ES2360698T3 - Vacunas mejoradas contra el antrax y procedimientos de administración. - Google Patents

Abstract

Una composición inmunógena contra el carbunco que comprende partículas sólidas secadas que tienen un diámetro de volumen medio de entre 35 µm y 300 µm, en la que al menos el 50% de dichas partículas secadas tiene un diámetro de volumen de hasta el 80% del medio, y dichas partículas secadas tienen una diámetro medio aerodinámico de entre 8 µm y 140 µm.

Description

Campo de la invención

La invención se refiere a composiciones inmunógenas contra el carbunco, tales como vacunas contra el carbunco y/o al uso de tales composiciones para preparar una vacuna contra el carbunco.

Antecedentes

En vista de los sucesos acaecidos el 11 de septiembre de 2001 y el pánico por el carbunco surgido en los meses posteriores, cada vez es más evidente que existe una necesidad urgente por nuevas vacunas de biodefensa para proteger a la población tanto militar como civil. Tal desarrollo de nuevas vacunas puede avanzar junto con el desarrollo de nuevas plataformas de administración para mejorar la eficacia de las vacunas candidatas y garantizar la seguridad y rápida utilización en el caso de una emergencia nacional. La virulencia de Bacillus anthracis, el agente causante del carbunco, está mediada por tres componentes proteicos principales: el antígeno protector (AP), el factor letal (FL) y el factor de edema (FE). Aunque estas proteínas no son tóxicas a nivel individual, en combinación, forman una toxina potencialmente letal. La exposición cutánea a las esporas de carbunco provoca una lesión cutánea que, por lo común, responde bien al tratamiento con antibióticos. Sin embargo, la inhalación de carbunco representa una amenaza mucho más temible. El diagnóstico temprano de la inhalación de carbunco es difícil y, a menudo, la enfermedad se manifiesta bruscamente en forma de insuficiencia respiratoria o colapso hemodinámico 2–4 días después de la aparición de los síntomas iniciales. La vacuna actualmente autorizada en Estados Unidos es la vacuna contra el carbunco absorbida (VCA), que está constituida por un filtrado de cultivo de una cepa no encapsulada toxígena de B. anthracis absorbido en hidróxido de aluminio como adyuvante. Aunque generalmente aporta una protección eficaz contra el carbunco en seres humanos, la vacuna actual se administra en una serie de 6 dosis durante 18 meses seguida después por recuerdos anuales. Así pues, existe la necesidad de producir vacunas contra el carbunco más seguras y potentes, p.ej.: para reducir el número de dosis necesarias para conseguir una inmunidad protectora. Una vacuna contra el carbunco candidata recientemente desarrollada se basa en un AP producido recombinantemente (Ivins, B.E., “Infection and Immunity”, 60:662–668, 1992; Ramirez, D.M., et al., J. Industrial Microbiol. and Biotechnol. 28:232–238, 2002). Esta vacuna está siendo investigada por USAMRIID como una alternativa a la VCA, debido a su potencial para mejorar la eficacia y así reducir el número de administraciones de recuerdo necesarias, así como mejorar el perfil de seguridad. Se requieren más estudios preclínicos y clínicos para determinar las vías de administración más eficaces para la protección y además para dilucidar los posibles requisitos para los adyuvantes. Los adyuvantes tales como el alumbre a menudo están asociados con reacciones cutáneas y otros efectos adversos; por tanto, una vacuna preferida conservaría la inmunogenicidad de la vacuna que contiene alumbre, pero no tendría los efectos secundarios asociados.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona composiciones inmunógenas contra el carbunco, tales como vacunas contra el carbunco y al uso de tales composiciones para preparar una vacuna contra el carbunco. Una realización de la invención es una composición inmnogénica contra el carbunco (p.ej., una vacuna contra el carbunco) que comprende partículas sólidas secadas que tienen un diámetro de volumen medio de entre 35 μm y 300 μm, en la que al menos el 50% de dichas partículas secadas tiene un diámetro de volumen de hasta el 80% del medio, y dichas partículas secadas tienen una diámetro medio aerodinámico de entre 8 μm y 140 μm. Tal composición se puede elaborar mediante los procedimientos descritos en la presente memoria y/o presenta las propiedades descritas en la presente memoria. Otras realizaciones de la invención incluyen el uso de las composiciones anteriores para preparar una vacuna contra el carbunco. Tal vacuna es adecuada para ser administrada intranasalmente, intradérmicamente (p.ej., usando microagujas huecas) y por abrasión tópica (p.ej., usando microagujas macizas). Las composiciones y las vacunas de la invención presentan varias ventajas. Por ejemplo, mejoran la inmunogenicidad y la eficacia protectora de las vacunas; pueden reducir o eliminar la necesidad de adyuvantes en las formulaciones de vacuna; proporcionan una administración mínimamente invasiva de las vacunas; y/o permiten la auto–administración de las vacunas. En una realización preferida, la vacuna es una vacuna para biodefensa, más preferiblemente, una vacuna contra el carbunco y, lo más preferible, una vacuna de antígeno protector recombinante (APr) contra el carbunco.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A es una vista desde arriba del extremo del mango de una realización preferida de un microabrasímetro.

La Figura 1B es una vista lateral de una realización preferida de un microabrasímetro.

La Figura 2A es una vista en perspectiva transparente del dispositivo de microabrasión de las Figuras 1A y 1B.

La Figura 2B es un corte transversal del dispositivo de microabrasión de las Figuras 1B.

La Figura 4 es una vista en perspectiva de la superficie abrasiva de la realización de la Figura 3. La Figura 4A es una vista lateral del corte transversal de la superficie abrasiva.

La Figura 5 es una vista inferior de la superficie abrasiva de la realización de la Figura 3.

Las Figuras 6A–6F muestran las concentraciones en suero del día 56 de los anticuerpos específicos de APr de los diversos isotipos de los grupos experimentales presentados en el Ejemplo 1.

Las Figuras 7A–7C muestran el porcentaje de viabilidad de los cultivos de monocitos tras la incubación con concentraciones líticas de AP y toxina letal (TL) de B. anthracis y suero diluido de ratones en diferentes grupos de vacunación.

La Figura 8 muestra el porcentaje de viabilidad de los cultivos de monocitos tras la incubación con concentraciones líticas de AP y toxina letal (TL) de B. anthracis y suero diluido de conejos en diferentes grupos de vacunación.

Descripción detallada de la invención

Según la presente invención, los términos “mejorar”, “mejorada” y “mejoras” en referencia a una vacuna pretenden significar que la vacuna produce una respuesta inmune más potente (es decir, proporciona una mayor inmunogenicidad) que la conseguida mediante las formulaciones convencionales y/o mediante las vías de administración de la vacuna convencionales. Las formulaciones convencionales incluyen, p.ej., APr en alumbre; y las vías de administración convencionales incluyen, p.ej., una administración intramuscular (IM) o subcutánea (SC). Los términos “mejorar”, “mejorada” y “mejoras” en este contexto también pueden significar que la vacuna produce una respuesta inmune protectora más potente que la conseguida mediante las formulaciones convencionales administradas por las vías de administración convencionales; y/o que la vacuna requiere un número menor de inmunizaciones para conseguir una respuesta inmune que el necesario para las formulaciones convencionales administradas mediante vías convencionales; y/o que la vacuna requiere un número menor de inmunizaciones para conseguir una respuesta inmune protectora que el necesario para las formulaciones convencionales administradas por las vías convencionales.

En un aspecto, la invención incluye una composición inmunógena contra el carbunco (p.ej., una vacuna o una composición farmacéutica contra el carbunco) en forma particulada que es adecuada para su administración intranasal a un paciente, y procedimientos para elaborar y usar tal composición. Por ejemplo, una realización es una composición inmunógena contra el carbunco en forma de partículas secadas elaborada mediante un procedimiento que comprende una o más de las siguientes etapas:

(i)

atomizar una formulación líquida de una composición inmunógena contra el carbunco para producir una formulación atomizada,

(ii)

congelar dicha formulación atomizada para formar partículas sólidas, y

(iii) secar dichas partículas sólidas para producir partículas secadas (p.ej., un polvo).

En realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la composición inmunógena contra el carbunco es una vacuna contra el carbunco, preferiblemente, una vacuna contra el carbunco absorbida (VCA), y más preferiblemente, una vacuna de antígeno protector recombinante (APr). La composición inmunógena contra el carbunco puede comprender o no adyuvante.

Las partículas secadas tienen un diámetro de volumen medio de entre 35 μm y 300 μm, en las que al menos el 50% de las partículas secadas tiene un diámetro de volumen de hasta el 80% del medio y en las que las partículas secadas tienen un diámetro aerodinámico medio de entre 8 μm y 140 μm.

En una realización preferida, las partículas secadas de la composición inmunógena contra el carbunco tienen un diámetro de volumen medio de entre 50 μm y 300 μm, más preferiblemente, de entre 50 μm y 100 μm, y/o las partículas secadas tienen un diámetro aerodinámico medio de entre 20 μm y 70 μm.

Con respecto a este procedimiento de fabricación de la composición inmunógena contra el carbunco (p.ej., vacuna contra el carbunco), la congelación se puede realizar introduciendo la formulación atomizada en un fluido o medio que tenga una temperatura inferior al punto de congelación de la formulación líquida; en la que, preferiblemente, el fluido o medio tiene un punto de ebullición o punto de sublimación menor del de dicha formulación atomizada. El fluido puede ser un gas o un líquido. Las partículas pueden ser secadas por liofilización; o aproximadamente a la presión atmosférica, en presencia de vibración, partes internas o agitación mecánica, o una combinación de las mismas y, opcionalmente, se pueden secar más mediante liofilización. La formulación líquida puede comprender un mucoadhesivo, p.ej., quitosán, sulfato de dermatán, condroitina o pectina. En una realización, la formulación líquida de la composición contra el carbunco está esencialmente constituida por dicha composición contra el carbunco y agua.

La invención también incluye una composición inmunógena contra el carbunco (p.ej., una vacuna contra el carbunco) preparada mediante la atomización de una formulación líquida de una composición inmunógena contra el carbunco para producir una formulación atomizada, de modo que tras congelar dicha formulación atomizada para formar partículas sólidas y secar dichas partículas sólidas para producir partículas secadas, dichas partículas secadas tienen un diámetro medio de entre 35 μm y 300 μm, y al menos el 50% de dichas partículas secadas tiene un diámetro de volumen de hasta el 80% del medio y dichas partículas secadas tienen un diámetro aerodinámico medio de entre 8 μm y 140 μm.

La invención también incluye una composición inmunógena contra el carbunco (p.ej., una vacuna contra el carbunco) que comprende partículas secadas que tienen un diámetro aerodinámico medio de entre 8 µm y 140 µm, y un diámetro de volumen medio de entre 35 µm y 300 µm, en la que al menos el 50% de dichas partículas secadas tiene un diámetro de volumen de hasta el 80% del medio, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición inmunógena contra el carbunco puede ser una vacuna contra el carbunco, p.ej., una vacuna VCA, o preferiblemente, una vacuna de APr.

Además, la invención incluye una composición inmunógena contra el carbunco (p.ej., una vacuna contra el carbunco) elaborada mediante un procedimiento que comprende:

(i)

atomizar una formulación líquida de una composición inmunógena contra el carbunco para producir una formulación atomizada que comprende gotas que tienen un diámetro medio de entre 35 µm y 300 µm,

(ii)

congelar dicha formulación atomizada para formar partículas sólidas y

(iii) secar dichas partículas sólidas para producir partículas secadas.

En una realización preferida, las partículas secadas tienen un diámetro de volumen medio de entre 35 µm y 300 µm. Preferiblemente, al menos el 50% de las partículas secadas tiene un diámetro de volumen de hasta el 80% del medio y dichas partículas secadas tienen un diámetro aerodinámico medio de entre 8 µm y 140 µm.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para preparar una composición inmunógena contra el carbunco (p.ej., una vacuna contra el carbunco). Una realización preferida de este aspecto de la invención es un procedimiento para preparar una composición inmunógena contra el carbunco que comprende:

(i)

atomizar una formulación líquida de una composición inmunógena contra el carbunco para producir una formulación atomizada,

(ii)

congelar dicha formulación atomizada para formar partículas sólidas y

(iii) secar dichas partículas sólidas para producir partículas secadas.

Las partículas secadas tienen un diámetro medio de entre 35 µm y 300 µm, al menos el 50% de dichas partículas secadas tiene un diámetro de volumen de hasta el 80% del medio y las partículas secadas tienen un diámetro aerodinámico medio de entre 8 µm y 140 µm. En realizaciones preferidas, dichas partículas secadas tienen un diámetro de volumen medio de entre 50 µm y 300 µm, preferiblemente, de entre 50 µm y 100 µm, y/o dichas partículas secadas tienen un diámetro aerodinámico medio de entre 20 µm y 70 µm. En realizaciones particulares de este procedimiento, la congelación se puede realizar introduciendo dicha formulación atomizada en un fluido o un medio que tiene una temperatura inferior al punto de congelación de la formulación líquida. Preferiblemente, el fluido

o el medio tienen un punto de ebullición o de sublimación inferior al de dicha formulación atomizada. El fluido puede ser un gas o un líquido. Las partículas pueden ser secadas por liofilización o aproximadamente a la presión atmosférica, en presencia de vibración, partes internas, agitación mecánica, o una combinación de las mismas. El secado también se puede realizar mediante una combinación de secado aproximadamente a la presión atmosférica, en presencia de vibración, partes internas, agitación mecánica o una combinación de las mismas, y liofilización. La formulación líquida puede comprender un mucoadhesivo, p.ej., quitosán, sulfato de dermatán, condroitina o pectina. En una realización particularmente preferida, la formulación líquida de la composición inmunógena contra el carbunco está esencialmente constituida por la composición inmunógena contra el carbunco y agua.

Otra realización de este aspecto de la invención es un procedimiento para preparar una vacuna inmunógena contra el carbunco que comprende atomizar una formulación líquida de una composición inmunógena contra el carbunco para producir una formulación atomizada, de modo que, tras congelar dicha formulación atomizada para formar partículas sólidas y secar dichas partículas sólidas para producir un polvo, el polvo secado comprende partículas Un aspecto más de la invención es el uso de las composiciones anteriores para preparar una vacuna contra el carbunco. Preferiblemente, la vacuna contra el carbunco es una vacuna contra el carbunco absorbida (VCA) o una vacuna de antígeno protector recombinante (APr). La vacuna contra el carbunco puede comprender además un adyuvante, pero preferiblemente está libre de adyuvantes. La vacuna contra el carbunco es adecuada para ser administrada intranasalmente y/o en una membrana mucosa.

Con la anterior vacuna contra el carbunco, se reduce la cantidad de vacuna contra el carbunco necesaria para producir un resultado eficaz tras la administración intranasal a un paciente en necesidad de la misma. Con la vacuna contra el carbunco, se puede provocar una respuesta inmune en un paciente. La vacuna contra el carbunco se puede usar en la vacunación de un paciente contra el carbunco. En una realización, la vacuna contra el carbunco se administra como parte de una pauta de estimulación más recuerdo. Las pautas de estimulación más recuerdo adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden determinar mediante una experimentación rutinaria.

La vacuna contra el carbunco anterior es adecuada para la administración intradérmica (ID) a un mamífero con una microaguja hueca (MAH). Por consiguiente, la vacuna contra el carbunco, tal como una vacuna contra el carbunco absorbida (VCA) o, preferiblemente, una vacuna de antígeno protector recombinante (APr), es adecuada para su administración intradérmica a través de al menos una aguja hueca que tenga una salida con una altura expuesta de entre 0 y 1 mm, siendo dicha salida introducida en la piel hasta una profundidad de entre 0,5 mm y 2 mm. La vacuna contra el carbunco puede comprender o no un adyuvante.

En una realización de esta vacuna contra el carbunco, es adecuado que ésta se administre con un dispositivo que comprenda una parte central que se pueda conectar a un depósito prellenable en el que se almacene la vacuna; al menos una microaguja hueca sostenida por dicha parte central y que tenga una punta delantera que salga de dicha parte central; y un tope que esté alrededor de dicha(s) microaguja(s) y que salga de dicha parte central hacia dicha punta delantera de dicha(s) microaguja(s), incluyendo dicho tope una superficie generalmente plana que se adapte a la piel extendiéndose en un plano generalmente perpendicular a un eje de dicha(s) microaguja(s) y que esté adaptada a ser recibida contra la piel de un mamífero para administrar una inyección intradérmica de la vacuna, extendiéndose dicha(s) punta(s) delantera(s) de la(s) microaguja(s) más allá de dicha superficie de adaptación a la piel una distancia de aproximadamente 0,5 mm a 2,0 mm, en el que dicho tope limita la penetración de la(s) microaguja(s) en la capa dérmica de la piel del mamífero. En realizaciones de este procedimiento, la administración de la composición inmunógena tiene lugar a una profundidad de entre 0,025 mm y 2,5 mm en la piel del mamífero; la composición inmunógena administrada provoca una respuesta inmune en el mamífero que es igual o mayor que la respuesta producida tras la administración de la misma cantidad de composición inmunógena con una inyección subcutánea o intramuscular; la composición inmunógena administrada provoca una respuesta inmune en el mamífero que es igual o mayor que la respuesta producida tras la administración de una cantidad mayor de composición inmunógena con una inyección subcutánea o intramuscular. Preferiblemente, la aguja es una microaguja de entre 0,23 y 0,025 mm (calibre 31 y 50), introducida perpendicularmente en la piel hasta una profundidad de entre 0,3 y 1,7 mm. En una realización de este procedimiento de administración, se administra una vacuna contra el carbunco como parte de una pauta de estimulación más recuerdo.

En otra realización más, la invención proporciona una vacuna contra el carbunco adecuada para una administración intradérmica de una cantidad eficaz de la composición contra el carbunco mediante al menos una aguja hueca. Preferiblemente, la aguja tiene una salida con una altura expuesta de entre 0 y 1 mm, introduciéndose la salida en la piel hasta una profundidad de entre 0,5 mm y 2 mm. Con el uso de éste y otros procedimientos similares de administración intradérmica, se mejora la eficacia protectora de una vacuna contra el carbunco.

La vacuna contra el carbunco es adecuada para provocar (inducir) una respuesta inmune en un paciente (o para vacunar a un paciente contra el carbunco), que comprende administrar intradérmicamente al paciente una cantidad eficaz de una composición inmunógena contra el carbunco (o de una vacuna contra el carbunco). En una realización preferida de este procedimiento, la composición se administra a través de al menos una aguja hueca que tiene una salida con una altura expuesta de entre 0 y 1 mm, introduciéndose la salida en la piel hasta una profundidad de entre 0,5 mm y 2 mm.

La vacuna contra el carbunco también puede ser adecuada para su administración tópica en la piel, que comprende excoriar la piel con un microabrasímetro de microaguja maciza (MAM) y aplicar la composición inmunógena bien antes, durante o después de la etapa de microabrasión. Este procedimiento de administración a veces se denomina en la presente memoria procedimiento de “abrasión tópica”, y se describe, entre otros documentos, en la solicitud estadounidense n.º 10/282.231 publicada como US 2003/0094341A1.

En una realización, se administra una vacuna contra el carbunco, tal como una vacuna contra el carbunco absorbida (VCA) o, preferiblemente, una vacuna de antígeno protector recombinante (APr), mediante la abrasión previa de la piel antes de la aplicación tópica de la composición contra el carbunco. La composición contra el carbunco administrada puede comprender un adyuvante. Preferiblemente, la abrasión de la piel se realiza al menos dos veces, y más preferiblemente, al menos seis veces, incluso de seis a doce veces o más. La abrasión de la piel se puede realizar en direcciones alternas o en la misma dirección. Preferiblemente, la vacuna se aplica en la piel en forma líquida y se puede aplicar a un dispositivo de abrasión, tal como un dispositivo revestido, o a uno que contenga un depósito para líquidos, o se puede aplicar por separado, bien antes o después de la etapa de abrasión. En una realización, simultáneamente a la abrasión, se reconstituye una composición inmunógena seca. Esto se puede realizar teniendo la composición inmunógena presente en forma de polvo o de otro sólido sobre una superficie abrasiva de un dispositivo de abrasión, siendo el líquido reconstituyente aplicado por separado sobre la piel antes de la abrasión o simultáneamente a la abrasión. En una realización preferida, la abrasión de la piel se realiza usando un dispositivo que comprende una disposición de microagujas macizas.

En una realización, la abrasión de la piel se realiza con un dispositivo que comprende una superficie abrasiva que comprende microprotuberancias troncocónicas o troncopiramidales que comprenden al menos un borde de raspado y que sobresalen de la superficie abrasiva. En realizaciones particulares, las microprotuberancias están, al menos parcialmente, revestidas de la vacuna contra el carbunco; siendo estas microprotuberancias de una longitud suficiente para penetrar en la capa córnea de la piel.

La presente invención también se refiere a kits que comprenden una cantidad eficaz de una vacuna contra el carbunco según lo definido anteriormente en la presente memoria y, opcionalmente, medios para administrar la composición inmunógena intranasalmente.

Otra realización de la invención es un kit para la administración intradérmica de una vacuna contra el carbunco. Por ejemplo, el kit puede comprender (a) un dispositivo de administración que tiene al menos una microaguja hueca diseñada para administrar intradérmicamente una sustancia hasta una profundidad de entre 0,025 y 2,5 mm, dispositivo de administración que comprende o está adaptado para recibir un recipiente que contiene una composición contra el carbunco, de modo que la microaguja está en contacto con el mismo, y (b) una cantidad eficaz (dosis) de la composición contra el carbunco. En realizaciones de este kit, la dosis está contenida en un depósito que forma parte del, o es capaz de ser funcionalmente conectado, al dispositivo de administración; la microaguja hueca es de entre 0,23 y 0,025 mm (calibre 31 y 50); o el dispositivo comprende una disposición de microagujas.

En una realización de este kit, el dispositivo comprende (a) una parte central que se puede conectar a un depósito prellenable en el que se almacena la vacuna; (b) al menos una microaguja sostenida por dicha parte central y que tiene una punta delantera que sale de dicha parte central; y (c) un tope alrededor de dicha microaguja y que sale de dicha parte central hacia dicha punta delantera de dicha microaguja, incluyendo dicho tope una superficie en general plana que se adapta a la piel que se extiende en un plano generalmente perpendicular a un eje de dicha microaguja y que está adaptada a ser recibida contra la piel de un mamífero para administrar una inyección intradérmica de la composición contra el carbunco, extendiéndose dicha punta delantera de la microaguja más allá de dicha superficie de adaptación a la piel una distancia de aproximadamente 0,5 mm a 2,0 mm, en el que dicho tope limita la penetración de la microaguja en la capa dérmica de la piel del mamífero.

En otra realización, el kit comprende (a) un medio de acceso dérmico diseñado para administrar intradérmicamente una composición contra el composición hasta una profundidad de entre 0,025 y 2,5 mm, medio de acceso dérmico que está adaptado para recibir un recipiente que contiene una composición contra el carbunco, de modo que el medio de acceso dérmico está en contacto con el mismo, y (b) una cantidad eficaz (dosis) de la composición contra el carbunco.

Otra realización de la invención es un kit para la administración de una vacuna contra el carbunco que comprende el uso de un microabrasímetro. Por ejemplo, en una realización, el kit comprende (a) un microabrasímetro que comprende una superficie abrasiva, en el que la superficie abrasiva comprende microprotuberancias troncocónicas o troncopiramidales que comprenden al menos un borde de raspado y que sobresalen de dicha superficie abrasiva, y

(b) una cantidad eficaz de una composición contra el carbunco. En realizaciones de este kit, la composición contra el carbunco reviste la superficie del microabrasímetro; la composición contra el carbunco está contenida en un depósito integrado en el microabrasímetro; o la composición contra el carbunco está envasada por separado en el kit.

Otra realización más de la invención es un kit para la administración de una vacuna contra el carbunco en la mucosa nasal que incluye la composición inmunógena contra el carbunco particulada o en polvo de la invención y un medio para su administración. Los dispositivos de administración adecuados se conocen en la técnica; por ejemplo, es posible administrar intranasalmente una sola dosis de medicamento en polvo usando un dispositivo que permita el almacenamiento del medicamento en un cartucho que tenga membranas que se puedan explotar o perforar cubriendo los extremos opuestos. Tales dispositivos se pueden accionar bien explotando o perforando mecánicamente estas membranas y expulsando el medicamento mediante el paso de un fluido a través del cartucho. En las solicitudes de patente estadounidense n.º 09/879.714 (presentada el 6/12/01) y 09/758.776 (presentada el 1/12/01) publicadas como US 2002/0092524A1 y US 2002/0092523A1, respectivamente, se describen dispositivos de este tipo.

Otros elementos opcionales de un kit de la invención incluyen tampones adecuados, componentes de los medios; recipientes; o materiales de envasado. Los reactivos del kit pueden estar en recipientes en los que los reactivos sean estables, p.ej., en forma liofilizada o líquidos estabilizados. Los reactivos también pueden estar en una forma de un solo uso, p.ej, en una sola forma farmacéutica para usarla como vacunas.

Composiciones contra el carbunco

Las composiciones inmunógenas contra el carbunco de la invención pueden adoptar cualquier forma adecuada. Por ejemplo, la composición puede comprender una mezcla de varias proteínas del carbunco, tal como la mezcla encontrada en la vacuna VCA, o puede comprender componentes individuales aislados o purificados de la bacteria del carbunco. Preferiblemente, la vacuna está esencialmente constituida sólo por una de las proteínas del carbunco (p.ej., una proteína recombinante), siendo la más preferible la proteína antígeno protector (AP), según lo descrito anteriormente (Ivins, B.E., “Infection and Immunity”, 60:662–668, 1992; Ramirez, D.M., et al., J. Industrial Microbiol. and Biotechnol. 28:232–238, 2002). Esta es la proteína del carbunco que se utiliza en los Ejemplos. También es probable que la presente invención se aplique a otros tipos de vacunas contra el carbunco, tales como las vacunas VCA y de plásmido de ADN (p.ej., Price et al., “Infection and Immunity”, 69:4509–4515, 2001).

Un polipéptido de la invención puede ser uno natural o se puede producir recombinantemente. (En la presente memoria, los términos polipéptido y proteína se usan indistintamente). Preferiblemente, un componente de polipéptido de la bacteria del carbunco, p.ej., la proteína PA, se produce recombinantemente. Los procedimientos para clonar secuencias adecuadas y generar vectores recombinantes en los que las secuencias de interés estén ligadas operativamente a las secuencias de control de la expresión adecuadas son habituales y convencionales. Los procedimientos más comunes (así como los procedimientos de Bilogía Molecular usados en otros aspectos de la invención) se describen, entre otras muchas fuentes, en Sambrook, J. et al. (1989) “Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, y Ausubel, F.M. et al. (1995). “Current Protocols in Molecular Biology”, NY, John Wiley & Sons. La expresión “secuencia de control de la expresión” significa una secuencia de polinucleótidos que regula la expresión de un polipéptido codificado por un polinucleótido al que está funcionalmente (“operativamente”) ligado. La expresión se puede regular al nivel de ARNm o de polipéptido. Así pues, la secuencia de control de la expresión incluye elementos relacionados con el ARNm y elementos relacionados con proteínas. Tales elementos incluyen promotores, potenciadores (virales o celulares), secuencias de unión al ribosoma, terminadores transcripcionales, etc. Una secuencia de control de la expresión está ligada operativamente a una secuencia codificante de nucleótidos cuando la secuencia de control de la expresión está colocada de manera que efectúe o realice la expresión de la secuencia codificante. Por ejemplo, cuando un promotor está ligado operativamente 5’ a la secuencia codificante, la expresión de la secuencia codificación es dirigida por el promotor. Las secuencias de control de la expresión adecuadas, tales como los promotores regulables o constitutivos potentes, serán evidentes para el experto en la técnica.

La invención engloba fragmentos funcionales o variantes funcionales de proteínas del carbunco de tipo natural. Un fragmento o una variante “funcional”, como se usa en la presente memoria, incluye un polipéptido que comprende cualquiera de una variedad de cambios (modificaciones), bien naturales o generadas deliberadamente, con la condición de que el polipéptido conserve al menos un epítopo que le permita ser inmunógeno. Preferiblemente, el fragmento o la variante conserva la capacidad de provocar (inducir) una respuesta protectora contra la infección por carbunco. El experto en la técnica puede determinar fácilmente si una variante o un fragmento dado presenta la propiedad deseada mediante el uso de procedimientos convencionales, tales como los revelados en la presente memoria. Las variantes alélicas naturales de las proteínas están englobadas en la invención.

Los polipéptidos usados en las composiciones o los procedimientos de la invención pueden ser fragmentos funcionales de proteínas de longitud completa. Se puede usar cualquier polipéptido de un tamaño (longitud) deseado, que varíe de un aminoácido más corto que la proteína de tipo natural a un péptido pequeño (p.ej., de 8–10 aminoácidos de longitud) que únicamente porte un solo epítopo y/o secuencia antigénica.

Los polipéptidos también pueden ser variantes funcionales. Por ejemplo, las variantes de polipéptido AP usadas en los procedimientos de la invención pueden presentar una identidad sustancial con partes comparables del AP de tipo natural. La expresión “identidad sustancial” o “similitud sustancial”, como se usa en la presente memoria, indica que un polipéptido (o un ácido nucleico) comprende una secuencia que tiene una identidad secuencial del al menos 90% con una secuencia de referencia o, preferiblemente, una identidad secuencial del al menos el 95%, o más preferiblemente, del al menos el 98% con la secuencia de referencia, en una franja de comparación de al menos 10 a 100 o más residuos de aminoácido o nucleótidos. Los procedimientos para determinar la identidad secuencial (entre ácidos nucleicos o proteínas) son los convencionales. Las alineaciones se pueden realizar usando cualquier algoritmo eficaz. Para las alineaciones por emparejamiento de secuencias de ADN, se pueden usar los procedimientos descritos por Wilbur–Lipman (p.ej., Wilbur et al. (1983), Proc. Natl. Acad Sci., 80, 726–730) o Martinez/Needleman–Wunsch (e.g., Martinez (1983), Nucleic Acid Res. 11, 4629–4634). Las parejas de secuencias proteicas se pueden alinear mediante el procedimiento de Lipman–Pearson (p.ej., Lipman et al. (1985), Science 227,1435–1441), p.ej., con la tupla k fijada en 2, la penalización por huecos fijada en 4 y la penalización por longitud de los huecos fijada en 12. Hay disponibles diversas fuentes comerciales y libres de programas de alineación, p.ej., MegAlign de DNA Star, BLAST (National Center for Biotechnology Information), BCM (Baylor College of Medicine) Launcher, etc. El porcentaje de identidad secuencial también se puede determinar mediante otros procedimientos convencionales, como p.ej, los descritos en Altschul et al.(1986), Bull. Math. Bio. 48, 603–616, 1986 y Henikoff et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89,10915–10919.

Las variantes de polipéptido de la invención incluyen polipéptidos que tienen una o más modificaciones, p.ej., inserciones, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones naturales (p.ej., a través de una mutación natural) o no naturales (p.ej., mediante la modificación deliberada, tal como mediante mutagénesis de sitio dirigida), bien conservadoras o no conservadoras. “Sustituciones conservadoras” pretende significar combinaciones, tales como Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. Las variantes pueden incluir, p.ej., homólogos, muteínas y miméticos. Se incluyen muchos tipos de modificaciones proteicas, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción. Las modificaciones posteriores a la traducción incluyen conjugados covalentes o agregativos naturales o producidos sintéticamente con otros restos químicos, p.ej., grupos glucosilo, lípidos, fosfatos, grupos acetilo, etc., así como la escisión tal como de uno o varios aminoácidos terminales. Véanse, p.ej.: las modificaciones reveladas en la patente estadounidense n.º 5.935.835. La invención también engloba variantes tales como los polipéptidos que tienen residuos de cisteína que no son esenciales para la actividad biológica eliminados o reemplazados por otros aminoácidos, evitando así la formación de enlaces de tipo disulfuro intramoleculares incorrectos; variantes naturales producto de cortes y empalmes alternos de ARNm; y formas alteradas que reflejan polimorfismo genético (p.ej., variación alélica). Otras variantes activas pueden comprender secuencias de péptidos añadidas, bien naturales o heterólogas, tales como, p.ej., secuencias líder, señal, secretoras, de dirección y enzimáticas. Además, el polipéptido se puede modificar mediante cualquiera de una variedad de modificaciones reconocidas en la técnica, tales como las de las variantes de polipéptido descritas en el documento US 2002/0052475.

Composiciones y procedimientos para la administración intranasal (IN)

Un aspecto de la presente invención se refiere a procedimientos para preparar composiciones farmacéuticas secadas, en forma particulada (p.ej., en un polvo), que sean adecuadas para una administración intranasal directa y a composiciones elaboradas mediante estos procedimientos. Tales partículas secadas también se pueden reconstituir en una forma líquida (acuosa) farmacéuticamente aceptable antes de su administración en la mucosa o en la piel.

Como se indica anteriormente, un aspecto de la invención es un procedimiento para preparar una composición inmunógena contra el carbunco (p.ej., una vacuna contra el carbunco) que comprende una o más de las siguientes etapas: atomizar una formulación líquida de una composición contra el carbunco para producir una formulación atomizada; congelar dicha formulación atomizada para formar partículas sólidas; y secar dichas partículas sólidas para producir partículas secadas. Preferiblemente, dicha formulación atomizada comprende gotas que tienen un diámetro de volumen medio (según lo definido por W. H. Finley, "The mechanics of inhaled pharmaceutical aerosols, an introduction", Academic Press, Londres, RU (2001)) de entre 35 μm y 300 μm. En una realización preferida, el polvo comprende partículas secadas que tienen un diámetro aerodinámico medio (según lo definido en W. H. Finley, supra) de entre 8 μm y 140 μm. Este procedimiento y las composiciones elaboradas mediante el procedimiento a veces se denominan en general en la presente memoria procedimiento o composiciones de “criodesecación por pulverizado” (CDP).

Las partículas de las composiciones farmacéuticas anteriores son de un tamaño, una densidad y/o una morfología apropiados para facilitar su administración intranasal. Sin el deseo de quedar vinculados a ninguna teoría en particular, se propone que, tras la administración intranasal, las composiciones descritas anteriormente se administran en las membranas mucosas, p.ej., del revestimiento nasal o de los senos nasales, a las que se adhieren, en lugar de ser impulsadas por las cavidades de los senos al sistema pulmonar, y que la adherencia a tales membranas mucosas permite una mayor velocidad de absorción que con otras formulaciones de composiciones terapéuticas o profilácticas. Cuando la composición de la invención es una vacuna, se reduce por tanto el tiempo necesario para elevar una respuesta eficaz de los anticuerpos, y se aumenta la inmunidad de las mucosas (p.ej., la mediada por una respuesta de IgA). La administración intranasal de tales vacunas de la invención provoca respuestas inmunes de IgA tanto sistémicas como nasomucosales.

Como se indica anteriormente, otro aspecto de la invención es un procedimiento para preparar una composición inmunógena contra el carbunco (p.ej., una vacuna contra el carbunco) que comprende una o más de las siguientes etapas: atomizar una formulación líquida de una composición contra el carbunco para producir una formulación atomizada; congelar dicha formulación atomizada para formar partículas sólidas; y secar dichas partículas sólidas a aproximadamente la presión atmosférica en presencia de vibración, partes internas, agitación mecánica o una combinación de las mismas, para producir partículas secadas (p.ej., para producir un polvo). “Aproximadamente la presión atmosférica” pretende significar una presión que varía de aproximadamente media atmósfera a aproximadamente cinco atmósferas. “Secar” pretende significar eliminar los componentes volátiles de formulación de las partículas congeladas sólidas. Preferiblemente, el polvo comprende partículas secadas que tienen un diámetro de volumen medio de entre 35 µm y 300 µm, más preferiblemente, de entre 50 µm y 300 µm, y/o las partículas secadas tienen un diámetro aerodinámico medio de entre 8 µm y 140 µm. Preferiblemente, las partículas sólidas congeladas están en estado fluidificado, pues están siendo secadas. Este procedimiento y las composiciones elaboradas mediante el procedimiento a veces se denominan en la presente memoria procedimiento o composiciones de “criodesecación atmosférica por pulverizado”. Una ventaja de las composiciones producidas mediante este procedimiento es que no se aglomeran.

En las solicitudes de patente estadounidenses n.º 10/299.012 y 10/299.010 publicadas como US 2003/0180755A1 y US 2003/0186271A1, respectivamente, se puede encontrar otra descripción de los procedimientos y las composiciones de “criodesecación por pulverizado” y “criodesecación atmosférica por pulverizado”.

Otras ventajas de las composiciones de la invención son que las composiciones son fácilmente pulverizables, ofrecen buenas estabilidad, esterilidad, dosis emitida y conservación de la bioactividad, dejan poco residuos en el dispositivo de administración, tal como un dispositivo de inhalación, y se reconstituyen fácilmente en líquido. Las partículas pueden presentar una densidad de compactación baja, lo que facilita la pulverización de las partículas, p.ej., para una administración respiratoria. Hay niveles bajos de partículas finas, lo que facilita su manipulación. Los procedimientos de la invención permiten una distribución bien controlada de los tamaños de partícula. Por lo tanto, las composiciones de la invención comprenden una distribución bien controlada de los tamaños de partícula. La morfología de las partículas reduce su posibilidad de aglomeración y además facilita la pulverización. Las composiciones son estables en ausencia de refrigeración, lo que permite un almacenamiento y un transporte más prácticos y menos caros que, p.ej., las formulaciones líquidas. Las composiciones de la invención son particularmente adecuadas para vacunaciones en masa. En una realización de la invención, las composiciones de la invención se administran mediante una administración respiratoria (p.ej., intranasal). Las composiciones de la invención son particularmente adecuadas para una administración intranasal, pues la distribución bien controlada del tamaño de partícula permite dirigirlas de manera precisa a la mucosa nasal. Las ventajas de una administración respiratoria en comparación con una administración por inyección (p.ej., intradérmica o subdérmica) incluyen un mejor cumplimiento terapéutico por parte del paciente y mayores respuestas inmunes. La administración respiratoria también es ventajosa porque es un procedimiento no invasivo, que resulta indoloro y fácil de realizar.

Una composición inmunógena de la invención se puede formular inicialmente como una formulación líquida usando cualquiera de una variedad de los líquidos convencionales. Preferiblemente, el líquido es uno acuoso, tal como, p.ej., agua (p.ej., agua de calidad inyectable) o cualquiera de una variedad de tampones convencionales, que pueden contener o no otras sales. El pH del tampón será generalmente seleccionado para estabilizar la proteína, y será determinado por los expertos en la técnica. Generalmente, éste estará en el intervalo del pH fisiológico. Por lo tanto, los intervalos de pH preferidos de la formulación líquida inicial son de 1 a 10, siendo el particularmente preferido de 3 a 8, y el especialmente preferido de 5 a 7. Como los expertos en la técnica apreciarán, se puede usar un gran número de tampones adecuados. Los tampones adecuados incluyen, pero no se limitan a, acetato sódico, citrato sódico, succinato sódico, bicarbonato y carbonato de amonio. En general, los tampones se usan en molaridades de 1mM a 2M, preferiblemente, de 2mM a 1M y, especialmente preferiblemente de 10mM a 0,5M, siendo la molaridad particularmente preferida la de 50 a 200mM. En general, las sales, si están presentes en la solución líquida, se usan en molaridades de 1mM a 2M, preferiblemente, de 2mM a 1M y, especialmente preferiblemente de 10mM a 0,5M, siendo la molaridad particularmente preferida de 50 a 200mM. Las sales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, NaCl.

La formulación líquida puede estar en cualquiera de una variedad de formas, p.ej., una solución, una suspensión o un coloide. Opcionalmente, la formulación líquida puede comprender uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables convencionales. “Excipientes” se refiere en general a compuestos o materiales que se añaden para aumentar la eficacia de una formulación de un ingrediente farmacéutico activo (IFA). Los ejemplos incluyen, p.ej., crioprotectores y lioprotectores que se añaden para garantizar o aumentar la estabilidad de la proteína durante el procedimiento de criodesecación por pulverizado o criodesecación atmosférica por pulverizado, y después, para proporcionar una estabilidad y fluidez a largo plazo al producto en polvo. Los protectores adecuados están, en general, relativamente libres de sólidos particulados sueltos, no se espesan ni se polimerizan al entrar en contacto con el agua, son esencialmente inocuos cuando son inhalados por un paciente o introducidos de otro modo en un paciente, y no interactúan significativamente con el agente terapéutico de una manera que modifique su actividad biológica. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, proteínas, tales como la albúmina de suero bovino y humano, gelatina, inmunoglobulinas, hidratos de carbono, incluyendo monosacáridos (galactosa, D– mannosa, sorbosa), disacáridos (lactosa, trehalosa, sacarosa), ciclodextrinas y polisacáridos (rafinosa, maltodextrinas, dextranos); un aminoácido, tal como glutamato monosódico, glicina, alanina, arginina o histidina, así como aminoácidos hidrófobos (triptófano, tirosina, leucina, fenilalanina); una metilamina, tal como betaína; una sal excipiente, tal como sulfato de magnesio; un poliol, tal como alcoholes de azúcar trihídricos o superiores, p. ej. glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol; propilenglicol; polietilenglicol; plurónicos; tensioactivos; y combinaciones de los mismos. Los excipientes preferidos incluyen, p.ej., trehalosa, sacarosa y manitol. Otra clase de excipiente, los mucoadhesivos, se usan a menudo para aumentar el contacto de un IFA con las superficies mucosas. Los ejemplos de mucoadhesivos incluyen, p.ej., quitosán, sulfato de dermatán, condroitina y pectina. Además, se pueden añadir codisolventes convencionales que mejoren la solubilidad de los IFA a formulaciones líquidas adecuadas para los procedimientos de CDP revelados en la presente memoria.

En general, cuando se usan mucoadhesivos, éstos se usan en cantidades que varían del 1 al 95% en peso; preferiblemente, del 1 al 50% en peso; especialmente preferiblemente, del 5 al 50% en peso; y particularmente preferiblemente del 5 al 20% en peso. En general, los crioprotectores se usan a una concentración de entre el 5 y el 95% en peso.

En una realización, los polvos secados de la invención se combinan después con agentes de carga o vehículos, que se usan para reducir la concentración del agente terapéutico del polvo que se está administrando a un paciente; es decir, puede ser deseable tener mayores volúmenes de material por unidad de toma. Los agentes de carga también se pueden usar para mejorar la dispersabilidad del polvo en el dispositivo de dispersión y/o para mejorar las características de manipulación del polvo. Esto se distingue del uso de los agentes de carga o los vehículos durante el procedimiento de secado mediante pulverización. Los agentes de carga adecuados son generalmente cristalinos (para evitar la absorción del agua) e incluyen, pero no se limitan a, lactosa y manitol. Por consiguiente, si se añaden agentes de carga, tales como la lactosa, la adición se puede realizar en proporciones variables, siendo preferible de

99:1 de un agente terapéutico de interés con respecto al agente de carga a 1:99; más preferiblemente, de 1:5 a 5:1; y especialmente preferiblemente, de 1:10 a 1:20.

Las formulaciones líquidas de la invención se pueden atomizar mediante cualquiera de una variedad de procedimientos convencionales. Por ejemplo, el líquido se puede pulverizar a través de una boquilla de doble chorro, una boquilla a presión o un disco giratorio, o puede ser atomizado con un nebulizador ultrasónico o un generador de aerosol de orificio vibrante (VOAG). En una realización, se atomiza una formulación líquida con una boquilla a presión, tal como una boquilla AccuSpra™ de BD.

En una realización preferida, se optimizan las condiciones de atomización de modo que el diámetro de masa medio de las gotas atomizadas (p.ej., gotas nebulizadas) sea de al menos 20 μm, preferiblemente, de entre 35 μm y aproximadamente 300 μm; más preferiblemente, de entre 50 μm y 300 μm; incluso más preferiblemente, de entre 50 μm y 100 μm. Los procedimientos para optimizar la generación de gotas de un tamaño deseado son convencionales. Entre las condiciones que se pueden variar están el flujo del gas de atomización, la presión del gas de atomización y el caudal del líquido. Además, se puede variar el tipo y el tamaño de la boquilla. El tamaño de la gota de líquido se puede medir fácilmente usando técnicas convencionales, tales como la difracción láser. El tamaño de las partículas secadas se puede medir mediante técnicas convencionales, tales como, p.ej., microscopía electrónica de barrido (SEM) o difracción láser.

En una realización, en la que se secan partículas atomizadas congeladas a aproximadamente la presión atmosférica, como se describe en otra parte de la presente memoria, el tamaño de las gotas atomizadas puede ser, p.ej., de al menos aproximadamente 20 μm, preferiblemente, de entre 20 μm y 300 μm; más preferiblemente, de entre 35 μm y 100 μm o de entre 50 μm y 100 μm.

Tras la atomización de una formulación líquida, se pueden congelar rápidamente las gotas para formar partículas sólidas. Preferiblemente, las gotas se congelan inmediatamente, o sustancialmente de inmediato, tras la etapa de atomización.

En una realización, las gotas se congelan sumergiéndolas en un líquido frío que esté por debajo del punto de congelación de la formulación líquida a partir de la que se formaron las gotas atomizadas. En una realización preferida, la temperatura del líquido frío es de –200°C a –80°C, más preferiblemente, de entre –200°C a –100°C, lo más preferible a –200°C (el nitrógeno líquido está a –196°C). Se puede usar cualquier líquido frío adecuado, incluyendo nitrógeno líquido, argón e hidrofluoroéteres, o un líquido comprimido, tal como CO2, helio, propano o etano líquido comprimido, o líquidos inertes equivalentes, como se conoce ampliamente en la técnica. Por ejemplo, en una realización, se atomiza una preparación líquida de una composición contra el carbunco a través de una boquilla de pulverización que está colocada sobre un recipiente que contiene un líquido frío adecuado, tal como, p.ej., nitrógeno líquido. Las gotas se congelan instantáneamente al ponerse en contacto con el líquido frío.

En otra realización, las gotas se congelan mediante su paso a través de un gas (p.ej., aire frío, nitrógeno, helio o argón), en una cámara de enfriamiento, en la que el gas está por debajo del punto de congelación de las gotas. En una realización preferida, el gas frío está de –5°C a –60°C, más preferiblemente, entre –20°C a –40°C. El gas se puede enfriar mediante procedimientos convencionales, tales como serpentines de enfriamiento, intercambiadores de calor o condensadores enfriadores. La temperatura del gas se puede reducir con procedimientos convencionales, p.ej., con nitrógeno líquido, dióxido de carbono sólido o un agente criogénico equivalente para producir las temperaturas de subcongelación.

Tras la formación de las partículas congeladas sólidas, se secan las partículas para producir un polvo. “Seco” significa que tiene una cantidad irrelevante de líquido, p.ej., que tiene un contenido de humedad de modo que las partículas sean fácilmente dispersables para formar un aerosol, p.ej., en un dispositivo de inhalación. Este contenido de humedad es generalmente inferior al 15% en peso de agua, siendo lo preferido que sea menor del 10%, y particularmente preferiblemente, menor del 1% al 5%.

En una realización de la invención, las gotas congeladas se secan mediante liofilización (criocongelación al vacío) con un aparato de liofilización convencional. Este procedimiento se denomina en general procedimiento de “criodesecación por pulverizado” o CDP, y las composiciones elaboradas mediante el procedimiento se denominan composiciones de “criodesecación por pulverizado” o CDP. Por ejemplo, en una realización, cuando se han congelado las partículas pulverizándolas en un recipiente (tal como un matraz de criodesecación de Virtis) que contiene nitrógeno líquido, se puede conectar el recipiente a un liofilizador convencional y evaporar el exceso de nitrógeno líquido. El aerosol congelado comúnmente se seca en aproximadamente 48 horas y alcanza un nivel de humedad inferior al aproximadamente 1% en peso. Alternativamente, las gotas, que han sido congeladas en aire frío a aproximadamente la presión atmosférica y que, opcionalmente, han sido parcialmente secadas a aproximadamente la presión atmosférica (como se describe más adelante), se pueden colocar en un matraz de liofilización y someterlas a una liofilización.

En otra realización, las gotas congeladas se secan mediante sublimación en una corriente de gas frío desecado (p.ej., aire, nitrógeno o helio) a aproximadamente la presión atmosférica. “Aproximadamente la presión atmosférica” pretende significar en la presente memoria una presión que varía de aproximadamente media atmósfera a aproximadamente cinco atmósferas. La temperatura del gas se puede reducir mediante cualquiera de una variedad de procedimientos convencionales, p.ej., con nitrógeno líquido, dióxido de carbono sólido o un agente criogénico equivalente. Las partículas de la invención que son secadas de tal manera se denominan, a veces, en la presente memoria partículas “criosecadas por pulverización atmosférica”. En una realización preferida, las gotas atomizadas se congelan y se secan en una cámara de “criodesecación atmosférica por pulverizado”, lo que permite llevar a cabo los procedimientos de congelación y secado en una sola etapa.

En Leuenberger, USP 4.608.764, se revela un aparato y un procedimiento para secar partículas sólidas congeladas en aire frío a aproximadamente la presión atmosférica. Véanse también los ejemplos de las solicitudes de las patentes estadounidenses n.º 10/299.012 y 10/299.010 publicadas como US 2003/0180755A y US 2003/0186271A1, respectivamente. También se pueden usar otros tipos de aparatos convencionales, como sabrán los expertos en la técnica.

En una realización preferida, las partículas atomizadas congeladas son secadas en un gas frío a aproximadamente la presión atmosférica en presencia de condiciones que aumentan la fluidificación de las partículas. En una realización más preferida, las partículas atomizadas congeladas se secan en presencia de vibración, partes internas, agitación mecánica o combinaciones de las mismas, durante el procedimiento de secado. La expresión “partes internas”, como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier obstáculo físico del interior de una cámara (p.ej., la cámara de CDP) o lecho fluidificado, tal como, p.ej., cuchillas, placas u otros obstáculos. Tales tratamientos permiten que las partículas alcancen un estado fluidificado y ayudan a evitar la canalización.

En otra realización, las gotas congeladas se secan mediante una combinación de la sublimación en una corriente de gas desecado frío (p.ej. aire) a aproximadamente la presión atmosférica, según lo descrito anteriormente, y la liofilización. Por ejemplo, se retira a un liofilizador una composición que ha sido parcialmente secada a aproximadamente la presión atmosférica (p.ej., para formar una torta o un polvo que siga conteniendo cantidades no deseables de líquido), en el que sigue secando la composición.

Se pueden usar procedimientos convencionales para recoger las composiciones secadas. En una realización, las partículas secadas se recogen sobre un se filtra, del que pueden ser retiradas para su uso en, p.ej., aplicaciones médicas. En otra realización, las partículas secadas mediante criodesecación atmosférica por pulverización se recogen en un recipiente de productos. Las partículas parcialmente secadas pueden formar una torta suelta de la que se puede eliminar la humedad restante mediante una mayor sublimación atmosférica en una corriente de aire desecado frío u, opcionalmente, pueden ser retiradas a un liofilizador o a otro dispositivo adecuado para seguir secándola bajo una presión reducida (por debajo de la presión atmosférica).

Las partículas secadas mediante cualquiera de los procedimientos anteriores presentan sustancialmente las mismas Tras el procedimiento de secado, una composición de la invención puede adoptar la forma de un polvo suelto. Las partículas porosas secas de la composición son aproximadamente del mismo tamaño (diámetro geométrico) y de la misma forma que las gotas congeladas antes de secarlas.

Las partículas secadas de la invención presentan propiedades aerodinámicas deseables, muestran una morfología deseable (como las mostradas mediante SEM) y una densidad deseable. Además, las partículas presentan menores cantidades de polvo residual en el dispositivo de administración tras su uso, presentan una estabilidad mayor que, p.ej., las formulaciones líquidas de insulina y se reconstituyen fácilmente en líquido.

Un aspecto de la invención es el uso de una composición inmunógena contra el carbunco producida mediante un procedimiento de la invención para preparar una vacuna contra el carbunco, siendo adecuado administrar una cantidad eficaz de carbunco a un paciente. “Cantidad eficaz” pretende significar en la presente memoria una cantidad que es eficaz para producir una respuesta deseada. Por ejemplo, una cantidad eficaz de una composición inmunógena es una cantidad que es eficaz para producir una respuesta inmune detectable. Es posible determinar empíricamente una dosis eficaz según procedimientos convencionales, teniendo en cuenta factores ampliamente conocidos, tales como la edad, el peso y/o el estado clínico del paciente, el procedimiento de y la planificación de la administración. En cuanto a la vacuna revelada en la presente memoria, el paciente puede ser cualquier animal, preferiblemente, un mamífero tal como, p.ej., un animal de granja u otro animal doméstico, rata, ratón, hámster, conejillo de Indias o conejo, preferiblemente, un ser humano.

Las vacunas de la invención son adecuadas para ser administradas mediante cualquiera de una variedad de vías que son conocidas por el experto en la técnica, incluyendo la vía respiratoria, y preferiblemente, la vía intranasal. En una realización, la vacuna es adecuada para ser administrada en un tejido mucoso, tal como un tejido mucoso de los conductos y senos nasales. En una realización preferida, la vacuna de la invención es adecuada para ser administrada a un paciente en necesidad de la misma a través del sistema respiratorio. “Administración a través del sistema respiratorio” o “administración respiratoria” pretende significar en la presente memoria que se administra un agente en la nariz (intranasalmente) o en los pulmones (administración pulmonar).

Se pueden usar procedimientos convencionales de administración. Los aplicadores adecuados (p.ej., inhaladores) son conocidos en la técnica. Los dispositivos de administración más comunes incluyen, pero no se limitan a, los dispositivos revelados en las solicitudes de patente estadounidense n.º 09/879.714 (presentada el 12/6/01) y 09/758.776 (presentada el 12/1/01) publicadas como US 2002/0092524A1 y US 2002/0092523A1, respectivamente. En una realización preferida, el dispositivo usado para una administración nasal es un aparato “Solovent”. Las dosis que se van a administrar se pueden determinar mediante procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Véase, p.ej., “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Goodman and Gilman, eds., Macmillan Publishing Co., Nueva York. Los factores a tener en consideración incluyen la actividad del agente específico implicado, la estabilidad metabólica y la duración de la acción del agente, el modo y el momento de administración, la combinación de fármacos, la velocidad de excreción, la especie que esté siendo tratada y la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta y la gravedad de los estados patológicos concretos del huésped sometido a la terapia. Las dosis para producir una respuesta inmune eficaz (p.ej., las dosis para una vacunación eficaz) son ampliamente conocidas por los expertos en la técnica.

La invención también incluye un receptáculo de unidades de toma o un inhalador de polvo seco que comprende una cantidad eficaz de una composición inmunógena contra el carbunco (p.ej., una vacuna contra el carbunco) de la invención.

La vacuna de la invención produce un mayor efecto terapéutico tras una administración intranasal de lo que lo hacen las formulaciones líquidas. Véase, p. ej., el Ejemplo 11. Por lo tanto, es posible reducir la cantidad de composición inmunógena contra el carbunco de la vacuna contra el carbunco necesaria para producir un resultado eficaz tras la administración intranasal a un paciente en necesidad de la misma.

La vacuna de la invención provoca (induce) una respuesta inmune en un paciente tras ser administrada al paciente. La expresión “respuesta inmune”, como se usa en la presente memoria, engloba, por ejemplo, mecanismos mediante los que un organismo multicelular produce anticuerpos contra un material antigénico que invade las células del organismo o el fluido extracelular del organismo. El anticuerpo producido de este modo puede pertenecer a cualquier clase inmunológica, tal como inmunoglobulinas A, D, E G o M. También se incluyen otros tipos de respuestas, por ejemplo, la inmunidad celular, tal como la inducción de linfocitos T citotóxicos. La respuesta inmune hacia los antígenos está ampliamente estudiada y extensamente publicada. Por ejemplo, en Roitt I., (1994), se proporciona un estudio sobre inmunología. “Essential Immunology”, Blackwell Scientific Publications, Londres. Los procedimientos en inmunología son habituales y convencionales (véase, p.ej, “Currents Protocols in Immunology”; editado por John

E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.).

En un aspecto, la composición inmunógena contra el carbunco es una vacuna contra el carbunco (una vacuna usada para estimular el sistema inmune de un organismo vivo de manera que proporcione protección contra una futura infección por carbunco). Es decir, la vacuna puede producir la mejoría de al menos alguno de los síntomas engendrados por la infección con carbunco. Las plataformas de administración y los procedimientos descritos en la presente memoria también serían aplicables a procedimientos de terapia génica para introducir ácidos nucleicos que codifiquen el AP del carbunco.

El carbunco por inhalación entra en el cuerpo y ejerce sus efectos patofisiológicos a través de las membranas mucosas nasales. Es posible proporcionar una protección contra la infección en un primer punto de entrada neutralizando los agentes infecciosos con IgA mucosa localmente producida. Aunque las respuestas inmunes sistémicas se producen fácilmente mediante las vías tradicionales de inmunización (tales como la IM, ID), en general, las respuestas mucosas son más difíciles de conseguir. Una ventaja de la administración intranasal (IN) de la vacuna en polvo seco es su capacidad para producir una respuesta inmune tanto sistémica como mucosa. Además, la administración de la vacuna en polvo IN puede reducir la dosis necesaria, debido a la eficacia de la ingesta del fármaco en polvo por vía mucosa.

Procedimientos de administración intradérmica (ID) con microagujas huecas (MAH) o microagujas macizas (MAM)

En un aspecto, la presente invención utiliza “microagujas”, tanto “huecas” como “sólidas” para administrar una vacuna de APr contra el carbunco en la piel. Según la presente invención, las microagujas “huecas” son pequeñas microproyecciones que permiten una administración intradérmica (ID) reproducible. Los dispositivos compuestos por tales estructuras de microaguja y mecanismos de conducción de líquidos adecuados son conocidos en la técnica. En las solicitudes estadounidenses n.º 10/028.988, presentada el 28 de diciembre de 2001, publicada como US 2003/0100885A1, y 10/185.717, presentada el 1 de julio de 2002, publicada como US 2002/0198509A1 y WO 02/02179 A1, se describen detalladamente estructuras de microaguja “hueca” y mecanismos de conducción de líquidos adecuados.

La administración con microagujas huecas (MAH) permite la administración en un espacio intradérmico de la piel de un mamífero. Se puede administrar una composición inmunógena contra el carbunco, p.ej., a través de una aguja hueca de poco calibre que tenga una salida con una altura expuesta de entre 0 y 1 mm, siendo dicha salida insertada en la piel hasta una profundidad de entre 0,3 mm y 2 mm, de modo que la administración de la sustancia tenga lugar a una profundidad de entre 0,3 mm y 2 mm. Se he descubierto que usando el procedimiento de la invención, la cantidad eficaz es menor que la necesaria para la administración mediante una inyección intramuscular para alcanzar un efecto inmunógeno, tal como una inmunidad protectora.

Un beneficio de la invención es que la administración ID con una mayor inmunogenicidad permite efectos biológicos equivalentes aunque se use menos de una composición inmunógena. Esto redunda en un beneficio económico directo para el fabricante y quizás también para el consumidor, especialmente, para una preparación de vacuna cara. Asimismo, una mayor inmunogenicidad permite una menor dosis total y disminuye los efectos secundarios asociados con dosis altas en el paciente.

Anatómicamente, la superficie exterior del cuerpo está formada por dos capas principales de tejido, una epidermis externa y una dermis subyacente, que conjuntamente constituyen la piel (para más información, véase “Physiology, Biochemistry, and Molecular Biology of the Skin”, Segunda edición, L.A. Goldsmith, Ed., Oxford University Press, Nueva York, 1991). La epidermis se divide en cinco capas o estratos de un espesor total de entre 75 y 150 μm. Bajo la epidermis se encuentra la dermis, que contiene dos capas, una parte exterior denominada dermis papilar y una capa más profunda denominada dermis reticular. La dermis papilar contiene enormes plexos linfáticos y sanguíneos microcirculatorios. Por el contrario, la dermis reticular es relativamente acelular y avascular, y está formada por un denso tejido conjuntivo colagenoso y elástico. Bajo la epidermis y la dermis está el tejido subcutáneo, también denominado hipodermis, que está compuesto por tejido conjuntivo y tejido graso. El tejido muscular se encuentra bajo el tejido subcutáneo.

Los expertos en la técnica saben que el espesor cutáneo varía, tanto entre los individuos como entre las diferentes zonas del cuerpo de un determinado individuo. Así pues, en función de la ubicación de la administración, variará la profundidad de la administración necesaria para dirigirse al espacio ID.

El sujeto de la administración intradérmica de la presente invención es un mamífero, preferiblemente, un ser humano. El reactivo biológicamente activo, con o sin reactivo trazador, puede ser administrado en el espacio intradérmico mediante una aguja o cánula, habitualmente, de 300 μm a 5 mm de longitud. Preferiblemente, la aguja o la cánula tienen de 300 μm a 1 mm de longitud, siendo la salida introducida en la piel del sujeto hasta una profundidad de 1 mm a 3 mm. Preferiblemente, se usa una aguja de poco calibre de entre 0,25 y 0,13 mm (calibre 30 y 36), preferiblemente, de 0,23 y 0,16 mm (calibre 31–34). La salida de la aguja o la cánula se introduce preferiblemente hasta una profundidad de 0,3 mm (300 μm) a 1,5 mm.

La composición inmunógena contra el carbunco se puede infundir o, preferiblemente, administrar en forma de bolo. Como se usa en la presente memoria, el término “bolo” pretende significar una cantidad que se administra en un período de tiempo de menos de diez (10) minutos. “Infusión” pretende significar la administración de una sustancia en un período de tiempo mayor de diez (10) minutos. Se entiende que la administración de un bolo se puede llevar a cabo con medios que controlen la velocidad, por ejemplo, una bomba, o sin medios específicos que controlen la velocidad, por ejemplo, una auto–inyección.

En una realización preferida, se administra una composición inmunógena contra el carbunco mediante, al menos, una aguja hueca de poco calibre que tiene una salida con una altura expuesta de entre 0 y 1 mm, siendo dicha salida insertada en la piel hasta una profundidad de entre 0,3 mm y 2 mm, de modo que la administración de la composición tenga lugar a una profundidad de entre 0,3 mm y 2 mm.

Como se usa en la presente memoria, “administración intradérmica” significa la administración de materiales en el espacio intradérmico y su interrogación según lo descrito por Pettis et al., documento WO 02/02179, que tiene fecha de prioridad del 29 de junio de 2000.

En una realización particularmente preferida, la composición inmunógena se administra mediante un dispositivo que permite al personal médico con experiencia o sin ella alcanzar el espacio dérmico en cada intento. En el documento WO 02/02178A1/WO 02/02179A1, que reivindica prioridad sobre la solicitud estadounidense n.º 606.909, presentada el 29 de junio de 2000, se describen la metodología y los dispositivos basados en micro–cánulas y microagujas. También se puede usar una cánula de acero estándar para la administración intradérmica usando dispositivos y procedimientos según lo descrito en EP 1092444B1, que reivindica prioridad sobre el n.º de serie estadounidense 417.671, presentado el 14 de octubre de 1999. Estos procedimientos y dispositivos incluyen la administración de sustancias a través de una “microcánula” de poco calibre (30G o menor) con una profundidad limitada de penetración (comúnmente, que varía de 10 μm a 2 mm), según lo definido por la longitud total de la cánula o la longitud total de la cánula expuesta a partir de un elemento central limitante de la profundidad. En una realización preferida, la microaguja está configurada en un dispositivo de administración que coloca la microaguja perpendicular a la superficie cutánea.

Como se usa en la presente memoria, “administración convencional” significa cualquier procedimiento para administrar cualquier material que tenga, o que se crea que produzca, respuestas inmunes que sean similares en magnitud o más débiles que las producidas mediante la administración intramuscular. La administración convencional puede incluir procedimientos subcutáneos, iontoforéticos e intradérmicos, tales como los descritos en el documento US 5.800.420 concedido a Gross.

Según la presente invención, las microagujas “mazizas” (MAM) son pequeñas microproyecciones que se usan para excoriar el estrato córneo y permitir el acceso de la vacuna al tejido epidérmico. Las microproyecciones son parte de una “superficie abrasiva” que, junto con una base y un asa adecuadas, forman un dispositivo “micropotenciador” o “microabrasímetro”. Estos dispositivos se usan comúnmente junto con la administración tópica de la vacuna en la piel. Preferiblemente, el dispositivo usado en la presente invención penetra, pero no perfora, el estrato córneo. La sustancia que se va a administrar usando los procedimientos de esta invención se puede aplicar en la piel antes de realizar la abrasión, simultáneamente a la abrasión o después de la abrasión. Los dispositivos compuestos por una superficie abrasiva, una base y un asa adecuadas se denominan en la presente memoria dispositivos de MAM. Tales dispositivos adecuados se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO 01/39693A2, que reivindica prioridad con respecto a la solicitud estadounidense n.º 09/405.488, presentada el 24 de septiembre de 1999; y WO 01/89622A1, que reivindica prioridad con respecto a 09/576.643, presentada el 22 de mayo de 2000; 09/974.829, presentada el 12 de octubre de 2001 y publicada como US 2002/0053756A1; y 10/282.231, publicada el 29 de octubre de 2002 y publicada como US 2003/0093040A1.

El procedimiento de MAM para administrar una vacuna u otra sustancia incluye las etapas de revestir la capa cutánea externa de un paciente o un microabrasímetro 2, véase la Figura 1B, con un medicamento u otra sustancia y mover el microabrasímetro 2 por la piel del paciente para realizar abrasiones que dejen surcos suficientes para permitir la entrada de la sustancia en la epidermis viable del paciente. Debido al diseño estructural del microabrasímetro 2, primero el borde delantero del microabrasímetro 2 estira la piel del paciente y luego la superficie superior del microabrasímetro 2 realiza la abrasión de la capa cutánea protectora externa abriendo el estrato córneo, permitiendo de ese modo que el medicamento u otra sustancia entre en el paciente. Tras la abrasión inicial de la capa cutánea protectora externa, los bordes trasero y delantero del microabrasímetro 2 pueden friccionar la superficie de la zona excoriada impregnando la superficie cutánea excoriada de medicamento o sustancia y mejorando así el efecto medicinal.

Como se muestra en las Figuras 1B, 2A y 2B, el microabrasímetro 2 incluye la base 4 sobre la que se puede montar una superficie abrasiva 5. Alternativamente, la superficie abrasiva puede estar integrada en la base y ser fabricada como una sola parte de dos componentes. Preferiblemente, la base 4 es una pieza sólida moldeada. En una realización, la base 4 está configurada con una corona de tipo champiñón 4b que está curvada hacia arriba y truncada en la parte superior. La parte superior de la base 4 es generalmente plana y tiene la superficie abrasiva 5 montada sobre ella o integrada en ella. Alternativamente, la parte superior truncada puede tener un hueco para recibir la superficie abrasiva 5. En todas las realizaciones, la superficie abrasiva 5 incluye una plataforma con un alineamiento de microprotuberancias que se extienden sobre la parte superior truncada. En otra realización del microabrasímetro, el asa, la base y la superficie abrasiva pueden estar integradas entre sí y ser fabricadas como un solo dispositivo de tres componentes.

El microabrasímetro 2 se aplica a un sujeto moviendo el microabrasímetro 2 por la piel del sujeto con una presión suficiente para permitir que la superficie abrasiva 5 abra la piel protectora externa o el estrato córneo del sujeto. La presión aplicada hacia el interior en la base presiona el microabrasímetro 2 sobre la piel del sujeto. Por consiguiente, es preferible que la altura de la corona inclinada de tipo champiñón 4b sea suficiente para evitar que la sustancia aplicada fluya por y sobre la cara 4c cuando se esté usando el microabrasímetro 2. Como se describirá más adelante, la superficie abrasiva 5 comprende un alineamiento de microprotuberancias.

Hay un asa 6 unida a la base 4 o integrada en la base 4. Como se muestra en la Fig. 2A, puede haber un extremo superior 6a del asa ajustado bien por presión o fricción entre flanco circunferencial interno 4a de la base 4. Alternativamente, como se muestra en las Figuras 1A y 2A, el asa 6 puede estar pegada (p.ej., con epóxido) al lado inferior 4c de la base 4. Alternativamente, el asa y la base pueden ser fabricadas (p.ej., moldeadas por inyección) como una sola parte de dos componentes. El asa puede ser de un diámetro menor que el diámetro de la base o puede ser de un diámetro similar al de la base. El lado inferior 4c de la base 4 puede estar alineado con la corona de tipo champiñón 4b o extendido a partir de la corona de tipo champiñón. El extremo inferior 6b del asa 6 puede ser más ancho que el eje 6c del asa 6 o puede ser de un diámetro similar al eje. El extremo inferior 6b puede incluir una impresión 6d que sirve para que la persona que administre la sustancia y mueva el microabrasímetro 2 pueda apoyar el dedo pulgar. Además, hay protuberancias 8 sobre el lado exterior del asa 6 para ayudar al usuario a agarrar firmemente el asa 6 cuando lo mueva contra o por la piel de un paciente.

Como se muestra en el corte transversal de la Figura 1B y la Figura 2B, el extremo inferior 6b puede ser cilíndrico. El microabrasímetro 2 puede ser de un material transparente, como se muestra en la Figura 2A. Las impresiones 6d se disponen a ambos lados del extremo inferior cilíndrico 6b para ayudar a la persona que esté usando el microabrasímetro 2 a agarrarlo. Es decir, el movimiento del microabrasímetro 2 se puede realizar con la mano o con los dedos. El asa 6, así como la base 4, del microabrasímetro está preferiblemente moldeada a partir de plástico o un material similar. El microabrasímetro 2 es de una fabricación preferiblemente barata, de modo que todo el microabrasímetro y la superficie abrasiva puedan ser desechados tras su uso en un paciente.

La superficie abrasiva 5 está diseñada de modo que cuando el microabrasímetro 2 se mueve por la piel del paciente, las abrasiones resultantes penetren en el estrato córneo. La superficie abrasiva 5 puede ser revestida de una sustancia o un médicamente deseado para administrarlo en la epidermis viable del paciente.

Para realizar las abrasiones deseadas, el microabrasímetro 2 ha de ser movido por la piel del paciente al menos una vez. La abrasión de la piel del paciente se puede realizar en direcciones alternas. El diseño estructural del microabrasímetro según la invención permite que la sustancia o el medicamento sean absorbidos más eficazmente, lo que permite aplicar menos sustancia o medicamento en la piel del paciente o sobre la superficie abrasiva 5.

La superficie abrasiva 5 puede ser revestida de la sustancia que se desee administrar al paciente. En una realización, la sustancia puede ser un polvo dispuesto sobre la superficie abrasiva 5. En otra realización, la sustancia que se va a administrar se puede aplicar directamente sobre la piel del paciente antes de la aplicación y el movimiento del microabrasímetro 2 sobre la piel del paciente.

En cuanto a la Figura 3, el dispositivo microabrasímetro 10 de la invención incluye un cuerpo sustancialmente plano

o soporte de la superficie abrasiva 12 que tiene una pluralidad de microprotuberancias 14 que se extienden desde la superficie inferior del soporte. El soporte generalmente tiene un espesor suficiente para permitir la unión de la superficie a la base del microabrasímetro, permitiendo así el fácil manejo del dispositivo, como se muestra en la Figura 1B, 2A y 2B. Alternativamente, se puede unir un asa o dispositivo de agarre diferente o estar integrado a la superficie superior del soporte de la superficie abrasiva 12. Las dimensiones del soporte de la superficie abrasiva 12 pueden variar en función de la longitud de las microprotuberancias, el número de microprotuberancias de una superficie dada y la cantidad de sustancia que se administre al paciente. Comúnmente, el soporte de la superficie abrasiva 12 tiene una superficie de aproximadamente 1 a 4 cm2. En realizaciones preferidas, el soporte de la superficie abrasiva 12 tiene una superficie de 1 cm2.

Como se muestra en las Figuras 3, 4, 4A y 5, las microprotuberancias 14 sobresalen de la superficie del soporte de la superficie abrasiva 12 y son sustancialmente perpendiculares al plano del soporte de la superficie abrasiva 12. Las microprotuberancias de la realización ilustrada se disponen en una pluralidad de filas y columnas, y están separadas preferiblemente a una distancia uniforme. Las microprotuberancias 14 tienen una forma generalmente piramidal con lados 16 que se extienden hasta una punta 18. Los lados 16 mostrados tienen un perfil generalmente cóncavo cuando se observan en corte transversal y forman una superficie curvada que se extiende desde el soporte de la superficie abrasiva 12 hasta la punta 18. En la realización ilustrada, las microprotuberancias están formadas por cuatro lados 16 de una forma y dimensión sustancialmente iguales. Como se muestra en las Figuras 4A y 5, cada uno de los lados 16 de las microprotuberancias 14 tiene bordes laterales opuestos contiguos al lado adyacente y forman un borde de raspado 22 que se extiende hacia fuera del soporte de la superficie abrasiva 12. Los bordes de raspado 22 definen una superficie de raspado generalmente triangular o trapezoide correspondiente a la forma del lado 16. En otras realizaciones, las microprotuberancias 14 pueden estar formadas por menos o más lados.

Las microprotuberancias 14 terminan preferiblemente en puntas romas 18. Generalmente, la punta 18 es sustancialmente plana y paralela al soporte 14. Cuando las puntas son planas, la longitud total de las microprotuberancias no penetra en la piel; por tanto, la longitud de las microprotuberancias es mayor que la profundidad total hasta la que penetran las microprotuberancias en dicha piel. La punta 18 forma preferiblemente un borde afilado 20 bien definido en el que se une con los lados 16. El borde 20 se extiende sustancialmente en paralelo al soporte de la superficie abrasiva 12 y define otro borde de raspado. En otras realizaciones, el borde 20 puede ser ligeramente redondeado para formar una transición suave desde los bordes 16 a la punta 18. Preferiblemente, las microprotuberancias tienen una forma troncocónica o troncopiramidal.

El dispositivo microabrasímetro 10 y las microprotuberancias pueden ser de un material plástico que no sea reactivo con la sustancia que se esté administrando. Una lista no restrictiva de materiales plásticos adecuados incluye, por ejemplo, polietileno, polipropileno, poliamidas, poliestirenos, poliésteres y policarbonatos, como los conocidos en la técnica. Alternativamente, las microprotuberancias pueden ser de un metal, tal como acero inoxidable, acero de volframio, aleaciones de níquel, molibdeno, cromo, cobalto, titanio y sus aleaciones, u otros materiales, tales como silicio, cerámicas y polímeros de vidrio. Las microprotuberancias metálicas se pueden fabricar usando diversas técnicas similares al grabado fotolitográfico de una oblea de silicio o el micromecanizado con trituradora con punta de diamante como las conocidas en la técnica. Las microprotuberancias también se pueden fabricar mediante el grabado fotolitográfico de una oblea de silicio usando técnicas estándar como las conocidas en la técnica. También se pueden fabricar en plástico mediante un procedimiento de moldeo por inyección, según lo descrito, por ejemplo, en la solicitud estadounidense n.º 10/193.317, presentada el 12 de julio de 2002, publicada como US 2004/0007796A1.

La longitud y el espesor de las microprotuberancias se seleccionan en base a la sustancia en particular que se esté administrando y al espesor del estrato córneo de la zona en la que se aplique el dispositivo. Preferiblemente, las microprotuberancias penetran en el estrato córneo sustancialmente sin perforar o pasar a través del mismo. Las microprotuberancias pueden tener una longitud de hasta 500 μm. Las microprotuberancias adecuadas tienen una longitud de 50 a 500 µm. Preferiblemente, las microprotuberancias tienen una longitud de 50 a 300 µm, y más preferiblemente, en el intervalo de 150 a 250 µm, siendo lo más preferido de 180 a 220 µm. Las microprotuberancias de la realización ilustrada tienen una forma generalmente piramidal y son perpendiculares al plano del dispositivo. Estas formas tienen ventajas particulares para garantizar que la abrasión se produzca hasta una profundidad deseada. En las realizaciones preferidas, las microprotuberancias son miembros macizos. En realizaciones alternativas, las microprotuberancias pueden ser huecas.

Como se muestra en la Figura 2 y 5, las microprotuberancias están preferiblemente separadas uniformemente en filas y columnas para formar un alineamiento que entra en contacto con la piel y penetra en el estrato córneo durante la abrasión. El espacio entre las microprotuberancias puede ser variado en función de la sustancia que se esté administrando, bien sobre la superficie de la piel o en el tejido de la piel. Comúnmente, las filas de las microprotuberancias están separadas para proporcionar una densidad de 2 a 10 por milímetro (mm). Generalmente, las filas o las columnas están separadas una distancia sustancialmente igual al espacio entre las microprotuberancias del alineamiento para proporcionar una densidad de microprotuberancias de 4 a 100 microprotuberancias por mm2. En otra realización, las microprotuberancias pueden estar dispuestas en un patrón circular. En otra realización más, las microprotuberancias pueden estar dispuestas en un patrón aleatorio. Cuando se disponen en columnas y filas, la distancia entre los centros de las microprotuberancias es preferiblemente al menos de dos veces la longitud de las microprotuberancias. En una realización preferida, la distancia entre los centros de las microprotuberancias es de dos veces la longitud de las microprotuberancias ±10 µm. También se incluyen espacios mayores, de hasta 3, 4, 5 y más múltiplos de la longitud de las microprotuberancias. Además, como se indica anteriormente, la configuración de las microprotuberancias puede ser tal que la altura hasta las microprotuberancias puede ser mayor que la profundidad a la que esas protuberancias penetrarán en la piel.

La superficie superior plana de las microprotuberancias troncocónicas o troncopiramidales es generalmente 10 a 100, preferiblemente, 30–70, y lo más preferible, 35–50 µm de anchura.

El procedimiento para preparar una zona de administración en la piel sitúa el microabrasímetro contra la piel 28 del paciente en la zona deseada. Se presiona suavemente el microabrasímetro contra la piel y luego se mueve por la piel. La longitud de la pasada del microabrasímetro puede variar en función del tamaño deseado de la zona de administración, definido por la superficie de administración deseada. Las dimensiones de la zona de administración se seleccionan para conseguir el resultado deseado y pueden variar en función de la sustancia y la forma de la sustancia que se esté administrando. Por ejemplo, la zona de administración puede cubrir una gran superficie para tratar una erupción o una enfermedad cutánea. En general, el microabrasímetro se mueve aproximadamente de 2 a 15 cm. En algunas realizaciones de la invención, el microabrasímetro se mueve para producir una zona excoriada que tenga una superficie de 4 cm2 a 300 cm2.

Luego se levanta el microabrasímetro de la piel para exponer la zona excoriada y poder aplicar un dispositivo de administración, parche o formulación tópica adecuado en la superficie excoriada. Alternativamente, la sustancia que se va a administrar se puede aplicar en la superficie de la piel bien antes o simultáneamente a la abrasión.

El grado de abrasión del estrato córneo depende de la presión aplicada durante el movimiento y del número de repeticiones realizadas con el microabrasímetro. En una realización, se levanta el microabrasímetro de la piel tras realizar la primera pasada y se vuelve a colocar sobre la posición inicial sustancialmente en el mismo lugar y posición. Luego se mueve el microabrasímetro una segunda vez en la misma dirección y la misma distancia. En otra realización, se mueve el microabrasímetro repetidas veces por la misma zona en direcciones alternas sin levantarlo de la piel tras hacer la primera pasada. Generalmente, se hacen dos o más pasadas con el microabrasímetro.

Los procedimientos para formular las composiciones contra el carbunco para administrarlas mediante procedimientos con microagujas descritos en la presente memoria son convencionales. Por ejemplo, el experto en la técnica reconocerá cómo usar o modificar de una manera apropiada los procedimientos descritos en la presente memoria con respecto a la administración intranasal.

Para examinar la utilidad de los procedimientos de administración de la invención para la administración de vacunas para biodefensa, se llevaron a cabo estudios en modelos animales. Los ejemplos de más adelante ilustran la administración con dispositivos de microaguja hueca y maciza, y con una administración intranasal. Los Ejemplos 1– 5 ilustran estudios con un modelo animal murino, comparando la administración con microaguja hueca y maciza entre el flanco circunferencial interno 4a de la base 4. Alternativamente, como se muestra en las Figuras 1A y 2A, el asa 6 puede estar pegado (p.ej., con epóxido) a la parte inferior 4c de la base 4. Alternativamente, el asa y la base pueden ser fabricadas (p.ej., moldeadas por inyección) como una sola parte de dos componentes. El asa puede ser de un diámetro menor que el diámetro de la base o puede ser de un diámetro similar al de la base. La parte inferior 4c de la base 4 puede estar alineada con la corona de tipo champiñón 4b o extendida a partir de la corona de tipo champiñón. El extremo inferior 6b del asa 6 puede ser más ancho que el eje 6c del asa 6 o puede ser de un diámetro similar al eje. El extremo inferior 6b puede incluir una impresión 6d que sirva para que la persona que administre la sustancia y mueva el microabrasímetro 2 pueda apoyar el dedo pulgar. Además, hay protuberancias 8 sobre el lado exterior del asa 6 para ayudar al usuario a agarrar firmemente el asa 6 cuando la mueva contra o por la piel de un paciente.

Como se muestra en el corte transversal de la Figura 1B y la Figura 2B, el extremo inferior 6b puede ser cilíndrico. El microabrasímetro 2 puede ser de un material transparente, como se muestra en la Figura 2A. Las impresiones 6d se disponen a ambos lados del extremo inferior cilíndrico 6b para ayudar a la persona que esté usando el microabrasímetro 2 a agarrarlo. Es decir, el movimiento del microabrasímetro 2 se puede realizar con la mano o con los dedos. El asa 6, así como la base 4 del microabrasímetro está preferiblemente moldeada a partir de plástico o un material similar. El microabrasímetro 2 es de una fabricación preferiblemente barata, de modo que todo el microabrasímetro y la superficie abrasiva puedan ser desechados tras su uso en un paciente.

La superficie abrasiva 5 está diseñada de modo que cuando se mueve el microabrasímetro 2 por la piel del paciente, las abrasiones resultantes penetren en el estrato córneo. La superficie abrasiva 5 puede ser revestida de una sustancia o un médicamente deseado para administrarlo en la epidermis viable del paciente.

Para realizar las abrasiones deseadas, el microabrasímetro 2 ha de ser movido por la piel del paciente al menos una vez. La abrasión de la piel del paciente se puede realizar en direcciones alternas. El diseño estructural del microabrasímetro según la invención permite que la sustancia o el medicamento sean absorbidos más eficazmente, lo que permite aplicar menos sustancia o medicamento en la piel del paciente o sobre la superficie abrasiva 5.

La superficie abrasiva 5 puede ser revestida de una sustancia deseada para su administración al paciente. En una realización, la sustancia puede ser un polvo dispuesto sobre la superficie abrasiva 5. En otra realización, la sustancia que se va a administrar se puede aplicar directamente sobre la piel del paciente antes de la aplicación y el movimiento del microabrasímetro 2 sobre la piel del paciente.

En cuanto a la Figura 3, el dispositivo microabrasímetro 10 de la invención incluye un cuerpo sustancialmente plano

o soporte de la superficie abrasiva 12 que tiene una pluralidad de microprotuberancias 14 que se extienden desde la superficie inferior del soporte. El soporte generalmente tiene un espesor suficiente para permitir la unión de la superficie a la base del microabrasímetro, permitiendo así el fácil manejo del dispositivo, como se muestra en la Figura 1B, 2A y 2B. Alternativamente, se puede unir un asa o dispositivo de agarre diferente o estar integrado en la superficie superior del soporte de la superficie abrasiva 12. Las dimensiones del soporte de la superficie abrasiva 12 pueden variar en función de la longitud de las microprotuberancias, el número de microprotuberancias en una superficie dada y la cantidad de sustancia que se administre al paciente. Comúnmente, el soporte de la superficie abrasiva 12 tiene una superficie de aproximadamente 1 a 4 cm2. En realizaciones preferidas, el soporte de la superficie abrasiva 12 tiene una superficie de aproximadamente 1 cm2.

Como se muestra en las Figuras 3, 4, 4A y 5, las microprotuberancias 14 sobresalen de la superficie del soporte de la superficie abrasiva 12 y son sustancialmente perpendiculares al plano del soporte de la superficie abrasiva 12. Las microprotuberancias de la realización ilustrada se disponen en una pluralidad de filas y columnas, y están separadas preferiblemente a una distancia uniforme. Las microprotuberancias 14 tienen una forma generalmente piramidal con los lados 16 que se extienden hasta una punta 18. Los lados 16 mostrados tienen un perfil generalmente cóncavo cuando se observan en corte transversal y forman una superficie curvada que se extiende desde el soporte de la superficie abrasiva 12 hasta la punta 18. En la realización ilustrada, las microprotuberancias están formadas por cuatro lados 16 de una forma y dimensión sustancialmente iguales. Como se muestra en las Figuras 4A y 5, cada uno de los lados 16 de las microprotuberancias 14 tiene bordes laterales opuestos contiguos al lado adyacente y forman un borde de raspado 22 que se extiende hacia fuera desde el soporte de la superficie abrasiva 12. Los bordes de raspado 22 definen una superficie pulida generalmente triangular o trapezoide correspondiente a la forma del lado 16. En otras realizaciones, las microprotuberancias 14 pueden estar formadas por menos o más lados.

Las microprotuberancias 14 terminan preferiblemente en puntas romas 18. Generalmente, la punta 18 es sustancialmente plana y paralela al soporte 14. Cuando las puntas son planas, la longitud total de las microprotuberancias no penetra en la piel; por tanto, la longitud de las microprotuberancias es mayor que la profundidad total hasta la que penetran las microprotuberancias en dicha piel. La punta 18 forma preferiblemente un borde afilado 20 bien definido en el que une con los lados 16. El borde 20 se extiende sustancialmente en paralelo al soporte de la superficie abrasiva 12 y define otro borde de raspado. En otras realizaciones, el borde 20 puede ser ligeramente redondeado para formar una transición suave desde los bordes 16 a la punta 18. Preferiblemente, las microprotuberancias tienen una forma troncocónica o troncopiramidal.

El dispositivo microabrasímetro 10 y las microprotuberancias pueden ser de un material plástico que no sea reactivo con la sustancia que se esté administrando. Una lista no restrictiva de materiales plásticos adecuados incluye, por ejemplo, polietileno, polipropileno, poliamidas, poliestirenos, poliésteres y policarbonatos, como los conocidos en la técnica. Alternativamente, las microprotuberancias pueden ser de un metal, tal como acero inoxidable, acero de volframio, aleaciones de níquel, molibdeno, cromo, cobalto, titanio y sus aleaciones, u otros materiales, tales como silicio, cerámicas y polímeros de vidrio. Las microprotuberancias metálicas se pueden fabricar usando diversas técnicas similares al grabado fotolitográfico de una oblea de silicio o el micromecanizado con trituradora con punta de diamante como las conocidas en la técnica. Las microprotuberancias también se pueden fabricar mediante el grabado fotolitográfico de una oblea de silicio usando técnicas estándar como las conocidas en la técnica. También se pueden fabricar en plástico mediante un procedimiento de de moldeo por inyección, según lo descrito, por ejemplo, en la solicitud estadounidense n.º 10/193.317, presentada el 12 de julio de 2002, incorporada en la presente memoria por referencia.

La longitud y el espesor de las microprotuberancias se seleccionan en base a la sustancia en particular que se esté administrando y al espesor del estrato córneo de la zona en la que se aplique el dispositivo. Preferiblemente, las microprotuberancias penetran en el estrato córneo sustancialmente sin perforar o pasar a través del mismo. Las microprotuberancias pueden tener una longitud de aproximadamente 500 micrómetros. Las microprotuberancias adecuadas tienen una longitud de aproximadamente 50 a 500 micrómetros. Preferiblemente, las microprotuberancias tienen una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 micrómetros, y más preferiblemente, en el intervalo de 150 a 250 micrómetros, siendo lo más preferido de 180 a 220 micrómetros. Las microprotuberancias de la realización ilustrada tienen una forma generalmente piramidal y son perpendiculares al plano del dispositivo. Estas formas tienen ventajas particulares para garantizar que la abrasión se produzca hasta una profundidad deseada. En las realizaciones preferidas, las microprotuberancias son miembros macizos. En realizaciones alternativas, las microprotuberancias pueden ser huecas.

Como se muestra en la Figura 2 y 5, las microprotuberancias están preferiblemente separadas uniformemente en filas y columnas para formar una disposición que entre en contacto con la piel y penetre en el estrato córneo durante la abrasión. El espacio entre las microprotuberancias puede ser variado en función de la sustancia que se esté administrando bien sobre la superficie de la piel o en el tejido de la piel. Comúnmente, las filas de las microprotuberancias están separadas para proporcionar una densidad de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 por milímetro (mm). Generalmente, las filas o las columnas están separadas una distancia sustancialmente igual al espacio de las microprotuberancias en el alineamiento para proporcionar una densidad de microprotuberancias de aproximadamente 4 a aproximadamente 100 microprotuberancias por mm2. En otra realización, las microprotuberancias pueden estar dispuestas en un patrón circular. En otra realización más, las microprotuberancias pueden estar dispuestas en un patrón aleatorio. Cuando se disponen en columnas y filas, la distancia entre los centros de las microprotuberancias es preferiblemente al menos de dos veces la longitud de las microprotuberancias. En una realización preferida, la distancia entre los centros de las microprotuberancias es de dos veces la longitud de las microprotuberancias ±10 micrómetros. También se incluyen espacios mayores, de hasta 3, 4, 5 y más múltiplos de la longitud de las microprotuberancias. Además, como se indica anteriormente, la configuración de las microprotuberancias puede ser tal que la altura hasta las microprotuberancias puede ser mayor que la profundidad a la que esas protuberancias penetrarán en la piel.

La superficie superior plana de las microprotuberancias troncocónicas o troncopiramidales es generalmente 10 a 100, preferiblemente, 30–70, y lo más preferible, 35–50 micrómetros de anchura.

El procedimiento para preparar una zona de administración en la piel sitúa el microabrasímetro contra la piel 28 del paciente en la zona deseada. Se presiona suavemente el microabrasímetro contra la piel y luego se mueve por la piel. La longitud de la pasada del microabrasímetro puede variar en función del tamaño deseado de la zona de administración, definido por la superficie de administración deseada. Las dimensiones de la zona de administración se seleccionan para conseguir el resultado deseado y pueden variar en función de la sustancia y la forma de la sustancia que se esté administrando. Por ejemplo, la zona de administración puede cubrir una gran superficie para tratar una erupción o una enfermedad cutánea. En general, el microabrasímetro se mueve aproximadamente de 2 a 15 centímetros (cm). En algunas realizaciones de la invención, el microabrasímetro se mueve para producir una zona excoriada que tenga una superficie de aproximadamente 4 cm2 a aproximadamente 300 cm2.

Luego se levanta el microabrasímetro de la piel para exponer la zona sometida a la abrasión y poder aplicar un dispositivo de administración, parche o formulación tópica adecuado en la superficie excoriada. Alternativamente, la sustancia que se va a administrar se puede aplicar en la superficie de la piel bien antes o simultáneamente a la abrasión.

El grado de abrasión del estrato córneo depende de la presión aplicada durante el movimiento y del número de repeticiones realizadas con el microabrasímetro. En una realización, se levanta el microabrasímetro de la piel tras realizar la primera pasada y se vuelve a colocar sobre la posición inicial sustancialmente en el mismo lugar y posición. Luego se mueve el microabrasímetro una segunda vez en la misma dirección y la misma distancia. En otra realización, se mueve el microabrasímetro repetidas veces por la misma zona en direcciones alternas sin levantarlo de la piel tras hacer la primera pasada. Generalmente, se hacen dos o más pasadas con el microabrasímetro.

Los procedimientos para formular las composiciones contra el carbunco para su administración mediante procedimientos con microagujas descritos en la presente memoria son convencionales. Por ejemplo, el experto en la técnica reconocerá cómo usar o modificar de una manera apropiada los procedimientos descritos en la presente memoria con respecto a la administración intranasal.

Para examinar la utilidad de los procedimientos de administración de la invención para administrar vacunas para biodefensa, se llevaron a cabo estudios en modelos animales. Los ejemplos de más adelante ilustran la administración con dispositivos de microaguja hueca y maciza, y con una administración intranasal. Los Ejemplos 1– 5 ilustran estudios con un modelo animal murino, comparando la administración con dispositivos de microaguja hueca y maciza con otros procedimientos de administración. Los Ejemplos 6–11 ilustran los estudios de pruebas de provocación letal con un modelo de conejos. Estos ejemplos muestran claramente que los procedimientos de administración intranasal (IN) e intradérmica (ID) proporcionan una protección superior en comparación con los procedimientos de administración convencionales, tales como la inyección intramuscular (IM). Además, el procedimiento de administración con abrasímetro/tópica de la invención proporciona una protección superior en comparación con los procedimientos convencionales de administración tópica.

En los siguientes ejemplos y en los anteriores, todas las temperaturas se presentan sin corregir en grados Celsius; y, a no ser que se indique lo contrario, todas las partes y porcentajes están en peso.

Ejemplos

I. Estudios en un modelo murino

Ejemplo 1.– Diseño experimental para los estudios de la administración de APr con dispositivos de microaguja hueca y maciza

Formulaciones: sólo formulaciones líquidas.

Adyuvantes: véanse los Grupos experimentales que se presentan más abajo.

Calendario de inmunizaciones: Los ratones fueron inmunizados los días 0, 21 y 42.

Número de animales: Total = 10/grupo.

Recogida de sangre: la sangre se recogió el día 0 (“d0”, presangrado), el día 21 (antes de la inmunización 2), el día 42 (antes de la inmunización 3) y el día 56. Se recogió fluido de lavado bronquioalveolar (LBA) de al menos 5 animales por grupo el día 56.

Prueba de provocación: Ninguna.

Análisis: Se analizó la Ig total específica del APr del suero de ratones individuales mediante ELISA, usando procedimientos de la técnica estándar. Además, se analizaron los perfiles de isotipos de Ig específicos del APr (IgG1, IgG2a, gG2b, IgG3, IgM, IgA) de sueros de grupos mezclados usando un análisis con kit de subisotipificación (Quantitative ELISA Immunoassay, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Se analizó la Ig total y la IgA específicas del APr del fluido de LBA de ratones individuales. Se midió la neutralización del carbunco añadiendo diluciones de sueros de animales vacunados y animales control a cultivos de monocitos incubados con concentraciones líticas de AP y toxina letal (TL) de B. anthracis. Este análisis representa una correlación in vitro de protección contra la enfermedad del carbunco. Se determinó la viabilidad celular midiendo el ATP intracelular.

Grupos experimentales:

Grupo 1: IM –alumbre* Grupo 2: IN (instilación de líquido) – Sin adyuvante Grupo 3: IN (instilación de líquido) – CpG** Grupo 4: ID (MAH) – Sin adyuvante Grupo 5: ID (MAH) – alumbre Grupo 5: ID (MAH) – alumbre Grupo 6: ID (MAH) – CpG Grupo 7: MAM (protocolo 1 = “preabrasión”) – Sin adyuvante Grupo 8: MAM (protocolo 1 = “preabrasión”) – alumbre Grupo 9: MAM (protocolo 1 = “preabrasión”) – CpG Grupo 10: MAM (protocolo 2 = “abrasión a través de gotas”) – Sin adyuvante Grupo 11: MAM (protocolo 2 = “abrasión a través de gotas”) – alumbre Grupo 12: MAM (protocolo 2 = “abrasión a través de gotas”) – CpG Grupo 13: Tópica – Sin adyuvante Grupo 14: Tópica –alumbre Grupo 15: Tópica – CpG

* Alhidrogel (Al(OH)3 al 2%; Superfos Biosector)

** oligonucleótido CpG (TCCATGACGTTCCTGACGTT; Proligo, LLC), 10 μg/ratón

Una vacuna contra el carbunco candidata recién desarrollada se basa en un antígeno protector producido recombinantemente (APr) (Ivins, B.E., “Infection and Immunity”, 60:662–668, 1992; Ramirez, D.M., et al., J. Industrial Microbiol and Biotechnol. 28:232–238, 2002). Esta vacuna está siendo investigada por USAMRIID como una alternativa a la VCA, debido a su potencial para mejorar la eficacia y así reducir el número de administraciones de refuerzo necesarias, así como mejorar el perfil de seguridad. Se requieren más estudios preclínicos y clínicos para determinar las vías de administración más eficaces para la protección y además para dilucidar los posibles requisitos de los adyuvantes. Esta vacuna se usó en los ejemplos expuestos a continuación.

Para los estudios con MAH, se unió una aguja hueca de acero inoxidable de 1 mm x 0,16 mm (calibre 34) a un pedazo corto de catéter, que a su vez fue unido a una jeringa. Las inyecciones fueron introducidas en los ratones esencialmente en paralelo a la superficie cutánea en una inyección de estilo Mantoux.

Para los estudios con MAM, el dispositivo comprendía una superficie abrasiva de plástico sobre un aplicador manual, como se muestra en las figuras 1–5 con una superficie abrasiva constituida por microproyecciones troncocónicas de plástico de 200 μm de altura, como se muestra en la Figura 4. Se colocó la superficie abrasiva sobre un dispositivo microabrasímetro, según lo representado en las Figuras 1 y 2. La tecnología para producir éstos y otros abrasímetros similares es conocida por los expertos en la técnica.

En cada zona de aplicación, se realizó un total de seis pasadas por la piel afeitada del ratón, de manera que se excorió una superficie de aproximadamente 1,5 cm2. Para algunos experimentos de MAM, se realizó la abrasión de la piel y se aplicó la vacuna (“pre”), para otros, se aplicó la vacuna e, inmediatamente, se realizó la abrasión de la piel través de la gota (“abr”).

Se dividió un volumen de 50 μl entre ambas zonas de inyección o de abrasión para todos los experimentos, a no ser que se indicara otra cosa.

La inyección IM se realizó de una manera estándar en una zona usando una aguja de 0,25 mm estándar (calibre 30). La administración intranasal se realizó mediante la instilación de 30 μl de líquido (15 μl por cada narina) usando una pipeta Gilson convencional (Gilson, Middleton, WI). Para la administración tópica, se aplicó la vacuna sobre la piel afeitada.

Ejemplo 2: Respuesta de los anticuerpos en suero específicos del AP (Ig total)

La siguiente Tabla 1 muestra los títulos de los anticuerpos en suero específicos del APr del carbunco (1/dilución de suero) para ratones individuales (n = 10 por grupo) tras la inmunización el día 21; es decir, tras una sola dosis de vacuna. Las respuestas seropositivas se indican en negrita.

Tabla 1. Títulos de anticuerpos en suero específicos de APr el día 21 (Ig total)

(MAH = Microaguja hueca; MAM = Microaguja maciza)

Grupo 1:

Grupo 2: Grupo 3:

Inyección IM

Intranasal Intranasal

Alumbre

Sin adyuvante CpG

50

<50 <50

50

<50 <50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

5

10

15 (continuación)

Grupo 4: MAH Sin adyuvante

Grupo 5: MAH Alumbre Grupo 6: MAH CpG

50

400 200

50

100 400

<50

400 400

50

400 800

400

<50 200

50

<50

50

50

1.600 <50

<50

<50

200

<50

1.600 800

<50

400 1.600

Grupo 7: MAM (“pre”) Sin adyuvante

Grupo 8: MAM (“pre”) Alumbre Grupo 9: MAM (“pre”) CpG

<50

<50

<50

<50

<50

50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

<50

50 50

50

<50 <50

<50

200

<50

<50

100

<50

<50

<50

200

<50

<50

<50

Grupo 10: MAM (“abr”) Sin adyuvante

Grupo 11: MAM (“abr”) Alumbre Grupo 12: MAM (“abr”) CpG

<50 <50 <50

<50 <50 <50

<50 <50 <50

Grupo 10: MAM (“abr”) Sin adyuvante

Grupo 11: MAM (“abr”) Alumbre Grupo 12: MAM (“abr”) CpG

<50 <50 <50 <50 <50 50 <50

<50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50

Grupo 13: Tópica Sin adyuvante

Grupo 14: Tópica Alumbre Grupo 15: Tópica CpG

50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50

<50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50 <50

Los resultados indican que los títulos de anticuerpos en suero más potentes y las tasas de respuesta totales más 5 altas se observaron tras una administración ID con una MAH. Las vacunas contra el carbunco actuales contienen alumbre como adyuvante y se administran bien IM o SC. Sólo hubo una tasa de respuesta del 20% en el grupo de alumbre IM (Grupo 1), en comparación con la tasa de respuesta del 60% de los animales inmunizados ID en ausencia de adyuvante (Grupo 4). Las tasas de respuesta de los grupos de ID se aumentaron más mediante la adición de bien alumbre (80%; Grupo 5) o CpG (90%; Grupo 6) como adyuvante.

10 La administración con MAM estimuló una respuesta de los anticuerpos de una magnitud y tasa de respuesta (de hasta el 30%; Grupos 8 y 9) similares a la inducida mediante una pauta de alumbre IM convencional. Además, los dispositivos de MAM permitieron la administración tópica, pues sólo se observó un único respondedor positivo en el total de los 30 ratones que recibieron APr tópicamente sin un dispositivo de microabrasión (Grupos 13–15).

La administración IN no dio como resultado una respuesta positiva de los anticuerpos tras una sola dosis de vacuna.

15 En general, los resultados indican que, en cuanto al calendario de vacunación con alumbre IM convencional, la

administración ID con MAH de APr de carbunco cubre la necesidad de adyuvantes y aumenta el nivel de respuesta y la tasa de respuesta de los anticuerpos en suero. Además, los resultados indican que la administración tópica con MAM en la piel produce una respuesta de los anticuerpos que es al menos tan potente como la inducida por la pauta de alumbre IM convencional.

Las Tablas 2 y 3 que se presentan a continuación ilustran los títulos de anticuerpos en suero específicos del APr del carbunco (1/dilución de suero) tras 2 y 3 dosis de vacuna respectivamente. Se produjeron muertes debidas a la anestesia, no relacionadas con ningún procedimiento de administración ni adyuvante en particular en algunos animales, y se incluyen en las siguientes Tablas.

Tabla 2. Títulos de anticuerpos específicos del APr en suero el día 42 (Ig total)

Grupo 1:

Grupo 2: Grupo 3:

Inyección IM

Intranasal Intranasal

Alumbre

Sin adyuvante CpG

51.200

<50 100

12.800

400 <50

25.600

<50 400

3.200

<50 <50

6.400

<50 3.200

25.600

<50 200

3.200

<50

3.200

3.200

<50 1.600

25.600

<50 400

51.200

<50 50

Grupo 4: MAH Sin adyuvante

Grupo 5: MAH Alumbre Grupo 6: MAH CpG

25.600

25.600

25.600

25.600

51.200

25.600

3.200

51.200 25.600

12.800

3.200 51.200

12.800

400 25.600

25.600

51.200 12.800

12.800

6.400 6.400

200

12.800 25.600

12.800

51.200 25.600

3.200

fallecido 25.600

Grupo 7: MAM (“pre”) Sin adyuvante

Grupo 8: MAM (“pre”) Alumbre Grupo 9: MAM (“pre”) CpG

12.800 12.800 12.800 12.800 6.400 25.600 12.800 1.600 6.400 12.800

6.400 25.600 25.600 6.400 25.600 6.400 25.600 3.200 6.400 25.600 6.400 25.600 12.800 6.400 51.200 12.800 25.600 25.600 102.400 12.800

Grupo 10: MAM (“abr”) Sin adyuvante

Grupo 11: MAM (“abr”) Alumbre Grupo 12: MAM (“abr”) CpG

6.400 3.200 400 6.400 6.400 1.600 3.200 6.400 3.200 fallecido

1.600 6.400 3.200 6.400 6.400 6.400 12.800 3.200 6.400 fallecido 6.400 1.600 3.200 3.200 12.800 6.400 6.400 <50 6.400 12.800

Grupo 13: Tópica Sin adyuvante

Grupo 14: Tópica Alumbre Grupo 15: Tópica CpG

400 <50 <50

50 <50 <50 50 <50 <50

Grupo 13:

Grupo 14: Grupo 15:

Tópica

Tópica

Tópica

Sin adyuvante

Alumbre CpG

<50

<50

<50

<50

3.200

<50

<50

<50

800

<50

<50

<50

<50

<50

6.400

12.800

<50 <50

<50

fallecido 3.200

Tabla 3: Títulos de anticuerpos en suero específicos de APr el día 56 (Ig total)

Grupo 1:

Grupo 2: Grupo 3:

Inyección IM

Intranasal Intranasal

Alumbre

Sin adyuvante CpG

25.600

<50 51.200

51.200

200 25.600

25.600

<50

25.600

25.600

<50 6.400

102.400

<50 51.200

51.200

<50 25.600

51.200

<50 25.600

102.400

<50

102.400

fallecido

<50 25.600

fallecido

<50 25.600

Grupo 4:

Grupo Grupo 6:

5:

MAH

MAH

MAH

Sin adyuvante

CpG

Alumbre

102.400

409.600

102.400

102.400

102.400

102.400

51.600

204.800 102.400

51.600

204.800 102.400

51.600

102.400 409.600

Grupo 4: MAH Sin adyuvante

Grupo 5: MAH Alumbre Grupo 6: MAH CpG

204.800 51.600 12.800 102.400 51.600

204.800 204.800 204.800 204.800 fallecido 204.800 51.600 102.400 102.400 102.400

Grupo 7: MAM (“pre”) Sin adyuvante

Grupo 8: MAM (“pre”) Alumbre Grupo 9: MAM (“pre”) CpG

51.200 25.600 51.200 12.800 51.200 25.600 25.600 12.800 25.600 25.600

51.200 51.200 25.600 51.200 51.200 25.600 51.200 12.800 25.600 25.600 51.200 51.200 204.800 102.400 51.200 51.200 51.200 51.200 51.200 51.200

Grupo 10: MAM (“abr”) Sin adyuvante

Grupo 11: MAM (“abr”) Alumbre Grupo 12: MAM (“abr”) CpG

25.600 25.600 25.600 51.200 25.600 25.600 12.800

25.600 25.600 102.400 51.200 25.600 25.600 51.200 25.600 51.200 25.600 51.200 102.400 51.200 51.200

Grupo 10:

Grupo 11: Grupo 12:

MAM (“abr”)

MAM (“abr”) MAM (“abr”)

Sin adyuvante

Alumbre CpG

51.200

51.200

25.600

51.200

fallecido 102.400

fallecido

fallecido

204.800

Grupo 13:

Grupo 14: Grupo 15:

Tópica

Tópica

Tópica

Sin adyuvante

Alumbre CpG

12.800

200 3.200

<50

50

<50

<50

1.600 6.400

<50

1.600

<50

<50

3.200

<50

<50

<50

6.400

3.200

100 100

50

400 12.800

12.800

100 800

<50

fallecido 6.400

Los resultados presentados en las Tablas 2 y 3 demuestran que hay un efecto de refuerzo relevante tras la

5 administración de la 2ª y 3ª dosis de vacuna de APr en todos los grupos. Al finalizar el estudio (día 56), los mayores títulos de anticuerpos en suero medios totales se observaron en los grupos de MAH ID (Grupo 4; título medio = 78.280; Grupo 5: título medio = 204.800; Grupo 6: título medio = 138.280). En todos los casos, los títulos medios inducidos ID fueron mayores que el correspondiente título alcanzado mediante la pauta convencional de inyección IM de APr más alumbre (Grupo 1: título medio = 54.400). Por lo tanto, según lo indicado anteriormente, la

10 administración ID con MAH produce una respuesta de los anticuerpos en suero mayor que la producida mediante la pauta convencional de alumbre IM y reduce o elimina la necesidad de adyuvantes.

Además, los resultados indican que la MAM produce respuestas de los anticuerpos que son de una magnitud comparable o mayor que las inducidas mediante la pauta convencional de alumbre IM. El día 56, los títulos medios inducidos mediante MAM variaron de 30.720 (Grupo 7) a 71.680 (Grupo 9), en comparación con un título medio de

15 54.400 del grupo de alumbre IM (Grupo 1). Así pues, la administración mediante MAM también reduce o elimina la necesidad de adyuvantes y, en presencia de adyuvantes, produce una respuesta inmune que es al menos tan potente como la inducida mediante una inyección IM, incluso sin la inyección de aguja convencional.

Además, los resultados indican que la administración IN del APr de carbunco requiere el uso de un adyuvante, en este caso, de CpG para inducir una respuesta inmune relevante y una sero–conversión del 100%. Sin embargo, tras

20 la adición de adyuvante, se consigue una respuesta de los anticuerpos de una magnitud similar o ligeramente inferior a la obtenida mediante inyección IM (Grupo 3: título medio el día 56 = 36.480), incluso sin una inyección de aguja convencional.

5

10

15

20

25

30

Ejemplo 3: Respuesta de los anticuerpos en suero específicos del AP (isótopos de Ig)

Para realizar una mayor caracterización de la respuesta inmune, se siguió investigando el perfil de los isotipos de Ig de los sueros del día 56 procedentes de los grupos experimentales presentados en el Ejemplo 1 anterior. Los diferentes isotipos están implicados en diferentes funciones inmunes, p.ej., la IgG fija el complemento y se une a receptores de Fc; la IgE está implicada en las respuestas alérgicas; la IgA está implicada en las respuestas inmunes en las mucosas. Las células T auxiliares (Th) se pueden dividir en 2 subconjuntos en base a las citocinas particulares producidas; las células “Th1” producen las citocinas pro–inflamatorias IFN–γ e IFN–α, importantes en las respuestas inmunes celulares, mientras que las células “Th2” producen IL–4, IL–5 e IL–10, que son importantes para las respuestas inmunes humorales. Tanto las citocinas Th1 como las Th2 influyen en el intercambio del isotipo IgG; las citocinas “Th1” favorecen la producción de IgG2a, mientras que las citocinas “Th2” favorecen la producción de IgG1. Así pues, la proporción de IgG1:IgG2a sugiere el tipo de respuesta de las células T auxiliares inducido por una vacuna dada. Las Figuras 6A–6F muestran las concentraciones en suero del día 56 de los anticuerpos específicos del APr de los diversos isotipos de los grupos experimentales presentados en el Ejemplo 1.

Los resultados presentados en la Figura 6 indican que la mayoría de los anticuerpos producidos en todos los grupos consistían en IgG1, IgG2a e IgG2b. Había muy poco anticuerpo o anticuerpo no detectable de los isotipos IgM, IgA y IgE en el suero. Así pues, los nuevos procedimientos y dispositivos descritos en la presente memoria producen una respuesta de los anticuerpos que es similar en composición a la alcanzada mediante una inyección IM convencional. Particularmente, los nuevos procedimientos y dispositivos descritos en la presente memoria no favorecen la inducción de una respuesta alérgica de tipo IgE.

La Tabla 4 que se presenta a continuación muestra las proporciones de IgG1:IgG2a para los grupos experimentales presentados en el Ejemplo 1. En los grupos que reciben APr bien sin adyuvante o con alumbre como adyuvante, las respuestas de IgG mostraron una mayor proporción de IgG1:IgG2a que los grupos correspondiente inmunizados con APr más CpG. En general, los nuevos procedimientos y dispositivos descritos en la presente memoria parecían producir las proporciones de IgG1:IgG2a esperadas para estos tipos de adyuvantes. Sin embargo, las proporciones de IgG1:IgG2a de los grupos IN fueron, en general, inferiores a la presentes en otros grupos, lo que sugiere más actividad de Th1 tras la administración IN que la alcanzada mediante otras vías.

Tabla 4. Proporciones de IgG1:IgG2 (referidas al Ejemplo 1 para la descripción de grupos experimentales)

Grupo:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Proporción G1/G2a

de 23 4 0,7 379 32 6 33 356 12 182 114 61 84 56 9

Ejemplo 4: Respuesta de los anticuerpos específicos del AP en LBA (Ig total)

Los anticuerpos específicos del carbunco presentes en al LBA proporcionan una primera línea de defensa contra la forma inhalada de la enfermedad. Al finalizar el experimento descrito en el Ejemplo 1, se recogieron muestras de LBA de 5–10 ratones por grupo y se analizaron los anticuerpos específicos del AP mediante ELISA. En la siguiente Tabla 5, se presentan los títulos de los anticuerpos específicos del AP (1/dilución de LBA):

Tabla 5: Títulos de los anticuerpos específicos del AP en LBA (Ig total)

Grupo 1:

Grupo 2: Grupo 3:

Inyección IM

Intranasal Intranasal

Alumbre

Sin adyuvante CpG

32

<1

32

64

<1 8

64

<1

64

32

<1 16

64

<1 32

<1

4

Grupo 1: Inyección IM Alumbre

Grupo 2: Intranasal Sin adyuvante Grupo 3: Intranasal CpG

<1 <1 <1 <1

32 64 32 8

Grupo 4: MAH Sin adyuvante

Grupo 5: MAH alumbre Grupo 6: MAH CpG

32 32 32 128 32

128 64 128 128 128 128 16 128 64 64

Grupo 7: MAM (“pre”) Sin adyuvante

Grupo 8: MAM (“pre”) alumbre Grupo 9: MAM (“pre”) CpG

32 32 64 32 64

16 32 16 32 32 32 32 64 64 32

Grupo 10: MAM (“abr”) Sin adyuvante

Grupo 11: MAM (“abr”) Alumbre Grupo 12: MAM (“abr”) CpG

32 8 8

32 32 16 8 32 32

5

10

15

20

25

30 (continuación)

Grupo 10:

Grupo 11: Grupo 12:

MAM (“abr”)

MAM (“abr”) MAM (“abr”)

Sin adyuvante

Alumbre CpG

16

16

32

16

128

Grupo 13:

Grupo 14: Grupo 15:

Tópica

Tópica

Tópica

Sin adyuvante

Alumbre CpG

4

2 <1

4

<1 2

<1

<1

4

8

<1

8

<1

<1

4

Los resultados presentados en la Tabla 5 indican que la administración con MAH y MAM de la vacuna de APr de carbunco produce niveles significativos de anticuerpos específicos del AP en el fluido de LBA. Como con los títulos del suero, la administración con MAH dio como resultado títulos totales más potentes en el LBA, habiendo ratones individuales que respondieron con un título medio del grupo tan alto como de 115 (Grupo 5) en comparación con el título medio del grupo de 51 producido tras una inyección IM (Grupo 1). Particularmente, los animales inmunizados con MAH elevaron un título significativo en el LBA incluso en ausencia de adyuvante añadido. Asimismo, la administración con MAM dio como resultado la inducción de títulos relevantes en el fluido de LBA incluso en ausencia de adyuvante añadido. Además, los títulos inducidos mediante MAM fueron comparables en magnitud a los generados mediante la pauta de alumbre IM convencional. Así pues, los procedimientos y dispositivos de la presente invención son capaces de cubrir las necesidades por adyuvantes en la inducción de respuestas inmunes en el fluido de LBA. Es probable que tales respuestas inmunes del LBA sean importantes para la protección contra la provocación con esporas de carbunco en aerosol.

La administración IN necesitó un adyuvante para producir títulos de anticuerpos relevantes en el fluido de LBA. En presencia de adyuvante, sin embargo, el APr administrado IN produjo títulos en LBA similares pero ligeramente inferiores en comparación con la inyección IM.

Además del análisis de Ig total presentado anteriormente, se analizó la IgA específica del AP del fluido de LBA. La IgA es un anticuerpo secretor implicado en la protección de la infección en las superficies mucosas. La IgA específica del AP sólo fue detectable en un número limitado de muestras; 4/9 muestras del grupo de CpG IN (Grupo 3) y 1/5 muestras del grupo de CpG IM (Grupo 6) dieron positivo en diluciones que variaban de 1:2 a 1:8. El resto de muestras dieron negativo. Estos resultados indican que la administración IN e ID son únicas entre las vías analizadas en cuanto a su capacidad para inducir respuestas de IgA en el fluido de LBA.

Ejemplo 5 – Títulos de anticuerpos neutralizantes en suero

Se midió la neutralización del carbunco añadiendo diluciones de sueros de animales vacunados y animales control a cultivos de monocitos incubados con concentraciones líticas de AP y toxina letal (TL) de B. anthracis. Este análisis representa una correlación in vitro de protección contra la enfermedad del carbunco. Se determinó la viabilidad celular midiendo el ATP intracelular. Los resultados se presentan en la Figura 7. Particularmente, la administración con MAH de APr sin adyuvante añadido indujo títulos de Ac neutralizantes en suero similares a los de la alumbre IM. La adición de alumbre o CpG como adyuvante aumentó más el título de los Ac neutralizantes en comparación con la vía IM. De igual manera, la administración con MAM también indujo títulos de Ac neutralizantes en suero relevantes que, en presencia de adyuvante, fueron mayores que los inducidos mediante una inyección IM. El pretratamiento con el dispositivo microabrasímetro con MAM seguido por la aplicación tópica de la vacuna produjo respuestas ligeramente más potentes que las conseguidas mediante el protocolo alternativo de realizar la abrasión directamente a través de la gota de vacuna sobre la superficie cutánea. La administración IN no produjo Ac neutralizantes en ausencia de adyuvante, pero sí indujo Ac neutralizantes tras 3 dosis de APr más CpG. En el LBA, se observaron títulos de Ac neutralizantes bajos en los grupos de MAM y MAH, mientras que los animales tratados IM e IN dieron negativo (no se muestran los datos).

Así pues, la administración ID mediante los dispositivos de MAH produce títulos de anticuerpos neutralizantes contra el carbunco mayores que cualquier otra vía de administración. La MAM permite la administración tópica y produce títulos de anticuerpos neutralizantes del carbunco que son tan potentes o más que los alcanzados mediante la inyección IM. Particularmente, se encontraron anticuerpos neutralizantes en los grupos de MAH y MAM incluso en ausencia de adyuvante añadido. Así pues, los procedimientos y dispositivos de la presente invención cubren la necesidad de adyuvantes añadidos en la inducción de una respuesta inmune hacia una vacuna. La administración IN también produjo respuestas de anticuerpos neutralizantes pero necesitó un adyuvante. Por lo tanto, la administración IN produce resultados comparables a la inyección IM, pero mediante una administración no invasiva sin aguja.

II. Estudios de prueba de provocación letal en un modelo de conejos

Ejemplo 6.– Diseño experimental para los estudios comparativos de la eficacia de las diversas vías de administración y otros factores

Vías de administración:

Administración intradérmica (ID) con microaguja hueca (MAH):

Las inyecciones aplicadas a los conejos se realizaron perpendicularmente a la superficie cutánea, usando una aguja de calibre 34 con una profundidad de 1 mm en el extremo de una línea de catéter. No se controló la velocidad de administración. La administración se realizó manualmente durante un espacio de tiempo de aproximadamente 20–30 segundos con una inyección de bolo rápido. Se administraron cien microlitros de vacuna divididos en 2 zonas de administración por conejo.

Administración basada en abrasión con microaguja maciza (MAM): se afeitaron los conejos con maquinillas eléctricas y luego se depilaron usando crema Nair®. Entonces se pretrataron los conejos con el dispositivo MAM, según lo descrito anteriormente. Luego se aplicó tópicamente la vacuna (volumen de 100 μl dividido en 2 zonas de tratamiento, cada uno de una superficie de aproximadamente 1 x 3 cm) en la piel tratada usando una pipeta Gilson.

Administración tópica (sin dispositivo): se afeitaron los conejos con maquinillas eléctricas y luego se depilaron usando crema Nair®. Luego se aplicó tópicamente la vacuna (volumen de 100 µl dividido en 2 zonas de tratamiento, cada uno de una superficie de aproximadamente 1 x 3 cm) en la piel tratada usando una pipeta Gilson.

Inyección intramuscular (IM): Se inyectó la vacuna (volumen de 100 µl) en el músculo cuádriceps usando una aguja 30Ga estándar y una jeringa de 1 cm3.

(Formulación líquida) intranasal (IN): se pulverizó la vacuna (volumen de 100 µl) en una narina usando el dispositivo pulverizador nasal de Penn–Century.

Administración intranasal (IN) con una formulación de partículas aerodinámicamente ligeras (PAL) de la invención: se llenó cada cápsula con 10 mg de polvo. La administración se realizó impulsando 5 ml de aire a través del dispositivo y en la narina. Adyuvantes: Alhidrogel (Al(OH)3 al 2%; Superfos Biosector), oligonucleótido CpG (TCCATGACGTTCCTGACGTT; Proligo, LLC), 50 µg/conejo.

Animales: conejos hembra blancos de Nueva Zelanda (NZW).

Calendario de inmunizaciones: Los ratones fueron inmunizados los días 0, 21 y 42.

Dosis de antígeno: 50 µg de APr por inmunización.

Número de animales: Total = n = 6 o n = 9 por grupo. Se sometieron seis animales de cada grupo la prueba de provocación letal. El resto de los animales fue sacrificado para realizar un lavado bronquioalveolar (LBA), nasal o vaginal el día 56. Véanse los grupos experimentales que se presentan más abajo

Recogida de sangre: la sangre se recogió el día 0 (“d0”, presangrado), el día 21 (antes de la inmunización 2), el día 35 (antes de la inmunización 3) y el día 56.

Análisis: los análisis fueron los convencionales y/o se realizaron según lo descrito en otra parte de la presente memoria.

Se midieron los títulos de Ig total en suero el día 21, 35 y 56. Se analizó la Ig total específica del APr del suero de conejos individuales mediante ELISA. Se midieron los títulos de Ig total en el LBA el día 56. Se midieron los títulos de IgA del LBA el día 56. Se midieron los títulos de IgA nasal el día 56 y los títulos de IgA vaginal el día 56. Se midieron los títulos de IgA en suero el día 56. Se determinaron los títulos neutralizante de AP/TL en cultivos de monocitos el día 21, 35 y 56, según lo descrito anteriormente.

El prueba de provocación letal con aerosol se realizó con una DL50 de ~100 esporas de carbunco, según lo descrito anteriormente (Pitt et al., “Vaccine” 19:4768–4773, 2001). La prueba de provocación se realizó a las 6 semanas de la tercera dosis de vacuna.

Tabla 6: Grupos experimentales

Grup o n.º

n.º Administración Adyuvante

1

*9 IN CpG líquido

2

*9 Solovent IN CpG, CD

3

*9 Solovent IN CpG, CDP

4

*9 Solovent IN Quit + CpG, CD

5

*9 Solovent IN Quit + CpG, CDP

6

*9 MAH ID CpG

12

6 MAH ID

13

6 MAH ID Alumbre

9

6 IM CpG

10

6 IM Alumbre

11

*9 IM

7

*9 MAM CpG

14

6 MAM Alumbre

8

6 Tópica CpG

* Indica los grupos con animales sacrificados para el lavado LBA, nasal y vaginal

10

Preparación de partículas de APr mediante CDP:

Para las muestras de APr por CDP en polvo seco usadas en este ejemplo, se generaron partículas líquidas de soluciones que contenían PAr y excipientes usando una boquilla AccuSpray BD según lo descrito en la solicitud n.º 10/299.012 publicada como US 2003/0180755A1. El diámetro de volumen medio de las partículas líquidas

15 producidas mediante este procedimiento es de entre 50 μm y 100 μm. Las gotas congeladas se secaron mediante liofilización (criocongelación, al vacío) con un aparato de liofilización convencional.

Las composiciones usadas en el estudio de prueba de provocación de los conejos fueron:

Grupo 3

Grupo 5

APr

1,231 ml (1,125 mg) 1,231 ml (1,125 mg)

Trehalosa

0,2246 g 0,2041 g

(continuación)

Grupo 3

Grupo 5

CpG

0,512 ml (1,1264 mg) 0,512 ml (1,1264 mg)

Quitosán

––––––––––– 0,0064 g

En los siguientes ejemplos, las partículas se congelaron pulverizándolas en un recipiente (tal como un matraz de criodesecación de Virtis) que contenía nitrógeno líquido, luego se conectó el recipiente a un liofilizador convencional y se evaporó el exceso de nitrógeno líquido. Se secó el aerosol congelado en aproximadamente 48 horas hasta

5 alcanzar un nivel de humedad inferior al 3% en peso.

Para la muestra 4, se criodesecó por pulverización el quitosán de una solución que contenía quitosán al 20% en peso y trehalosa al 80% en peso usando una boquilla AccuSpray BD como la descrita anteriormente. Entonces se mezclaron el APr de CDP y el quitosán de CDP mediante agitación en un vial.

Preparación de partículas de APr mediante CD:

10 Para las muestras de APr de CD en polvo seco usadas en este ejemplo, se secó la solución congelada mediante liofilización (criodesecación al vacío) usando un aparato de liofilización convencional. Este procedimiento se denominó en general procedimiento de “criodesecación” o CD, y las composiciones elaboradas mediante el procedimiento se denominan composiciones de “criodesecación” o CD.

Las composiciones usadas en el estudio de la prueba de provocación de los conejos fueron:

Grupo 2

Grupo 4

APr

1,477 ml (1,35 mg) 1,477 ml (1,35 mg)

Trehalosa

0,2699 g 0,2402 g

CpG

0,614 ml (1,3508 mg) 0,614 ml (1,3508 mg)

Quitosán

––––––––––– 0,0075 g

15 Se congelaron las soluciones que contenían APr, trehalosa y CpG colocando los viales que contenían las soluciones en un baño de hielo seco. Luego se secaron los viales que contenían la solución congelada usando un aparato de liofilización convencional para alcanzar un nivel de humedad inferior al 3% en peso. Para la muestra 3, se trituró entonces el polvo seco durante 30 usando un molino de bolas de “culebreo”. La muestra 5 se preparó añadiendo la muestra de quitosán secada de CDP, que fue preparada según lo descrito anteriormente, y triturando durante 30

20 usando un molino de bolas de “culebreo”. El procedimiento de trituración dio como resultado un diámetro de volumen medio de entre 50 μm y 100 μm.

Ejemplo 7 – Títulos de los anticuerpos en suero el día 21, día 35 y día 56

Los títulos de los anticuerpos en suero del día 21, día 35 y día 56 se presentan en las Tablas 7–9.

Tabla 7. Títulos de anticuerpos en suero tras 1 dosis de vacuna (día 21)

Conejo

Grupo 1 CpG lic. IN Grupo 2 CpG, CD Grupo 3 CpG, CDP Grupo 4 Quit + CpG, CD Grupo 5 Quit + CpG, CDP

1 2 3 4

400 1.600 3.200 3.200 3.200 3.200 3.200 1.600 400 1.600 3.200 400 400 1.600 3.200 1.600 6.400 25.600 fallecido 12.800

Conejo

Grupo 1 CpG lic. IN Grupo 2 CpG, CD Grupo 3 CpG, CDP Grupo 4 Quit + CpG, CD Grupo 5 Quit + CpG, CDP

5 6 7 8 9

6.400 800 3.200 1.600 3.200 800 800 400 1.600 3.200 1.600 3.200 400 1.600 3.200 3.200 25.600 3.200 6.400 3.200 12.800 6.400 omitido 12.800 6.400

Media

2.622 2.000 1.733 5.378 11.886

TGM

2.016 1.600 1.270 2.963 10.500

Grupo 6

Grupo 12 Grupo 13 Grupo 9 Grupo 10 Grupo 11

Conejo

CpG ID ID alumbre ID CpG IM Alumbre IM IM

1

6.400 6.400 102.400 6.400 25.600 12.800

2

25.600 3.200 204.800 12.800 25.600 6.400

3

200 3.200 12.800 3.200 12.800 25.600

4

3.200 6.400 25.600 6.400 51.200 3.200

5

12.800 3.200 102.400 25.600 25.600 1.600

6

3.200 12.800 409.600 25.600 51.200 6.400

7

3.200 6.400

8

3.200 12.800

9

6.400 25.600

Media

7.133 5.867 142.933 13.333 32.000 11.200

TGM

4.032 5.080 81.275 10.159 28.735 8.063

Grupo 7

Grupo 14 Grupo 8

Conejo

CpG, Alumbre, MAM CpG

MAM

tópico

1

1.600 <50 <50

2

200 <50 <50

3

3.200 <50 <50

4

400 200 <50

5

6.400 1.600 <50

6

6.400 1.600 <50

Conejo

Grupo 7 CpG, MAM Grupo 14 Alumbre, MAM Grupo 8 CpG tópico

7 8 9

1.600 6.400 800

Media

3.000 567 < 50

TGM

1.728 < 50 < 50

Tabla 8. Títulos de anticuerpos en suero tras 2 dosis de vacuna (día 35) Tabla 9. Títulos de anticuerpos en suero tras 3 dosis de vacuna (día 56)

Conejo

Grupo 1 CpG lic. IN Grupo 2 CpG, CD Grupo 3 CpG, CDP Grupo 4 Quit + CpG, CD Grupo 5 Quit + CpG, CDP

1 2 3 4 5 6 7 8 9

51.200 51.200 1.638.400 409.600 819.200 102.400 819.200 102.400 409.600 409.600 409.600 409.600 204.800 51.200 409.600 204.800 819.200 102.400 204.800 204.800 102.400 204.800 409.600 409.600 409.600 204.800 409.800 409.600 409.600 409.600 1.638.400 409.600 819.200 409.600 819.200 409.600 204.800 819.200 fallecido 409.600 409.600 409.600 omitido 409.600 819.200

Media

489.244 335.644 284.467 637.156 497.371

TGM

258.032 258.032 258.046 557.380 452.235

Grupo 12

Grupo 6 Grupo 13 Grupo 9 Grupo 10 Grupo 11

Conejo

ID CpG ID alumbre CpG IM Alumbre IM

ID

IM

1

819.200 1.638.400 6.553.600 819.200 1.638.400 1.638.400

2

204.800 3.276.800 6.553.600 1.638.400 6.553.600 1.638.400

3

102.400 102.400 1.638.400 819.200 819.200 3.276.800

4

409.600 819.200 819.200 1.638.400 1.638.400 819.200

5

819.200 204.800 819.200 819.200 1.638.400 819.200

6

409.600 409.600 1.638.400 409.600 1.638.400 819.200

7

409.600 819.200

Grupo 12

Grupo 6 Grupo 13 Grupo 9 Grupo 10 Grupo 11

Conejo

ID CpG ID alumbre CpG IM Alumbre IM

ID

IM

8

409.600 1.638.400

9

819.200 819.200

Media

460.800 898.844 3.003.733 1.024.000 2.321.067 1.365.333

TGM

364.912 557.380 2.064.255 919.521 1.839.042 1.204.006

Conejo

Grupo 7 CpG, MAM Grupo 14 Alumbre, MAM Grupo 8 CpG tópico

1 2 3 4 5 6 7 8 9

51.200 51.200 204.800 6.400 409.600 204.800 102.400 409.600 102.400 102.400 51.200 < 50 6.400 204.800 409.600 50 51.200 6.400 < 50 6.400 < 50

Media

171.378 129.067 10.675

TGM

102.400 11.882 217

Conejo

Grupo 1 CpG lic. IN Grupo 2 CpG, CD Grupo 3 CpG, CDP Grupo 4 Quit + CpG, CD Grupo 5 Quit + CpG, CDP

1 2 3 4 5 6 7 8

51.200 204.800 819.200 204.800 204.800 51.200 102.400 204.800 409.600 51.200 819.200 204.800 409.600 409.600 204.800 409.600 819.200 819.200 204.800 409.600 204.800 204.800 409.600 409.600 819.200 819.200 409.600 819.200 819.200 3.276.800 819.200 1.638.400 819.200 819.200 fallecido 1.638.400 409.600 409.600 omitido 409.600

Conejo

Grupo 1 CpG lic. IN Grupo 2 CpG, CD Grupo 3 CpG, CDP Grupo 4 Quit + CpG, CD Grupo 5 Quit + CpG, CDP

9

204.800 1.638.400 204.800 409.600 819.200

Media

227.556 506.311 409.600 1.092.267 760.686

TGM

162.550 351.127 351.127 884.785 672.019

Grupo 6

Grupo 12 Grupo 13 Grupo 9 Grupo 10 Grupo 11

Conejo

CpG ID ID alumbre CpG IM Alumbre IM

ID

IM

1

409.600 6.553.600 1.638.400 1.638.400 1.638.400 6.553.600

2

409.600 204.800 409.600 3.276.800 3.276.800 3.276.800

3

204.800 409.600 819.200 1.638.400 819.200 13.107.200

4

819.200 204.800 1.638.400 1.638.400 3.276.800 13.107.200

5

409.600 819.200 6.553.600 3.276.800 3.276.800 3.276.800

6

204.800 409.600 3.276.800 1.638.400 1.638.400 13.107.200

7

409.600 3.276.800

8

409.600 6.553.600

9

1.638.400 6.553.600

Media

546.133 1.433.600 2.389.333 2.184.533 2.321.067 7.645.867

TGM

442.392 579.262 1.638.400 2.064.255 2.064.255 6.553.600

Grupo 7

Grupo 14 Grupo 8

Conejo

CpG, Alumbre, MAM CpG

MAM

tópico

1

25.600 409.600 3.200

2

204.800 204.800 51.200

3

102.400 < 50 1.600

4

25.600 204.800 fallecido

5

51.200 204.800 25.600

6

102.400 409.600 100

7

204.800

8

409.600

9

51.200

Media

130.844 238.933 16.340

Conejo

Grupo 7 CpG, MAM Grupo 14 Alumbre, MAM Grupo 8 CpG tópico

TGM

87.782 33.608 3.675

Tras la dosis 1 de vacuna, la respuesta total de los anticuerpos en suero más elevada se produjo en el grupo de alumbre ID, coincidiendo con los resultados del estudio murino presentado anteriormente. El título medio aritmético 5 de este grupo fue de 142.933 en comparación con el título medio de 32.000 del grupo de alumbre IM. La administración IN también produjo títulos de anticuerpos en suero relevantes tras una sola dosis de vacuna, aunque en general inferiores a los alcanzados mediante la inyección ID o IM. Los conejos inmunizados IN con la formulación en polvo de CDP que contenía adyuvante de quitosán y CpG generaron la respuesta total inducida IN más potente con un título medio en suero de 10.500 en comparación con un título de 2.016 del grupo inmunizado IN con la

10 formulación líquida estándar.

Los dispositivos de MAM permitieron la administración tópica de la vacuna contra el carbunco, pues se generaron respuestas de los anticuerpos relevantes tras 1 dosis de vacuna en los grupos 7 y 14, mientras que ninguno de los conejos del grupo tópico (grupo 8) generó una respuesta detectable.

Tras la segunda dosis de vacuna, todos los grupos mostraron un aumento significativo de los títulos de los

15 anticuerpos en suero. Como tras la primera dosis, la respuesta total más potente fue generada en el grupo de alumbre ID con MAH con un título medio de 3.003.733, en comparación con una media de 2.321.067 en los conejos inmunizados IM con APr más alumbre.

Tras la tercera dosis de vacuna, todos los grupos dieron positivo en anticuerpos específicos del AP en el suero. En términos generales, los títulos inducidos ID e IM fueron superiores, seguidos por la administración IN, con MAM y 20 tópica.

Ejemplo 9 – Títulos de los anticuerpos mucosos el día 56

Las Tablas 10–12 muestran los títulos de los anticuerpos del día 56 en diversos tejidos. La Tabla 10 muestra los títulos de IgA específica del AP de fluido de LBA; la Tabla 11 muestra los títulos de IgA específica del AP de fluido nasal; la Tabla 12 muestra los títulos de IgA específica del AP de fluido vaginal. Los resultados presentados en la 25 Tabla 10 muestran que las composiciones de vacuna contra el carbunco y los procedimientos de la presente invención producen respuestas inmunes mucosas en el LBA. Los resultados presentados en la Tabla 11 muestran que las composiciones de vacuna contra el carbunco y los procedimientos de la presente invención producen respuestas inmunes mucosas en la cavidad nasal. Los resultados presentados en la Tabla 12 muestran que las composiciones de vacuna contra el carbunco y los procedimientos de la presente invención producen respuestas

30 inmunes mucosas en el tejido vaginal, un tejido mucoso remoto distante de las zonas de administración de la vacuna.

Tabla 10: Títulos de los anticuerpos (IgA total) del fluido de LBA (día 56)

ID del conejo

Grupo 1 CpG lic. IN ID del conejo Grupo 2 CpG IN por CD Grupo 3 ID del conejo CpG IN por CDP Grupo 4 ID del conejo CpG+Qui t IN por CD Grupo 5 ID del conejo CpG+Quit IN por CDP

1–2 < 2 1–3 1–7

16 128 2–3 2–5 2–7 2 <2 <2 3–1 3–6 3–7 <2 <2 16 4–2 4–3 4–6 4 <2 <2 5–4 5–5 16 4

Media

72 <2 5 <2 10

TGM

45 <2 3 <2 8

Grupo 6

Grupo 7

Grupo 11

ID del

ID del

ID del

CpG ID

CpG, MAM

IM

conejo

conejo

conejo

6–1

2 7–1 8 11–3 8

6–3

8 7–6 <2 11–5 <2

6–9

8 7–9 2 11–6 16

Media

6 5 12

TGM

5 3 5

Tabla 11: Títulos de IgA nasal (día 56)

Grupo 1

Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5

ID del conejo

CpG lic. IN ID del conejo CpG IN por CD ID del conejo CpG IN por CDP ID del conejo CpG+Qui t IN por CD ID del conejo CpG+Quit IN por CDP

1–2

8 2–3 <2 3–1 4 4–2 4 5–4 <2

1–3

16 2–5 4 3–6 8 4–3 <2 5–5 <2

1–7

32 2–7 8 3–7 32 4–6 4

Media

19 6 15 3 <2

TGM

16 3 10 3 <2

Grupo 6

Grupo 7 Grupo 11

ID del conejo

CpG ID ID del conejo CpG, MAM ID del conejo IM

6–1

<2 7–1 16 11–3 4

6–3

2 7–6 2 11–5 4

6–9

<2 7–9 16 11–6 <2

Media

<2 11 3

TGM

<2 8 3

Tabla 12: Títulos de IgA vaginal (día 56)

Grupo 1 ID del conejo CpG lic. IN

Grupo 2 ID del conejo CpG IN por CD Grupo 3 ID del conejo CpG IN por CDP Grupo 4 ID del conejo CpG+Qui t IN por CD Grupo 5 ID del conejo CpG+Quit IN por CDP

1–2 <5

2–3 5 3–1 <5 4–2 <5 5–4 <5

(continuación)

Grupo 1

Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5

ID del conejo CpG lic. IN

ID del conejo CpG IN por CD ID del conejo CpG IN por CDP ID del conejo CpG+Qui t IN por CD ID del conejo CpG+Quit IN por CDP

1–3 5

2–5 <5 3–6 <5 4–3 <5 5–5 <5

1–7 <5

2–7 <5 3–7 <5 4–6 <5

Media <5

<5 <5 <5 <5

TGM <5

<5 <5 <5 <5

Grupo 6

Grupo 7 Grupo 11

ID del conejo CpG ID

ID del conejo CpG, MAM ID del conejo IM

6–1 5

7–1 <5 11–3 5

6–3 <5

7–6 <5 11–5 <5

6–9 <5

7–9 10 11–6 <5

Media <5

<5 <5

TGM <5

<5 <5

Ejemplo 10 – Respuesta de los anticuerpos neutralizantes

5 Se midió la neutralización del carbunco añadiendo diluciones de sueros de conejos vacunados y conejos control a cultivos de monocitos incubados con concentraciones líticas del AP y de la toxina letal (TL) de B. anthracis. Este análisis representa una correlación in vitro de la protección contra la enfermedad del carbunco. Se determinó la viabilidad celular midiendo el ATP intracelular. Los resultados se muestran en la figura 8. Tras una dosis de vacuna, los títulos de Ac neutralizantes totales más altos fueron observados en el grupo de alumbre ID; los niveles de Ac

10 neutralizantes de este grupo fueron mayores que los generados en uno cualquiera de los grupos de inyección IM. La administración IN y con MAM también produjo títulos de Ac neutralizantes relevantes tras una sola dosis de vacuna a niveles que fueron comparables con los inducidos por la inyección IM. Tras la segunda dosis de vacuna, los títulos de Ac neutralizantes resultaron ser comparables en los grupos de IM, MAH e IN. Sólo se hizo evidente un efecto de refuerzo tras la 3ª dosis de vacuna en los grupos de IN que recibieron vacuna formulada en polvo. La administración

15 con MAM permitió la administración tópica de la vacuna contra el carbunco, pues no se hizo evidente ninguna respuesta detectable de los Ac neutralizantes en el grupo tratado tópicamente en ausencia del dispositivo MAM. Así pues, la composición de vacuna y los procedimientos de la presente invención producen Ac neutralizantes a niveles que son al menos tan potentes como los inducidos mediante una inyección IM convencional.

Ejemplo 11 – Resumen de la respuesta inmune protectora: supervivencia tras la prueba de provocación con 20 aerosol de esporas de carbunco.

En la Tabla 13, se resumen los datos obtenidos con los diversos tipos de administración.

TABLA 13. Protección entre los conejos vacunados contra la prueba de provocación de Bacillus anthracis en aerosol

Grupo Vacunación Prueba de provocación con B. anthracis1 cepa Antígeno3 (μg) Adyuvante3 (μg) n.º Vía DL60s2 (media ± DE) Vivo/total (%)

NZW control preinmune NZW sólo con antígeno NZW con antígeno/adyuvante NZW con antígeno/adyuvante – APr (50) APr (50) APr (50) APr (50) APr (50) APr (50) APr (50) APr (50) APr (50) APr (50) APr (50) APr (50) APr (50) APr (50) – ninguno ninguno alumbre (360) alumbre (360) alumbre (360) CpG (50) CpG (50) CpG (50) CpG (50) CpG (50) CpG (50) CpG (50) CpG/Quit. (50) CpG/Quit. (50 – 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 – intramuscular MAH Intramuscular MAH MAM Tópica MAM MAH Intramuscular Intranasal4 Intranasal;CDP5 Intranasal; CD6 Intranasal; CDP5 Intranasal; CD6 105 ± 38 107 ± 49 91 ± 63 107 ± 58 111 ± 34 11,1 ± 34 80 ± 25 81 ± 47 101 ± 50 101 ± 70 96 ± 44 133 ± 35 106 ± 54 113 ± 29 101 ± 51 0/8 (0) 6/6 (100) 6/6 (100) 5/6 (83) 6/6 (100) 2/6 (33) 1/6 (17) 3/6 (50) 5/6 (83) 5/6 (83) 4/6 (67) 5/8 (83) 8/6 (100) 6/6 (100) 6/6 (100)

1 Cepa de Ames, proporcionada por el Dr. Bruce Ivins, Departamento de Bacteriología, USAMRIID. 2 Número total de DL50 s de aerosol dado calculado a 103 ± 44 (media ± DE). 3 La cantidad entre paréntesis es por vacunación. 4 Formulación líquida de antígeno/adyuvante. 5 Formulación en polvo de antígeno/adyuvante criodesecada por pulverización. 6 Formulación en polvo de antígeno/adyuvante criodesecada.

El patrón actual para la vacunación contra el carbunco consiste en una inyección IM de vacuna que contiene alumbre como adyuvante. En este estudio, este patrón proporcionó una protección parcial (83%) contra la prueba de provocación letal (Tabla 13). Por el contrario, la administración ID con MAH de APr más alumbre o APr sin adyuvante proporcionó una protección completa (100%). En general, la elección del adyuvante para los grupos de IM o ID no pareció desempeñar un papel fundamental en la determinación de la eficacia protectora a la dosis del APr empleada en este estudio. La administración IN de una formulación líquida proporcionó una protección del 67%, mientras que la administración IN de la formulación en polvo de la presente invención proporcionó una protección completa (100%). La administración tópica con MAM proporcionó una protección de hasta el 50% en comparación con sólo el 17% obtenido mediante la administración tópica en ausencia de un dispositivo. En términos generales, los resultados del estudio de la prueba de provocación letal demuestran que dirigiéndose a la piel y a la mucosa nasal mediante los

5 procedimientos y las formulaciones de la presente invención, se puede conseguir una protección contra el carbunco total. Esta es la primera vez que se ha demostrado la protección dirigiéndose a los mismos tejidos mediante los cuales se adquiere la enfermedad del carbunco de forma natural y armada del patógeno (es decir, la piel y el sistema respiratorio).

Ejemplo 12 – Beneficios de reducción de las dosis

10 Los resultados de los estudios con ratones y conejos presentados anteriormente muestran que la administración ID mediante una MAH proporciona respuestas inmunes más potentes que la inyección IM tras una sola dosis de vacuna. Así pues, la administración ID a través de una MAH puede permitir una reducción del número de dosis necesario de vacuna contra el carbunco para producir el efecto protector. Además, en base a estos resultados, como es natural, la administración ID con MAH puede proporcionar beneficios de reducción de las dosis; es decir, puede

15 permitir el uso de una cantidad reducida de APr por dosis para alcanzar el mismo nivel o un nivel superior de respuesta inmune y protección que el conseguido usando una dosis completa de vacuna mediante la vía IM.

Claims (30)

1.– Una composición inmunógena contra el carbunco que comprende partículas sólidas secadas que tienen un diámetro de volumen medio de entre 35 µm y 300 µm, en la que al menos el 50% de dichas partículas secadas tiene un diámetro de volumen de hasta el 80% del medio, y dichas partículas secadas tienen una diámetro medio aerodinámico de entre 8 µm y 140 µm.

2.– La composición inmunógena contra el carbunco de la reivindicación 1, composición que está elaborada mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

(i)

atomizar una formulación líquida de una composición inmunógena contra el carbunco para producir una formulación atomizada,

(ii)

congelar dicha formulación atomizada para formar partículas sólidas y

(iii) secar dichas partículas sólidas para obtener partículas secadas. 3.– La composición de la reivindicación 1 ó 2 que es una vacuna contra el carbunco. 4.– La composición de la reivindicación 3, en la que la vacuna contra el carbunco:

(i)

es una vacuna contra el carbunco absorbida (VCA); o

(ii)

es una vacuna de antígeno protector recombinante (APr); o

(iii) comprende un adyuvante; o

(iv)

no contiene un adyuvante; o

(v)

comprende partículas secadas que tienen un diámetro de volumen medio de entre 35 µm y 300 µm; o

(vi)

es reconstituida para formar una formulación líquida que está esencialmente constituida por dicha composición contra el carbunco y agua.

5.– La composición de la reivindicación 3, en la que la vacuna contra el carbunco comprende un agente inmunógeno y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6.– La composición de la reivindicación 5, en la que la vacuna contra el carbunco:

(i)

es una vacuna VCA; o

(ii)

es una vacuna de APr.

7.– La composición de la reivindicación 3, en la que la vacuna contra el carbunco está elaborada mediante un procedimiento que comprende:

(i)

atomizar una formulación líquida de una composición de vacuna contra el carbunco para producir una formulación atomizada que comprende gotas que tienen un diámetro medio de entre 35 µm y 300 µm,

(ii)

congelar dicha formulación atomizada para formar partículas sólidas y

(iii) secar dichas partículas sólidas para obtener partículas secadas. 8.– Un procedimiento para preparar una vacuna contra el carbunco que comprende:

(i)

atomizar una formulación líquida de una composición de vacuna contra el carbunco para producir una formulación atomizada,

(ii)

congelar dicha formulación atomizada para formar partículas sólidas y

(iii) secar dichas partículas sólidas para obtener partículas sólidas que tienen un diámetro de volumen medio de entre 35 µm y 300 µm, en las que al menos el 50% de dichas partículas secadas tiene un diámetro de volumen de hasta el 80% del medio, y dichas partículas secadas tienen una diámetro medio aerodinámico de entre 8 µm y 140 µm, preferiblemente, dichas partículas secadas tienen un diámetro de volumen medio de entre 50 µm y 300 µm.

9.– El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha formulación líquida de dicha composición de vacuna contra el carbunco está esencialmente constituida por dicha vacuna contra el carbunco y agua.

11.– El uso de la reivindicación 10, en el que:

(i)

la vacuna contra el carbunco es una vacuna contra el carbunco absorbida (VCA); o

(ii)

la vacuna contra el carbunco es una vacuna de antígeno protector recombinante (APr); o

(iii) la vacuna contra el carbunco comprende un adyuvante; o

(iv)

la vacuna contra el carbunco no contiene un adyuvante; o

(v)

la vacuna contra el carbunco es adecuada para una administración intranasal; o

(vi)

la vacuna contra el carbunco es adecuada para una administración en una membrana mucosa; o

(vii) la vacuna contra el carbunco es adecuada para reducir la cantidad de vacuna contra el carbunco necesaria para producir un resultado eficaz mediante la administración intranasal.

12.

El uso de la reivindicación 10, en el que dicha vacuna es adecuada para una administración intranasal.

13.

El uso de la reivindicación 10 ó 11, en el que la vacuna es adecuada para vacunar a un paciente contra el carbunco.

14.

El uso de la reivindicación 13, en el que dicha vacuna es adecuada

(i)

para la administración intranasal; o

(ii)

para ser administrada como parte de una pauta de estimulación más recuerdo; o

(iii) para una administración intradérmica a una profundidad de entre 0,025 y 2,5 mm en la piel del paciente; preferiblemente, el medicamento es adecuado para su administración mediante al menos una aguja hueca que tenga una salida con una altura expuesta de entre 0 y 1 mm, siendo dicha salida insertable en la piel hasta una profundidad de entre 0,5 mm y 2 mm.

15.

El uso de la reivindicación 10, en el que la vacuna produce una respuesta inmune en un mamífero que es igual o superior que la respuesta tras la administración de la misma cantidad de medicamento mediante una inyección subcutánea o intramuscular.

16.

El uso de la reivindicación 15, en el que la aguja es una microaguja de entre 0,23 y 0,025 mm (calibre 31 y 50), preferiblemente, la microaguja está en una disposición de microagujas.

17.

El uso de la reivindicación 11 para la expresión de inmunidad protectora mediante la administración de dicha vacuna contra el carbunco inmunógena en un espacio intradérmico en la piel de un sujeto humano a través de una aguja de poco calibre insertada en el espacio intradérmico, aguja que tiene una salida con una altura expuesta de entre 0 y 1 mm, y es insertada a una profundidad de entre 0,025 mm y 2,5 mm en la piel, mediante lo que se mejora la inmunogenicidad de la vacuna contra el carbunco.

18.

El uso de la reivindicación 11 para la expresión de inmunidad protectora mediante la administración de dicha vacuna contra el carbunco inmunógena en la piel de un sujeto humano mediante la abrasión de la piel y la administración de la vacuna contra el carbunco en la piel excoriada, en el que la piel es

(i)

sometida a abrasión antes de administrar la vacuna contra el carbunco; o

(ii)

sometida a abrasión simultáneamente a la administración de la vacuna contra el carbunco, mediante lo que se mejora la inmunogenicidad de la vacuna contra el carbunco.

19. El uso de la reivindicación 17 ó 18, en el que:

(i)

la vacuna contra el carbunco es una vacuna contra el carbunco absorbida (VCA); o

(ii)

la vacuna contra el carbunco es una vacuna de antígeno protector recombinante (APr); o

(iii) la vacuna contra el carbunco comprende un adyuvante; o

(iv) la vacuna contra el carbunco no contiene un adyuvante.

20.

El uso de la reivindicación 18, en el que la piel es sometida a abrasión al menos dos veces.

21.

El uso de la reivindicación 18, en el que la piel es sometida a abrasión en direcciones alternas.

22.

El uso de la reivindicación 18, en el que la vacuna contra el carbunco inmunógena es aplicada en la piel en forma líquida.

23.

El uso de la reivindicación 18, en el que la vacuna contra el carbunco inmunógena es aplicada en la piel desde un dispositivo de abrasión.

24.

El uso de la reivindicación 23, en el que la vacuna contra el carbunco inmunógena es un polvo, un gel o una película sobre una superficie abrasiva de un dispositivo de abrasión.

25.

El uso de la reivindicación 24, en el que se aplica un líquido reconstituyente en la piel antes de la abrasión.

26.

El uso de la reivindicación 24, en el que se aplica un líquido reconstituyente en la piel simultáneamente a la abrasión.

27.

Un kit que comprende una cantidad eficaz de una vacuna contra el carbunco de la reivindicación 3.

28.

El kit de la reivindicación 27 que comprende además un medio para administrar la vacuna intranasalmente.

29.

El kit de la reivindicación 27 que comprende un microabrasímetro que comprende una superficie abrasiva y una cantidad eficaz de una vacuna contra el carbunco.

30.

El kit de la reivindicación 29, en el que:

(i)

la vacuna contra el carbunco reviste la superficie del microabrasímetro; o

(ii)

la vacuna contra el carbunco está contenida en un depósito integrado en el microabrasímetro.

31.

El kit de la reivindicación 27, en el que la vacuna contra el carbunco está envasada por separado dentro del kit.

32.

El kit de la reivindicación 27 que comprende un dispositivo de administración adecuado para la administración intradérmica de una sustancia hasta una profundidad de entre 0,025 y 2,5 mm de la piel de un paciente y una dosis eficaz de una vacuna contra el carbunco.

33.

El kit de la reivindicación 32, en el que dicho dispositivo de administración comprende al menos una microaguja hueca diseñada para la administración intradérmica de una sustancia hasta una profundidad de entre 0,025 y 2,5 mm de la piel de un paciente, y el dispositivo de administración comprende o está adaptado para recibir un depósito que contiene una vacuna contra el carbunco de modo que la microaguja esté comunicada con el mismo.

34.

El kit de la reivindicación 33, en el que:

(i)

la dosis está contenida en un depósito que forma parte integral del, o es capaz de estar unido funcionalmente al, dispositivo de administración; o

(ii)

la microaguja hueca es de entre 0,23 y 0,025 mm (calibre 31 y 50); o

(iii) el dispositivo comprende una disposición de microagujas.