ES2362652T3 - PROCEDURE FOR EVALUATING THE EFFECTIVENESS ADCC MEDIATED BY THE CD16 OF MONOCLONAL OR POLYCLONAL ANTIBODIES. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro para evaluar la eficacia ADCC mediada por el CD16 de un anticuerpo monoclonal o policlonal, que comprende la puesta en contacto de células efectoras Jurkat transfectadas con un vector de expresión que codifica para el receptor CD16 en un medio de reacción en presencia de dicho anticuerpo y del antígeno de dicho anticuerpo, y una medición de la cantidad de IL-2 producida por las células efectoras Jurkat transfectadas con un vector de expresión que codifica para el receptor CD16, caracterizado porque la secreción de IL-2 por las células Jurkat transfectadas con un vector de expresión que codifica para el receptor CD16 está correlacionada con la actividad ADCC mediada por el CD16.In vitro procedure to evaluate the CD16-mediated ADCC efficacy of a monoclonal or polyclonal antibody, which comprises contacting Jurkat effector cells transfected with an expression vector encoding the CD16 receptor in a reaction medium in the presence of said antibody and the antigen of said antibody, and a measurement of the amount of IL-2 produced by Jurkat effector cells transfected with an expression vector encoding the CD16 receptor, characterized in that IL-2 secretion by transfected Jurkat cells with an expression vector encoding the CD16 receptor is correlated with CD16-mediated ADCC activity.
Description
La presente solicitud se refiere a un procedimiento para medir la activación de una célula efectora, que pertenece al sistema inmunitario o modificada in vitro mediante un anticuerpo monoclonal (AcMo) o policlonal, caracterizado porque comprende una puesta en contacto de células que expresan el receptor CD16 en un medio de reacción en presencia del anticuerpo y del antígeno de dicho anticuerpo y una medición de la calidad de por lo menos una citoquina producida por la célula que expresa el receptor CD16. La solicitud se refiere asimismo a la selección de anticuerpos que presentan la característica de inducir la expresión de citoquinas y de interleucinas, en particular el IFNγ o la IL2. The present application refers to a method to measure the activation of an effector cell, belonging to the immune system or modified in vitro by means of a monoclonal antibody (mAb) or polyclonal, characterized in that it comprises contacting cells that express the CD16 receptor in a reaction medium in the presence of the antibody and the antigen of said antibody and a measurement of the quality of at least one cytokine produced by the cell that expresses the CD16 receptor. The application also relates to the selection of antibodies that have the characteristic of inducing the expression of cytokines and interleukins, in particular IFNγ or IL2.
La inmunoterapia con la ayuda de anticuerpos policlonales o monoclonales está a punto de convertirse en uno de los aspectos más importantes de la medicina. Por el contrario, los resultados obtenidos durante los ensayos clínicos aparecen contrastados. En efecto, puede resultar que el anticuerpo monoclonal no sea suficientemente eficaz. En la actualidad, las investigaciones se orientan al fragmento Fcγ de la inmunoglobulina con el fin de mejorar las propiedades de los anticuerpos. En el futuro, esto debería permitir la obtención de anticuerpos que interactúan y que activan los receptores de las células efectoras (macrófago, linfocito T y NK). Immunotherapy with the help of polyclonal or monoclonal antibodies is about to become one of the most important aspects of medicine. On the contrary, the results obtained during clinical trials appear contrasted. Indeed, it may turn out that the monoclonal antibody is not sufficiently effective. Currently, research is directed at the Fcγ fragment of immunoglobulin in order to improve the properties of antibodies. In the future, this should allow obtaining antibodies that interact and activate the receptors of the effector cells (macrophage, T lymphocyte and NK).
La actividad biológica de ciertas inmunoglobulinas G es dependiente de la estructura de los oligosacáridos presentes en la molécula, y en particular en su parte Fc. Las moléculas IgG de todas las sub-clases humanas y murinas poseen un N-oligosacárido fijado al dominio CH2 de cada cadena pesada (en el residuo Asn 297 para las IgG humanas). Se ha demostrado la influencia de este residuo glicánico sobre la capacidad del anticuerpo para interactuar con unas moléculas efectoras (Fc receptores y complemento). La inhibición de glicosilación de una IgG1 humana, mediante el cultivo en presencia de Tunicamicina, provoca por ejemplo una disminución de 50 veces de la afinidad de este anticuerpo para el receptor FcγRI presente sobre los monocitos y macrófagos (Leatherbarrow et al., 1985). La fijación al receptor FcγRIII está afectada asimismo por la pérdida de carbohidratos sobre la IgG, puesto que se ha descrito que una IgG3 no glicosilada es capaz de inducir una lisis de tipo ADCC por medio del receptor FcγRIII de las células NK (Lund et al., 1990). The biological activity of certain immunoglobulins G is dependent on the structure of the oligosaccharides present in the molecule, and in particular on its Fc part. IgG molecules of all human and murine subclasses possess an N-oligosaccharide attached to the CH2 domain of each heavy chain (at residue Asn 297 for human IgGs). The influence of this glycan residue on the ability of the antibody to interact with effector molecules (Fc receptors and complement) has been demonstrated. The inhibition of glycosylation of a human IgG1, by culturing in the presence of Tunicamycin, causes, for example, a 50-fold decrease in the affinity of this antibody for the FcγRI receptor present on monocytes and macrophages (Leatherbarrow et al., 1985). Binding to the FcγRIII receptor is also affected by the loss of carbohydrates on IgG, since it has been described that non-glycosylated IgG3 is capable of inducing ADCC-like lysis by means of the FcγRIII receptor of NK cells (Lund et al. , 1990).
Sin embargo, más allá de la presencia necesaria de estos residuos glicánicos, es más precisamente la heterogeneidad de su estructura lo que puede ocasionar unas diferencias en la capacidad para activar unas funciones efectoras. Se han observado unos perfiles de galactosilación variables en función de los individuos (IgG1 humanas séricas). Estas diferencias reflejan probablemente unas disparidades en la actividad de las galactosiltransferasas y otras enzimas entre los clones celulares de estos individuos (Jefferis et al., 1990). Mientras que esta heterogeneidad normal de los procesos post-traduccionales genera diferentes glicoformas (incluso en el caso de anticuerpos monoclonales), puede conducir a unas estructuras atípicas asociadas a ciertos estados patológicos tales como la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, para los cuales se ha demostrado una proporción importante de los residuos agalactosilados (Parekh et al., 1985). However, beyond the necessary presence of these glycan residues, it is more precisely the heterogeneity of their structure that can cause differences in the ability to activate effector functions. Variable galactosylation profiles have been observed depending on the individuals (serum human IgG1). These differences probably reflect disparities in the activity of galactosyltransferases and other enzymes between cell clones from these individuals (Jefferis et al., 1990). While this normal heterogeneity of post-translational processes generates different glycoforms (even in the case of monoclonal antibodies), it can lead to atypical structures associated with certain pathological states such as rheumatoid arthritis, Crohn's disease, for which it is has shown a significant proportion of agalactosylated residues (Parekh et al., 1985).
Frente a la complejidad planteada por la relación existente entre las diferentes estructuras glicánicas y la actividad de los anticuerpos, sería útil poder discriminar rápidamente cuáles son los anticuerpos eficaces y permitir así seleccionar unas líneas celulares que producen unos anticuerpos que tienen una mejor eficacia o unas propiedades específicas en la activación o en la inhibición de ciertos componentes del sistema inmunitario. Faced with the complexity posed by the relationship between the different glycan structures and the activity of the antibodies, it would be useful to be able to quickly discriminate which are the effective antibodies and thus allow the selection of cell lines that produce antibodies that have better efficacy or specific properties. specific in the activation or inhibition of certain components of the immune system.
En la solicitud FR 0004685 del 12 de abril de 2000 (LFB), se describió un nuevo procedimiento de preparación de un anticuerpo monoclonal capaz de activar las células efectoras que expresan el FcγRIII. En este procedimiento, se ensayan unos anticuerpos monoclonales que proceden de hibridomas o de líneas transfectadas en una mezcla de reacción que comprende las células diana de dichos anticuerpos, unas células efectoras que comprenden unas células que expresan el FcγRIII y unas IgG polivalentes. Así, se puede determinar el porcentaje de lisis de las células diana y seleccionar unos anticuerpos monoclonales que activan las células efectoras que provocan una lisis significativa de las células diana (actividad ADCC de tipo FcγRIII). Por ejemplo, la parte Fab del anticuerpo anti-D se fijará sobre el antígeno Rhesus D contenido por los hematíes. A consecuencia de esta fijación, su parte Fc se fija entonces sobre el receptor Fc gamma RIII o CD16 de la célula efectora (célula NK). Este "sándwich" induce la secreción de sustancias químicas de tipo perforinas que lisarán el glóbulo rojo. Se trata por lo tanto de una citotoxicidad celular anticuerpo dependiente (CCDA) o ADCC en inglés. Para acercarse de las condiciones fisiológicas, el ensayo se efectúa en presencia de inmunoglobulinas polivalentes humanas. In the application FR 0004685 of April 12, 2000 (LFB), a new process for the preparation of a monoclonal antibody capable of activating effector cells expressing FcγRIII was described. In this procedure, monoclonal antibodies originating from hybridomas or transfected lines are tested in a reaction mixture comprising the target cells of said antibodies, effector cells comprising cells that express FcγRIII and polyvalent IgGs. Thus, the percentage of lysis of the target cells can be determined and monoclonal antibodies that activate the effector cells that cause a significant lysis of the target cells (FcγRIII type ADCC activity) can be selected. For example, the Fab part of the anti-D antibody will bind to the Rhesus D antigen contained by the red blood cells. As a result of this binding, its Fc part then binds on the Fc gamma RIII or CD16 receptor of the effector cell (NK cell). This "sandwich" induces the secretion of perforin-like chemicals that will lyse the red blood cell. It is therefore an antibody dependent cellular cytotoxicity (CCDA) or ADCC in English. To approximate physiological conditions, the assay is carried out in the presence of human polyvalent immunoglobulins.
En el marco de la invención, se ha descubierto que la fijación de un anticuerpo sobre su ligando puede inducir una activación de la célula Jurkat transfectada CD16 que induce la secreción de IL2. Se observa una fuerte correlación entre la secreción de IL2 por Jurkat CD16 y la actividad ADCC mediada por el CD16 de las células efectoras. Además, se ha observado que un mismo anticuerpo dirigido contra un antígeno dado es completamente ineficaz cuando está producido en unas líneas de mieloma de ratón, mientras que se muestra muy eficaz cuando está producido en otras líneas celulares. Within the framework of the invention, it has been discovered that the binding of an antibody on its ligand can induce an activation of the CD16 transfected Jurkat cell which induces the secretion of IL2. A strong correlation is observed between the secretion of IL2 by Jurkat CD16 and the CD16-mediated ADCC activity of effector cells. Furthermore, it has been observed that the same antibody directed against a given antigen is completely ineffective when produced in some mouse myeloma lines, while it is very effective when produced in other cell lines.
El problema es por lo tanto saber cuál es la capacidad de un anticuerpo dado para estimular la producción de citoquinas por las células efectoras y cuáles son las consecuencias de dicha activación en función de la naturaleza de las citoquinas liberadas. The problem is therefore to know what is the capacity of a given antibody to stimulate the production of cytokines by the effector cells and what are the consequences of said activation as a function of the nature of the cytokines released.
La solicitud propone por lo tanto la utilización de anticuerpos seleccionados por un ensayo Jurkat CD16 mediante la medición de IL2 segregada o de otras citoquinas, lo cual permite garantizar la actividad biológica de dichos anticuerpos para un uso terapéutico. The application therefore proposes the use of antibodies selected by a Jurkat CD16 assay by measuring secreted IL2 or other cytokines, which makes it possible to guarantee the biological activity of said antibodies for therapeutic use.
La invención es tal como se describe en las reivindicaciones. The invention is as described in the claims.
La presente solicitud se refiere a un procedimiento para medir la activación de una célula efectora que pertenece al sistema inmunitario, transformada o no, por un anticuerpo monoclonal (AcMo) o policlonal, caracterizado porque comprende una puesta en contacto de células que expresan el receptor CD16 en un medio de reacción en presencia del anticuerpo y del antígeno de dicho anticuerpo y una medición de la cantidad de por lo menos una citoquina producida por la célula que expresa el receptor CD16. The present application refers to a method to measure the activation of an effector cell belonging to the immune system, transformed or not, by a monoclonal antibody (mAb) or polyclonal, characterized in that it comprises contacting cells that express the CD16 receptor in a reaction medium in the presence of the antibody and the antigen of said antibody and a measurement of the amount of at least one cytokine produced by the cell that expresses the CD16 receptor.
Mediante la expresión "célula transformada" se entiende una célula modificada genéticamente, de manera que exprese un receptor, en particular el receptor CD16. By the term "transformed cell" is meant a cell that is genetically modified, such that it expresses a receptor, in particular the CD16 receptor.
De manera más general, se utiliza para la selección de los anticuerpos una línea de tipo Jurkat u otra línea transfectada con un vector de expresión que codifica para un receptor Fc, incluyendo CD16, CD32 y CD64, como célula efectora. Preferentemente, se utiliza una línea Jurkat transfectada con un vector de expresión que codifica para el receptor CD16 como célula efectora. Esta línea es particularmente ventajosa puesto que es inmortalizada y se desarrolla indefinidamente en unos medios de cultivo. More generally, a Jurkat-type line or another line transfected with an expression vector encoding an Fc receptor, including CD16, CD32 and CD64, is used as the effector cell for the selection of the antibodies. Preferably, a Jurkat line transfected with an expression vector encoding the CD16 receptor is used as the effector cell. This line is particularly advantageous since it is immortalized and grows indefinitely in culture media.
Entre las citoquinas que se pueden cuantificar, es posible medir la producción de por lo menos una citoquina seleccionada de entre IL1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, etc. TNFa, TGFβ, IP10 e IFNγ. Se puede seleccionar ventajosamente la interleucina IL-2. Among the cytokines that can be quantified, it is possible to measure the production of at least one cytokine selected from IL1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 8, IL-9, IL-10, etc. TNFa, TGFβ, IP10 and IFNγ. Interleukin IL-2 can be advantageously selected.
El porcentaje de citoquina producida es un marcador de activación o de inhibición de las células efectoras. The percentage of cytokine produced is a marker of activation or inhibition of effector cells.
Preferentemente, el porcentaje de interleucina IL2 segregada refleja la calidad del anticuerpo fijado por el receptor CD16 en cuanto a su integridad (función Fc) y a su eficacia (sitio antigénico) de unión al antígeno. La medición del porcentaje de IL2 está correlacionada con una actividad de tipo ADCC. Preferably, the percentage of interleukin IL2 secreted reflects the quality of the antibody bound by the CD16 receptor in terms of its integrity (Fc function) and its antigen-binding efficacy (antigenic site). Measurement of percent IL2 is correlated with ADCC-like activity.
En otro aspecto, la solicitud se refiere a un procedimiento para evaluar la eficacia de un anticuerpo monoclonal o policlonal, caracterizado porque comprende una puesta en contacto de células efectoras del sistema inmunitario, transformadas o no, que expresan el receptor CD16 en un medio de reacción en presencia de un anticuerpo y del antígeno de dicho anticuerpo, y una medición de la cantidad de por lo menos una citoquina producida por la célula que expresa el receptor CD16. In another aspect, the application refers to a method for evaluating the efficacy of a monoclonal or polyclonal antibody, characterized in that it comprises contacting effector cells of the immune system, transformed or not, that express the CD16 receptor in a reaction medium. in the presence of an antibody and the antigen of said antibody, and a measurement of the amount of at least one cytokine produced by the cell that expresses the CD16 receptor.
Este procedimiento está particularmente adaptado para evaluar la eficacia de un anticuerpo monoclonal o policlonal de especificidad anti-Rh D del glóbulo rojo humano. This procedure is particularly adapted to evaluate the efficacy of a monoclonal or polyclonal antibody of human red blood cell anti-Rh D specificity.
En otro aspecto, la solicitud se refiere a un procedimiento para evaluar la capacidad de una célula para producir un anticuerpo monoclonal eficaz, caracterizado porque comprende una puesta en contacto de células efectoras del sistema inmunitario, transformadas o no, que expresan el receptor CD16 en un medio de reacción en presencia de un anticuerpo y del antígeno de dicho anticuerpo, y una medición de la cantidad de por lo menos una citoquina producida por la célula que expresa el receptor CD16. In another aspect, the application refers to a method for evaluating the ability of a cell to produce an effective monoclonal antibody, characterized in that it comprises contacting effector cells of the immune system, transformed or not, that express the CD16 receptor in a reaction medium in the presence of an antibody and the antigen of said antibody, and a measurement of the amount of at least one cytokine produced by the cell that expresses the CD16 receptor.
Este procedimiento se puede llevar a cabo para unas células utilizadas para la producción de anticuerpos terapéuticos, tales como CHO, YB2/0, unas células linfoblastoides humanas, unas células de insectos y unas células de mielomas murinos. This procedure can be carried out for cells used for the production of therapeutic antibodies, such as CHO, YB2 / 0, human lymphoblastoid cells, insect cells and murine myeloma cells.
Este procedimiento puede ser aplicado asimismo a la evaluación de la producción de AcMo por unas plantas transgénicas o de mamíferos transgénicos. This procedure can also be applied to the evaluation of mAb production by transgenic plants or transgenic mammals.
En un aspecto complementario, la solicitud se refiere a un procedimiento para evaluar la eficacia y la integridad de anticuerpos policlonales después de una etapa o de varias etapas de purificación, caracterizado porque comprende una puesta en contacto de células efectoras del sistema inmunitario, transformadas o no, que expresan el receptor CD16 en un medio de reacción en presencia del anticuerpo purificado y del antígeno de dicho anticuerpo, y una medición de la cantidad de por lo menos una citoquina producida por la célula que expresa el receptor CD16. In a complementary aspect, the application refers to a method for evaluating the efficacy and integrity of polyclonal antibodies after a stage or stages of purification, characterized in that it comprises contacting effector cells of the immune system, transformed or not. , which express the CD16 receptor in a reaction medium in the presence of the purified antibody and the antigen of said antibody, and a measurement of the amount of at least one cytokine produced by the cell that expresses the CD16 receptor.
Los procedimientos descritos anteriormente se pueden llevar a cabo eventualmente en presencia de inmunoglobulinas humanas (IVIg). The procedures described above can optionally be carried out in the presence of human immunoglobulins (IVIg).
A título de ejemplo, se seleccionarán los anticuerpos para los cuales se observa un aumento superior a 100%, 250%, 500% o 1.000% del porcentaje de liberación de IL-2 con respecto al control en ausencia de anticuerpos o un anticuerpo dado como referencia negativa. By way of example, antibodies will be selected for which an increase of more than 100%, 250%, 500% or 1,000% is observed in the percentage of IL-2 release with respect to the control in the absence of antibodies or an antibody given as negative reference.
La solicitud se refiere asimismo a la utilización del procedimiento descrito anteriormente para seleccionar unos anticuerpos eficaces para un tratamiento terapéutico. Por ejemplo, el anticuerpo seleccionado puede ser un anti-D. Puede estar destinado asimismo al tratamiento de las enfermedades autoinmunes e inflamatorias, de los cánceres y de las infecciones por unos agentes patógenos. The application also refers to the use of the method described above to select effective antibodies for therapeutic treatment. For example, the selected antibody can be an anti-D. It can also be used for the treatment of autoimmune and inflammatory diseases, cancers and infections caused by pathogens.
La solicitud se refiere asimismo a un kit que permite evaluar la actividad biológica de un anticuerpo que comprende unos medios y unos agentes reactivos necesarios, y unas células efectoras que expresan el receptor CD16 para la realización del procedimiento descrito anteriormente que permite la dosificación de por lo menos una citoquina, en particular IL-2, IFN y TNF. The application also refers to a kit that makes it possible to evaluate the biological activity of an antibody comprising the necessary means and reactive agents, and effector cells that express the CD16 receptor to carry out the procedure described above, which allows the dosage of at least less one cytokine, in particular IL-2, IFN and TNF.
Además, este ensayo puede comprender asimismo un ensayo ADCC. A este respecto, la solicitud se refiere a un procedimiento de selección de un anticuerpo monoclonal quimérico, humanizado o humano optimizado, caracterizado porque comprende una puesta en contacto de células que expresan el receptor CD16 en un medio de reacción en presencia del anticuerpo y del antígeno de dicho anticuerpo, y una medición de la cantidad de por lo menos una citoquina producida por la célula que expresa el receptor CD16. Furthermore, this assay may also comprise an ADCC assay. In this regard, the application refers to a selection procedure for a chimeric, humanized or optimized human monoclonal antibody, characterized in that it comprises contacting cells that express the CD16 receptor in a reaction medium in the presence of the antibody and the antigen. of said antibody, and a measurement of the amount of at least one cytokine produced by the cell that expresses the CD16 receptor.
En un modo de realización particular, el anticuerpo de la solicitud es capaz de inducir la secreción de por lo menos una citoquina por una célula leucocitaria, en particular de la familia de las NK (natural killer) o por unas células del grupo monocitos-macrófagos. De manera general, se utiliza para la selección de los anticuerpos una línea de tipo Jurkat u otra línea transfectada con un vector de expresión que codifica para un receptor Fc, incluyendo CD16, CD32 y CD64, como célula efectora. Preferentemente, se utiliza para la selección de los anticuerpos una línea Jurkat transfectada con un vector de expresión que codifica para el receptor CD16 como célula efectora. Esta línea es particularmente ventajosa puesto que es inmortalizada y se desarrolla indefinidamente en unos medios de cultivos. El porcentaje de interleucina IL2 segregado refleja la calidad del anticuerpo fijado por el receptor CD16 en cuanto a su integridad (función Fc) y a su eficacia (sitio antigénico) de unión al antígeno. In a particular embodiment, the antibody of the application is capable of inducing the secretion of at least one cytokine by a leukocyte cell, in particular of the NK family (natural killer) or by cells of the monocyte-macrophage group . In general, a Jurkat-type line or another line transfected with an expression vector encoding an Fc receptor, including CD16, CD32 and CD64, is used as an effector cell for the selection of antibodies. Preferably, a Jurkat line transfected with an expression vector encoding the CD16 receptor as an effector cell is used for the selection of the antibodies. This line is particularly advantageous since it is immortalized and grows indefinitely in culture media. The percentage of interleukin IL2 secreted reflects the quality of the antibody bound by the CD16 receptor in terms of its integrity (Fc function) and its antigen-binding efficacy (antigenic site).
En otro modo de realización, el anticuerpo optimizado se puede preparar después de haber sido purificado y/o modificado ex vivo mediante modificación de la estructura glicánica del fragmento Fc. Con este fin, se puede utilizar cualquier medio químico, cromatográfico o enzimático apropiado para modificar la estructura glicánica de los anticuerpos. In another embodiment, the optimized antibody can be prepared after it has been purified and / or modified ex vivo by modifying the glycan structure of the Fc fragment. To this end, any appropriate chemical, chromatographic or enzymatic means can be used to modify the glycan structure of the antibodies.
En otro modo de realización, el anticuerpo se puede producir mediante unas células de líneas de mieloma de rata, en particular YB2/0 y sus derivados. Se pueden seleccionar otras líneas por sus propiedades para producir los anticuerpos definidos anteriormente. Se podrán ensayar por ejemplo unas células linfoblastoides humanas, unas células de insectos y unas células de mieloma murino. La selección se puede aplicar asimismo a la evaluación de los anticuerpos producidos por unas plantas transgénicas o de mamíferos transgénicos. Cone este fin, la producción en CHO sirve de referencia (siendo CHO utilizado para la producción de anticuerpos medicamento) para comparar y seleccionar los sistemas de producción que conducen a los anticuerpos según la solicitud. In another embodiment, the antibody can be produced by cells of rat myeloma lines, in particular YB2 / 0 and its derivatives. Other lines can be selected for their properties to produce the antibodies defined above. For example, human lymphoblastoid cells, insect cells and murine myeloma cells can be tested. The selection can also be applied to the evaluation of antibodies produced by transgenic plants or transgenic mammals. For this purpose, the production in CHO serves as a reference (being CHO used for the production of drug antibodies) to compare and select the production systems that lead to the antibodies according to the application.
La estructura glicánica general del anticuerpo es de tipo biantenada, con unas cadenas cortas, una baja sialilación, unas manosas y GlcNAc del punto de enganche terminales no intercalares, y una baja fucosilación. En estos anticuerpos, el porcentaje de GlcNac intermedio es no nulo. Por ejemplo, se pueden utilizar unas composiciones de anticuerpos que presentan un contenido superior a 60%, preferentemente superior a 80% para las formas G0 + G1 + G0F + G1F, entendiéndose que las formas G0F + G1F son inferiores a 50%, preferentemente inferiores a 30%. Estas composiciones se pueden obtener con unas líneas de mielomas de rata, por ejemplo con la línea YB2/0. The overall glycanic structure of the antibody is of the bianated type, with short chains, low sialylation, non-intercalary terminal attachment point mannoses and GlcNAc, and low fucosylation. In these antibodies, the percentage of intermediate GlcNac is non-zero. For example, antibody compositions can be used that have a content greater than 60%, preferably greater than 80% for the G0 + G1 + G0F + G1F forms, it being understood that the G0F + G1F forms are less than 50%, preferably less to 30%. These compositions can be obtained with rat myeloma lines, for example with the YB2 / 0 line.
En un segundo aspecto, la solicitud se refiere a la utilización de un anticuerpo descrito anteriormente para la preparación de un medicamento destinado a inducir la secreción de por lo menos una citoquina por una célula efectora que pertenece al sistema inmunitario, estando dicho anticuerpo caracterizado porque es susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento de selección que comprende una puesta en contacto de células efectoras del sistema inmunitario que expresan el receptor CD16, trasformadas o no, en un medio de reacción en presencia del anticuerpo a ensayar y del antígeno de dicho anticuerpo, y una medición de la cantidad de por lo menos una citoquina producida por la célula que expresa el receptor CD16. In a second aspect, the application refers to the use of an antibody described above for the preparation of a drug intended to induce the secretion of at least one cytokine by an effector cell belonging to the immune system, said antibody being characterized in that it is capable of being obtained by a selection procedure that comprises contacting effector cells of the immune system that express the CD16 receptor, transformed or not, in a reaction medium in the presence of the antibody to be tested and the antigen of said antibody, and a measurement of the amount of at least one cytokine produced by the cell that expresses the CD16 receptor.
Preferentemente, se utiliza para la selección de los anticuerpos una línea Jurkat transfectada con un vector de expresión que codifica para el receptor CD16 como célula efectora. Dichas citoquinas liberadas son unas interleucinas, unos interferones y unos factores de necrosis tisular (TNF). Así, el anticuerpo seleccionado tiene la capacidad de inducir la secreción de por lo menos una citoquina seleccionada de entre IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, etc. TNFa, TGFβ, IP10 e IFNγ por las células efectoras del sistema inmunitario que expresa el receptor CD16. Preferably, a Jurkat line transfected with an expression vector encoding the CD16 receptor as an effector cell is used for the selection of the antibodies. Said released cytokines are interleukins, interferons and tissue necrosis factors (TNF). Thus, the selected antibody has the ability to induce the secretion of at least one cytokine selected from among IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, etc. TNFa, TGFβ, IP10 and IFNγ by effector cells of the immune system that express the CD16 receptor.
Preferentemente, el anticuerpo seleccionado tiene la capacidad de inducir la secreción de IL-2 por las células efectoras del sistema inmunitario que expresan el receptor CD16. El porcentaje de interleucina IL2 segregada refleja la calidad del anticuerpo fijado por el receptor CD16 en cuanto a su integridad (función Fc) y a su eficacia (sitio antigénico) de unión al antígeno. La medición del porcentaje de IL2 está correlacionada con una actividad de tipo ADCC. Preferably, the selected antibody has the ability to induce IL-2 secretion by effector cells of the immune system that express the CD16 receptor. The percentage of interleukin IL2 secreted reflects the quality of the antibody bound by the CD16 receptor in terms of its integrity (Fc function) and its antigen-binding efficacy (antigenic site). Measurement of percent IL2 is correlated with ADCC-like activity.
La selección se puede realizar sobre unos anticuerpos producidos por unas células utilizadas habitualmente para la producción de anticuerpos terapéuticos, tales como CHO, YB2/0, las células linfoblastoides humanas, las células de insectos y las células de mielomas murinos. La selección se puede aplicar asimismo a la evaluación de anticuerpos producidos por unas plantas transgénicas o de mamíferos transgénicos. The selection can be carried out on antibodies produced by cells commonly used for the production of therapeutic antibodies, such as CHO, YB2 / 0, human lymphoblastoid cells, insect cells and murine myeloma cells. The selection can also be applied to the evaluation of antibodies produced by transgenic plants or transgenic mammals.
Preferentemente, la solicitud se refiere a la utilización de un anticuerpo producido por una línea de mieloma de rata, por ejemplo con la línea YB2/0 para la preparación de un medicamento destinado a inducir la secreción de por lo menos una citoquina por una célula efectora que pertenece al sistema inmunitario. A este respecto, la solicitud se refiere a la utilización de un anticuerpo que presenta una estructura glicánica de tipo biantenada, con unas cadenas cortas, una baja sialilación, unas manosas y GlcNAc del punto de enganche terminales no intercalares, y una baja fucosilación para la preparación de un medicamento destinado a inducir la secreción de por lo menos una citoquina por una célula efectora que pertenece al sistema inmunitario. En este anticuerpo, el porcentaje de GlcNac intermedio es no nulo. Por ejemplo, se pueden utilizar unas composiciones de anticuerpos que presentan un contenido superior a 60%, preferentemente superior a 80% para las formas G0 + G1 + G0F + G1F, entendiéndose que las formas G0F Preferably, the application refers to the use of an antibody produced by a rat myeloma line, for example with the YB2 / 0 line for the preparation of a drug intended to induce the secretion of at least one cytokine by an effector cell. that belongs to the immune system. In this regard, the application refers to the use of an antibody having a glycanic structure of the bianated type, with short chains, low sialylation, non-intercalary mannoses and GlcNAc of the terminal attachment point, and low fucosylation for the preparation of a medicament intended to induce the secretion of at least one cytokine by an effector cell belonging to the immune system. In this antibody, the percentage of intermediate GlcNac is non-zero. For example, antibody compositions can be used that have a content greater than 60%, preferably greater than 80% for the G0 + G1 + G0F + G1F forms, it being understood that the G0F forms
+ G1F son inferiores a 50%, preferentemente inferiores a 30%. + G1F are less than 50%, preferably less than 30%.
En un modo de realización particular, el anticuerpo seleccionado es capaz de inducir la secreción de por lo menos una citoquina por una célula leucocitaria, en particular de la familia de las NK (natural killer) o por unas células del grupo monocitos-macrófagos. In a particular embodiment, the selected antibody is capable of inducing the secretion of at least one cytokine by a leukocyte cell, in particular of the NK family (natural killer) or by cells of the monocyte-macrophage group.
La solicitud se refiere asimismo a la utilización de los anticuerpos seleccionados descritos anteriormente específicos de un antígeno que proceden de una célula patológica o de un organismo patógeno para el ser humano. The application also relates to the use of the selected antibodies described above specific for an antigen originating from a pathological cell or from an organism that is pathogenic for humans.
Este anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o policlonal. This antibody is a monoclonal or polyclonal antibody.
Por ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o policlonal de especificidad anti-Rhesus del glóbulo rojo humano. For example, the antibody is a human red cell anti-Rhesus specificity monoclonal or polyclonal antibody.
El anticuerpo según la solicitud puede asimismo ser un anticuerpo dirigido contra unos virus patógenos para el ser humano, contra unos antígenos de tumores malignos o contra los antígenos de una bacteria o de un parásito patógeno para el ser humano. The antibody according to the application can also be an antibody directed against viruses that are pathogenic for humans, against antigens of malignant tumors or against antigens of a bacterium or of a parasite that are pathogenic for humans.
Ventajosamente, el anticuerpo seleccionado muestra un aumento superior a 100%, 250%, 500% o 1.000% del porcentaje de liberación de IL-2 con respecto al control en ausencia de anticuerpos o en presencia de un anticuerpo dado como referencia negativa. Advantageously, the selected antibody shows an increase of more than 100%, 250%, 500% or 1000% in the percentage of IL-2 release with respect to the control in the absence of antibodies or in the presence of an antibody given as a negative reference.
Los procedimientos descritos anteriormente se pueden llevar a cabo eventualmente en presencia de inmunoglobulinas humanas (IVIg). Para la comparación, se pueden utilizar unos anticuerpos homólogos producidos en CHO, o también unos anticuerpos de referencia disponibles en el comercio. The procedures described above can optionally be carried out in the presence of human immunoglobulins (IVIg). For comparison, homologous antibodies produced in CHO or also commercially available reference antibodies can be used.
En un aspecto suplementario, la solicitud prevé la utilización de dichos anticuerpos seleccionados como soporte terapéutico en medicina humana, en particular para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de las enfermedades autoinmunes, inflamatorias, de los cánceres y de las infecciones por unos agentes patógenos. In a supplementary aspect, the application foresees the use of said selected antibodies as therapeutic support in human medicine, in particular for the preparation of a medicine for the treatment of autoimmune and inflammatory diseases, cancers and infections by pathogens. .
Figura 1: Descripción del ensayo ADCC CMN. Figure 1: Description of the ADCC CMN assay.
Las células mononucleadas en presencia de Tegelina (IVIg) son incubadas con los anticuerpos anti-Rhesus D y unos hematíes Rhesus + (diana). Después de una noche a 37ºC, se mide la lisis de los hematíes mediante la evaluación del porcentaje de hemoglobina liberada en el medio de reacción. Mononucleated cells in the presence of Tegelin (IVIg) are incubated with anti-Rhesus D antibodies and Rhesus + red blood cells (target). After one night at 37 ° C, the lysis of the red blood cells is measured by evaluating the percentage of hemoglobin released in the reaction medium.
Figura 2: Descripción del ensayo ADCC NK Figure 2: Description of the ADCC NK assay
Las células NK purificadas son incubadas con los anticuerpos anti-Rhesus D y unos hematíes Rhesus + (diana). Después de una noche a 37ºC, se mide la lisis de los hematíes mediante evaluación del porcentaje de hemoglobina liberada en el medio de reacción. The purified NK cells are incubated with the anti-Rhesus D antibodies and Rhesus + red cells (target). After one night at 37 ° C, the lysis of the red cells is measured by evaluating the percentage of hemoglobin released in the reaction medium.
Figura 3: Resultados ADCC NK e inhibición por el anti-CD16 "3G8". Figure 3: Results of ADCC NK and inhibition by anti-CD16 "3G8".
Los anticuerpos anti-D, DF5-EBV (expresado por la célula B inmortalizada EBV), DF5-YB2/0 (expresado por la célula YB2/0), son comparados con el anticuerpo policlonal WinRho para su capacidad a inducir la lisis de hematíes Rhesus D en presencia de células NK. La inhibición de ADCC se estudia en presencia del anti-CD16 3G8. Anti-D antibodies, DF5-EBV (expressed by immortalized B cell EBV), DF5-YB2 / 0 (expressed by YB2 / 0 cell), are compared to the polyclonal antibody WinRho for their ability to induce red blood cell lysis. Rhesus D in the presence of NK cells. The inhibition of ADCC is studied in the presence of anti-CD16 3G8.
Figura 4: Descripción del ensayo Jurkat CD16. Figure 4: Description of the Jurkat CD16 assay.
Unas células Jurkat CD16 se mezclan con diferentes anticuerpos anti-D en presencia de hematíes Rhesus+ y de PMA. Después de una noche de incubación, la liberación de IL-2 en el sobrenadante se cuantifica mediante ELISA. Figura 5: Resultados del ensayo Jurkat CD16. Comentarios: los anticuerpos positivos en ADCC-NK inducen una secreción de IL-2 en presencia de Jurkat CD16 y Jurkat CD16 cells mix with different anti-D antibodies in the presence of Rhesus + red blood cells and PMA. After an overnight incubation, the release of IL-2 in the supernatant is quantified by ELISA. Figure 5: Results of the Jurkat CD16 assay. Comments: ADCC-NK positive antibodies induce IL-2 secretion in the presence of Jurkat CD16 and
de su diana. of your target.
Figura 6: Liberación de citoquina (IL-1, IFN y TNF) por unos leucocitos activados por unos anticuerpos en presencia de su diana. A-Esquema de activación de los leucocitos. B-Los leucocitos han sido incubados con diferentes anticuerpos en presencia de hematíes. Después de una noche Figure 6: Release of cytokine (IL-1, IFN and TNF) by leukocytes activated by antibodies in the presence of your target. A-Leukocyte activation scheme. B-The leukocytes have been incubated with different antibodies in the presence of red blood cells. After one night
de incubación, la liberación de TNFa e IFNγ en el sobrenadante ha sido cuantificada mediante ELISA. After incubation, the release of TNFa and IFNγ in the supernatant has been quantified by ELISA.
Figura 7: Liberación de citoquina (IFN, TNF) por unas células NK activadas por unos anticuerpos en presencia de su diana (LFB-R297-RBC). A-Esquema de activación de las células NK. B-Unas células NK purificadas han sido mezcladas con diferentes anticuerpos anti-D en presencia de hematíes Figure 7: Release of cytokine (IFN, TNF) by NK cells activated by antibodies in the presence of their target (LFB-R297-RBC). A-NK cell activation scheme. B-Some purified NK cells have been mixed with different anti-D antibodies in the presence of red blood cells
Rhesus+. Después de una noche de incubación, la liberación de TNFa y de IFNγ en el sobrenadante ha sido cuantificada mediante ELISA. Figura 8: Liberación de IL2 por Jurkat CD16 activadas por un anti-CD20 Rhesus +. After an overnight incubation, the release of TNFa and IFNγ in the supernatant has been quantified by ELISA. Figure 8: IL2 release by Jurkat CD16 activated by an anti-CD20
A-Esquema de activación de célula Jurkat. B-Unas células Jurkat CD16 han sido mezcladas con diferentes anticuerpos anti-CD20 (anticuerpo murino CAT13 y anticuerpo quimérico C273) en presencia de células Raji y de PMA. Después de una noche de incubación, la liberación de IL-2 en el sobrenadante ha sido cuantificada mediante ELISA. A-Jurkat cell activation scheme. B-Jurkat CD16 cells have been mixed with different anti-CD20 antibodies (murine antibody CAT13 and chimeric antibody C273) in the presence of Raji cells and PMA. After an overnight incubation, the IL-2 release in the supernatant has been quantified by ELISA.
Figura 9: Liberación de IL2 por Jurkat CD16 activadas por un anti-D A-Esquema de activación de célula Jurkat. B-Unas células Jurkat CD16 han sido mezcladas con diferentes anticuerpos anti-D en presencia de hematíes Figure 9: IL2 release by Jurkat CD16 activated by an anti-D A-Jurkat cell activation scheme. B-Jurkat CD16 cells have been mixed with different anti-D antibodies in the presence of red blood cells
Rhesus+ y de PMA. Después de una noche de incubación, la liberación de IL-2 en el sobrenadante ha sido cuantificada mediante ELISA. DF5 expresado en YB2/0 y T125 expresado en CHO Lec13 inducen una fuerte secreción de IL2. Rhesus + and PMA. After an overnight incubation, the release of IL-2 in the supernatant has been quantified by ELISA. DF5 expressed in YB2 / 0 and T125 expressed in CHO Lec13 induce strong IL2 secretion.
Figura 10: Recta de correlación entre ADCC (Tegelina 500 µg/pocillo y anti-D a 7,5 ng/pocillo) y el ensayo Jurkat IL2. Figura 11: Secreción de IL-8 por las células mononucleadas. Figura 12: Inducción de la secreción de TNF alfa, IL-6 y TGF beta por las células mononucleadas. Figura 13: Inducción de la secreción de citoquinas por los polinucleares. Figura 14: Inducción de la secreción de IFN gamma, TNF alfa e IP10 por las NK. Figure 10: Correlation line between ADCC (Tegelin 500 µg / well and anti-D at 7.5 ng / well) and the Jurkat IL2 assay. Figure 11: IL-8 secretion by mononucleated cells. Figure 12: Induction of TNF alpha, IL-6 and TGF beta secretion by mononucleated cells. Figure 13: Induction of cytokine secretion by polynuclear cells. Figure 14: Induction of IFN gamma, TNF alpha and IP10 secretion by NKs.
Anticuerpos: Anticuerpos policlonales WinRho, anticuerpo monoclonal DF5-EBV, anticuerpo monoclonal DF5-YB2/0. Antibodies: WinRho polyclonal antibodies, DF5-EBV monoclonal antibody, DF5-YB2 / 0 monoclonal antibody.
Principio: Beginning:
Este ensayo evalúa la capacidad de los anticuerpos anti-D para fijarse sobre el receptor CD16 (Fc gamma RIII) expresado en las células Jurkat CD16 y para inducir la secreción de IL2. Este ensayo consiste en poner en contacto en placas de 96 pocillos: los anticuerpos anti-D, los hematíes Rhesus This assay assesses the ability of anti-D antibodies to bind to the CD16 receptor (Fc gamma RIII) expressed in Jurkat CD16 cells and to induce IL2 secretion. This test consists of putting in contact in 96-well plates: anti-D antibodies, Rhesus red blood cells
positivo tratados con papaína, las células Jurkat CD16 y PMA. positive treated with papain, Jurkat CD16 and PMA cells.
Después de una noche de incubación a 37ºC, se centrifugan los P96 y se dosifica en el sobrenadante la cantidad de IL2 segregada. Material Anticuerpos de control positivo: Poli-D WinRho, DF5 YB2/0. Anticuerpos de control negativos: DF5. Hematíes Rhesus positivo Células Jurkat CD16. Kit de dosificación de IL2: Cuantiquina de R/D. Método Tratamiento con papaína de los hematíes. 1 ml de residuo de hematíes diluidos en PBS incubado con 1 ml de una disolución de papaína (1 mg/ml) durante 10 After an overnight incubation at 37 ° C, the P96s are centrifuged and the amount of IL2 segregated. Material Positive control antibodies: Poly-D WinRho, DF5 YB2 / 0. Negative control antibodies: DF5. Rhesus positive red blood cells Jurkat CD16 cells. IL2 Dosing Kit: R / D Quantikine. Method Papain treatment of red blood cells. 1 ml of red blood cell residue diluted in PBS incubated with 1 ml of a papain solution (1 mg / ml) for 10
minutos a 37ºC. Después, 3 lavados en H2O-NaCl 0,15 M. Mezcla de reacción: -Anticuerpos: 50 µl de una dilución a 150 ng/ml en IMDM 5% SVF -PMA 50 µl de una dilución a 40 ng/ml en IMDM 5% SVF -Hematíes tratados con papaína. 50 µl a 8·106/ml en IMDM 5% SVF -Jurkat CD16. 50 µl a 2x106/ml en IMDM 5% SVF Incubación durante 1 noche a 37ºC Después, centrifugación de las placas, extracción de 100 µl de sobrenadantes y dosificación de IL2 con el kit minutes at 37 ° C. Then 3 washes in 0.15 M H2O-NaCl. Reaction mixture: -Antibodies: 50 µl of a dilution of 150 ng / ml in IMDM 5% SVF -PMA 50 µl of a dilution at 40 ng / ml in IMDM 5% SVF -RBCs treated with papain. 50 µl at 8106 / ml in IMDM 5% SVF -Jurkat CD16. 50 µl at 2x106 / ml in IMDM 5% SVF Incubation overnight at 37ºC Then, centrifugation of the plates, extraction of 100 µl of supernatants and dosing of IL2 with the kit.
comercial. Lectura a 450 nm. Se proporcionan los valores (en pg/ml) en forma de histograma para cada muestra. commercial. Reading at 450 nm. Values (in pg / ml) are provided as a histogram for each sample.
Para este estudio, se han comparado 3 anticuerpos monoclonales anti-D. For this study, 3 anti-D monoclonal antibodies have been compared.
Mab DF5-EBV ha sido producido mediante unos linfocitos B humanos obtenidos en un donante inmunizado D-negativo e inmortalizados mediante transformación con EBV. Este anticuerpo ha sido utilizado como control negativo debido a que ha mostrado que es incapaz de eliminar los glóbulos rojos Rhesus positivo de la circulación durante un ensayo clínico. Mab DF5-EBV has been produced by human B lymphocytes obtained from a D-negative immunized donor and immortalized by transformation with EBV. This antibody has been used as a negative control because it has been shown to be unable to remove positive Rhesus red blood cells from the circulation during a clinical trial.
El anticuerpo monoclonal (Mab) DF5-YB2/0 ha sido obtenido expresando la secuencia primaria de DF5-EBV en la línea YB2/0. El anticuerpo monoclonal R297 y otros anticuerpos recombinantes han sido asimismo expresados en YB2/0. The monoclonal antibody (Mab) DF5-YB2 / 0 has been obtained by expressing the primary sequence of DF5-EBV in the YB2 / 0 line. The monoclonal antibody R297 and other recombinant antibodies have also been expressed in YB2 / 0.
Estos anticuerpos se ensayan in vitro por su capacidad para inducir una lisis de los glóbulos rojos tratados con papaína utilizando unas células mononucleadas (PBL) como efector. These antibodies are tested in vitro for their ability to induce lysis of papain-treated red blood cells using mononucleated cells (PBL) as effector.
Todos los ensayos han sido llevados a cabo en presencia de inmunoglobulinas humanas (IVIg) de manera que se reconstituyan las condiciones fisiológicas. All the tests have been carried out in the presence of human immunoglobulins (IVIg) so that the physiological conditions are reconstituted.
Se cree que las IVIg se unen con una alta afinidad al FcgammaRI (CD64). Los dos Mab DF5-YB2/0 y R297 inducen una lisis de los glóbulos rojos a un nivel comparable al de los anticuerpos WinRho. Por el contrario, el Mab DF5-EBV es completamente ineficaz. IVIg are believed to bind with high affinity to FcgammaRI (CD64). The two Mabs DF5-YB2 / 0 and R297 induce lysis of red blood cells at a level comparable to that of WinRho antibodies. In contrast, Mab DF5-EBV is completely ineffective.
En una segunda serie de experimentos, unas células NK purificadas y unos glóbulos rojos no tratados han sido utilizados como efector y dianas respectivamente. Después de 5 horas de incubación, los Mab antiD-R297 y DF5YB2/0 han sido capaces de provocar la lisis de los glóbulos rojos, mientras que DF5-EBV sigue siendo ineficaz. In a second series of experiments, purified NK cells and untreated red blood cells were used as effector and targets respectively. After 5 hours of incubation, the anti-D-R297 and DF5YB2 / 0 Mabs have been able to induce red blood cell lysis, while DF5-EBV remains ineffective.
En estos dos experimentos, la lisis de los glóbulos rojos ha sido inhibida por el anticuerpo 3G8 dirigido contra el FcgammaRIII (CD16). In these two experiments, red blood cell lysis has been inhibited by the 3G8 antibody directed against FcgammaRIII (CD16).
En resumen, estos resultados demuestran que el ADCC provocado por el anticuerpo R297 y el anticuerpo DF5YB2/0 implica el FcgammaRIII expresado en la superficie de las células NK. In summary, these results demonstrate that ADCC elicited by antibody R297 and antibody DF5YB2 / 0 involves FcgammaRIII expressed on the surface of NK cells.
En el marco de la invención, una tercera serie de experimentos ha destacado un ensayo in vitro con la ayuda de célula Jurkat CD16 para evaluar la eficacia de anticuerpos anti-D. Los anticuerpos han sido incubados durante la noche con unos glóbulos rojos Rhesus positivo y unas células Jurkat CD16. La liberación de IL-2 en el sobrenadante ha sido evaluada mediante ELISA. Se ha observado una fuerte correlación entre el ADCC y la activación de las células Jurkat, lo cual implica que este ensayo se puede utilizar para realizar la discriminación de los anticuerpos anti-D en función de su reactividad frente a FcgammaRIII (CD16). Within the framework of the invention, a third series of experiments has highlighted an in vitro assay with the aid of the Jurkat CD16 cell to evaluate the efficacy of anti-D antibodies. The antibodies were incubated overnight with Rhesus positive red blood cells and Jurkat CD16 cells. The release of IL-2 in the supernatant has been evaluated by ELISA. A strong correlation between ADCC and Jurkat cell activation has been observed, implying that this assay can be used to discriminate anti-D antibodies based on their reactivity against FcgammaRIII (CD16).
Las mismas muestras son evaluadas en ADCC y en el ensayo Jurkat IL2. Los resultados se expresan en porcentaje del anticuerpo de referencia "LFB-R297". La curva de correlación entre las 2 técnicas tiene un coeficiente r2=0,9658 (figura 10). The same samples are evaluated in ADCC and in the Jurkat IL2 assay. The results are expressed as a percentage of the reference antibody "LFB-R297". The correlation curve between the 2 techniques has a coefficient r2 = 0.9658 (figure 10).
En conclusión, estos datos muestran la importancia de las modificaciones post-traduccionales de la estructura de los anticuerpos para su actividad ADCC específic del FcgammaRIII. La liberación de citoquinas tales como IL-2 refleja esta actividad. In conclusion, these data show the importance of post-translational modifications of the antibody structure for their specific ADCC activity of FcgammaRIII. The release of cytokines such as IL-2 reflects this activity.
Modelo de estudio: Células NK purificadas a partir de sangre periférica. Aplicaciones: refuerzo de una respuesta anti-tumoral. La IL1 induce una activación de los linfocitos T y de las células NK, pudiendo a su vez estimular la proliferación celular. El IFNγ estimula la actividad de las CTL y puede reforzar la actividad de los macrófagos. Study model: NK cells purified from peripheral blood. Applications: reinforcement of an anti-tumor response. IL1 induces an activation of T lymphocytes and NK cells, which in turn can stimulate cell proliferation. IFNγ stimulates CTL activity and can enhance macrophage activity.
Aplicaciones: refuerzo de la fagocitosis e inducción de propiedades anti-inflamatorias. El TNF estimula la proliferación de los macrófagos y de los linfocitos que infiltran los tumores. El IL-1Ra es una citoquina producida por los macrófagos que entra en competición con IL1 a nivel de su receptor y ejerce así un efecto anti-inflamatorio. Applications: reinforcement of phagocytosis and induction of anti-inflammatory properties. TNF stimulates the proliferation of macrophages and lymphocytes that infiltrate tumors. IL-1Ra is a cytokine produced by macrophages that competes with IL1 at the level of its receptor and thus exerts an anti-inflammatory effect.
Aplicaciones: inducción de una tolerancia específica a ciertos antígenos. La IL10 es una molécula inhibidora de la activación de diferentes células efectoras y de la producción de citoquinas. Applications: induction of a specific tolerance to certain antigens. IL10 is a molecule that inhibits the activation of different effector cells and the production of cytokines.
Se han estudiado tres poblaciones celulares: las polinucleares, las células mononucleadas y las células NK. Las síntesis de citoquinas son dependientes de la presencia de la diana. Existe poca diferencia en los perfiles de las citoquinas inducidas por el anticuerpo R297 y del anticuerpo policlonal anti-D. AD1 es muy frecuentemente no inductor de secreción de citoquinas. Three cell populations have been studied: polynuclear cells, mononuclear cells, and NK cells. Cytokine syntheses are dependent on the presence of the target. There is little difference in the profiles of the cytokines induced by the R297 antibody and the polyclonal anti-D antibody. AD1 is very frequently not an inducer of cytokine secretion.
Resultados: Results:
6.1 El anticuerpo monoclonal R297 y el policlonal WinRho inducen una secreción importante de IL8 en presencia de células mononucleadas. Esta secreción es dependiente de la concentración de anticuerpos y de la presencia de la diana antigénica. El anticuerpo AD1 es mucho menos efector (figura 11), es decir, capaz de inducir la producción de citoquinas. 6.1 The monoclonal antibody R297 and the polyclonal WinRho induce a significant secretion of IL8 in the presence of mononucleated cells. This secretion is dependent on the concentration of antibodies and the presence of the antigenic target. The AD1 antibody is much less effector (Figure 11), that is, capable of inducing cytokine production.
Con unas células mononucleadas (CMN), el anticuerpo monoclonal R297 y el policlonal WinRho inducen una secreción importante de TNF alfa, en menor medida aunque superior a AD1 una secreción de IL6, de IFN gamma, de IP10, de TNF alfa y de TGF beta. A la más alta concentración de anticuerpos, esta secreción de IL6, IFN gamma, IP10, aumenta, pero disminuye para el TNF alfa y el TGF beta (figura 12). With mononucleated cells (CMN), the monoclonal antibody R297 and the polyclonal WinRho induce a significant secretion of TNF alpha, to a lesser extent but higher than AD1 a secretion of IL6, IFN gamma, IP10, TNF alpha and TGF beta . At the highest antibody concentration, this secretion of IL6, IFN gamma, IP10, increases, but decreases for TNF alpha and TGF beta (Figure 12).
6.2 El anticuerpo monoclonal R297 y el policlonal WinRho inducen una secreción muy baja, pero superior a AD1, de IL2, de IFN gamma, de IP10 y de TNF por las polinucleares. Esta secreción es dependiente de la concentración de anticuerpos (figura 13). 6.2 The monoclonal antibody R297 and the polyclonal WinRho induce a very low secretion, but higher than AD1, IL2, IFN gamma, IP10 and TNF by polynuclear cells. This secretion is dependent on the concentration of antibodies (Figure 13).
6.3 El anticuerpo monoclonal R297 y el policlonal WinRho inducen una secreción importante de IFN gamma, de IP10 y de TNF por las células NK. Esta secreción es dependiente de la concentración de anticuerpos (figura 14). 6.3 The monoclonal antibody R297 and the polyclonal WinRho induce a significant secretion of IFN gamma, IP10 and TNF by NK cells. This secretion is dependent on the concentration of antibodies (Figure 14).
Introducción Introduction
Los primeros resultados han mostrado que los anticuerpos anti-D producidos en YB2/0 así como los anticuerpos policlonales utilizados en clínica inducían la producción de citoquinas, en particular de TNF alfa y de interferón gamma (IFN gamma) a partir de células NK purificadas o de células mononucleadas. Por el contrario, otros anticuerpos anti-D, producidos en otras líneas celulares son negativos en ADCC y resultan incapaces de inducir esta secreción. The first results have shown that the anti-D antibodies produced in YB2 / 0 as well as the polyclonal antibodies used clinically induced the production of cytokines, in particular of TNF alpha and interferon gamma (IFN gamma) from purified or NK cells. mononucleated cells. On the contrary, other anti-D antibodies produced in other cell lines are negative in ADCC and are unable to induce this secretion.
Los resultados complementarios siguientes muestran que este mecanismo no es exclusivo a los anti-D en presencia de hematíes Rhesus positivo sino se que aplica asimismo a los anticuerpos anti-CD20 y anti-HLA DR expresados en YB2/0. La expresión en CHO confiere al anticuerpo unas propiedades activadoras menos importantes. Esto está en correlación con los resultados obtenidos en ADCC. The following complementary results show that this mechanism is not exclusive to anti-D in the presence of Rhesus positive red blood cells but also applies to anti-CD20 and anti-HLA DR antibodies expressed in YB2 / 0. Expression in CHO confers less activating properties on the antibody. This is in correlation with the results obtained in ADCC.
Material Material
Anticuerpos Antibodies
Anti-CD20: el anticuerpo quimérico anti-CD20 transfectado en YB2/0 se compara con un anticuerpo comercial antiCD20 producido en CHO (Rituxan). Anti-CD20: YB2 / 0 transfected anti-CD20 chimeric antibody is compared to a commercial anti-CD20 antibody produced in CHO (Rituxan).
Anti-HLA DR: la misma secuencia que codifica para el anticuerpo quimérico anti-HLA DR se transfecta en CHO (B11) o YB2/0 (4B7). Anti-HLA DR: the same sequence that codes for the chimeric anti-HLA DR antibody is transfected into CHO (B11) or YB2 / 0 (4B7).
Células diana: células Raji que expresan en su superficie los antígenos CD20 y HLA-DR. Target cells: Raji cells that express CD20 and HLA-DR antigens on their surface.
Células efectoras: células NK humanas purificadas mediante selección negativa a partir de bolsa de sangre humana. Effector cells: human NK cells purified by negative selection from human blood bag.
Método Method
Se incuban diferentes concentraciones de anticuerpos anti-CD20 o anti-HLA DR con las células Raji (diana) y las células NK (efectoras). Después de 16 horas de incubación, las células se centrifugan. Los sobrenadantes se dosifican en TNF alfa e IFN gamma. Different concentrations of anti-CD20 or anti-HLA DR antibodies are incubated with the Raji cells (target) and the NK cells (effector). After 16 hours of incubation, the cells are centrifuged. The supernatants are dosed in TNF alpha and IFN gamma.
Resultados: Results:
7.1 TNF alfa: Los resultados expresados en pg/ml de TNF alfa dosificado en los sobrenadantes. En abscisas figuran las diferentes concentraciones de anticuerpos añadidos en la mezcla de reacción (figura 15). 7.1 TNF alpha: The results expressed in pg / ml of TNF alpha dosed in the supernatants. The abscissa shows the different concentrations of antibodies added in the reaction mixture (Figure 15).
Los anticuerpos anti-CD20 y anti-HLA DR quiméricos producidos en YB2/0 inducen unos porcentajes más importantes de TNF en presencia de su diana (Raji) con respecto a los mismos anticuerpos producidos en CHO. La cantidad de TNF alfa es muy dosis-dependiente de la concentración de anticuerpos añadida. A 10 ng/ml de anticuerpos, se induce 5 veces más TNF alfa con los anticuerpos producidos en YB2/0 con respecto a los anticuerpos producidos en CHO. The chimeric anti-CD20 and anti-HLA DR antibodies produced in YB2 / 0 induce higher percentages of TNF in the presence of their target (Raji) with respect to the same antibodies produced in CHO. The amount of TNF alpha is highly dose-dependent on the added antibody concentration. At 10 ng / ml of antibodies, 5 times more TNF alpha is induced with the antibodies produced in YB2 / 0 relative to the antibodies produced in CHO.
7.2 IFN gamma: Los resultados se expresan en pg/ml de IFN gamma dosificado en los sobrenadantes. En abscisas figuran las diferentes concentraciones de anticuerpos añadidos en la mezcla de reacción (figura 16). 7.2 IFN gamma: The results are expressed in pg / ml of IFN gamma dosed in the supernatants. The abscissa shows the different concentrations of antibodies added in the reaction mixture (Figure 16).
Los anticuerpos anti-CD 20 y anti-HLA DR quimérico producidos en YB2/0 inducen unos porcentajes más importantes de IFN gamma en presencia de su diana (Raji) con respecto a los mismos anticuerpos producidos en CHO. La cantidad de IFN gamma es muy dosis-dependiente de la concentración de anticuerpos añadidos. A todas las concentraciones utilizadas (0 a 200 ng/ml) el anticuerpo anti-HLA DR producido en CHO no induce ninguna secreción de IFN gamma, mientras que 40 ng/ml del anticuerpo producido en YB2/0 induce alrededor de 1.000 pg/ml de IFN gamma. The anti-CD 20 and anti-chimeric HLA DR antibodies produced in YB2 / 0 induce higher percentages of IFN gamma in the presence of their target (Raji) with respect to the same antibodies produced in CHO. The amount of IFN gamma is highly dose-dependent on the concentration of added antibodies. At all the concentrations used (0 to 200 ng / ml) the anti-HLA DR antibody produced in CHO does not induce any secretion of IFN gamma, while 40 ng / ml of the antibody produced in YB2 / 0 induces around 1,000 pg / ml IFN gamma.
Para el anticuerpo anti-CD20, se necesita menos de 10 ng/ml del anticuerpo producido en YB2/0 y 200 ng/ml del anticuerpo producido en CHO para inducir 300 pg/ml de IFN gamma (figura 16). For anti-CD20 antibody, less than 10 ng / ml of the antibody produced in YB2 / 0 and 200 ng / ml of the antibody produced in CHO are needed to induce 300 pg / ml IFN gamma (Figure 16).
Jefferis, R., Lund, J., Mizutani, H., Nakagawa, H., Kawazoe, Y., Arata, Y. y Takahashi, N. A comparative study of the N-linked oligosaccharides structure of human IgG Subclass proteins. Biochem. J., 268: 529-537 (1990). 5 Leatherbarrow, R.J., Rademacher, T.W., Dwek, R.A., Woof, J.M., Clark, A., Burton, D.R., Richardson, N. y Feinstein, Jefferis, R., Lund, J., Mizutani, H., Nakagawa, H., Kawazoe, Y., Arata, Y. and Takahashi, N. A comparative study of the N-linked oligosaccharides structure of human IgG Subclass proteins. Biochem. J., 268: 529-537 (1990). 5 Leatherbarrow, R.J., Rademacher, T.W., Dwek, R.A., Woof, J.M., Clark, A., Burton, D.R., Richardson, N. and Feinstein,
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Claims (4)
- 2. 2.
- Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal o monoclonal de especificidad anti-Rh D del glóbulo rojo humano. Method according to claim 1, characterized in that the antibody is a polyclonal or monoclonal antibody with anti-Rh D specificity for the human red blood cell.
- 3. 3.
- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque comprende además una etapa de Method according to one of claims 1 to 2, characterized in that it also comprises a step of
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-
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2003
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