ES2358824B1 - GROUP OR MODIFIED HIV-1 RETROTRANSCRIPTASE. - Google Patents
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Abstract
Retrotranscriptasa del VIH-1 de grupo O modificada.#La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Más concretamente, se refiere a retrotranscriptasas aisladas de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) de grupo O y modificadas en la posición 75 y/o en la posición 478, que presentan una elevada fidelidad de copia y termoestabilidad, así como a su uso para llevar a cabo la retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde. La invención se refiere, además, a un método para obtener dichas retrotranscriptasas.Modified group O HIV-1 retrotranscriptase. # The present invention falls within the field of biotechnology. More specifically, it refers to retrotranscriptases isolated from a human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) of group O and modified at position 75 and / or position 478, which have high copy fidelity and thermostability, as well as its use to carry out the retrotranscription, amplification or sequencing of a template nucleic acid. The invention also relates to a method for obtaining said retrotranscriptases.
Description
Retrotranscriptasa del VIH-1 de grupo O modificada. Modified group O-1 HIV-1 retrotranscriptase.
La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Más concretamente, se refiere a retrotranscriptasas aisladas de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) de grupo O y modificadas que presentan una elevada fidelidad de copia y termoestabilidad, así como a su uso para llevar a cabo la retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde. La invención se refiere, además, a un método para obtener dichas retrotranscriptasas. The present invention falls within the field of biotechnology. More specifically, it refers to isolated retrotranscriptases of a type 1 (HIV-1) type 1 (HIV-1) human immunodeficiency virus that have high copy and thermostability, as well as its use to carry out back transcription, ampli fi cation or sequencing of a template nucleic acid. The invention also relates to a method of obtaining said retrotranscriptases.
Estado de la técnica anterior Prior art
La enzima responsable de la replicación del genoma de los retrovirus se denomina retrotranscriptasa (RT) (o transcriptasa inversa). Esta enzima convierte el ARN genómico monocatenario en ADN bicatenario capaz de integrarse en el genoma de la célula hospedadora [revisado por Telesnitsky y Goff. En Retroviruses. Coffin et al. (ed.), p. 121160, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview EE.UU., 1997], Se trata de una polimerasa capaz de sintetizar ADN, utilizando como molde ARN ó ADN, indistintamente. Además, la RT posee actividad endonucleasa (RNasa H), que le permite degradar el molde ARN durante el proceso de síntesis de ADN dependiente de ARN. The enzyme responsible for the replication of the genome of retroviruses is called retrotranscriptase (RT) (or reverse transcriptase). This enzyme converts single-stranded genomic RNA into double-stranded DNA capable of integrating into the genome of the host cell [reviewed by Telesnitsky and Goff. In Retroviruses. Cof fi n et al. (ed.), p. 121160, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview USA, 1997], It is a polymerase capable of synthesizing DNA, using RNA or DNA as a template, interchangeably. In addition, RT has endonuclease activity (RNase H), which allows it to degrade the RNA template during the RNA-dependent DNA synthesis process.
Por tanto, las RTs de retrovirus son enzimas útiles para la obtención de ADN complementario (ADNc) a partir de ARN mensajero, que una vez amplificado por técnicas convencionales [reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo] puede utilizarse para detectar expresión génica en organismos o tejidos. A partir de librerías de ADNc es posible seleccionar transcritos de genes que una vez amplificados por PCR pueden ser clonados en plásmidos Therefore, retrovirus RTs are useful enzymes for obtaining complementary DNA (cDNA) from messenger RNA, which once amplified by conventional techniques [polymerase chain reaction (PCR), for example] can be used to detect gene expression in organisms or tissues. From cDNA libraries it is possible to select gene transcripts that once amplified by PCR can be cloned into plasmids
o vectores virales. Para estas aplicaciones resulta interesante disponer de RTs que presenten una mayor estabilidad térmica, es decir, que retengan actividad polimerasa a temperaturas relativamente elevadas, ya que en estas condiciones disminuirían los niveles de estructura secundaria en el ARN y mejoraría el proceso de amplificación. Por otro lado, las RTs son enzimas que carecen de actividad exonucleasa y por tanto, son polimerasas con una tasa de error relativamente alta, por lo que un aumento de su fidelidad sería deseable si lo que se pretende es clonar los productos derivados del ADNc generado durante la retrotranscripción. or viral vectors. For these applications it is interesting to have RTs that have greater thermal stability, that is, to retain polymerase activity at relatively high temperatures, since under these conditions the levels of secondary structure in the RNA would decrease and the amplification process would be improved. On the other hand, RTs are enzymes that lack exonuclease activity and therefore are polymerases with a relatively high error rate, so an increase in their reliability would be desirable if what is intended is to clone products derived from the generated cDNA during retrotranscription.
Se han aislado y purificado RTs de diversos retrovirus. Entre ellas podemos citar, las del virus de mieloblastosis de aves (AMV), del virus Moloney de la leucemia de ratón (MLV) (Coté y Roth. Virus Res 2008; 134: 186-202), del virus de la anemia infecciosa equina (EIAV), del virus de la inmunodeficiencia de felinos (FIV), del virus de la inmunodeficiencia de bóvidos (BIV), del virus del tumor mamario de ratón (MMTV), del virus de la leucemia de bóvidos (BLV), y de espuma-retrovirus (revisado en Hizi y Herschhorn. Virus Res 2008; 134: 203-220); además de las RTs de virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) y tipo 2 (VIH-2) y de la inmunodeficiencia de simios (SIV). RTs from various retroviruses have been isolated and purified. Among them we can mention, those of the bird myeloblastosis virus (AMV), the Moloney virus of the mouse leukemia (MLV) (Coté and Roth. Virus Res 2008; 134: 186-202), of the equine infectious anemia virus (EIAV), feline immunodeficiency virus (IVF), bovine immunodeficiency virus (BIV), mouse mammary tumor virus (MMTV), bovine leukemia virus (BLV), and foam-retrovirus (reviewed in Hizi and Herschhorn. Virus Res 2008; 134: 203-220); in addition to the RTs of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and type 2 (HIV-2) and simian immunodeficiency (SIV).
Desde un punto de vista metodológico las RTs más utilizadas comercialmente en reacciones de amplificación son las de MLV, AMV y VIH-1. En el caso de la RT del VIH-1, la enzima de referencia en este tipo de análisis es una variante “wild-type”, que se clasifica filogenéticamente como perteneciente a subtipo B (grupo M). La RT del VIH-1 (subtipo B) es más estable que la RT del MLV a temperaturas superiores a 45ºC. From a methodological point of view, the most commercially used RTs in amplification reactions are those of MLV, AMV and HIV-1. In the case of HIV-1 RT, the reference enzyme in this type of analysis is a wild-type variant, which is phylogenetically classified as belonging to subtype B (group M). The HIV-1 RT (subtype B) is more stable than the MLV RT at temperatures above 45 ° C.
La expansión de la epidemia del SIDA y la caracterización de aislados virales del VIH en diferentes partes del mundo ha permitido constatar su gran heterogeneidad y ha conducido a la identificación de variantes de la RT alejadas filogenéticamente de la RT del VIH-1 de subtipo B. Entre ellas, las más alejadas son las pertenecientes al grupo O, que se caracterizan por presentar alrededor de un 20% de aminoácidos distintos cuando se comparan con secuencias prototipo “wild-type” de subtipo B (Quiñones-Mateu et al. Virology 1997; 236: 364-373). Las RTs “wild-type” de grupo O son resistentes naturales a nevirapina y otros inhibidores no análogos a nucleósido y presentan mayor estabilidad en presencia de urea que las RTs de subtipo B (Menéndez-Arias et al. J. Biol. Chem. 2001; 276: 27470-27479). Sin embargo, su expresión y purificación es difícil debido al escaso rendimiento de los procedimientos descritos hasta la fecha. The expansion of the AIDS epidemic and the characterization of HIV viral isolates in different parts of the world has allowed us to verify its great heterogeneity and has led to the identification of variants of the RT phylogenetically far from the RT of subtype B-type HIV-1. Among them, the furthest are those belonging to group O, which are characterized by having about 20% of different amino acids when compared with prototype "wild-type" sequences of subtype B (Quiñones-Mateu et al. Virology 1997; 236: 364-373). Group O wild-type RTs are naturally resistant to nevirapine and other non-nucleoside-like inhibitors and have greater stability in the presence of urea than subtype B RTs (Menéndez-Arias et al. J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 27470-27479). However, its expression and purification is difficult due to the poor performance of the procedures described to date.
La caracterización de RTs obtenidas mediante mutagénesis dirigida ha permitido estudiar el papel de distintos cambios de aminoácido sobre la fidelidad de copia, así como la inactivación de la actividad RNasa H de la RT del VIH-1 (subtipo B). Sin embargo, el contexto de la secuencia ha demostrado ser de gran importancia (Taube et al. Eur. J. Biochem. 1997; 250: 106-114), por lo que no parece probable que una mutación analizada en la RT del VIH-1 subtipo B pueda ejercer el mismo efecto en una variante del VIH-1 filogenéticamente alejada como la RT del VIH-1 de grupo O. The characterization of RTs obtained by means of directed mutagenesis has allowed us to study the role of different amino acid changes on copyity, as well as the inactivation of the RNase H activity of the HIV-1 RT (subtype B). However, the context of the sequence has proven to be of great importance (Taube et al. Eur. J. Biochem. 1997; 250: 106-114), so it seems unlikely that a mutation analyzed in the RT of HIV- 1 subtype B can exert the same effect on a variant of HIV-1 phylogenetically far away as the HIV-1 RT of group O.
Explicación de la invención Explanation of the invention.
La presente invención se refiere a retrotranscriptasas (RTs) aisladas de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) de grupo O y modificadas que presentan una elevada fidelidad de copia y termoestabilidad, así como a su uso para llevar a cabo la retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde. La invención se refiere, además, a un método para obtener dichas RTs. The present invention refers to retrotranscriptases (RTs) isolated from a group 1 human immunodeficiency virus (HIV-1) and modified with high copy stability and thermostability, as well as its use for carrying out retrotranscription, ampli fi cation or sequencing of a template nucleic acid. The invention also relates to a method for obtaining said RTs.
Las RTs de retrovirus son enzimas útiles, por ejemplo, para la obtención de ADN complementario a partir de ARN mensajero, que una vez amplificado puede ser clonado en un vector. Es deseable que las RTs que se utilicen con este fin presenten elevada estabilidad térmica, ya que en estas condiciones disminuirían los niveles de estructura secundaria en el ARN y mejoraría el proceso de amplificación. Sin embargo, las RTs son enzimas que carecen de actividad exonucleasa correctora de errores y por tanto, tienen una tasa de error relativamente alta, por lo que un aumento de su fidelidad sería deseable para poder ser empleadas con este fin. Retrovirus RTs are useful enzymes, for example, for obtaining complementary DNA from messenger RNA, which once ampli fi ed can be cloned into a vector. It is desirable that the RTs used for this purpose have high thermal stability, since under these conditions the levels of secondary structure in the RNA would decrease and the amplification process would improve. However, RTs are enzymes that lack error-correcting exonuclease activity and therefore have a relatively high error rate, so an increase in their reliability would be desirable in order to be used for this purpose.
En los ejemplos de la presente invención se describen mutantes de una RT aislada de un VIH-1 de grupo O (RT del VIH-1 de grupo O) cuya subunidad p66 ha sido modificada mediante la sustitución de la valina 75 por isoleucina (mutación V75I), de manera que se observa un incremento en su fidelidad de copia con respecto a la de la RT no modificada. Es importante tener en cuenta que las RTs del VIH-1 de grupo O portadoras de esta mutación presentan mayor fidelidad de copia y termoestabilidad que las RTs presentes en aislados o cepas del VIH-1 de grupo M subtipo B (RT del VIH-1 de subtipo B), empleadas actualmente con el mismo fin. In the examples of the present invention mutants of an isolated RT of a group O HIV-1 (group O HIV-1 RT) whose p66 subunit has been modified by replacing valine 75 with isoleucine (mutation V75I) are described ), so that there is an increase in its copy reliability with respect to that of the unmodified RT. It is important to take into account that the group O HIV-1 RTs carrying this mutation have a higher copy and thermostability than the RTs present in isolates or strains of group M HIV-1 subtype B (HIV-1 RT subtype B), currently employed for the same purpose.
Sin embargo, la mutación V75I en la RT del VIH-1 de grupo O conduce a una pérdida de termoestabilidad con respecto a la RT no modificada. En los ejemplos de la presente invención se demuestra como la introducción de un segundo cambio de aminoácido (mutación) consistente en la sustitución del ácido glutámico de la posición 478 de la subunidad p66 por glutamina permite aumentar su termoestabilidad con respecto a la RT que únicamente presenta la mutación V75I. Por tanto, la presente invención, proporciona RTs con elevada termoestabilidad y fidelidad de copia, apropiadas para llevar a cabo la retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde. However, the V75I mutation in group O HIV-1 RT leads to a loss of thermostability with respect to unmodified RT. In the examples of the present invention it is demonstrated how the introduction of a second amino acid change (mutation) consisting in the substitution of glutamic acid at position 478 of the p66 subunit by glutamine allows to increase its thermostability with respect to the RT that only presents the V75I mutation. Therefore, the present invention provides RTs with high thermostability and copy accuracy, suitable for carrying out retrotranscription, ampli fi cation or sequencing of a template nucleic acid.
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a una RT del VIH-1 de grupo O modificada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación que modifica dicha secuencia de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 75 de la SEQ ID NO: 1, en el que la RT modificada tiene una fidelidad de copia incrementada, con relación a la RT no modificada correspondiente. A first aspect of the present invention refers to a modified group O HIV-1 RT comprising an amino acid sequence having a mutation that modifies said amino acid sequence in the residue corresponding to position 75 of SEQ ID NO : 1, in which the modified RT has an increased copy accuracy, relative to the corresponding unmodified RT.
Preferiblemente, dicha RT comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación de manera que el residuo que se corresponde con la posición 75 de la SEQ ID NO: 1 de esta secuencia de aminoácidos es isoleucina o una sustitución conservativa de isoleucina. Se entiende por sustitución conservativa de isoleucina aquella sustitución de isoleucina por otro aminoácido que presenta similares propiedades y permite la conservación de la función de la proteína que contiene dicha sustitución. Estas sustituciones conservativas, conocidas en el estado de la técnica, son sustituciones de isoleucina por leucina o metionina. Preferably, said RT comprises an amino acid sequence that has a mutation such that the residue corresponding to position 75 of SEQ ID NO: 1 of this amino acid sequence is isoleucine or a conservative substitution of isoleucine. Conservative substitution of isoleucine is understood as that substitution of isoleucine for another amino acid that has similar properties and allows the preservation of the function of the protein contained in said substitution. These conservative substitutions, known in the state of the art, are substitutions of isoleucine for leucine or methionine.
Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a una RT del VIH-1 de grupo O modificada, que comprende una secuencia de aminoácidos, mutada según se ha descrito anteriormente, y que además tiene otra mutación que modifica dicha secuencia de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 478 de la SEQ ID NO: 1, en el que la RT modificada tiene una termoestabilidad incrementada con relación a la RT modificada en el residuo que corresponde a la posición 75 de la SEQ ID NO: 1. A preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a modified group O HIV-1 RT, which comprises an amino acid sequence, mutated as described above, and which also has another mutation that modifies said amino acid sequence in the residue corresponding to position 478 of SEQ ID NO: 1, in which the modified RT has increased thermostability in relation to the modified RT in the residue corresponding to position 75 of SEQ ID NO: 1.
Preferiblemente, dicha RT comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación de manera que el residuo que se corresponde con la posición 478 de la SEQ ID NO: 1 de esta secuencia de aminoácidos es glutamina Preferably, said RT comprises an amino acid sequence having a mutation such that the residue corresponding to position 478 of SEQ ID NO: 1 of this amino acid sequence is glutamine.
o una sustitución conservativa de glutamina. Se entiende por sustitución conservativa de glutamina aquella sustitución de glutamina por otro aminoácido que presenta similares propiedades y permite la conservación de la función de la proteína que contiene dicha sustitución. Estas sustituciones conservativas, conocidas en el estado de la técnica, son sustituciones de glutamina por alanina, prolina, glicina, ácido aspártico, asparagina, serina o treonina. or a conservative glutamine substitution. Conservative glutamine substitution is understood as that substitution of glutamine for another amino acid that has similar properties and allows the preservation of the function of the protein that contains said substitution. These conservative substitutions, known in the state of the art, are substitutions of glutamine for alanine, proline, glycine, aspartic acid, asparagine, serine or threonine.
De ahora en adelante utilizaremos la expresión “RT de la invención” para referirnos a una RT modificada según cualquiera de las características descritas anteriormente en la presente descripción. From now on we will use the expression "RT of the invention" to refer to a modified RT according to any of the characteristics described above in the present description.
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos comprendida por la RT de la invención presenta una identidad de, al menos, un 90%, más preferiblemente, de, al menos, un 95% y, aún más preferiblemente, de, al menos un 98% con la SEQ ID NO: 1. Preferably, the amino acid sequence comprised by the RT of the invention has an identity of at least 90%, more preferably, of at least 95% and, even more preferably, of at least 98% with SEQ ID NO: 1.
Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a una RT del VIH-1 de grupo O modificada que comprende la SEQ ID NO: 2. A preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a modified group O HIV-1 RT comprising SEQ ID NO: 2.
Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a una RT del VIH-1 de grupo O modificada que comprende la SEQ ID NO: 3. Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a modified group O HIV-1 RT comprising SEQ ID NO: 3.
Los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2) son los agentes etiológicos del SIDA en el hombre. Pertenecen al género lentivirus dentro de la familia Retroviridae (retrovirus), que poseen como una de sus principales características una enorme diversidad genética. El VIH-1 se ha clasificado en tres grupos: M, O y N. Del grupo M se conocen al menos 10 subtipos A-K, además de múltiples recombinantes de dichos subtipos (Buonaguro et al.J. Virol. 2007; 81: 10209-10219; Ramírez et al. Virus Res. 2008; 134: 64-73). El primer aislado de VIH-1 grupo O se obtuvo de pacientes infectados en 1987, y su secuencia de nucleótidos se publicó tres años más tarde (De Leys et al. J. Virol. 1990; 64: 1207-1216). Actualmente, se pueden obtener variantes del VIH-1 grupo O (por ejemplo, la cepa MVP5180/91) a través del NIH AIDS Research & Reference Reagent Program (http://www.aidsreagent.org) (Germantown, Maryland, EE.UU.) Human immunodeficiency viruses (HIV-1 and HIV-2) are the etiological agents of AIDS in man. They belong to the genus lentivirus within the family Retroviridae (retrovirus), which have as one of their main characteristics an enormous genetic diversity. HIV-1 has been classified into three groups: M, O and N. At least 10 AK subtypes are known from the M group, in addition to multiple recombinants of these subtypes (Buonaguro et al. J. Virol. 2007; 81: 10209- 10219; Ramírez et al. Virus Res. 2008; 134: 64-73). The first isolate of HIV-1 group O was obtained from infected patients in 1987, and its nucleotide sequence was published three years later (De Leys et al. J. Virol. 1990; 64: 1207-1216). Currently, variants of the HIV-1 group O (for example, strain MVP5180 / 91) can be obtained through the NIH AIDS Research & Reference Reagent Program (http://www.aidsreagent.org) (Germantown, Maryland, USA. UU.)
La RT del VIH-1 es una enzima multifuncional que presenta actividades ADN polimerasa dependiente de ARN y de ADN y actividad endonucleasa o ribonucleasa H (RNasa H). Es un heterodímero constituido por dos subunidades, denominadas p66 y p51. La subunidad p51 posee 440 aminoácidos mientras que la p66 tiene 560. Aunque p51 y p66 comparten idéntica estructura primaria en sus primeros 440 residuos, los distintos subdominios contenidos en sus secuencias respectivas se orientan de forma diferente en ambas subunidades. La subunidad p66 participa de forma importante en la formación del surco en el que interacciona el complejo molde-cebador ya sea ARN/ADN o ADN/ADN, además del centro activo que interviene en la catálisis que conduce a la formación de enlaces fosfodiéster entre desoxirribonucleótidos 5’-trifosfato (dNTP) libres y el extremo 5’ de la cadena de ADN que está siendo sintetizada. Por el contrario, la subunidad p51 tiene una función principalmente estructural. The HIV-1 RT is a multifunctional enzyme that exhibits RNA and DNA-dependent DNA polymerase activities and endonuclease or ribonuclease H (RNase H) activity. It is a heterodimer consisting of two subunits, called p66 and p51. The p51 subunit has 440 amino acids while the p66 has 560. Although p51 and p66 share the same primary structure in their first 440 residues, the different subdomains contained in their respective sequences are oriented differently in both subunits. The p66 subunit participates in an important way in the formation of the groove in which the mold-primer complex interacts with either RNA / DNA or DNA / DNA, in addition to the active center involved in catalysis that leads to the formation of phosphodiester bonds between deoxyribonucleotides Free 5'-triphosphate (dNTP) and the 5 'end of the DNA chain being synthesized. On the contrary, the p51 subunit has a mainly structural function.
Las subunidades p51 y p66 se generan a partir del procesamiento de la poliproteina Gag-Pol. Aunque no se conoce con exactitud cuáles son los intermediarios en el procesamiento de Gag-Pol que llevan a la formación del heterodímero funcional p66/p51, se sabe que in vitro, homodímeros p66/p66 pueden convertirse en heterodímeros p66/p51 por acción de la proteasa viral. Esta enzima realiza un corte endoproteolítico, entre los aminoácidos 440 y 441, en una de las dos cadenas que forman el homodímero. The p51 and p66 subunits are generated from the processing of the Gag-Pol polyprotein. Although it is not known exactly which are the intermediaries in Gag-Pol processing that lead to the formation of the functional p66 / p51 heterodimer, it is known that in vitro, p66 / p66 homodimers can be converted into p66 / p51 heterodimers by the action of the viral protease This enzyme makes an endoproteolytic cut, between amino acids 440 and 441, in one of the two chains that form the homodimer.
El término “RT del VIH-1 de grupo O”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una retrotranscriptasa aislada de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 de grupo O. El término “RT del VIH-1 de subtipo B” se refiere a una retrotranscriptasa aislada de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 de grupo M subtipo B. The term "group O HIV-1 RT", as used herein refers to a retrotranscriptase isolated from a group O human type 1 immunodeficiency virus. The term "HIV-1 RT of subtype B ”refers to a retrotranscriptase isolated from a human immunodeficiency virus type 1 group M subtype B.
El término “retrotranscriptasa aislada del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1” se refiere a una proteína con actividad retrotranscriptasa que se encuentra sustancialmente o completamente libre de los componentes que normalmente lo acompañan o interactúan con ella en su forma natural. Puede obtenerse, por ejemplo, por amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de la secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la subunidad p66 de la retrotranscriptasa a partir del ARN viral obtenido de un aislado del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1, y posterior clonaje en un vector de expresión. The term "retrotranscriptase isolated from human immunodeficiency virus type 1" refers to a protein with retrotranscriptase activity that is substantially or completely free of the components that normally accompany or interact with it in its natural form. It can be obtained, for example, by amplification by polymerase chain reaction (PCR) of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the p66 subunit of the retrotranscriptase from the viral RNA obtained from an isolate of the virus human immunodeficiency type 1, and subsequent cloning into an expression vector.
La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de la subunidad p66 de la RT aislada de una cepa o de un aislado del VIH-1 grupo O. La subunidad p66 de la RT aislada de otras cepas u otros aislados del VIH-1 de grupo O presenta una identidad en su secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 1 de hasta el 90%. SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the p66 subunit of the RT isolated from a strain or an isolate of HIV-1 group O. The p66 subunit of the RT isolated from other strains or other isolates of HIV-1 Group O has an identity in its amino acid sequence with SEQ ID NO: 1 of up to 90%.
Los términos “secuencia de aminoácidos” o “proteína” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados. The terms "amino acid sequence" or "protein" are used interchangeably herein, and refer to a polymeric form of amino acids of any length, which may or may not be chemically or biochemically modified.
El término “identidad”, tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de aminoácidos idénticos entre dos secuencias de aminoácidos que se comparan. El tanto por ciento de identidad existente entre dos secuencias puede ser identificado fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias. The term "identity", as used herein, refers to the proportion of identical amino acids between two amino acid sequences that are compared. The percentage of identity existing between two sequences can be easily identified by a person skilled in the art, for example, with the help of an appropriate computer program to compare sequences.
El término “fidelidad de copia” se refiere a la precisión de la polimerización, o la capacidad de la RT para discriminar entre los sustratos correctos e incorrectos (por ejemplo, nucleótidos) cuando está sintetizando moléculas de ácido nucleico que son complementarias a un ácido nucleico molde. The term "copy accuracy" refers to the accuracy of polymerization, or the ability of RT to discriminate between correct and incorrect substrates (eg, nucleotides) when it is synthesizing nucleic acid molecules that are complementary to a nucleic acid mold.
La fidelidad de la RT de la presente invención puede ser analizada mediante diferentes tipos de análisis, como por ejemplo, pero sin limitarnos, ensayos de fidelidad en cultivos celulares o ensayos de fidelidad in vitro (genéticos o bioquímicos). The accuracy of the RT of the present invention can be analyzed by different types of analysis, such as, but not limited to, cell culture trust tests or in vitro (genetic or biochemical) trust tests.
Los ensayos de fidelidad en cultivos celulares se basan en el uso de un vector retroviral que contiene un gen marcador (como por ejemplo, pero sin limitarnos, lacZα, timidina quinasa o neomicina), además de todos los elementos necesarios para que tenga lugar la transcripción de las proteínas virales, su encapsidación, y la síntesis del ADN proviral. Este vector, del que se han eliminado genes esenciales como gag, pol, env, y/o genes accesorios, se introduce en una línea celular empaquetadora que le proporciona estos genes en trans, y el virus producido se utiliza para infectar células diana. En estas células, el vector es capaz de completar una ronda de replicación y de integrarse en el genoma de la célula diana para formar provirus. Una única ronda de replicación implica una etapa de transcripción de ARN por la ARN polimerasa II celular, y una etapa de retrotranscripción que incluye la síntesis de ADN dependiente de ARN de una cadena del ADN proviral, y la síntesis posterior de la segunda cadena del ADN proviral a través de la actividad ADN polimerasa dependiente de ADN de la RT. Dado que el provirus es incapaz de expresar proteínas virales esenciales, no ocurren ciclos adicionales de replicación. Seleccionando un cultivo celular apropiado, se pueden detectar los fenotipos natural o mutante del gen marcador, y obtener así frecuencias de mutación. Affinity cell culture assays are based on the use of a retroviral vector that contains a marker gene (such as, but not limited to, lacZα, thymidine kinase or neomycin), in addition to all the elements necessary for transcription to take place. of viral proteins, their encapsidation, and the synthesis of proviral DNA. This vector, from which essential genes such as gag, pol, env, and / or accessory genes have been removed, is introduced into a packaging cell line that provides these genes in trans, and the virus produced is used to infect target cells. In these cells, the vector is able to complete a round of replication and integrate into the genome of the target cell to form provirus. A single round of replication involves a stage of RNA transcription by cellular RNA polymerase II, and a retrotranscription stage that includes the RNA-dependent DNA synthesis of a proviral DNA chain, and the subsequent synthesis of the second DNA chain. proviral through the DNA-dependent DNA polymerase activity of the RT. Since the provirus is unable to express essential viral proteins, no additional replication cycles occur. By selecting an appropriate cell culture, the natural or mutant phenotypes of the marker gene can be detected, and thus obtain mutation frequencies.
En los ensayos bioquímicos se utiliza la RT purificada para la determinación de constantes cinéticas sobre un molde ARN o ADN, bajo unas condiciones determinadas (pH, concentración de sustrato, etc...). De esta manera se pueden obtener los parámetros cinéticos de la fidelidad de copia de ADN (dependiente de ARN o ADN) de la RT, tanto en estado estacionario como preestacionario. In biochemical tests, purified RT is used for the determination of kinetic constants on an RNA or DNA template, under certain conditions (pH, substrate concentration, etc ...). In this way, the kinetic parameters of the DNA copying (RNA or DNA dependent) of the RT can be obtained, both stationary and pre-stationary.
Los ensayos bioquímicos de incorporación errónea en el estado estacionario, se basan en la determinación de las constantes cinéticas (kcat y Km) para la incorporación de nucleótidos en el extremo 3’ de un cebador y proporcionan una estimación de la selectividad de la RT por el nucleótido. La determinación de los parámetros cinéticos se lleva a cabo midiendo la incorporación de nucleótidos en el extremo 3’ del cebador, previamente marcado en su extremo 5’ con [γ32P]ATP, en presencia de distintas concentraciones de dNTP, una vez formado el complejo binario RT/moldecebador. Los productos resultantes son analizados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. Los datos obtenidos se ajustan a la ecuación de Michaelis-Menten, y los parámetros kcat (tasa de incorporación) y Km (constante de Michaelis-Menten) son determinados para los nucleótidos correctos e incorrectos. La eficiencia de incorporación errónea (finc) se define como la relación entre la eficacia catalítica (kcat/Km) obtenida para el nucleótido incorrecto y la eficacia catalítica obtenida para el nucleótido correcto. Así, una mayor fidelidad de la RT implica una menor eficiencia de incorporación errónea. Biochemical tests of erroneous incorporation in the steady state are based on the determination of the kinetic constants (kcat and Km) for the incorporation of nucleotides at the 3 'end of a primer and provide an estimate of the selectivity of RT by the nucleotide The determination of the kinetic parameters is carried out by measuring the incorporation of nucleotides at the 3 'end of the primer, previously labeled at its 5' end with [γ32P] ATP, in the presence of different dNTP concentrations, once the binary complex has formed RT / molder. The resulting products are analyzed by electrophoresis in polyacrylamide gels. The data obtained conform to the Michaelis-Menten equation, and the parameters kcat (incorporation rate) and Km (Michaelis-Menten constant) are determined for the correct and incorrect nucleotides. The efficiency of erroneous incorporation (finc) is defined as the relationship between the catalytic efficiency (kcat / Km) obtained for the incorrect nucleotide and the catalytic efficiency obtained for the correct nucleotide. Thus, a greater fidelity of the RT implies a lower efficiency of erroneous incorporation.
Para que se produzca la fijación de un error en el ADN naciente, no es suficiente la incorporación de un nucleótido incorrecto, la RT debe ser capaz además, de elongar el extremo desapareado que se genera como consecuencia de esta incorporación errónea. Esta medida de fidelidad se lleva a cabo mediante ensayos de extensión de extremos desapareados. En estos ensayos se calculan las constantes cinéticas en estado estacionario para la incorporación de un nucleótido correcto sobre dos tipos de complejo molde-cebador: el complejo con el extremo 3’ correctamente apareado y el mismo complejo con el extremo 3’ desapareado. La eficiencia de extensión de extremos desapareados (fext) se define como la relación entre kcat/Km obtenida para la extensión del extremo desapareado y la obtenida para la extensión del extremo correctamente apareado. For the establishment of an error in the nascent DNA, the incorporation of an incorrect nucleotide is not sufficient, the RT must also be able to elongate the missing end that is generated as a result of this erroneous incorporation. This measure of accuracy is carried out by extension tests of missing ends. In these tests the steady state kinetic constants are calculated for the incorporation of a correct nucleotide on two types of template-primer complex: the complex with the 3 ′ end properly matched and the same complex with the 3 ′ end disappeared. The efficiency of extension of missing ends (fext) is defined as the ratio between kcat / Km obtained for the extension of the missing end and that obtained for the extension of the correctly paired end.
Los ensayos bioquímicos en el estado preestacionario examinan la capacidad de la RT para unirse e incorporar el dNTP a tiempos muy cortos (como por ejemplo, del orden de milisegundos). De esta forma, es posible el cálculo de la constante de afinidad (Kd) para la interacción entre el dNTP y el complejo binario RT/molde-cebador, y de la constante de polimerización (kpol). La eficiencia de incorporación errónea y de extensión de extremos desapareados se determina a partir de los valores de kpol/Kd obtenidos para la incorporación de nucleótidos correctos o incorrectos, o los obtenidos para la incorporación de nucleótidos correctos sobre complejos molde-cebador que contienen un extremo 3’OH apareado o desapareado. Biochemical tests in the pre-stationary state examine the ability of RT to bind and incorporate dNTP at very short times (such as in the order of milliseconds). In this way, it is possible to calculate the affinity constant (Kd) for the interaction between the dNTP and the RT / mold-primer binary complex, and the polymerization constant (kpol). The efficiency of erroneous incorporation and extension of missing ends is determined from the kpol / Kd values obtained for the incorporation of correct or incorrect nucleotides, or those obtained for the incorporation of correct nucleotides on template-primer complexes containing an end 3'OH paired or disappeared.
Los ensayos genéticos más utilizados, denominados “forward mutation assays”, se suelen llevar a cabo usando como molde-cebador de la reacción de síntesis de ADN, el ADN bicatenario del fago M13mp2, del cual se ha eliminado la zona correspondiente al gen lacZ de una de las hebras. La reacción de síntesis de ADN se realiza en presencia de la RT y de concentraciones altas de los dNTPs. The most commonly used genetic assays, called "forward mutation assays", are usually carried out using as a template-primer of the DNA synthesis reaction, the double stranded DNA of phage M13mp2, from which the zone corresponding to the lacZ gene of One of the threads. The DNA synthesis reaction is performed in the presence of RT and high concentrations of dNTPs.
Tras la transformación bacteriana con el producto de la reacción, los mutantes se identifican como placas azules/blancas en medio de cultivo que contiene X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-β-galactopiranósido) e IPTG (isopropilβ-tio-galactopiranósido). De este modo, si en la reacción de síntesis de ADN no se producen errores, el resultado es una placa azul oscuro. Por el contrario, la introducción de uno o varios errores implica la pérdida parcial o total de la α-complementación, lo que se traduce en placas azul claro o blancas. El ADN recuperado de estas placas puede ser secuenciado, para determinar exactamente el número, el tipo y la posición en el genoma de las mutaciones introducidas por la RT. After bacterial transformation with the reaction product, the mutants are identified as blue / white plates in culture medium containing X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indole-β-galactopyranoside) and IPTG (isopropylβ -thio-galactopyranoside). Thus, if there are no errors in the DNA synthesis reaction, the result is a dark blue plate. On the contrary, the introduction of one or several errors implies the partial or total loss of α-complementation, which translates into light blue or white plates. The DNA recovered from these plates can be sequenced, to determine exactly the number, type and position in the genome of the mutations introduced by RT.
Otro tipo de ensayos genéticos son los ensayos de reversión. Estos ensayos se basan en el uso de moldes que contienen una mutación inactivante (típicamente, codones de terminación o inserciones de un nucleótido). La reversión de la mutación se traduce en la corrección del error y por lo tanto en la restauración de la actividad del gen marcador. Another type of genetic assays are reversal assays. These assays are based on the use of templates containing an inactivating mutation (typically, termination codons or insertions of a nucleotide). Reversal of the mutation results in the correction of the error and therefore in the restoration of the activity of the marker gene.
El “incremento en la fidelidad de copia” puede medirse mediante la comparación de parámetros indicativos de la fidelidad de copia de las RTs de la invención y la RT no modificada. Estos parámetros pueden analizarse, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante cualquiera de los métodos anteriormente descritos en este documento. The "increase in copy accuracy" can be measured by comparing parameters indicative of the copy accuracy of the RTs of the invention and the unmodified RT. These parameters can be analyzed, for example, but not limited, by any of the methods previously described in this document.
Una RT con una fidelidad de copia “incrementada” o “aumentada” se define como una RT que tiene un incremento An RT with an “increased” or “augmented” copy definition is defined as an RT that has an increase
o un aumento significativo (aplicando criterios estadísticos) en la fidelidad de copia con respecto a la RT no modificada, típicamente de, al menos, 1,5 veces, más preferiblemente de, al menos, 2 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 3 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 4 veces. Por ejemplo, en ensayos bioquímicos de incorporación de nucleótido, se considera un aumento de fidelidad cuando el valor obtenido para la RT modificada es significativamente superior al de la no modificada (aplicando criterios estadísticos), típicamente, de al menos, 1,5 veces, preferiblemente, de al menos, 2 veces, más preferiblemente de, al menos, 3 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 4 veces. Por ejemplo, en ensayos genéticos (“forward mutation assays”) se considera fidelidad incrementada cuando hay un aumento significativo (aplicando criterios estadísticos) en la frecuencia de mutante obtenida por la RT modificada, típicamente de, al menos, un 50% (1,5 veces), preferiblemente, de al menos, 2 veces, más preferiblemente de, al menos, 3 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 4 veces. or a significant increase (applying statistical criteria) in the copyity of the unmodified RT, typically at least 1.5 times, more preferably at least 2 times, and even more preferably from at less, 3 times, and even more preferably, at least 4 times. For example, in biochemical nucleotide incorporation assays, a de fi nity increase is considered when the value obtained for the modified RT is significantly higher than that of the unmodified RT (applying statistical criteria), typically, at least 1.5 times, preferably, at least 2 times, more preferably at least 3 times, and even more preferably at least 4 times. For example, in genetic tests (“forward mutation assays”) it is considered increased fidelity when there is a significant increase (applying statistical criteria) in the mutant frequency obtained by the modified RT, typically of at least 50% (1, 5 times), preferably, at least 2 times, more preferably at least 3 times, and even more preferably at least 4 times.
La temperatura a la cual la actividad polimerasa (dependiente de ARN o ADN) de una RT es máxima se denomina temperatura óptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica de la RT, de manera que su actividad polimerasa (dependiente de ADN o ARN) decrece. El término “termoestabilidad” se refiere a la estabilidad mostrada por una RT cuando se encuentra sometida a una temperatura elevada, por ejemplo, típicamente, una temperatura de, al menos, 45ºC, preferiblemente de, al menos, 55ºC, más preferiblemente de, al menos, 60ºC y aún más preferiblemente de, al menos 65ºC. The temperature at which the polymerase activity (RNA or DNA dependent) of a RT is maximum is called the optimum temperature. Above this temperature, the increase in reaction speed due to temperature is counteracted by the loss of catalytic activity due to thermal denaturation of RT, so that its polymerase activity (dependent on DNA or RNA) decreases. The term "thermostability" refers to the stability shown by an RT when it is subjected to an elevated temperature, for example, typically, a temperature of at least 45 ° C, preferably of at least 55 ° C, more preferably of, at less, 60 ° C and even more preferably, at least 65 ° C.
La termoestabilidad de la RT de la presente invención puede ser analizada mediante diferentes tipos de análisis. La termoestabilidad de la RT de la presente invención, puede estimarse, por ejemplo, pero sin limitarse, midiendo la actividad específica ADN polimerasa a distintas temperaturas elevadas, utilizando un complejo molde-cebador, analizando la actividad RT residual después de someter a la enzima a una incubación a temperatura elevada durante distintos intervalos de tiempo, analizando la vida media de la RT o midiendo la cantidad y/o la longitud del producto sintetizado por la RT a una elevada temperatura. The thermostability of the RT of the present invention can be analyzed by different types of analysis. The thermostability of the RT of the present invention can be estimated, for example, but not limited, by measuring the specific activity of DNA polymerase at different elevated temperatures, using a template-primer complex, analyzing the residual RT activity after subjecting the enzyme to an incubation at elevated temperature for different time intervals, analyzing the half-life of the RT or measuring the quantity and / or length of the product synthesized by the RT at a high temperature.
La “vida media” de una proteína es un parámetro que permite medir su termoestabilidad. Por ejemplo, la vida media de la actividad RT se refiere al tiempo en que la actividad polimerasa (dependiente de ARN o ADN) se reduce a la mitad cuando la reacción de síntesis (dependiente de ARN o ADN) se realiza a una elevada temperatura. The "half-life" of a protein is a parameter that allows measuring its thermostability. For example, the half-life of RT activity refers to the time when polymerase activity (RNA or DNA dependent) is reduced by half when the synthesis reaction (RNA or DNA dependent) is carried out at a high temperature.
Otros parámetros indicativos de la termoestabilidad de una RT son la cantidad y/o la longitud del producto sintetizado por la RT cuando la reacción de síntesis se realiza a una elevada temperatura. Por ejemplo, se puede obtener una estimación de la estabilidad de la RT, analizando la cantidad del producto obtenido mediante la RT en una RT-PCR. Para ello, se puede realizar primero una reacción de retrotranscripción empleando como ácido nucleico molde ARN total a una temperatura elevada, y después el ADN complementario obtenido de la retrotranscripción se puede amplificar el producto de reacción mediante PCR. La cantidad de producto obtenido en estas reacciones constituye una medida de la estabilidad de la RT, a la temperatura en la que se ha llevado a cabo la reacción de retrotranscripción. Other parameters indicative of the thermostability of an RT are the quantity and / or length of the product synthesized by the RT when the synthesis reaction is carried out at a high temperature. For example, an estimate of the stability of the RT can be obtained by analyzing the amount of the product obtained by the RT in an RT-PCR. For this, a retrotranscription reaction can be performed first using total RNA as a template nucleic acid at an elevated temperature, and then the complementary DNA obtained from the retrotranscription can be amplified the reaction product by PCR. The amount of product obtained in these reactions constitutes a measure of the stability of the RT, at the temperature at which the back transcription reaction was carried out.
Una “reacción de síntesis a elevada temperatura”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una reacción y, más preferiblemente, una reacción de retrotranscripción (o transcripción inversa), que se realiza a una temperatura de, al menos, 45ºC, preferiblemente de, al menos, 55ºC, más preferiblemente de, al menos 60ºC y aún más preferiblemente de, al menos, 65ºC. A "high temperature synthesis reaction", as used herein, refers to a reaction and, more preferably, a back transcription (or reverse transcription) reaction, which is performed at a temperature of at least , 45 ° C, preferably at least 55 ° C, more preferably at least 60 ° C and even more preferably at least 65 ° C.
En algunas circunstancias, la RT de la invención puede mostrar un incremento de la termoestabilidad en presencia In some circumstances, the RT of the invention may show an increase in thermostability in the presence
o en ausencia del ácido nucleico molde. Es conocido en el estado de la técnica que las RTs son, típicamente, más estables en presencia del ácido nucleico molde. or in the absence of the nucleic acid template. It is known in the state of the art that RTs are typically more stable in the presence of the template nucleic acid.
La expresión “termoestabilidad incrementada”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a que la RT del VIH-1 de grupo O modificada, que comprende una secuencia de aminoácidos, mutada en los residuos que corresponden a la posiciones 75 y 478 de la SEQ ID NO: 1, conserva su actividad a una temperatura de reacción de síntesis más elevada, o actúa más tiempo a la misma temperatura, que la RT que únicamente tiene una mutación en el residuo que corresponde a la posición 75 de la SEQ ID NO: 1. The term "increased thermostability", as used herein, refers to the modified group O HIV-1 RT, comprising an amino acid sequence, mutated in the residues corresponding to positions 75 and 478 of SEQ ID NO: 1, retains its activity at a higher synthesis reaction temperature, or acts longer at the same temperature, than RT that only has a mutation in the residue corresponding to position 75 of the SEQ ID NO: 1.
Una RT con termoestabilidad “incrementada” o “aumentada” se define como una RT que tiene un incremento o un aumento significativo (aplicando criterios estadísticos) en la termoestabilidad, típicamente de, al menos, 1,5 veces, más preferiblemente de, al menos, 2 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 3 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 4 veces, con respecto a la RT que únicamente tiene una mutación en el residuo que corresponde a la posición 75 de la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, cuando se estima la termoestabilidad mediante la cantidad del producto obtenido mediante la RT en una RT-PCR, se considera que la RT tiene una fidelidad de copia incrementada cuando la cantidad de producto obtenido mediante la RT-PCR tiene un incremento o un aumento significativo (aplicando criterios estadísticos), típicamente de, al menos 1,5 veces, preferiblemente de, al menos, 3 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 4 veces, con respecto a la RT que únicamente tiene una mutación en el residuo que corresponde a la posición 75 de la SEQ ID NO: 1. An RT with “increased” or “increased” thermostability is defined as an RT that has a significant increase or increase (applying statistical criteria) in thermostability, typically at least 1.5 times, more preferably at least , 2 times, and even more preferably at least 3 times, and even more preferably at least 4 times, with respect to the RT which only has a mutation in the residue corresponding to position 75 of the SEQ ID NO: 1. For example, when thermostability is estimated by the amount of the product obtained by RT in an RT-PCR, the RT is considered to have an increased copy accuracy when the amount of product obtained by the RT-PCR it has a significant increase or increase (applying statistical criteria), typically at least 1.5 times, preferably at least 3 times, and even more preferably at least 4 times, with respect to the RT that only The mind has a mutation in the residue that corresponds to position 75 of SEQ ID NO: 1.
Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término “mutación” se refiere a una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido distinto. Los aminoácidos individuales en una secuencia se representan aquí como XN, en la que X es el aminoácido en la secuencia (designado mediante el código de una letra universalmente aceptado en la nomenclatura de aminoácidos),yNesla posición en la secuencia. Las mutaciones puntuales tipo sustitución en una secuencia de aminoácidos se representan aquí como X1NX2, en la que X1 es el aminoácido en la secuencia de proteína no mutada, X2 es el aminoácido en la secuencia de proteína mutada, y N es la posición en la secuencia de aminoácidos. As used herein, the term "mutation" refers to a substitution of one amino acid for another different amino acid. The individual amino acids in a sequence are represented here as XN, in which X is the amino acid in the sequence (designated by the code of a universally accepted letter in the amino acid nomenclature), and is not positioned in the sequence. Point substitution mutations in an amino acid sequence are represented herein as X1NX2, in which X1 is the amino acid in the non-mutated protein sequence, X2 is the amino acid in the mutated protein sequence, and N is the position in the sequence. of amino acids
La secuencia de aminoácidos comprendida por la RT de la invención puede obtenerse mediante técnicas de ingeniería genética o recombinante bien conocidas en el estado de la técnica. Pueden obtenerse, por ejemplo, mutando el gen de la RT mediante mutagénesis dirigida o al azar. Preferiblemente, la mutación se introduce en la secuencia de aminoácidos mediante un cambio de codón adecuado en el polinucleótido que codifica para la RT. Más preferiblemente, los mutantes de la presente invención pueden obtenerse mediante la técnica de mutagénesis dirigida por oligonucléotido. Esta técnica consiste en el anillamiento de un oligonucléotido complementario (excepto por la presencia de uno o más nucleótidos desapareados) con la secuencia nucleotídica de la RT del VIH-1 de grupo O. El oligonucléotido parcialmente desapareado es entonces extendido por una ADN polimerasa, generando una molécula de ADN de cadena doble que contiene el cambio deseado en la secuencia de una de las cadenas. Los cambios introducidos en la secuencia tienen como consecuencia el cambio de un aminoácido por otro. El polinucléotido de doble cadena puede ser entonces insertado en un vector de expresión apropiado y el polipéptido mutante producido. La mutagénesis dirigida por oligonucléotido puede ser llevada a cabo, por ejemplo, mediante PCR. The amino acid sequence comprised by the RT of the invention can be obtained by genetic or recombinant engineering techniques well known in the state of the art. They can be obtained, for example, by mutating the RT gene by randomized or directed mutagenesis. Preferably, the mutation is introduced into the amino acid sequence by a suitable codon change in the polynucleotide encoding the RT. More preferably, the mutants of the present invention can be obtained by the oligonucleotide-directed mutagenesis technique. This technique consists in the ringing of a complementary oligonucleotide (except for the presence of one or more missing nucleotides) with the nucleotide sequence of the group O-1 HIV-RT. The partially missing oligonucleotide is then extended by a DNA polymerase, generating a DNA polymerase, generating a double stranded DNA molecule that contains the desired change in the sequence of one of the chains. The changes introduced in the sequence result in the exchange of one amino acid for another. The double stranded polynucleotide can then be inserted into an appropriate expression vector and the mutant polypeptide produced. Oligonucleotide-directed mutagenesis can be carried out, for example, by PCR.
Otro aspecto de la presente invención, se refiere a un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos comprendida en la RT de la invención. Another aspect of the present invention refers to a polynucleotide that encodes the amino acid sequence comprised in the RT of the invention.
Los términos “secuencia nucleotídica”, “secuencia de nucleótidos”, “ácido nucleico”, “oligonucléotido” y “polinucleótido” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados. The terms "nucleotide sequence", "nucleotide sequence", "nucleic acid", "oligonucleotide" and "polynucleotide" are used interchangeably herein, and refer to a polymeric form of nucleotides of any length, which may be, or no, chemically or biochemically modified.
Otro aspecto de la presente invención, se refiere a un vector que comprende el polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos comprendida en la RT de la invención. Another aspect of the present invention refers to a vector comprising the polynucleotide encoding the amino acid sequence comprised in the RT of the invention.
El vector puede ser, por ejemplo un vector de clonación o un vector de expresión. Preferiblemente, dicho vector es un vector apropiado para la expresión y purificación de la RT de la invención. The vector can be, for example a cloning vector or an expression vector. Preferably, said vector is an appropriate vector for the expression and purification of the RT of the invention.
El término “vector de clonación”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula de ADN en la que se puede integrar otro fragmento de ADN, sin que pierda la capacidad de autorreplicación. Ejemplos de vectores de expresión son, pero sin limitarse, plásmidos, cósmidos, fagos de ADN o cromosomas artificiales de levadura. The term "cloning vector", as used in the present description, refers to a DNA molecule in which another DNA fragment can be integrated, without losing the capacity for self-replication. Examples of expression vectors are, but are not limited to, plasmids, cosmids, phage DNA or artificial yeast chromosomes.
El término vector de “expresión”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un vector de clonaje adecuado para expresar un ácido nucleico que ha sido clonado en el mismo tras ser introducido en una célula, denominada célula huésped. Dicho ácido nucleico se encuentra, por lo general, unido operativamente a secuencias de control. The term "expression" vector, as used herein, refers to a cloning vector suitable for expressing a nucleic acid that has been cloned therein after being introduced into a cell, called a host cell. Said nucleic acid is generally operatively linked to control sequences.
El termino “expresión” se refiere al proceso por el cuál se sintetiza un polipéptido a partir de un polinucleótido. Incluye la transcripción del polinucleótido en un ARN mensajero (ARNm) y la traducción de dicho ARNm en una proteína o un polipéptido. The term "expression" refers to the process by which a polypeptide is synthesized from a polynucleotide. It includes transcription of the polynucleotide into a messenger RNA (mRNA) and the translation of said mRNA into a protein or a polypeptide.
El término “célula huésped”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier organismo procariota o eucariota que es recipiente de un vector de expresión, de clonación o de cualquier otra molécula de ADN. The term "host cell", as used herein, refers to any prokaryotic or eukaryotic organism that is the recipient of an expression vector, cloning or any other DNA molecule.
El término “secuencia de control”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a secuencias nucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias a las que están ligadas. Se pretende que el término “secuencias de control” incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa. Ejemplos de secuencias de control, son por ejemplo, pero sin limitarse, promotores, señales de inicio de la transcripción, señales de terminación de la transcripción, señales de poliadenilación o activadores transcripcionales. The term "control sequence", as used herein, refers to nucleotide sequences that are necessary to effect the expression of the sequences to which they are linked. The term "control sequences" is intended to include, at a minimum, all components whose presence is necessary for expression, and may also include additional components whose presence is advantageous. Examples of control sequences are, for example, but not limited to, promoters, transcription initiation signals, transcription termination signals, polyadenylation signals or transcriptional activators.
La expresión “unidos operativamente”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control “unida de forma operativa” a un polinucleótido, está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control. The term "operably linked", as used in the present description, refers to a juxtaposition in which the components thus described have a relationship that allows them to function in the intended manner. A control sequence "operatively linked" to a polynucleotide is linked in such a way that the expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.
Como se usa aquí, el término “promotor” hace referencia a una región del ADN, generalmente “aguas arriba” o “upstream” del punto de inicio de la transcripción, que es capaz de iniciar la transcripción en una célula. Este término incluye, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicos de tipo celular o de tejido o promotores inducibles o reprimibles. As used herein, the term "promoter" refers to a region of DNA, generally "upstream" or "upstream" of the transcription start point, which is capable of initiating transcription in a cell. This term includes, for example, but not limited to, constitutive promoters, specific cell or tissue type promoters or inducible or repressible promoters.
Las secuencias de control dependen del origen de la célula en la que se quiere expresar el ácido nucleico. Ejemplos de promotores procariotas incluyen, por ejemplo, pero sin limitarnos, los promotores de los genes trp, recA, lacZ, lacI, tet, gal, trc,o tac de E. coli, o el promotor del gen α-amylase de B. subtilis. Para la expresión de un ácido nucleico en una célula procariota también es necesaria la presencia de un sitio de unión ribosomal situado “upstream” de la secuencia codificante. Secuencias de control apropiadas para la expresión de un polinucleótido en células eucariotas son conocidas en el estado de la técnica. Control sequences depend on the origin of the cell in which the nucleic acid is to be expressed. Examples of prokaryotic promoters include, for example, but not limited to, promoters of the trp, recA, lacZ, lacI, tet, gal, trc, or tac genes of E. coli, or the promoter of the α-amylase gene of B. subtilis For the expression of a nucleic acid in a prokaryotic cell, the presence of an upstream ribosomal binding site of the coding sequence is also necessary. Appropriate control sequences for the expression of a polynucleotide in eukaryotic cells are known in the state of the art.
Utilizando técnicas bien conocidas, un experto en la materia será capaz de obtener un vector adecuado para la expresión de la secuencia de aminoácidos que comprende la RT de la invención en cualquier célula procariota o eucariota. Using well known techniques, one skilled in the art will be able to obtain a suitable vector for the expression of the amino acid sequence comprising the RT of the invention in any prokaryotic or eukaryotic cell.
Una realización preferida de este aspecto de la invención, se refiere a un vector que comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos comprendida en la RT de la invención, donde dicho polinucleótido está unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de la lista que comprende: A preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a vector comprising a polynucleotide encoding the amino acid sequence comprised in the RT of the invention, wherein said polynucleotide is operably linked to at least one control sequence of the list comprising:
a) un promotor, a) a promoter,
b) una señal de inicio de la transcripción, b) a transcription initiation signal,
c) una señal de terminación de la transcripción, c) a transcription termination signal,
d) una señal de poliadenilación, o d) a polyadenylation signal, or
e) un activador transcripcional. e) a transcriptional activator.
Una realización preferida de este aspecto de la invención, se refiere a un vector que comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos comprendida por la RT de la invención, donde dicho polinucleótido está unido en fase de lectura a una secuencia nucleotídica que codifica para una etiqueta de purificación. A preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a vector comprising a polynucleotide encoding the amino acid sequence comprised by the RT of the invention, wherein said polynucleotide is linked in reading phase to a nucleotide sequence encoding a purification tag.
La expresión “etiqueta de purificación” o “etiqueta de afinidad”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una secuencia de aminoácidos que ha sido incorporada (generalmente, por ingeniería genética) a una proteína para facilitar su purificación. La etiqueta, que puede ser otra proteína o una secuencia corta de aminoácidos, permite la purificación de la proteína, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad. Algunos ejemplos de etiquetas de purificación conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse a: el péptido de unión a calmodulina (CBP), la enzima glutatión-S-transferasa (GST) o una cola de residuos de histidina. Preferiblemente, la etiqueta de purificación consiste en al menos 6 residuos de histidina. The term "purification label" or "affinity label", as used herein refers to an amino acid sequence that has been incorporated (generally, by genetic engineering) into a protein to facilitate its purification. The tag, which may be another protein or a short amino acid sequence, allows the protein to be purified, for example, by affinity chromatography. Some examples of purification labels known in the state of the art are, for example, but not limited to: calmodulin-binding peptide (CBP), glutathione-S-transferase enzyme (GST) or a tail of histidine residues . Preferably, the purification tag consists of at least 6 histidine residues.
De ahora en adelante utilizaremos la expresión “vector primero de la invención” para referirnos a un vector que comprende un polinucleótido que codifica la secuencia comprendida en la RT de la invención, donde dicho vector presenta cualquiera de las características descritas anteriormente en la presente descripción. From now on we will use the expression "first vector of the invention" to refer to a vector comprising a polynucleotide that encodes the sequence comprised in the RT of the invention, wherein said vector has any of the characteristics described above in the present description.
Otra realización preferida de este aspecto de la invención, se refiere a un vector que comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos comprendida por la RT de la invención y que, además, comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en la secuencia de aminoácidos comprendida en la RT de la invención entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de la SEQ ID NO: 1. De ahora en adelante utilizaremos la expresión “vector segundo de la invención” para referirnos a un vector que comprende un polinucleótido que codifica la secuencia comprendida en la RT de la invención, donde dicho vector presenta cualquiera de las características del vector primero de la invención, y que además comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en la secuencia de aminoácidos comprendida en la RT de la invención entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de la SEQ ID NO: 1. Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a vector comprising a polynucleotide that encodes the amino acid sequence comprised by the RT of the invention and which further comprises a polynucleotide encoding a protease capable of performing an endoproteolytic cut. in the amino acid sequence included in the RT of the invention between the residues corresponding to positions 440 and 441 of SEQ ID NO: 1. From now on we will use the expression "second vector of the invention" to refer to a vector comprising a polynucleotide encoding the sequence comprised in the RT of the invention, wherein said vector has any of the characteristics of the first vector of the invention, and also comprising a polynucleotide encoding a protease capable of performing an endoproteolytic cut in the sequence of amino acids included in the RT of the invention among the residues that run Sponsor positions 440 and 441 of SEQ ID NO: 1.
En una realización preferida, la proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en la secuencia de aminoácidos comprendida en la RT de la invención entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de la SEQ ID NO: 1 es la proteasa del VIH-1, una variante de la proteasa del VIH-1 o un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente. In a preferred embodiment, the protease capable of performing an endoproteolytic cut in the amino acid sequence comprised in the RT of the invention between residues corresponding to positions 440 and 441 of SEQ ID NO: 1 is the HIV-1 protease, a variant of the HIV-1 protease or a fragment thereof, as long as said variant or said fragment is functionally equivalent.
El término “proteasa de VIH-1”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una proteasa aislada de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1. El término “proteasa aislada del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1” se refiere a una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en la secuencia de aminoácidos comprendida en la RT de la invención entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de la SEQ ID NO: 1, que se encuentra sustancialmente o completamente libre de los componentes que normalmente lo acompañan The term "HIV-1 protease", as used herein, refers to a protease isolated from a human immunodeficiency virus type 1. The term "protease isolated from human immunodeficiency virus type 1 "refers to a protease capable of making an endoproteolytic cut in the amino acid sequence comprised in the RT of the invention between residues corresponding to positions 440 and 441 of SEQ ID NO: 1, which is substantially or completely free of the components that normally accompany it
o interactúan con ella en su forma natural. Puede obtenerse, por ejemplo, por amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de la secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la proteasa a partir del ARN viral obtenido de un aislado del VIH-1, y posterior clonaje en un vector de expresión. Preferiblemente, la proteasa del VIH-1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4. La SEQ ID NO: 4 corresponde a la secuencia de la proteasa del VIH-1 aislada de la cepa prototípica de grupo M-subtipo B NL4-3. En el virus, dicha proteasa forma homodímeros mediante la unión no covalente de sus subunidades. or interact with her in her natural way. It can be obtained, for example, by amplification by polymerase chain reaction (PCR) of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the protease from the viral RNA obtained from an isolate of HIV-1, and subsequent cloning in an expression vector. Preferably, the HIV-1 protease has the amino acid sequence SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 4 corresponds to the HIV-1 protease sequence isolated from the prototypic strain of group M-subtype B NL4-3 . In the virus, said protease forms homodimers by non-covalent binding of its subunits.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término “variante” se refiere a una proteína sustancialmente homologa a la proteasa del VIH-1. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. El término “variante” incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación, fosforilación o metilación. In the sense used in this description, the term "variant" refers to a protein substantially homologous to HIV-1 protease. In general, a variant includes additions, deletions or substitutions of amino acids. The term "variant" also includes proteins resulting from posttranslational modifications, for example, but not limited to, glycosylation, phosphorylation or methylation.
Tal como aquí se utiliza, una proteína es “sustancialmente homologa” a la proteasa del VIH-1 cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferentemente de, al menos un 90%, más preferentemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferentemente de, al menos, un 99%. As used herein, a protein is "substantially homologous" to the HIV-1 protease when its amino acid sequence has a good alignment with the amino acid sequence SEQ ID NO: 4, that is, when its amino acid sequence has a degree of identity with respect to the amino acid sequence SEQ ID NO: 4, of at least 50%, typically of at least 80%, advantageously of at least 85%, preferably of at least 90%, more preferably of at least 95%, and even more preferably of at least 99%.
El término “fragmento”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una porción de la proteasa del VIH-1 o de una sus variantes. The term "fragment," as used herein, refers to a portion of the HIV-1 protease or one of its variants.
La expresión “funcionalmente equivalente”, tal como aquí se utiliza, significa que la proteína o el fragmento de la proteína en cuestión mantiene la capacidad de realizar un corte endoproteolítico en la secuencia de aminoácidos comprendida en la RT de la invención entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de la SEQ ID NO: 1. The term "functionally equivalent", as used herein, means that the protein or fragment of the protein in question maintains the ability to perform an endoproteolytic cut in the amino acid sequence comprised in the RT of the invention among the corresponding residues. to positions 440 and 441 of SEQ ID NO: 1.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una célula que comprende el vector primero de la invención. De ahora en adelante utilizaremos la expresión “célula primera de la invención” para referirnos a una célula que comprende el vector primero de la invención. Another aspect of the present invention relates to a cell comprising the first vector of the invention. From now on we will use the expression "first cell of the invention" to refer to a cell comprising the first vector of the invention.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una célula que comprende el vector segundo de la invención. De ahora en adelante utilizaremos la expresión “célula segunda de la invención” para referirnos a una célula que comprende el vector segundo de la invención. Another aspect of the present invention relates to a cell comprising the second vector of the invention. From now on we will use the expression "second cell of the invention" to refer to a cell comprising the second vector of the invention.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una célula que comprende el vector primero de la invención y que, además, comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en la secuencia de aminoácidos comprendida en la RT de la invención entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de la SEQ ID NO: 1. De ahora en adelante utilizaremos la expresión “célula tercera de la invención” para referirnos a una célula con dichas características. Another aspect of the present invention refers to a cell that comprises the first vector of the invention and that, furthermore, comprises a vector comprising a polynucleotide that encodes a protease capable of making an endoproteolytic cut in the amino acid sequence comprised in RT of the invention between the residues corresponding to positions 440 and 441 of SEQ ID NO: 1. From now on we will use the expression "third cell of the invention" to refer to a cell with said characteristics.
De ahora en adelante utilizaremos la expresión “célula de la invención” para referirnos a la célula primera, a la célula segundaoala célula tercera de la invención. La célula de la invención puede ser una célula procariota o eucariota. Preferiblemente, la célula de la invención es una célula procariota. From now on we will use the expression "cell of the invention" to refer to the first cell, the second cell or the third cell of the invention. The cell of the invention can be a prokaryotic or eukaryotic cell. Preferably, the cell of the invention is a prokaryotic cell.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para producir la secuencia de aminoácidos comprendida en la RT de la invención que comprende: Another aspect of the present invention relates to a method for producing the amino acid sequence comprised in the RT of the invention comprising:
a) cultivar la célula de la invención, y a) cultivate the cell of the invention, and
b) aislar la secuencia de aminoácidos comprendida en la RT expresada en el paso (a) por dicha célula. b) isolating the amino acid sequence comprised in the RT expressed in step (a) by said cell.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para producir la RT de la invención que comprende: Another aspect of the present invention relates to a method for producing the RT of the invention comprising:
a) cultivar la célula de la invención, y a) cultivate the cell of the invention, and
b) aislar la RT expresada en el paso (a) por dicha célula. b) isolate the RT expressed in step (a) by said cell.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la RT de la invención para la RT de un ácido nucleico molde, preferiblemente ARNm. Another aspect of the present invention relates to the use of the RT of the invention for the RT of a template nucleic acid, preferably mRNA.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la RT de la invención para la amplificación de un ácido nucleico molde, preferiblemente ARNm. Another aspect of the present invention relates to the use of the RT of the invention for the amplification of a template nucleic acid, preferably mRNA.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la RT de la invención para la secuenciación de un ácido nucleico molde, preferiblemente ARNm. Another aspect of the present invention relates to the use of the RT of the invention for the sequencing of a template nucleic acid, preferably mRNA.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de RT de un ácido nucleico molde, preferiblemente ARNm, que comprende: Another aspect of the present invention relates to a RT method of a template nucleic acid, preferably mRNA, comprising:
a) mezclar dicho ácido nucleico molde con la RT de la invención, e a) mixing said template nucleic acid with the RT of the invention, and
b) incubar la mezcla del paso (a) en condiciones que permitan la síntesis de ADN complementario al ácido nucleico molde. b) incubate the mixture from step (a) under conditions that allow the synthesis of DNA complementary to the template nucleic acid.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de amplificación de un ácido nucleico molde, preferiblemente ARNm, que comprende: Another aspect of the present invention relates to a method of amplifying a template nucleic acid, preferably mRNA, comprising:
a) mezclar dicho ácido nucleico con la RT de la invención y con, al menos, una ADN polimerasa dependiente de ADN, e a) mixing said nucleic acid with the RT of the invention and with at least one DNA-dependent DNA polymerase, and
b) incubar la mezcla del paso (a) en condiciones que permitan la amplificación de ADN complementario al ácido nucleico molde. b) incubate the mixture of step (a) under conditions that allow amplification of DNA complementary to the template nucleic acid.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de secuenciación de un ácido nucleico, preferiblemente ARNm, que comprende: Another aspect of the present invention relates to a method of sequencing a nucleic acid, preferably mRNA, comprising:
a) poner en contacto dicho ácido nucleico con la RT de la invención, a) contacting said nucleic acid with the RT of the invention,
b) incubar dicha mezcla en condiciones que permitan la síntesis de una población de moléculas de ADN complementario al ácido nucleico molde, y b) incubating said mixture under conditions that allow the synthesis of a population of DNA molecules complementary to the template nucleic acid, and
c) separar dicha población de moléculas de ADN complementario para determinar la secuencia de nucleótidos. c) separating said population of complementary DNA molecules to determine the nucleotide sequence.
El término “retrotranscripción” o “transcripción inversa”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la síntesis de un ADN complementario a un ARN. The term "retrotranscription" or "reverse transcription", as used herein, refers to the synthesis of a DNA complementary to an RNA.
El término “amplificación”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al aumento del número de copias de un ácido nucleico molde. En una realización preferida, la amplificación tiene lugar mediante PCR. The term "amplification", as used herein, refers to the increase in the number of copies of a template nucleic acid. In a preferred embodiment, amplification takes place by PCR.
El término “secuenciación”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la determinación del orden de los nucleótidos de un ácido nucleico molde. The term "sequencing", as used herein, refers to the determination of the nucleotide order of a template nucleic acid.
El término “ácido nucleico molde”, “ácido nucleico templado”, “molde” o “templado”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una molécula de ácido nucleico de cadena simple o de doble cadena que va a ser retrotranscrita, amplificada o secuenciada. The term "template nucleic acid", "tempered nucleic acid", "template" or "tempered", as used herein refers to a single or double stranded nucleic acid molecule that is to be retrotranscribed, ampli fi ed or sequenced.
La expresión “condiciones que permitan la síntesis de ADN complementario” se refiere a las condiciones en las que puede tener lugar la incorporación de los nucleótidos a un ADN naciente mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde. The term "conditions that allow the synthesis of complementary DNA" refers to the conditions under which the incorporation of the nucleotides into a nascent DNA can take place by complementing bases with the template nucleic acid.
Generalmente las condiciones en las que tiene lugar la síntesis de ADN incluyen: (a) poner en contacto dicho ácido nucleico molde con la RT de la invención en una mezcla que además comprende un cebador, un catión bivalente, por ejemplo, Mg2+, y nucleótidos, y (b) someter dicha mezcla a una temperatura suficiente para que una polimerasa de ADN, por ejemplo, la RT de la invención, inicie la incorporación de los nucleótidos al cebador mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde, y de lugar una población de moléculas de ADN complementario de diferente tamaño. La separación de dicha población de moléculas de ADN complementario permite determinar la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico molde. Generally the conditions under which DNA synthesis takes place include: (a) contacting said template nucleic acid with the RT of the invention in a mixture which further comprises a primer, a bivalent cation, for example, Mg2 +, and nucleotides , and (b) subjecting said mixture to a sufficient temperature so that a DNA polymerase, for example, the RT of the invention, initiates the incorporation of the nucleotides into the primer by complementarity of bases with the template nucleic acid, and instead a population of complementary DNA molecules of different sizes. The separation of said population from complementary DNA molecules makes it possible to determine the nucleotide sequence of the template nucleic acid.
La incorporación de nucleótidos mal apareados durante la síntesis del ADN complementario puede resultar en una The incorporation of poorly matched nucleotides during complementary DNA synthesis may result in a
o más bases desapareadas. Por tanto, la cadena de ADN sintetizada puede no ser exactamente complementaria al ácido nucleico molde. or more mismatched bases. Therefore, the synthesized DNA chain may not be exactly complementary to the template nucleic acid.
La expresión “condiciones que permitan la síntesis de una población de moléculas de ADN complementario al ácido nucleico molde” se refiere a las condiciones en las cuáles se realiza la secuenciación, y que generalmente incluyen (a) poner en contacto dicho ácido nucleico molde con la RT de la invención en una mezcla que además comprende un cebador, un catión bivalente, (por ejemplo, Mg2+), y nucleótidos, generalmente, dNTPs y, al menos, un ddNTP, y (b) someter dicha mezcla a una temperatura suficiente para que una polimerasa de ADN, por ejemplo, la RT de la invención, inicie la incorporación de los nucleótidos al cebador mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde, y de lugar a una población de moléculas de ADN complementario de diferente tamaño. La separación de dicha población de moléculas de ADN complementario, generalmente, mediante electroforesis, permite determinar la secuencia de nucleótidos. The term "conditions that allow the synthesis of a population of DNA molecules complementary to the template nucleic acid" refers to the conditions under which sequencing is performed, and which generally include (a) contacting said template nucleic acid with the RT of the invention in a mixture which further comprises a primer, a bivalent cation, (eg, Mg2 +), and nucleotides, generally, dNTPs and, at least, a ddNTP, and (b) subjecting said mixture to a temperature sufficient to that a DNA polymerase, for example, the RT of the invention, initiates the incorporation of the nucleotides into the primer by complementarity of bases with the template nucleic acid, and results in a population of complementary DNA molecules of different sizes. The separation of said population from complementary DNA molecules, generally, by electrophoresis, allows to determine the nucleotide sequence.
El término “cebador”, como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucléotido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN cuando híbrida con el ácido nucleico molde. Preferiblemente, el cebador es un oligonucleótido de desoxirribosa. The term "primer", as used herein, refers to an oligonucleotide capable of acting as the starting point of DNA synthesis when hybridized with the template nucleic acid. Preferably, the primer is a deoxyribose oligonucleotide.
Los cebadores pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, la clonación y restricción de secuencias apropiadas y la síntesis química directa. Los cebadores pueden diseñarse para hibridar con secuencias específicas de nucleótidos en el ácido nucleico molde (cebadores específicos) o pueden ser sintetizados al azar (cebadores arbitrarios). The primers can be prepared by any suitable method, including, but not limited to, cloning and restriction of appropriate sequences and direct chemical synthesis. The primers can be designed to hybridize with specific nucleotide sequences in the template nucleic acid (specific primers) or they can be synthesized at random (arbitrary primers).
El término “cebador específico”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un cebador cuya secuencia es complementaria a una secuencia específica de nucleótidos en el ácido nucleico molde que se quiere retrotranscribir, amplificar o secuenciar. The term "specific primer", as used in the present description, refers to a primer whose sequence is complementary to a specific sequence of nucleotides in the template nucleic acid that is intended to be re-transcribed, amplified or sequenced.
El término “cebador arbitrario” se refiere a un cebador cuya secuencia es sintetizada al azar y que se usa para iniciar la síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ácido nucleico molde que se quiere retrotranscribir, amplificar The term "arbitrary primer" refers to a primer whose sequence is synthesized at random and that is used to initiate DNA synthesis at random positions of the template nucleic acid to be retranscribed, amplified.
o secuenciar. Con frecuencia se emplea una población de distintos cebadores arbitrarios. El término “cebadores arbitrarios” se refiere a un conjunto de cebadores cuya secuencia es sintetizada al azar y que se usa para iniciar la síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ácido nucleico molde que se quiere retrotranscribir, amplificar o secuenciar. or sequence A population of different arbitrary primers is often used. The term "arbitrary primers" refers to a set of primers whose sequence is synthesized at random and that is used to initiate DNA synthesis at random positions of the template nucleic acid that is to be re-transcribed, amplified or sequenced.
El término “hibridación”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al apareamiento de dos moléculas de ácido nucleico (de ADN y/o ARN) de cadena simple complementarias para dar una molécula de doble cadena. Preferiblemente, la complementariedad es del 100%. Esto es, en la región de complementariedad cada nucleótido de una de las dos moléculas de ácido nucleico puede formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido presente en la otra molécula de ácido nucleico. Sin embargo, aquellos con una experiencia normal en el campo reconocerán que dos moléculas de ácido nucleico que posean una región con complementariedad menor al 100% también pueden hibridar. The term "hybridization," as used herein, refers to the pairing of two complementary single stranded nucleic acid (DNA and / or RNA) molecules to give a double stranded molecule. Preferably, the complementarity is 100%. That is, in the region of complementarity each nucleotide of one of the two nucleic acid molecules can form hydrogen bonds with a nucleotide present in the other nucleic acid molecule. However, those with normal experience in the field will recognize that two nucleic acid molecules that possess a region with complementarity less than 100% can also hybridize.
El término “nucleótido”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a un molécula orgánica formada por la unión covalente de una pentosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato. El término nucleótido incluye desoxirribonucleósidos trifosfato como, por ejemplo, pero sin limitarse, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, o derivados de los mismos. El término nucleótido incluye también dideoxirribonucleósidos trifosfato (ddNTPs), como por ejemplo, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP, ddTTP o derivados de los mismos. The term "nucleotide", as used herein, refers to an organic molecule formed by the covalent junction of a pentose, a nitrogenous base and a phosphate group. The term "nucleotide" includes deoxyribonucleoside triphosphates, such as, but not limited to, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, or derivatives thereof. The term nucleotide also includes dideoxypyribonucleoside triphosphates (ddNTPs), such as ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP, ddTTP or derivatives thereof.
De acuerdo con la presente invención un “nucleótido” o un “cebador” puede ser marcado o etiquetado mediante técnicas bien conocidas en el estado de la técnica. Etiquetas detectables incluyen, por ejemplo, isótopos radiactivos, etiquetas fluorescentes, etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes o etiquetas enzimáticas. In accordance with the present invention a "nucleotide" or a "primer" can be labeled or labeled by techniques well known in the state of the art. Detectable labels include, for example, radioactive isotopes, fluorescent labels, chemiluminescent labels, bioluminescent labels or enzymatic labels.
El término “ADN polimerasa dependiente de ADN”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una ADN polimerasa capaz de catalizar la polimerización de desoxinucleótidos utilizando ADN como ácido nucleico molde. Ejemplos de ADN polimerasa dependientes de ADN que pueden se empleadas en el método de amplificación de la siguiente invención son, pero sin limitarnos, las ADN polimerasas de Thermus thermophilus (Tth), Thermus aquaticus (Taq), Thermotoga neapolitana (Tne), Thermotoga maritima (Tma), Thermococcus litoralis (Tli or VENTTM), Pyrococcus furiosis (Pfu), Pyrococcus species GB-D (Deep VentTM), Pyrococcus woosii (Pwo), Bacillus stearo-thermophilus (Bst), Bacillus caldophilus (Bca), Sulfolobus acidocaldarius (Sac), Thermoplasma acidophilum (Tac), Thermus flavus (Tfl/Tub), Thermus ruber (Tru), Thermus brockianus (DyNAzymeTM), Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth) o Mycobacterium sp. (Mtb, Mlep). The term "DNA-dependent DNA polymerase," as used herein, refers to a DNA polymerase capable of catalyzing the polymerization of deoxynucleotides using DNA as a template nucleic acid. Examples of DNA-dependent DNA polymerase that can be employed in the amplification method of the following invention are, but are not limited to, the DNA polymerases of Thermus thermophilus (Tth), Thermus aquaticus (Taq), Thermotoga neapolitana (Tne), Thermotoga maritima (Tma), Thermococcus litoralis (Tli or VENTTM), Pyrococcus furiosis (Pfu), Pyrococcus species GB-D (Deep VentTM), Pyrococcus woosii (Pwo), Bacillus stearo-thermophilus (Bst), Bacillus caldophilus (Bca), Sulfiusbus acido (Sac), Thermoplasma acidophilum (Tac), Thermus fl avus (T fl / Tub), Thermus ruber (Tru), Thermus brockianus (DyNAzymeTM), Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth) or Mycobacterium sp. (Mtb, Mlep).
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo cualquiera de los métodos descritos anteriormente en la presente descripción. Another aspect of the present invention relates to a kit comprising the elements necessary to carry out any of the methods described above in the present description.
Una realización preferida de este aspecto de la invención, se refiere a un kit para llevar a cabo cualquiera de los métodos descritos anteriormente en la presente descripción, que comprende: A preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a kit for carrying out any of the methods described above in the present description, which comprises:
a) la RT de la invención, y a) the RT of the invention, and
b) al menos, un elemento de la lista que comprende: b) at least one element of the list comprising:
- i) i)
- un tampón, a tampon,
- ii) ii)
- un cebador, a primer,
- iii) iii)
- una ADN polimerasa dependiente de ADN, y a DNA dependent DNA polymerase, and
- iv) iv)
- un nucleótido. a nucleotide
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention. The following figures and examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
Descripción de las figuras Description of the fi gures
Figura 1. Muestra la electroforesis en gel de poliacrilamida y SDS de la RT del VIH-1 grupo O “wild-type” resultante de la purificación. M, marcadores de peso molecular, pocillos 1-4: albúmina de suero bovino (66,2 kDa) (0,5, 1, 2 y 4 μg respectivamente); pocillos 5-7: alícuotas de la RT de VIH-1 grupo O purificada. El rendimiento de la purificación fue superiora3mgdeRTpor litro de cultivo procesado. Figure 1. It shows the electrophoresis in polyacrylamide gel and SDS of the RT of the HIV-1 group O "wild-type" resulting from purification. M, molecular weight markers, wells 1-4: bovine serum albumin (66.2 kDa) (0.5, 1, 2 and 4 μg respectively); wells 5-7: aliquots of the purified HIV-1 RT group O. The purification yield was superior to 3mg of RT per liter of processed culture.
Figura 2. Muestra la eficiencia de extensión de extremos desapareados obtenida con los tres mutantes analizados. Figure 2. It shows the efficiency of extension of missing ends obtained with the three mutants analyzed.
Figura 3. Muestra la amplificación por RT-PCR de fragmentos de ARN codificante para actina, de (A) 500 y (B) 1000 pares de bases, a partir de ARN total de hígado de ratón. La amplificación se llevó a cabo con las enzimas indicadas [RT de VIH-1 grupo O “wild-type” (RTO), RT de VIH-1 subtipo B BH10 (RTB), mutante V75I en el contexto de RTO (RTO V75I) y el doble mutante V75I/E478Q en el contexto de RTO (RTO V75I/E478Q)]. Las temperaturas indicadas se refieren a la reacción de síntesis del ADN copia. La eficiencia de estas enzimas se compara también con la de la RT de virus Moloney de la leucemia de ratón carente de actividad RNasa H (MLV) (véanse reacciones de retrotranscripción a temperaturas superiores a 65ºC). Act neg, control negativo (sin ADNc); Esc, marcadores de peso molecular. Figure 3. Shows the amplification by RT-PCR of fragments of RNA coding for actin, of (A) 500 and (B) 1000 base pairs, from total mouse liver RNA. The ampli fi cation was carried out with the indicated enzymes [RT of HIV-1 group O "wild-type" (RTO), RT of HIV-1 subtype B BH10 (RTB), mutant V75I in the context of RTO (RTO V75I) and the double mutant V75I / E478Q in the context of RTO (RTO V75I / E478Q)]. The indicated temperatures refer to the DNA synthesis reaction copy. The efficiency of these enzymes is also compared with that of the Moloney virus RT of mouse leukemia lacking RNase H (MLV) activity (see back transcription reactions at temperatures above 65 ° C). Act neg, negative control (without cDNA); Esc, molecular weight markers.
Figura 4. Muestra la actividad RNasa H de distintas RTs: RT de VIH-1 grupo O “wild-type” (RTO_WT), RT de VIH-1 subtipo B BH10 (BH10_WT), mutante V75I en el contexto de RTO (RTO_V75I), mutante E478Q en el contexto de RTO (RTO_E478Q) y el doble mutante V75I/E478Q en el contexto de RTO (RTO V75I/E478Q). En la parte inferior se indican las secuencias del molde y del cebador utilizado, indicándose con un asterisco la posición del extremo marcado radiactivamente. Figure 4. Shows the RNase H activity of different RTs: HIV-1 RT group "wild-type" (RTO_WT), HIV-1 RT subtype B BH10 (BH10_WT), mutant V75I in the context of RTO (RTO_V75I) , mutant E478Q in the context of RTO (RTO_E478Q) and the double mutant V75I / E478Q in the context of RTO (RTO V75I / E478Q). In the lower part, the sequences of the mold and the primer used are indicated, indicating the position of the radioactively marked end with an asterisk.
Ejemplos Examples
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma. The following specific examples provided in this patent document serve to illustrate the nature of the present invention. These examples are included for illustrative purposes only and should not be construed as limitations to the invention claimed herein. Therefore, the examples described below illustrate the invention without limiting its scope of application.
Ejemplo 1 Example 1
Generación, expresión y purificación la RTs del virus VIH de tipo 1 de grupo O “wild type” y mutantes Generation, expression and puri fi cation of the RTs of type 1 “wild type” HIV virus and mutants
La expresión y purificación de las RTs se llevó a cabo con una versión modificada del plásmido p66RTB (Boretto et al. Anal. Biochem. 2001; 292: 139-147; Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2005; 349: 451-463), que contiene el gen de resistencia a ampicilina y en el que clonamos la región codificante de la subunidad p66 de la RT de un aislado del VIH-1 de grupo O (Menéndez-Arias et al. J. Biol. Chem. 2001; 276: 27470-27479). Para ello se digirió el plásmido p66RTB portador de la enzima SS RT (descrito en Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2005; 349: 451-463) con las enzimas EcoRI y XhoI y se clonó el inserto que codifica para la subunidad p66 de la RT de VIH-1 grupo O, derivado de la digestión con las mismas enzimas del plásmido pRT6 (portador de la variante ESP49) (Menéndez-Arias et al. J. Biol. Chem. 2001; 276: 27470-27479). La secuencia de nucleótidos que comprende la región que codifica para la subunidad p66 del VIH-1 (grupo O) en el plásmido de expresión se muestra en la SEQ ID NO: 5, mientras que la secuencia de aminoácidos de la RT obtenida con dicho plásmido se indica en la SEQ ID NO: 6. Utilizando esta construcción se produce la subunidad p66, modificada en el extremo N-terminal por la presencia de tres aminoácidos: Met-Asn-Ser, y en el extremo C-terminal por la presencia de una cola de 9 aminoácidos (Glu-Ser-Thr-His-His-His-His-His-His), que contiene los seis residuos de histidina, que facilitan su purificación. La subunidad p51 se genera por el procesamiento proteolítico de p66, por parte de la proteasa del VIH-1 co-expresada mediante la utilización del plásmido pATproteasa (Boretto et al. Anal. Biochem. 2001; 292: 139-147). The expression and purification of the RTs was carried out with a modified version of plasmid p66RTB (Boretto et al. Anal. Biochem. 2001; 292: 139-147; Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2005; 349: 451 -463), which contains the ampicillin resistance gene and in which we clone the coding region of the p66 subunit of the RT of an isolate of group O HIV-1 (Menéndez-Arias et al. J. Biol. Chem. 2001; 276: 27470-27479). To do this, the plasmid p66RTB carrying the enzyme SS RT (described in Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2005; 349: 451-463) was digested with the enzymes EcoRI and XhoI and the insert encoding the subunit was cloned p66 of the RT of HIV-1 group O, derived from digestion with the same enzymes of plasmid pRT6 (carrier of the ESP49 variant) (Menéndez-Arias et al. J. Biol. Chem. 2001; 276: 27470-27479) . The nucleotide sequence comprising the region coding for the p66 subunit of HIV-1 (group O) in the expression plasmid is shown in SEQ ID NO: 5, while the amino acid sequence of the RT obtained with said plasmid It is indicated in SEQ ID NO: 6. Using this construction the p66 subunit is produced, modified at the N-terminal end by the presence of three amino acids: Met-Asn-Ser, and at the C-terminal end by the presence of a 9 amino acid tail (Glu-Ser-Thr-His-His-His-His-His-His), which contains the six histidine residues, which facilitate its purification. The p51 subunit is generated by the proteolytic processing of p66, by the HIV-1 protease co-expressed by the use of the plasmid pATprotease (Boretto et al. Anal. Biochem. 2001; 292: 139-147).
Los plásmidos para la expresión de las RTs mutantes RTO_V75I y RTO_V75I/E478Q se obtuvieron por mutagénesis dirigida utilizando el kit “Quik-Change Site-Directed Mutagenesis” de Stratagene, siguiendo las instrucciones del fabricante. Como oligonucleótidos mutagénicos se emplearon: SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 para introducir la mutación V75I, y SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 para E478Q. Como molde para la introducción de V75I, se empleó el plásmido portador de la secuencia que codifica la p66 de VIH-1 (grupo O), descrito anteriormente. La mutación E478Q se introdujo en el plásmido portador de V75I. Tras la mutagénesis se comprobó por secuenciación que la región codificante de p66 en dichos plásmidos era correcta y contenía únicamente las mutaciones introducidas. Las secuencias de nucleótidos de los insertos portadores de las mutaciones V75I y V75I/E478Q se muestran en las SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, y las secuencias de aminoácidos de las RTs obtenidas de la expresión de los plásmidos mutantes se indican las SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14. Plasmids for the expression of the mutant RTs RTO_V75I and RTO_V75I / E478Q were obtained by directed mutagenesis using Stratagene's "Quik-Change Site-Directed Mutagenesis" kit, following the manufacturer's instructions. The mutagenic oligonucleotides were: SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 to introduce the V75I mutation, and SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for E478Q. As a template for the introduction of V75I, the plasmid carrying the sequence encoding p66 of HIV-1 (group O), described above, was used. The E478Q mutation was introduced into the V75I carrier plasmid. After mutagenesis, it was verified by sequencing that the coding region of p66 in said plasmids was correct and contained only the mutations introduced. The nucleotide sequences of the inserts carrying mutations V75I and V75I / E478Q are shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and the amino acid sequences of the RTs obtained from the expression of the mutant plasmids are indicated. SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14.
La subunidad p66 (con sus extremos modificados) se coexpresa en E. coli XL1 Blue con la proteasa del VIH1 (subtipo B) empleando el vector pATprotease (Boretto et al. Anal. Biochem. 2001; 292: 139-147), portador de resistencia a kanamicina. Se obtuvieron 3 cultivos de 1 litro cada uno (medio estándar Luria-Broth con ampicilina 100 μg/ml y kanamicina 50 μg/ml) de E. coli portadora de los plásmidos de expresión de RT grupo O (“wild-type” o los mutantes correspondientes) y pATproteasa, en fase exponencial de crecimiento, y se indujo la expresión de RT con isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) durante 20-24 horas. The p66 subunit (with its modified ends) is coexpressed in E. coli XL1 Blue with the HIV1 protease (subtype B) using the vector pATprotease (Boretto et al. Anal. Biochem. 2001; 292: 139-147), carrier of Kanamycin resistance. 3 cultures of 1 liter each were obtained (Luria-Broth standard medium with 100 μg / ml ampicillin and 50 μg / ml kanamycin) of E. coli carrying the group O RT expression plasmids (“wild-type” or corresponding mutants) and pATprotease, in exponential phase of growth, and RT expression was induced with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) for 20-24 hours.
Al cabo de ese tiempo se recogieron las bacterias y se procesaron siguiendo el procedimiento descrito por Boretto et al. (Anal. Biochem. 2001; 292: 139-147), en el que se incluye una etapa de lisis bacteriana y homogenización, seguida de cromatografías de intercambio iónico (en fosfocelulosa) y de afinidad (en columnas de Ni2+-nitriloacéticoagarosa). After that time the bacteria were collected and processed following the procedure described by Boretto et al. (Anal. Biochem. 2001; 292: 139-147), which includes a stage of bacterial lysis and homogenization, followed by ion exchange chromatographs (in phosphocellulose) and affinity (in Ni2 + -nitriloacetic agarose columns).
El rendimiento obtenido a partir de 3 litros de cultivo (10 g de células) fue de 10 mg, estimado a partir del coeficiente de extinción molar de la RT a 280 nm (ε280 = 260450 M−1cm−1) (Kati et al. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2598825997). La proporción de enzima activa obtenida fue igual o superior al 40%. La pureza de la RT obtenida fue superior al 95% de acuerdo a estimaciones llevadas a cabo con geles de poliacrilamida y SDS (Figura 1). Estos rendimientos son sensiblemente superiores a los obtenidos utilizando protocolos anteriormente descritos, en los que el rendimiento no superaba los 50-100 μg para el mismo volumen de cultivo de partida (Quiñones-Mateu et al. Virology 1997; 236: 364-373). The yield obtained from 3 liters of culture (10 g of cells) was 10 mg, estimated from the coefficient of molar extinction of the RT at 280 nm (ε280 = 260450 M − 1cm − 1) (Kati et al. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2598825997). The proportion of active enzyme obtained was equal to or greater than 40%. The purity of the obtained RT was greater than 95% according to estimates carried out with polyacrylamide gels and SDS (Figure 1). These yields are significantly higher than those obtained using previously described protocols, in which the yield did not exceed 50-100 μg for the same volume of starting culture (Quiñones-Mateu et al. Virology 1997; 236: 364-373).
Ejemplo 2 Example 2
Efecto de las mutaciones V75I y V75I/E478Q sobre la fidelidad de copia Effect of mutations V75I and V75I / E478Q on copy accuracy
La fidelidad de copia de las RTs se ha determinado mediante ensayos cinéticos de incorporación de nucleótido en el estado pre-estacionario, utilizando complejos molde-cebador 31T/21P en los que el extremo 3’OH puede estar correcta The copy accuracy of the RTs has been determined by kinetic assays of nucleotide incorporation in the pre-stationary state, using 31T / 21P template-primer complexes in which the 3'OH end may be correct
- o incorrectamente apareado (Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2008; 375: 1234-1248), y mediante ensayos genéticos utilizando el plásmido M13mp2 lacZα (Bebenek y Kunkel. Methods Enzymol. 1995; 262: 217-232; Matamoros et al. or incorrectly paired (Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2008; 375: 1234-1248), and by genetic testing using the plasmid M13mp2 lacZα (Bebenek and Kunkel. Methods Enzymol. 1995; 262: 217-232; Matamoros et to the.
- J. J.
- Mol. Biol. 2008; 375: 1234-1248). Mol. Biol. 2008; 375: 1234-1248).
La RT de grupo O portadora del cambio V75I retiene actividad catalítica similar a la RT “wild-type” y presenta una menor capacidad para extender cebadores que contienen un extremo 3’ desapareado (Tabla 1; Figura 2). En ensayos cinéticos en los que se determina la eficacia catalítica de la reacción con distintos complejos molde-cebador, se observó que la presencia de la mutación V75I produce un descenso de la eficiencia de extensión de extremos desapareados de 3,5 veces para el par G:T; 2,9 veces para el par G:G y de 3,7 veces para el par G:A, cuando se compara con la RT de VIH-1 grupo O “wild-type”, y de 2 a 6 veces cuando se compara con la RT de VIH-1 subtipo B (cepa prototipo BH10). The group O RT carrying the change V75I retains catalytic activity similar to the "wild-type" RT and has a lower capacity to extend primers containing a missing 3 'end (Table 1; Figure 2). In kinetic tests in which the catalytic efficiency of the reaction with different template-primer complexes is determined, it was observed that the presence of the V75I mutation causes a decrease in the efficiency of extension of missing ends of 3.5 times for the G pair. : T; 2.9 times for the G: G pair and 3.7 times for the G: A pair, when compared to the HIV-1 RT group “wild-type”, and 2 to 6 times when compared with the RT of HIV-1 subtype B (prototype strain BH10).
Por otro lado se midió la fidelidad en ensayos de complementación que utilizan derivados del fago M13mp2 en los que está presente el gen lacZ. Se determinó la frecuencia con que se obtenían mutantes cuando el proceso de síntesis se realiza con las distintas RTs recombinantes (Tabla 2). Un aumento de fidelidad de copia se refleja en la aparición en el ensayo de un número menor de placas mutantes. La RT del VIH-1 grupo O “wild-type” presentaba un incremento de fidelidad de 2,5 veces con respecto a la RT del VIH-1 subtipo B (“wild-type” BH10), mientras que la presencia de la mutación V75I en el contexto de la RT de VIH-1 grupo O mejoraba la fidelidad de copia en 4,7 veces respecto a la RT de subtipo B. En el contexto de secuencia de la RT de VIH-1 grupo O, el doble mutante V75I/E478Q presenta una fidelidad de copia similar a la de V75I, en ensayos de complementación que utilizan derivados del fago M13mp2 en los que está presente el gen lacZ. On the other hand, the reliability was measured in complementation tests using phage derivatives M13mp2 in which the lacZ gene is present. The frequency with which mutants were obtained was determined when the synthesis process is performed with the different recombinant RTs (Table 2). An increase in copy accuracy is reflected in the appearance in the test of a smaller number of mutant plates. The RT of the HIV-1 O-group "wild-type" presented a 2.5-fold increase in fidelity with respect to the RT of the HIV-1 subtype B ("wild-type" BH10), while the presence of the mutation V75I in the context of the RT of HIV-1 group O improved copy accuracy 4.7 times compared to the RT of subtype B. In the context of the sequence of the RT of HIV-1 group O, the double mutant V75I / E478Q has a copying similarity to that of V75I, in complementation assays using M13mp2 phage derivatives in which the lacZ gene is present.
TABLA 1 TABLE 1
Parámetros cinéticos de extensión de extremos desapareados sobre el complejo molde-cebador 31T/21P para la RT del VIH-1 subtipo B “wild-type” BH10 (BH10_WT), comparada con la del VIH-1 grupo O “wild-type” (RTO_WT) y con el mutante V75I en el contexto de secuencia de VIH-1 grupo O (RTO_V75I), determinados en el estado pre-estacionario Kinetic parameters of extension of missing ends on the 31T / 21P template-primer complex for the RT of HIV-1 subtype B "wild-type" BH10 (BH10_WT), compared with that of HIV-1 group O "wild-type" ( RTO_WT) and with mutant V75I in the context of sequence of HIV-1 group O (RTO_V75I), determined in the pre-stationary state
TABLA 2 TABLE 2
Fidelidad de la RT del VIH-1 subtipo B “wild-type” BH10 (BH10_WT), comparada con la del mutante V75I (en el contexto de secuencia de BH10), con la del VIH-1 grupo O “wild-type” (RTO_WT) y con los mutantes V75I y V75I/E478Q en el contexto de secuencia de VIH-1 grupo O (RTO_V75I y RTO_V75I/E478Q), estimada mediante ensayos genéticos (M13mp2 lacZa “forward mutation assay”) Fidelity of the HIV-1 RT subtype B “wild-type” BH10 (BH10_WT), compared with that of the V75I mutant (in the sequence context of BH10), with that of HIV-1 group “wild-type” (RTO_WT) and with mutants V75I and V75I / E478Q in the context of HIV-1 group O sequence (RTO_V75I and RTO_V75I / E478Q), estimated by genetic tests (M13mp2 lacZa “forward mutation assay”)
Ejemplo 3 Example 3
Efecto de las mutaciones V75I y V75I/E478Q sobre la termoestabilidad Effect of V75I and V75I / E478Q mutations on thermostability
Para analizar la termostabilidad de los mutantes se llevaron a cabo reacciones de retrotranscripción a diferentes temperaturas, y posteriormente los productos de reacción (ADNc) se amplificaron por PCR en condiciones estándar. Típicamente, la reacción de retrotranscripción se llevó a cabo en un volumen de 20 μl[4 μl de tampón Tris-HCl 250 mM (pH 8,3 at 25ºC) que contiene KCl 375 mM, MgCl2 15 mM y ditiotreitol 50 mM; 1 μl de ARN total aislado de hígado de ratón (1 μg/μl); 4 μl de una mezcla de los 4 dNTPs (a 2,5 mM cada uno de ellos); 1 μl de oligo-dT (100 μM); 0,5 μl de inhibidor de RNasa (40 unidades/μl); la RT a una concentración aproximada de 150 nM y el resto hasta 20 μl de agua]. Inicialmente se incuba el ARN y el oligo dT a 68ºC durante 3 min. Después se añaden los demás componentes de la reacción y se incuba durante 1 hora a la temperatura deseada para ver termostabilidad. Finalmente, la reacción se detiene incubando 10 min a 92ºC, para obtener el ADNc. Este se amplifica por PCR en condiciones estándar, utilizando Taq polimerasa y los cebadores ACT1 y ACT2 (fragmento de 500 pares de bases) o ACT1 y ACT3 (fragmento de 1000 pares de bases). Las secuencias de los cebadores utilizados son: ACT1: SEQ ID NO: 15, ACT2: SEQ ID NO: 16, y ACT3: SEQ ID NO: 17. To analyze the thermostability of the mutants, back transcription reactions were carried out at different temperatures, and subsequently the reaction products (cDNA) were amplified by PCR under standard conditions. Typically, the back transcription reaction was carried out in a volume of 20 μl [4 μl of 250 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3 at 25 ° C) containing 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2 and 50 mM dithiothreitol; 1 μl of total RNA isolated from mouse liver (1 μg / μl); 4 μl of a mixture of the 4 dNTPs (at 2.5 mM each); 1 μl of oligo-dT (100 μM); 0.5 μl of RNase inhibitor (40 units / μl); RT at an approximate concentration of 150 nM and the rest up to 20 μl of water]. Initially the RNA and oligo dT are incubated at 68 ° C for 3 min. The other reaction components are then added and incubated for 1 hour at the desired temperature to see thermostability. Finally, the reaction is stopped by incubating 10 min at 92 ° C, to obtain the cDNA. This is amplified by PCR under standard conditions, using Taq polymerase and primers ACT1 and ACT2 (500 base pair fragment) or ACT1 and ACT3 (1000 base pair fragment). The sequences of the primers used are: ACT1: SEQ ID NO: 15, ACT2: SEQ ID NO: 16, and ACT3: SEQ ID NO: 17.
Ejemplo 4 Example 4
Pérdida de la actividad RNasa H en las RTs portadoras del cambio E478Q Loss of RNase H activity in the RT carriers carrying the E478Q change
Los estudios de termostabilidad llevados a cabo con las cuatro RTs de VIH-1 (VIH-1 grupo O “wild-type”, VIH1 grupo O mutante V75I, VIH-1 grupo O mutante V75I/E478Q y VIH-1 subtipo B “wild-type BH10”) y la RT del virus Moloney de la leucemia de ratón (MLV) demostraron que las tres enzimas derivadas de VIH-1 grupo O eran las más termoestables (Figura 3). Sin embargo la presencia de V75I disminuía la termostabilidad de la enzima, mientras que cuando iba acompañada por el cambio E478Q, se producía una mejora en su estabilidad que se reflejaba en un aumento en la intensidad de la banda amplificada. Esto se debe a que la presencia de la mutación E478Q conduce a la pérdida de actividad RNasa H de la enzima (Figura 4), lo que facilita la estabilidad del ARN en reacciones de amplificación. The thermostability studies carried out with the four RTs of HIV-1 (HIV-1 group O "wild-type", HIV1 group O mutant V75I, HIV-1 group O mutant V75I / E478Q and HIV-1 subtype B "wild -type BH10 ”) and the Moloney virus of mouse leukemia (MLV) RT showed that the three enzymes derived from HIV-1 group O were the most thermostable (Figure 3). However, the presence of V75I decreased the thermostability of the enzyme, while when accompanied by the change E478Q, there was an improvement in its stability that was reflected in an increase in the intensity of the amplified band. This is because the presence of the E478Q mutation leads to the loss of RNase H activity of the enzyme (Figure 4), which facilitates the stability of the RNA in amplification reactions.
La actividad RNasa H de los mutantes generados se determinó con un complejo molde-cebador, cuya estructura aparece en la parte inferior. El molde ARN se encuentra marcado en su extremo 5’ con 32P y la reacción se lleva a cabo a 37ºC, en presencia de molde-cebador ARN/ADN a 50 nM y la RT correspondiente a 100 nM, en un tampón que contenía: Tris-HCl 50 mM (pH 8.0), NaCl 50 mM y MgCl2 5 mM. Las reacciones se iniciaron tras añadir 1 μl de la RT concentrada y MgCl2. Se tomaron alícuotas a 0, 15, 60, 120, 240 y 480 s, y la reacción se detuvo añadiendo EDTA 10 mM disuelto en formamida al 90%. Las muestras se analizaron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida y urea. Los fragmentos de 26 y 25 nucleótidos se generan como consecuencia de la ruptura del molde ARN por parte de la actividad RNasa H de la RT. La ausencia de degradación del molde de 31 nucleótidos demuestra la pérdida de actividad RNasa H por parte de los mutantes portadores del cambio E478Q. The RNase H activity of the generated mutants was determined with a template-primer complex, whose structure appears at the bottom. The RNA template is labeled at its 5 'end with 32P and the reaction is carried out at 37 ° C, in the presence of a 50 nM RNA / DNA primer and the RT corresponding to 100 nM, in a buffer containing: Tris -50 mM HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl and 5 mM MgCl2. The reactions were started after adding 1 µl of the concentrated RT and MgCl2. Aliquots were taken at 0, 15, 60, 120, 240 and 480 s, and the reaction was stopped by adding 10 mM EDTA dissolved in 90% formamide. Samples were analyzed in denaturing polyacrylamide and urea gels. The 26 and 25 nucleotide fragments are generated as a consequence of the rupture of the RNA template by the RNase H activity of the RT. The absence of degradation of the 31 nucleotide template demonstrates the loss of RNase H activity by the E478Q change-bearing mutants.
Claims (33)
- 1. one.
- Retrotranscriptasa aislada de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 de grupo O y modificada para que comprenda una secuencia de aminoácidos en la que el residuo que corresponde a la posición 75 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por una isoleucina o por otro aminoácido que suponga una sustitución conservativa respecto a la isoleucina, donde dicha retrotranscriptasa modificada tiene una fidelidad de copia incrementada con relación a la retrotranscriptasa no modificada correspondiente. Retrotranscriptase isolated from a type 1 human immunodeficiency virus of group O and modified to comprise an amino acid sequence in which the residue corresponding to position 75 of SEQ ID NO: 1 is replaced by an isoleucine or another amino acid that supposes a conservative substitution with respect to isoleucine, where said modified retrotranscriptase has an increased copyity in relation to the corresponding unmodified retrotranscriptase.
- 2. 2.
- Retrotranscriptasa según la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos presenta una identidad de, al menos, un 90% con la SEQ ID NO: 1. Retrotranscriptase according to claim 1, wherein the amino acid sequence has an identity of at least 90% with SEQ ID NO: 1.
- 3. 3.
- Retrotranscriptasa según la reivindicación 2, donde la secuencia de aminoácidos presenta una identidad de, al menos, un 95% con la SEQ ID NO: 1. Retrotranscriptase according to claim 2, wherein the amino acid sequence has an identity of at least 95% with SEQ ID NO: 1.
- 4. Four.
- Retrotranscriptasa según la reivindicación 3, donde la secuencia de aminoácidos presenta una identidad de, al menos, un 98% con la SEQ ID NO: 1. Retrotranscriptase according to claim 3, wherein the amino acid sequence has an identity of at least 98% with SEQ ID NO: 1.
- 5. 5.
- Retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la secuencia de aminoácidos además tiene otra sustitución del residuo que corresponde a la posición 478 de la SEQ ID NO: 1 por una glutamina o por otro aminoácido que suponga una sustitución conservativa respecto a la glutamina, y donde dicha retrotranscriptasa modificada tiene una termoestabilidad incrementada con relación a la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones1a4. Retrotranscriptase according to any one of claims 1 to 4, wherein the amino acid sequence also has another substitution of the residue corresponding to position 478 of SEQ ID NO: 1 with a glutamine or another amino acid that involves a conservative substitution with respect to glutamine , and wherein said modified retrotranscriptase has increased thermostability in relation to the retrotranscriptase according to any of claims 1 to 4.
- 6. 6.
- Retrotranscriptasa según las reivindicaciones1a4, donde la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 2. Retrotranscriptase according to claims 1-4, wherein the amino acid sequence is SEQ ID NO: 2.
- 7. 7.
- Retrotranscriptasa según la reivindicación 5, donde la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 3. Retrotranscriptase according to claim 5, wherein the amino acid sequence is SEQ ID NO: 3.
- 8. 8.
- Polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de una retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones1a7. Polynucleotide encoding the amino acid sequence of a retrotranscriptase according to any one of claims 1-7.
- 10. 10.
- Vector según la reivindicación 9 donde el polinucleótido está unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de la lista que comprende: a) un promotor, b) una señal de inicio de la transcripción, c) una señal de terminación de la transcripción, Vector according to claim 9 wherein the polynucleotide is operatively linked to at least one control sequence of the list comprising: a) a promoter, b) a transcription initiation signal, c) a transcription termination signal ,
- 11. eleven.
- Vector según cualquiera de las reivindicaciones9ó10 donde el polinucleótido está unido en fase de lectura a una secuencia que codifica para una etiqueta de purificación. Vector according to any of claims 9 or 10 wherein the polynucleotide is linked in reading phase to a sequence encoding a purification tag.
- 13. 13.
- Vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que además comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en la secuencia de aminoácidos de una retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones1a7 entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de la SEQ ID NO: 1. Vector according to any of claims 9 to 12, further comprising a polynucleotide encoding a protease capable of performing an endoproteolytic cut in the amino acid sequence of a retrotranscriptase according to any of claims 1 to 7 between residues corresponding to positions 440 and 441 of SEQ ID NO: 1.
- 14. 14.
- Célula que comprende un vector según cualquiera de las reivindicaciones9a12yque además comprende otro vector que comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en la secuencia de aminoácidos de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de la SEQ ID NO: 1. Cell comprising a vector according to any one of claims 9 to 12 and further comprising another vector comprising a polynucleotide encoding a protease capable of making an endoproteolytic cut in the amino acid sequence of the retrotranscriptase according to any one of claims 1 to 7 among the residues corresponding to positions 440 and 441 of SEQ ID NO: 1.
- 18. 18.
- Uso de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la retrotranscripción de un ácido nucleico molde. Use of the retrotranscriptase according to any one of claims 1 to 7 for the retrotranscription of a template nucleic acid.
- 19. 19.
- Uso de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones1a7 para la amplificación de un ácido nucleico molde. Use of the retrotranscriptase according to any one of claims 1-7 for the amplification of a template nucleic acid.
- 20. twenty.
- Uso de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones1a7 para la secuenciación de un ácido nucleico molde. Use of the retrotranscriptase according to any of claims 1-7 for the sequencing of a template nucleic acid.
- 21. twenty-one.
- Uso de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 donde el ácido nucleico molde es ARNm. Use of the retrotranscriptase according to any of claims 18 to 20 wherein the template nucleic acid is mRNA.
- i) i)
- un tampón, a tampon,
- ii) ii)
- un cebador, a primer,
- iii) iii)
- una ADN polimerasa dependiente de ADN, y a DNA dependent DNA polymerase, and
- iv) iv)
- un nucleótido. a nucleotide
- Categoría Category
- Documentos citados Reivindicaciones afectadas Documents cited Claims Affected
- X X
- MATAMOROS, T., KIM, B., MENÉNDEZ-ARIAS, L. Mechanistic insights into the role of Val75 of HIV-1 reverse transcriptase in misinsertion and mispair extension fidelity of DNA synthesis. The Journal of Molecular Biology. Febrero 2008, Vol. 375, Nº 5, páginas 1234-1248. ISSN 1089-8638. <DOI:10.1016/j.jmb.2007.11.021> 1-4,6,8-26 MATAMOROS, T., KIM, B., MENÉNDEZ-ARIAS, L. Mechanistic insights into the role of Val75 of HIV-1 reverse transcriptase in misinsertion and mispair extension fidelity of DNA synthesis. The Journal of Molecular Biology. February 2008, Vol. 375, No. 5, pages 1234-1248. ISSN 1089-8638. <DOI: 10.1016 / j.jmb.2007.11.021> 1-4,6,8-26
- A TO
- SISMOUR, A. M., LUTZ, S., PARK, J.-H. et al. PCR amplification of DNA containing non-standard base pairs by variants of reverse transcriptase from Human Immunodeficiency Virus-1. Nucleic Acids Research. 2004, Vol. 32, Nº 2, páginas 728-735. ISSN 1362-4962. <DOI:10.1093/nar/gkh241> 5,7-12,14,16-26 SISMOUR, A. M., LUTZ, S., PARK, J.-H. et al. PCR amplification of DNA containing non-standard base pairs by variants of reverse transcriptase from Human Immunodeficiency Virus-1. Nucleic Acids Research. 2004, Vol. 32, No. 2, pages 728-735. ISSN 1362-4962. <DOI: 10.1093 / nar / gkh241> 5,7-12,14,16-26
- A TO
- ABBONDANZIERI, E. A., BOKINSKY, G., RAUSCH, J. W., et al. Dynamic binding orientations direct activity of HIV reverse transcriptase. Nature. Mayo 2008, Vol. 453, Nº 7192 páginas 184-189. ISSN 1476-4687. <DOI:10.1038/nature06941> 5,7-10,14,16,17 ABBONDANZIERI, E. A., BOKINSKY, G., RAUSCH, J. W., et al. Dynamic binding orientations direct activity of HIV reverse transcriptase. Nature May 2008, Vol. 453, No. 7192 pages 184-189. ISSN 1476-4687. <DOI: 10.1038 / nature06941> 5,7-10,14,16,17
- A TO
- RODES, B., MENDOZA, C., RODGERS, M. et al. Treatment response and drug resistance in patients infected with HIV type 1 group O viruses. AIDS Research and Human Retroviruses. Julio 2005, Vol. 21, Nº 7, páginas 602-607. ISSN 0889-2229. <DOI:10.1089/aid.2005.21.602> 1-4,6,8 RODES, B., MENDOZA, C., RODGERS, M. et al. Treatment response and drug resistance in patients infected with HIV type 1 group O viruses. AIDS Research and Human Retroviruses. July 2005, Vol. 21, No. 7, pages 602-607. ISSN 0889-2229. <DOI: 10.1089 / aid.2005.21.602> 1-4,6,8
- Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the date of priority submission of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application
- El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº: This report has been prepared • for all claims • for claims no:
- Fecha de realización del informe 28.04.2011 Date of realization of the report 04/28/2011
- Examinador E. Relaño Reyes Página 1/5 Examiner E. Relaño Reyes Page 1/5
- Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-26 SI NO Claims Claims 1-26 IF NOT
- Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Inventive activity (Art. 8.1 LP11 / 1986)
- Reivindicaciones 5, 7 Reivindicaciones 1-4, 6, 8-26 SI NO Claims 5, 7 Claims 1-4, 6, 8-26 IF NOT
- Documento Document
- Número Publicación o Identificación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date
- D01 D01
- MATAMOROS, T. et al. The Journal of Molecular Biology. Febrero 2008, Vol. 375, Nº 5, páginas 1234-1248. 02.2008 MATAMOROS, T. et al. The Journal of Molecular Biology. February 2008, Vol. 375, No. 5, pages 1234-1248. 02.2008
- D02 D02
- SISMOUR, A. M. et al. Nucleic Acids Research. 2004, Vol. 32, Nº 2, páginas 728-735. 2004 SISMOUR, A. M. et al. Nucleic Acids Research. 2004, Vol. 32, No. 2, pages 728-735. 2004
- D03 D03
- ABBONDANZIERI, E. A. et al. Nature. Mayo 2008, Vol. 453, Nº 7192, páginas 184-189. 05.2008 ABBONDANZIERI, E. A. et al. Nature May 2008, Vol. 453, No. 7192, pages 184-189. 05.2008
- D04 D04
- RODES, B. et al. AIDS Research and Human Retroviruses. Julio 2005, Vol. 21, Nº 7, páginas 602-607. 07.2005 RODES, B. et al. AIDS Research and Human Retroviruses. July 2005, Vol. 21, No. 7, pages 602-607. 07.2005
- 1.one.
- NOVEDAD (Art. 6.1 LP 11/1986) NEW (Art. 6.1 LP 11/1986)
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