ES2363901A1 - Nanopartículas metálicas funcionalizadas que comprenden un sistema sensible a variaciones de ph y temperatura capaces de formar nano-topografías lineares en 2-d y estructuras globulares submicro-métricas. - Google Patents

Abstract

Nanopartículas metálicas funcionalizadas que comprenden un sistema sensible a variaciones de pH y temperatura capaces de formar nano-topografías lineares en 2-D y estructuras globulares submicro-métricas.La invención se refiere a la inmovilización de fragmentos moleculares con sensibilidad específica a temperatura y pH sobre la superficie de la nanopartícula metálica. Las nanopartículas también pueden ser utilizadas: como plantillas para la creación controlada de topografías lineales de metales nanométricos en dos dimensiones (nanohileras) para aplicaciones tecnológicas como la fabricación de nano-conectores y nano-conductores; como plantillas para la creación controlada de topografías que muestran patrones geométricos recíprocos y distancias inter-partícula análogas mayoritariamente dentro del rango comprendido entre 10 y 40 nm; y como unidades discretas de transporte y vehiculización de metales nanométricos mediante la formación de estructuras globulares de escala micro y submicro-métrica para la creación de nano y micro dispositivos inteligentes en aplicaciones tecnológicas, biotecnológicas y biomédicas.

Description

Nanopartículas metálicas funcionalizadas que comprenden un sistema sensible a variaciones de PH y temperatura capaces de formar nano-topografías lineares en 2-D y estructuras globulares submicro-métricas.

La presente invención se refiere a la inmovilización de fragmentos moleculares con sensibilidad específica a temperatura y pH sobre la superficie de la nanopartícula metálica.

La invención proporciona también métodos para la producción de nanopartículas funcionalizadas (por ejemplo, estabilizadas). Además, la presente invención puede proporcionar por ejemplo, monocapas de polímero derivado de la elastina auto-estructuradas (SAM's), donde la monocapa se forma sobre una nanopartícula metálica.

Las nanopartículas pueden ser utilizadas como sensores multirespuesta para aplicaciones biomédicas ya que son capaces de detectar variaciones de pH y temperatura dentro de los parámetros utilizados en análisis y estudios biológicos.

Las nanopartículas también pueden ser utilizadas como plantillas para la creación controlada de topografías lineales de metales nanométricos en dos dimensiones (nano-hileras) para aplicaciones tecnológicas como la fabricación de nano-conectores y nano-conductores.

Las nanopartículas también pueden ser utilizadas como plantillas para la creación controlada de topografías que muestran patrones geométricos recíprocos y distancias inter-partícula análogas mayoritariamente dentro del rango comprendido entre 10 y 40 nm.

Las nanopartículas pueden ser utilizadas como unidades discretas de transporte y vehiculización de metales nanométricos mediante la formación de estructuras globulares de escala micro y submicro-métrica para la creación de nano y micro dispositivos inteligentes en aplicaciones tecnológicas, biotecnológicas y biomédicas.

El termino "metálico" queda referido en este contexto como derivados de la síntesis de metales, óxidos metálicos y otras composiciones que contengan uno o varios metales.

El término "híbrido" queda referido en este contexto como la asociación físico-química de un material o varios de origen inorgánico con un material o varios de origen orgánico. La mencionada asociación debe de ser conceptualizada como una unidad discreta que muestra una fusión sinérgica de las propiedades de los bloques constituyentes.

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Antecedentes de la invención

El número creciente de artículos de investigación que describen el diseño y la síntesis de nuevas estructuras auto-ensambladas basadas en la combinación de nanopartículas metálicas y biomoléculas refleja la importancia de esta asociación sinérgica de compuesto inorgánico-orgánico en relación a la producción de nuevos materiales híbridos interesantes para aplicaciones biomédicas, biotecnológicas y tecnológicas que comprende desde el desarrollo de sondas inteligentes para la vehiculización y descarga de fármacos hasta la generación de dispositivos metálicos conductores que muestras dimensiones nanométricas [1-3].

El desarrollo de los primeros protocolos de síntesis de nanopartículas de oro ha permitido el estudio de la interacción metal-ligando necesario para estabilizar el metal nanoscópico [4-6] y segundo para amplificar las propiedades físico-químicas del agregado en vista a aplicaciones prácticas [1, 3, 7]. En particular, el estudio de la interacción entre polímeros derivados de la elastina (PDE) y nanopartículas de oro ha dado lugar a la creación de sensores y detectores [8]. Los PDE son biocompatibles y biodegradables. Esto supone una ventaja a la hora de su utilización en aplicaciones biomédicas. De manera característica, los PDE están basados en sutiles modificaciones de la estructura original de la proteína elastina que exhiben los mamíferos superiores [9]. Afortunadamente, el desarrollo de la ingeniería genética ha permitido la obtención de PDE como polímeros recombinantes [10]. Los PDE de naturaleza recombinante, también llamados "recombinameros" suponen un gran avance respecto a la utilización de protocolos de síntesis tradicionales que generalmente son tediosos y complejos [10]. De manera destacada cabe mencionar que la producción de PDE mediante técnicas de ingeniería genética permite el control absoluto de parámetros como el peso molecular, estructura polimérica y conectividad de los PDE producidos [11]. Además, los PDE exhiben un comportamiento reversible de agregación-expansión de su estructura molecular en función de la variación de propiedades del medio como temperatura, pH, concentración iónica, entre otras [9, 12]. Los PDE muestran en su fase condensada uno de los factores más relevantes de su naturaleza inteligente: auto-ensamblaje en función de múltiples estímulos. Dicha característica o propiedad has sido ya explotada para el desarrollo y creación de superficies inteligentes [13]. Los PDE son además materiales que muestran una excelente biocompatibilidad tanto en disolución como entrecruzados en forma de hidrogeles [14]. Recientemente han sido publicadas aplicaciones de PDE como vehículos de transporte y liberación controlada de fármacos [15]. De manera paralela, la conceptualización de plataformas de PDE han sido hasta la fecha, una contribución sustanciosa para el avance de la medicina regenerativa a nivel de control del crecimiento y proliferación celular para la creación y reparación de tejidos [16].

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Los autores de la presente publicación también han presentado el comportamiento inteligente de PDE funcionalizados con grupos fotocrómicos. La modificación de PDE con moléculas fotosensibles ha dado lugar a materiales sensibles a múltiples estímulos incluyendo sensibilidad a radiación UV-visible [17].

En este marco cabe destacar que la producción de materiales híbridos basados en la combinación de PDE con nanopartículas metálicas esta todavía inexplorado. No obstante, ya ha sido demostrada la habilidad específica de aminoácidos naturales para la producción de nanocadenas de oro [18]. Hoy en día, la producción de topografías metálicas a escala nanométrica reviste gran importancia en el desarrollo de nuevas aplicaciones electro-ópticas avanzadas [3]. Además, la utilización del reconocimiento biomolecular ya ha permitido el control del auto-ensamblamiento de nanopartículas inorgánicas así como el desarrollo de nuevos materiales y dispositivos nanotecnológicos [19]. De manera destacada cabe mencionar que la presencia de nanopartículas de oro puede condicionar el plegamiento de proteínas. Por lo tanto, la asociación nanopartícula-proteína muestra connotaciones de carácter terapéutico ya que pueden ser aplicadas en el estudio de patologías provocadas por el plegamiento incorrecto de proteínas [20]. En este sentido, ya han sido publicadas la síntesis de nanopartículas de oro y de plata mediadas por proteínas modelo [21, 22]. Actualmente, la síntesis de nanopartículas de oro mediada o en presencia de proteínas está prácticamente inexplorada, a pesar de que dicha síntesis reviste grandes ventajas con respecto a técnicas y protocolos tradicionales. Los autores de la presente invención ya han desarrollado algunos trabajos relativos al estudio de la interfase oro-proteína y que han dado lugar al desarrollo una patente en éste campo (P-200900418).

Por otro lado, la preparación de materiales que muestran geometrías globulares de tamaño nanométrico en la fase condensada (tanto micelas como vesículas) son también interesantes para el desarrollo de nano-vehículos de transporte y descarga en aplicaciones biomédicas. Actualmente existe un número creciente de materiales poliméricos tanto recombinantes [15], como sintéticos (copolímeros en bloque) [23-25] que presentan una alternativa muy ventajosa con respecto al tradicional uso de liposomas [26] en la conceptualización de nuevas plataformas de transporte biocompatibles que exhiben dimensiones por debajo de la escala submicro-métrica.

Es este sentido, la obtención de materiales capaces de actuar como nano-contenedores presenta una gran perspectiva en el desarrollo de terapias basadas en la transferencia de: material genético, fármacos o nano-dispositivos; así como la creación de membranas artificiales, nano-reactores y biosensores [15, 27-30].

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Compendio de la invención

La presente invención proporciona la primera preparación con éxito de nanopartículas funcionalizadas (por ejemplo estabilizadas) con PDE sensibles a pH y a temperatura. Además, las nanopartículas de oro funcionalizadas fueron obtenidas en una única etapa y en un medio homogéneo de un único disolvente. Simultáneo a la formación de las nanopartículas ha sido su funcionalización con materiales que muestran sensibilidad a la temperatura y el pH del medio.

El modo de realización preferido utiliza un PDE de origen recombinante que se une a la nanopartículas de oro a través de un enlace covalente azufre-oro entre el PDE y la superficie de la nanopartícula. Las nanopartículas funcionalizadas exhiben respuestas cuantificables físicamente expresadas como resultado de cambios en la estructura de sus componentes moleculares que inducen modificaciones de la estructura de la fase condensada en función a variaciones de temperatura y pH.

La Figura 1 muestra la secuencia del PDE modificado de origen recombinante utilizado en el modo preterido de realización para funcionalizar las nanopartículas. Su estructura incluye la siguiente secuencia aminoacídica: C-[(VPGVG)_{2}(VPGEG)(VPGVG)_{2}]_{15}.

Donde las letras C, V, P, G, E corresponde con los aminoácidos cisteína, valina, prolina, glicina y ácido glutámico, respectivamente.

La Figura 2 muestra una micrografía de transmisión de electrones (TEM) de nanopartículas de oro funcionalizadas con el PDE (oro-PDE) utilizado en el modo preferido de realización. La barra de escala representa nanómetros.

La Figura 3 muestra el espectro de infrarrojos (FT-IR) de los materiales que han sido sintetizados en el modo de realización preferido y son los siguientes: PDE, nanopartículas de oro funcionalizadas con PDE (oro-PDE).

La Figura 4 muestra la energía de los orbitales S2p (donde S corresponde con el átomo azufre y 2p con los orbitales 2p) obtenida mediante XPS (X-ray Photoelectron Spectroscopy) medida para el PDE utilizado en el modo preferido de realización y para el híbrido oro-PDE.

La Figura 5 muestra espectrogramas de absorción de radiación UV-vis realizado en el rango comprendido entre 250 y 800 nm y llevado a cabo para disoluciones a pH ácido (pH = 3) del híbrido (oro-PDE) en función de la temperatura. La concentración de la disolución oro-PDE corresponde con 0.39 mg/mL.

La Figura 6 muestra una repetición de ciclos de calentamiento y de enfriamiento entre 25ºC y 35ºC llevado a cabo para las nanopartículas funcionalizadas oro-PDE en los que se ha medido la absorción de radiación UV-vis a 505 nm en función de la temperatura y el número ciclos de calentamiento-enfriamiento. La concentración de la disolución oro-PDE corresponde con 0.22 mg/mL.

La Figura 7 muestra la absorbancia del híbrido oro-PDE en función del pH del medio. La concentración de la disolución oro-PDE corresponde con 0.39 mg/mL.

La Figura 8 muestra una repetición de ciclos entre pH ácido (pH = 3) y pH básico (pH = 10) llevado a cabo para las nanopartículas funcionalizadas oro-PDE en los que se ha medido la absorción de radiación UV-vis a 500 nm en función del pH del medio y el número ciclos a temperatura ambiente. La concentración de la disolución oro-PDE corresponde con 0.39 mg/mL.

La Figura 9 muestra dos electro-micrografías (obtenidas mediante la técnica Cryo-TEM) de nanopartículas de oro funcionalizadas con el PDE utilizado en el modo preferido de realización del híbrido oro-PDE. Las micrografías fueron obtenidas de una disolución a pH = 3. En las micrografías se observa que la distancia entre las nanopartículas funcionalizadas es dependiente de la temperatura. La electro-micrografía de la izquierda (a) fue tomada a 15ºC y la de la derecha (b) a 35ºC. Comparando la densidad y la distancia entre partículas que aparecen en ambas micrografías es posible razonar que las nanopartículas funcionarizadas oro-PDE muestran un comportamiento de agregación y separación en función de la temperatura a pH ácido (pH = 4). La barra de escala representa nanómetros.

La Figura 10 muestra una micrografía de transmisión de electrones tomada en áreas de baja densidad de nanopartículas donde puede distinguirse la presencia de una asociación lineal de nanopartículas de oro que muestran distancias inter-partícula correlacionadas. La muestra fue preparada mediante el protocolo de dip-coating. La barra de escala representa nanómetros.

La Figura 11 muestra un histograma correspondiente a las distancias inter-partícula calculadas para la asociación lineal mostrada en la Figura 10 y que corresponde a la formación de nano-hileras de nanopartículas compuestas por oro-PDE y que comprenden la formación de estructuras lineales con distancias inter-partícula mayoritariamente en el rango comprendido entre 10 y 40 nm.

La Figura 12 muestra una micrografía mostrada previamente en la Figura 9 y tomada mediante la técnica Cryo-TEM donde se reflejan mediante el trazo de contornos las posibles asociaciones lineales diferenciadas que corresponden con la formación de estructuras lineales de oro-PDE que muestran distancias inter-partícula reciprocas y que pueden ser diferenciadas como nano-hileras de material híbrido oro-PDE. La barra de escala representa nanómetros.

La Figura 13 muestra un histograma correspondiente a las distancias inter-partícula calculadas para las asociaciones lineales destacadas en la Figura 11 y que corresponden a la formación de nano-hileras de nanopartículas compuestas por oro-PDE y que comprenden la formación de estructuras lineales con distancias inter-partícula mayoritariamente en el rango comprendido entre 10 y 40 nm.

La Figura 14 muestra una micrografía del experimento de control donde puede observarse la formación de asociaciones lineales y equidistantes de nanopartículas de oro sintetizadas mediante el método de Turkevich que muestran distancias inter-partícula dentro del rango comprendido entre 10 y 40 nm. La barra de escala representa nanómetros.

La Figura 15 muestra un histograma correspondiente a las distancias inter-partícula calculadas para las distancias observadas en la Figura 14 y que corresponden a la formación de distribuciones lineales y equidistantes de nanopartículas de oro que comprenden la formación de estructuras lineales con distancias inter-partícula mayoritariamente en el rango comprendido entre 10 y 40 nm.

La Figura 16 muestra una micrografía del híbrido oro-PDE liofilizado donde pueden observarse la presencia de estructuras globulares de tamaño submicro-métrico. La barra de escala representa micrómetros.

La Figura 17 muestra una micrografía del híbrido oro-PDE liofilizado donde pueden observarse la presencia de tres estructuras globulares de diferentes tamaños y sección transversal. La barra de escala representa nanómetros.

La Figura 18 muestra una micrografía del híbrido oro-PDE liofilizado donde puede observarse la ruptura de la superficie externa de la estructura globular y que permite que el contenido interior se desplace hacia el exterior. La barra de escala representa nanómetros.

La Figura 19 muestra una micrografía del híbrido oro-PDE liofilizado donde puede observarse el contenido de una estructura globular. Dicho contenido se asemeja a una nanocadena compuesta de oro y PDE donde las nanopartículas de oro están unidas entre sí mediante PDE que tiene una estructura condensada oblonga y bien definida. La barra de escala representa nanómetros.

La Figura 20 muestra una micrografía del híbrido oro-PDE liofilizado donde pueden observarse la presencia de una estructuras globular híbrida de dimensiones submicro-métricas. La barra de escala representa nanómetros.

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Descripción detallada del modo de realización preferido de la invención

La síntesis de nanopartículas funcionalizadas de oro se llevó a cabo basándose en el método de Brust y col. modificado por los autores de la presente invención [5]. La síntesis del PDE utilizado en el modo de realización preferido ya ha sido descrita en la literatura por los autores de la presente invención [12]. La estructura del PDE utilizado en el modo de realización preferido de la invención está incluido en la Figura 1 y corresponde con la siguiente secuencia aminoacídica C-[(VPGVG)_{2}(VPGEG)(VPGVG)_{2}]_{15} donde las letras C, V, P, G, y E corresponden con los aminoácidos cisteína, valina, prolina, glicina y ácido glutámico respectivamente. Brevemente, se disolvió el reductor NaBFL en 2 mL de agua ultrapura (9.7 mg, 2.55 x 10^{-4} mol) y se añadió a una disolución acuosa de PDE (53.0 mg, 1.66 x 10^{-6} mol en 1 ml de H_{2}O). La disolución resultante fue agitada a 4ºC unos minutos. Posteriormente, se añadió 2 mL de una disolución acuosa del complejo de oro HAuCl_{4} (63.0 mg. 1.6 x 10^{-4} mol. en 6 mL) manteniendo la agitación. Los reactivos son solubles en medio acuoso, luego no es necesario el uso de co-disolventes ni de agentes de transferencia de fase para que la reacción de reducción y de crecimiento de las nanopartículas de oro tenga lugar. La disolución roja resultante fue agitada durante 2 horas a 4ºC. Posteriormente, la mezcla de reacción fue filtrada (tamaño de poro del filtro 0.22 \mum). El híbrido oro-PDE obtenido fue separado de subproductos y reactivos en un proceso de purificación basado en diálisis frente a agua ultrapura. La diálisis de las nanopartículas funcionalizadas oro-PDE fue llevada a cabo durante 48 horas (tripas de diálisis 12-14000 Dalton). Las nanopartículas funcionalizadas oro-PDE fueron obtenidas como un sólido de aspecto algodonoso de color rojo oscuro después de la liofilización de la disolución dializada.

El contenido en oro metálico presente en las nanopartículas funcionalizadas oro-PDE fue estimado a través de técnicas espectroscópicas (ICP-AES). El contenido en Au^{()} encontrado fue de 13.8% en peso.

Las micrografías electrónicas de transmisión (TEM) de las nanopartículas funcionalizadas oro-PDE se corresponden con las publicadas por otros investigadores para otros híbridos metal-compuesto orgánico en que se muestran pequeñas partículas no agregadas de tamaño comprendido entre 1 nm y 10 nm (Figura 2). Las partículas mostradas en la Figura 2 sugieren que el PDE actúa como monocapa estabilizante que impide la formación de agregados de mayor tamaño. El análisis de espectroscopia infrarroja (FT-IR) del híbrido oro-PDE muestra las bandas de absorción características del material de partida PDE (Figura 3). Un sistema híbrido inorgánico-orgánico sería particularmente ventajoso al ser soluble en medio acuoso y contener las propiedades originales del material modificado de elastina para aplicaciones biomédicas. Además, el modo de realización preferido utiliza un PDE de origen recombinante que se une a la nanopartículas de oro a través de un enlace covalente azufre-oro entre el PDE y la superficie de la nanopartícula (Figura 4). La energía de los orbitales enlazantes fue medida mediante la técnica XPS (X-ray Photo-electron Spectroscopy) y los resultados han sido mostrados en la Figura 4.

El espectro de absorción en el UV-vis (Figura 5) del híbrido oro-PDE muestra una banda de absorción con \lambda_{max} = 500 nm. Esta banda ha sido atribuida a la resonancia de plasmones superficiales (SPR) de partículas de oro de tamaño nanométrico [7].

Por otro lado el híbrido oro-PDE exhibe propiedades espectroscópicas que pueden ser moduladas en función de la temperatura y el pH del medio (Figura 5). A pH ácido (pH = 3) las nanopartículas funcionalizadas muestran una amplificación de la absorción de radiación UV-vis en función de la temperatura (Figura 5). Por lo tanto, el híbrido oro-PDE puede ser utilizado como un sensor de temperatura del medio mediante la relación directa de la absorbancia del híbrido con la temperatura del medio. Además el híbrido oro-PDE puede ser sometido de manera reversible a ciclos de calentamiento y enfriamiento como se muestra en la Figura 6. La amplificación de la absorbancia con respecto a la temperatura no se observa en el híbrido oro-PDE a pH neutro ni a pH básico como puede observarse en la Figura 7. Debido a esta propiedad, el híbrido oro-PDE muestra una absorbancia que puede ser modulada en función del pH del medio como se muestra en la Figura 8. El híbrido oro-PDE ha sido sometido a variaciones de pH del medio de una manera reversible donde se ha demostrado la amplificación de la radiación absorbida a pH ácido (pH = 3) y una disminución de la absorbancia a pH básico (pH = 10). Por lo tanto, el híbrido oro-PDE puede ser utilizado como un sensor de pH en medio acuoso incluyendo los medios biológicos. Los autores de la presente investigación ya han explicado la influencia del pH y de la temperatura en las propiedades ópticas del PDE [12].

El híbrido oro-PDE fue analizado mediante microscopía electrónica de transmisión. Las muestras fueron preparadas mediante la deposición de una gota de disolución de estudio en una rejilla de microscopía electrónica. Los análisis se llevaron a cabo 24 horas después (como mínimo) para asegurar la completa evaporación de los compuestos volátiles (como el disolvente). Las micrografías electrónicas de transmisión obtenidas mediante la técnica Cryo-TEM del híbrido oro-PDE se corresponden con las publicadas por otros investigadores para otros híbridos metal-compuesto orgánico en que se muestran pequeñas partículas no agregadas de tamaño comprendido entre 1 nm y 10 nm (Figura 9). La respuesta a las variaciones térmicas del material derivado de elastina inmovilizado en la superficie de las nanopartículas de oro no sufrió modificaciones notables. De este modo, mediante la observación de micrografías electrónicas de transmisión llevadas a cabo a dos temperaturas distintas, fue posible observar directamente la agregación y separación de las nanopartículas en función de la temperatura. En las micrografías mostradas en la Figura 9 se observa que la distancia entre las nanopartículas funcionalizadas es dependiente de la temperatura. La micrografía de la izquierda ha sido tomada a 15ºC y la de la derecha a 35ºC. Comparando la densidad y la distancia entre partículas que aparecen en ambas micrografías es posible razonar que las nanopartículas funcionarizadas oro-PDE muestran un comportamiento de agregación y separación en función de la temperatura (en disolución a pH = 4). A 15ºC las nanopartículas funcionalizadas están separadas (distancia entre las nanopartículas es de varios ordenes de magnitud con respecto al diámetro de las nanopartículas) y la densidad de partículas es relativamente baja en la zona de estudio. A 35ºC se produce una agregación de las nanopartículas que conlleva un aumento de la densidad de partículas y una disminución general de la distancia entre partículas vecinas, donde en algunas áreas de la zona de estudio la distancia entre partículas adyacentes es del orden del diámetro de las nanopartículas. Esto supone una demostración directa del mecanismo de agregación-expansión mostrado por las nanopartículas funcionarizadas (oro-PDE) en función de la temperatura. Las partículas mostradas en la Figura 9 sugieren que el material de elastina actúa como monocapa estabilizante que impide la formación de agregados insolubles.

De manera destacada y particular para la asociación híbrida oro-PDE, fueron detectadas asociaciones lineares de nanopartículas de oro en zonas de baja densidad de nanopartículas. Por ejemplo, en la micrografía mostrada en la Figura 10 pude observarse una nano-hilera de nanopartículas de oro. Dicha topografía lineal de dos dimensiones (2-d) es característica del híbrido oro-PDE. Desafortunadamente las nano-topografías lineales solo pueden ser apreciadas con claridad en zonas de baja densidad de nanopartículas. Esto se debe a que en zonas de alta densidad de nanopartículas se produce el apilamiento y el solapamiento de bloques partícula-polímero de oro-PDE. Las nano-hileras observadas corresponden con una sucesión de nanopartículas de oro que muestran distancias inter-partícula correlacionadas. En la Figura 11 hemos mostrado el histograma correspondiente a la medida de las distancias inter-partícula. En resumen, hemos detectado que mas del 85% de las distancias inter-partícula medidas están dentro del rango comprendido entre 10 y 40 nm. De manera análoga también se han podido diferenciar topografías lineales 2d en la micrografía de la Figura 9 tomada a 15ºC. En este caso, la visión de disposiciones lineales es mas compleja debido a que la zona fotografiada corresponde con una zona de densidad media-alta de nanopartículas. Por claridad, en la Figura 12 hemos diferenciado las posibles asociaciones lineales análogas a aquellas descritas para la Figura 10. Además, los datos estadísticos de distancias inter-partícula medidas para las asociaciones propuestas en la Figura 10 se encuentran en el mismo rango, es decir, mas del 90% de las distancias inter-partícula medidas se encuentran dentro del intervalo comprendido entre 10 y 40 nm. Los datos estadísticos correspondientes a la Figura 12 se muestran en la Figura 13. Este comportamiento del híbrido oro-PDE puede estar asociado al comportamiento intrínseco del PDE utilizado en el modo preferido de realización. Varias publicaciones ya han reflejado la capacidad de los PDE para formar nano-estructuras filamentosas compuestas de filamentos enrollados de espirales \beta de unos 5 nm de anchura [31, 32]. De esta manera es posible asociar las topografías lineales observadas con la capacidad del PDE utilizado para formar nano-fibras que poseen una estructura lineal de tipo fibrilar. De esta manera nos gustaría destacar la capacidad intrínseca del híbrido oro-PDE para disponerse en forma de nano-hileras de dimensiones nanométricas que presentan distancias inter-partícula correlacionadas y dentro del rango comprendido entre 10 y 40 nm preferiblemente. Este fenómeno en particular reviste gran importancia respecto a la aplicación de híbridos oro-PDE en la producción de nano-materiales conductores así como la preparación de nano-conectores en aplicaciones tanto ópticas como electrónicas [3]. Para comprobar que la disposición del híbrido oro-PDE en nano-topografías lineales 2-d no es un artefacto o un fenómeno aislado diseñamos un experimento de control. El experimento de control se ha basado en la producción de nanopartículas de oro estabilizadas con citrato. La síntesis fue llevada a cabo siguiendo un protocolo descrito ya por Turkevich en 1963 [6]. El tamaño de las nanopartículas de oro del experimento de control estaba dentro del rango comprendido entre 10 y 15 nm. El experimento de control consiste en determinar si el PDE utilizado en el modo preferido de reacción es la plataforma necesaria para la producción de nano-topografías lineales 2-d. Para ello, el experimento de control se llevará a cabo mezclando las nanopartículas sintetizadas de manera independiente (mediante el protocolo de Turkevich) con el PDE utilizado en el modo preferido de realización. De esta manera, si el PDE induce la formación de topografías lineales 2-d con nanopartículas de oro sintetizadas "in situ", entonces también debería de promover la formación de topografías análogas en nanopartículas sintetizadas por otros métodos.

El experimento de control se llevó a cabo de la siguiente manera. Brevemente, a una disolución coloidal de nanopartículas sintetizadas por el método de Turkevieh (1 mL) se le añadió una disolución acuosa de PDE (2 mg en 0.1 mL). La mezcla fue agitada durante dos horas. Posteriormente, se tomo una alícuota que fue dispuesta en una rejilla de microscopía electrónica. La muestra fue analizada una vez que los compuestos volátiles (disolvente) se evaporaron. Una micrografía representativa del experimento de control muestra que las nanopartículas se disponen en asociaciones lineales con distancias inter-partícula correlacionadas (Figura 14) y en el mismo rango observado para el híbrido oro-PDE es decir entre 10 y 40 nm (Figura 15). Ya hemos demostrado que el híbrido oro-PDE exhibe la capacidad de formar nano-topografías lineales 2-d en muestras sometidas a evaporación lenta y posteriormente analizadas por microscopía de transmisión de electrones. También hemos demostrado que las mencionadas topografías son susceptibles a la concentración y por lo tanto, son mas destacadas y diferenciadas en zonas de baja densidad de oro- PDE debido a que en zonas de alta densidad se producen solapamientos y apilamientos de bloques partícula-PDE. Por lo tanto, las nanopartículas objeto de la presente invención pueden ser utilizadas como plantillas para la creación controlada de topografías lineales y/o equidistantes de metales nanométricos para aplicaciones tecnológicas como la fabricación de nano-conectores y nano-conductores. Además, las nanopartículas también pueden ser utilizadas como plantillas para la creación controlada de topografías que muestran patrones geométricos lineales recíprocos y distancias inter-partícula mayoritariamente dentro del rango comprendido entre 10 y 40 nm.

Por otro lado, también queremos destacar la capacidad del híbrido oro-PDE para auto-ensamblarse en forma de estructuras globulares de dimensiones submicro-métricas cuando el híbrido es sometido a liofilización. Este fenómeno reviste gran interés como un método de preparación y dosificación de híbrido oro-PDE en porciones discretas y en tamaños submicro-métricos. Una micrografía representativa de las estructuras globulares ha sido mostrada en la Figura 16. Las estructuras globulares observadas comprenden un sistema híbrido compuesto de oro-PDE con tamaños inferiores a los micrómetros pudiendo llegar incluso a las decenas de nanómetros en sección transversal como hemos mostrado en la Figura 17. La composición de las estructuras globulares producidas por la liofilización del híbrido oro-PDE corresponde con agregados convexos de híbrido oro-PDE los cuales contienen distribuciones discretas de metal nanoscópico y PDE como puede observarse en la Figura 18. Este fenómeno reviste gran interés para la dosificación del híbrido oro-PDE en porciones discretas de tamaño determinado. De manera alternativa, la obtención de distribuciones discretas de estructuras globulares compuestas de oro-PDE permite la dosificación homogénea y en seco (sin necesidad de disolventes) del híbrido oro-PDE como por ejemplo formando parte de la carga de aerosoles y nebulizadores. Esta capacidad de encapsulamiento mostrado por el híbrido oro-PDE queda latente en la micrografía mostrada en la Figura 18 donde puede observarse que las estructuras globulares no están huecas sino rellenas de material constituyente, lo cual incrementa su estabilidad mecánica con respecto a estructuras globulares huecas (en ausencia de disolvente). Por lo tanto, queda de manifiesto la capacidad intrínseca mostrada por el híbrido oro-PDE para formar estructuras globulares que contienen material híbrido que es capaz de auto-estructurarse. En la Figura 19 también se observa como el contenido de una de las estructuras globulares se corresponde con una nano-hilera de híbrido oro-PDE. En este caso, la nano-sucesión de partículas de oro exhibe fibras constituidas por PDE y nanopartículas metálicas (oro) que se asemejan a un collar de cuentas aunque no muestra una geometría lineal debido a que durante el proceso de liofilización se produce la total retirada del disolvente (agua) y como consecuencia se produce el plegamiento de las cadenas poliméricas que constituyen el híbrido oro-PDE de manera mas acuciada con respecto a las disposiciones lineales en 2-d observadas en las muestras analizadas mediante evaporación lenta y dip-coating (Figura 10). Por lo tanto, la deshidratación total inducida en el proceso de liofilización conlleva a un repliegue del material oro-PDE que se estabiliza mediante la minimización de la tensión superficial de los agregados y la formación de estructuras globulares de tamaños submicro-métricos como puede observarse en la Figura 20. Entonces, las nanopartículas oro-PDE pueden ser utilizadas como unidades discretas de transporte y vehiculización de metales nanométricos mediante la formación de estructuras globulares de escala micro y submicro-métrica para la creación de nano y micro dispositivos inteligentes en aplicaciones tecnológicas, biotecnológicas y biomédicas [15, 27-30].

El modo de preparación preferido contempla la liofilización de disoluciones acuosas de oro-PDE de concentraciones entre 0.001% hasta 1%. La liofilización del híbrido oro-PDE puede ser llevada a cabo mediante una técnica de evaporación a alto vacío y a baja temperatura, en un proceso similar o relativo a la liofilización de materiales
orgánicos.

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Descripción de los modos de realización alternativos de la invención

Habiéndose descrito la invención con respecto a los modos de realización preferidos actualmente, la invención no queda limitada por ellos. Existen alternativas para los diversos elementos que constituyen el híbrido como se describe a continuación. Estas alternativas se pueden emplear individualmente o en consonancia con otras variantes.

1- Nanopartícula metálica

Las nanopartículas son generalmente partículas de tamaños nanoscópicos y que pueden mostrar geometrías variadas como octaedros, esferas, cilindros..etc. Los autores de la presente invención han obtenido nanopartículas de forma esferoidal. La forma puede cubrir todas las posibilidades indicadas para nanopartículas. Tal y como aquí se utiliza el término, por partícula se entiende las de un tamaño de 500 nm o inferior, preferiblemente entre 1 y 10 nm y mas preferiblemente entre 1 y 3 nm. Se puede utilizar una serie de materiales metálicos como parte inorgánica del híbrido. El material preferido en la presente invención es un metal, preferiblemente oro. De manera alternativa, el metal puede seleccionarse entre otros metales como por ejemplo plata, cobre, platino, cobalto, hierro entre todos los metales restantes de la tabla periódica. La presente invención no excluye la posible utilización de compuestos metálicos y aleaciones. Dos ejemplos de materiales que pueden estar formados de mezclas de metales y óxidos metálicos son el FePt y el Fe_{3}O_{4} respectivamente.

2- El PDE (polímero derivado de elastina)

La matriz polimérica que se une a la superficie derivada del núcleo de la nanopartícula es una característica importante del modo de realización preferido de la invención. Se prefiere una secuencia aminioacídica del tipo VPGXG donde V, P y G corresponden con los aminoácidos valina, prolina, glicina respectivamente y X corresponde con cualquier aminoácido.

En el modo preferido de realización de la invención se ha seleccionado por grupo X el aminoácido ácido glutámico porque puede formar enlaces covalentes (por ejemplo de tipo amida) con otros grupos reactivos por ejemplo con las aminas para dar lugar a amidas derivadas. Sin embargo, no hay que entender que se excluye del marco de la presente invención otros aminoácidos susceptibles de formar enlaces covalentes con grupos otros grupos químicos, como por ejemplo los aminoácidos lisina y ácido aspártico.

La secuencia aminoacídica expresada en el modo preferido de realización de la presente invención corresponde con la repetición de las secuencias pentapeptídicas (VPGVG) y (VPGXG). Sin embargo, tampoco se excluye del marco de la presente invención otras secuencias aminoacídicas pentapeptídicas ni de las combinaciones o repeticiones de las mismas que conlleve estructuras diferentes y pesos moleculares variados.

La matriz polimérica derivada de la elastina (PDE) se puede unir por otros medios a la superficie de la nanopartícula en lugar de hacerlo a través del enlace SH, como está expresado en el modo preferido de realización de la invención. No obstante, no se excluyen del marco de la presente invención otros modos covalentes de enlace entre el PDE con la superficie de la nanopartícula, como por ejemplo, a través de enlaces de puente disulfuro S-S.

El PDE se puede unir por otros medios a la superficie de la nanopartícula en lugar de hacerlo a través del aminoácido cisteína, como está expresado en el modo preferido de realización de la invención. No obstante, no se excluyen del marco de la presente invención otros aminoácidos susceptibles de formar enlaces covalentes con la superficie de la nanopartículas metálicas.

El número de grupos sulfhidrilo (SH) susceptibles de enlazar covalentemente a la superficie de la nanopartícula es uno por unidad de PDE, pero este número de grupos puede ser de orden superior. Por lo tanto, no se excluyen del marco de la presente invención otros PDE diferentes del utilizado en el modo preferido de realización que muestre uno o mas (por ejemplo, dos o tres) grupos SH susceptibles de enlazar covalentemente con la superficie de la nanopartícula.

El PDE se puede unir por otros medios a la superficie de la nanopartícula en lugar de hacerlo a través del aminoácido cisteína y de un enlace covalente, como está expresado en el modo preferido de realización de la invención. No obstante, no se excluyen del marco de la presente invención otros aminoácidos susceptibles de formar enlaces no covalentes con la superficie de la nanopartículas metálicas como pueden ser los enlaces de tipo electrostáticos que pueden formar los aminoácidos cargados positivamente o negativamente como por ejemplo la lisina o el ácido glutámico.

El PDE utilizado en el modo preferido de realización de la invención muestra el aminoácido cisteína esta en la posición terminal. Este aminoácido es el responsable de la quimisorción del PDE a la superficie de la nanopartícula. Pero este aminoácido puede estar en cualquier parte de la estructura del PDE. Luego, no se excluye del marco de la presente invención otras posiciones para el aminoácido cisteína (por ejemplo, en cualquier otro lugar que no sea el principio o el termino de la secuencia aminoacídica del PDE) dentro de la estructura del PDE.

La síntesis del PDE utilizado en el modo preferido de realización de la invención se ha llevado a cabo mediante técnicas recombinantes. Sin embargo, no se excluyen del marco de la presente invención la síntesis de PDE a través de técnicas de síntesis tradicionales.

Las propiedades inteligentes atribuidas al PDE corresponden con sensibilidad a temperatura y pH. Sin embargo, no se excluyen del marco de la presente invención otras propiedades que pueda mostrar el PDE y que no hayan sido consideradas dentro del modo preferido de realización de la invención como son por ejemplo la modificación del estado de agregación del PDE en función de la concentración de iones del medio.

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Claims (12)

1. Una nanopartícula funcionalizada que comprende:

un núcleo metálico, y

una monocapa de PDE unida químicamente al citado núcleo conteniendo la citada monocapa moléculas capaces de mostrar sensibilidad a variaciones de pH y temperatura.

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2. Una nanopartícula según la reivindicación 1, donde el núcleo comprende un metal o metales seleccionados entre plata, cobre, platino, cobalto, hierro.

3. Una nanopartícula según la reivindicación 1, donde el núcleo es oro.

4. Una nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el PDE muestra una secuencia aminoacídica del tipo VPGXG, donde X puede corresponder con cualquier aminoácido.

5. Una nanopartícula según las reivindicaciones precedentes donde el agente estabilizador de las nanopartículas corresponde con un PDE.

6. Una nanopartícula según la reivindicación 5, donde el PDE evita la agregación de las nanopartículas de forma irreversible durante su síntesis.

7. Una nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la monocapa se forma por auto-estructuración durante la formación del núcleo.

8. Una nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el núcleo tiene un tamaño de 500 nm o inferior, preferiblemente entre 1 y 10 nm y mas preferiblemente entre 1 y 3 nm.

9. Un método para producir una nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores hasta la presente, incluye las siguientes etapas:

a) Disolver el agente reductor en agua

b) Agitar

c) Añadir a una disolución acuosa de PDE

d) Agitar

e) Añadir una disolución acuosa de HAuCU

f) Agitar.

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10. Un método según la reivindicación 9 donde la síntesis de la nanopartícula tiene lugar en un medio único, homogéneo y acuoso.

11. Un método para producir distribuciones de nanopartículas lineales y equidistantes que muestran distancias inter-partícula análogas y mayoritariamente dentro del rango entre 40 nm y 10 nm, incluye:

a) todas etapas de la reivindicación 9 y además

b) evaporar lentamente el disolvente a presión y temperatura ambiente.

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12. Un método para producir estructuras híbridas globulares convexas de dimensiones submicrométricas constituidas de nanopartículas de oro y PDE, incluye:

a) todas etapas de la reivindicación 9 y además

b) evaporar lentamente el disolvente a baja presión y baja temperatura.