratarse de compuestos del grupo que abarca proteínas celulares citosólicas o unidas por membrana, en especial en los procesos de la transducción de señales en las células de proteínas intervinientes, como por ejemplo las quinasas. Los analitos también pueden ser grupos modificados mediante tecnología biológica, por ejemplo con luminescentes o bien fluorescentes, como por ejemplo con BFP (“blue fluorescent proteins”, GFP (“green fluorescent proteins”) o RFP (“red fluorescent proteins”). Without restriction as to the generality, in the case of the analytes to be detected, contained in the " immobilization samples " applied in differentiated measurement areas, for example, they can be compounds of the group consisting of proteins, for example antibodies and fragments of mono and polyclonal antibodies, peptides, enzymes, glycopeptides, oligosaccharides, lectins, antigens for antibodies, with additional binding sites of Functionalized proteins (Proteins "Tag" such as proteins "Histidine-Tag") as well as nucleic acids (eg, DNA, RNA). As for the analytes to be detected, contained in discrete measurement regions, it can also be compounds of the group that includes cytosolic or membrane-bound cellular proteins, especially in the processes of signal transduction in the intervening protein cells, such as kinases. The analytes can also be groups modified by biological technology, for example with luminescent or fluorescent, such as with BFP ("blue fluorescent proteins", GFP ("green fluorescent proteins") or RFP ("red fluorescent proteins").

En función de la configuración física de la plataforma sensora de campo evanescente, para el tipo de tecnología de medición de la generación de señales existen diversas posibilidades. Una variante posible se caracteriza porque las señales optoelectrónicas accionadas localmente para las modificaciones a ser medidas, como consecuencia de la formación de sustancias de detección en los analitos contenidos en las "muestras de inmovilización", debido a las modificaciones locales de las condiciones de resonancia para la generación de un plasmón de superficie, son causados en una delgada capa de metal como parte de la mencionada plataforma sensora de campo evanescente. Depending on the physical configuration of the evanescent field sensor platform, there are several possibilities for the type of measurement technology for signal generation. A possible variant is characterized in that locally activated optoelectronic signals for the modifications to be measured, as a consequence of the formation of detection substances in the analytes contained in the "immobilization samples" due to local modifications of the resonance conditions for the generation of a surface plasmon, they are caused in a thin layer of metal as part of the aforementioned evanescent field sensing platform.

Desde el punto de vista de la tecnología de la medición, para la determinación de modificaciones de las condiciones de resonancia son accesibles el ángulo de rayo incidente (en el caso de una variación del ángulo de rayo incidente, a longitud de onda constante de la luz incidente) y de la longitud de onda de resonancia (a ángulo de rayo incidente constante y variación de la longitud de onda de excitación incidente). De manera correspondiente puede la mencionada modificación de las condiciones de resonancia consistir en una modificación del ángulo de resonancia para el rayo incidente de una luz de excitación para generar un plasmón de superficie en una delgada capa de metal como parte de la mencionada plataforma sensora de campo evanescente. De manera correspondiente, puede también la mencionada modificación consistir en una modificación de la longitud de onda de resonancia de un rayo de luz de excitación ingresante para generar un plasmón de superficie en una delgada capa de metal como parte de la mencionada plataforma sensora de campo evanescente. From the point of view of measurement technology, the incident beam angle is accessible for the determination of modifications of the resonance conditions (in the case of a variation of the incident beam angle, at a constant wavelength of light incident) and resonance wavelength (at constant angle of lightning and variation of incident excitation wavelength). Correspondingly, the aforementioned modification of the resonance conditions may consist of a modification of the resonance angle for the incident beam of an excitation light to generate a surface plasmon in a thin metal layer as part of said field sensing platform evanescent. Correspondingly, the aforementioned modification may also consist of a modification of the resonance wavelength of an incoming excitation light beam to generate a surface plasmon in a thin metal layer as part of said evanescent field sensing platform .

Las modificaciones resueltas localmente a ser medidas de las señales optoelectrónicas, como consecuencia de la unión de sustancias de detección en regiones de medición discretas en los analitos contenidos en las "muestras de inmovilización", pueden ser causadas por modificaciones locales del índice de ruptura efectivo en dichas regiones en la mencionada plataforma sensora de campo evanescente. Modifications resolved locally to be measurements of optoelectronic signals, as a consequence of the union of detection substances in discrete measurement regions in the analytes contained in the "immobilization samples", may be caused by local modifications of the effective break rate in said regions in the mentioned evanescent field sensor platform.

Otra forma de realización importante del procedimiento de acuerdo con la invención se caracteriza porque las señales optoelectrónicas resueltas localmente de las modificaciones a ser medidas, como consecuencia de la unión de las sustancias de detección en las regiones de medición discretas, en los analitos contenidos en las "muestras de inmovilización", son causadas por modificaciones locales de una o varias luminiscencias de dentro de las moléculas capaces de luminiscencia situadas en el campo evanescente de la mencionada plataforma sensora de campo evanescente. Another important embodiment of the process according to the invention is characterized in that the optoelectronic signals resolved locally from the modifications to be measured, as a consequence of the union of the detection substances in the discrete measurement regions, in the analytes contained in the "immobilization samples" are caused by local modifications of one or several luminescences within the luminescence capable molecules located in the evanescent field of said evanescent field sensor platform.

Se prefiere que dichas modificaciones de una o más luminiscencias provengan de moléculas capaces de luminiscencia o de nanopartículas capaces de luminiscencia, que en calidad de etiqueta de luminiscencia están unidas a una o más sustancias de detección para los analitos contenidos en las regiones de medición discretas. It is preferred that said modifications of one or more luminescences come from molecules capable of luminescence or nanoparticles capable of luminescence, which as a luminescence label are bound to one or more detection substances for the analytes contained in the discrete measurement regions.

Es especialmente ventajoso emplear para la detección del analito dos o más marcas de luminiscencia con diversas longitudes de onda y/o diversos espectros de excitación, preferentemente con diversas longitudes de onda e igual longitud de onda de excitación. Cuando haya varias marcas de luminiscencia con diversas propiedades espectrales, en especial diferentes longitudes de onda de emisión en diferentes sustancias de detección de la segunda multiplicidad de participantes específicos en la unión, que se llevan a contacto con las regiones de medición, es posible determinar por ejemplo diversos analitos en un solo paso de detección, es decir, mediante puesta en contacto de las regiones de medición con dichas sustancias de detección y detección, simultáneamente o subsiguiente, de las luminiscencias generadas. It is especially advantageous to use two or more luminescence labels with different wavelengths and / or different excitation spectra for the analyte detection, preferably with different wavelengths and the same excitation wavelength. When there are several luminescence marks with different spectral properties, especially different emission wavelengths in different detection substances of the second multiplicity of specific participants in the junction, which are brought into contact with the measurement regions, it is possible to determine by for example, several analytes in a single detection step, that is, by bringing the measurement regions into contact with said detection and detection substances, simultaneously or subsequently, of the luminescences generated.

A modo de ejemplo, tal variante del procedimiento según la invención es particularmente apropiada para, al mismo tiempo, detectar por ejemplo la forma fosforilada y no fosforilada de un compuesto, en especial, también dentro de un campo de medición único (común), con ayuda de dos diferentes asociados de unión correspondientes específicos marcados en este caso directamente (por ejemplo, con marcas luminiscentes verdes o rojas) como sustancias de detección. By way of example, such a variant of the process according to the invention is particularly suitable for, at the same time, detecting, for example, the phosphorylated and non-phosphorylated form of a compound, in particular, also within a single (common) measuring range, with help of two different specific corresponding binding partners marked in this case directly (for example, with green or red luminescent marks) as detection substances.

De igual manera, se pueden detectar al mismo tiempo dos o más distintos analitos, cuando se usan para la detección del analito dos o más etiquetas luminiscentes con distintos tiempos de disminución de las emisiones. Similarly, two or more different analytes can be detected at the same time, when two or more luminescent labels with different emission reduction times are used for analyte detection.

Para el procedimiento según la invención también se prefiere que, para la detección de distintos analitos en una “muestra de inmovilización” se usen dos o más etiquetas luminiscentes. Asimismo se prefiere que, para la detección de distintos analitos en un campo de medición se usen dos o más etiquetas luminiscentes. For the process according to the invention it is also preferred that, for the detection of different analytes in an "immobilization sample" two or more luminescent labels are used. It is also preferred that, for the detection of different analytes in a measurement field, two or more luminescent labels are used.

Además, es ventajoso cuando la radiación de la luz de excitación se realice en pulsos con una duración de entre 1 fseg y 10 minutos y la luz de emisión de las áreas de medición se mide resuelta en el tiempo. In addition, it is advantageous when the radiation of the excitation light is carried out in pulses with a duration of between 1 fsec and 10 minutes and the emission light of the measurement areas is measured resolved over time.

Con preferencia, la plataforma sensora de campo evanescente comprende como soporte sólido un conductor de ondas óptico que comprende una o varias capas. En este caso, se puede tratar, por ejemplo, de un conductor de ondas de fibra óptica, compuesto por varias capas. Con preferencia, se trata sin embargo de un conductor de ondas óptico planar, que está conformado íntegramente sobre una superficie de la plataforma sensora de campo evanescente o que también puede estar dividido en áreas discretas conductoras de ondas, tal como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 96/35940. Preferably, the evanescent field sensing platform comprises as solid support an optical wave conductor comprising one or several layers. In this case, it can be, for example, a fiber optic wave conductor, consisting of several layers. Preferably, it is, however, a planar optical wave conductor, which is formed entirely on a surface of the evanescent field sensing platform or which can also be divided into discrete wave-conducting areas, as described, for example, in patent application WO 96/35940.

Se prefiere en particular una forma de realización del procedimiento según la invención que se caracteriza porque la plataforma sensora de campo evanescente comprende como soporte sólido un conductor de onda de capa fina óptico planar con una capa conductora de ondas transparente esencialmente óptica sobre una segunda capa asimismo transparente esencialmente óptica con un menor índice de refracción que la capa conductora de ondas y eventualmente una capa intermedia transparente esencialmente óptica entre la capa conductora de ondas y la segunda capa asimismo con un índice de refracción menor que la capa conductora de ondas. Particularly preferred is an embodiment of the process according to the invention, characterized in that the evanescent field sensing platform comprises as a solid support a planar optical thin layer wave conductor with an essentially optical transparent wave conductive layer on a second layer also essentially optical transparent with a lower refractive index than the wave conductive layer and possibly an essentially optical transparent intermediate layer between the wave conductive layer and the second layer also with a lower refractive index than the wave conductive layer.

La luz de excitación de una o varias fuentes luminosas se puede acoplar en una capa conductora de ondas de la plataforma sensora del campo evanescente a través de uno o varios elementos de acoplamiento ópticos que están seleccionados del grupo formado por acopladores de prismas, acopladores evanescentes con conductores de ondas ópticos comunes con campos evanescentes superpuestos, acopladores de cara frontal con lentes de enfoque dispuesta delante de una cara frontal de la capa conductora de ondas, con preferencia lentes cilíndricas, y acopladores de rejilla. The excitation light of one or several light sources can be coupled in a wave-conducting layer of the evanescent field sensing platform through one or more optical coupling elements that are selected from the group consisting of prism couplers, evanescent couplers with common optical wave conductors with overlapping evanescent fields, front face couplers with focusing lenses arranged in front of a front face of the wave conducting layer, preferably cylindrical lenses, and grid couplers.

Se prefiere que el acoplamiento de luz de excitación en una capa conductora de ondas de la plataforma sensora del campo evanescente se realice con ayuda de una o varias estructuras de rejilla que están estampadas en la capa conductora de ondas mencionada. It is preferred that the coupling of excitation light in a wave-conducting layer of the evanescent field sensing platform is carried out with the aid of one or more grid structures that are stamped on the mentioned wave-conducting layer.

Además, se prefiere que el desacoplamiento de la luz conducida en una capa conductora de ondas de la plataforma sensora del campo evanescente se realice con ayuda de una o varias estructuras de rejilla para el desacople, que están estampadas en dicha capa conductora de ondas y que tienen igual o diferente período y profundidad de rejilla que las estructuras de rejilla para el acoplamiento. Furthermore, it is preferred that the decoupling of the light conducted in a wave-conducting layer of the evanescent field sensing platform be performed with the aid of one or more grid structures for decoupling, which are stamped on said wave-conducting layer and that they have the same or different grid period and depth as the grid structures for the coupling.

Una forma de realización de especial preferencia del procedimiento según la invención se caracteriza porque la luz de excitación de una o varias fuentes luminosas se acopla a través de una estructura de rejilla para el acoplamiento en una capa conductora de ondas de dicha plataforma sensora de campo evanescente y se conduce a las áreas de medición que se hallan en la plataforma sensora de campo evanescente como onda conducida, porque además la luminiscencia de moléculas luminiscentes generada en el campo evanescente de dicha onda conducida se registra con uno o varios detectores resueltos en el espacio y se determina la concentración relativa de uno o varios analitos de la intensidad relativa de estas señales de luminiscencia. A particularly preferred embodiment of the process according to the invention is characterized in that the excitation light of one or more light sources is coupled through a grid structure for coupling in a wave-conducting layer of said evanescent field sensing platform and it is conducted to the measurement areas that are in the evanescent field sensing platform as a conducted wave, because in addition the luminescence of luminescent molecules generated in the evanescent field of said conducted wave is recorded with one or several detectors resolved in space and the relative concentration of one or more analytes of the relative intensity of these luminescence signals is determined.

Una variante especial consiste en determinar, además de la determinación de una o varias luminiscencias, modificaciones del índice de refracción efectivo en las áreas de medición. A special variant consists in determining, in addition to the determination of one or several luminescences, modifications of the effective refractive index in the measurement areas.

Para otra mejora de la sensibilidad, puede ser ventajoso cuando una o varias luminiscencias y / o determinaciones de señales luminosas se realizan con polarización selectiva en la longitud de ondas de excitación. En este caso, se prefiere que se midan una o varias luminiscencias en otra polarización que la de la luz de excitación. For another sensitivity improvement, it may be advantageous when one or more luminescences and / or determinations of light signals are performed with selective polarization in the excitation wavelength. In this case, it is preferred that one or more luminescences be measured in another polarization than that of the excitation light.

Otro objeto de la presente invención es una plataforma analítica para analizar una multiplicidad de muestras en lo relativo a compuestos biológicamente relevantes como participantes de reacciones de bioafinidad contenidos en las muestras como analitos, que comprende Another object of the present invention is an analytical platform for analyzing a multiplicity of samples in relation to biologically relevant compounds as participants of bioaffinity reactions contained in the samples as analytes, which comprises

– -: una plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido an evanescent field sensing platform as a solid support

– -: al menos una matriz uni– o bidimensional de áreas de medición diferenciadas con asociados de unión allí inmovilizados sobre dicha plataforma sensora de campo evanescente para la detección de dichos analitos en una reacción de bioafinidad, at least one uni- or two-dimensional matrix of differentiated measurement areas with binding partners there immobilized on said evanescent field sensing platform for the detection of said analytes in a bioaffinity reaction,

caracterizada porque characterized because

dichas áreas de medición diferenciadas se generaron por aplicación de dichas muestras o fracciones de dichas muestras directamente o después de diluciones adicionales de estas muestras o de sus fracciones, con los analitos a detectar allí, como una primera multiplicidad de asociados de unión específicos, porque distintas muestras o fracciones o distintas diluciones de las muestras o de sus fracciones están dispuestas en distintos áreas de medición diferenciadas y porque en el caso de uno o varios asociados de unión inmovilizados, que forman dicha primera multiplicidad de asociados de unión específicos, se trata de uno o varios analitos en sí que están contenidos en las muestras a analizar. said differentiated measurement areas were generated by applying said samples or fractions of said samples directly or after additional dilutions of these samples or their fractions, with the analytes to be detected there, as a first multiplicity of specific binding partners, because different samples or fractions or different dilutions of the samples or their fractions are arranged in different areas of differentiated measurement and because in the case of one or more immobilized binding partners, which form said first multiplicity of specific binding partners, it is one or several analytes themselves that are contained in the samples to be analyzed.

A este respecto, se puede haber fraccionado una muestra por ensayar separada en dichas fracciones por medio de un procedimiento de separación, que puede estar seleccionado del grupo de procedimientos formando por centrifugación, HPLC y micro–HPLC (“cromatografía líquida de alta presión”) por medio del método de cromatografía en “fase normal”, cromatografía “en fase inversa”, cromatografía por intercambio iónico o cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), “cromatografía por exclusión de tamaño”, cromatografía en gel, electroforesis, electroforesis capilar, electrocromatografía, “electroforesis de flujo libre”, etc. In this regard, a sample to be tested separately in said fractions may have been fractionated by means of a separation procedure, which may be selected from the group of procedures by centrifugation, HPLC and micro-HPLC ("high pressure liquid chromatography") by means of the "normal phase" chromatography method, "reverse phase" chromatography, ion exchange chromatography or hydrophobic interaction chromatography (HIC), "size exclusion chromatography", gel chromatography, electrophoresis, capillary electrophoresis, electrochromatography , "Free flow electrophoresis", etc.

Una o varias de dichas muestras pueden haberse extraído de organismos biológicos o estructuras tisulares o celulares o células y haberse aplicado directamente (es decir, después del lisado de las células) sin posterior dilución, sobre dicho soporte sólido. One or more of said samples may have been extracted from biological organisms or tissue or cellular structures or cells and applied directly (ie, after lysing the cells) without further dilution, on said solid support.

La plataforma analítica según la invención se caracteriza por una sensibilidad tan grande que es posible diluir una muestra o una fracción de una muestra antes de la aplicación sobre dicha plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido al menos en un factor 10. Incluso es posible diluir una muestra o una fracción de una muestra por ensayar en un factor 30 ó 100 y a pesar de ello, detectar cuantitativamente una multiplicidad de analitos en un campo de medición que se genera por aplicación de una fracción fuertemente diluida. The analytical platform according to the invention is characterized by a sensitivity so great that it is possible to dilute a sample or a fraction of a sample before application on said evanescent field sensing platform as a solid support at least by a factor 10. It is even possible to dilute a sample or a fraction of a sample to be tested in a factor of 30 or 100 and in spite of this, quantitatively detect a multiplicity of analytes in a measurement field that is generated by application of a strongly diluted fraction.

A continuación, se deben resumir, a su vez, las fracciones de muestras para aplicar en áreas de medición diferenciadas y las diluciones de fracciones de muestras para aplicar bajo el término de “muestras de inmovilización. Next, in turn, the sample fractions to be applied in differentiated measurement areas and the dilutions of sample fractions to apply under the term “immobilization samples.

Las muestras por ensayar con los analitos a detectar eventualmente después de un fraccionamiento pueden estar seleccionadas del grupo de extractos de células sanas o enfermas (por ejemplo, de extractos celulares humanos, animales, bacterianos o vegetales), extractos de tejido animal o humano, como, por ejemplo tejido orgánico, de la piel, del cabello o de los huesos, o de tejido vegetal, así como de líquidos corporales o sus componentes como, por ejemplo, sangre, suero o plasma, líquidos articulares, líquido lagrimal, orina, saliva, líquido tisular, linfa. The samples to be tested with the analytes to be detected eventually after a fractionation may be selected from the group of healthy or diseased cell extracts (eg, from human, animal, bacterial or plant cell extracts), animal or human tissue extracts, such as , for example, organic tissue, skin, hair or bones, or plant tissue, as well as body fluids or their components, such as blood, serum or plasma, joint fluids, tear fluid, urine, saliva , tissue fluid, lymph.

En especial, una muestra por ensayar (“muestra de inmovilización”) también puede estar seleccionada del grupo que comprende extractos de células estimuladas o no tratadas y extractos de tejido sano o enfermo. In particular, a sample to be tested ("immobilization sample") may also be selected from the group comprising extracts from stimulated or untreated cells and extracts from healthy or diseased tissue.

Los analitos contenidos en las muestras o sus fracciones o bien sus diluciones, es decir, en especial, biopolímeros como, por ejemplo ácidos nucleicos o proteínas, pueden presentarse en forma nativa o en forma desnaturalizada, después del tratamiento de la “muestra original” por ejemplo con urea o tensioactivos (por ejemplo, SDS). The analytes contained in the samples or their fractions or their dilutions, that is, in particular, biopolymers such as, for example, nucleic acids or proteins, can be presented natively or in denatured form, after the treatment of the "original sample" by example with urea or surfactants (for example, SDS).

Con preferencia, los analitos contenidos en las “muestras de inmovilización”, es decir, en especial, biopolímeros como, por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas, después del tratamiento con urea, se presentan en forma desnaturalizada, en donde los epítopos de dichos analitos son de libre acceso para la unión de sus correspondientes sustancias de detección, por ejemplo de anticuerpos. Esto se posibilita por medio de la destrucción de la estructura terciaria o cuaternaria como consecuencia del tratamiento de urea. Preferably, the analytes contained in the "immobilization samples", that is, in particular, biopolymers such as, for example, nucleic acids or proteins, after urea treatment, are presented in denatured form, where the epitopes of said analytes they are freely available for the binding of their corresponding detection substances, for example of antibodies. This is possible through the destruction of the tertiary or quaternary structure as a result of urea treatment.

De modo correspondiente, además de “Laser Micro Dissection”, una muestra también se puede haber extraído de un organismo o estructura tisular o celular o célula por medio de un método del grupo de cortes tisulares, o biopsia. Correspondingly, in addition to "Laser Micro Dissection", a sample may also have been extracted from an organism or tissue or cellular structure or cell by means of a method of the group of tissue cuts, or biopsy.

Una muestra aplicada puede comprender el material de menos de 20000 células, incluso de menos de 1000 células. La muestra puede tener un volumen de menos de 1 µl, incluso menos de 10 nl. An applied sample may comprise the material of less than 20,000 cells, even less than 1000 cells. The sample may have a volume of less than 1 µl, even less than 10 nl.

La cantidad necesaria de muestra puede comprender incluso el material de menos de 100 células y se puede analizar de modo confiable. Esto sucede cuando en el caso de los analitos a detectar, se trata de ingredientes que se presentan en una concentración relativamente elevada. The necessary amount of sample can even comprise the material of less than 100 cells and can be analyzed reliably. This happens when in the case of the analytes to be detected, these are ingredients that are presented in a relatively high concentration.

Distintas muestras aplicadas se pueden extraer del mismo organismo. En este caso, las muestras pueden extraerse en diversas posiciones del mismo organismo. Distintas muestras aplicadas también se pueden extraer del mismo cultivo celular o uno diferente. Different applied samples can be extracted from the same organism. In this case, the samples can be extracted in different positions of the same organism. Different applied samples can also be extracted from the same or a different cell culture.

Pero distintas muestras aplicadas también pueden extraerse de distintos organismos o distintos cultivos celulares. But different applied samples can also be extracted from different organisms or different cell cultures.

Se prefiere que la plataforma sensora de campo evanescente, para mejorar la capacidad de adhesión de las “muestras de inmovilización” aplicadas en áreas de medición diferenciadas, comprenda una capa adhesiva sobre la que se aplican dichas muestras o sus fracciones o diluciones. It is preferred that the evanescent field sensing platform, to improve the adhesion capacity of the "immobilization samples" applied in differentiated measurement areas, comprises an adhesive layer on which said samples are applied or their fractions or dilutions.

A este respecto, con preferencia, el espesor de la capa de adhesión es menor a 200 nm, con preferencia especial, menor a 20 nm. In this regard, preferably, the thickness of the adhesion layer is less than 200 nm, with special preference, less than 20 nm.

La capa adhesiva puede comprender compuestos del grupo de silanos, silanos funcionalizados, epóxidos, polímeros funcionalizados, cargados o polares y “mono– o multicapas pasivas o funcionalizadas autoorganizadas”, tioles, fosfatos y fosfonatos de alquilo, copolímeros de bloque multifuncionales tales como, por ejemplo, poli(L)lisina/polietilenglicoles. The adhesive layer may comprise compounds of the group of silanes, functionalized silanes, epoxides, functionalized, charged or polar polymers and "mono- or passive or functionalized monolayer multilayers", thiols, phosphates and phosphonates of alkyl, multifunctional block copolymers such as, by example, poly (L) lysine / polyethylene glycols.

Se mostró particularmente ventajoso que dicha capa adhesiva comprenda compuestos del grupo de ácidos organofosfóricos de la fórmula general I (A) It was particularly advantageous for said adhesive layer to comprise compounds of the group of organophosphoric acids of the general formula I (A)

Y–B–OPO3 H2 (IA) o de ácidos organofosfónicos de la fórmula general I (B) Y – B – OPO3 H2 (IA) or organophosphonic acid of the general formula I (B)

Y–B–PO3 H2 (IB) y sus sales, en las que B significa un resto alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, hetarilo o hetarilalquilo e Y es hidrógeno o un grupo funcional de la serie hidroxi, carboxi, amino, mono– o dialquilamino eventualmente sustituido con alquilo inferior, tiol, o un grupo ácido negativo de la serie éster, fosfato, fosfonato, sulfato, sulfonato, maleimida, succinimidilo, epoxi o acrilato. Y – B – PO3 H2 (IB) and its salts, in which B means an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, heteroaryl or hetarylalkyl moiety and Y is hydrogen or a functional group of the hydroxy, carboxy, amino series, mono- or dialkylamino optionally substituted with lower alkyl, thiol, or a negative acid group of the ester, phosphate, phosphonate, sulfate, sulphonate, maleimide, succinimidyl, epoxy or acrylate series.

Una forma de realización especial de la plataforma analítica según la invención se caracteriza porque una o varias “muestras de inmovilización” antes de su aplicación sobre la plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido (para mejorar la adherencia sobre dicho soporte sólido y aumento de la homogeneidad de la aplicación) se mezclan con una solución de polímeros o monómeros polimerizables, eventualmente en presencia de iniciadores, o de “Cross–Linkern” químicos (por ejemplo, glutaraldehído). Esta variante del procedimiento puede contribuir, por ejemplo, a evitar la formación de inhomogeneidades de la distribución del material de muestra dentro de un campo de medición en el proceso de evaporación del líquido de muestra, lo cual lleva a una mejor “morfología de mancha”, facilitando así la evaluación de los resultados. En este caso, se prefiere que dicha solución de polímeros o monómeros polimerizables o “Cross–Linkers” químico esté seleccionada del grupo que comprende soluciones de polisacáridos como, por ejemplo, agarosa, o de acrilamidas o de glutaraldehído, etc. A special embodiment of the analytical platform according to the invention is characterized in that one or more "immobilization samples" before its application on the evanescent field sensing platform as a solid support (to improve the adhesion on said solid support and increase the application homogeneity) are mixed with a solution of polymerizable polymers or monomers, possibly in the presence of initiators, or of chemical "Cross-Linkern" (eg glutaraldehyde). This variant of the process can contribute, for example, to avoid the formation of inhomogeneities of the distribution of the sample material within a measurement field in the process of evaporation of the sample liquid, which leads to a better "spot morphology" , thus facilitating the evaluation of the results. In this case, it is preferred that said solution of polymerizable polymers or monomers or chemical "Cross-Linkers" be selected from the group comprising solutions of polysaccharides such as, for example, agarose, or acrylamides or glutaraldehyde, etc.

Tal forma de realización especial de una plataforma analítica según la invención también se caracteriza porque los componentes de una o varias “muestras de inmovilización” después de su mezcla con una solución polimérica, unido en una estructura reticular tridimensional están inmovilizados sobre la plataforma sensora del campo evanescente y allí son accesibles para sus sustancias de detección, con las que se ponen en contacto en una posterior etapa de una reacción de bioafinidad. Con ello, se puede lograr un mayor grado de recubrimiento de la superficie de la plataforma sensora de campo evanescente que una monocapa, lo cual puede llevar a un posterior aumento de las señales mensurables en la etapa de la detección de analitos. En este caso, sin embargo, no se deberá extender la estructura reticular polimérica lograda más allá de la profundidad de penetración del campo evanescente en el medio, ya que una detección de analitos más allá de esta distancia de la superficie de la plataforma sensora de campo evanescente no es posible. Such a special embodiment of an analytical platform according to the invention is also characterized in that the components of one or more "immobilization samples" after mixing with a polymer solution, joined in a three-dimensional reticular structure are immobilized on the field sensing platform. evanescent and there are accessible for its detection substances, with which they are contacted at a later stage of a bioaffinity reaction. With this, a greater degree of surface coating of the evanescent field sensing platform than a monolayer can be achieved, which can lead to a subsequent increase in measurable signals at the analyte detection stage. In this case, however, the polymeric reticular structure achieved beyond the depth of penetration of the evanescent field in the medium should not be extended, since an analyte detection beyond this distance from the surface of the field sensing platform Evanescent is not possible.

Son ventajosas aquellas formas de realización de una plataforma analítica según la invención en las que una matriz comprende más de 50, con preferencia más de 500, con preferencia especial, más de 5000 áreas de medición. Advantageous are those embodiments of an analytical platform according to the invention in which a matrix comprises more than 50, preferably more than 500, with special preference, more than 5000 measurement areas.

A este respecto, cada área de medición puede contener una muestra inmovilizada igual o diferente a la de otras áreas de medición. In this regard, each measurement area may contain an immobilized sample equal to or different from that of other measurement areas.

Las áreas de medición de una matriz están dispuestas en una densidad de más de 10, con preferencia de más de 100, con preferencia especial, de más de 1000 áreas de medición por centímetro cuadrado. The measurement areas of a matrix are arranged in a density of more than 10, preferably more than 100, with special preference, more than 1000 measurement areas per square centimeter.

También es ventajosa una forma de realización de una plataforma analítica según la invención caracterizada porque sobre la plataforma sensora del campo evanescente están dispuestas como portadores sólidos una multiplicidad de matrices de áreas de medición. En especial, sobre la plataforma sensora del campo evanescente pueden estar dispuestos al menos 5, con preferencia al menos 50 matrices de áreas de medición. Es particularmente ventajoso cuando están dispuestas distintas matrices de áreas de medición de una variante tal de una plataforma analítica según la invención en distintos recipientes de muestra. A modo de ejemplo, en las solicitudes de patente internacionales WO 01/13096 y WO 01/43875, se describe cómo una plataforma sensora de campo evanescente, que es apropiada para una plataforma analítica según la invención, se puede combinar como plataforma de suelo con un cuerpo colocado apropiado para generar una matriz apropiada de recipientes de muestra en cada caso para el alojamiento de una matriz de áreas de medición. An embodiment of an analytical platform according to the invention is also advantageous, characterized in that a multiplicity of measurement area matrices are arranged as solid carriers on the sensor platform of the evanescent field. In particular, at least 5, preferably at least 50 matrices of measurement areas, may be arranged on the sensor platform of the evanescent field. It is particularly advantageous when different arrays of measuring areas of such a variant of an analytical platform according to the invention are arranged in different sample containers. As an example, in international patent applications WO 01/13096 and WO 01/43875, it is described how an evanescent field sensing platform, which is suitable for an analytical platform according to the invention, can be combined as a floor platform with an appropriate positioned body to generate an appropriate array of sample vessels in each case for the accommodation of an array of measurement areas.

Con esta forma de realización de una plataforma analítica según la invención, se permite una concepción experimental que se puede denominar como “multidimensional”: por ejemplo, en las líneas y columnas de una matriz, se pueden aplicar distintas muestras, por ejemplo de distintos organismos (por ejemplo, según las columnas), en diferente dilución (por ejemplo, según las líneas). Se puede poner en contacto distintas matrices de áreas de medición, en diferentes recipientes de muestras, con distintos segundos múltiplos de asociados de unión específicos como sustancias de detección para determinar distintos analitos inmovilizados den diferentes matrices. Es obvio que, con tal variante de una plataforma analítica según la invención, se puede realizar una cantidad casi ilimitada de diversos experimentos. With this embodiment of an analytical platform according to the invention, an experimental conception that can be referred to as "multidimensional" is allowed: for example, in the lines and columns of a matrix, different samples can be applied, for example from different organisms (for example, according to the columns), in different dilution (for example, according to the lines). Different matrices of measurement areas, in different sample vessels, can be contacted with different second multiples of specific binding partners as detection substances to determine different immobilized analytes in different matrices. It is obvious that, with such a variant of an analytical platform according to the invention, an almost unlimited amount of various experiments can be performed.

También es ventajoso que áreas entre las áreas de medición diferenciadas para minimizar la unión inespecífica de sustancias de detección “estén pasivadas”, es decir, que entre las áreas de medición separados espacialmente estén aplicados componentes “químicamente neutros” respecto de los analitos y otros ingredientes de las “muestras de inmovilización” aplicadas, así como respecto de las sustancias de detección para dichos analitos, es decir, componentes que no se unan a éstos. It is also advantageous that areas between the differentiated measurement areas to minimize the non-specific binding of detection substances "are passivated", that is, that "chemically neutral" components are applied between the analytes and other ingredients between the spatially separated measurement areas of the “immobilization samples” applied, as well as with respect to the detection substances for said analytes, that is, components that do not bind to them.

Dichos componentes “químicamente neutros”, respecto de los analitos y otros ingredientes de las “muestras de inmovilización” aplicadas, así como respecto de las sustancias de detección para dichos analitos, es decir, que no se unen a éstos se pueden seleccionar de los grupos formados por albúminas, en especial, albúmina de suero bovino o albúmina de suero humano, caseína, anticuerpos, policlonales o monoclonales, inespecíficos de especies extraña o empíricamente inespecíficos para el o los analitos a detectar, (en especial, para inmunoensayos), detergentes –tales como, por ejemplo Tween 20–, ADN natural o sintético fragmentado que no hibride con los polinucleótidos a analizar, o también polímeros no cargados pero hidrófilos, por ejemplo un extracto de esperma de arenque o salmón (en especial, para ensayos de hibridación de polinucleótidos), o tal polímeros no cargados pero hidrófilos como, por ejemplo, polietilenglicoles o dextranos. Said "chemically neutral" components, with respect to the analytes and other ingredients of the applied "immobilization samples", as well as with respect to the detection substances for said analytes, that is to say, that do not bind to them can be selected from the groups formed by albumin, especially bovine serum albumin or human serum albumin, casein, antibodies, polyclonal or monoclonal, nonspecific of strangely or empirically nonspecific species for the analyte or analytes to be detected, (especially for immunoassays), detergents - such as, for example, Tween 20–, fragmented natural or synthetic DNA that does not hybridize with the polynucleotides to be analyzed, or also non-charged but hydrophilic polymers, for example a herring or salmon sperm extract (especially for hybridization assays of polynucleotides), or such non-charged but hydrophilic polymers such as, for example, polyethylene glycols or dextrans.

Sin limitar la generalidad, en el caso de los analitos a detectar contenidos en las “muestras de inmovilización” aplicadas en las áreas de medición diferenciadas de una plataforma analítica según la invención se puede tratar, por ejemplo, de compuestos del grupo formado por proteínas, por ejemplo anticuerpos mono– o policlonales y fragmentos de anticuerpos, péptidos, enzimas, glucopéptidos, oligosacáridos, lactinas, antígenos para anticuerpos, proteínas funcionalizadas con sitios de unión adicionales (“proteínas Tag”, como, por ejemplo, “proteínas Tag de histidina”), así como ácidos nucleicos (por ejemplo ADN, ARN). Without limiting the generality, in the case of the analytes to be detected in the "immobilization samples" applied in the differentiated measurement areas of an analytical platform according to the invention, it can be, for example, compounds of the group formed by proteins, for example mono- or polyclonal antibodies and fragments of antibodies, peptides, enzymes, glycopeptides, oligosaccharides, lactins, antigens for antibodies, proteins functionalized with additional binding sites ("Tag proteins", such as, "Histidine Tag proteins" ), as well as nucleic acids (for example DNA, RNA).

En especial, en el caso de los analitos a detectar contenidos en las muestras aplicadas en las áreas de medición diferenciadas se trata de compuestos del grupo que comprende proteínas celulares citosólicas o unidas a membrana, en especial, proteínas participantes de los procesos de la transducción de señales en células como, por ejemplo, quinasas. Los analitos pueden ser también biopolímeros biotécnicamente modificados, por ejemplo con grupos luminescentes o bien fluorescentes y biopolímeros biológicamente expresados como, por ejemplo, con “blue fluorescent proteins” (BFP), “green fluorescent proteins” (GFP) o “red fluorescent proteins” (RFP). In particular, in the case of the analytes to be detected in the samples applied in the differentiated measurement areas, they are compounds of the group comprising cytosolic or membrane-bound cellular proteins, in particular, proteins participating in the transduction processes of signals in cells such as kinases. The analytes can also be biotechnically modified biopolymers, for example with luminescent or fluorescent groups and biologically expressed biopolymers such as, for example, with "blue fluorescent proteins" (BFP), "green fluorescent proteins" (GFP) or "red fluorescent proteins" (RFP)

Una variante especial de una plataforma analítica según la invención se caracteriza porque la plataforma sensora de campo evanescente, como componente de la plataforma analítica, comprende una capa metálica delgada eventualmente sobre una capa intermedia que se halla debajo con un índice de refracción preferentemente de < 1,5, como por ejemplo dióxido de silicio o fluoruro de magnesio, en donde el espesor de la capa de metal y la capa intermedia eventual está elegido de forma tal que se pueda excitar un plasmón de la superficie con una longitud de onda de una luz de excitación irradiada y / o con la longitud de onda de una luminiscencia generada. A special variant of an analytical platform according to the invention is characterized in that the evanescent field sensing platform, as a component of the analytical platform, comprises a thin metal layer possibly on an intermediate layer that is below with a refractive index preferably of <1 , 5, such as silicon dioxide or magnesium fluoride, where the thickness of the metal layer and the eventual intermediate layer is chosen such that a surface plasmon can be excited with a wavelength of a light of irradiated excitation and / or with the wavelength of a generated luminescence.

En este caso, se prefiere que el metal esté seleccionado del grupo que comprende oro y plata. Además, se prefiere que la capa metálica tenga un espesor de entre 10 nm y 1000 nm, con preferencia de entre 30 nm y 200 nm. In this case, it is preferred that the metal is selected from the group comprising gold and silver. Furthermore, it is preferred that the metal layer has a thickness between 10 nm and 1000 nm, preferably between 30 nm and 200 nm.

Con preferencia, la plataforma sensora de campo evanescente comprende como soporte sólido un conductor de ondas óptico que comprende una o varias capas. En este caso, se puede tratar por ejemplo de un conductor de ondas de fibra óptica compuesto por varias capas. Con preferencia, sin embargo, se trata de un conductor de ondas óptico planar que está formado por completo sobre una superficie de la plataforma sensora de campo evanescente o también puede estar dividido en áreas discretas conductoras de ondas tal como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 96/35940. Preferably, the evanescent field sensing platform comprises as solid support an optical wave conductor comprising one or several layers. In this case, it can be for example a fiber optic wave conductor consisting of several layers. Preferably, however, it is a planar optical wave conductor that is completely formed on a surface of the evanescent field sensing platform or can also be divided into discrete wave-conducting areas as described, for example, in patent application WO 96/35940.

Con preferencia especial, se prefiere tal forma de realización del procedimiento según la invención que se caracteriza porque la plataforma sensora de campo evanescente comprende como soporte sólido un conductor de ondas de capa fina óptico planar con una capa conductora de ondas óptimamente transparentes sobre una segunda capa óptimamente transparente con menor índice de refracción que la capa conductora de ondas y eventualmente una capa intermedia transparente asimismo esencialmente óptica entre la capa conductora de ondas (a) y la segunda capa con índice de refracción asimismo menor que la capa conductora de ondas. With particular preference, such an embodiment of the process according to the invention is preferred, characterized in that the evanescent field sensing platform comprises as a solid support a planar optical thin layer wave conductor with a conductive layer of optimally transparent waves on a second layer optimally transparent with a lower refractive index than the conductive wave layer and possibly a transparent intermediate layer also essentially optical between the conductive wave layer (a) and the second layer with refractive index also smaller than the conductive wave layer.

Con preferencia, una plataforma analítica según la invención se conforma de modo que una capa conductora de ondas de la plataforma sensora de campo evanescente esté en contacto óptico con uno o varios elementos de acoplamiento ópticos, que permiten el acoplamiento de luz de excitación de una o varias fuentes luminosas en la dicha capa conductora de ondas, en donde dichos elementos ópticos de acoplamiento están seleccionados del grupo de acopladores de prismas, acopladores evanescentes con conductores de ondas ópticos reunidos con campos evanescentes superpuestos, acoplados de superficie frontal con lentes de enfoque dispuestos delante de una cara frontal de dicha capa conductora de ondas de la plataforma sensora de campo evanescente, con preferencia lentes cilíndricas y acopladores de rejilla. Preferably, an analytical platform according to the invention is formed such that a wave-conducting layer of the evanescent field sensing platform is in optical contact with one or more optical coupling elements, which allow the coupling of excitation light of one or more several light sources in the said wave conductive layer, wherein said optical coupling elements are selected from the group of prism couplers, evanescent couplers with optical wave conductors coupled with superimposed evanescent fields, front surface coupled with focusing lenses arranged in front of a front face of said wave conducting layer of the evanescent field sensing platform, preferably cylindrical lenses and grid couplers.

Se prefiere en especial que en una capa conductora de ondas de la plataforma sensora de campo evanescente estén estampadas una o varias estructuras de rejilla para el desacople con el mismo o diferente período de rejilla y profundidad de rejilla que las estructuras de rejilla para el acoplamiento, que permiten el desacoplamiento de la luz conduce en dicha capa conductora de ondas. It is especially preferred that one or more grid structures for decoupling with the same or different grid period and grid depth be stamped on a wave-conducting layer of the evanescent field sensing platform as the grid structures for coupling, which allow decoupling of the light leads in said wave conducting layer.

Otras formas de realización de plataformas sensoras de campo evanescente que son apropiadas para una plataforma analítica según la invención, se describen por ejemplo en las solicitudes de patente WO 95/33197, WO 95/33198 y WO 96/35940, que se incorporan en la presente asimismo por completo como parte integral de la presente invención. Other embodiments of evanescent field sensing platforms that are suitable for an analytical platform according to the invention are described for example in patent applications WO 95/33197, WO 95/33198 and WO 96/35940, which are incorporated in the also present as an integral part of the present invention.

Otro objeto de la presente invención es el uso de un procedimiento según la invención o de una plataforma analítica según la invención para análisis cuantitativos y / o cualitativos para la determinación de analitos químicos, bioquímicos o biológicos en procedimientos de control en la investigación farmacológica, la química combinatoria, el desarrollo clínico y preclínico, estudios de unión en tiempo real y para la determinación de parámetros cinéticos en el control de afinidad y en la investigación, para determinaciones cualitativas y cuantitativas de analitos, en especial, para el análisis de ADN y ARN y la determinación de diferencias genómicas o proteómicas en el genoma como, por ejemplo, polimorfismos de mononucleótidos, para la medición de interacciones de proteína y ADN, para la determinación de mecanismos de control para la expresión de ARNm y para la (bio)síntesis de proteínas, para la confección de estudios de toxicidad, así como para la determinación de perfiles de expresión, en especial, para la determinación de sustancias marcadoras biológicas y químicas como ARNm, proteínas, péptidos o sustancias (mensajeras) orgánicas de bajo peso molecular, así como para la detección de anticuerpos, antígenos, patógenos o bacterias en la investigación y desarrollo farmacéuticos, el diagnóstico humano y veterinario, la investigación y el desarrollo de productos agroquímicos, el diagnóstico sintomático y presintomático en plantas, para la estratificación de pacientes en el desarrollo de productos farmacéuticos y para la selección terapéutica de medicamentos, para la detección de agentes patógenos, sustancias nocivas y agente causantes especialmente de salmonelas, priones, virus y bacterias, en especial, en el análisis ambiental y de comestibles. Another object of the present invention is the use of a method according to the invention or an analytical platform according to the invention for quantitative and / or qualitative analyzes for the determination of chemical, biochemical or biological analytes in control procedures in pharmacological research, the Combinatorial chemistry, clinical and preclinical development, real-time binding studies and for the determination of kinetic parameters in affinity control and in research, for qualitative and quantitative analyte determinations, especially for DNA and RNA analysis and the determination of genomic or proteomic differences in the genome, such as mononucleotide polymorphisms, for the measurement of protein and DNA interactions, for the determination of control mechanisms for mRNA expression and for (bio) synthesis of proteins, for the preparation of toxicity studies, as well as for dete rmination of expression profiles, especially for the determination of biological and chemical marker substances such as mRNA, proteins, peptides or organic substances (messengers) of low molecular weight, as well as for the detection of antibodies, antigens, pathogens or bacteria in the pharmaceutical research and development, human and veterinary diagnosis, research and development of agrochemicals, symptomatic and presymptomatic diagnosis in plants, for the stratification of patients in the development of pharmaceutical products and for the therapeutic selection of medications, for the detection of pathogens, harmful substances and causative agents especially of salmonellae, prions, viruses and bacteria, especially in the environmental and edible analysis.

La invención se explicará con mayor detalle a continuación por medio de ejemplos de realización, en los que las formas de realización allí descritas no implican una limitación de la generalidad. The invention will be explained in greater detail below by means of embodiments, in which the embodiments described therein do not imply a limitation of the generality.

Examples 1.

Plataforma analítica Analytical platform

1.1. Evanescent Field Sensing Platform

Como plataforma analítica sirve una plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido con las dimensiones de 14 mm de ancho x 57 mm de largo x 0,7 mm de espesor. La plataforma sensora de campo evanescente está acuñada como un conductor de ondas de capa fina, que comprende un sustrato de vidrio (AF 45) y una capa de pentóxido de tantalio de alto índice de refracción de 150 nm de espesor aplicado sobre él. En el sustrato de vidrio, paralelamente al largo, se modulan dos rejillas de relieve superficial (período de rejilla: 318 nm, profundidad de rejilla: (12 +/– 2) nm) en una distancia de 9 mm. En la siguiente aplicación de la capa de alto índice de refracción, se transfirieron estas estructuras a la superficie de la capa de pentóxido de tantalio que deben servir como rejilla difractiva del acoplamiento de luz en la capa de alto índice de refracción. An analytical platform serves as an evanescent field sensor platform as a solid support with the dimensions of 14 mm wide x 57 mm long x 0.7 mm thick. The evanescent field sensing platform is wedged as a thin-layer wave conductor, comprising a glass substrate (AF 45) and a tantalum pentoxide layer of high refractive index of 150 nm thickness applied thereto. In the glass substrate, parallel to the length, two surface relief gratings are modulated (grid period: 318 nm, grid depth: (12 +/– 2) nm) over a distance of 9 mm. In the next application of the high refractive index layer, these structures were transferred to the surface of the tantalum pentoxide layer that should serve as a diffractive grid of the light coupling in the high refractive index layer.

Después de una limpieza cuidadosa de la plataforma sensora de campo evanescente, se genera en la superficie de la capa de óxido metálico una monocapa de mono–dodecilfosfato (DDP) por autoorganización espontánea como capa adhesiva por medio de separación de solución acuosa (0,5 mM de DDP). Esta modificación superficial de la superficie de óxido metálico antes hidrofílica lleva a una superficie hidrofóbica (con un ángulo de contacto de aproximadamente 100° respecto de agua), sobre la qu e se debe aplicar una multiplicidad de “muestras de inmovilización” con analitos allí contenidos como participantes específicos de unión para la detección de analitos en una reacción de unión específica. After careful cleaning of the evanescent field sensing platform, a monolayer of mono-dodecyl phosphate (DDP) is generated on the surface of the metal oxide layer by spontaneous self-organization as an adhesive layer by means of separation of aqueous solution (0.5 mM of DDP). This superficial modification of the previously hydrophilic metal oxide surface leads to a hydrophobic surface (with a contact angle of approximately 100 ° with respect to water), on which a multiplicity of "immobilization samples" with analytes contained therein should be applied as specific binding participants for the detection of analytes in a specific binding reaction.

Sobre las plataformas sensoras de campo evanescentes provistas de la capa adhesiva hidrófoba, se aplican 6 micromatrices idénticas con 90 áreas de medición cada una (Spots), a su vez, en una dispositivo de 10 filas y 9 columnas, con un Inkjet–Spotter (Modelo BCA1, Perkin Elmer, Boston, MA, Estados Unidos). Cada spot se genera por aplicación de una única gotita de 280 µL de volumen sobre la superficie del chip. On the evanescent field sensor platforms provided with the hydrophobic adhesive layer, 6 identical microarrays are applied with 90 measuring areas each (Spots), in turn, in a 10-row device and 9 columns, with an Inkjet-Spotter ( Model BCA1, Perkin Elmer, Boston, MA, United States). Each spot is generated by applying a single droplet of 280 µL volume on the surface of the chip.

1.2. Reagents and generation of measurement area matrices

Para la detección de analitos de proteínas biológicamente relevantes en “muestras de inmovilización” se usan cultivos de células T humanas (Jurkat, DMZ # ACC282). Estas células se cultivan en una solución que contiene RPMI 1640, 10% de FCS (suero bovino fetal), 2 mM de glutamina, 50 U/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptamicina a 37 °C (densidad celular aproximadamente 0,5–1,0 x 106 células/ml). Estas células se incuban luego con anticuerpos, a saber “ratón–anti–humano–CD3” (“mouse–α–human–CD3”) o bien “ratón–anti–humano–CD28” (“mouse–α–human–CD28”), contra los receptores de superficie CD3 o bien CD28 (en una solución de 1 µg/ml durante 10 min). Para una muestra comparativa con los cultivos celulares tratados con los anticuerpos, se usa un cultivo celular por lo demás similar, que quedó sin tratar y que servirá en el procedimiento de detección analítico como control negativo. Otro cultivo celular por lo demás similar se trata con estaurosporina (concentración: 10 µM), un potente inhibidor de la proteína quinasa, durante 180 min. For the detection of biologically relevant protein analytes in "immobilization samples" human T cell cultures are used (Jurkat, DMZ # ACC282). These cells are cultured in a solution containing RPMI 1640, 10% FCS (fetal bovine serum), 2 mM glutamine, 50 U / ml penicillin, 50 µg / ml streptamycin at 37 ° C (cell density approximately 0, 5–1.0 x 106 cells / ml). These cells are then incubated with antibodies, namely "mouse-anti-human-CD3" ("mouse-α-human-CD3") or "mouse-anti-human-CD28" ("mouse-α-human-CD28 ”), Against CD3 or CD28 surface receptors (in a solution of 1 µg / ml for 10 min). For a comparative sample with the cell cultures treated with the antibodies, an otherwise similar cell culture is used, which was left untreated and will serve in the analytical detection procedure as a negative control. Another otherwise similar cell culture is treated with staurosporin (concentration: 10 µM), a potent protein kinase inhibitor, for 180 min.

Luego se enfrían los cultivos celulares tratados de esta forma o bien no tratados se enfrían hasta 4 °C y se sedimentan durante 2 minutos con una fuerza de centrifugación de 350x g (cantidad celular aproximadamente 107). En este caso, se separan las células únicamente, sin daño, del medio. Luego se decanta el sobrenadante y se añade tampón de lisis (7 M de urea, 2 M de tiourea, 4% de CHAPS, 1% de DTT, 4 mM de espermidina y Complete (inhibidor de proteasa, Roche AG, 1 comprimido/50 ml)), en donde la concentración de proteína total se regula a aproximadamente 10 mg/ml. Todos los componentes celulares con contenido de proteína se desnaturalizan y solubilizan aquí de forma espontánea y completa. Then, the treated or untreated cell cultures are cooled, cooled to 4 ° C and sedimented for 2 minutes with a centrifugal force of 350x g (approximately 107 cell quantity). In this case, the cells are separated only, without damage, from the medium. The supernatant is then decanted and lysis buffer is added (7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 1% DTT, 4 mM spermidine and Complete (protease inhibitor, Roche AG, 1 tablet / 50 ml)), where the total protein concentration is regulated at approximately 10 mg / ml. All cellular components with protein content are denatured and solubilized here spontaneously and completely.

Por centrifugación a 13000 x g se centrifuga el material que contiene el ADN. El sobrenadante se regula después de nueva dilución en un factor 10 (ver más abajo) como “muestra de inmovilización”. The material containing the DNA is centrifuged by centrifugation at 13000 x g. The supernatant is regulated after further dilution by a factor of 10 (see below) as "immobilization sample".

El tratamiento con los anticuerpos mencionados sirve como sistema de modelo para la activación de coestimulación de linfocitos T humanos (M. Diehn et al., “Genomic expression programs and the integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation”, Proceedings of the National Academy of Sciences 99 (2002) 11796 – 11801). La unión de dichos anticuerpos con los receptores unidos a la membrana celular desencadena una cascada de fosforilación con vías de señales distintas conectadas dentro de las células en cuestión. La actividad de una determina vía de señales se puede detectar aquí por medio de la determinación del grado de fosforilación de una proteína clave implicada correspondiente (como una llamada “proteína marcadora”) o sus sustratos, lo cual se debe llevar a cabo con ayudar de una plataforma analítica según la invención. Treatment with the aforementioned antibodies serves as a model system for the activation of costimulation of human T lymphocytes (M. Diehn et al., “Genomic expression programs and the integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation”, Proceedings of the National Academy of Sciences 99 (2002) 11796-11801). The binding of said antibodies with the receptors bound to the cell membrane triggers a phosphorylation cascade with distinct signal pathways connected within the cells in question. The activity of a determined signal pathway can be detected here by determining the degree of phosphorylation of a corresponding involved key protein (such as a so-called "marker protein") or its substrates, which should be carried out with the help of an analytical platform according to the invention.

Las muestras obtenidas con ayuda de las etapas de preparación descritas previamente se diluyen nuevamente en un factor de 10 hasta una concentración de proteína total de aproximadamente 1 mg/ml y luego se aplican en áreas de medición diferenciadas para generar una matriz de áreas de medición sobre la plataforma sensora de campo evanescente provista de la capa adhesiva. Samples obtained with the aid of the preparation steps described above are again diluted by a factor of 10 to a total protein concentration of approximately 1 mg / ml and then applied in differentiated measurement areas to generate a matrix of measurement areas on the evanescent field sensing platform provided with the adhesive layer.

Además de las áreas de medición con las muestras allí aplicadas, cada micromatriz contiene otros áreas de medición con albúmina de suero bovino marcado con fluorescencia Cy5 allí inmovilizada (Cy5–BSA), que se usan para referenciación de diferencias locales y / o variaciones temporales de la intensidad de la luz de excitación en la medición (“Spots de referencia”). Cy5–BSA se aplica en una concentración de 1,0 nM en solución de cloruro de sodio tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) (tasa de marcación: 3 moléculas de Cy5 por molécula de BSA). In addition to the measurement areas with the samples applied there, each microarray contains other measurement areas with bovine serum albumin labeled with immobilized Cy5 fluorescence (Cy5 – BSA), which are used for referencing local differences and / or temporal variations of the intensity of the excitation light in the measurement ("Reference Spots"). Cy5 – BSA is applied at a concentration of 1.0 nM in phosphate buffered sodium chloride solution (PBS, pH 7.4) (labeling rate: 3 Cy5 molecules per BSA molecule).

Tras aplicar las “muestras de inmovilización” y Cy5–BSA, se almacena la plataforma analítica durante dos horas a temperatura ambiente y 100 % de humedad relativa ambiente y luego se seca a temperatura ambiente. A continuación se saturan las áreas de la superficie hidrófoba libre no cubierta con proteína de la plataforma sensora de campo evanescente con albúmina de suero bovino (BSA), incubando la superficie con una solución de BSA (30 mg/ml) en 50 mM de imidazol / 100 mM de NaCl (pH 7,4). Luego se lava con agua la plataforma sensora de campo evanescente con las áreas de medición generados arriba y luego se seca en una corriente de nitrógeno y se almacena a 4 °C para realizar el procedimiento de d etección según la invención. After applying the “immobilization samples” and Cy5 – BSA, the analytical platform is stored for two hours at room temperature and 100% ambient relative humidity and then dried at room temperature. The areas of the free hydrophobic surface not covered with protein from the evanescent field sensing platform with bovine serum albumin (BSA) are then saturated, incubating the surface with a solution of BSA (30 mg / ml) in 50 mM imidazole / 100 mM NaCl (pH 7.4). The evanescent field sensor platform is then washed with water with the measurement areas generated above and then dried in a stream of nitrogen and stored at 4 ° C to perform the detection procedure according to the invention.

La geometría de una disposición típica de las áreas de medición en una matriz bidimensional y una disposición lineal de seis matrices (idénticas) sobre una plataforma sensora de campo evanescente está representada en la Figura 1 (para los ejemplos, que se tratan con mayor detalle por medio de la Figura 3A/B o bien Figura 4A/B). El diámetro de las manchas, con una distancia de centro a centro de 600 µm, es de aproximadamente 90 µm. Una matriz de áreas de medición comprende para estos ejemplos en cada caso una disposición de áreas de medición con 8 distintas muestras aplicadas en 5 replicaciones, en donde los 5 áreas de medición similares están dispuestos en una columna común vertical a la dirección de expansión de la luz conducida durante la etapa de detección en la capa conductora de ondas de la plataforma analítica. Con ayuda de los 5 áreas de medición similares, se debe determinar la reproducibilidad de las señales de medición dentro de la matriz de áreas de medición. Entre y junto a las columnas de las áreas de medición con muestras para analizar allí aplicadas, están dispuestas columnas de áreas de medición con Cy5–BSA allí aplicado (con fines de referenciación). La plataforma analítica según la invención comprende en este ejemplo 6 matrices similares de áreas de medición, tal como se representa en la Figura 1. The geometry of a typical arrangement of the measurement areas in a two-dimensional matrix and a linear arrangement of six (identical) matrices on an evanescent field sensing platform is represented in Figure 1 (for examples, which are treated in greater detail by middle of Figure 3A / B or Figure 4A / B). The diameter of the spots, with a distance from center to center of 600 µm, is approximately 90 µm. An array of measurement areas comprises for these examples in each case an arrangement of measurement areas with 8 different samples applied in 5 replications, where the 5 similar measurement areas are arranged in a common vertical column to the direction of expansion of the light conducted during the detection stage in the conductive wave layer of the analytical platform. With the aid of the 5 similar measurement areas, the reproducibility of the measurement signals within the matrix of measurement areas must be determined. Between and next to the columns of the measurement areas with samples to analyze applied there, columns of measurement areas with Cy5-BSA applied there are arranged (for reference purposes). The analytical platform according to the invention comprises in this example 6 similar matrices of measurement areas, as shown in Figure 1.

2. Analytical detection procedure 2.1. Essay architecture

La detección de determinadas proteínas en general (es decir, por ejemplo, con o sin fosforilación) o bien de determinadas proteínas en especial en forma activada (por ejemplo, fosforilada) en los lisados celulares inmovilizados como “muestras de inmovilización” aplicadas en áreas de medición diferenciadas se realiza con ayuda de una adición secuencial de correspondientes reactivos de detección como etapas del ensayo antes de la medición de las señales de fluorescencia resultantes: para preparar una primera etapa del ensayo, se diluyen anticuerpos de conejo policlonales específicos de analitos (anticuerpo A1 (#2261): sustrato fosfo–(Ser) PKC; anticuerpo A2 (#9611): sustrato fosfo–(Ser/Thr) Akt; anticuerpo A3 (#9101): fosfo–p44/42 MAP quinasa (Thr202/Tyr204); anticuerpo A4 (#9102): p44/42 MAP quinasa (Thr202/Tyr204); todos los anticuerpos adquiridos de Cell Signaling Technology, INC., Beverly, MA, Estados Unidos) típicamente en la relación 1:500 en tampón de ensayo (50 mM de imidazol, 100 mM de NaCl, 0,1% de BSA, 0,05% de Tween 20 pH 7,4). De estas cuatro soluciones de anticuerpos distintas, se aplican en cada caso 30 µl sobre cada una de las 6 matrices idénticas de áreas de medición, seguido de una incubación a temperatura ambiente durante la noche (primera etapa de ensayo). Los anticuerpos excedentes no unidos específicamente se eliminan por lavado de cada matriz con tampón de ensayo (5x100 ul). The detection of certain proteins in general (that is, for example, with or without phosphorylation) or of certain proteins especially in activated form (for example, phosphorylated) in immobilized cell lysates as "immobilization samples" applied in areas of Differentiated measurement is performed with the aid of a sequential addition of corresponding detection reagents as test steps before the measurement of the resulting fluorescence signals: to prepare a first stage of the assay, analyte specific polyclonal rabbit antibodies are diluted (antibody A1 (# 2261): phospho substrate - (Ser) PKC; A2 antibody (# 9611): phospho substrate - (Ser / Thr) Akt; A3 antibody (# 9101): phospho-p44 / 42 MAP kinase (Thr202 / Tyr204); A4 antibody (# 9102): p44 / 42 MAP kinase (Thr202 / Tyr204); all antibodies acquired from Cell Signaling Technology, INC., Beverly, MA, United States) typically in the 1: 500 ratio in salad buffer I (50 mM imidazole, 100 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% Tween 20 pH 7.4). Of these four different antibody solutions, 30 µl are applied in each case on each of the 6 identical matrices of measurement areas, followed by an incubation at room temperature overnight (first test stage). Surplus antibodies not specifically bound are removed by washing each matrix with assay buffer (5x100 ul).

Los 4 distintos anticuerpos utilizados aquí son básicamente de distinta naturaleza: los anticuerpos A1 y A2 reconocen y se unen a una serie de proteínas diversas fosforiladas en serían o bien serina/treonina, que sirven a las proteína quinasas como sustratos. Éstos se reconocen por una multiplicidad de bandas en Western–Blot (Figura 2A y sección 2.4, “Resultados”). Los anticuerpos A3 y A4 reconocen y unen el mismo tipo de compuesto, a saber, la p44/42 MAP–quinasa (también mencionada Erk2), pero en donde el anticuerpo A3 sólo conoce su forma fosforilada “activa” (pErk2), mientras que el anticuerpo A4 reconoce ambas formas (la forma no fosforilada Erk2 y la forma fosforilada pErk2) y se une a ellas. The 4 different antibodies used here are basically of a different nature: the A1 and A2 antibodies recognize and bind to a series of various phosphorylated proteins in either serine / threonine, which serve the protein kinases as substrates. These are recognized by a multiplicity of bands in Western – Blot (Figure 2A and section 2.4, “Results”). The A3 and A4 antibodies recognize and bind the same type of compound, namely p44 / 42 MAP kinase (also mentioned Erk2), but where the A3 antibody only knows its "active" phosphorylated form (pErk2), while antibody A4 recognizes both forms (the non-phosphorylated Erk2 form and the phosphorylated form pErk2) and binds to them.

Para la detección de anticuerpos específicos de analitos contenidos en áreas de medición diferenciadas unidos allí a las muestras inmovilizadas se realiza una segunda etapa de ensayo usando un anticuerpo anti–conejo marcado con Cy5 (Amersham Biosciences, Dübendorf, CH), que se une a todos los anticuerpos antes mencionados A1 – A4. Este anticuerpo marcado con Cy5 se aplica en una concentración de típicamente 10 nM en tampón de ensayo sobre las matrices (30 µl cada una) y así se deja incubar durante 2 horas a temperatura ambiente a la oscuridad. Luego se lavan las matrices con tampón de ensayo (cinco veces con 100 µl por vez), para eliminar los anticuerpos de Cy5– anti–conejo no unidos específicamente. Luego se almacenan las plataformas analíticas así preparadas hasta la etapa de detección por medio de excitación y detección de señales de fluorescencia resultantes en ZeptoREADER™ (ver bajo). For the detection of specific analyte antibodies contained in differentiated measurement areas attached thereto to the immobilized samples, a second test step is performed using a Cy5-labeled anti-rabbit antibody (Amersham Biosciences, Dübendorf, CH), which binds all the aforementioned antibodies A1-A4. This Cy5-labeled antibody is applied at a concentration of typically 10 nM in assay buffer on the matrices (30 µl each) and thus allowed to incubate for 2 hours at room temperature in the dark. The matrices are then washed with assay buffer (five times with 100 µl at a time), to remove Cy5-anti-rabbit antibodies not specifically bound. The analytical platforms thus prepared are stored until the detection stage by means of excitation and detection of fluorescence signals resulting in ZeptoREADER ™ (see below).

2.2. Determination of the fluorescence signals of the measurement area matrices

Las señales de fluorescencia de las distintas matrices de áreas de medición se miden automáticamente de modo secuencial con un ZeptoREADER™ (Zeptosens AG, CH–4108 Witterswil, Suiza). Para cada matriz de áreas de medición se ajusta la plataforma analítica según la invención para satisfacer la condición de resonancia para el acoplamiento de luz en la capa de pentóxido de tantalio conductora de ondas y para maximizar la luz de excitación disponible en las áreas de medición. Luego se genera en cada matriz una cantidad seleccionable por el usuario de imágenes de señales de fluorescencia de la matriz en cuestión, pudiendo seleccionar distintos tiempos de iluminación. La longitud de ondas de excitación es, en el caso de las mediciones para el presente ejemplo de 633 nm, la detección de la luz de fluorescencia se realiza con una cámara enfriada con una longitud de onda de fluorescencia de Cy5, usando un filtro de interferencia (transmisión 670 ± 20 nm) para suprimir la luz dispersa en la longitud de onda de excitación que se posiciona delante del objeto de la cámara. Las imágenes de fluorescencia generadas se almacenan automáticamente en la placa de memoria de la computadora de control. Otros detalles del sistema óptico (ZeptoREADER™) se describen en la solicitud de patente internacional PCT/EP 01/10012, que se introduce por completo como parte integral de esta solicitud. The fluorescence signals of the different measurement area matrices are automatically measured sequentially with a ZeptoREADER ™ (Zeptosens AG, CH-4108 Witterswil, Switzerland). For each matrix of measurement areas, the analytical platform according to the invention is adjusted to satisfy the resonance condition for the light coupling in the wave-conducting tantalum pentoxide layer and to maximize the excitation light available in the measurement areas. A user selectable amount of fluorescence signal images of the matrix in question is then generated in each matrix, and different lighting times can be selected. The excitation wavelength is, in the case of measurements for the present example of 633 nm, the detection of the fluorescence light is performed with a chamber cooled with a fluorescence wavelength of Cy5, using an interference filter (670 ± 20 nm transmission) to suppress scattered light at the excitation wavelength that is positioned in front of the camera object. The generated fluorescence images are automatically stored on the memory board of the control computer. Other details of the optical system (ZeptoREADER ™) are described in the international patent application PCT / EP 01/10012, which is fully introduced as an integral part of this application.

2.3. Evaluation and referencing:

La intensidad de señal media de las áreas de medición (Spots) se determina por medio de un software de análisis de imágenes (ZeptoVIEW, Zeptosens AG, CH–4108 Witterswil), que permite evaluar las imágenes de fluorescencia de una multiplicidad de matrices de áreas de medición de forma semiautomática. The average signal intensity of the measurement areas (Spots) is determined by means of an image analysis software (ZeptoVIEW, Zeptosens AG, CH-4108 Witterswil), which allows to evaluate the fluorescence images of a multiplicity of area matrices Semi-automatic measurement.

Los datos en bruto de cada uno de los píxeles de la cámara representan una matriz bidimensional de valores de medición digitalizados con la intensidad medida como valor de medición de cada píxel correspondiente a la superficie reflejada en ella sobre la plataforma sensora. Para la evaluación de los datos, primero se coloca manualmente una red bidimensional (de coordenadas) sobre los puntos de imagen (valores de píxeles) de forma tal que la imagen parcial de cada spot recae en un elemento de red bidimensional individual. Dentro de este elemento de red, se asigna a cada spot un “valor de evaluación” circular lo más adecuado posible (area of interest, AOI) con un radio predeterminado por el usuario (típicamente 90 µm). Mediante el software de análisis de imágenes, se determina el lugar de cada AOI de forma individual en función de la intensidad de la señal de cada píxel. En este caso, se mantiene el radio de AOI predeterminado al comienzo por el usuario. Como intensidad de señal bruta media de cada spot se determina la media aritmética de los valores de píxeles (intensidades de señales) dentro de un rango de evaluación seleccionado. The raw data of each of the camera's pixels represents a two-dimensional matrix of digitized measurement values with the intensity measured as the measurement value of each pixel corresponding to the surface reflected in it on the sensor platform. For the evaluation of the data, a two-dimensional network (of coordinates) is first placed manually over the image points (pixel values) so that the partial image of each spot falls on an individual two-dimensional network element. Within this network element, each spot is assigned a circular "evaluation value" as appropriate as possible (area of interest, AOI) with a radius predetermined by the user (typically 90 µm). Using the image analysis software, the location of each AOI is determined individually based on the signal strength of each pixel. In this case, the default AOI radius is maintained at the beginning by the user. The arithmetic mean of the pixel values (signal intensities) within a selected evaluation range is determined as the mean gross signal intensity of each spot.

Las señales de fondo se determinan a partir de las intensidades de señales medidas entre los spots. Para ello, se definen por spot cuatro otras superficies circulares (típicamente con igual radio como para los rangos de evaluación de los spots) como rangos de evaluación para la determinación de la señal de fondo, que están dispuestas con preferencia en el medio entre spots adyacentes. De estas cuatro superficies circulares, se determina la intensidad de señal de fondo media, por ejemplo, como la media aritmética de los valores de píxeles (intensidades de señales) dentro de un AOI seleccionado para ello. La intensidad de señal neta media proveniente de las áreas de medición (spots) se calcula luego como diferencia entre la intensidad de señal bruta media local y de fondo media local de cada spot. Background signals are determined from the intensities of signals measured between the spots. For this, four other circular surfaces are defined by spot (typically with the same radius as for the evaluation ranges of the spots) as evaluation ranges for the determination of the background signal, which are preferably arranged in the middle between adjacent spots . From these four circular surfaces, the average background signal intensity is determined, for example, as the arithmetic mean of the pixel values (signal intensities) within an AOI selected for it. The average net signal intensity from the measurement areas (spots) is then calculated as the difference between the local average gross and local average background signal intensity of each spot.

La referenciación de la intensidad de señales netas de todos los spots se realiza por medio de spots de referencia (Cy5–BSA) de cada matriz de áreas de medición. Para ello, se divide la intensidad de señal neta de cada spot por el valor medio de la intensidad de señal neta del spot de referencia adyacente de la misma serie (dispuesta paralelamente a la dirección de expansión de la luz conducida en la plataforma sensora de campo evanescente). Por esta referenciación, se compensan las diferencias locales de la intensidad disponible de la luz de excitación ortogonalamente a la dirección de expansión de la luz tanto dentro de una micromatriz como también entre distintas micromatrices. The reference of the intensity of net signals of all the spots is carried out by means of reference spots (Cy5 – BSA) of each matrix of measurement areas. For this, the net signal intensity of each spot is divided by the average value of the net signal intensity of the adjacent reference spot of the same series (arranged parallel to the direction of expansion of the light conducted on the field sensing platform evanescent). By this referencing, the local differences in the available intensity of the excitation light are orthogonally compensated to the direction of expansion of the light both within a microarray and also between different microarrays.

2.4. Results

La Figura 2 muestra los resultados que se lograron por medio del procedimiento según la invención con la plataforma analítica según la invención. El diagrama de barras muestra en cada caso en comparación los resultados del cultivo celular tratado con los anticuerpos contra los receptores de superficie CD23 (“αCD3”) y CD28 (“αCD28”) (barras llenas) y el cultivo no tratado (“control negativo”, barras vacías), qué muestras “de naturaleza idéntica” obtenidas después de aplicación en 6 matrices similares de áreas de medición sobre una plataforma sensora de campo evanescente descrita con anterioridad se pusieron en contacto con las soluciones de los distintos anticuerpos A1 – A4. En este caso, se aplicaron en 4 matrices similares que estaban dispuestas en distintos recipientes de muestras en una plataforma sensora de campo evanescente común, distintas soluciones que contenían uno de los 4 anticuerpos A1 – A4 mencionados y luego, tal como se describió en el punto 2.1., se añadieron anticuerpos anti– conejo marcados con Cy5. En la Figura 2 se representan los valores medios de las intensidades de señales referenciadas según el procedimiento antes descrito de cinco áreas de medición similares dentro de una matriz y sus desviaciones estándar. Figure 2 shows the results that were achieved by means of the method according to the invention with the analytical platform according to the invention. In each case, the bar diagram shows in comparison the results of the cell culture treated with the antibodies against the surface receptors CD23 ("αCD3") and CD28 ("αCD28") (full bars) and the untreated culture ("negative control ”, Empty bars), which“ identical nature ”samples obtained after application in 6 similar matrices of measurement areas on an evanescent field sensing platform described above were contacted with the solutions of the various A1-A4 antibodies. In this case, they were applied in 4 similar matrices that were arranged in different sample containers on a common evanescent field sensing platform, different solutions containing one of the 4 A1-A4 antibodies mentioned and then, as described in point 2.1., Cy5-labeled anti-rabbit antibodies were added. The average values of the signal strengths referenced according to the above-described procedure of five similar measurement areas within a matrix and their standard deviations are shown in Figure 2.

A este respecto, las intensidades de señales calculadas se correlacionan con la concentración de un analito determinado presente (alta intensidad de señal equivalente a alta concentración). Claramente se puede reconocer que por tratamiento de los cultivos celulares de Jurkat con los anticuerpos contra los receptores de superficie CD23 (“αCD3”) y CD28 (“αCD28”) (“estimulación”) se elevó la concentración intracelular relativa de los sustratos fosfo– (Ser) PKC– y fosfo–(Ser/Thr) Akt a casi el doble, en comparación con el control negativo. Aún más, a saber en el factor 5, aumentó la concentración de pErk2, en donde la suma del contenido de Erk2 y pErk2 (detectado con ayuda del anticuerpo A4) dentro de la precisión de medición permaneció constante. Esto significa que dentro de la duración de la estimulación de 10 minutos, el contenido total de Erk2 no se elevó por aumento de la expresión, sino sólo el contenido de pErk2 se elevó por fosforilación. In this regard, the calculated signal intensities correlate with the concentration of a given analyte present (high signal intensity equivalent to high concentration). It can clearly be recognized that by treating Jurkat cell cultures with antibodies against the surface receptors CD23 ("αCD3") and CD28 ("αCD28") ("stimulation") the relative intracellular concentration of the phospho- substrates was raised (Ser) PKC– and phospho– (Ser / Thr) Akt at almost double, compared to the negative control. Moreover, namely in factor 5, the concentration of pErk2 increased, where the sum of the content of Erk2 and pErk2 (detected with the aid of the A4 antibody) within the measurement accuracy remained constant. This means that within the duration of the 10 minute stimulation, the total Erk2 content was not raised by increased expression, but only the pErk2 content was raised by phosphorylation.

A fin de evaluar la sensibilidad del procedimiento según la invención para la detección de una única “proteína marcadora” interesante en una muestra aplicada en un campo de medición, es decir, en el proteoma inmovilizado en cada campo de medición, se dividió un lisado celular no tratado (control negativo), que según el ensayo realizado con anterioridad (cuyos resultados se representan en la Figura 2) contenía comprobablemente sólo un muy bajo contenido de pErk2 (tercer par de barras en la Figura 2), para un segundo ensayo en soluciones parciales individuales que se mezclan con esta “proteína marcadora” en distintas concentraciones de (0–3645 ng/ml). Luego se inmovilizan estas soluciones, tal como se describió con anterioridad, sobre el chip planar del conductor de ondas y se realiza un ensayo de acuerdo con el punto 2.1 (usando anticuerpo A3). La Figura 3A muestra una distribución típica de señales de una matriz de áreas de medición, en donde los rectángulos marcados representan en cada caso 5 spots de replicación de una concentración de pErk2 añadida al lisado celular no tratado (1–8: mayor concentración de acuerdo con la disposición geométrica representada en la Figura). In order to evaluate the sensitivity of the method according to the invention for the detection of a single interesting "marker protein" in a sample applied in a measurement field, that is, in the immobilized proteome in each measurement field, a cell lysate was divided untreated (negative control), which according to the test carried out previously (whose results are shown in Figure 2) probably contained only a very low content of pErk2 (third pair of bars in Figure 2), for a second test in solutions individual partials that are mixed with this "marker protein" in different concentrations of (0–3645 ng / ml). These solutions are then immobilized, as described above, on the planar chip of the wave conductor and an assay is performed according to item 2.1 (using A3 antibody). Figure 3A shows a typical distribution of signals from an array of measurement areas, where the marked rectangles in each case represent 5 replication spots of a concentration of pErk2 added to the untreated cell lysate (1-8: higher concentration of agreement with the geometric arrangement represented in the Figure).

El resultado de esta medición para la detección de pErk2, en función de su concentración añadida, se puede describir por una típica curva de unión, adecuando una función Hill al curso de la concentración de las señales (Fig. 3B). Cada punto de datos en la Figura 3B representa el valor medio de las intensidades de señales netas referenciadas de 5 spots de analitos replicados, cada uno con su correspondiente desviación estándar marcada por medio de barras de error. El corte ampliado de la imagen en la Figura 3B muestra el curso de la concentración de las señales para las menores concentraciones, cuyo aumento en la representación para todo el curso de la concentración ya no se puede resolver. Como sensibilidad del ensayo (Limit of Detection), sobre la base de la suma de la señal del valor 0 (“Blank”, sin p–Erk2 añadido) y su doble desviación estándar, se determina un valor de 2,0 ng/ml, lo cual equivale a una fracción en peso de 2,3 x 10–6 g por g de proteína total. The result of this measurement for the detection of pErk2, depending on its added concentration, can be described by a typical binding curve, a Hill function adapting to the course of the signal concentration (Fig. 3B). Each data point in Figure 3B represents the average value of the referenced net signal intensities of 5 replicated analyte spots, each with its corresponding standard deviation marked by means of error bars. The enlarged section of the image in Figure 3B shows the course of the concentration of the signals for the lower concentrations, whose increase in the representation for the entire course of the concentration can no longer be resolved. As sensitivity of the test (Limit of Detection), based on the sum of the signal of the value 0 ("Blank", without p-Erk2 added) and its double standard deviation, a value of 2.0 ng / ml is determined , which is equivalent to a weight fraction of 2.3 x 10–6 g per g of total protein.

Las Figuras 4A y 4B muestran los resultados de un tercer ensayo esencialmente análogo al segundo. Como diferencia del segundo ensayo previamente descrito con los resultados representados en la Figura 3A y 3B, se realiza en este tercer ensayo el ensayo de acuerdo con el punto 2.1 usando el anticuerpo A4 (es decir, con adición a la matriz similar como en el segundo ensayo). En este ensayo, también se determina la totalidad de compuesto fosforilado y no fosforilado (pErk2 y Erk2), correspondiente a la adición diferente de pErk2. La Figura 4A muestra una típica distribución de señales de una matriz de áreas de medición, en donde los rectángulos marcados a su vez representan en cada caso 5 spots de replicación de una concentración de pErk2 añadida al lisado celular sin tratar (1–8: mayor concentración, según la disposición geométrica representada en la Figura 1). En este caso, se determina para la sensibilidad del ensayo (Limit of Detection) un valor de 110 ng/ml, lo cual equivale a una fracción en peso de 1,1x10–4 g por g de proteína total. Figures 4A and 4B show the results of a third test essentially analogous to the second. As a difference from the second test previously described with the results represented in Figure 3A and 3B, the test according to item 2.1 is performed in this third test using antibody A4 (ie, with addition to the similar matrix as in the second test). In this test, the totality of phosphorylated and non-phosphorylated compound (pErk2 and Erk2), corresponding to the different addition of pErk2, is also determined. Figure 4A shows a typical signal distribution of an array of measurement areas, where the marked rectangles in turn represent in each case 5 replication spots of a concentration of pErk2 added to the untreated cell lysate (1–8: higher concentration, according to the geometric arrangement represented in Figure 1). In this case, a value of 110 ng / ml is determined for the sensitivity of the assay (Limit of Detection), which is equivalent to a weight fraction of 1.1x10-4 g per g of total protein.

En otro cuarto experimento se ensaya si también distintas modificaciones de la concentración en pErk2 como consecuencia de la coestimulación de células Jurkat se pueden detectar con αCD3/αCD28, con distinta duración de estimulación y si las diferencias de estas modificaciones se pueden resolver con el procedimiento según la invención. Para ello, se incuban cultivos celulares Jurkat antes de su lisis durante un tiempo diferente (en el intervalo de los minutos) con 1 µg/ml de αCD3/αCD28. Además, se trata un cultivo celular Jurkat con estaurosporina (inhibidor de proteína quinasa). Este último cultivo celular sirve como control negativo, ya que aquí debido a la inhibición de todas las proteína quinasas no debía haber pErk2 (ver también el punto 1.2), una señal medida para ello también debería corresponder a la señal de una muestra libre de pErk2. Luego se someten a spots los lisados celulares tratados de esta manera sobre la plataforma sensora de campo evanescente y se realiza un ensayo de acuerdo con el punto 2.1, usando el anticuerpo A3 para la detección de las modificaciones de las concentraciones de pErk2. In another fourth experiment it is tested whether different modifications of the concentration in pErk2 as a result of the costimulation of Jurkat cells can also be detected with αCD3 / αCD28, with different duration of stimulation and if the differences of these modifications can be resolved with the procedure according to the invention. To do this, Jurkat cell cultures are incubated before lysis for a different time (in the interval of minutes) with 1 µg / ml of αCD3 / αCD28. In addition, a Jurkat cell culture is treated with staurosporine (protein kinase inhibitor). This last cell culture serves as a negative control, since here due to the inhibition of all protein kinases there should be no pErk2 (see also point 1.2), a signal measured for this should also correspond to the signal of a free sample of pErk2 . The cell lysates treated in this way are then spotted on the evanescent field sensing platform and an assay is performed according to item 2.1, using the A3 antibody for the detection of changes in pErk2 concentrations.

El resultado de esta medición se representa en la Fig. 5A. Cada una de las barras mostradas en el gráfico representa el valor medio referenciado de la intensidad de señal neta de 5 spots de analitos referenciados con la correspondiente desviación estándar. Se ha de reconocer bien que la modificación de la concentración de pErk2, detectado con el anticuerpo 3, se puede disolver bien, donde la función del tiempo, es decir, la dependencia del tiempo de estimulación, se caracteriza por un rápido aumento de la concentración de pErk2, seguido de una caída al nivel de la concentración inicial después de un tiempo de estimulación de 60 minutos, en donde se alcanza el máximo de concentración después de aproximadamente 10 minutos. La señal de la muestra de control no estimulada es ligeramente superior a aquella de la muestra tratada con estaurosporina, lo cual representa la proporción natural de pErk2 sin estimulación. The result of this measurement is represented in Fig. 5A. Each of the bars shown in the graph represents the average reference value of the net signal strength of 5 analyte spots referenced with the corresponding standard deviation. It should be well recognized that the modification of the concentration of pErk2, detected with antibody 3, can be dissolved well, where the function of time, that is, the dependence of the stimulation time, is characterized by a rapid increase in concentration of pErk2, followed by a drop to the initial concentration level after a stimulation time of 60 minutes, where the maximum concentration is reached after approximately 10 minutes. The signal of the non-stimulated control sample is slightly higher than that of the sample treated with staurosporine, which represents the natural proportion of pErk2 without stimulation.

Como medición de control, se realizan un ensayo por lo demás similar y un procedimiento de detección, en donde en lugar del anticuerpo 3, se usa el anticuerpo 4 para la detección de la totalidad de la forma proteica correspondiente fosforilada y no fosforilada, es decir, del contenido total relativo de Erk2/pErk2. En este caso, dentro de la precisión experimenta, no se comprobó ninguna diferencia significativa de las señales, es decir, ninguna modificación de la concentración para las distintas duraciones de estimulación de hasta 60 minutos, ni tampoco una diferencia con la muestra de control no tratada y con la muestra tratada con estaurosporina (Fig. 5B). As a control measurement, an otherwise similar assay and a detection procedure are performed, in which instead of antibody 3, antibody 4 is used for the detection of all of the corresponding phosphorylated and non-phosphorylated protein form, i.e. , of the relative total content of Erk2 / pErk2. In this case, within the precision experienced, no significant difference of the signals was verified, that is, no change in the concentration for the different stimulation durations of up to 60 minutes, nor a difference with the untreated control sample and with the sample treated with staurosporine (Fig. 5B).

Claims

1. Procedure for testing a multiplicity of samples in relation to the compounds contained in the samples, biologically relevant as participants in specific binding reactions, such as analytes, characterized in that

– -: dichas muestras o fracciones de dichas muestras con los analitos a detectar allí contenidos, como una primera multiplicidad de asociados de unión específicos se aplican directamente o después de diluciones adicionales de las fracciones en al menos una matriz unidimensional o bidimensional en áreas de medición diferenciadas en una plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido, en donde se disponen distintas muestras o fracciones o distintas diluciones de muestras o fracciones en distintos áreas de medición diferenciadas, said samples or fractions of said samples with the analytes to be detected therein, as a first multiplicity of specific binding partners are applied directly or after additional dilutions of the fractions in at least one one-dimensional or two-dimensional matrix in differentiated measurement areas in a evanescent field sensor platform as a solid support, where different samples or fractions or different dilutions of samples or fractions are arranged in different differentiated measurement areas,

– -: una o varias sustancias de detección, como una segunda multiplicidad de asociados de unión específicos, para la detección específica de uno o varios analitos contenidos en las muestras o sus fracciones, a partir de dicha primera multiplicidad de asociados de unión específicos, se ponen en contacto en una única etapa o en varias etapas de una reacción de unión específica con las muestras o fracciones aplicados en dichas áreas de medición diferenciadas o sus diluciones, one or more detection substances, such as a second multiplicity of specific binding partners, for the specific detection of one or more analytes contained in the samples or their fractions, from said first multiplicity of specific binding partners, are contacted in a single stage or in several stages of a specific binding reaction with the samples or fractions applied in said differentiated measurement areas or their dilutions,

– -: modificaciones de señales optoelectrónicas como consecuencia de la unión de sustancias de detección con analitos contenidos en áreas de medición diferenciadas, se miden con resolución local en el campo evanescente de la plataforma sensora de campo evanescente, y a partir del tamaño relativo de las modificaciones de dichas señales optoelectrónicas de los respectivos áreas de medición se determina cualitativa y / o cuantitativamente la presencia de los analitos a detectar allí de forma específica. Modifications of optoelectronic signals as a result of the union of detection substances with analytes contained in differentiated measurement areas, are measured with local resolution in the evanescent field of the evanescent field sensor platform, and from the relative size of the modifications of said signals The presence of analytes to be detected there is determined qualitatively and / or quantitatively in the optoelectronics of the respective measurement areas.

2. 2.: Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por un procedimiento de separación para dividir la muestra en una o varias de dichas fracciones del grupo de procedimientos formado por centrifugación, cromatografía líquida de alta presión y microcromatografía líquida de alta presión por medio del método de cromatografía en fase normal, en fase inversa, de intercambio iónico o de interacción hidrófoba, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía en gel, electroforesis, electroforesis capilar, electrocromatografía, electroforesis de flujo libre. Method according to claim 1, characterized by a separation method for dividing the sample into one or more of said fractions of the group of procedures formed by centrifugation, high pressure liquid chromatography and high pressure liquid microchromatography by means of the chromatography method in normal phase, in reverse phase, ion exchange or hydrophobic interaction, size exclusion chromatography, gel chromatography, electrophoresis, capillary electrophoresis, electrochromatography, free flow electrophoresis.

3. 3.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–2, caracterizado porque se diluye una fracción de una muestra antes de la aplicación sobre dicha plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido al menos en un factor 10. Method according to one of claims 1–2, characterized in that a fraction of a sample is diluted before application on said evanescent field sensing platform as a solid support at least by a factor of 10.

4. Four.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–2, caracterizado porque se diluye una fracción de una muestra antes de la aplicación sobre dicha plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido al menos en un factor 30. Method according to one of claims 1–2, characterized in that a fraction of a sample is diluted before application on said evanescent field sensing platform as a solid support at least by a factor of 30.

5. 5.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–4, caracterizado porque las muestras están seleccionadas del grupo de extractos de células sanas o enfermas, extractos de tejido animal o humano o de tejido vegetal, así como de líquidos corporales o sus componentes. Method according to one of claims 1–4, characterized in that the samples are selected from the group of extracts of healthy or diseased cells, extracts of animal or human tissue or plant tissue, as well as body fluids or their components.

6. 6.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–4, caracterizado porque las muestras están seleccionadas del grupo que comprende extractos de células estimuladas o no tratadas y extractos de tejido sano o enfermo. Method according to one of claims 1–4, characterized in that the samples are selected from the group comprising extracts from stimulated or untreated cells and extracts from healthy or diseased tissue.

7. 7.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–6, caracterizado porque una muestra por ensayar de un organismo o estructura tisular o celular o célula se extrajo por medio de un método del grupo de cortes de tejidos, biopsia o “Laser Capture Micro Dissection”. Method according to one of claims 1–6, characterized in that a sample to be tested from an organism or tissue or cell structure or cell was extracted by means of a method of the group of tissue cuts, biopsy or "Laser Capture Micro Dissection" .

8. 8.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–7, caracterizado porque una muestra inmovilizada comprende el material de menos de 20000 células. Method according to one of claims 1–7, characterized in that an immobilized sample comprises the material of less than 20,000 cells.

9. 9.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–8, caracterizado porque una muestra inmovilizada comprende el material de menos de 1000 células. Method according to one of claims 1–8, characterized in that an immobilized sample comprises the material of less than 1000 cells.

10. 10.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–9, caracterizado porque los analitos contenidos en una muestra inmovilizada están presentes en forma nativa o desnaturalizada. Method according to one of claims 1–9, characterized in that the analytes contained in an immobilized sample are present in a native or denatured form.

11. eleven.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–9, caracterizado porque los analitos, ácidos nucleicos o proteínas contenidos en una muestra inmovilizada, después del tratamiento con urea, se presentan en forma desnaturalizada, en donde los epítopos de dichos analitos tienen libre acceso para la unión a sus correspondientes sustancias de detección. Method according to one of claims 1–9, characterized in that the analytes, nucleic acids or proteins contained in an immobilized sample, after urea treatment, are presented in denatured form, wherein the epitopes of said analytes have free access for binding to their corresponding detection substances.

12. 12.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–11, caracterizado porque las cantidades totales relativas de uno o varios compuestos como analitos contenidas en una muestra inmovilizada son determinadas, como suma de sus presencias en forma fosforilada o no fosforilada y / o en forma glicosilada y / o no glicosilada. Method according to one of claims 1–11, characterized in that the relative total amounts of one or more compounds as analytes contained in an immobilized sample are determined, as a sum of their presences in phosphorylated or non-phosphorylated form and / or in glycosylated form and / or non-glycosylated.

13. 13.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–11, caracterizado porque las cantidades relativas de uno o varios compuestos como analitos contenidas en una muestra inmovilizada se determinan en cada caso por su presencia en forma fosforilada y / o no fosforilada y / o en forma glicosilada y / o no glicosilada, para una o varias de dichas formas. Method according to one of claims 1–11, characterized in that the relative amounts of one or more compounds as analytes contained in an immobilized sample are determined in each case by their presence in phosphorylated and / or non-phosphorylated form and / or in form glycosylated and / or non-glycosylated, for one or more of said forms.

14. 14.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–11, caracterizado porque se determina el grado de activación uno o varios de analitos contenidos en una muestra inmovilizada. Method according to one of claims 1–11, characterized in that the degree of activation of one or more analytes contained in an immobilized sample is determined.

15. fifteen.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–11, caracterizado porque se determina el grado de fosforilación y / o el grado de glucosilación de uno o varios de analitos contenidos en una muestra inmovilizada. Method according to one of claims 1–11, characterized in that the degree of phosphorylation and / or the degree of glycosylation of one or more analytes contained in an immobilized sample is determined.

16. 16.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–15, caracterizado porque se detectan diferencias de menos del 20 %, con preferencia de menos del 10 %, de las cantidades relativas de uno o varios compuestos contenidos en una muestra inmovilizada y en una o varias muestras comparativas en forma fosforilada y / o no fosforilada y / o en forma glicosilada y / o no glicosilada como analitos, para una o varias de dichas formas. Method according to one of claims 1–15, characterized in that differences of less than 20%, preferably less than 10%, of the relative amounts of one or more compounds contained in an immobilized sample and in one or several are detected comparative samples in phosphorylated and / or non-phosphorylated form and / or in glycosylated and / or non-glycosylated form as analytes, for one or more of said forms.

17. 17.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 – 16, caracterizado porque dicha muestra inmovilizada y una o varias muestras comparativas se extrajeron del mismo lugar de origen en diferentes momentos y porque se determinan modificaciones temporales de las cantidades relativas de uno o varios compuestos contenidas en estas muestras en forma fosforilada y / o no fosforilada y / o en forma glicosilada y / o no glicosilada como analitos. Method according to one of claims 1-16, characterized in that said immobilized sample and one or several comparative samples were extracted from the same place of origin at different times and because temporary modifications of the relative amounts of one or more compounds contained in these samples in phosphorylated and / or non-phosphorylated form and / or in glycosylated and / or non-glycosylated form as analytes.

18. 18.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–17, caracterizado porque se extrajeron diferentes muestras del mismo organismo o del mismo cultivo celular. Method according to one of claims 1–17, characterized in that different samples were extracted from the same organism or from the same cell culture.

19. 19.: Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque se extrajeron diferentes muestras en diversas posiciones del mismo organismo. Method according to claim 18, characterized in that different samples were extracted in different positions of the same organism.

20. twenty.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–17, caracterizado porque se extrajeron diferentes muestras de distintos organismos o distintos cultivos celulares. Method according to one of claims 1–17, characterized in that different samples were extracted from different organisms or different cell cultures.

21. twenty-one.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–20, caracterizado porque la plataforma sensora de campo evanescente, para mejorar la adherencia de la muestra inmovilizada a aplicar en las áreas de medición diferenciadas, comprende una capa adhesiva sobre la que se aplican dichas fracciones de muestras o diluciones de estas fracciones. Method according to one of claims 1-20, characterized in that the evanescent field sensing platform, to improve the adhesion of the immobilized sample to be applied in the differentiated measurement areas, comprises an adhesive layer on which said fractions of samples or dilutions of these fractions.

22. 22: Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizado porque dicha capa adhesiva tiene un espesor de menos de 200 nm, con preferencia de menos de 20 nm. Method according to claim 21, characterized in that said adhesive layer has a thickness of less than 200 nm, preferably less than 20 nm.

23. 2. 3.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 21–22, caracterizado porque dicha capa adhesiva comprende compuestos del grupo de silanos, silanos funcionalizados, epóxidos, polímeros funcionalizados, cargados o polares y mono– o multicapas pasivas o funcionalizadas autoorganizadas, tioles, fosfatos y fosfonatos de alquilo, copolímeros de bloque multifuncionales. Method according to one of claims 21-22, characterized in that said adhesive layer comprises compounds of the group of silanes, functionalized silanes, epoxides, functionalized, charged or polar polymers and mono- or self-organized passive or functionalized multilayers, thiols, phosphates and phosphonates alkyl, multifunctional block copolymers.

24. 24.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 21–22, caracterizado porque dicha capa adhesiva comprende compuestos del grupo de ácidos organofosfóricos de la fórmula general I (A) Process according to one of claims 21-22, characterized in that said adhesive layer comprises compounds of the group of organophosphoric acids of the general formula I (A)

Y – B – OPO3 H2 (IB) or organophosphonic acid of the general formula I (B)

Y – B – PO3 H2 (IB) and its salts, in which B means an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, heteroaryl or hetarylalkyl moiety and Y hydrogen or a functional group of the hydroxy, carboxy, amino series, mono- or dialkylamino optionally substituted with lower alkyl, thiol, or a negative acid group of the series of ester, phosphate, phosphonate, sulfate, sulphonate, maleimide, succinimidyl, epoxy or acrylate.

25. 25.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–24, caracterizado porque una o varias muestras inmovilizadas se mezclan antes de su aplicación sobre la plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido con una solución de polímeros o monómeros polimerizables, eventualmente en presencia de iniciadores o de reticulantes químicos. Method according to one of claims 1–24, characterized in that one or more immobilized samples are mixed before being applied on the evanescent field sensing platform as a solid support with a solution of polymerizable polymers or monomers, possibly in the presence of initiators or of chemical crosslinkers.

26. 26.: Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, caracterizado porque dicha solución de polímeros o monómeros polimerizables o reticulantes químicos está seleccionada del grupo que comprende soluciones de polisacáridos. Process according to claim 25, characterized in that said solution of polymerizable polymers or monomers or chemical crosslinkers is selected from the group comprising polysaccharide solutions.

27. 27.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 25–26, caracterizado porque la mezcla de una o varias muestras inmovilizadas con una solución de polímeros o monómeros polimerizables da lugar a la inmovilización de una estructura de red tridimensional con componentes de muestras allí unidas, accesibles para sustancias de detección en la siguiente etapa de una reacción de bioafinidad sobre la plataforma sensora de campo evanescente como soporte sólido. Method according to one of claims 25-26, characterized in that the mixing of one or more immobilized samples with a solution of polymerizable polymers or monomers results in the immobilization of a three-dimensional network structure with components of samples attached there, accessible for detection substances in the next stage of a bioaffinity reaction on the evanescent field sensing platform as a solid support.

28. 28.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–20, caracterizado porque la muestra inmovilizada se aplica en áreas de medición diferenciadas sobre la plataforma sensora de campo evanescente directamente o sobre una capa adhesiva colocada sobre ella de forma espacialmente selectiva con ayuda de un procedimiento que se selecciona del grupo de procedimientos formados por “Inkjet spotting”, spotting mecánico por medio de vástago, muelle o capilares, “Micro contact printing”, contacto fluídico de las áreas de medición con dichas muestras suministrándolas en microcanales paralelos o cruzados bajo acción de diferencias de presión o potenciales eléctricos o electromagnéticos, así como procedimientos de inmovilización fotoquímicos o fotolitográficos. Method according to one of claims 1–20, characterized in that the immobilized sample is applied in differentiated measuring areas on the evanescent field sensing platform directly or on an adhesive layer placed on it in a spatially selective manner with the aid of a procedure that It is selected from the group of procedures formed by “Inkjet spotting”, mechanical spotting by means of a rod, spring or capillaries, “Micro contact printing”, fluidic contact of the measurement areas with said samples, supplying them in parallel or crossed microchannels under the action of differences pressure or electrical or electromagnetic potentials, as well as photochemical or photolithographic immobilization procedures.

29. 29.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–28, caracterizado porque se aplican áreas entre las áreas de medición diferenciadas para minimizar la unión inespecífica de sustancias de detección entre las áreas de medición espacialmente separados respecto de los analitos y otros componentes de la muestra inmovilizada aplicada, así como respecto de componentes que no unen los analitos con las sustancias de detección para dichos analitos. Method according to one of claims 1-28, characterized in that areas are applied between the differentiated measurement areas to minimize the non-specific binding of detection substances between the spatially separated measurement areas with respect to the analytes and other components of the immobilized sample applied, as well as with respect to components that do not link the analytes with the detection substances for said analytes.

30. 30: Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque estos componentes que no se unen están seleccionados de los grupos formados por albúminas, en especial, albúmina de suero bovino o albúmina de suero humano, caseína, anticuerpos, policlonales o monoclonales, inespecíficos de especies extraña o empíricamente inespecíficos para el o los analitos a detectar, detergentes, ADN natural o sintético fragmentado que no hibride con los polinucleótidos a analizar, o también polímeros no cargados pero hidrófilos. Method according to claim 29, characterized in that these components that do not bind are selected from the groups formed by albumin, especially bovine serum albumin or human serum albumin, casein, antibodies, polyclonal or monoclonal, non-specific species or empirically unspecific for the analyte (s) to be detected, detergents, fragmented natural or synthetic DNA that does not hybridize with the polynucleotides to be analyzed, or also non-charged but hydrophilic polymers.

31. 31.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–23, caracterizado porque en el caso de los analitos a detectar contenidos en muestras inmovilizadas aplicadas en áreas de medición diferenciadas se trata de compuestos del grupo formado por proteínas, por ejemplo anticuerpos y fragmentos de anticuerpos mono– o policlonales, péptidos, enzimas, glucopéptidos, oligosacáridos, lectinas, antígenos para anticuerpos, proteínas funcionalizadas con sitios de unión adicionales, así como ácidos nucleicos. Method according to one of claims 1–23, characterized in that in the case of the analytes to be detected contained in immobilized samples applied in differentiated measurement areas, these are compounds of the group consisting of proteins, for example antibodies and mono-antibody fragments - or polyclonal, peptides, enzymes, glycopeptides, oligosaccharides, lectins, antigens for antibodies, proteins functionalized with additional binding sites, as well as nucleic acids.

32. 32: Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31, caracterizado porque en el caso de los analitos a detectar contenidos en muestras inmovilizadas aplicadas en áreas de medición diferenciadas se trata de compuestos del grupo que comprende proteínas celulares citosólicas o unidas a membrana, en especial, proteína quinasas participantes de los procesos de transducción de señales en células. Method according to claim 31, characterized in that in the case of the analytes to be detected contents in immobilized samples applied in differentiated measurement areas, these are compounds of the group comprising cytosolic or membrane-bound cell proteins, especially participating protein kinases of signal transduction processes in cells.

33. 33.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–32, caracterizado porque los cambios en las señales optoeléctricas medidas con resolución local se producen como consecuencia de la unión de las sustancias de detección a los analitos presentes en áreas de medición diferenciadas en las muestras inmovilizadas, por cambios locales en las condiciones de resonancia para generar un plasmón superficial en una capa de metal fina como parte de dicha plataforma sensora de campo evanescente. Method according to one of claims 1–32, characterized in that the changes in the optoelectric signals measured with local resolution occur as a result of the union of the detection substances to the analytes present in differentiated measurement areas in the immobilized samples, by local changes in the resonance conditions to generate a surface plasmon in a thin metal layer as part of said evanescent field sensing platform.

34. 3. 4.: Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 33, caracterizado porque dichos cambios en las condiciones de resonancia consisten un cambio del ángulo de resonancia para la iluminación con una luz de excitación para generar un plasmón superficial en una capa fina de metal como parte de dicha plataforma sensora de campo evanescente. Method according to claim 33, characterized in that said changes in the resonance conditions consist of a change in the resonance angle for illumination with an excitation light to generate a surface plasmon in a thin metal layer as part of said sensing platform of evanescent field.

35. 35: Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 33, caracterizado porque dichos cambios en las condiciones de resonancia consisten en cambio de la longitud de onda de resonancia de una luz de excitación incidente para generar un plasmón superficial en una capa fina de metal como parte de dicha plataforma sensora de campo evanescente. Method according to claim 33, characterized in that said changes in the resonance conditions consist in changing the resonance wavelength of an incident excitation light to generate a surface plasmon in a thin metal layer as part of said sensor platform of evanescent field.

36. 36.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–35, caracterizado porque los cambios en las señales optoeléctricas medidas con resolución local se producen, como consecuencia de la unión de las sustancias de detección a los analitos presentes en áreas de medición diferenciadas en las muestras inmovilizadas, por cambios locales en el índice de refracción efectivo en estas áreas de dicha plataforma sensora de campo evanescente. Method according to one of claims 1–35, characterized in that the changes in the optoelectric signals measured with local resolution occur, as a consequence of the union of the detection substances to the analytes present in differentiated measurement areas in the immobilized samples , due to local changes in the effective refractive index in these areas of said evanescent field sensor platform.

37. 37.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–32, caracterizado porque los cambios en las señales optoeléctricas medidas con resolución local se producen, como consecuencia de la unión de las sustancias de detección a los analitos presentes en áreas de medición diferenciadas en las muestras inmovilizadas, por cambios locales de una o más luminiscencias de moléculas capaces de producir luminiscencia presentes dentro del campo evanescente de dicha plataforma sensora de campo evanescente. Method according to one of claims 1–32, characterized in that the changes in the optoelectric signals measured with local resolution occur, as a consequence of the union of the detection substances to the analytes present in differentiated measurement areas in the immobilized samples , by local changes of one or more luminescence of molecules capable of producing luminescence present within the evanescent field of said evanescent field sensing platform.

38. 38.: Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 37, caracterizado porque dichos cambios en una o más de las luminiscencias provienen de moléculas capaces de producir luminiscencia o nanopartículas capaces de producir luminiscencia que se unen como marcas luminiscentes a una o más sustancias de detección para los analitos presentes en las áreas de medición diferenciadas. Method according to claim 37, characterized in that said changes in one or more of the luminescence come from molecules capable of producing luminescence or nanoparticles capable of producing luminescence that bind as luminescent labels to one or more detection substances for the analytes present in Differentiated measurement areas.

39. 39.: Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 38, caracterizado porque se emplean dos o más marcas luminiscentes con diferentes longitudes de emisión y/o diferentes espectros de excitación, con preferencia con diferentes longitudes de emisión y la misma longitud de excitación, para la detección del analito. Method according to claim 38, characterized in that two or more luminescent labels with different emission lengths and / or different excitation spectra are used, preferably with different emission lengths and the same excitation length, for the detection of the analyte.

40. 40: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 38–39, caracterizado porque se emplean dos o más marcas luminiscentes con diferentes velocidades de decaimiento de la emisión para la detección del analito. Method according to one of claims 38–39, characterized in that two or more luminescent labels with different emission decay rates are used for the detection of the analyte.

41. 41.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 39–40, caracterizado porque para la detección de diferentes analitos en una muestra inmovilizada se utilizan dos o más marcas luminiscentes. Method according to one of claims 39–40, characterized in that two or more luminescent labels are used for the detection of different analytes in an immobilized sample.

42. 42: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 39–41, caracterizado porque para la detección de diferentes analitos en un área de medición se utilizan dos o más marcas luminiscentes. Method according to one of claims 39–41, characterized in that two or more luminescent labels are used for the detection of different analytes in a measurement area.

43. 43: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 37–42, caracterizado porque la iluminación con luz de excitación se lleva a cabo en pulsos de entre 1 fseg y 10 minutos, y la luz de emisión de las áreas de medición se mide de manera resuelta en el tiempo. Method according to one of claims 37–42, characterized in that the illumination with excitation light is carried out in pulses of between 1 fsec and 10 minutes, and the emission light of the measurement areas is measured in a determined manner in time.

44. 44.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 36–43, caracterizado porque la plataforma sensora de campo evanescente que actúa como soporte sólido comprende una guía de onda óptica, que comprende una o más capas. Method according to one of claims 36–43, characterized in that the evanescent field sensing platform that acts as a solid support comprises an optical waveguide, comprising one or more layers.

45. Four. Five.: Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 44, caracterizado porque la plataforma sensora de campo evanescente que actúa como soporte sólido comprende una guía de onda óptica plana que es continua o dividida en áreas de guía de onda diferenciadas y comprende una o más capas. Method according to claim 44, characterized in that the evanescent field sensor platform acting as a solid support comprises a flat optical waveguide that is continuous or divided into differentiated waveguide areas and comprises one or more layers.

46. 46.: Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 45, caracterizado porque la plataforma sensora de campo evanescente que actúa como soporte sólido comprende una quía de onda óptica de película fina plana que tiene una capa conductora de la onda esencialmente ópticamente transparente sobre una segunda capa también esencialmente ópticamente transparente con un índice de refracción inferior que la capa y opcionalmente también una capa intermedia esencialmente ópticamente transparente entre la capa conductora de la onda y la segunda capa, también con un índice de refracción inferior que la capa conductora de la onda. Method according to claim 45, characterized in that the evanescent field sensing platform that acts as a solid support comprises a flat thin film optical waveguide having an essentially optically transparent wave conductive layer on a second layer also essentially optically transparent. with a lower refractive index than the layer and optionally also an essentially optically transparent intermediate layer between the conductive layer of the wave and the second layer, also with a lower refractive index than the conductive layer of the wave.

47. 47: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–46, caracterizado porque la luz de excitación de una o más fuentes de luz se acopla en una capa conductora de la onda de la plataforma sensora de campo evanescente por medio de uno o más elementos de acoplamiento óptico seleccionados del grupo formado por acopladores de prismas, acopladores evanescentes con guías de onda óptica unidas con campos evanescentes superpuestos, acopladores de superficies frontales con lentes de enfoque, con preferencia lentes cilíndricas, dispuestas antes de una cara frontal de dicha capa conductora de la onda, y acopladores de rejilla. Method according to one of claims 1–46, characterized in that the excitation light of one or more light sources is coupled in a conductive layer of the evanescent field sensing platform wave by means of one or more coupling elements optics selected from the group consisting of prism couplers, evanescent couplers with optical waveguides joined with superimposed evanescent fields, front surface couplers with focusing lenses, preferably cylindrical lenses, arranged before a front face of said wave conducting layer , and grid couplers.

48. 48.: Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 47, caracterizado porque el acoplamiento de la luz de excitación se realiza en una capa conductora de la onda de la plataforma sensora de campo evanescente con la ayuda de una Method according to claim 47, characterized in that the coupling of the excitation light is carried out in a conductive layer of the wave of the evanescent field sensing platform with the aid of a

or more grid structures for coupling that are stamped on said wave conductive layer.

49. 49.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–48, caracterizado porque el desacoplamiento de la luz guiada en una capa conductora de la onda de la plataforma sensora de campo evanescente se realiza con la ayuda de una o más estructuras de rejilla para desacoplamiento que están estampadas en dicha capa conductora de la onda y que tienen período y profundidad de rejilla idéntico o diferente con respecto a las estructuras de rejilla para el acoplamiento. Method according to one of claims 1–48, characterized in that the uncoupling of the guided light in a conductive layer of the wave of the evanescent field sensing platform is carried out with the aid of one or more grid structures for decoupling that are stamped on said wave conductive layer and having identical or different grid period and depth with respect to the grid structures for coupling.

50. fifty.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 48–49, caracterizado porque la luz de excitación de una más fuentes de luz se acopla por medio de una estructura de rejilla para acoplar la luz de excitación en una capa conductora de la onda de dicha plataforma sensora de campo evanescente y es guiada como onda guiada a las áreas de medición de la plataforma sensora de campo evanescente, además la luminiscencia de la moléculas capaces de producir luminiscencia que se genera en el campo evanescente de dicha onda guiada se registra con resolución local con uno o más detectores y se determina la concentración relativa de uno o más analitos a partir de dichas señales de luminiscencia. Method according to one of claims 48-49, characterized in that the excitation light of one more light sources is coupled by means of a grid structure to couple the excitation light in a wave-conducting layer of said sensor platform evanescent field and is guided as a guided wave to the measurement areas of the evanescent field sensing platform, in addition the luminescence of the molecules capable of producing luminescence that is generated in the evanescent field of said guided wave is recorded with local resolution with one or more detectors and the relative concentration of one or more analytes is determined from said luminescence signals.

51. 51.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 37–50, caracterizado porque además de la determinación de una o más luminiscencias se determinan los cambios en el índice de refracción efectivo en las áreas de medición. Method according to one of claims 37–50, characterized in that in addition to the determination of one or more luminescences the changes in the effective refractive index in the measurement areas are determined.

52. 52: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 33–51, caracterizado porque la una o más luminiscencias y/o determinaciones de las señales luminosas en la longitud de excitación se llevan a cabo con selectiva polarización. Method according to one of claims 33–51, characterized in that the one or more luminescences and / or determinations of the light signals in the excitation length are carried out with selective polarization.

53. 53.: Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 47–52, caracterizado porque la una o más luminiscencias se miden con una polarización diferente de la de la luz de excitación. Method according to one of claims 47–52, characterized in that the one or more luminescences are measured with a polarization different from that of the excitation light.

54. 54: Plataforma analítica para analizar una multiplicidad de muestras en lo relativo a los compuestos contenidos en las muestras como analitos, que son biológicamente relevantes como participantes en las reacciones de bioafinidad, que comprende Analytical platform to analyze a multiplicity of samples in relation to the compounds contained in the samples as analytes, which are biologically relevant as participants in the bioaffinity reactions, comprising

– -: una plataforma sensora de campo evanescente que actúa como soporte sólido, an evanescent field sensing platform that acts as a solid support,

– -: al menos una matriz de una o dos dimensiones de las áreas de medición diferenciadas con asociados de unión inmovilizados allí en dicha plataforma sensora de campo evanescente para detectar dichos analitos en una reacción de bioafinidad, at least one one or two dimensional matrix of the differentiated measurement areas with binding partners immobilized there on said evanescent field sensing platform to detect said analytes in a bioaffinity reaction,

characterized because

– -: dichas áreas de medición diferenciadas se generaron por la aplicación de dichas muestras o fracciones de dichas muestras en forma directa o después de diluciones adicionales de dichas muestras o de sus fracciones, con los analitos detectados allí, como una primera multiplicidad de asociados de unión específicos, said differentiated measurement areas were generated by the application of said samples or fractions of said samples directly or after additional dilutions of said samples or their fractions, with the analytes detected there, as a first multiplicity of specific binding partners,

– -: diferentes muestras o fracciones o diferentes diluciones de dichas muestras o de sus fracciones se disponen en diferentes áreas de medición diferenciadas, y different samples or fractions or different dilutions of said samples or their fractions are arranged in different differentiated measurement areas, and

– -: dicho uno o más asociados de unión inmovilizados, que forman dicha primera multiplicidad de asociados de unión específicos, son los uno o más analitos mismos que están contenidos en las muestras a analizar. said one or more immobilized binding partners, which form said first multiplicity of specific binding partners, are the one or more analytes themselves that are contained in the samples to be analyzed.

55. 55.: Plataforma analítica de acuerdo con la reivindicación 54, caracterizada porque una o más muestras o fracciones de una muestra se diluyen en al menos un factor 10 antes de la aplicación en la plataforma sensora de campo evanescente que actúa como soporte sólido, y diferentes diluciones de una fracción se aplicaron en diferentes áreas de medición diferenciadas en dicha plataforma sensora de campo evanescente. Analytical platform according to claim 54, characterized in that one or more samples or fractions of a sample are diluted in at least one factor 10 before application in the evanescent field sensing platform that acts as a solid support, and different dilutions of one fraction was applied in different areas of differentiated measurement in said evanescent field sensor platform.

56. 56.: Plataforma analítica de acuerdo con la reivindicación 54, caracterizada porque una o más muestras o fracciones de una muestra se diluyen en al menos un factor 30 antes de la aplicación en la plataforma sensora de campo evanescente que actúa como soporte sólido, y diferentes diluciones de una fracción se aplicaron en diferentes áreas de medición diferenciadas en dicha plataforma sensora de campo evanescente. Analytical platform according to claim 54, characterized in that one or more samples or fractions of a sample are diluted in at least one factor 30 before application in the evanescent field sensing platform that acts as a solid support, and different dilutions of one fraction was applied in different areas of differentiated measurement in said evanescent field sensor platform.

57. 57.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–56, caracterizada porque las muestras se seleccionan del grupo de extractos de células sanas o enfermas, extractos de tejido animal humano o de tejido de planta, y de fluidos corporales o sus componentes. Analytical platform according to one of claims 54–56, characterized in that the samples are selected from the group of healthy or diseased cell extracts, human animal tissue or plant tissue extracts, and body fluids or their components.

58. 58.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–56, caracterizada porque las muestras muestras se seleccionan del grupo que comprende extractos de células estimuladas o no tratadas y extractos de tejido sano o enfermo. Analytical platform according to one of claims 54–56, characterized in that the sample samples are selected from the group comprising extracts from stimulated or untreated cells and extracts from healthy or diseased tissue.

59. 59.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–58, caracterizada porque las muestras para analizar se extrajeron de un organismo o una estructura tisular celular o célula por medio de un procedimiento del grupos de cortes de tejido, biopsia o microdisección por captura láser. Analytical platform according to one of claims 54–58, characterized in that the samples to be analyzed were extracted from an organism or a cellular or cell tissue structure by means of a procedure of groups of tissue cuts, biopsy or microdissection by laser capture.

60. 60: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–59, caracterizada porque una muestra inmovilizada comprende el material de menos de 20000 células. Analytical platform according to one of claims 54-59, characterized in that an immobilized sample comprises the material of less than 20,000 cells.

61. 61.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–60, caracterizada porque una muestra inmovilizada comprende el material de menos de 1000 células. Analytical platform according to one of claims 54–60, characterized in that an immobilized sample comprises the material of less than 1000 cells.

62. 62: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–61, caracterizada porque los analitos presentes en una muestra inmovilizada están en forma nativa o desnaturalizada. Analytical platform according to one of claims 54–61, characterized in that the analytes present in an immobilized sample are in native or denatured form.

63. 63.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–61, caracterizada porque los analitos contenidos en las muestras inmovilizadas están en forma desnaturalizada después del tratamiento con urea, estando los epítopos de dichos analitos libremente accesibles para la unión a sus correspondientes sustancias de detección. Analytical platform according to one of claims 54-61, characterized in that the analytes contained in the immobilized samples are in denatured form after urea treatment, the epitopes of said analytes being freely accessible for binding to their corresponding detection substances.

64. 64.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–63, caracterizada porque diferentes muestras aplicadas se extrajeron del mismo organismo o el mismo cultivo celular. Analytical platform according to one of claims 54–63, characterized in that different samples applied were extracted from the same organism or the same cell culture.

65. 65: Plataforma analítica de acuerdo con la reivindicación 64, caracterizada porque diferentes muestras aplicadas se extrajeron de varias posiciones del mismo organismo. Analytical platform according to claim 64, characterized in that different applied samples were extracted from several positions of the same organism.

66. 66.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–63, caracterizada porque diferentes muestras aplicadas se extrajeron de distintos organismos o cultivos celulares. Analytical platform according to one of claims 54–63, characterized in that different applied samples were extracted from different organisms or cell cultures.

67. 67.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–66, caracterizada porque la plataforma sensora de campo evanescente comprende una capa adhesiva a la que se aplican dichas muestras a fracciones de muestras o diluciones de estas fracciones, a fin de mejorar la capacidad adhesiva de las muestras inmovilizadas aplicadas en las áreas de medición diferenciadas. Analytical platform according to one of claims 54-66, characterized in that the evanescent field sensing platform comprises an adhesive layer to which said samples are applied to sample fractions or dilutions of these fractions, in order to improve the adhesive capacity of the immobilized samples applied in the differentiated measurement areas.

68. 68.: Plataforma analítica de acuerdo con la reivindicación 67, caracterizada porque dicha capa adhesiva tiene un grosor de menos de 200 nm, con preferencia menos de 20 nm. Analytical platform according to claim 67, characterized in that said adhesive layer is less than 200 nm thick, preferably less than 20 nm.

69. 69.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 67–68, caracterizada porque dicha capa adhesiva comprende compuestos del grupo de silanos, silanos funcionalizados, epóxidos, polímeros cargados o polares, funcionalizados y mono o multicapas pasivas o funcionalizadas autoorganizadas, tioles, fosfatos de alquilo y fosfonatos de alquilo, copolímeros de bloque multifuncionales. Analytical platform according to one of the claims 67-68, characterized in that said adhesive layer comprises compounds of the group of silanes, functionalized silanes, epoxides, charged or polar polymers, functionalized and self-organized passive or monolayer monolayers, thiols, alkyl phosphates and alkyl phosphonates, multifunctional block copolymers.

70. 70.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 67–68, caracterizada porque dicha capa adhesiva comprende compuestos del grupo de ácidos organofosfóricos de la fórmula general I(A) Analytical platform according to one of claims 67-68, characterized in that said adhesive layer comprises compounds of the group of organophosphoric acids of the general formula I (A)

Y – B – OPO3H2 (IA)

or of organophosphonic acids of the general formula I (B)

Y – B – PO3H2 (IB),

and its salts, in which B means an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, heteroaryl or hetarylalkyl moiety, and Y hydrogen or a functional group of the hydroxy, carboxy, amino, mono- or dialkylamino series optionally substituted with alkyl lower, thiol or a negative acid group of the series of ester, phosphate, phosphonate, sulfate, sulphonate, maleimide, succinimidyl, epoxy or acrylate.

71. 71.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–70, caracterizada porque una o más muestras inmovilizadas se mezclan con una solución de polímeros o monómeros polimerizables, eventualmente en presencia de iniciadores o de reticulantes químicos, antes de su aplicación a la plataforma sensora de campo evanescente que actúa como soporte sólido. Analytical platform according to one of claims 54-70, characterized in that one or more immobilized samples are mixed with a solution of polymerizable polymers or monomers, possibly in the presence of initiators or chemical crosslinkers, before being applied to the sensor platform of evanescent field that acts as a solid support.

72. 72.: Plataforma analítica de acuerdo con la reivindicación 71, caracterizado porque dicha solución de polímeros o monómeros polimerizables o reticulantes químicos, se selecciona del grupo que comprende soluciones de polisacáridos. Analytical platform according to claim 71, characterized in that said solution of polymerizable polymers or monomers or chemical crosslinkers is selected from the group comprising polysaccharide solutions.

73. 73: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 71–72, caracterizada porque la mezcla de las una o más muestras inmovilizadas con una solución de polímeros o monómeros polimerizables, opcionalmente en presencia de iniciadores o de reticulantes químicos, produce la inmovilización de una estructura de red tridimensional con componentes de muestra allí incorporados que son accesibles a las sustancias de detección en la etapa posterior de una reacción de bioafinidad, sobre la plataforma sensora de campo evanescente que actúa como soporte sólido. Analytical platform according to one of claims 71–72, characterized in that the mixing of the one or more immobilized samples with a solution of polymerizable polymers or monomers, optionally in the presence of initiators or chemical crosslinkers, results in the immobilization of a structure of three-dimensional network with sample components incorporated there that are accessible to the detection substances in the subsequent stage of a bioaffinity reaction, on the evanescent field sensing platform that acts as a solid support.

74. 74.: Plataforma analítica de acuerdo con la reivindicaciones 54–73, caracterizada porque una matriz comprende más de 50, con preferencia más de 500, particularmente con preferencia más de 5000, áreas de medición. Analytical platform according to claims 54–73, characterized in that a matrix comprises more than 50, preferably more than 500, particularly preferably more than 5000, measurement areas.

75. 75.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–74, caracterizada porque las áreas de medición de una matriz se disponen en una densidad de más de 10, con preferencia de más de 100, particularmente con preferencia de más de 1000, áreas de medición por centímetro cuadrado. Analytical platform according to one of claims 54–74, characterized in that the measurement areas of a matrix are arranged in a density of more than 10, preferably more than 100, particularly preferably more than 1000, measurement areas per square centimeter.

76. 76: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–75, caracterizada porque una multiplicidad de matrices de áreas de medición estén dispuestas sobre la plataforma sensora de campo evanescente que actúa como soporte sólido. Analytical platform according to one of claims 54–75, characterized in that a multiplicity of matrices of measurement areas are arranged on the evanescent field sensing platform that acts as a solid support.

77. 77.: Plataforma analítica de acuerdo con la reivindicación 76, caracterizada porque al menos 5, con preferencia al menos 50, matrices de áreas de medición estén dispuestas sobre la plataforma sensora de campo evanescente que actúa como soporte sólido. Analytical platform according to claim 76, characterized in that at least 5, preferably at least 50, matrices of measurement areas are arranged on the evanescent field sensing platform that acts as a solid support.

78. 78.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–77, caracterizada porque están aplicadas áreas entre las áreas de medición diferenciadas entre las áreas de medición separadas espacialmente respecto de los analitos y otros ingredientes de las muestras inmovilizadas aplicadas, así como respecto de componentes que no se unen con las sustancias de detección para dichos analitos. Analytical platform according to one of claims 54-77, characterized in that areas are applied between the differentiated measurement areas between the spatially separated measurement areas with respect to the analytes and other ingredients of the applied immobilized samples, as well as with respect to components that they do not bind with the detection substances for such analytes.

79. 79.: Plataforma analítica de acuerdo con la reivindicación 78, caracterizada porque estos componentes que no se unen se seleccionan de los grupos formados por albúminas, en particular albúmina sérica bovina o albúmina sérica humana, caseína, anticuerpos policlonales o monoclonales, inespecíficos, de especies extrañas o anticuerpos empíricamente inespecíficos para los analitos a detectar, detergentes, ADN natural o sintético fragmentado que no hibride con los polinucleótidos a analizar, o también polímeros no cargados pero hidrófilos. Analytical platform according to claim 78, characterized in that these components that do not bind are selected from the groups formed by albumin, in particular bovine serum albumin or human serum albumin, casein, polyclonal or monoclonal, nonspecific antibodies of foreign species or antibodies empirically nonspecific for the analytes to be detected, detergents, fragmented natural or synthetic DNA that does not hybridize with the polynucleotides to be analyzed, or also non-charged but hydrophilic polymers.

80. 80.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–79, caracterizada porque los analitos a detectar y contenidos en las muestras inmovilizadas aplicadas en las áreas de medición diferenciadas son compuestos del grupo formado por proteínas y ácidos nucleicos. Analytical platform according to one of claims 54-79, characterized in that the analytes to be detected and contained in the immobilized samples applied in the differentiated measurement areas are composed of the group consisting of proteins and nucleic acids.

81. 81.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–79, caracterizada porque los analitos a detectar y contenidos en las muestras inmovilizadas aplicadas en las áreas de medición diferenciadas son compuestos del grupo formado por proteínas citosólicas o celulares unidas a membrana, en particular proteínas involucradas en los procesos de transducción de señales en las células. Analytical platform according to one of claims 54-79, characterized in that the analytes to be detected and contained in the immobilized samples applied in the differentiated measurement areas are composed of the group consisting of membrane-bound cytosolic or cellular proteins, in particular involved proteins in the processes of signal transduction in cells.

82. 82.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–81, caracterizada porque la plataforma sensora de campo evanescente comprende una capa fina de metal, eventualemente sobre una capa intermedia dispuesta debajo de esta y que tiene un índice de refracción de con preferencia < 1,5, como por ejemplo dióxido de silicio o fluoruro de magnesio en el que el grosor de dicha capa de metal y de la eventual capa intermedia se selecciona de manera que un plasmón superficial se pueda excitar a la longitud de onda de una luz de excitación incidente y/o a la longitud de onda de una luminiscencia generada. Analytical platform according to one of claims 54–81, characterized in that the evanescent field sensing platform comprises a thin metal layer, possibly on an intermediate layer disposed below it and having a refractive index of preferably <1, 5, such as silicon dioxide or magnesium fluoride in which the thickness of said metal layer and the possible intermediate layer is selected so that a surface plasmon can be excited at the wavelength of an incident excitation light and / or the wavelength of a generated luminescence.

83. 83.: Plataforma analítica de acuerdo con la reivindicación 82, caracterizada porque el metal se selecciona del grupo que comprende oro y plata. Analytical platform according to claim 82, characterized in that the metal is selected from the group comprising gold and silver.

84. 84.: Plataforma analítica de acuerdo con la reivindicación 82, caracterizada porque la capa de metal tiene un grosor de entre 10 nm y 1000 nm, con preferencia entre 30 nm y 200 nm. Analytical platform according to claim 82, characterized in that the metal layer has a thickness between 10 nm and 1000 nm, preferably between 30 nm and 200 nm.

85. 85.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–84, caracterizada porque la plataforma sensora de campo evanescente que actúa como soporte sólido comprende una guía de onda óptica que comprende una o más capas. Analytical platform according to one of claims 54–84, characterized in that the evanescent field sensing platform that acts as a solid support comprises an optical waveguide comprising one or more layers.

86. 86.: Plataforma analítica de acuerdo con la reivindicación 85, caracterizada porque la plataforma sensora de campo evanescente que actúa como soporte sólido comprende una guía de onda óptica plana que es continua o dividida en áreas conductoras de la onda diferenciadas y comprende una o más capas. Analytical platform according to claim 85, characterized in that the evanescent field sensing platform that acts as a solid support comprises a flat optical waveguide that is continuous or divided into differentiated conductive areas of the wave and comprises one or more layers.

87. 87.: Plataforma analítica de acuerdo con la reivindicación 86, caracterizada porque la plataforma sensora de campo evanescente que actúa como soporte sólido comprende una quía de onda óptica de película fina plana que tiene una capa conductora de la onda esencialmente ópticamente transparente sobre una segunda capa también esencialmente ópticamente transparente (b) con un índice de refracción inferior que la capa conductora de la onda y eventualmente también una capa intermedia esencialmente ópticamente transparente entre la capa conductora de la onda y la segunda capa, también con un índice de refracción inferior que la capa conductora de la onda. Analytical platform according to claim 86, characterized in that the evanescent field sensing platform that acts as a solid support comprises a flat thin film optical waveguide having an essentially optically transparent wave conductive layer on a second layer also essentially optically transparent (b) with a lower refractive index than the conductive layer of the wave and possibly also an essentially optically transparent intermediate layer between the conductive layer of the wave and the second layer, also with a lower refractive index than the conductive layer of the wave.

88. 88.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–87, caracterizada porque una capa conductora de la onda de la plataforma sensora de campo evanescente está en contacto óptico con uno o más elementos de acoplamiento óptico que permiten que la luz de excitación de una o más fuentes luminosas se acoplen en dicha capa conductora de la onda, estando seleccionados dichos elementos de acoplamiento óptico del grupo de acopladores de prismas, acopladores evanescentes con guías de onda óptica unidas con campos evanescentes superpuestos, acopladores de superficies frontales con lentes de enfoque, con preferencia lentes cilíndricas, dispuestas antes de una cara frontal de dicha capa conductora de la onda de la plataforma sensora de campo evanescente, y acopladores de rejilla. Analytical platform according to one of claims 54-87, characterized in that a conductive layer of the wave of the evanescent field sensing platform is in optical contact with one or more optical coupling elements that allow the excitation light of one or more more light sources are coupled in said wave conductive layer, said optical coupling elements being selected from the group of prism couplers, evanescent couplers with optical waveguides joined with superimposed evanescent fields, front surface couplers with focusing lenses, with preferably cylindrical lenses, arranged before a front face of said wave conductive layer of the evanescent field sensing platform, and grid couplers.

89. 89.: Plataforma analítica de acuerdo con la reivindicación 88, caracterizada porque una o más estructuras de rejilla que permiten que la luz de excitación de una o más fuentes luminosas se acoplen están diseñadas en una capa conductora de la onda de la plataforma sensora de campo evanescente para el acoplamiento. Analytical platform according to claim 88, characterized in that one or more grid structures that allow the excitation light of one or more light sources to be coupled are designed in a conductive layer of the wave of the evanescent field sensor platform for the coupling

90. 90.: Plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–88, caracterizada con un período y están estampadas en una capa conductora de la onda de la plataforma sensora de campo evanescente y una o varias estructuras de rejilla para el desacoplamiento con el mismo o distinto periodo de rejilla y profundidad de rejilla que las estructuras de rejilla por el acoplamiento que permiten que se acople la luz guiada en dicha capa conductora de la onda. Analytical platform according to one of claims 54–88, characterized with a period and are stamped on a conductive layer of the wave of the evanescent field sensing platform and one or more grid structures for decoupling with the same or different period of grid and grid depth than the grid structures by the coupling that allow the guided light to be coupled into said conductive layer of the wave.

91. 91.: Uso de un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1–53 o de una plataforma analítica de acuerdo con una de las reivindicaciones 54–90 para el análisis cuantitativo y/o cualitativo para determinar analitos químicos, bioquímicos o biológicos en procedimientos de rastreo en investigación farmacológica, química combinatoria, desarrollo clínico y preclínico, para estudios de unión en tiempo real y para determinar parámetros cinéticos en el análisis de afinidad y en investigación, para determinaciones cualitativas y cuantitativas, y para detectar anticuerpos, antígenos, patógenos o bacterias en la investigación y desarrollo de productos farmacéuticos, diagnóstico humano y veterinario, investigación y desarrollo de productos agroquímicos, diagnóstico de plantas sintomático y presintomático, para estratificación de pacientes en el desarrollo de productos farmacéuticos y para la selección de medicamentos terapéuticos, para la detección de patógenos, sustancias nocivas y agentes causantes en análisis de productos alimenticios y análisis ambiental. Use of a method according to one of claims 1–53 or an analytical platform according to one of claims 54–90 for quantitative and / or qualitative analysis to determine chemical, biochemical or biological analytes in screening procedures in Pharmacological research, combinatorial chemistry, clinical and preclinical development, for real-time binding studies and for determining kinetic parameters in affinity analysis and research, for qualitative and quantitative determinations, and for detecting antibodies, antigens, pathogens or bacteria in the research and development of pharmaceutical products, human and veterinary diagnosis, research and development of agrochemicals, diagnosis of symptomatic and presymptomatic plants, for stratification of patients in the development of pharmaceutical products and for the selection of therapeutic drugs, for the detection of patho genes, harmful substances and causative agents in food product analysis and environmental analysis.