ES2355788A1

ES2355788A1 - Method for obtaining vegetable oligosacrides (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Info

Publication number: ES2355788A1
Application number: ES200930375A
Authority: ES
Inventors: Maria Jose Villanueva Suarez; Maria Pilar Ruperez Anton; Maria Luisa Perez Cozar; Araceli Redondo Cuenca
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Complutense de Madrid
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Complutense de Madrid
Priority date: 2009-06-29
Filing date: 2009-06-29
Publication date: 2011-03-31
Anticipated expiration: 2029-06-29
Also published as: ES2355788B1

Abstract

Method for obtaining plant oligosaccharides. The present invention relates to a method for obtaining oligosaccharides from any part of a vegetable, preferably from okara, a by-product that remains after the processing of soy milk or the preparation of tofu, which comprises the steps of obtaining the soluble and/or insoluble fiber of a vegetable, hydrolyze the fiber of section (a) by the addition of an enzymatic mixture comprising at least one glycosidase, incubate the mixture obtained in section (b) at a temperature of between 20 and 50º c, and isolate the oligosaccharides from the product obtained in section (c). (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Description

Método para la obtención de oligosacáridos vegetales.Method for obtaining oligosaccharides vegetables.

La presente invención se refiere a un método de obtención de oligosacáridos a partir de cualquier parte de un vegetal. Preferiblemente los oligosacáridos se obtienen del okara, subproducto que queda tras la elaboración de la leche de soja o de la elaboración del tofu. Dicho método comprende la hidrólisis de la fibra soluble y/o insoluble, o de la fibra insoluble dispersada en un medio líquido, mediante la adición de una mezcla enzimática que comprende al menos una glicosidasa. Dicha glicosidasa puede ser al menos una beta-glucanasa, al menos una xilanasa, al menos una celulasa, al menos una pentosanasa, al menos una arabinasa, o cualquiera de sus combinaciones. El método de la presente invención se ha optimizado para obtener mayores rendimientos y por ello además puede comprender una etapa de tratamiento en autoclave previa a la hidrólisis enzimática. Con la optimización de las condiciones del método de la presente invención se consigue reducir el tiempo de incubación para llevar a cabo la hidrólisis, obteniendo además mayores rendimientos. Los oligosacáridos obtenidos se pueden utilizar para la elaboración de un alimento funcional.The present invention relates to a method of obtaining oligosaccharides from any part of a vegetable. Preferably the oligosaccharides are obtained from okara, by-product left after the processing of soy milk or Tofu making. Said method comprises the hydrolysis of the soluble and / or insoluble fiber, or insoluble fiber dispersed in a liquid medium, by adding an enzymatic mixture that It comprises at least one glycosidase. Said glycosidase may be at at least one beta-glucanase, at least one xylanase, at least one cellulase, at least one pentosanase, at least one arabinase, or any combination thereof. The method of The present invention has been optimized to obtain greater yields and therefore can also comprise a stage of autoclave treatment prior to enzymatic hydrolysis. With the optimization of the conditions of the method of the present invention it is possible to reduce the incubation time to carry out the hydrolysis, also obtaining higher yields. The obtained oligosaccharides can be used for the preparation of A functional food.

Prior art

Algunos de los polisacáridos que constituyen la fibra alimentaria, así como los oligosacáridos, se consideran ingredientes prebióticos, ya que son capaces de estimular el crecimiento selectivo de bacterias del colon beneficiosas para la salud (Gibson y Roberfroid, 1995, J. Nutr., 125: 1401-1412).Some of the polysaccharides that constitute dietary fiber, as well as oligosaccharides, are considered prebiotic ingredients, since they are capable of stimulating the selective growth of colon bacteria beneficial to health (Gibson and Roberfroid, 1995, J. Nutr ., 125 : 1401-1412).

Actualmente los oligosacáridos funcionales se consideran ingredientes importantes de los alimentos para mantener y mejorar el estado de salud. Muchos consumidores basan su alimentación en productos procesados, el aumento del contenido en oligosacáridos funcionales en alimentos de gran consumo pueden contribuir a alcanzar los niveles recomendados de carbohidratos no disponibles (Qiang et al, 2009. Carbohydr Pol, 77: 435-441).Currently functional oligosaccharides are considered important food ingredients to maintain and improve health status. Many consumers base their diet on processed products, increasing the content of functional oligosaccharides in high-consumption foods can contribute to reaching the recommended levels of carbohydrates not available (Qiang et al , 2009. Carbohydr Pol , 77: 435-441).

Un alimento puede considerarse funcional si se demuestra que ejerce un efecto beneficioso sobre una o más funciones selectivas del organismo, independientemente de sus propiedades nutritivas, de modo tal que resulte apropiado para mejorar el estado de salud y bienestar, reducir el riesgo de enfermedad, o ambas cosas.A food can be considered functional if proves that it has a beneficial effect on one or more functions selective organism, regardless of its properties nutritious, so that it is appropriate to improve the state health and wellness, reduce the risk of disease, or both stuff.

Numerosos estudios experimentales y epidemiológicos atribuyen a la fibra un papel preventivo de diversas enfermedades especialmente frecuentes en países desarrollados, debido a la gran variedad de efectos fisiológicos beneficiosos que presenta en el organismo humano (Cummings et al, 1997. Eur J Clin Nutr, 51: 417-423; Chandalia et al, 2000. The New England J Med, 342: 1392-1398; Jenkins et al, 2003. Am J Clin Nutr, 76: 266-273). Los oligosacáridos presentan unos efectos cercanos a los de la fibra soluble, ya que debido a su estructura química no pueden ser hidrolizados por los enzimas digestivos humanos y muestran algunos de los efectos propios de la fibra soluble.Numerous experimental and epidemiological studies attribute to the fiber a preventive role of various diseases especially frequent in developed countries, due to the great variety of beneficial physiological effects that it presents in the human organism (Cummings et al , 1997. Eur J Clin Nutr , 51: 417-423; Chandalia et al. , 2000. The New England J Med , 342: 1392-1398; Jenkins et al , 2003. Am J Clin Nutr , 76: 266-273). Oligosaccharides have effects close to those of soluble fiber, since due to their chemical structure they cannot be hydrolyzed by human digestive enzymes and show some of the effects of soluble fiber.

Son conocidos procedimientos de obtención de oligosacáridos prebióticos mediante un proceso enzimático a partir de maltosa catalizada por la \alpha-glucosidasa de Xanthophyllomyces dendrorhous (nº de publicación ES 2255847 A1) y la formación de fructooligosacáridos a 45ºC a partir de sacarosa catalizada por la fructofuranosidasa de Xanthophyllomyces dendrorhous (Nº de publicación ES 2265297 A1).Methods of obtaining prebiotic oligosaccharides by an enzymatic process from maltose catalyzed by Xanthophyllomyces dendrorhous α-glucosidase (publication No. ES 2255847 A1) and the formation of fructooligosaccharides at 45 ° C from sucrose catalyzed by fructofuranosidase are known Xanthophyllomyces dendrorhous (Publication No. ES 2265297 A1).

Debido a la gran importancia industrial de los oligosacáridos y su función prebiótica, es deseable proporcionar nuevos métodos para su obtención a partir de nuevas materias primas, especialmente si éstas son subproductos que se producen en grandes cantidades. Asimismo, es igualmente deseable optimizar los métodos de obtención de oligosacáridos con el objeto de aumentar el rendimiento obtenido, pudiendo de esta manera rentabilizar de forma clara dicho proceso.Due to the great industrial importance of oligosaccharides and their prebiotic function, it is desirable to provide new methods for obtaining from new raw materials, especially if these are by-products that are produced in large quantities. Likewise, it is equally desirable to optimize the methods for obtaining oligosaccharides in order to increase the performance obtained, thus being able to monetize in a way Clear said process.

Explanation of the invention.

La presente invención se refiere a un método de obtención de oligosacáridos a partir de cualquier parte de un vegetal. Preferiblemente los oligosacáridos se obtienen del okara, subproducto que queda tras la elaboración de la leche de soja o de la elaboración del tofu. Dicho método comprende la hidrólisis de la fibra soluble y/o insoluble, o de la fibra insoluble dispersada en un medio líquido mediante la adición de una mezcla enzimática que comprende al menos una glicosidasa. Dicha glicosidasa puede ser al menos una beta-glucanasa, al menos una xilanasa, al menos una celulasa, al menos una pentosanasa o al menos una arabinasa, o cualquiera de sus combinaciones. El método de la presente invención se ha optimizado para obtener mayores rendimientos y por ello además puede comprender una etapa de tratamiento en autoclave previa a la hidrólisis enzimática. Con la optimización de las condiciones del método se consigue reducir el tiempo de incubación para llevar a cabo la hidrólisis y obtener mayores rendimientos a esos tiempos más bajos.The present invention relates to a method of obtaining oligosaccharides from any part of a vegetable. Preferably the oligosaccharides are obtained from okara, by-product left after the processing of soy milk or Tofu making. Said method comprises the hydrolysis of the soluble and / or insoluble fiber, or insoluble fiber dispersed in a liquid medium by adding an enzymatic mixture that It comprises at least one glycosidase. Said glycosidase may be at at least one beta-glucanase, at least one xylanase, at least one cellulase, at least one pentosanase or at least one arabinase, or any combination thereof. The method of The present invention has been optimized to obtain greater yields and therefore can also comprise a stage of autoclave treatment prior to enzymatic hydrolysis. With the optimization of the conditions of the method is achieved to reduce the incubation time to carry out hydrolysis and obtain higher yields at those lower times.

En el caso de que se utilice una parte del vegetal que contenga más de un 5% de su peso seco de grasa, se desengrasará dicha muestra para evitar interferencias en las etapas posteriores de obtención de la fibra soluble y/o insoluble.In the event that a part of the vegetable that contains more than 5% of its dry fat weight, is degreasing said sample to avoid interference in the stages after obtaining the soluble and / or insoluble fiber.

El okara de soja es muy rico en fibra alimentaria, especialmente en polisacáridos insolubles en agua, tanto celulosa como hemicelulosas, particularmente del tipo xilano y xiloglucano. La hidrólisis de estos polisacáridos del okara con el objetivo de obtener oligosacáridos se puede llevar a cabo por métodos enzimáticos o por métodos químicos. El tratamiento enzimático empleado en la presente invención presenta ventajas frente al método químico, como por ejemplo:Soy okara is very rich in fiber food, especially in water insoluble polysaccharides, both cellulose and hemicelluloses, particularly of the xylan type and xyloglucan. The hydrolysis of these okara polysaccharides with the objective of obtaining oligosaccharides can be carried out by enzymatic methods or by chemical methods. The treatment Enzymatic used in the present invention has advantages against the chemical method, such as:

--: permite una hidrólisis específica y controlada, evitando así la generación de compuestos indeseables.allows specific hydrolysis and controlled, thus avoiding the generation of compounds undesirable

--: las condiciones en las que se desarrolla la reacción enzimática son menos agresivas que las utilizadas en el tratamiento químico (ataque por ácidos).the conditions under which the enzymatic reaction develops are less aggressive than those used in chemical treatment (attack by acids).

--: la hidrólisis enzimática de los polisacáridos del okara con glicosidasas produce oligosacáridos potencialmente prebióticos que pueden formar parte de un alimento como ingredientes funcionales.the Enzymatic hydrolysis of okara polysaccharides with glycosidases produces potentially prebiotic oligosaccharides that they can be part of a food as ingredients functional.

La obtención de polisacáridos del okara de soja revaloriza dicho subproducto y ayuda a eliminar un problema ambiental ya que este subproducto es altamente susceptible a la putrefacción.Obtaining soy okara polysaccharides revalue that byproduct and help eliminate a problem environmental since this by-product is highly susceptible to putrefaction.

Tal como se ha comentado en un párrafo anterior, en la presente invención se optimiza el método de obtención de oligosacáridos por medio de la adición de etapas como por ejemplo el tratamiento en autoclave de la fibra soluble y/o insoluble o de la fibra insoluble dispersada o de cualquiera de los tipos anteriores de fibra, desengrasada, o por medio del empleo de diferentes medios líquidos de dispersión de fibra insoluble. El resultado de dicha optimización es la reducción del tiempo empleado en la incubación necesaria para la hidrólisis enzimática de dicha fibra y además, la obtención de mayores rendimientos a dichos tiempos. Tal como puede observarse en la tabla 1 de los ejemplos de la presente invención, cuando se emplea agua destilada en lugar de tampón acetato pH 6 como medio líquido para la dispersión de 60 mg de fibra insoluble desengrasada por mL de medio líquido, se obtienen 11,51 g de oligosacáridos por 100 g de fibra insoluble desengrasada frente a los 8,2 g de oligosacáridos por 100 g de fibra insoluble desengrasada cuando se emplea tampón acetato pH 6, a pesar de mantener una incubación de 180 minutos frente a los 90 minutos cuando se emplea agua destilada. El rendimiento obtenido cuando se introduce una etapa de tratamiento en autoclave de la fibra insoluble desengrasada dispersada en agua destilada, con 10 minutos de incubación para llevar a cabo la hidrólisis, es de 25,3 g de oligosacáridos por 100 g de fibra insoluble desengrasada.As discussed in a previous paragraph, in the present invention the method of obtaining oligosaccharides by means of the addition of steps such as the autoclave treatment of soluble and / or insoluble fiber or of the insoluble fiber dispersed or of any of the above types fiber, degreased, or through the use of different media insoluble fiber dispersion liquids. The result of said optimization is the reduction of time spent in incubation necessary for the enzymatic hydrolysis of said fiber and also the obtaining higher yields at those times. As you can observed in table 1 of the examples of the present invention, when distilled water is used instead of acetate buffer pH 6 as liquid medium for the dispersion of 60 mg of insoluble fiber degreased per mL of liquid medium, 11.51 g of oligosaccharides per 100 g of insoluble fiber degreased against 8.2 g of oligosaccharides per 100 g of insoluble fiber degreased when acetate buffer pH 6 is used, despite maintain a 180 minute incubation versus 90 minutes when distilled water is used. The performance obtained when introduces a stage of autoclave treatment of the fiber insoluble degreased dispersed in distilled water, with 10 minutes incubation to carry out hydrolysis, is 25.3 g of oligosaccharides per 100 g of insoluble fiber degreased.

Así pues, un aspecto de la presente invención se refiere a un método para la obtención de oligosacáridos que comprende:Thus, one aspect of the present invention is refers to a method for obtaining oligosaccharides that understands:

a.to.: Obtener la fibra soluble y/o insoluble de un vegetal,Obtain the soluble and / or insoluble fiber of a vegetable,

b.b.: hidrolizar la fibra del apartado (a) mediante la adición de una mezcla enzimática que comprende al menos una glicosidasa,hydrolyze the fiber of section (a) by adding an enzymatic mixture comprising at least a glycosidase,

c.C.: incubar la mezcla obtenida en el apartado (b) a una temperatura de entre 20 y 50ºC, yincubate the mixture obtained in the section (b) at a temperature between 20 and 50 ° C, and

d.d.: aislar los oligosacáridos del producto obtenido en el apartado (c)isolate oligosaccharides from the product obtained in section (c)

En el apartado (a) del método se puede obtener la fibra soluble, la fibra insoluble o, la fibra soluble e insoluble (conjunta) de un vegetal. La obtención de la fibra soluble y/o insoluble de un vegetal se lleva a cabo por medio de cualquier técnica conocida en el estado de la técnica (ver el apartado de ejemplos para la obtención de la fibra insoluble). La fibra soluble y/o insoluble se obtiene de cualquier parte de un vegetal como por ejemplo, pero sin limitarse, de la parte aérea, de la parte radicular, de las semillas, o de cualquier subproducto de las mismas.In section (a) of the method you can obtain soluble fiber, insoluble fiber or, soluble and insoluble fiber (joint) of a vegetable. Obtaining soluble fiber and / or insoluble of a vegetable is carried out by means of any technique known in the state of the art (see the section on examples for obtaining insoluble fiber). Soluble fiber and / or insoluble is obtained from any part of a vegetable as per example, but not limited, of the aerial part, of the part root, of the seeds, or of any by-product of the same.

La fibra soluble y/o insoluble obtenida del vegetal puede someterse a un proceso de concentración mediante cualquier técnica conocida en el estado de la técnica como por ejemplo, pero sin limitarse, la liofilización. El producto de dicha concentración puede disolverse en el caso de la fibra soluble o dispersarse en el caso de la fibra insoluble, en un medio líquidoThe soluble and / or insoluble fiber obtained from Vegetable can undergo a concentration process by any technique known in the state of the art as per example, but not limited to lyophilization. The product of said concentration can be dissolved in the case of soluble fiber or dispersed in the case of insoluble fiber, in a medium liquid

Una realización preferida de la presente invención se refiere al método para la obtención de oligosacáridos que además comprende obtener la fibra insoluble del vegetal según el apartado (a) y dispersar dicha fibra en un medio líquido, y en el apartado (b) hidrolizar el producto de la dispersión obtenido. Posteriormente, se prosigue con el resto de apartados (c) y (d) del método para obtener dichos oligosacáridos.A preferred embodiment of the present invention refers to the method for obtaining oligosaccharides which also includes obtaining the insoluble fiber of the vegetable according to the section (a) and disperse said fiber in a liquid medium, and in the section (b) hydrolyze the product of the dispersion obtained. Subsequently, the rest of sections (c) and (d) of the method of obtaining said oligosaccharides.

El término "dispersar" tal como se entiende en la presente invención, se refiere a la acción de mezclar la fibra insoluble de dicho vegetal con un medio líquido para que se distribuya de forma sustancialmente homogénea en el mismo. Al contrario que en una disolución, en la dispersión, las partículas que forman parte de la fibra insoluble, no se disuelven en el medio líquido sino que permanecen incorporadas a dicho líquido en el mismo estado original. La dispersión de la fibra insoluble en el medio líquido permite la actividad de la mezcla enzimática del paso posterior.The term "disperse" as understood In the present invention, it refers to the action of mixing the fiber insoluble of said vegetable with a liquid medium so that it distribute substantially homogeneously in it. To the unlike in a solution, in the dispersion, the particles that are part of the insoluble fiber, do not dissolve in the middle liquid but remain incorporated into said liquid therein original state. The dispersion of insoluble fiber in the medium liquid allows the activity of the enzymatic mixture of the passage later.

Los oligosacáridos son constituyentes de los polisacáridos. Los polisacáridos están formados por monosacáridos unidos entre sí por medio de enlaces glicosídicos. En la presente invención, se obtienen carbohidratos más pequeños debido a la hidrólisis de los enlaces glicosídicos entre residuos, es decir oligosacáridos. Los oligosacáridos son polímeros también formados por monosacáridos unidos por enlaces glicosídicos, con un número de unidades monoméricas, por ejemplo, pero sin limitarse de entre 2 y 10 residuos de azúcar. La hidrólisis de los polisacáridos produce su digestión. En la digestión o ruptura por hidrólisis del enlace glicosídico se consume una molécula de agua. Así pues, a modo de ejemplo, la molécula de agua reacciona con un polisacárido AB, en el que A y B representan fragmentos del mismo. En la reacción, la molécula de agua se descompone en los fragmentos H+ y OH-, y el polisacárido AB se descompone en los oligosacáridos A+ y B-. A continuación, estos fragmentos se unen proporcionando los productos finales AOH y BH. La reacción es catalizada por al menos una enzima, produciendo la ruptura de dichos enlaces. Dicha digestión o hidrólisis está catalizada por enzimas hidrolasas, preferiblemente glicosilasas y más preferiblemente glicosidasas, que pueden ser específicas para determinados polisacáridos y, sobre todo, para determinados tipos de enlace glicosídico.Oligosaccharides are constituents of polysaccharides The polysaccharides are formed by monosaccharides linked together through glycosidic bonds. At the moment invention, smaller carbohydrates are obtained due to the hydrolysis of glycosidic bonds between residues, that is oligosaccharides Oligosaccharides are also formed polymers by monosaccharides linked by glycosidic bonds, with a number of monomer units, for example, but not limited to between 2 and 10 sugar residues Hydrolysis of polysaccharides produces their digestion. In digestion or rupture by hydrolysis of the bond Glycosidic consumes a molecule of water. So, by way of example, the water molecule reacts with an AB polysaccharide, in the that A and B represent fragments thereof. In the reaction, the Water molecule breaks down into the H + and OH- fragments, and the Polysaccharide AB decomposes into oligosaccharides A + and B-. TO then these fragments join providing the products AOH and BH finishes. The reaction is catalyzed by at least one enzyme, causing the breaking of said links. Such digestion or Hydrolysis is catalyzed by hydrolase enzymes, preferably glycosylases and more preferably glycosidases, which can be specific for certain polysaccharides and, above all, for certain types of glycosidic bond.

Las enzimas que catalizan la hidrólisis de los polisacáridos se adicionan a la fibra dispersada del apartado (paso) (a) en forma de una mezcla enzimática que comprende al menos una glicosidasa.Enzymes that catalyze the hydrolysis of polysaccharides are added to the dispersed fiber of the section (step) (a) in the form of an enzyme mixture comprising at least one glycosidase

Otra realización preferida de la presente invención se refiere a un método, donde la glicosidasa es al menos una beta-glucanasa y/o al menos una xilanasa. Según una realización más preferida, la glicosidasa es, además de una beta-glucanasa y/o una xilanasa, al menos una celulasa, al menos una pentosanasa, al menos una arabinasa o cualquiera de las combinaciones de la/s celulasa/s, la/s pentosanasa/s y la/s arabinasa/s con la/s beta-glucanasa/s y/o la/s xilanasa/s.Another preferred embodiment of the present invention refers to a method, where glycosidase is at least a beta-glucanase and / or at least one xylanase. According a more preferred embodiment, glycosidase is, in addition to a beta-glucanase and / or a xylanase, at least one cellulase, at least one pentosanase, at least one arabinase or any of the combinations of the cellulase / s, the / s pentosanase / s and arabinase / s with the / s beta-glucanase / s and / or xylanase / s.

Según el comité de nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB), las enzimas usadas en el método de la presente invención son clasificadas con la siguiente nomenclatura:According to the nomenclature committee of the Union International Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), the enzymes used in the method of Present invention are classified with the following nomenclature:

EC 3 Hidrosilasas; EC 3.2 Glicosilasas; EC 3.2.1 Glicosidasas; EC 3.2.1.4 celulasa; EC 3.2.1.6 \beta-1,3-1,4-glucanasa; EC 3.2.1.8 \beta-1,4-xilanasa; EC. 3.2.1.72 pentosanasa; EC 3.2.1.99 arabinanasa.EC 3 Hydrosylases; EC 3.2 Glycosylases; EC 3.2.1 Glycosidases; EC 3.2.1.4 cellulase; EC 3.2.1.6 β-1,3-1,4-glucanase; EC 3.2.1.8 β-1,4-xylanase; EC. 3.2.1.72 pentosanase; EC 3.2.1.99 arabinanase.

La enzima celulasa (EC 3.2.1.4) también es conocida con la denominación 4-(1,3;1,4)-\beta-D-glucan 4-glucanohidrolasa. Esta enzima cataliza la hidrólisis de la celulosa.The enzyme cellulase (EC 3.2.1.4) is also known by the denomination 4- (1,3; 1,4) -? -D-glucan 4-glucanhydrolase. This enzyme catalyzes the cellulose hydrolysis.

La enzima beta-glucanasa (EC 3.2.1.6) cuya denominación aceptada por la NC-IUBMB es endo-1,3(4)-\beta-glucanasa, es también conocida por otras denominaciones como por ejemplo endo-1,3-\beta-D-glucanasa; laminarinasa; laminaranasa; \beta-1,3-glucanasa; \beta-1,3-1,4-glucanasa; endo-1,3-\beta-glucanasa; endo-\beta-1,3(4)-glucanasa; endo-\beta-1,3-1,4-glucanasa; endo-\beta-(1,3)-D-glucanasa; endo-1,3-1,4-\beta-D-glucanasa; endo-\beta-(1-3)-D-glucanasa; endo-\beta-1,3-glucanasa IV; endo-1,3-\beta-D-glucanasa; 1,3-(1,3;1,4)-\beta-D-glucan 3(4)-glucanohidrolasa.The beta-glucanase enzyme (EC 3.2.1.6) whose denomination accepted by the NC-IUBMB is endo-1,3 (4) -? -glucanase, It is also known by other denominations such as endo-1,3-? -D-glucanase; laminarinase; laminaranase; β-1,3-glucanase; β-1,3-1,4-glucanase; endo-1,3-? -glucanase; endo-?-1,3 (4) -glucanase; endo-? -1,3-1,4-glucanase; endo-? - (1,3) -D-glucanase; endo-1,3-1,4-? -D-glucanase; endo-? - (1-3) -D-glucanase; endo-?-1,3-glucanase IV; endo-1,3-? -D-glucanase; 1,3- (1,3; 1,4) -? -D-glucan 3 (4) -glucanhydrolase.

La beta-glucanasa cataliza la reacción de hidrólisis de enlaces (1,3) ó (1-4) en \beta-D-glucanos.Beta glucanase catalyzes the link hydrolysis reaction (1,3) or (1-4) in β-D-glucans.

La enzima xilanasa (EC 3.2.1.8) cuya denominación aceptada por la NC-IUBMB es endo-1,4-\beta-xilanasa, es también conocida por otras denominaciones como por ejemplo endo-(1,4)-\beta-xilan 4-xilanohidrolasa; endo-1,4-xilanasa; xilanasa; \beta-1,4-xilanasa; endo-1,4-xilanasa; endo-\beta-1,4-xilanasa; endo-1,4-\beta-D-xilanasa; 1,4-\beta-xilan xilanohidrolasa; \beta-xilanasa; \beta-1,4-xilan xilanohidrolasa; endo-1,4-\beta-xilanasa; \beta-D-xilanasa. La enzima xilanasa cataliza la reacción de hidrólisis de enlaces (1,4)-\beta-D-xilosídico en xilanos. El xilano es un polisacárido constituido por una cadena lineal de residuos de xilosa y diversas ramificaciones y sustituciones. El xilano es el componente mayoritario de la hemicelulosa. Esta enzima es una hemicelulasa. Las hemicelulosas comprenden polímeros de pentosas, xilosas, arabinosas, hexosas, glucosas, mañosas, galactosas o ácidos urónico, glucurónico o galacturónico.The enzyme xylanase (EC 3.2.1.8) whose denomination accepted by the NC-IUBMB is endo-1,4-β-xylanase, It is also known by other denominations such as endo- (1,4) -? -xilan 4-xylanhydrolase; endo-1,4-xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-?-1,4-xylanase; endo-1,4-? -D-xylanase; 1,4-? -Xylan xylanhydrolase; β-xylanase; β-1,4-xylan xylanhydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-D-xylanase. Enzyme xylanase catalyzes the bond hydrolysis reaction (1,4) -? -D-xyloid in xylanes. Xylan is a polysaccharide consisting of a chain linear waste of xylose and various branches and substitutions Xylan is the major component of the hemicellulose This enzyme is a hemicellulase. Hemicelluloses they comprise polymers of pentoses, xyloses, arabinoses, hexoses, glucoses, mannose, galactose or uronic, glucuronic or galacturonic

La enzima arabinasa (EC 3.2.1.99) cuya denominación aceptada por la NC-IUBMB es arabinan endo-1,5-\alpha-L-arabinosidasa, es también conocida por otras denominaciones como por ejemplo endo-1,5-\alpha-L-arabinanasa; endo-\alpha-1,5-arabanasa; endo-arabanasa; 1,5-\alpha-L-arabinan 1,5-\alpha-L-arabinanohidrolasa. La enzima arabinasa cataliza la reacción de hidrólisis de enlaces (1,5)-\alpha-arabinofuranosídicos.The enzyme arabinase (EC 3.2.1.99) whose denomination accepted by the NC-IUBMB is arabinan endo-1,5-? -L-arabinosidase, It is also known by other denominations such as endo-1,5-? -L-arabinanase; endo-?-1,5-arabanase; endo-arabanase; 1,5-? -L-arabinan 1,5-? -L-arabinanohydrolase. The enzyme arabinase catalyzes the linkage hydrolysis reaction (1,5) -? -Arabinofuranosides.

La enzima pentosanasa (EC. 3.2.1.72) cuya denominación aceptada por la NC-IUBMB es xilan 1,3-\beta-xilosidasa, es también conocida por otras denominaciones como por ejemplo 1,3-\beta-D-xilosidasa, exo-1,3-\beta-xilosidasa; \beta-1,3'-xilanasa; exo-\beta-1,3'-xilanasa; 1,3-\beta-D-xilan xilohidrolasa. La pentosanasa de la presente invención es una hemicelulasa, que cataliza la hidrólisis del pentosano. El pentosano es un polímero de pentosas (azúcares con 5 átomos de carbono, como por ejemplo, pero sin limitarse xilosa o arabinosa). El pentosano es una hemicelulosa.The enzyme pentosanase (EC. 3.2.1.72) whose denomination accepted by the NC-IUBMB is xilan 1,3-? -Xylosidase, is also known by other denominations such as 1,3-? -D-xylosidase, exo-1,3- β-xylosidase; β-1,3'-xylanase; exo-?-1,3'-xylanase; 1,3-? -D-xilan xylohydrolase The pentosanase of the present invention is a hemicellulase, which catalyzes the hydrolysis of pentosan. Pentosan it is a polymer of pentoses (sugars with 5 carbon atoms, such as for example, but not limited to xylose or arabinose). The pentosan is a hemicellulose.

Así pues, la adición de una mezcla enzimática que comprende al menos una beta-glucanasa y al menos una xilanasa, a la fibra soluble y/o insoluble o a la fibra insoluble dispersada, supone la hidrólisis de celulosa y hemicelulosa.Thus, the addition of an enzymatic mixture comprising at least one beta-glucanase and at least a xylanase, to the soluble and / or insoluble fiber or to the fiber insoluble dispersed, involves cellulose hydrolysis and hemicellulose

Además, la adición de al menos una pentosanasa y/o al menos una arabinasa supone la hidrólisis de oligosacáridos más específicos de hemicelulosa hidrolizados por las xilanasas.In addition, the addition of at least one pentosanase and / or at least one arabinase involves the hydrolysis of oligosaccharides more specific hemicellulose hydrolyzed by xylanases.

La hidrólisis del método de la presente invención se puede llevar a cabo por medio de mezclas enzimáticas comerciales procedentes de bacterias, hongos o de cualquier otra procedencia. La mezcla enzimática comercial puede ser, pero sin limitarse, Ultraflo L de Novozymes, una mezcla de \beta-glucanasas, xilanasas, celulasas, pentosanasas y arabinasas. El Ultraflo L es una preparación enzimática multiactiva producida por el hongo no patógeno y no tóxico Humicola insolens.The hydrolysis of the method of the present invention can be carried out by means of commercial enzymatic mixtures from bacteria, fungi or any other source. The commercial enzyme mixture may be, but is not limited to, Ultraflo L of Novozymes , a mixture of β-glucanases, xylanases, cellulases, pentosanases and arabinases. Ultraflo L is a multiactive enzyme preparation produced by the non-pathogenic and non-toxic Humicola insolens fungus.

En el apartado (c) del método, se incuba la mezcla obtenida en el apartado (b) a una temperatura de entre 20 y 50ºC. Dicha temperatura comprende las temperaturas óptimas de las enzimas glicosidasas. Una realización preferida de la presente invención se refiere a un método donde la incubación del apartado (c) se lleva a cabo a una temperatura de entre 35 y 45ºC. No obstante, en cualquiera de los métodos de la presente invención puede emplearse al menos una enzima glicosidasa termófila cuya temperatura óptima para catalizar la hidrólisis de los enlaces glicosídicos supera los 60ºC.In section (c) of the method, the mixture obtained in section (b) at a temperature between 20 and 50 ° C Said temperature comprises the optimum temperatures of the glycosidases enzymes. A preferred embodiment of the present invention refers to a method where incubation of the section (c) is carried out at a temperature between 35 and 45 ° C. Do not However, in any of the methods of the present invention at least one thermophilic glycosidase enzyme whose optimum temperature to catalyze the hydrolysis of the bonds glycosides over 60 ° C.

Según el apartado (d) del método, se aíslan los oligosacáridos del producto obtenido en el apartado (c) mediante cualquier técnica conocida en el estado de la técnica. Los oligosacáridos de la presente invención son prebióticos. Así pues, los oligosacáridos obtenidos con el método de la presente invención se pueden usar para la elaboración de un alimento prebiótico. Los alimentos prebióticos son alimentos funcionales que afectan beneficiosamente al organismo mediante la estimulación del crecimiento y/o actividad de una o varias cepas de bacterias en el colon, mejorando la salud del individuo que los ingiere.According to section (d) of the method, the oligosaccharides of the product obtained in section (c) by any technique known in the state of the art. The oligosaccharides of the present invention are prebiotics. So that, oligosaccharides obtained with the method of the present invention They can be used for the preparation of a prebiotic food. The Prebiotic foods are functional foods that affect beneficially to the organism by stimulating the growth and / or activity of one or several strains of bacteria in the colon, improving the health of the individual who ingests them.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere al método, donde la fibra soluble y/o insoluble o a la fibra insoluble dispersada, procede de un vegetal de la familia Fabaceae. Según una realización más preferida el vegetal de la familia Fabaceae es Glycine max L (soja). Según otra realización aún más preferida, los oligosacáridos se obtienen del okara de Glycine max L.Another preferred embodiment of the present invention relates to the method, wherein the soluble and / or insoluble fiber or the dispersed insoluble fiber, comes from a vegetable of the Fabaceae family. According to a more preferred embodiment, the vegetable of the Fabaceae family is Glycine max L (soy). According to another even more preferred embodiment, the oligosaccharides are obtained from the Glycine max L. okara.

Otra realización preferida se refiere al método donde la fibra soluble y/o insoluble o a la fibra insoluble dispersada, está desengrasada. En los casos en los que el porcentaje de grasa del vegetal supera el 5% de su peso seco, se hace necesario desengrasar previamente la muestra para obtener su fibra soluble y/o insoluble, permitiendo así una hidrólisis eficaz mediante la mezcla de enzimas utilizadas.Another preferred embodiment refers to the method where the soluble and / or insoluble fiber or to the insoluble fiber scattered, it is degreased. In cases where the percentage of vegetable fat exceeds 5% of its dry weight, it becomes necessary Degrease the sample beforehand to obtain its soluble fiber and / or insoluble, thus allowing effective hydrolysis by mixing of enzymes used.

Según otra realización preferida, el medio líquido en el que se dispersa la fibra insoluble es tampón acetato a un pH de entre 3,5 y 6,5. En una realización más preferida, el tampón acetato tiene un pH de entre 5,5 y 6,5. El tampón acetato también puede tener un pH de entre 4,5 y 6,5.According to another preferred embodiment, the medium liquid in which the insoluble fiber is dispersed is acetate buffer at a pH between 3.5 and 6.5. In a more preferred embodiment, the Acetate buffer has a pH between 5.5 and 6.5. Acetate buffer It can also have a pH between 4.5 and 6.5.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere al método donde el medio líquido en el que se dispersa la fibra insoluble es agua destilada.Another preferred embodiment of the present invention refers to the method where the liquid medium in which it is dispersed insoluble fiber is distilled water.

Según otra realización preferida de la presente invención, el método además comprende el tratamiento en autoclave de la fibra soluble y/o insoluble o, de la fibra insoluble dispersada en el medio líquido y, en el apartado (b), hidrolizar el producto obtenido de dicho tratamiento en autoclave y seguir con los apartados (c) y (d) del método.According to another preferred embodiment of the present invention, the method further comprises the autoclave treatment of soluble and / or insoluble fiber or, of dispersed insoluble fiber in the liquid medium and, in section (b), hydrolyze the product obtained from said autoclave treatment and continue with the Sections (c) and (d) of the method.

El término "tratamiento en autoclave" tal como se entiende en la presente invención se refiere a someter a la fibra dispersada en el medio líquido a vapor de agua a una temperatura y presión altas para de esta forma facilitar la hidrólisis que será llevada a cabo por medio de la adición de la mezcla enzimática. La presión alta evita que el agua llegue a ebullición. El tratamiento se lleva a cabo en un autoclave, en una olla a presión o en cualquier recipiente capaz de soportar las presiones y temperaturas alcanzadas. En el proceso citado se permite la entrada o generación de vapor de agua pero se limita su salida, hasta obtener una presión interna, por ejemplo, pero sin limitarse, de 90 a 200 kPa, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura aproximada de 120 a 135ºC. En condiciones de alta presión hidrostática se pueden alcanzar hasta 900 MPa.The term "autoclave treatment" such as understood in the present invention it refers to subjecting the fiber dispersed in the liquid medium to water vapor at a high temperature and pressure to facilitate the hydrolysis that will be carried out by adding the enzymatic mixture High pressure prevents water from reaching boiling. The treatment is carried out in an autoclave, in a pressure cooker or in any container capable of withstanding pressures and temperatures reached. In the aforementioned process it is allowed the entry or generation of water vapor but its output is limited, until an internal pressure is obtained, for example, but not limited to, 90 to 200 kPa, which causes the steam to reach a approximate temperature of 120 to 135ºC. In high conditions Hydrostatic pressure can be reached up to 900 MPa.

Según una realización más preferida del método, el tratamiento en autoclave se lleva a cabo a una temperatura de entre 115 y 125ºC, una presión de entre 90 y 110 Kpa, y un tiempo de entre 5 y 30 minutos.According to a more preferred embodiment of the method, autoclave treatment is carried out at a temperature of between 115 and 125ºC, a pressure between 90 and 110 Kpa, and a time of between 5 and 30 minutes.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere al método, donde además comprende la inactivación de las enzimas de la mezcla incubada según el apartado (c) y, en el apartado (d), aislar los oligosacáridos del producto obtenido de dicha inactivación. Es decir, en esta realización preferida se incluye un apartado adicional entre los apartados (c) y (d) del método que comprende dicha inactivación enzimática. La inactivación enzimática se puede llevar a cabo por medio de cualquiera de las técnicas conocidas en el estado de la técnica como por ejemplo, pero sin limitarse, sumergiendo un recipiente que contenga el producto obtenido en el apartado (c) en agua a una temperatura mayor de 95ºC o exponiéndolo a vapor de agua, durante un tiempo en el que se asegure dicha inactivación como por ejemplo, pero sin limitarse, durante un tiempo mínimo de 5 minutos, durante un tiempo mínimo de 10 minutos ó durante un tiempo mínimo de 15 minutos.Another preferred embodiment of the present invention refers to the method, where it further comprises the inactivation of the enzymes of the incubated mixture according to section (c) and, in section (d), isolate the oligosaccharides from the product obtained from said inactivation. That is, in this embodiment an additional section is included between sections (c) and (d) of the method comprising said enzymatic inactivation. The Enzymatic inactivation can be carried out by means of any of the techniques known in the state of the art as for example, but not limited to, dipping a container that contain the product obtained in section (c) in water at a temperature greater than 95 ° C or by exposing it to water vapor, during a time in which said inactivation is ensured, for example, but not limited, for a minimum time of 5 minutes, during a minimum time of 10 minutes or for a minimum time of 15 minutes

Según otra realización preferida de la presente invención, la fibra insoluble o la fibra insoluble desengrasada se dispersa hasta 100 mg de dicha fibra por cada mL de medio líquido. Preferiblemente la fibra insoluble o la fibra insoluble desengrasada se dispersa hasta 90, 70 ó 60 mg de dicha fibra por cada mL de medio líquido. Una realización más preferida se refiere al método, donde se dispersa hasta 50 mg de fibra insoluble por cada mL de medio líquido.According to another preferred embodiment of the present invention, insoluble fiber or degreased insoluble fiber is disperses up to 100 mg of said fiber per mL of liquid medium. Preferably insoluble fiber or degreased insoluble fiber up to 90, 70 or 60 mg of said fiber is dispersed per mL of medium liquid. A more preferred embodiment refers to the method, where up to 50 mg of insoluble fiber is dispersed per mL of medium liquid.

Preferiblemente se dispersa hasta 40, 30, 20 ó 10 mg de fibra insoluble por cada mL de medio líquido.Preferably it is dispersed up to 40, 30, 20 or 10 mg of insoluble fiber per mL of liquid medium.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para el experto en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants not they intend to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For the person skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be partly detached of the description and in part of the practice of the invention. The following figures and examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.

Examples

Los siguientes ejemplos ilustran la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen la obtención de oligosacáridos proocedentes del okara de soja. Los ejemplos tienen carácter ilustrativo y no limitativo de un método de obtención de oligosacáridos de origen vegetal.The following examples illustrate the invention by means of tests carried out by the inventors that describe the Obtaining oligosaccharides from soybean okara. The examples are illustrative and not limiting of a method of Obtaining oligosaccharides of plant origin.

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Ejemplo 1Example one

Obtaining insoluble fiber from soy okara ( Glycine max L.) and enzymatic hydrolysis 1.1 Obtaining insoluble fiber

Se seleccionaron muestras de okara, subproducto industrial de la soja (Glycine max L). El okara en fresco se sometió a liofilización, es decir, se eliminó el agua mediante desecación al vacío y a muy bajas temperaturas. De esta manera el agua se extrae por sublimación.Samples of okara, industrial by-product of soybeans ( Glycine max L) were selected. The fresh okara was subjected to lyophilization, that is, the water was removed by drying under vacuum and at very low temperatures. In this way the water is extracted by sublimation.

La muestra liofilizada supone un método de conservación, pero además facilita el manejo a la hora de realizar los distintos análisis. Posteriormente, se pulverizó la muestra para obtener un polvo fino y homogéneo (tamaño de partícula < 1 mm), que se guardó en frascos de vidrio debidamente etiquetados y cerrados herméticamente. Estos frascos se almacenaron a temperatura ambiente y en ausencia de luz.The lyophilized sample is a method of conservation, but also facilitates handling when performing The different analyzes. Subsequently, the sample was sprayed to obtain a fine and homogeneous powder (particle size <1 mm), which was stored in properly labeled glass jars and hermetically sealed These bottles were stored at temperature ambient and in the absence of light.

Posteriormente la muestra de okara liofilizada se sometió a un proceso de desengrasado con éter etílico en un extractor Soxhlet.Subsequently the lyophilized okara sample underwent a degreasing process with ethyl ether in a Soxhlet extractor.

Una vez desengrasada la muestra, se procedió a obtener la fibra insoluble del okara de soja. Se llevó a cabo según el método de Prosky (Prosky et al. 1988. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 71: 1017-1023): Se trata de un método enzimático- gravimétrico para la determinación de fibra alimentaria que se basa principalmente en la digestión de la muestra con \alpha-amilasa termoestable, proteasa y amiloglucosidasa para eliminar la proteína y el almidón de la muestra. Este método ha sido adoptado oficialmente por la AOAC (Association of Official Analytical Chemists) (AOAC, 1995a; AOAC, 1995b).Once the sample was degreased, the insoluble fiber of soybean okara was obtained. It was carried out according to the method of Prosky (Prosky et al . 1988. J. Assoc. Off. Anal. Chem ., 71: 1017-1023): It is an enzymatic-gravimetric method for the determination of food fiber that is relies primarily on the digestion of the sample with thermostable α-amylase, protease and amyloglucosidase to remove protein and starch from the sample. This method has been officially adopted by the AOAC ( Association of Official Analytical Chemists ) (AOAC, 1995a; AOAC, 1995b).

Una vez fue obtenida la fibra insoluble, se pulverizó y se homogenizó (tamaño de partícula < 1 mm).Once the insoluble fiber was obtained, it pulverized and homogenized (particle size <1 mm).

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1.2. Enzymatic hydrolysis of insoluble fiber degreased

La fibra insoluble de la muestra de okara desengrasada se expuso a la acción de las enzimas hidrolíticas.The insoluble fiber of the okara sample Degreased was exposed to the action of hydrolytic enzymes.

Se añadió un volumen determinado de un medio líquido a una cantidad determinada de fibra insoluble desengrasada (ver más adelante), para conseguir dispersar dicha fibra insoluble. Los medios líquidos utilizados para la dispersión fueron tampón acetato a pH 6 ó agua destilada. Para favorecer el ataque enzimático se trató la muestra térmicamente en autoclave a 121ºC y 1 atmósfera (100 Kpa) de presión. Posteriormente se añadió un volumen determinado de Ultraflo L y se mantuvo en agitación constante a 40ºC. Transcurrida la hidrólisis enzimática, las enzimas se inactivaron llevando la muestra a ebullición durante 10 minutos.A certain volume of medium was added liquid at a certain amount of degreased insoluble fiber (see below), to disperse said insoluble fiber. The liquid media used for the dispersion were buffer acetate at pH 6 or distilled water. To favor the enzymatic attack The sample was heat treated in an autoclave at 121 ° C and 1 atmosphere (100 Kpa) pressure. Subsequently a volume was added determined from Ultraflo L and kept under constant agitation at 40 ° C After enzymatic hydrolysis, the enzymes are inactivated by bringing the sample to a boil for 10 minutes.

A continuación, el extracto soluble se separó del residuo insoluble por centrifugación (8000 rpm durante 10 minutos). El residuo fue sometido a varios lavados con etanol del 85% (v/v) y el líquido resultante de estos lavados se unió al extracto soluble y se evaporó a sequedad en rotavapor a 50ºC.Then the soluble extract was separated. of the insoluble residue by centrifugation (8000 rpm for 10 minutes) The residue was subjected to several washes with ethanol of the 85% (v / v) and the liquid resulting from these washes joined the soluble extract and evaporated to dryness on a rotary evaporator at 50 ° C.

Para que la muestra pudiera ser analizada por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), el extracto obtenido se redisolvió en agua destilada y se pasó por un filtro de 0.45 \mum para soluciones acuosas. El volumen utilizado en la redisolución con agua destilada depende de la cantidad de muestra de partida y de la concentración en oligosacáridos que se obtenga.So that the sample could be analyzed by High efficiency liquid chromatography (HPLC), the extract obtained it was redissolved in distilled water and passed through a 0.45 filter um for aqueous solutions. The volume used in the redisolution with distilled water depends on the sample amount of heading and the concentration of oligosaccharides obtained.

Las condiciones cromatográficas utilizadas fueron las siguientes:The chromatographic conditions used They were the following:

--: Fase móvil: agua milliQPhase mobile: milliQ water

--: Flujo: 0,5 mL/minFlow: 0.5 mL / min

--: Temperatura de la columna: 85ºCColumn temperature: 85ºC

--: Columna: HPX87P BioRadColumn: HPX87P BioRad

--: Detector: Índice de Refracción.Detector: Refractive Index.

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A continuación se muestra un esquema que resume el método mediante el cual se obtienen los oligosacáridos de la fibra insoluble del okara de soja.Below is an outline that summarizes the method by which oligosaccharides of the insoluble fiber of soy okara.

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1one

22

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Ejemplo 2Example 2

Performance in obtaining oligosaccharides using buffer acetate pH 6 as liquid dispersion medium 2.1 Experiment 1

Se partió de 0,6 g de fibra insoluble (FI) de okara desengrasado y se añadieron 10 mL de tampón acetato a pH 6. La reacción enzimática se llevó a cabo con 1 mL de Ultraflo L durante 180 minutos a una temperatura de 40ºC y en agitación constante. Transcurrido este tiempo, se inactivo el enzima llevando la muestra a ebullición durante 10 minutos. Tras la extracción de los oligosacáridos, se analizó el sobrenadante por HPLC. En estas condiciones, por cada 100 g de FI de okara desengrasado se obtienen 8,2 g de oligosacáridos.It was split from 0.6 g of insoluble fiber (FI) of okara degreased and 10 mL of acetate buffer was added at pH 6. The Enzymatic reaction was carried out with 1 mL of Ultraflo L during 180 minutes at a temperature of 40 ° C and constant stirring. After this time, the enzyme was inactivated carrying the sample boiling for 10 minutes. After the extraction of the oligosaccharides, the supernatant was analyzed by HPLC. In these conditions, for every 100 g of degreased okara FI are obtained 8.2 g of oligosaccharides.

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

2.2. Experiment 2

Se realizó un experimento enzimático para estudiar la concentración de oligosacáridos liberados en las mismas condiciones que en el experimento 1, pero durante un menor tiempo de actuación del enzima.An enzymatic experiment was performed to study the concentration of oligosaccharides released in them conditions than in experiment 1, but for a shorter time than enzyme performance.

Para ello, se utilizaron 0,6 g de FI de okara desengrasado, 1 mL de Ultraflo L/10 mL de tampón acetato pH6. La temperatura incubación fue de 40ºC y el tiempo de hidrólisis enzimática 60 minutos. El sobrenadante se analizó por HPLC y se observó una liberación de oligosacáridos de 4,46 g/100 g de FI de okara desengrasado. Por tanto, se produjo una liberación del 54,4% en un tiempo tres veces inferior de hidrólisis enzimática.For this, 0.6 g of okara FI was used degreased, 1 mL of Ultraflo L / 10 mL of acetate buffer pH6. The incubation temperature was 40 ° C and hydrolysis time Enzymatic 60 minutes. The supernatant was analyzed by HPLC and was observed an oligosaccharide release of 4.46 g / 100 g of FI from okara degreased. Therefore, there was a 54.4% release in a time three times lower than enzymatic hydrolysis.

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

Ejemplo 3Example 3

Performance in obtaining oligosaccharides using water distilled as a liquid dispersion medium 3.1. Experiment 1

Se añadieron 10 mL de agua destilada, en lugar del tampón acetato, a 0,6 g de FI de okara desengrasado. Posteriormente se adicionó 1 mL de Ultraflo L y se llevó a cabo la reacción durante 90 minutos a una temperatura de 40ºC y en agitación constante. Tras la inactivación del enzima, se analizó el sobrenadante por HPLC y se observó una liberación de oligosacáridos de 11,51 g/100 g de FI de okara desengrasado.10 mL of distilled water was added, instead of the acetate buffer, 0.6 g of degreased okara IF. Subsequently 1 mL of Ultraflo L was added and the reaction for 90 minutes at a temperature of 40 ° C and stirring constant. After enzyme inactivation, the supernatant by HPLC and oligosaccharide release was observed 11.51 g / 100 g of degreased okara FI.

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

3.2. Experiment 2

Se adicionaron 10 mL de agua destilada a 0,1 g de FI de okara desengrasado. A continuación, la dispersión de FI en agua destilada se trató en el autoclave a 121ºC durante un tiempo de 10 minutos. Después del enfriamiento del sustrato, se añadió 1 mL de Ultraflo L y se llevó a un baño de 40ºC en agitación continua. Transcurridos 10 minutos, se inactivo el enzima (10 minutos en ebullición). Tras la extracción, se procedió a la cuantificación de los oligosacáridos por HPLC, obteniendo 25,3 g/100 g FI de okara desengrasado.10 mL of distilled water was added to 0.1 g of degreased okara FI. Then the FI dispersion in distilled water was treated in the autoclave at 121 ° C for a time of 10 minutes. After substrate cooling, 1 mL of Ultraflo L and was taken to a 40 ° C bath under continuous agitation. After 10 minutes, the enzyme was inactivated (10 minutes in boiling). After extraction, the quantification of oligosaccharides by HPLC, obtaining 25.3 g / 100 g FI of okara degreased

En la siguiente tabla se presentan los resultados obtenidos en cada uno de los experimentos descritos en párrafos anteriores.The following table shows the results obtained in each of the experiments described in previous paragraphs.

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

TABLE 1 Resumen de los resultados obtenidos en cada uno de los experimentosSummary of the results obtained in each of the experiments

33

       \begin{minipage}[t]{150mm} Nota: En todos
los casos, se usa 1 mL de la mezcla enzimática Ultraflo L, se lleva
a cabo la incubación a 40ºC y se inactivan las enzimas añadidas
llevando dicha mezcla de reacción a ebullición durante 10 minutos.
\end{minipage}\ begin {minipage} [t] {150mm} Note: In all
the cases, 1 mL of the Ultraflo L enzyme mixture is used, it is carried
incubation is carried out at 40 ° C and the added enzymes are inactivated
bringing said reaction mixture to a boil for 10 minutes.
\ end {minipage}

       \newpage\ newpage

Como puede observarse, la utilización de agua destilada como medio líquido de dispersión en el cual se va a llevar a cabo la hidrólisis tras la adición de la mezcla enzimática, mejora los rendimientos en la obtención de oligosacáridos respecto del medio líquido tampón acetato.As can be seen, the use of water distilled as a liquid dispersion medium in which it is to be carried carried out hydrolysis after the addition of the enzyme mixture, improves yields in obtaining oligosaccharides with respect to liquid medium acetate buffer.

En vista de estos resultados, los inventores llevaron a cabo un experimento con agua como medio líquido de dispersión y trataron en autoclave el producto de dicha dispersión, obteniendo de esta manera el mejor rendimiento en la obtención de oligosacáridos de okara de soja. El tratamiento en autoclave permite mejorar el rendimiento de forma sorprendente ya que hay que tener en cuenta que se parte de una dispersión con una concentración de fibra de 10 mg/mL frente a los 60 mg/mL en el resto de experimentos y, además, la hidrólisis se lleva a cabo durante un periodo de 10 minutos frente a tiempos de entre 6 y 18 veces superiores en el resto de experimentos. En definitiva, se obtiene mayor cantidad de oligosacáridos y se reduce el tiempo empleado. Este hecho puede constituir una ventaja importante en lo que se refiere a la producción industrial de oligosacáridos de muestras vegetales.In view of these results, the inventors they conducted an experiment with water as a liquid medium of dispersion and autoclaved the product of said dispersion, obtaining in this way the best performance in obtaining soy okara oligosaccharides. The autoclave treatment allows improve performance surprisingly since you have to have in account that starts from a dispersion with a fiber concentration of 10 mg / mL versus 60 mg / mL in the rest of the experiments and, in addition, hydrolysis is carried out over a period of 10 minutes versus times between 6 and 18 times higher in the Other experiments In short, you get more oligosaccharides and the time taken is reduced. This fact may constitute an important advantage as regards the Industrial production of oligosaccharides from plant samples.

Claims

1. Method for obtaining oligosaccharides which includes:

a.to.: obtener la fibra soluble y/o insoluble de un vegetal,get soluble and / or insoluble fiber of a vegetable,

d.d.: aislar los oligosacáridos del producto obtenido en el apartado (c).isolate oligosaccharides from the product obtained in section (c).

2. Method for obtaining oligosaccharides according to claim 1, further comprising obtaining the fiber insoluble vegetable according to section (a) and disperse said fiber in a liquid medium, and in the section (b) hydrolyze the product of The dispersion obtained.

3. Method according to any of the claims 1 or 2, wherein the enzymatic mixture comprises the least one glycosidase that is selected from at least one beta-glucanase or at least one xylanase or any combination thereof.

4. Method according to claim 3, wherein the Enzymatic mixture further comprises at least one glycosidase selected from at least one cellulase or at least one pentosanase or at least one arabinase or any combination thereof.

5. Method according to any one of claims 1 to 4, wherein the fiber is derived from a vegetable of the Fabaceae family.

6. Method according to claim 5, wherein the vegetable of the Fabaceae family is Glycine max L.

7. Method according to claim 6, wherein the oligosaccharides are obtained from Glycine max L. okara.

8. Method according to any of the claims 1 to 7, wherein the fiber is degreased.

9. Method according to any of the claims 2 to 8, wherein the liquid medium in which it is dispersed The insoluble fiber is acetate buffer at a pH between 3.5 and 6.5.

10. Method according to claim 9, wherein the Acetate buffer has a pH between 5.5 and 6.5.

11. Method according to any of the claims 2 to 8, wherein the liquid medium in which it is dispersed Insoluble fiber is distilled water.

12. Method according to any of the claims 1 to 11, wherein the incubation of section (c) is carried out at a temperature between 35 and 45 ° C.

13. Method according to any of the claims 1 to 12, further comprising the treatment in autoclave of the soluble and / or insoluble fiber or, of the insoluble fiber dispersed in the liquid medium and, in section (b), hydrolyze the product obtained from said autoclave treatment.

14. Method according to claim 13, wherein the autoclave treatment is carried out at a temperature between 115 and 125 ° C, a pressure between 90 and 110 Kpa, and a time between 5 and 30 minutes.

15. Method according to any of the claims 1 to 14, further comprising the inactivation of the enzymes of the incubated mixture according to section (c) and, in the section (d), isolate the oligosaccharides from the product obtained from said inactivation.

16. Method according to any of the claims 2 to 15, wherein up to 100 mg of fiber is dispersed insoluble for each mL of reaction medium.

17. Method for obtaining oligosaccharides according to claim 16, wherein up to 50 mg of fiber is dispersed insoluble for each mL of reaction medium.