ES2365282B1

ES2365282B1 - MICROCAMARA AND MONITORIZABLE CELLULAR CULTURE DEVICE BY NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE

Info

Publication number: ES2365282B1
Application number: ES201030382A
Authority: ES
Inventors: Bernardo Celda Muñoz; Vicent Esteve Moya; Francisco Sancho Bielsa; Rosa Villa Sanz; Luis José Fernández Ledesma; Javier Berganzo Ruiz
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Ikerlan S Coop; Centro de Investigacion Biomedica en Red en Bioingenieria Biomateriales y Nanomedicina CIBERBBN; Universitat de Valencia
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Ikerlan S Coop; Centro de Investigacion Biomedica en Red en Bioingenieria Biomateriales y Nanomedicina CIBERBBN; Universitat de Valencia
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2010-03-16
Publication date: 2012-08-09
Anticipated expiration: 2030-03-16
Also published as: ES2365282A1; WO2011113980A1

Abstract

La presente invención hace referencia a una microcámara y a un dispositivo de cultivo celular, monitorizables por resonancia magnética nuclear y otras técnicas de imagen, donde dicha microcámara de cultivo se encuentra encapsulada y alojada en el interior de un chip. Dicha microcámara y dicho dispositivo resultan de fácil manejo para el usuario, permitiendo su manipulación o su reemplazo sin la necesidad de un montaje laborioso, beneficiando además notablemente el estudio de cultivos durante periodos largos de tiempo, superiores a 24 horas.The present invention refers to a microcamera and a cell culture device, which can be monitored by nuclear magnetic resonance and other imaging techniques, where said culture microcamera is encapsulated and housed inside a chip. Said microcamera and said device are easy to handle for the user, allowing its manipulation or replacement without the need for a laborious assembly, also benefiting notably the study of crops for long periods of time, exceeding 24 hours.

Description

Microcámara y dispositivo de cultivo celular monitorizables por resonancia magnética nuclear. Campo de la invenciónMicrocamera and cell culture device monitored by nuclear magnetic resonance. Field of the Invention

La presente invención hace referencia a una microcámara y a un dispositivo de preparación y cultivo de sistemas celulares, monitorizables por resonancia magnética nuclear y otras técnicas de imagen. Antecedentes de la invención The present invention refers to a microcamera and a device for the preparation and cultivation of cellular systems, which can be monitored by nuclear magnetic resonance and other imaging techniques. Background of the invention

El cultivo de células in vitro es uno de los métodos fundamentales en la biomedicina actual. La caracterización de biomarcadores en muestras biológicas es capaz, con el uso de las técnicas vigentes, de proporcionar información valiosa para el análisis de especies químicas, así como para facilitar la detección precoz de enfermedades y para el estudio de los sistemas biológicos. In vitro cell culture is one of the fundamental methods in current biomedicine. The characterization of biomarkers in biological samples is able, with the use of current techniques, to provide valuable information for the analysis of chemical species, as well as to facilitate the early detection of diseases and for the study of biological systems.

A pesar del gran desarrollo de este campo, aún se desconocen, sin embargo, muchos de los factores que inducen y mantienen la diferenciación observada en distintos tipos de tejidos y que dan lugar, en consecuencia, a diferentes fenotipos. Conocer los mecanismos que regulan dichos factores de diferenciación resulta de especial relevancia en la observación y el estudio del desarrollo de células tumorales y biomarcadores del cáncer. In spite of the great development of this field, many of the factors that induce and maintain the differentiation observed in different types of tissues and that give rise to different phenotypes are still unknown. Knowing the mechanisms that regulate these differentiation factors is of special relevance in the observation and study of the development of tumor cells and cancer biomarkers.

Las técnicas utilizadas comúnmente en el estado de la técnica para analizar tejidos biológicos incluyen, por ejemplo, el uso de nanosensores y nanopartículas Techniques commonly used in the state of the art to analyze biological tissues include, for example, the use of nanosensors and nanoparticles.

o técnicas basadas en espectrometría de masas, entre otras. Adicionalmente, los citados estudios biológicos pueden realizarse mediante técnicas ópticas, en dispositivos de estructura superﬁcial o tridimensional, cuyo modo de operación se basa en la difusión de dianas en sistemas de detección o en sistemas de resonancia magnética nuclear (RMN), con o sin el uso de agentes de contraste. Un tipo de dichos agentes de contraste incluye la preparación de partículas magnéticas (nanopartículas) que pueden ser fácilmente manipulables por campos magnéticos débiles. La microscopía por RMN ha ido desarrollándose paralelamente a las técnicas de imagen macroscópicas habituales en aplicaciones clínicas y con animales y, recientemente, se ha comenzado a abordar la obtención de imágenes por RMN de células individuales, así como la obtención de perﬁles metabólicos en volúmenes de escala celular. Sin embargo, tanto el aumento de resolución de la técnica, como el reducido tamaño de las muestras vivas a investigar, presentan aún retos tecnológicos importantes. or techniques based on mass spectrometry, among others. Additionally, the aforementioned biological studies can be carried out by means of optical techniques, in devices of surface or three-dimensional structure, whose mode of operation is based on the diffusion of targets in detection systems or in nuclear magnetic resonance (NMR) systems, with or without the use of contrast agents. One type of such contrast agents includes the preparation of magnetic particles (nanoparticles) that can be easily manipulated by weak magnetic fields. NMR microscopy has been developed in parallel to the usual macroscopic imaging techniques in clinical and animal applications and, recently, it has begun to address the NMR imaging of individual cells, as well as obtaining metabolic profiles in volumes of cell scale However, both the increased resolution of the technique and the small size of the live samples to be investigated still present significant technological challenges.

En un intento de reproducir lo más ﬁelmente posible las condiciones en que las células crecen in vivo y, a su vez, de disponer del máximo control sobre su entorno, existen en la actualidad diversos tipos de dispositivos preparados para su análisis por RMN, y que están basados en la combinación de las técnicas de microﬂuídica y microfabricación, junto con la construcción de matrices tridimensionales que remedan el entorno celular en el seno de los tejidos vivos. De este modo, tanto el aporte de nutrientes, factores de crecimiento y otras señales, así como el intercambio de gases y las fuerzas mecánicas, pueden ser aproximadas a los valores ﬁsiológicos que se pretende simular. Algunos ejemplos del citado tipo de dispositivos son las solicitudes de patente WO2002/041021, EP1500944 y US 5313162, que describen diferentes diseños de microcámaras de cultivo celular, o “microrreactores”. In an attempt to reproduce as closely as possible the conditions in which cells grow in vivo and, in turn, to have maximum control over their environment, there are currently various types of devices prepared for NMR analysis, and that They are based on the combination of micro ﬂ uid and microfabrication techniques, together with the construction of three-dimensional matrices that mimic the cellular environment within living tissues. Thus, both the contribution of nutrients, growth factors and other signals, as well as the exchange of gases and mechanical forces, can be approximated to the physiological values that are intended to simulate. Examples of the aforementioned type of devices are patent applications WO2002 / 041021, EP1500944 and US 5313162, which describe different designs of cell culture microchambers, or "microreactors".

La soﬁsticación progresiva de las técnicas de fotolitografía empleadas en la fabricación de chips y dispositivos electrónicos microscópicos, ha permitido el diseño de sistemas en los que se combina la microﬂuídica, con tratamientos especiales de las superﬁcies y la integración de diversos tipos de sensores, para implementar laboratorios a microescala o “lab-on-chips” como, por ejemplo, el dispositivo descrito en la solicitud de patente WO 2009/045551. En la construcción de dicho tipo de dispositivos se emplean gran variedad de materiales, predominando el uso de resinas y polímeros (SU-8, PMMA, PMMS, etc.). Dichos sistemas lab-on-chip suponen una considerable mejora frente a desarrollos anteriores, presentando ventajas tales como el ahorro en el volumen del ﬂuido analizado, lo que reduce costes en los agentes reactivos y disminuye la necesidad de grandes muestras de análisis; tiempos menores de respuesta y de análisis, como consecuencia de que las distancias de difusión son menores; mayor control de los procesos y una respuesta más rápida de los sistemas; la posibilidad de realizar análisis paralelos masivos, así como la producción a gran escala de dispositivos; y proporcionan, además, plataformas más seguras para realizar estudios químicos, biológicos o radiológicos, como consecuencia de su menor volumen. The progressive sophistication of the photolithography techniques used in the manufacture of chips and microscopic electronic devices, has allowed the design of systems in which the micro ﬂ uid is combined, with special surface treatments and the integration of various types of sensors, to implement microscale laboratories or "lab-on-chips" as, for example, the device described in patent application WO 2009/045551. In the construction of such devices, a wide variety of materials are used, predominantly the use of resins and polymers (SU-8, PMMA, PMMS, etc.). These lab-on-chip systems represent a considerable improvement over previous developments, presenting advantages such as saving the volume of the analyzed fluid, which reduces costs in reactive agents and reduces the need for large analysis samples; shorter response and analysis times, as a consequence of the fact that the diffusion distances are shorter; greater control of the processes and a faster response of the systems; the possibility of carrying out massive parallel analyzes, as well as the large-scale production of devices; and they also provide safer platforms for chemical, biological or radiological studies, as a consequence of their smaller volume.

Si bien el estado de la técnica es capaz de resolver algunos de los desafíos que plantea el desarrollo de microcámaras de cultivo celular, la presente invención supone una mejora frente a ellas, al estar especialmente concebida como una microcámara encapsulada de material transparente y biocompatible, que proporciona una plataforma de dimensiones aptas para un equipo de RMN, pero utilizable, a la vez, junto con técnicas de microscopía, y que resulta al mismo tiempo de fácil manejo para el usuario, permitiendo su manipulación o su reemplazo sin la necesidad de un montaje laborioso. El hecho de tratar con una microcámara encapsulada beneﬁcia notablemente el estudio de cultivos durante periodos largos de tiempo, permitiendo estudios durante tiempos superiores a 24 horas. Although the state of the art is able to solve some of the challenges posed by the development of cell culture microcameras, the present invention is an improvement against them, being especially conceived as an encapsulated microcamera of transparent and biocompatible material, which It provides a platform of suitable dimensions for an NMR device, but usable, at the same time, together with microscopy techniques, and that is at the same time easy to handle for the user, allowing its manipulation or replacement without the need for assembly laborious. The fact of dealing with an encapsulated microcamera remarkably benefits the study of crops for long periods of time, allowing studies for times longer than 24 hours.

Adicionalmente, el diseño de la microcámara de la presente invención, basado en, al menos, dos canales diferenciados para la entrada de las células de cultivo y del medio de cultivo, proporciona un mayor control sobre el ﬂujo de células introducidas, dado que éstas, al poseer su propia vía de entrada, no se ven condicionadas por el ﬂujo propio del medio de cultivo. Dicha característica permite ajustar y corregir el volumen de células de cultivo a medida que las características del experimento lo requieran, sin modiﬁcar el ﬂujo del medio empleado para mantener el cultivo estudiado en condiciones óptimas. Additionally, the design of the microcamera of the present invention, based on at least two differentiated channels for the entry of the culture cells and the culture medium, provides greater control over the flow of introduced cells, since these, having their own way of entry, they are not conditioned by the flow of the culture medium itself. This characteristic allows adjusting and correcting the volume of culture cells as the characteristics of the experiment require, without modifying the ﬂ ow of the medium used to maintain the culture studied in optimal conditions.

La invención resulta especialmente adecuada para estudiar el efecto de fármacos y otros agentes (tales como nanopartículas) permitiendo, además de los usos habituales de inspección visual y obtención de imágenes, el control metabólico de los sistemas celulares mediante RMN, facultad que resulta de especial relevancia para la comprobación y el análisis de efectos tóxicos en las células de cultivo estudiadas. The invention is especially suitable for studying the effect of drugs and other agents (such as nanoparticles) allowing, in addition to the usual uses of visual inspection and imaging, the metabolic control of cellular systems by NMR, which is of particular relevance. for the verification and analysis of toxic effects in the culture cells studied.

A lo largo del presente documento, el término “chip” se reﬁere a un dispositivo plástico de algunos milímetros cuadrados de área, en el que se fabrica la microcámara de cultivo mediante la combinación de procesos de fotolitografía de diferentes capas que se unen entre sí mediante procesos de pegado o técnicas similares de microfabricación, tales como microinyección o “hot embossing”. Throughout this document, the term "chip" refers to a plastic device of some square millimeters of area, in which the culture microcamera is manufactured by combining photolithography processes of different layers that are joined together by gluing processes or similar microfabrication techniques, such as microinjection or hot embossing.

El término “encapsulado” se interpreta como un empaquetado compacto del chip procedente de la oblea semiconductora sobre la que se fabrica la microcámara, para efectuar la conexión de dicha microcámara con los demás componentes del dispositivo de cultivo celular. The term "encapsulated" is interpreted as a compact packaging of the chip from the semiconductor wafer on which the microcamera is manufactured, to effect the connection of said microcamera with the other components of the cell culture device.

El término “biocompatible” se reﬁere, dentro del contexto de la presente invención, a la capacidad de un material para alojar cultivos biológicos vivos, sin producir efectos locales perjudiciales en las funciones The term "biocompatible" refers, within the context of the present invention, to the ability of a material to house living biological cultures, without producing detrimental local effects on functions.

o la integridad de dichos cultivos, permitiendo de forma natural su desarrollo celular o su respuesta tisular. or the integrity of said cultures, naturally allowing their cellular development or their tissue response.

Objeto de la invenciónObject of the invention

Un objeto de la presente invención es una microcámara de cultivo celular encapsulada, monitorizable por RMN y alojada en el interior de un chip. Se consigue con ello un dispositivo de fácil manejo para el usuario, permitiendo su manipulación o su reemplazo sin la necesidad de un montaje laborioso, beneﬁciando además notablemente el estudio de cultivos durante periodos largos de tiempo, no inferiores a 24 horas. An object of the present invention is an encapsulated cell culture microcamera, monitored by NMR and housed inside a chip. This achieves a user-friendly device, allowing its manipulation or replacement without the need for a laborious assembly, also remarkably benefiting the study of crops for long periods of time, not less than 24 hours.

Un objeto de la presente invención es una microcámara de cultivo celular monitorizable por RMN que comprende, adicionalmente, al menos un canal de entrada de las células de cultivo, al menos, un canal de entrada del medio de cultivo y, al menos, un canal de salida. Ello proporciona un mayor control sobre el ﬂujo de células introducidas, dado que éstas, al poseer su propia vía de entrada, no se ven condicionadas por el ﬂujo propio del medio de cultivo. Dicha característica permite, además, ajustar y corregir el volumen de células de cultivo a medida que las características del experimento lo requieran. An object of the present invention is an NMR-monitored cell culture microcamera that additionally comprises at least one input channel of the culture cells, at least one input channel of the culture medium and at least one channel output This provides greater control over the flow of introduced cells, since these, having their own way of entry, are not conditioned by the flow of the culture medium itself. This characteristic also allows adjusting and correcting the volume of culture cells as the characteristics of the experiment require.

Otro objeto de la invención es una microcámara de cultivo celular monitorizable por RMN que comprende, adicionalmente, uno o más canales para la entrada de sensores destinados a la medición de propiedades físicas del cultivo, tales como su temperatura, pH, pNO, pSH2,pO2 ó pCO2, preferentemente fabricados con ﬁbra óptica. Ello permite un mayor control sobre las propiedades físico-químicas del cultivo estudiado. Another object of the invention is an NMR-monitored cell culture microcamera that additionally comprises one or more channels for the input of sensors intended for the measurement of physical properties of the culture, such as its temperature, pH, pNO, pSH2, pO2 or pCO2, preferably manufactured with optical fiber. This allows greater control over the physicochemical properties of the crop studied.

En concreto, el objeto de la invención es una microcámara de cultivo celular monitorizable por RMN, cuyo volumen está, preferentemente, comprendido entre 1 -4 mm3 y cuyas dimensiones de longitud y anchura son, preferentemente, iguales o inferiores a 2 mm x 2 mm, con una altura comprendida entre 400 1000 μm. Con ello se consigue una microcámara de cultivo idónea para su instalación en aparatos de detección por RMN y especíﬁcamente en su sistema de microbobinas, permitiendo conseguir una alta resolución. Specifically, the object of the invention is an NMR-monitored cell culture microcamera, whose volume is preferably between 1 -4 mm3 and whose length and width dimensions are preferably equal to or less than 2 mm x 2 mm , with a height between 400 1000 μm. This achieves an ideal microcamera for installation in NMR detection devices and specifically in its micro-coil system, allowing high resolution to be achieved.

Otro objeto de la invención es una microcámara de cultivo celular monitorizable por RMN donde el chip que aloja dicha microcámara de cultivo está fabricado con materiales transparentes y biocompatibles, preferentemente con un sustrato Glass-SOI (“Silicon on insulator”), SOI-PDMS (Polidimetil siloxano), Glass-SiC (carburo de silicio) ó materiales fotodeﬁnibles (por ejemplo, SU-8). Se consigue con ello microcámaras de cultivo que permiten también su monitorización por medio de dispositivos de microscopía, que favorecen además la pervivencia de las células estudiadas y el mantenimiento de los cultivos en condiciones óptimas durante un mayor tiempo. Another object of the invention is an NMR-monitored cell culture microcamera where the chip that houses said culture microcamera is made of transparent and biocompatible materials, preferably with a Glass-SOI substrate ("Silicon on insulator"), SOI-PDMS ( Polydimethyl siloxane), Glass-SiC (silicon carbide) or photodefinable materials (for example, SU-8). This achieves culture microchambers that also allow their monitoring by means of microscopy devices, which also favor the survival of the cells studied and the maintenance of the cultures in optimal conditions for a longer time.

Otro objeto de la presente invención es una microcámara de cultivo celular monitorizable por RMN, donde la anchura del canal de entrada de células de cultivo está comprendida entre 150-500 μm. Dicho tamaño resulta especialmente apropiado para el cultivo de neuroesferas (estructuras celulares libres generadas in vitro por células troncales de tejido nervioso) Another object of the present invention is an NMR-monitored cell culture microcamera, where the width of the inlet channel of culture cells is between 150-500 µm. Such size is especially appropriate for the culture of neurospheres (free cellular structures generated in vitro by stem cells of nerve tissue)

o esferoides obtenidos de otras células tracales o con alta tasa de división, como las células tumorales. or spheroids obtained from other tracal cells or with high division rate, such as tumor cells.

Otro objeto de la presente invención es una microcámara de cultivo celular monitorizable por RMN donde los canales de entrada y de salida se conectan con una pluralidad de canales de difusión divididos a través de tabiques, estando dichos canales destinados a obtener una distribución más uniforme del ﬂujo de células dentro de la cámara de cultivo, facilitando además el conﬁnamiento de dichas células. Another object of the present invention is an NMR-monitored cell culture microcamera where the input and output channels are connected with a plurality of diffusion channels divided through partitions, said channels being intended to obtain a more uniform distribution of the flow of cells within the culture chamber, further facilitating the con ﬁ nation of said cells.

Otro objeto de la presente invención es una microcámara de cultivo celular monitorizable por RMN donde los canales de difusión para la entrada y la salida del medio de cultivo poseen una anchura menor que las células de cultivo. Ello favorece que dichas células permanezcan localizadas en el interior de la zona de cultivo. Another object of the present invention is an NMR-monitored cell culture microcamera where the diffusion channels for the entry and exit of the culture medium have a smaller width than the culture cells. This favors that said cells remain located inside the culture zone.

Otro objeto de la presente invención es una microcámara de cultivo celular monitorizable por RMN donde los canales de difusión de entrada de las células de cultivo poseen una anchura de, preferentemente, 200 μm, y los canales de difusión de entrada y de salida del medio de cultivo poseen, preferentemente, una anchura comprendida entre 40 -75 μm, siendo dicho rango suﬁcientemente pequeño para mantener conﬁnadas las células de cultivo dentro de la cámara. Another object of the present invention is an NMR-monitored cell culture microcamera where the input diffusion channels of the culture cells have a width of preferably 200 μm, and the input and output diffusion channels of the medium of culture preferably have a width between 40-75 μm, said range being sufficiently small to keep the culture cells confined within the chamber.

Otro objeto de la presente invención es un dispositivo de cultivo celular que comprende: Another object of the present invention is a cell culture device comprising:

i) una microcámara de cultivo celular; i) a cell culture microcamera;

ii) un solenoide plano impreso para la monitorización del cultivo por RMN; ii) a flat printed solenoid for monitoring the culture by NMR;

iii) un sistema de ﬁjación encapsulado que comprende el acoplamiento solidario de los elementos i), ii) y una conexión hermética, opcionalmente desacoplable, entre la microcámara y una pluralidad de tubos capilares para la circulación de las células de cultivo y del medio de cultivo; iii) an encapsulated fixation system comprising the integral coupling of the elements i), ii) and a hermetic connection, optionally decoupled, between the microcamera and a plurality of capillary tubes for the circulation of the culture cells and the culture medium ;

y que es monitorizable por RMN. and that is monitored by NMR.

Otro objeto de la presente invención es un dispositivo de cultivo celular que comprende, al menos un equipo de resonancia magnética nuclear para la monitorización del cultivo celular. Another object of the present invention is a cell culture device comprising at least one nuclear magnetic resonance equipment for cell culture monitoring.

Otro objeto de la presente invención es un dispositivo de cultivo celular donde la distancia de contacto entre el solenoide plano impreso y la microcámara es igual o inferior a 50 μm. Esta distancia resulta óptima para una adecuada monitorización por RMN. Another object of the present invention is a cell culture device where the contact distance between the printed flat solenoid and the microcamera is equal to or less than 50 μm. This distance is optimal for proper NMR monitoring.

Otro objeto de la presente invención es un dispositivo de cultivo celular que comprende, adicionalmente, al menos un equipo de microscopía para la monitorización del cultivo celular. Another object of the present invention is a cell culture device that additionally comprises at least one microscopy equipment for cell culture monitoring.

Otro objeto de la presente invención es un dispositivo de cultivo celular donde los tubos capilares están conectados, opcionalmente, a sistemas de impulsión de los líquidos empleados, a válvulas y/o ﬁltros para regular la circulación de dichos líquidos, así como a contenedores de desecho o a puntos de acceso adicionales para la conexión de otros elementos al sistema. Another object of the present invention is a cell culture device where the capillary tubes are optionally connected to delivery systems of the liquids used, to valves and / or filters to regulate the circulation of said liquids, as well as to waste containers or to additional access points for connecting other elements to the system.

Otro objeto de la presente invención es un dispositivo donde los sistemas de impulsión del ﬂuido son jeringas reguladas mediante microbombas de inyección. Another object of the present invention is a device where the fluid delivery systems are syringes regulated by injection micropumps.

Otro objeto de la presente invención es un dispositivo donde los tubos capilares que se conectan a los canales de entrada y de salida poseen una longitud de, al menos, 3 m. Another object of the present invention is a device where the capillary tubes that are connected to the inlet and outlet channels have a length of at least 3 m.

Otro objeto de la presente invención es un procedimiento de montaje de un dispositivo de cultivo celular, donde dicho montaje se realiza situando la superﬁcie del chip que aloja la microcámara sobre una base de circuito impreso PCB que posee el solenoide plano impreso, acoplándose dicho chip y la base de circuito impreso a presión entre una base y una cubierta, disponiendo la base de un alojamiento sobre el que se asienta el chip, una abertura en la parte posterior de la base que permite que los sensores salgan del chip, y unos alojamientos sobre los que se insertan conectores ﬂuídicos para conectar la microcámara a una pluralidad de tubos capilares para la circulación de las células de cultivo y del medio de cultivo. Another object of the present invention is a method of assembling a cell culture device, where said assembly is carried out by placing the surface of the chip that houses the microcamera on a PCB printed circuit base that has the printed flat solenoid, said chip being coupled and the pressurized printed circuit base between a base and a cover, the base of a housing on which the chip sits, an opening in the back of the base that allows the sensors to exit the chip, and housings on those that insert fluid connectors to connect the microcamera to a plurality of capillary tubes for the circulation of the culture cells and the culture medium.

Otro objeto de la presente invención es el uso de una microcámara en el estudio y monitorización de cultivos biológicos, preferentemente que comprenden células tumorales. Another object of the present invention is the use of a microcamera in the study and monitoring of biological cultures, preferably comprising tumor cells.

Otro objeto de la presente invención es el uso de un dispositivo de cultivo celular en el estudio y monitorización de cultivos biológicos, preferentemente que comprenden células tumorales. Another object of the present invention is the use of a cell culture device in the study and monitoring of biological cultures, preferably comprising tumor cells.

Otro objeto de la presente invención es un método de monitorización de un cultivo celular que comprende el uso de una microcámara, donde se acopla dicha microcámara a un equipo de resonancia magnética nuclear. Another object of the present invention is a method of monitoring a cell culture comprising the use of a micro camera, where said micro camera is coupled to a nuclear magnetic resonance equipment.

Otro objeto de la presente invención es un método donde, adicionalmente, se monitoriza la microcámara por medio de, al menos, un equipo de microscopía. Another object of the present invention is a method where, additionally, the micro camera is monitored by means of at least one microscopy equipment.

Otro objeto de la presente invención es un método de monitorización de un cultivo celular que comprende el uso de un dispositivo de cultivo celular, donde se acopla dicho dispositivo a un equipo de resonancia magnética nuclear, adaptándose al sistema de imanes de monitorización del citado equipo de resonancia magnética nuclear. Another object of the present invention is a method of monitoring a cell culture comprising the use of a cell culture device, wherein said device is coupled to a nuclear magnetic resonance device, adapting to the system of monitoring magnets of said equipment. nuclear magnetic resonance.

Otro objeto de la presente invención es un método donde, adicionalmente, se monitoriza el dispositivo de cultivo celular por medio de, al menos, un equipo de microscopía. Another object of the present invention is a method where, in addition, the cell culture device is monitored by means of at least one microscopy equipment.

Otras características y ventajas de la presente invención se desprenderán de la descripción de la invención que sigue, así como de la realización ilustrativa de las ﬁguras que la acompañan. Descripción de las ﬁgurasOther features and advantages of the present invention will be apparent from the description of the invention that follows, as well as from the illustrative embodiment of the accompanying figures. Description of the ﬁ gures

La Figura 1 representa el chip y la microcámara de cultivo de un dispositivo según la presente invención. Figure 1 represents the chip and the microcamera of a device according to the present invention.

La Figura 2 representa el procedimiento de encapsulado del chip y de la microcámara de cultivo de un dispositivo según la presente invención. Figure 2 depicts the method of encapsulating the chip and the microcamera of a device according to the present invention.

La Figura 3 representa una de las posibles conﬁguraciones para el uso del dispositivo de la invención, donde la microcámara de cultivo está conectada a una pluralidad de tubos capilares, sistemas de inyección y otros elementos para la regulación y el análisis del cultivo estudiado. Descripción detallada de la invenciónFigure 3 represents one of the possible configurations for the use of the device of the invention, where the culture microcamera is connected to a plurality of capillary tubes, injection systems and other elements for the regulation and analysis of the studied crop. Detailed description of the invention

El dispositivo de cultivo celular (1) monitorizable por RMN según la presente invención comprende, al menos, una microcámara de cultivo (2) alojada en el interior de un chip (3). Tal y como se representa en la Figura 1, el chip (3) posee una forma preferentemente cuadrada o rectangular, siendo sus dimensiones de longitud (X), anchura (Y) y altura (Z), preferentemente, de 56.0 x 5.5 x 0.56 mm, respectivamente. Dichas dimensiones resultan adecuadas para la producción en serie del dispositivo, permitiendo aplicar para su fabricación las técnicas habituales empleadas en la producción de chips en microelectrónica para el desarrollo de microcircuitos en obleas. The NMR-monitored cell culture device (1) according to the present invention comprises at least one culture microcamera (2) housed inside a chip (3). As shown in Figure 1, the chip (3) has a preferably square or rectangular shape, its dimensions being length (X), width (Y) and height (Z), preferably 56.0 x 5.5 x 0.56 mm, respectively. These dimensions are suitable for the serial production of the device, allowing the usual techniques used in the production of microelectronic chips for the development of microcircuits in wafers to be applied.

La microcámara (2) alojada dentro del chip (3) posee, preferentemente, un volumen comprendido entre 1-4mm3. Las dimensiones de longitud (X’) y anchura (Y’) de dicha microcámara de cultivo (2) son, preferentemente, iguales o inferiores a 2 mm x 2 mm, siendo su altura, preferentemente, igual o inferior a 400 -1000 μm. The microcamera (2) housed inside the chip (3) preferably has a volume between 1-4mm3. The dimensions of length (X ') and width (Y') of said culture microcamera (2) are preferably equal to or less than 2 mm x 2 mm, their height preferably being equal to or less than 400-1000 μm .

Adicionalmente, la microcámara (2) está conectada a, al menos, un canal de entrada de las células de cultivo (4), al menos, un canal de entrada del medio de cultivo (5) y, al menos, un canal de salida (6). Los canales de entrada (4, 5) y de salida (6) poseen, preferentemente, una anchura comprendida entre 150 -500 μm. Additionally, the microcamera (2) is connected to at least one input channel of the culture cells (4), at least one input channel of the culture medium (5) and at least one output channel (6). The input (4, 5) and output (6) channels preferably have a width between 150-500 μm.

Los canales de entrada (4, 5) y de salida (6) se conectan con la microcámara (2) por medio de canales de difusión (8, 9, 10) divididos a través de tabiques (11). Los canales de difusión para la entrada de las células de cultivo (8) poseen, según la presente invención, una anchura mayor que la de los canales de difusión de entrada (9) y de salida (10) del medio de cultivo, de forma que se favorezca que las células estudiadas permanezcan en la zona de cultivo (7). En una realización de la presente invención donde las estructuras celulares estudiadas son neuroesferas, los canales de difusión de entrada de las células de cultivo (8) poseen una anchura de, preferentemente, 200 μm, apta para la correcta circulación de dicho tipo de estructuras celulares. En la misma realización, los canales de difusión de entrada (9) y de salida (10) del medio de cultivo poseen, preferentemente, una anchura comprendida entre 40 -75 μm, lo que permite mantener conﬁnadas las células de cultivo dentro de la microcámara, sin añadir una complejidad excesiva a la tecnología de fabricación del chip. The input (4, 5) and output (6) channels are connected to the microcamera (2) by means of broadcast channels (8, 9, 10) divided through partitions (11). The diffusion channels for the entrance of the culture cells (8) have, according to the present invention, a width greater than that of the diffusion channels of entry (9) and exit (10) of the culture medium, so that the cells studied remain in the culture zone (7). In an embodiment of the present invention where the cellular structures studied are neurospheres, the input diffusion channels of the culture cells (8) have a width of preferably 200 μm, suitable for the correct circulation of said type of cellular structures . In the same embodiment, the inlet (9) and outlet (10) diffusion channels of the culture medium preferably have a width between 40-75 μm, which allows the culture cells to be kept confined within the microcamera , without adding excessive complexity to chip manufacturing technology.

El chip (3) donde se aloja la microcámara de cultivo (2) está fabricado con materiales transparentes y biocompatibles, preferentemente con sustratos Glass-SOI (“Silicon on insulator”), SOI-PDMS (Polidimetil siloxano), Glass-SiC (carburo de silicio) o materiales fotodeﬁnibles (por ejemplo, SU-8). El disponer de un chip (3) transparente permite obtener microcámaras de cultivo que permitan, adicionalmente, su monitorización por medio de dispositivos de microscopía, proporcionando así un mayor control sobre las células estudiadas. The chip (3) where the culture microcamera (2) is housed is made of transparent and biocompatible materials, preferably with substrates Glass-SOI (“Silicon on insulator”), SOI-PDMS (Polydimethyl siloxane), Glass-SiC (carbide of silicon) or photodefinable materials (for example, SU-8). The availability of a transparent chip (3) allows to obtain culture microcamera that additionally allow its monitoring by means of microscopy devices, thus providing greater control over the cells studied.

Además de los canales de entrada (4, 5) y de salida (6) de las células estudiadas y del medio de cultivo, la microcámara (2) según la presente invención puede presentar uno o más canales (12) para a la entrada de sensores (13) destinados a la medición de propiedades físicas del cultivo celular, tales como su temperatura, pH, pNO, pSH2,pO2 ó pCO2. Ello permite un mayor control sobre las propiedades físico-químicas del cultivo estudiado. Preferentemente, dichos sensores (13) son sensores de ﬁbra óptica. In addition to the input (4, 5) and output (6) channels of the studied cells and the culture medium, the microcamera (2) according to the present invention can have one or more channels (12) for the input of sensors (13) intended for the measurement of physical properties of cell culture, such as its temperature, pH, pNO, pSH2, pO2 or pCO2. This allows greater control over the physicochemical properties of the crop studied. Preferably, said sensors (13) are optical fiber sensors.

Las dimensiones y el sistema de canales de la microcámara de cultivo según la presente invención resultan, junto con su capacidad de ser monitorizable tanto por RMN como por sistemas de microscopía, especialmente adecuados para probar el efecto de fármacos y otros agentes, tales como nanopartículas (entendidas éstas como cuerpos o partículas de un tamaño inferior a 100 nm), que permite, además de los usos de obtención de imágenes por inspección visual, el control metabólico de los sistemas celulares estudiados (mediante la espectroscopia de RMN). The dimensions and channel system of the culture microcamera according to the present invention are, together with its ability to be monitored by both NMR and microscopy systems, especially suitable for testing the effect of drugs and other agents, such as nanoparticles ( understood as bodies or particles smaller than 100 nm), which allows, in addition to the use of imaging by visual inspection, the metabolic control of the cellular systems studied (using NMR spectroscopy).

El encapsulado de la microcámara de cultivo (2) según la presente invención está representado en la Figura 2. En dicha ﬁgura, se muestra cómo la superﬁcie del chip (3) que aloja la microcámara (2) se sitúa sobre una base de circuito impreso (14) PCB (“printed circuit board”) que posee una placa de vidrio (15) sobre la que se monta un solenoide plano impreso (16), de modo que el conjunto sea transparente, para poder visualizar la microcámara. Dicho solenoide (16) es un componente necesario en equipos de monitorización por RMN. Con el ﬁn de obtener un acoplamiento óptimo entre la microcámara (2) y el solenoide plano impreso (16), para lograr una adecuada monitorización, la distancia entre sus superﬁcies no ha de superar los 50 μm. The encapsulation of the culture microcamera (2) according to the present invention is represented in Figure 2. In said figure, it is shown how the surface of the chip (3) that houses the microcamera (2) is placed on a printed circuit base (14) PCB (“printed circuit board”) that has a glass plate (15) on which a printed flat solenoid (16) is mounted, so that the assembly is transparent, to visualize the microcamera. Said solenoid (16) is a necessary component in NMR monitoring equipment. In order to obtain an optimal coupling between the microcamera (2) and the printed flat solenoid (16), to achieve adequate monitoring, the distance between its surfaces must not exceed 50 μm.

El encapsulado realiza varias funciones: ﬁja el chip (3) a la placa de circuito impreso (14) con el solenoide (16) para RMN; permite introducir y extraer los diferentes contenidos de la microcámara (2); y garantiza el sellado de los diferentes elementos. Tal y como se muestra en la Figura 2, el montaje del encapsulado se realiza mediante una base (17) y una cubierta (18), ambas realizadas en resina epoxi u otro material plástico o cerámico. La base (17) dispone de un alojamiento (19) sobre el que se asienta el chip (3). Sobre el alojamiento (19) se colocan unas juntas The encapsulation performs several functions: it fixes the chip (3) to the printed circuit board (14) with the solenoid (16) for NMR; allows to introduce and extract the different contents of the microcamera (2); and guarantees the sealing of the different elements. As shown in Figure 2, the encapsulation is assembled using a base (17) and a cover (18), both made of epoxy resin or other plastic or ceramic material. The base (17) has a housing (19) on which the chip (3) sits. Seals are placed on the housing (19)

(20) de material elástico. Dichas juntas (20) aseguran la estanqueidad entre el chip (3) y la base (17). Una abertura (21) en la parte posterior de la base (17) permite que los sensores de ﬁbra óptica (13) salgan del chip sin impedimentos. La base dispone de unos alojamientos (22) sobre los que se insertan conectores ﬂuídicos (23) que permiten conectar de forma hermética, a través de tubos, el encapsulado a diferentes elementos del dispositivo, tales como microbombas, jeringas, dispositivos de análisis, etcétera. Los conectores ﬂuídicos (23), de material plástico, se amarran en los alojamientos (22) de la base (17), mediante presión, adhesión, juntas elásticas, sistemas de rosca, biconos o mediante cualquier otro método que los ﬁje a la base (17) y garantice la estanqueidad de la conexión, permitiendo, al mismo tiempo, el desacople del dispositivo de cultivo celular (1) según las necesidades del experimento realizado. La base (17) dispone, asimismo, de conductos internos (24) que comunican los conectores ﬂuídicos (23) con los canales (4, 5, 6) del chip (3). La cubierta (18) se ﬁja a la base (17) a presión para garantizar que las juntas (20) efectúen un sellado correcto. Ello se realiza mediante tornillos (25), abrazaderas, grapas, o cualquier otro medio, siempre de material aislante eléctrico, como por ejemplo el plástico. Esta ﬁjación, además de garantizar el sellado, mantiene a todos los elementos del encapsulado unidos, ﬁjando también el encapsulado a la placa de circuito impreso (14) con el solenoide (16). (20) of elastic material. Said joints (20) ensure the tightness between the chip (3) and the base (17). An opening (21) on the back of the base (17) allows the optical fiber sensors (13) to exit the chip without hindrance. The base has some housings (22) on which fluidic connectors (23) are inserted that allow to connect hermetically, through tubes, the encapsulation to different elements of the device, such as micropumps, syringes, analysis devices, etc. . Fluidic connectors (23), of plastic material, are attached to the housings (22) of the base (17), by means of pressure, adhesion, elastic seals, thread systems, bicones or by any other method that fixes them to the base (17) and guarantee the tightness of the connection, allowing, at the same time, the decoupling of the cell culture device (1) according to the needs of the experiment performed. The base (17) also has internal ducts (24) that connect the fluid connectors (23) with the channels (4, 5, 6) of the chip (3). The cover (18) is fixed to the pressurized base (17) to ensure that the seals (20) make a correct seal. This is done by screws (25), clamps, staples, or any other means, always made of electrical insulating material, such as plastic. This fixation, in addition to guaranteeing the sealing, keeps all the elements of the package together, also fixing the package to the printed circuit board (14) with the solenoid (16).

Las ventajas que un dispositivo encapsulado otorgan a la presente invención están fundamentalmente orientadas a conseguir una microcámara de cultivo que resulte de fácil manejo, permitiendo acoplar y desacoplar de forma sencilla el dispositivo sin necesidad de montajes individualizados. Las propiedades de encapsulamiento del presente dispositivo beneﬁcian, adicionalmente, el mantenimiento de los cultivos celulares en condiciones óptimas, sin contaminación, durante periodos largos de tiempo, facilitando el estudio de dichos cultivos durante tiempos superiores a 24 horas. The advantages that an encapsulated device give to the present invention are fundamentally oriented to achieve a culture microcamera that is easy to handle, allowing the device to be easily coupled and uncoupled without the need for individual assemblies. The encapsulation properties of the present device benefit, in addition, the maintenance of cell cultures in optimal conditions, without contamination, for long periods of time, facilitating the study of said cultures for times longer than 24 hours.

El montaje encapsulado del dispositivo de cultivo The encapsulated assembly of the culture device

(1) (one): según la presente invención es fácilmente adaptable a los aparatos de RMN empleados habitualmente en el sector y existentes en el mercado. Adicionalmente, y según lo descrito anteriormente, en distintas realizaciones de la invención también es posible acoplar al dispositivo (1) a uno o más aparatos de microscopía, instalados como apoyo a la monitorización realizada por RMN. According to the present invention, it is easily adaptable to the NMR devices commonly used in the sector and existing in the market. Additionally, and as described above, in different embodiments of the invention it is also possible to couple the device (1) to one or more microscopy devices, installed in support of the NMR monitoring.

La Figura 3 representa, para una posible conﬁguración de la invención, el sistema de conexión del dispositivo de cultivo (1) a una pluralidad de tubos capilares (26), así como los sensores de ﬁbra óptica (13). El dispositivo de cultivo (1) se conecta, a través de los conectares ﬂuídicos (23), a cada uno de los citados tubos capilares (26), acoplando los tubos (26) de entrada de células de cultivo y de entrada del medio de cultivo a sus respectivas jeringas (27) reguladas mediante microbombas de inyección, los sensores de ﬁbra óptica (13) a los dispositivos de análisis empleados para la monitorización de las propiedades físicas deseadas (temperatura, pH, pNO, pSH2,pO2 ó pCO2), y el tubo capilar de salida a un contenedor de desecho (28). Los tubos (26) que conectan los conectares ﬂuídicos (23) de entrada con las jeringas (27) poseen una longitud preferente de, al menos, 3 m, siendo dicha distancia la mínima necesaria entre los sistemas electro mecánicos empleados para la impulsión del ﬂuido y para el control de los sensores, al tiempo que se pueda alcanzar el interior del aparato de RMN donde se aloja la muestra. El sistema de conexión, opcionalmente, puede incluir la presencia de válvulas (29) que permiten regular el ﬂujo de los líquidos empleados, de ﬁltros Figure 3 represents, for possible con ﬁ guration of the invention, the connection system of the culture device (1) to a plurality of capillary tubes (26), as well as the optical fiber sensors (13). The culture device (1) is connected, through the fluidic connectors (23), to each of said capillary tubes (26), coupling the inlet tubes (26) of culture cells and inlet of the medium of culture to their respective syringes (27) regulated by injection micropumps, the optical fiber sensors (13) to the analysis devices used for monitoring the desired physical properties (temperature, pH, pNO, pSH2, pO2 or pCO2), and the capillary outlet tube to a waste container (28). The tubes (26) connecting the fluidic connectors (23) with the syringes (27) have a preferred length of at least 3 m, said distance being the minimum necessary between the electro-mechanical systems used to drive the fluid and for the control of the sensors, while the interior of the NMR apparatus where the sample is housed can be reached. The connection system, optionally, can include the presence of valves (29) that allow to regulate the flow of the liquids used, filters

(30) (30): que facilitan la retención de burbujas generadas por cambios de presión y/o temperatura, o de puntos de acceso (31) adicionales para la conexión de otros elementos al sistema (microbombas, depósitos, válvulas, etc.), según resulte conveniente para el estudio de un determinado cultivo. that facilitate the retention of bubbles generated by changes in pressure and / or temperature, or additional access points (31) for the connection of other elements to the system (micropumps, tanks, valves, etc.), as is convenient for the study of a particular crop.

Una vez descrita la presente invención, cabe resaltar que las realizaciones preferentes de la misma no han de ser consideradas como limitativas frente variaciones de su diseño o de los elementos empleados para su fabricación, siempre que dichas variaciones no alteren la esencia de la invención, así como el objeto de la misma. Once the present invention has been described, it should be noted that the preferred embodiments thereof should not be considered as limiting against variations of its design or of the elements used for its manufacture, provided that said variations do not alter the essence of the invention, thus as the object of it.

Claims

9 10 and that is monitored by NMR.

1. Cell culture microcamera (2) housed inside a substantially flat chip (3), comprising:

--: al menos, un canal de entrada (4) de las células de cultivo; at least one input channel (4) of the culture cells;

--: al menos, un canal de entrada (5) del medio de cultivo; at least one input channel (5) of the culture medium;

--: al menos, un canal de salida (6); at least one output channel (6);

--: al menos, un canal (12) para la entrada de sensores (13) destinados a la medición de propiedades físicas del cultivo celular, tales como su temperatura, pH, pNO, pSH2,pO2 ó PCO2; at least one channel (12) for the input of sensors (13) for the measurement of physical properties of the cell culture, such as its temperature, pH, pNO, pSH2, pO2 or PCO2;

and that is monitored by NMR.

2. 2.: Microcámara (2) según la reivindicación 1, donde el chip (3) está fabricado con un material transparente y biocompatible, preferentemente con un sustrato Glass-SOI, SOI-PDMS, Glass-Carburo de silicio o SU-8. Microcamera (2) according to claim 1, wherein the chip (3) is made of a transparent and biocompatible material, preferably with a Glass-SOI, SOI-PDMS, Silicon Glass-Carbide or SU-8 substrate.

3. 3.: Microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde su volumen está comprendido entre 1-4 mm3. Microcamera (2) according to any of claims 1-2, wherein its volume is comprised between 1-4 mm3.

4. Four.: Microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde sus dimensiones de longitud y anchura son, preferentemente, iguales o inferiores a 2 mmx 2 mm. Microcamera (2) according to any of claims 1-3, wherein its length and width dimensions are preferably equal to or less than 2 mm x 2 mm.

5. 5.: Microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la anchura del canal de entrada de células de cultivo (4) está comprendida entre 150500 μm. Microcamera (2) according to any of claims 1-4, wherein the width of the inlet channel of culture cells (4) is between 150500 µm.

6. 6.: Microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde los sensores (13) destinados a la medición de propiedades físicas del cultivo celular están fabricados con ﬁbra óptica. Microcamera (2) according to any one of claims 1-5, wherein the sensors (13) intended for the measurement of physical properties of the cell culture are manufactured with optical fiber.

7. 7.: Microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde los canales de entrada (4, 5) y de salida (6) se conectan a canales de difusión para la entrada de células de cultivo (8), canales de difusión para la entrada del medio de cultivo (9) y canales de difusión para la salida del medio de cultivo (10), estando divididos dichos canales de difusión (8, 9, 10) a través de tabiques (11). Microcamera (2) according to any of claims 1-6, wherein the input (4, 5) and output (6) channels are connected to broadcast channels for the input of culture cells (8), broadcast channels for the entrance of the culture medium (9) and diffusion channels for the exit of the culture medium (10), said diffusion channels (8, 9, 10) being divided through partitions (11).

8. 8.: Microcámara (2) según la reivindicación 7, donde los canales de difusión de entrada (9) y de salida Microcamera (2) according to claim 7, wherein the input (9) and output broadcast channels

(10) of the culture medium have a width smaller than the culture cells studied, so that it is favored that said cells remain inside the culture zone (7).

9. 9.: Microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde los canales de difusión de entrada de las células de cultivo (8) poseen una anchura de, preferentemente, 200 μm, y los canales de difusión de entrada (9) y de salida (10) del medio de cultivo poseen, preferentemente, una anchura comprendida entre 40-75 μm. Microcamera (2) according to any of claims 7-8, wherein the input diffusion channels of the culture cells (8) have a width of preferably 200 μm, and the input diffusion channels (9) and of The outlet (10) of the culture medium preferably has a width between 40-75 μm.

10. 10.: Dispositivo de cultivo celular (1), que comprende: i) una microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-9; ii) un solenoide plano impreso (16) para la monitorización del cultivo por RMN; Cell culture device (1), comprising: i) a microcamera (2) according to any of claims 1-9; ii) a flat printed solenoid (16) for monitoring the culture by NMR;

iii) an encapsulated fixing system comprising the integral coupling of the elements i), ii) and an hermetic connection, optionally uncoupleable, between the microcamera (2) and a plurality of capillary tubes (26) for the circulation of the cells of culture and culture medium;

11. eleven.: Dispositivo (1) según la reivindicación 10, que comprende, al menos un equipo de resonancia magnética nuclear para la monitorización del cultivo celular. Device (1) according to claim 10, comprising at least one nuclear magnetic resonance equipment for cell culture monitoring.

12. 12.: Dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-11, donde la distancia de contacto entre el solenoide plano impreso (16) y la microcámara (2) es igual o inferior a 50 μm. Device (1) according to any of claims 10-11, wherein the contact distance between the printed flat solenoid (16) and the microcamera (2) is equal to or less than 50 μm.

13. 13.: Dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que comprende, adicionalmente, al menos un equipo de microscopía para la monitorización del cultivo celular. Device (1) according to any one of claims 10-12, further comprising at least one microscopy equipment for cell culture monitoring.

14. 14.: Dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde los tubos capilares (26) están conectados, opcionalmente, a sistemas de impulsión (27) de los líquidos empleados, a válvulas (29) y/o ﬁltros (30) para regular la circulación de dichos líquidos, así como a contenedores de desecho (28) o a puntos de acceso (31) adicionales para la conexión de otros elementos al sistema. Device (1) according to any of claims 10-13, wherein the capillary tubes (26) are optionally connected to delivery systems (27) of the liquids used, to valves (29) and / or ﬁ lters (30) for regulate the circulation of said liquids, as well as waste containers (28) or additional access points (31) for the connection of other elements to the system.

15. fifteen.: Dispositivo (1) según la reivindicación 14, donde los sistemas de impulsión (27) del ﬂuido son jeringas reguladas mediante microbombas de inyección. Device (1) according to claim 14, wherein the fluid delivery systems (27) are syringes regulated by injection micropumps.

16. 16.: Dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-15, donde los tubos capilares (26) que se conectan a los canales (4, 5, 6) poseen una longitud de, al menos, 3 m. Device (1) according to any of claims 10-15, wherein the capillary tubes (26) that are connected to the channels (4, 5, 6) have a length of at least 3 m.

17. Procedure for mounting a device

(1) (one): según cualquiera de las reivindicaciones 10-16, donde dicho montaje se realiza situando la superﬁcie del chip (3) que aloja la microcámara (2) sobre una base de circuito impreso (14) PCB que posee el solenoide plano impreso (16) para la monitorización del cultivo por RMN, acoplándose dicho chip (3) y la base de circuito impreso (14) a presión entre una base according to any of claims 10-16, wherein said assembly is carried out by placing the surface of the chip (3) that houses the microcamera (2) on a printed circuit base (14) PCB that has the printed flat solenoid (16) for the NMR culture monitoring, said chip (3) and the printed circuit base (14) being pressed under pressure between a base

(17) (17): y una cubierta (18), disponiendo la base (17) de un alojamiento (19) sobre el que se asienta el chip (3), una abertura (21) en la parte posterior de la base (17) que permite que los sensores (13) salgan del chip, y unos alojamientos (22) sobre los que se insertan conectores ﬂuídicos (23) para conectar la microcámara and a cover (18), the base (17) having a housing (19) on which the chip (3) sits, an opening (21) on the back of the base (17) that allows the sensors (13) exit the chip, and some housings (22) on which ﬂ uid connectors (23) are inserted to connect the microcamera

(2) (2): a una pluralidad de tubos capilares (26) para la circulación de las células de cultivo y del medio de cultivo. to a plurality of capillary tubes (26) for the circulation of the culture cells and the culture medium.

18. 18.: Uso de una microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en el estudio y monitorización de cultivos biológicos, preferentemente que comprenden células tumorales. Use of a microcamera (2) according to any of claims 1-9 in the study and monitoring of biological cultures, preferably comprising tumor cells.

19. 19.: Uso de una microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en el estudio del efecto de fármacos sobre cultivos biológicos. Use of a microcamera (2) according to any of claims 1-9 in the study of the effect of drugs on biological cultures.

20. twenty.: Uso de una microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en el estudio del efecto de nanopartículas sobre cultivos biológicos. Use of a microcamera (2) according to any of claims 1-9 in the study of the effect of nanoparticles on biological cultures.

21. twenty-one.: Uso de un dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-16 en el estudio y monitorización de cultivos biológicos, preferentemente que comprenden células tumorales. Use of a device (1) according to any of claims 10-16 in the study and monitoring of biological cultures, preferably comprising tumor cells.

22. 22: Uso de un dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-16 en el estudio del efecto de fármacos sobre cultivos biológicos. Use of a device (1) according to any of claims 10-16 in the study of the effect of drugs on biological cultures.

23. 2. 3.: Uso de un dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-16 en el estudio del efecto de nanopartículas sobre cultivos biológicos. Use of a device (1) according to any of claims 10-16 in the study of the effect of nanoparticles on biological cultures.

24. 24.: Método de monitorización de un cultivo celular que comprende el uso de una microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde Method of monitoring a cell culture comprising the use of a microcamera (2) according to any of claims 1-9, wherein

said microcamera (2) is coupled to a nuclear magnetic resonance equipment.

25. 25.: Método según la reivindicación 24 donde, adicionalmente, se monitoriza la microcámara (2) por medio de, al menos, un equipo de microscopía. Method according to claim 24 wherein, additionally, the microcamera (2) is monitored by means of at least one microscopy equipment.

26. 26.: Método de monitorización de un cultivo celular que comprende el uso de un dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-16, donde Method of monitoring a cell culture comprising the use of a device (1) according to any of claims 10-16, wherein

said device (1) is coupled to a nuclear magnetic resonance equipment, adapting to the monitoring magnet system of said nuclear magnetic resonance equipment.

27. A method according to claim 26 wherein, in addition, the device (1) is monitored by means of at least one microscopy equipment.

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Application no .: 201030382

SPAIN

Date of submission of the application: 03/16/2010

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RELEVANT DOCUMENTS

Categoría Category: Documentos citados Reivindicaciones afectadas Documents cited Claims Affected

A TO: WO 0241021 A1 (METABOLIC EXPLORER) 23.05.2002, 1-27 WO 0241021 A1 (METABOLIC EXPLORER) 23.05.2002, 1-27

resumen; figuras 1-7; reivindicaciones 1-17. summary; Figures 1-7; claims 1-17.

A TO: EP 1500944 A1 (BRADAMANTE S) 26.01.2005, resumen; 1-27 EP 1500944 A1 (BRADAMANTE S) 26.01.2005, summary; 1-27

figuras 1-4; reivindicaciones 1-9. Figures 1-4; claims 1-9.

A TO: US 5313162 (DE GRAAF et al.) 17.05.1994, resumen; 1-27 US 5313162 (DE GRAAF et al.) 05.17.1994, summary; 1-27

figuras 1-5. Figures 1-5.

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the date of priority submission of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº: This report has been prepared • for all claims • for claims no:

Fecha de realización del informe 26.07.2011 Date of realization of the report 26.07.2011: Examinador M. García Grávalos Página 1/4 Examiner M. García Grávalos Page 1/4

REPORT OF THE STATE OF THE TECHNIQUE

Application number: 201030382

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G01R, C12M

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WRITTEN OPINION

Application number: 201030382

Date of Completion of Written Opinion: 07.27.2011

Statement

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986): Reivindicaciones Reivindicaciones 1-27 SI NO Claims Claims 1-27 IF NOT

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Inventive activity (Art. 8.1 LP11 / 1986): Reivindicaciones Reivindicaciones 1-27 SI NO Claims Claims 1-27 IF NOT

The application is considered to comply with the industrial application requirement. This requirement was evaluated during the formal and technical examination phase of the application (Article 31.2 Law 11/1986).

Opinion Base.-

This opinion has been made on the basis of the patent application as published.

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WRITTEN OPINION

Application number: 201030382

1. Documents considered.-

The documents belonging to the state of the art taken into consideration for the realization of this opinion are listed below.

Documento Document: Número Publicación o Identificación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date

D01 D01: WO 0241021 A1 23.05.2002 WO 0241021 A1 05/23/2002

D02 D02: EP 1500944 A1 26.01.2005 EP 1500944 A1 01/26/2005

D03 D03: US 5313162 17.05.1994 US 5313162 05/17/1994

2. Statement motivated according to articles 29.6 and 29.7 of the Regulations for the execution of Law 11/1986, of March 20, on Patents on novelty and inventive activity; quotes and explanations in support of this statement

The present invention discloses a cell culture microcamera, housed inside a flat chip, which contains a series of channels for the entry and exit of cells and the culture medium; as well as sensor input for control of physical properties; It is NMR monitored (claims 1-9). It also refers to a device for cell culture that includes, together with the claimed chamber, a flat printed solenoid and an encapsulated fixing system for coupling the chamber to the solenoid; a tight connection between the microcamera and capillary connectors for circulation of the cells and the culture medium; It is also monitored by NMR (claims 10-17). It also includes the use of the microcamera and the device for the study and monitoring of biological cultures, as well as the effect produced by drugs and / or nanoparticles on them (claims 18-27).

Document D01 discloses a device for metabolite analysis, by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), in a cell culture medium. It is formed by a set of tubular ducts, arranged in an NMR analysis equipment, which have an inlet and an outlet part, adapted to be connected to a reactor that contains the culture medium; it consists of a helical section, where the nuclei of the cells of the culture medium are magnetized, and another straight section of double direction in the course of which the excitation of the nuclei is carried out and its NMR spectrum is recorded (see summary; figures; 1-7; claims 1-17).

Document D02 discloses a bioreactor for NMR spectroscopy, formed by a container for cell culture and inlet and outlet ducts of the culture medium. The first conduit is connected to a spiral-shaped device, so that when the medium flows from one channel to another, it causes a hydrostatic propulsion and hydrodynamic force that produce a simulated condition of gravity reduction in the container with the cell culture ( see summary; figures 1-4; claims 1-9).

Document D03 discloses a device for cell culture formed by the combination of a fermenter and a tube for measuring NMR spectroscopy of a continuous flow cell suspension. The tube has a capacity of 3 to 20 ml in the measuring area of the magnet and the fermenter is a premagnetization reservoir whose largest section has a capacity of 100 ml. It is provided with a continuous flow circuit of 5 to 250 ml / s (see summary; Figures 1-5).

1. NEW AND INVENTIVE ACTIVITY ((Art. 6.1 and 8.1) LP 11/1986)

The technical object of the invention is a microcamera for cell culture, encapsulated and housed inside a chip, and a cell culture device, both monitored by NMR and other imaging techniques.

1.1. CLAIMS 1-27

Documents D01-D03, anticipate devices that include microcameras or bioreactors, for biological studies, coupled to NMR equipment. However, the characteristics of the camera and the device claimed in the present application do not coincide with those of these documents, nor would they be obvious to an expert in the field, considering these documents individually or together.

Consequently, claims 1-27 meet the requirement of novelty and inventive activity (Art. 6.1 and 8.1) LP 11/1986)

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