ES2355455A1 - Method of obtaining haploid embryos and double-haploides encine plants. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding) - Google Patents
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Abstract
Description
Método de obtención de embriones haploides y plantas doble-haploides de encina.Method of obtaining haploid embryos and double-haploid oak plants.
La presente invención se basa en una aplicación de la biotecnología vegetal a la mejora genética de la encina (Quercus ilex L.), dirigida a la obtención de embriones haploides y plantas doble-haploides homocigóticas puras (líneas puras) de encina mediante embriogénesis gamética.The present invention is based on an application of plant biotechnology to the genetic improvement of the oak ( Quercus ilex L.), aimed at obtaining haploid embryos and pure homozygous double-haploid plants (pure lines) of oak by gamtic embryogenesis.
Las especies forestales como la encina (Q. ilex L.) están sometidas a largos ciclos reproductivos que impiden la obtención de líneas puras mediante métodos convencionales, tales como retrocruzamientos.Forest species such as oak ( Q. ilex L.) are subject to long reproductive cycles that prevent obtaining pure lines by conventional methods, such as backcrossing.
Este hecho dificulta aún más la mejora genética clásica, ya de por sí lenta, puesto que se necesitan varios años para que las plantas alcancen la madurez sexual.This fact makes genetic improvement even more difficult. classic, already slow, since it takes several years so that the plants reach sexual maturity.
Por este motivo se ha buscado una alternativa válida para obtener líneas puras en una sola generación gracias a la producción de embriones haploides y plantas doble-haploides de encina, mediante embriogénesis gamética, que es el objeto de la presente invención.For this reason an alternative has been sought valid to obtain pure lines in a single generation thanks to the production of haploid embryos and plants double-haploid of oak, by embryogenesis gamética, which is the object of the present invention.
En el estado de la técnica no existen evidencias de la obtención de individuos haploides y doble-haploides de encina, ni mediante técnicas de reproducción convencionales, como el retrocruzamiento, ni mediante la aplicación de técnicas novedosas de biotecnología.In the state of the art there is no evidence of obtaining haploid individuals and double-haploid oak, or by techniques of conventional reproduction, such as backcrossing, or through the application of novel biotechnology techniques.
En la patente española ES2180385 se describe un método para la obtención de embriones y plantas haploides de alcornoque, mediante técnicas biotecnológicas de inducción de embriogénesis gamética a partir de células gaméticas de alcornoque. La diferencia entre dicha patente y la presente invención, radica en que, aunque la encina y el alcornoque son especies procedentes de la misma familia, para que la embriogénesis gamética pueda producirse en la encina, se ha descubierto sorprendentemente que es necesario someter a las células gaméticas de la encina (microsporas), a un doble pretratamiento de estrés que actúa como señal o estímulo para desencadenar el programa del desarrollo esporofítico en dichas microsporas, o lo que es lo mismo, desencadena el proceso de inducción de embriogénesis gamética en las mismas.A Spanish patent ES2180385 describes a method for obtaining embryos and haploid plants of cork oak, through biotechnological techniques of induction of Gamtic embryogenesis from gamine cork oak cells. The difference between said patent and the present invention lies in that, although the oak and cork oak are species from the same family, so that gamine embryogenesis can occur in the oak, it has been surprisingly discovered that it is necessary subject the gamine cells of the oak (microspores) to a double stress pretreatment that acts as a signal or stimulus to trigger the sporophytic development program in those microspores, or what is the same, triggers the process of induction of gothic embryogenesis in them.
Es conocido en el estado de la técnica que para inducir embriogénesis gamética en las especies forestales en general y como queda detallado particularmente en la patente española mencionada anteriormente, ES218035, se suelen utilizar pretratamientos que se dan in vivo o in vitro tanto a botones florales enteros como a las propias anteras o a las microsporas y pueden ser tratamientos físicos, fisiológicos y químicos en forma de choque térmico (de frío o de calor), ayuno (ausencia de azúcar o de nitrógeno en el medio) o tratamientos químicos en la escisión de espigas, anteras o microsporas. Una de las diferencias esenciales del método descrito en la invención reside en el doble pretratamiento, in vivo e in vitro, que es necesario llevar a cabo para que tenga lugar la embriogénesis de las células gaméticas de la encina y así obtener embriones haploides de encina. Por un lado, se realiza un tratamiento in vivo con frío, en los amentos recogidos del propio árbol de la encina y por otro lado, se realiza un tratamiento in vitro de choque térmico con calor, en las anteras extraídas de los amentos previamente sometidos a estrés, para inducir la embriogénesis gamética y obtener embriones haploides y plantas doble-haploides de encina. Otra diferencia esencial entre la patente española ES218035 y la presente invención radica en que en la patente española se describe un método para la obtención de embriones y plantas haploides, en cambio en la presente invención se describe un método novedoso para la obtención de embriones haploides y plantas doble-haploides, líneas puras, en una sola generación, que no se habían conseguido obtener hasta el momento, ni mediante métodos convencionales de retrocruzamiento, ni mediante la aplicación de novedosos métodos biotecnológicos. La obtención de líneas puras de encina mediante el método descrito en la presente invención, consigue que se disminuya el tiempo y los costes en el desarrollo de nuevos clones, además de proporcionar individuos con material genético "fijado". Con este término se hace referencia a que en las especies agrícolas en general, se pueden obtener líneas puras mediante autofecundación forzada y continuada durante 7 o más años. Durante dicho proceso de autofecundación forzada, la segregación producida a través de los sucesivos cruzamientos y selección de individuos, hace que la forma homocigótica para la combinación génica deseada no se "fije" o no se consiga en su totalidad. Sin embargo, mediante el método descrito en la presente invención, al obtenerse el embrión haploide directamente y de una sola vez, su duplicación hace que la homocigosis obtenida esté plenamente "fijada genéticamente".It is known in the state of the art that in order to induce gamnetic embryogenesis in forest species in general and as it is detailed in particular in the Spanish patent mentioned above, ES218035, pretreatments that are given in vivo or in vitro to both whole flower buds are usually used as to the anthers themselves or to the microspores and they can be physical, physiological and chemical treatments in the form of thermal shock (cold or heat), fasting (absence of sugar or nitrogen in the middle) or chemical treatments in the spreading of spikes , anthers or microspores. One of the essential differences of the method described in the invention resides in the double pretreatment, in vivo and in vitro , which is necessary to carry out so that embryogenesis of the gamine cells of the oak takes place and thus obtain haploid embryos of oak. On the one hand, an in vivo cold treatment is carried out, on the catkins collected from the oak tree itself and on the other hand, an in vitro heat shock treatment with heat is performed, on the anthers extracted from the catkins previously subjected to stress, to induce gamnetic embryogenesis and obtain haploid embryos and double-haploid oak plants. Another essential difference between the Spanish patent ES218035 and the present invention is that in the Spanish patent a method for obtaining haploid embryos and plants is described, instead a new method for obtaining haploid embryos is described in the present invention. double-haploid plants, pure lines, in a single generation, which had not been obtained so far, either by conventional backcrossing methods, or by the application of novel biotechnological methods. Obtaining pure oak lines by the method described in the present invention, reduces the time and costs in the development of new clones, in addition to providing individuals with "fixed" genetic material. This term refers to the fact that in agricultural species in general, pure lines can be obtained through forced self-fertilization and continued for 7 or more years. During this process of forced self-fertilization, the segregation produced through the successive crossings and selection of individuals means that the homozygous form for the desired gene combination is not "fixed" or not achieved in its entirety. However, by the method described in the present invention, by obtaining the haploid embryo directly and at one time, its duplication causes the homozygosis obtained to be fully "genetically fixed".
Además, la obtención de individuos haploides y doble-haploides de encina, mediante el método descrito en la presente invención, es ventajoso para la mejora genética de la especie, ya que la obtención de individuos homocigóticos facilitará la identificación de genes y proteínas y su estudio para conseguir individuos mejores genéticamente y mejor adaptados a las condiciones específicas del medio en el cual crezcan. Por otro lado, los individuos haploides y doble-haploides permiten realizar eficazmente estudios de mapeo genético en menor tiempo, centrándose en los caracteres de interés en cada estudio realizado. Los individuos haploides son también esenciales en la manipulación genética que se lleve a cabo en esta especie (transformación y estudios transgénicos).In addition, obtaining haploid individuals and oak double-haploids, by the method described in the present invention, it is advantageous for improvement genetics of the species, since obtaining individuals homozygous will facilitate the identification of genes and proteins and their study to get better genetically and better individuals adapted to the specific conditions of the environment in which grow up On the other hand, haploid individuals and double-haploids allow to perform effectively genetic mapping studies in less time, focusing on characters of interest in each study. Individuals haploids are also essential in genetic manipulation that carry out in this species (transformation and studies transgenic).
La encina es una de las especies más importantes del ecosistema forestal, la dehesa, del sur europeo. Es necesaria por tanto su conservación tanto desde el punto de vista medioambiental como para la economía rural. El pastoreo excesivo y el problema de la "seca" (infección debida a determinados hongos que ataca a los árboles produciéndoles la muerte) imposibilitan el relevo generacional en las dehesas. Las dehesas, como es conocido, son zonas preferentes de pastoreo del ganado porcino y los productos porcinos son altamente reconocidos a nivel mundial. La falta de regeneración de las dehesas y el problema de la "seca" pone en riesgo su futuro. En este sentido, la obtención de plantas doble-haploides mediante el método descrito en la presente invención, puede utilizarse en repoblación forestal e intentar paliarlos problemas mencionados.The oak is one of the most important species of the forest ecosystem, the pasture, of southern Europe. It is necessary therefore its conservation both from the point of view environmental as for the rural economy. Overgrazing and the problem of "dry" (infection due to certain fungi that attacks trees causing death) prevent generational relief in the meadows. The pastures, as is known, they are preferred grazing areas of cattle swine and pig products are highly recognized at the level world. The lack of regeneration of the pastures and the problem of "seca" puts your future at risk. In this sense, obtaining of double-haploid plants by the method described in the present invention, can be used in restocking forestry and try to alleviate the aforementioned problems.
La presente invención describe un método de
obtención de embriones haploides de encina (Quercus ilex L.)
a partir de células gaméticas (microsporas), mediante embriogénesis
gamética y que posteriormente son utilizados para la obtención de
plantas doble-haploides homocigóticas puras (líneas
puras), aplicables a la mejora genética de la
encina.The present invention describes a method of obtaining haploid oak embryos ( Quercus ilex L.) from gamnetic cells (microspores), by means of gammatic embryogenesis and which are subsequently used to obtain pure homozygous double-haploid plants (pure lines) , applicable to the genetic improvement of
Holm oak.
El método consiste en la inducción de la embriogénesis gamética en las microsporas de la encina mediante un doble tratamiento de estrés, inducido mediante choque térmico. En primer lugar, los amentos recogidos directamente de las encinas son sometidos a un primer tratamiento de estrés in vivo en frío, y en segundo lugar, las anteras extraídas de los amentos antes mencionados, son sometidas a otro tratamiento de estrés in vitro, mediante choque térmico por calor. Ambos pretratamientos inducen el proceso de embriogénesis de las células gaméticas, microsporas, que se encuentran en el interior de dichas anteras y la obtención de embriones haploides. Los embriones haploides obtenidos pueden diploidizarse dando lugar a embriones doble-haploides a los que se les somete posteriormente a un proceso de maduración, germinación y crecimiento, dando lugar a plantas doble-haploides, líneas puras, de encina. Estas plantas de encina, doble-haploides, son homocigóticas (líneas puras) y pueden utilizarse para la mejora genética de dicha especie.The method consists of the induction of the gamético embryogenesis in the microspores of the oak by means of a double treatment of stress, induced by thermal shock. First, the catkins collected directly from the oaks are subjected to a first cold in vivo stress treatment, and secondly, the anthers extracted from the aforementioned catkins are subjected to another in vitro stress treatment, by shock heat thermal Both pretreatments induce the process of embryogenesis of the gamnetic cells, microspores, which are found inside these anthers and obtaining haploid embryos. The haploid embryos obtained can be diploidized resulting in double-haploid embryos that are subsequently subjected to a maturation, germination and growth process, giving rise to double-haploid plants, pure lines, of oak. These holm oak plants, double-haploid, are homozygous (pure lines) and can be used for the genetic improvement of this species.
A efectos de la presente invención se hacen constar los siguientes términos:For the purposes of the present invention are made include the following terms:
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- Embriogénesis gamética: proceso mediante el cual las células gaméticas, en la presente invención, microsporas, como resultado de un tratamiento de estrés, cambian su programa de desarrollo gametofítico por un programa esporofítico, dando lugar a la formación de embriones haploides que posteriormente se pueden diploidizar, y obtener-plantas doble-haploides.Gamy Embryogenesis: Process whereby the gamnetic cells, in the present invention, microspores, as a result of a stress treatment, change their gametophytic development program by a sporophytic program, leading to the formation of haploid embryos that later can be diploidized, and get-plants double-haploid.
- \bullet?
- Haploides: Individuos con un complemento cromosómico.Haploides: Individuals with a chromosomal complement.
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- Doble-haploides: Individuos con el mismo complemento cromosómico duplicado, por tanto los genes están en homocigosis y son líneas puras.Double-haploid: Individuals with the same duplicated chromosomal complement, therefore the genes are in homozygosis and are pure lines.
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- Diploides: Individuos con doble complemento cromosómico diferente uno del otro. Los genes pueden estar en heterocigosis y homocigosis).Diploides: Individuals with double chromosomal complement different from each other. Genes can be in heterozygosis and homozygosis).
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- Amento: inflorescencia, preferentemente en forma de espiga colgante, formada por flores unisexuales. En su interior se localizan las anteras.Catkin: inflorescence, preferably in the form of a hanging spike, formed by flowers unisexual Inside are the anthers.
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- Antera: parte del estambre de las flores dónde se almacenan las células gaméticas o microsporas.Anther: part of the stamen of the flowers where the gamnetic cells are stored or microspores
La invención describe un método para la
obtención de embriones haploides y plantas
doble-haploides de encina a partir de células
gaméticas (microsporas), que son sometidas a un doble tratamiento de
estrés, que induce la embriogénesis de dichas células gaméticas,
obteniéndose los embriones haploides y posteriormente mediante
diploidización de los mismos, las plantas
doble-haploides homocigóticas puras (líneas puras).
Las plantas doble-haploides de encina obtenidas
mediante el método descrito en la presente invención son aplicables
a la mejora genética de la
encina.The invention describes a method for obtaining haploid embryos and double-haploid oak plants from gamnetic cells (microspores), which are subjected to a double stress treatment, which induces embryogenesis of said gamnetic cells, obtaining haploid embryos. and subsequently by diploidizing them, the pure homozygous double-haploid plants (pure lines). The double-haploid oak plants obtained by the method described in the present invention are applicable to the genetic improvement of the
Holm oak.
Para la obtención de los embriones haploides y las plantas doble-haploides de encina, se parte de la recogida de pequeñas ramas con amentos del propio árbol de encina seleccionado. Esta recogida se realiza preferentemente durante 15 días en los meses de floración de la encina, que dependerán de la zona geográfica en la que se cultiven las mismas. En la encina, la ventana de inducción de embriogénesis es muy estrecha, puesto que las microsporas deben estar en el estado uninucleado tardío o polen bicelular temprano, para que estas microsporas abandonen su programa de desarrollo gametofítico redireccionando su desarrollo hacia una ruta esporofítica que conlleva la formación de embriones haploides que darán lugar posteriormente a plantas haploides, y este proceso solo se produce durante un tiempo determinado. Como se ha comentado anteriormente, la ventana de la inducción de embriogénesis es muy estrecha, puesto que las microsporas deben estar en el estado uninucleado tardío o polen bicelular temprano, para que estas microsporas abandonen su programa de desarrollo gametofítico redireccionando su desarrollo hacia una ruta esporofítica que conlleva a la formación de embriones haploides que darán lugar posteriormente a plantas doble-haploides, y este proceso solo se produce durante un tiempo determinado, que como hemos mencionado anteriormente, en la encina tiene como fecha tope el periodo de floración de la misma.To obtain haploid embryos and double-haploid oak plants, it starts from the collection of small branches with catkins from the oak tree itself selected. This collection is preferably carried out for 15 days in the months of flowering of the oak, which will depend on the geographical area where they are grown. In the oak, the Embryogenesis induction window is very narrow, since the microspores must be in the late uninucleated state or pollen early two-cell, so that these microspores leave their program of gametophytic development redirecting its development towards a sporophytic pathway that involves the formation of haploid embryos which will subsequently lead to haploid plants, and this process It only occurs for a certain time. As commented previously, the window of the induction of embryogenesis is very narrow, since microspores must be in the state a late uninucleate or early bicellular pollen, so that you are microspores abandon their gametophytic development program redirecting its development towards a sporophytic path that leads to the formation of haploid embryos that will result subsequently to double-haploid plants, and this process only occurs for a certain time, which as We have mentioned above, in the oak it has a deadline the flowering period of it.
Los amentos recogidos directamente de los árboles de encina, se someten a un primer pretratamiento de estrés in vivo en frío, a una temperatura preferentemente de 4 \pm 2ºC durante 7 \pm 2 días. Posteriormente y de manera aséptica, se extraen de los amentos pretratados, las anteras para ser sometidas a otro pretratamiento de estrés in vitro en placas Petri, por choque térmico con calor, a una temperatura preferentemente de 33 \pm 2ºC durante 7 \pm 2 días en oscuridad y en un medio de cultivo específico que se denomina medio de inducción. Transcurrido dicho tiempo, los cultivos in vitro de las anteras son mantenidos en una cámara de cultivo a una temperatura preferentemente de 25ºC en oscuridad. Los primeros embriones haploides de encina aparecen aproximadamente entre 1 y 3 meses, tiempo específico de la encina.Catkins collected directly from oak trees are subjected to a first pretreatment of stress in vivo in cold, at a temperature preferably of 4 ± 2 ° C for 7 ± 2 days. Subsequently and aseptically, the anthers are extracted from the pretreated catkins, the anthers to be subjected to another in vitro stress pretreatment in Petri dishes, by heat shock with heat, at a temperature preferably of 33 ± 2 ° C for 7 ± 2 days in darkness and in a specific culture medium that is called induction medium. After this time, the in vitro cultures of the anthers are kept in a culture chamber at a temperature preferably of 25 ° C in the dark. The first haploid oak embryos appear approximately between 1 and 3 months, specific time of the oak.
Los medios de cultivo utilizados en la presente invención, tanto para favorecer la inducción, proliferación, maduración y germinación, ya sea tanto de los embriones haploides, como de los embriones doble-haploides, hasta obtener la planta doble-haploide, están formados por un medio de cultivo basal llamado SM al que se le adicionan determinados componentes específicos para favorecer cada uno de los procesos específicos que se describen en la presente invención, hasta obtener la planta de encina doble-haploide.The culture media used herein invention, both to favor induction, proliferation, maturation and germination, either of haploid embryos, as of double-haploid embryos, until obtaining the double-haploid plant, are formed by a basal culture medium called SM to which they are added certain specific components to favor each of the specific processes described in the present invention, until the oak plant is obtained double-haploid.
El medio de cultivo basal, al que hemos llamado SM, está compuesto por:The basal culture medium, which we have called SM, is composed of:
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- Solución de macronutrientes: KCl, Cl_{2}Ca.2H_{2}O, SO_{4}(NH_{4})_{2}, NO_{3}K ó NO_{3}Na, SO_{4}Mg.7H_{2}O, y PO_{4}H_{2}Na.H_{2}O o PO_{4}HNa_{2}.Macronutrient solution: KCl, Cl 2 Ca.2H 2 O, SO 4 (NH 4) 2, NO 3 K or NO 3 Na, SO 4 Mg.7H 2 O, and PO 4 H 2 Na.H 2 O or PO 4 HNa 2.
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- Solución de micronutrientes: solución de MURASHIGE y SKOOG (1962), además se añade hierro quelado en forma de Fe-EDTA, adicionando SO_{4}Fe.7H_{2}O y Na_{2}EDTA (etilendiamino tetraacetato de sodio).Micronutrient Solution: MURASHIGE and SKOOG solution (1962), in addition chelated iron is added in the form of Fe-EDTA, adding SO 4 Fe.7H 2 O and Na 2 EDTA (ethylenediamine tetraacetate of sodium).
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- Cofactores: Piridoxina, Inositol, Tiamina, Ácido ascórbico, Ácido nicotínico y Glicina.Co-factors: Pyridoxine, Inositol, Thiamine, Ascorbic acid, Nicotinic acid and Glycine
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El pH del medio de cultivo se ajusta entre 5,5 y 5,7.The pH of the culture medium is adjusted between 5.5 and 5.7.
El medio de inducción mencionado anteriormente está compuesto por medio de cultivo basal SM además de 90 mM de sacarosa y 1% de carbón activo. La presencia de carbón activo en este medio de inducción es requerida ya que, en los cultivos in vitro, la oxidación fenólica que se produce puede ocasionar serios problemas en el establecimiento y supervivencia de los explantes. Cuando los tejidos son dañados, éstos liberan compuestos fenólicos que se manifiestan con un ennegrecimiento del medio de cultivo alrededor del explante y que se puede extender a todo el medio, provocar daños que impidan el crecimiento y hasta la muerte del explante. Para contrarrestar el efecto de la oxidación fenólica, se agregan antioxidantes al medio de cultivo (en la presente invención se utiliza carbón activo), que son inhibidores de las enzimas específicas que participan en esos procesos de oxidación. El carbón activo también es utilizado como adsorbente de compuestos tóxicos de la microatmósfera gaseosa que se produce en las cámaras de cultivo y de los reguladores de crecimiento en exceso que están presentes en dichos medios de cultivo.The induction medium mentioned above is composed of SM basal culture in addition to 90 mM sucrose and 1% active carbon. The presence of active carbon in this induction medium is required since, in in vitro cultures, the phenolic oxidation that occurs can cause serious problems in the establishment and survival of the explants. When the tissues are damaged, they release phenolic compounds that manifest themselves with a blackening of the culture medium around the explant and that can spread to the entire medium, causing damage that prevents growth and even the death of the explant. To counteract the effect of phenolic oxidation, antioxidants are added to the culture medium (active carbon is used in the present invention), which are inhibitors of the specific enzymes that participate in these oxidation processes. Activated carbon is also used as an adsorbent for toxic compounds of the gaseous microatmosphere that is produced in the culture chambers and the excess growth regulators that are present in said culture media.
En este sentido, durante el proceso de extracción de las anteras de los amentos de la encina, aunque se realiza manualmente y con sumo cuidado, siempre provoca algún daño que hace liberar compuestos fenólicos. El carbón activo absorbe todo lo deletéreo y presente en exceso en los cultivos in vitro de embriones de encina y además facilita la inducción de los mismos, sin la presencia de dicho carbón activo en el medio la inducción, dicho proceso no se produciría.In this sense, during the process of extracting the anthers from the catkins of the oak, although it is done manually and with great care, it always causes some damage that releases phenolic compounds. The active carbon absorbs all the deleterious and excessively present in in vitro cultures of oak embryos and also facilitates the induction thereof, without the presence of said active carbon in the medium induction, said process would not occur.
Los embriones haploides de encina obtenidos mediante el método descrito son transferidos a un medio de cultivo específico llamado medio de proliferación, que como su nombre indica favorece la proliferación y el crecimiento de dichos embriones. Estos embriones haploides son cultivados en una cámara en oscuridad y a una temperatura preferentemente de 25ºC. El medio de proliferación está formado por el medio de cultivo basal SM + 500 mg/L de glutamina + 90 mM de sacarosa. La glutamina es un aminoácido utilizado para la proliferación de embriones en cultivo in vitro obtenidos mediante embriogénesis gamética, que favorece la proliferación de dichos embriones.The haploid oak embryos obtained by the described method are transferred to a specific culture medium called proliferation medium, which, as the name implies, favors the proliferation and growth of said embryos. These haploid embryos are grown in a dark chamber and preferably at a temperature of 25 ° C. The proliferation medium is formed by the basal culture medium SM + 500 mg / L glutamine + 90 mM sucrose. Glutamine is an amino acid used for the proliferation of embryos in in vitro culture obtained through gamine embryogenesis, which favors the proliferation of these embryos.
Para la obtención de embriones doble-haploides a partir de los embriones haploides se utilizan agentes antimitóticos como por ejemplo la Orizalina o el Amiprofos-metil. La aplicación in vitro de agentes antimitóticos hace que se interrumpa la mitosis durante el ciclo celular mediante la inhibición de la formación de microtúbulos, duplicándose así el número de cromosomas y obteniéndose embriones doble-haploides.To obtain double-haploid embryos from haploid embryos, antimitotic agents such as Orizaline or Amiprofos-methyl are used. The in vitro application of antimitotic agents causes mitosis to be interrupted during the cell cycle by inhibiting microtubule formation, thus doubling the number of chromosomes and obtaining double-haploid embryos.
Posteriormente los embriones doble-haploides obtenidos son transferidos a un medio de cultivo específico llamado medio de maduración, que como su nombre indica favorece la maduración de dichos embriones doble-haploides. Para obtener dichos embriones maduros se mantienen en cultivo en dicho medio de maduración durante un tiempo aproximado de un mes y a una temperatura preferentemente de 25ºC y en oscuridad. El medio de maduración, que es igual que el medio de inducción mencionado anteriormente, está formado por el medio de cultivo basal SM + 90 mM de sacarosa + 1% carbón activo. La presencia de carbón activo en este medio tiene la misma función que en el medio de inducción, adsorbe todo lo sobrante, y presente en exceso en el medio de cultivo y además favorece la maduración del embrión. La incorporación de carbón activo al medio de cultivo, además de producir un aumento de la calidad de los embriones maduros (mayor tamaño y peso), también permite un control eficaz sobre la embriogénesis secundaria, necesaria para que la maduración de los embriones se realice correctamente.Subsequently the embryos obtained double-haploids are transferred to a specific culture medium called ripening medium, which as its name indicates favors the maturation of these embryos double-haploid. To get these embryos mature are kept in culture in said ripening medium during an approximate time of one month and at a temperature preferably of 25ºC and in darkness. The ripening medium, which is the same as the induction medium mentioned above, is formed by the basal culture medium SM + 90 mM sucrose + 1% active carbon. The presence of active carbon in this medium has the same function as in the medium of induction, it adsorbs all that is left over, and present in excess in the culture medium and also favors the ripening of the embryo. The incorporation of active carbon into the culture medium, in addition to producing an increase in the quality of mature embryos (larger size and weight), also allows effective control over the secondary embryogenesis, necessary for the maturation of embryos succeed.
Una vez conseguidos los embriones doble-haploides maduros, se mantienen en cultivo en medio de maduración durante un mínimo de dos meses a una temperatura preferentemente de 4 \pm 2ºC, para romper lo que se conoce en el estado de la técnica como periodo de latencia o letargo. En general, la mayoría de las semillas y más si son forestales, tienen un periodo de letargo o latencia hasta que se produce la germinación. Dicho periodo de letargo, generalmente en su medio natural, se suele romper con frío. Los embriones doble-haploides de encina actúan como "semillas" ya que forman raíz, tallo y posteriormente una planta, (aunque su origen biotecnológico es distinto que el de la semilla), de ahí que para que se produzca la germinación de dichos embriones doble-haploides, sea necesario romper dicho letargo o latencia.Once the embryos are obtained mature double-haploids, are kept in culture in ripening medium for a minimum of two months at a temperature preferably 4 ± 2 ° C, to break what is known in the state of the art as latency or lethargy period. In general, most of the seeds and more if they are forest, they have a lethargy or dormancy period until germination occurs. Said period of lethargy, usually in its natural environment, is usually break with cold The double-haploid embryos of oak act as "seeds" since they form root, stem and later a plant, (although its biotechnological origin is different from that of the seed), hence for the production of germination of said double-haploid embryos, either It is necessary to break this lethargy or latency.
Posteriormente, los embriones doble-haploides son transferidos a un medio de germinación, que favorece, como su nombre indica, la germinación de dichos embriones gracias a la presencia en el mismo de hormonas específicas para la inducción del crecimiento del tallo y la formación de la planta doble-haploide de encina. Estas hormonas son la 6-Bencilaminopurina (BAP) y el ácido 3-Indol-butírico (IBA). Para favorecer también dicha germinación, los embriones son cultivados preferentemente a una temperatura de 25ºC en presencia de luz (fotoperiodo de 16 h luz/8 h oscuridad). El medio de germinación está formado por medio de cultivo basal SM+ 30 mM de sacarosa + 0.05 mg/L de BAP + 0.1 mg/L de IBA. Las plantas germinadas son aclimatadas en invernaderos.Subsequently, the embryos double-haploids are transferred to a medium of germination, which favors, as the name implies, the germination of said embryos thanks to the presence of hormones in it specific for stem growth induction and formation of the double-haploid oak plant. These hormones are 6-Benzylaminopurine (BAP) and the 3-Indole-butyric acid (IBA). For also favor germination, embryos are cultivated preferably at a temperature of 25 ° C in the presence of light (photoperiod of 16 h light / 8 h dark). The germination medium It is formed by basal culture SM + 30 mM sucrose + 0.05 mg / L of BAP + 0.1 mg / L of IBA. Sprouted plants are acclimatized in greenhouses.
Mediante el método descrito en la presente invención, las plantas de encina obtenidas no son nuevas variedades vegetales.By the method described herein invention, the oak plants obtained are not new varieties vegetables.
Así, el primer objeto de la presente invención es un método para la obtención de embriones haploides y/o plantas doble-haploides de encina que comprende:Thus, the first object of the present invention It is a method for obtaining haploid embryos and / or plants oak double-haploids comprising:
a) Recogida de amentos de encina durante el periodo de floración del árbol.a) Collection of oak catkins during the flowering period of the tree.
b) Tratamiento in vivo en frío de los amentos recogidos.b) Cold in vivo treatment of the collected catkins.
c) Extracción aséptica de las anteras del interior de los amentos previamente tratados en el paso anterior.c) Aseptic extraction of the anthers of the inside of the catkins previously treated in the step previous.
d) Tratamiento in vitro mediante cultivo en un medio de inducción de las anteras del paso anterior mediante choque térmico.d) In vitro treatment by culture in an induction medium of the anthers of the previous step by thermal shock.
e) Mantener en cultivo las anteras del paso anterior hasta la aparición de los embriones haploides.e) Keep in cultivation the anthers of the passage anterior until the appearance of haploid embryos.
f) Transferir los embriones haploides obtenidos en el paso anterior a un medio de proliferación, y que además comprende los pasos de:f) Transfer the haploid embryos obtained in the previous step to a proliferation medium, and that in addition Understand the steps of:
g) Obtener embriones dobles-haploide mediante la aplicación in vitro de agentes antimitóticos.g) Obtain double-haploid embryos by in vitro application of antimitotic agents.
h) Transferir los embriones doble-haploides obtenidos en el paso anterior a un medio de maduraciónh) Transfer embryos double-haploids obtained in the previous step to a ripening medium
i) Someter al frío a los cultivos de embriones doble-haploides maduros obtenidos en el paso anterior.i) Subject embryo cultures to cold mature double-haploids obtained in the step previous.
j) Transferir los embriones doble-haploides del paso anterior a un medio de germinación para obtener plantas doble-haploides.j) Transfer the embryos double-haploids from the previous step to a medium of germination to obtain plants double-haploid.
k) Transferir las plantas doble-haploides obtenidas en el paso anterior a recipientes adecuados para su crecimiento y aclimatación en invernadero.k) Transfer the plants double-haploids obtained in the previous step to suitable containers for growth and acclimatization in greenhouse.
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En una realización preferida el método de la invención se caracteriza porque el tratamiento in vivo en frío de los amentos se realiza a una temperatura, preferentemente de 4 \pm 2ºC y durante un tiempo, preferentemente de 7 \pm 2 días.In a preferred embodiment the method of the invention is characterized in that cold in vivo treatment of the catkins is carried out at a temperature, preferably 4 ± 2 ° C and for a time, preferably 7 ± 2 days.
En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque las células gaméticas presentes en el interior de las anteras, extraídas de los amentos recogidos del árbol de encina, se encuentran en estadio uninucleado tardío o polen bicelular temprano.In another preferred embodiment the method of invention is characterized in that the gamma cells present in the interior of the anthers, extracted from the catkins collected from the holm tree, are in late uninucleated stage or pollen early two-cell.
En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque el choque térmico in vitro de las anteras se realiza a una temperatura, preferentemente de 33 \pm 2ºC durante un tiempo, preferentemente de 7 \pm 2 días y preferentemente, en condiciones de oscuridad.In another preferred embodiment the method of the invention is characterized in that the in vitro thermal shock of the anthers is carried out at a temperature, preferably 33 ± 2 ° C for a time, preferably 7 ± 2 days and preferably, in dark conditions .
En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque el cultivo en un medio de inducción de las anteras, hasta la aparición de embriones haploides, se realiza a una temperatura, preferentemente de 25ºC y durante un tiempo, preferentemente de 1 a 3 meses y preferentemente, en condiciones de oscuridad.In another preferred embodiment the method of invention is characterized in that the culture in an induction medium of the anthers, until the appearance of haploid embryos, is performed at a temperature, preferably 25 ° C and during a time, preferably 1 to 3 months and preferably, in dark conditions.
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En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque los embriones haploides obtenidos se cultivan en un medio de proliferación a una temperatura, preferentemente de 25ºC y preferentemente, en condiciones de oscuridad.In another preferred embodiment the method of invention is characterized in that the haploid embryos obtained are grown in a proliferation medium at a temperature, preferably at 25 ° C and preferably, under conditions of darkness.
En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque los embriones doble- haploides se cultivan en medio de maduración durante un tiempo, preferentemente de 1 mes a una temperatura, preferentemente de 25ºC y preferentemente, en condiciones de oscuridad.In another preferred embodiment the method of invention is characterized in that double-haploid embryos are grown in ripening medium for a while, preferably 1 month at a temperature, preferably 25 ° C and preferably, in dark conditions.
En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque la temperatura de frío a la que son sometidos los embriones doble-haploides es preferentemente de 2-5ºC y durante un tiempo de al menos 2 meses.In another preferred embodiment the method of invention is characterized in that the cold temperature at which they are submitted double-haploid embryos is preferably from 2-5ºC and for a time of at minus 2 months
En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque el cultivo de los embriones doble-haploides en medio de germinación se realiza a una temperatura, preferentemente de 25ºC y preferentemente en condiciones de luminosidad.In another preferred embodiment the method of invention is characterized because embryo culture double-haploids in germination medium is performed at a temperature, preferably 25 ° C and preferably at light conditions.
En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque el medio de inducción está formado preferentemente por un medio de cultivo basal SM, carbón activo y una fuente de carbono.In another preferred embodiment the method of invention is characterized in that the induction medium is formed preferably by a basal culture medium SM, activated carbon and A source of carbon.
En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque el medio de proliferación está formado preferentemente por un medio de cultivo basal SM, glutamina y una fuente de carbono.In another preferred embodiment the method of invention is characterized in that the proliferation medium is preferably formed by a basal culture medium SM, glutamine and a source of carbon.
En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque el medio de maduración está formado preferentemente por un medio de cultivo basal SM, carbón activo y una fuente de carbono.In another preferred embodiment the method of invention is characterized in that the ripening medium is formed preferably by a basal culture medium SM, activated carbon and A source of carbon.
En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque el medio de germinación está formado preferentemente por un medio de cultivo basal SM, hormonas de crecimiento y una fuente de carbono.In another preferred embodiment the method of invention is characterized in that the germination medium is formed preferably by a basal culture medium SM, hormones of Growth and a source of carbon.
El medio de cultivo basal SM, mencionado anteriormente, está formado por una solución de macronutrientes, una solución de micronutrientes, hierro quelado y cofactores, ajustándose el valor de pH preferentemente entre 5.5-5.7. La solución de macronutrientes utilizada preferentemente comprende: KCl a una concentración preferentemente de entre 0,30 a 0,95 g/L, Cl_{2}Ca.2H_{2}O a una concentración preferentemente de entre 0,12 a 0,15 g/L, SO_{4}(NH_{4})_{2} a una concentración preferentemente de entre 0,13 a 0,20 g/L, NO_{3}K ó NO_{3}Na a una concentración preferentemente de entre 0,75 a 1,00 g/L, SO_{4}Mg.7H_{2}O a una concentración preferentemente de entre 0,20 a 0,31 g/L, PO_{4}H_{2}Na.H_{2}O a una concentración preferentemente de entre 0,09 a 0,15 g/L y PO_{4}HNa_{2} a una concentración preferentemente de 0,03 g/L. La solución de micronutrientes utilizada preferentemente comprende: BO_{3}H_{3} a una concentración preferentemente de 6,200 mg/L, SO_{4}Mn.H_{2}O a una concentración preferentemente de 16,900 mg/L, SO_{4}Zn.7H_{2}O a una concentración preferentemente de 10,590 mg/L, IK a una concentración preferentemente de 0,830 mg/L, MoO_{4}Na2.2H_{2}O a una concentración preferentemente de 0,250 mg/L, SO_{4}CU.5H_{2}O a una concentración preferentemente de 0,025 mg/L y Cl_{2}CO.6H_{2}O a una concentración preferentemente de 0,025 mg/L. El hierro quelado se añade preferentemente en forma de Fe-EDTA. Los cofactores empleados preferentemente son: Piridoxina a una concentración, preferentemente de 5 \muM, Tiamina a una concentración, preferentemente de 3 \muM, Ácido ascórbico a una concentración, preferentemente de 10 \muM, Ácido nicotínico a una concentración, preferentemente de 10 \muM, Glicina a una concentración, preferentemente de 10 \muM e Inositol a una concentración, preferentemente de 250 \muM.The basal culture medium SM, mentioned previously, it consists of a macronutrient solution, a micronutrient solution, chelated iron and cofactors, adjusting the pH value preferably between 5.5-5.7. The macronutrient solution used preferably comprises: KCl at a concentration preferably between 0.30 to 0.95 g / L, Cl2 Ca.2H2 O at a concentration preferably between 0.12 to 0.15 g / L, SO4 (NH4) 2 at a concentration preferably between 0.13 to 0.20 g / L, NO 3 K or NO 3 Na a a concentration preferably between 0.75 to 1.00 g / L, SO 4 Mg.7H 2 O at a concentration preferably between 0.20 to 0.31 g / L, PO 4 H 2 Na.H 2 O at a concentration preferably between 0.09 to 0.15 g / L and PO 4 HNa 2 at a concentration preferably 0.03 g / L. The solution of Micronutrients preferably used comprise: BO 3 H 3 at a concentration preferably of 6,200 mg / L, SO 4 Mn.H 2 O at a concentration preferably of 16,900 mg / L, SO4 Zn.7H2O at a concentration preferably of 10,590 mg / L, IK at a concentration preferably of 0.830 mg / L, MoO4 Na2.2H2O at a concentration preferably of 0.250 mg / L, SO 4 CU.5H 2 O at a concentration preferably of 0.025 mg / L and Cl2CO.6H2O at a concentration preferably 0.025 mg / L. Chelated iron is added preferably in the form of Fe-EDTA. Cofactors preferably used are: Pyridoxine at a concentration, preferably 5 µM, Thiamine at a concentration, preferably 3 µM, ascorbic acid at a concentration, preferably 10 µM, nicotinic acid at a concentration, preferably 10 µM, glycine at a concentration, preferably 10 µM and Inositol at a concentration, preferably 250 µM.
La concentración de carbón activo utilizada en los medios de inducción o maduración es preferentemente del 1% (w/v).The concentration of active carbon used in Induction or maturation media is preferably 1% (w / v).
La fuente de carbono utilizada en los medio de inducción, proliferación, maduración y germinación es preferentemente sacarosa a una concentración de preferentemente 90 mM (medios de inducción, proliferación y maduración) o 30 mM (medio de germinación).The source of carbon used in the middle of induction, proliferation, maturation and germination is preferably sucrose at a concentration of preferably 90 mM (induction, proliferation and maturation media) or 30 mM (medium of germination).
La concentración de glutamina utilizada en el medio de proliferación es preferentemente 500 mg/L.The glutamine concentration used in the Proliferation medium is preferably 500 mg / L.
En otra realización preferida el método de la
invención se caracteriza porque los agentes antimitóticos se
seleccionan preferentemente entre orizalina ó amiprofosmetil y se
añaden a una concentración preferentemente de
0.01 mM.In another preferred embodiment the method of the invention is characterized in that the antimitotic agents are preferably selected from orizaline or amiprofosmethyl and are added at a concentration preferably of
0.01 mM.
En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque las hormonas utilizadas son preferentemente ácido 3-Indol-Butírico, que se añade al medio de cultivo a una concentración preferentemente de 0.1 mg/mL y 6-Bencilaminopurina que se añade al medio de cultivo a una concentración preferentemente de 0.05 mg/L.In another preferred embodiment the method of invention is characterized in that the hormones used are preferably acid 3-Indole-Butyric, which is added to culture medium at a concentration preferably of 0.1 mg / mL and 6-Benzylaminopurine that is added to the culture medium at a concentration preferably of 0.05 mg / L.
El segundo objeto de la presente invención es el embrión haploide de encina obtenible mediante el método descrito anteriormente.The second object of the present invention is the haploid oak embryo obtainable by the described method previously.
El tercer objeto de la presente invención es el embrión doble-haploide de encina obtenible mediante el método descrito anteriormente.The third object of the present invention is the double-haploid oak embryo obtainable by The method described above.
El cuarto objeto de la presente invención es la planta doble-haploide de encina obtenible mediante el método descrito anteriormente.The fourth object of the present invention is the double-haploid oak plant obtainable by The method described above.
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Los siguientes ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos y no pretenden ser, ni deben considerarse, una limitación del alcance de la invención.The following examples are for purposes only. illustrative and are not intended to be, nor should they be considered, a Limitation of the scope of the invention.
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En la época de floración de la encina se recogen directamente del árbol seleccionado pequeñas ramas con amentos durante un periodo de 15 días. Para la realización del presente ejemplo se han utilizado encinas de la zona centro de España y se han recogido los amentos durante un periodo de 15 días, máximo en el mes de Abril, que es el periodo apropiado en la zona centro de España. Como se ha comentado anteriormente, la ventana de la inducción de embriogénesis es muy estrecha, puesto que las microsporas deben estar en el estado uninucleado tardío o polen bicelular temprano para que estas microsporas abandonen su programa de desarrollo gametofítico redireccionando su desarrollo hacia una ruta esporofítica que conlleva a la formación de embriones haploides que darán lugar posteriormente a plantas doble-haploides. Como método de control para asegurar que las microsporas presentes en el interior de las anteras de los amentos recogidos se encuentran en las fases uninuclear tardía o polen bicelular temprano se realiza manualmente un "aplastamiento" de la antera para romperla y posteriormente se tiñe mediante una tinción específica, DAPI (4'-6'-diamidino-2-fenilindol), que permite visualizar los núcleos de las células gaméticas al microscopio de fluorescencia y comprobar que se encuentran en dichas fases. Una vez se ha realizado dicho proceso de control, los amentos recogidos directamente del árbol son sometidos a un pretratamiento in vivo en frío a una temperatura de 4 \pm 2ºC durante aproximadamente 7 \pm 2 días. Posteriormente y en condiciones asépticas, se procede a la extracción manual de las anteras de dichos amentos para establecerlas en cultivo en placas Petri con medio de inducción.At the time of flowering of the oak, small branches with catkins are collected directly from the selected tree for a period of 15 days. Holm oaks from the central area of Spain have been used for the realization of this example and the catkins have been collected for a period of 15 days, maximum in the month of April, which is the appropriate period in the central area of Spain. As previously mentioned, the window of the induction of embryogenesis is very narrow, since the microspores must be in the late uninucleated state or early bicellular pollen so that these microspores leave their gametophytic development program redirecting their development towards a sporophytic pathway that it leads to the formation of haploid embryos that will subsequently lead to double-haploid plants. As a control method to ensure that the microspores present inside the anthers of the collected catkins are in the late uninuclear or early two-cell pollen phases, a "crush" of the anther is performed manually to break it and then stained by staining specific, DAPI (4'-6'-diamidino-2-phenylindole), which allows to visualize the nuclei of the gamético cells to the fluorescence microscope and to verify that they are in said phases. Once this control process has been carried out, the catkins collected directly from the tree are subjected to a cold pre-treatment in vivo at a temperature of 4 ± 2 ° C for approximately 7 ± 2 days. Subsequently and under aseptic conditions, the anthers of said catkins are manually extracted to establish them in culture in Petri dishes with induction medium.
El medio de inducción está compuesto por el medio de cultivo basal SM + 1% de carbón activo + 90 mM de sacarosa. La esterilización de dicho medio de cultivo se realiza en autoclave entre 0,5 y 1 atmósferas (115-120ºC) durante 20 minutos. El medio basal SM específico está formado por:The induction medium is composed of the basal culture medium SM + 1% active carbon + 90 mM sucrose. The sterilization of said culture medium is carried out in an autoclave between 0.5 and 1 atmospheres (115-120ºC) for 20 minutes The specific SM baseline means is formed by:
Sales minerales macronutrientes:Macronutrient mineral salts:
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Una solución de micronutrientes, preferentemente se emplea la de MURASHIGE Y SKOOG (1962):A micronutrient solution, preferably MURASHIGE AND SKOOG (1962) is used:
Además también posee hierro quelado en forma de Fe-EDTA, adicionando 27,8 mg/l de SO_{4}Fe.7H_{2}O y 37,3 mg/l de Na_{2}EDTA (etilendiamino tetraacetato de sodio).In addition it also has chelated iron in the form of Fe-EDTA, adding 27.8 mg / l of SO 4 Fe.7H 2 O and 37.3 mg / l Na 2 EDTA (ethylenediamine sodium tetraacetate).
Cofactores: empleándose preferentemente los siguientes:Cofactors: preferably using following:
Una vez establecido dicho cultivo, se aplica un segundo pretratamiento de estrés in vitro a dichas anteras que consiste en un choque térmico a una temperatura de 33 \pm 2ºC durante aproximadamente 7 \pm 2 días en oscuridad.Once said culture is established, a second in vitro stress pretreatment is applied to said anthers consisting of a thermal shock at a temperature of 33 ± 2 ° C for approximately 7 ± 2 days in the dark.
Posteriormente, estos cultivos se mantienen en una cámara de cultivo a una temperatura de 25ºC en condiciones de oscuridad. Los primeros embriones haploides aparecen entre aproximadamente los meses 1 y 3 de cultivo, tiempo específico de aparición de los embriones de encina.Subsequently, these crops are kept in a culture chamber at a temperature of 25 ° C under conditions of darkness. The first haploid embryos appear between approximately months 1 and 3 of cultivation, specific time of appearance of oak embryos.
Los embriones haploides de encina formados, para continuar con su crecimiento óptimo, son transferidos a medio de proliferación, continuando su crecimiento en dicho medio en las mismas condiciones que las mencionadas anteriormente, en una cámara de cultivo a una temperatura de 25ºC en condiciones de oscuridad. EL medio de proliferación está compuesto por medio de cultivo basal SM + 500 mM de glutamina + 90 mM de sacarosa.The haploid oak embryos formed, for continue with their optimal growth, they are transferred through proliferation, continuing its growth in this environment in the same conditions as mentioned above, in a camera of culture at a temperature of 25 ° C in dark conditions. HE proliferation medium is composed of baseline culture SM + 500 mM glutamine + 90 mM sucrose.
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Una vez obtenidos los embriones haploides de encina y mantenidos en cultivo en medio de proliferación según se describe en el Ejemplo 1, dichos embriones son sometidos a un tratamiento in vitro con agentes antimitóticos, haciendo que se interrumpan los procesos de mitosis producidos durante el ciclo celular en dichos embriones, duplicándose así el número de cromosomas y obteniéndose embriones doble-haploides de encina, que darán lugar a plantas doble haploides de encina. Los agentes antimitóticos utilizados son Orizalina ó Amiprofos-metil, pudiéndose utilizar cualquier otro conocido en el estado de la técnica, y son añadidos al medio de proliferación en el cual crecen los embriones haploides, a una concentración de 0.01 mM.Once the haploid oak embryos are obtained and kept in culture in proliferation medium as described in Example 1, said embryos are subjected to an in vitro treatment with antimitotic agents, causing the mitosis processes produced during the cell cycle to be interrupted. in said embryos, thus doubling the number of chromosomes and obtaining double-haploid oak embryos, which will give rise to double-haploid oak plants. The antimitotic agents used are Orizalina or Amiprofos-methyl, being able to use any other known in the state of the art, and are added to the proliferation medium in which haploid embryos grow, at a concentration of 0.01 mM.
Posteriormente los embriones doble-haploides se transfieren a un medio de maduración y se mantienen en cultivo a una temperatura preferentemente de 25ºC en condiciones de oscuridad durante aproximadamente un mes. El medio de maduración en el cual crecen dichos embriones doble- haploides es similar al medio de inducción de los embriones haploides, compuesto por medio de cultivo basal SM + 1% de carbón activo + 90 mM de sacarosa.Subsequently the embryos double-haploids are transferred to a medium of maturation and kept in culture at a temperature preferably 25 ° C in dark conditions during approximately one month. The ripening medium in which they grow said double-haploid embryos is similar to the induction medium of haploid embryos, composed of SM basal culture + 1% active carbon + 90 mM sucrose.
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Los embriones doble-haploides de encina maduros obtenidos según se describe en el Ejemplo 2, son sometidos en el propio medio de maduración, durante 2 meses, a una temperatura preferentemente de 4 \pm 2ºC para romper la latencia de los mismos y comenzar el proceso de germinación.The double-haploid embryos of mature oak obtained as described in Example 2, are submitted in the ripening medium itself, for 2 months, to a temperature preferably 4 ± 2 ° C to break the latency of them and begin the germination process.
Transcurrido dicho periodo de tiempo, los embriones doble-haploides son transferidos a medio de germinación y se mantienen en cultivo a una temperatura preferentemente de 25ºC en presencia de luz con un fotoperiodo de 16 h de luz, 8 h de oscuridad, para estimular la germinación de los mismos y obtener las plantas doble-haploides, líneas puras, de encina. El medio de germinación está formado por medio de cultivo basal SM + 30 mM de sacarosa + 0.05 mg/L BAP + 0.1 mg/L IBA. La presencia en el medio de germinación de las hormonas mencionadas favorece el crecimiento del tallo y la formación de la planta doble-haploide de encina.After this period of time, the double-haploid embryos are transferred to medium germination and kept in culture at a temperature preferably at 25 ° C in the presence of light with a photoperiod of 16 h of light, 8 h of darkness, to stimulate the germination of same and get double-haploid plants, lines Pure, holm oak. The germination medium is formed by basal culture SM + 30 mM sucrose + 0.05 mg / L BAP + 0.1 mg / L IBA. The presence in the germination medium of the mentioned hormones promotes stem growth and plant formation double-haploid oak.
Las plantas doble-haploides germinadas de encina, se pueden transplantar a envases o recipientes específicos para que continúen su crecimiento y aclimatación en invernaderos.Double-haploid plants Sprouted oak, can be transplanted into containers or containers specific to continue their growth and acclimatization in greenhouses
Claims (30)
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SO_{4}(NH_{4})_{2} a una concentración de entre 0,13 a 0,20 g/L, NO_{3}K ó NO_{3}Na a una concentración de entre 0,75 a 1,00 g/L, SO_{4}Mg.7H_{2}O a una concentración de entre 0,20 a 0,31 g/L, PO_{4}H_{2}Na.H_{2}O a una concentración de entre 0,09 a 0,15 g/L y PO_{4}HNa_{2} a una concentración de 0,03 g/L.17. Method according to claim 16 characterized in that the macronutrient solution used comprises: KCl at a concentration of between 0.30 to 0.95 g / L, Cl2 Ca.2H2 O at a concentration of between 0 , 12 to 0.15 g / L,
SO 4 (NH 4) 2 at a concentration of between 0.13 to 0.20 g / L, NO 3 K or NO 3 Na at a concentration of between 0.75 a 1.00 g / L, SO 4 Mg.7H 2 O at a concentration of between 0.20 to 0.31 g / L, PO 4 H 2 Na.H 2 O a a concentration of between 0.09 to 0.15 g / L and PO 4 HNa 2 at a concentration of 0.03 g / L.
250 \muM.20. Method according to claim 16, characterized in that the cofactors used are: Pyridoxine at a concentration of 5 µM, Thiamine at a concentration of 3 µM, Ascorbic acid at a concentration of 10 µM, Nicotinic acid at a concentration of 10 µM muM, Glycine at a concentration of 10 µM and Inositol at a concentration of
250 µM.
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| Title |
|---|
| JAIN S.M. ET AL. Protocols for micropropagation of woody trees and fruits. 2007. Páginas 163-172. (Recuperado el 02.02.2011).Recuperado de internet: http://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=ZwhWViy0sCUC&oi=fnd&pg=PA163&dq=Antimitotic+agents+increase+the+production+of+doubled-haploid+embryos+from+cork+oak+anther+culture&ots=KF8t_OUBi6&sig=yTk0m_odaHmN06Z8PxSGOmRDcZM#v=onepage&q&f=false * |
| PINTOS B. ET AL. Antimitotic agents increase the production of doubled-haploid embryos from cork oak anther culture. 2007. Journal of Plant Physiology. Vol.164. páginas 1595-1604. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103535280A (en) * | 2013-10-29 | 2014-01-29 | 江苏省林业科学研究院 | Water oak tissue culture breeding method |
| CN103535280B (en) * | 2013-10-29 | 2015-10-28 | 江苏省林业科学研究院 | A kind of water oak tissue culture propagation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2355455B1 (en) | 2012-02-07 |
| PT105287A (en) | 2011-03-11 |
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