ES2355027B2 - PLASMIDS INCLUDING THE SEQUENCE OF HIV-1 AND ITS USES. - Google Patents
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Abstract
Plásmidos que incluyen la secuencia del VIH-1 y sus usos.Plasmids that include the sequence of HIV-1 and its uses.
En la presente invención se proveen cuatro plásmidos en los que se han creado mutaciones dirigidas al tercer nucleótido del codón sin cambio en la traducción de la secuencia original, así como los usos para utilizar estas construcciones en la evaluación de sistemas de extracción de ácidos nucleicos, en la clonación de fragmentos del gen pol y del gen que codifica para la proteasa del virus VIH-1 y en el análisis de la resistencia fenotípica de VIH-1 de muestras clínicas a antirretrovirales, así como los correspondientes métodos para realizar la evaluación de los sistemas de extracción de ácidos nucleicos y para la construcción de los plásmidos.In the present invention four plasmids are provided in which mutations directed to the third nucleotide of the codon have been created without change in the translation of the original sequence, as well as the uses to use these constructs in the evaluation of nucleic acid extraction systems, in the cloning of fragments of the pol gene and the gene coding for the protease of the HIV-1 virus and in the analysis of the phenotypic resistance of HIV-1 of clinical samples to antiretrovirals, as well as the corresponding methods for evaluating the nucleic acid extraction systems and for the construction of plasmids.
Description
Plásmidos que incluyen la secuencia del VIH-1 y sus usos.Plasmids that include the sequence of HIV-1 and its uses.
En la presente invención se proveen cuatro plásmidos en los que se han creado mutaciones dirigidas al tercer nucleótido del codón sin cambio en la traducción de la secuencia original, así como los usos para utilizar estas construcciones en la evaluación de sistemas de extracción de ácidos nucleicos, en la clonación de fragmentos del gen pol y del gen que codifica para la proteasa del virus VIH-1 y en el análisis de la resistencia fenotípica de VIH-1 de muestras clínicas a antirretrovirales, así como los correspondientes métodos para realizar la evaluación de los sistemas de extracción de ácidos nucleicos y para la construcción de los plásmidos.In the present invention four plasmids are provided in which mutations directed to the third nucleotide of the codon have been created without change in the translation of the original sequence, as well as the uses to use these constructs in the evaluation of nucleic acid extraction systems, in the cloning of fragments of the pol gene and the gene coding for the protease of the HIV-1 virus and in the analysis of the phenotypic resistance of HIV-1 of clinical samples to antiretrovirals, as well as the corresponding methods for evaluating the nucleic acid extraction systems and for the construction of plasmids.
Las pruebas diagnósticas moleculares pueden
seguir tres pasos consecutivos: extracción, amplificación/detección
y análisis de datos. El primero de estos pasos, la extracción,
condiciona el tiempo de respuesta de la prueba y, a su vez, éste
está condicionado por el tipo y cantidad de la muestra, que debe ser
siempre representativo del compartimento que se pretende analizar.
El diseño de sistemas para la extracción de ácidos nucleicos, paso
previo a cualquier detección molecular diagnóstica, se basa cada vez
de forma más acentuada en el uso de nanopartículas magnéticas y
lleva asociada una química diseñada para lograr la absorción
inespecífica del ácido nucleico a la nanopartícula. El control de
los métodos de producción y el rendimiento de los sistemas de
extracción se ha basado en el posterior funcionamiento del sistema
de detección que incluye una reacción de amplificación. Este proceso
de expansión de la diana, imprescindible en la mayor parte de los
test diagnósticos en uso, hace que el paso previo de extracción haya
tenido sólo una importancia relativa, pero cada vez más, debido a
las condiciones previamente apuntadas (duración del test e
importancia del compartimento que se quiere analizar), este paso
inicial cobra más
transcendencia.Molecular diagnostic tests can follow three consecutive steps: extraction, amplification / detection and data analysis. The first of these steps, the extraction, determines the response time of the test and, in turn, it is conditioned by the type and quantity of the sample, which must always be representative of the compartment to be analyzed. The design of systems for the extraction of nucleic acids, prior to any diagnostic molecular detection, is increasingly based on the use of magnetic nanoparticles and is associated with a chemistry designed to achieve the nonspecific absorption of nucleic acid to the nanoparticle. . The control of the production methods and the performance of the extraction systems has been based on the subsequent operation of the detection system that includes an amplification reaction. This process of expansion of the target, essential in most of the diagnostic tests in use, means that the previous extraction step has had only a relative importance, but increasingly, due to the conditions previously indicated (duration of the test and importance of the compartment to be analyzed), this initial step charges more
transcendence
Se conocen dos tipos de soluciones alternativas para el control de la extracción y valoración de su calidad: 1) Colecciones o paneles de sueros estándar (Ronsin et al., 2006. J. Clin. Microbiol., 44:4, 1390-1399) y 2). Uso de muestras aleatorias obtenidas de pacientes.Two types of alternative solutions are known for the control of extraction and assessment of their quality: 1) Standard sera collections or panels (Ronsin et al ., 2006. J. Clin. Microbiol ., 44: 4, 1390-1399) and 2). Use of random samples obtained from patients.
Las evaluaciones encontradas hasta la fecha, no incluyen ni los plásmidos propuestos en esta invención, ni su combinación (Loens et al., 2007. J. Clin. Microbiol. 45:2, 421-425). En el mercado se encuentra disponible OptiQual® un set de controles de ARN de VIH-1 que provee una herramienta para testar los resultados obtenidos mediante diferentes metodologías, evaluando o comparando nuevos procedimientos basados en el uso de ácidos nucleicos para la determinación del virus VIH-1.The evaluations found to date do not include neither the plasmids proposed in this invention, nor their combination (Loens et al ., 2007. J. Clin. Microbiol . 45: 2, 421-425). OptiQual® is available on the market a set of HIV-1 RNA controls that provides a tool to test the results obtained by different methodologies, evaluating or comparing new procedures based on the use of nucleic acids for the determination of the HIV virus. one.
Los plásmidos objeto de la presente invención ofrecen un método alternativo para evaluar y comparar la calidad de la extracción de los sistemas de extracción de ácido nucleicos, cuya eficacia se muestra en el correspondiente ejemplo de la presente invención.The plasmids object of the present invention offer an alternative method to evaluate and compare the quality of the extraction of nucleic acid extraction systems, whose efficacy is shown in the corresponding example of the present invention.
Además, aunque NL4.3 ha sido usado para la
evaluación fenotípica de resistencias de VIH a los
antirretrovirales, los sistemas comerciales y experimentales
similares al que se presenta en esta invención, no son capaces de
facilitar la discriminación en la aportación de diferentes regiones
de los fragmentos clonados en la resistencia de diversos fenotipos
de VIH a antirretrovirales. Por tanto, se provee de un modelo capaz
de caracterizar los genes y las subregiones genómicas de
VIH-1 implicadas en la resistencia a
antirretrovirales. Con ello se permite la clonación y el estudio de
fragmentos progresivamente más largos del mismo gen, con lo que se
puede determinar la aportación de las porciones diferentes del
espacio de secuencia correspondiente al gen pol, usando cada
una de las construcciones tras pseudotiparlas con la secuencia
correspondiente del paciente en la valoración de la resistencia a
los
antirretrovirales.In addition, although NL4.3 has been used for the phenotypic evaluation of HIV resistance to antiretrovirals, commercial and experimental systems similar to that presented in this invention are not capable of facilitating discrimination in the contribution of different regions of the fragments cloned in the resistance of various HIV phenotypes to antiretrovirals. Therefore, a model capable of characterizing the genes and genomic subregions of HIV-1 involved in antiretroviral resistance is provided. This allows cloning and the study of progressively longer fragments of the same gene, so that the contribution of different portions of the sequence space corresponding to the pol gene can be determined, using each of the constructs after pseudotyping them with the sequence corresponding to the patient in the assessment of resistance to
antiretrovirals
Las regiones de la proteasa y de la retrotranscriptasa son reguladoras de la actividad del virus VIH-1 en etapas clave del proceso de infección y, por tanto, fundamentales para el éxito de la integración del ADN viral en el ADN del huésped. La proteasa actúa cortando unidades de las proteínas Gag, Pol y de la Gag-Pol. La retrotranscriptasa tiene la función de sintetizar el ADN de doble cadena del provirus usando como patrón la cadena singular del ARN viral; es una ADN-polimerasa actúa como dependiente del ARN. Una parte de los fármacos empleados para evitar la progresión del ciclo vital del virus VIH son inhibidores de la función de estos genes, así pues, los pseudotipos virales construidos usando secuencias de los genes de los virus aislados en los pacientes en las construcciones de la presente invención, permiten valorar el comportamiento in vivo de estos fármacos en la infección por VIH en experimentos de inhibición de la infección usando concentraciones crecientes de antiretrovirales.The protease and retrotranscriptase regions are regulators of HIV-1 virus activity at key stages of the infection process and, therefore, fundamental to the success of the integration of viral DNA into host DNA. The protease acts by cutting units of Gag, Pol and Gag-Pol proteins. Retrotranscriptase has the function of synthesizing the double stranded DNA of the provirus using the single strand of the viral RNA as a standard; It is a DNA polymerase acts as an RNA dependent. A part of the drugs used to prevent the progression of the life cycle of the HIV virus are inhibitors of the function of these genes, thus, viral pseudotypes constructed using sequences from the genes of the isolated viruses in the patients in the present constructions. The invention allows assessing the in vivo behavior of these drugs in HIV infection in infection inhibition experiments using increasing concentrations of antiretrovirals.
En la presente invención se proveen cuatro plásmidos en los que se han creado mutaciones dirigidas al tercer nucleótido del codón sin cambio en la traducción de una secuencia original, así como los usos para dos aplicaciones alternativas (1) evaluar los sistemas de extracción de ácidos nucleicos; cantidad, pureza e integridad de los fragmentos de ácidos nucleicos ADN y ARN eluídos y (2) valoración de la resistencia fenotípica de VIH-1 a antirretrovirales, es decir, el análisis fenotípico de resistencias VIH que permite valorar el "fitness" genético del virus o el papel de mutaciones compensatorias al usar secuencias más largas de la que habitualmente se usa en este tipo de análisis con NL4.3, que es la integración en el vector del fragmento ApaI-PinAI. Asimismo, la presente invención provee el método de construcción de estos plásmidos, así como el método para evaluar la calidad de los sistemas de extracción de ADN y ARN eluídos.In the present invention four plasmids are provided in which mutations directed to the third nucleotide of the codon have been created without change in the translation of an original sequence, as well as the uses for two alternative applications (1) to evaluate the nucleic acid extraction systems ; quantity, purity and integrity of eluted DNA and RNA nucleic acid fragments and (2) assessment of the phenotypic resistance of HIV-1 to antiretrovirals, that is, the phenotypic analysis of HIV resistance that allows to assess the genetic "fitness" of the virus or the role of compensatory mutations when using longer sequences than is usually used in this type of analysis with NL4.3, which is the integration into the Apa I- Pin AI fragment vector. Also, the present invention provides the method of construction of these plasmids, as well as the method for evaluating the quality of eluted DNA and RNA extraction systems.
Las cuatro construcciones están basadas en un
virus VIH tipo NL4.3 (Adachi et al., 1986. J. Virol.
59:284-291.) NIH AIDS Reagent Reference
Program (Cat. Num.: 144.), en las que se han creado mutaciones
dirigidas al tercer nucleótido del codón, de forma que, siendo la
expresión de aminoácidos idéntica a la de la secuencia original, se
generen sitios únicos de restricción en posiciones sucesivas del gen
pol del virus VIH-1. La ventaja de este
sistema es que es posible obtener ácidos nucleicos con cuatro
polimorfismos de un solo nucleótido (de las siglas en inglés SNP,
Single nucleotide polimorphism) y además, al tener secuencias
conocidas, podemos obtener la construcción como ADNs lineales (por
corte en lugares únicos comunes como ApaI) o circulares.
Alternativamente puede obtenerse por transfección con Calphos^{TM}
(Invitrogen) en células empaquetadoras (por ejemplo, células
293T/17), viriones VIH infecciosos que puedan usarse como origen de
ARNs o en el otro uso alternativo de la invención como herramienta
para la infección experimental "in vivo" y la posible
valoración de la capacidad inhibitoria de los
antiretrovirales.The four constructs are based on an HIV virus type NL4.3 (Adachi et al ., 1986. J. Virol . 59: 284-291.) NIH AIDS Reagent Reference Program (Cat. Num .: 144.), in which mutations directed to the third nucleotide of the codon have been created, so that, being the expression of amino acids identical to that of the original sequence, unique restriction sites are generated at successive positions of the pol gene of the HIV-1 virus. The advantage of this system is that it is possible to obtain nucleic acids with four single nucleotide polymorphisms (SNP, Single nucleotide polymorphism ) and also, by having known sequences, we can obtain the construction as linear DNAs (by cutting in Unique common places like Apa I) or circular. Alternatively, it can be obtained by transfection with Calphos ™ (Invitrogen) in packaging cells (e.g., 293T / 17 cells), infectious HIV virions that can be used as the origin of RNAs or in the other alternative use of the invention as a tool for experimental infection " in vivo " and the possible assessment of the inhibitory capacity of
antiretrovirals
Para evaluar el rendimiento de los sistemas de extracción de ácidos nucleicos, se lleva a cabo la extracción de los plásmidos integrados en una mezcla estándar cuya cantidad y composición inicial es conocida. Una aplicación colateral desarrollada, es la posibilidad de un rápido análisis clonal que detecte sesgos en el proceso de extracción que puede realizarse por pirosecuenciación, con pares de cebadores que hemos diseñado y reconocen de forma específica cada uno de los plásmidos de la presente invención permitiendo valorar la calidad de la extracción realizada. Los sistemas convencionales de análisis clonal mediante los cuales se determina la calidad del proceso de extracción, son procesos que no determinan sesgos, que recuperan de forma equilibrada todas las especies de ácidos nucleicos, y que se suelen hacer por transfección en bacterias y análisis individual de clones bacterianos que crecen de la placa de cultivo tras la transformación. Éste es un método largo y laborioso. En la presente invención esta determinación se puede hacer de forma rápida utilizando cebadores mediante los que, por pirosecuenciación, se detectan los diferentes polimorfismos y permiten comparar el porcentaje de especies de cada uno de los cuatro tipos de ácido nucleico incluidos en la presente invención tras el proceso de extracción en cuestión de horas.To evaluate the performance of systems nucleic acid extraction, the extraction of the plasmids integrated into a standard mixture whose quantity and Initial composition is known. A collateral application developed, is the possibility of a rapid clonal analysis that detect biases in the extraction process that can be performed by pyrosequencing, with pairs of primers that we have designed and specifically recognize each of the plasmids in the present invention allowing to assess the quality of the extraction done. Conventional clonal analysis systems using which determines the quality of the extraction process, are processes that do not determine biases, that recover in a way balanced all species of nucleic acids, and that are usually do by transfection in bacteria and individual clone analysis bacteria that grow from the culture plate after transformation. This is a long and laborious method. At the moment invention this determination can be made quickly using primers whereby, by pyrosequencing, detect the different polymorphisms and allow to compare the percentage of species of each of the four types of acid nucleic included in the present invention after the process of extraction in a matter of hours.
La producción de reactivos para la detección de VIH y extracción de ADN de VIH es un aspecto que posee una clara aplicación industrial. Los sistemas automáticos de extracción y detección se han basado en el paso de detección para garantizar la calidad del producto comercializado. Los plásmidos y el sistema propuesto en la presente invención permiten establecer criterios de normalización de los reactivos de extracción de forma alternativa e independiente al resto del procedimiento, de forma que el uso del sistema de extracción no esté restringido a un proceso de detección específico y los lotes de nanopartículas magnéticas o de cartuchos de filtración puedan utilizarse con distintas técnicas de detección y análisis (secuenciación, PCR, Lipa, etc.).The production of reagents for the detection of HIV and HIV DNA extraction is an aspect that has a clear industrial application Automatic extraction systems and detection have been based on the detection step to ensure the Product quality marketed. Plasmids and the system proposed in the present invention allow to establish criteria of standardization of extraction reagents alternatively and independent of the rest of the procedure, so that the use of extraction system is not restricted to a detection process specific and lots of magnetic nanoparticles or cartridges filtration can be used with different detection techniques and analysis (sequencing, PCR, Lipa, etc.).
Otra posible aplicación clínica o de desarrollo con las construcciones diseñadas en esta invención es la evaluación de la resistencia de los diferentes fenotipos de VIH-1 a antirretrovirales comerciales o en vías de ensayo.Another possible clinical or developmental application with the constructions designed in this invention is the evaluation of the resistance of the different phenotypes of HIV-1 to commercial or on-going antiretrovirals test.
Para evaluar la resistencia de diferentes fenotipos de virus a antirretrovirales, es necesaria la clonación, en los plásmidos de la invención, de los fragmentos deseados de los virus presentes en los pacientes por medio de su amplificación por PCR mediante el uso de un cebador directo común y diferentes cebadores reversos, incluyendo estos últimos, sitios de restricción correspondientes a cada uno de los sitios obtenidos por mutagénesis dirigida en los plásmidos.To assess the resistance of different Antiretroviral virus phenotypes, cloning is necessary, in the plasmids of the invention, of the desired fragments of the viruses present in patients by means of amplification by PCR by using a common and different direct primer reverse primers, including the latter, restriction sites corresponding to each of the sites obtained by mutagenesis directed in plasmids.
En este sentido, un primer aspecto de la presente invención es un plásmido seleccionado de la lista que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. En adelante nos referiremos a este plásmido/s como "el plásmido de la presente invención" o "los plásmidos de la invención".In this sense, a first aspect of the The present invention is a plasmid selected from the list that comprises SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. Hereinafter we will refer to this plasmid / s as "the plasmid of the present invention "or" the plasmids of the invention".
La secuencia de cada uno de los plásmidos está basada en la del plásmido pNL4.3 que incluye parte de la secuencia del virus VIH-1. Asimismo, también se considera cualquier combinación de los plásmidos de la lista. A continuación describimos las características de las secuencias:The sequence of each of the plasmids is based on that of plasmid pNL4.3 that includes part of the sequence of the HIV-1 virus. It is also considered any combination of the plasmids listed. Then We describe the characteristics of the sequences:
SEQ ID NO: 1. Se sustituyó el nucleótido que ocupaba la posición 4243 del plásmido original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió el codón ATA (codifica para el aminoácido isoleucina) por ATC (también codifica para el aminoácido isoleucina), generándose de ese modo un nuevo sitio de restricción ClaI.SEQ ID NO: 1. The nucleotide occupying position 4243 of the original plasmid pNL4.3 corresponding to the pol gene that changed the ATA codon (encoding the amino acid isoleucine) was replaced by ATC (also encoding the amino acid isoleucine), being generated from that way a new Cla I. restriction site
SEQ ID NO: 2. Se sustituyó el nucleótido que ocupaba la posición 4403 del plásmido original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió el codón CCA (codifica para el aminoácido prolina) por CCG (también codifica para el aminoácido prolina), generándose de ese modo un nuevo sitio de restricción XmaI.SEQ ID NO: 2. The nucleotide occupying position 4403 of the original plasmid pNL4.3 corresponding to the pol gene that changed the CCA codon (encoding the amino acid proline) was replaced by CCG (also encoding the amino acid proline), being generated from that way a new restriction site Xma I.
SEQ ID NO: 3. Se sustituyeron dos nucleótidos que ocupaban las posiciones 4625 y 4626 del plásmido original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió la secuencia TGGGCG por TGCCCG. Se produjeron dos cambios de aminoácido TGG (codifica para el aminoácido triptófano) por TGC (codifica para el aminoácido cisteína) y GCG (codifica para el aminoácido alanina) por CCG (codifica para el aminoácido prolina), generándose de ese modo un nuevo sitio de restricción XmaI.SEQ ID NO: 3. Two nucleotides occupying positions 4625 and 4626 of the original plasmid pNL4.3 corresponding to the pol gene that changed the TG GG CG sequence to TG CC CG were replaced. Two changes of the amino acid TGG (coding for the amino acid tryptophan) were produced by TGC (encoding the amino acid cysteine) and GCG (encoding the amino acid alanine) by CCG (encoding the amino acid proline), thereby generating a new site of Xma I. restriction
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SEQ ID NO: 4. Se sustituyó el nucleótido que ocupaba la posición 4688 del plásmido original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió el codón TCT (codifica para el aminoácido serina) por TCG (también codifica para el aminoácido serina), generándose de ese modo un nuevo sitio de restricción ClaI.SEQ ID NO: 4. The nucleotide occupying position 4688 of the original plasmid pNL4.3 corresponding to the pol gene that changed the TCT codon (encodes for the amino acid serine) was replaced by TCG (also encoded for the amino acid serine), being generated from that way a new Cla I. restriction site
En este aspecto de la invención también se incluyen aquellos plásmidos derivados de los plásmidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4. Por plásmidos derivados se entienden aquellos que conservan las mutaciones que los caracterizan y permiten reconocer las enzimas de restricción que se han descrito anteriormente para cada uno de ellos.In this aspect of the invention also include those plasmids derived from plasmids SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 4. Derived plasmids are those that they retain the mutations that characterize them and allow recognition the restriction enzymes described above for each one of them.
Un segundo aspecto de la presente invención es el uso de una célula empaquetadora transfectada con cualquiera de los plásmidos de la invención.A second aspect of the present invention is the use of a packaging cell transfected with any of the plasmids of the invention.
El término "célula empaquetadora" hace referencia a cualquier célula modificada para expresar los genes correspondientes a las proteínas virales necesarias para que se pueda constituir la partícula viral infectiva a partir de la construcción que se transfecta.The term "packing cell" makes reference to any modified cell to express genes corresponding to the viral proteins necessary for it may constitute the infective viral particle from the construction that is transfected.
El término célula "transformada" o "transfectada" hace referencia a la célula procariota o eucariota, respectivamente, en la que se ha introducido material genético externo mediante plásmidos, vectores víricos u otras herramientas de transferencia de este tipo de material.The term "transformed" cell or "transfected" refers to the prokaryotic cell or eukaryotic, respectively, in which material has been introduced external genetic through plasmids, viral vectors or others Transfer tools of this type of material.
Un tercer aspecto de la presente invención es un virión que contiene el ARN codificado por cualquiera de los plásmidos descritos en el primer aspecto de la presente invención. El término "virión" se refiere a la partícula viral infectiva compuesta al menos por:A third aspect of the present invention is a virion containing the RNA encoded by any of the Plasmids described in the first aspect of the present invention. The term "virion" refers to the infective viral particle. composed of at least:
- Ácido nucleico vírico: el ácido nucleico es ARN de cadena sencilla.Nucleic acid viral: the nucleic acid is single stranded RNA.
- Proteínas víricas: Pueden ser proteínas estructurales como las que forman la cubierta externa o cápside (por ejemplo las proteínas ENV de los plásmidos de la presente invención), o también pueden ser otro tipo de proteínas enzimáticas (por ejemplo POL, VIF, VPR, TAT, etc...).Protein viral: They can be structural proteins like those that form the outer shell or capsid (for example the ENV proteins of the plasmids of the present invention), or they can also be another type of enzymatic proteins (for example POL, VIF, VPR, TAT, etc...).
Los viriones de la presente invención se obtienen como consecuencia de la transfección de células empaquetadoras mediante un plásmido caracterizado por las secuencias del primer aspecto de la presente invención. Los viriones son liberados al medio en el que se cultivan las células empaquetadoras transfectadas.The virions of the present invention are obtained as a result of cell transfection packaging machines using a plasmid characterized by the sequences of the first aspect of the present invention. Virions are released into the medium in which the packaging cells are grown Transfected
Un cuarto aspecto de la presente invención es el uso de una célula reporter transfectada con cualquiera de los viriones según el aspecto anterior.A fourth aspect of the present invention is the use of a reporter cell transfected with any of the virions according to the previous aspect.
El término "célula reporter" hace referencia a la célula que contiene un gen foráneo cuya proteína puede ser detectada por la medida de su fluorescencia o cualquier otro gen cuya proteína sea detectable.The term " reporter cell" refers to the cell that contains a foreign gene whose protein can be detected by measuring its fluorescence or any other gene whose protein is detectable.
Un quinto aspecto es el uso del plásmido de la presente invención, o cualquiera de sus combinaciones, para evaluar la calidad de los sistemas de extracción de ADN. Por "calidad de los sistemas de extracción de ADN" se entiende la evaluación de la concentración, pureza y composición de las especies de ácidos nucleicos obtenidos tras el proceso de extracción. El uso descrito en este aspecto de la invención permite evaluar el nivel de estandarización de un sistema de extracción de ácidos nucleicos (por ejemplo un lote de nanopartículas) que debería poseer unas condiciones fijas en la capacidad de recuperación de los mismos. Estas condiciones fijas se ven alteradas por el efecto de impurezas presentes, otros ácidos nucleicos o compuestos aromáticos y otros agentes contaminantes que interfieren la capacidad de absorción de las matrices que se usan para purificar y extraer ácidos nucleicos.A fifth aspect is the use of the plasmid of the present invention, or any combination thereof, to evaluate The quality of DNA extraction systems. For "quality of DNA extraction systems "means the evaluation of the concentration, purity and composition of acid species Nuclei obtained after the extraction process. The described use In this aspect of the invention it is possible to evaluate the level of standardization of a nucleic acid extraction system (by example a batch of nanoparticles) that should have some fixed conditions in their capacity to recover. These fixed conditions are altered by the effect of impurities. present, other nucleic acids or aromatic compounds and others pollutants that interfere with the absorption capacity of the matrices that are used to purify and extract acids nucleic
Para poder determinar la calidad de la extracción se comparan los datos de concentración y los porcentajes de bases nucleotídicas obtenidos después de la extracción de la mezcla de las construcciones, mediante los métodos de extracción de ácidos nucleicos que se deseen probar, con la mezcla estándar compuesta por todos los plásmidos en una concentración conocida y con un porcentaje de bases conocido. En este proceso, se usa una cantidad alta de ADN, superior a la que son capaces de absorber las nanopartículas utilizadas, así podemos ver el rendimiento del proceso. La pureza se calcula por espectrofotometría; la relación de lecturas A280/A260 debe ser en torno a 1,8 para un 90% de pureza y los sesgos se valoran rápidamente por pirosecuenciación (ejemplo 2).In order to determine the quality of the extraction are compared concentration data and percentages of nucleotide bases obtained after the extraction of the mixture of the constructions, by means of the extraction methods of nucleic acids to be tested, with the standard mixture composed of all plasmids in a known concentration and with a known percentage of bases. In this process, a high amount of DNA, higher than what they are able to absorb nanoparticles used, so we can see the performance of the process. Purity is calculated by spectrophotometry; The relationship of A280 / A260 readings should be around 1.8 for 90% purity and biases are quickly assessed by pyrosequencing (example 2).
La pirosecuenciación es un tipo de secuenciación basada en la síntesis. Se utiliza una hebra del ADN inmovilizada y se sintetiza su hebra complementaria medio de la enzima ADN polimerasa empleando otra enzima quimioluminiscente. De este modo se consigue detectar de una forma rápida base por base según son adicionadas en la síntesis de la hebra complementaria. El uso que se propone para la pirosecuenciación, es el del análisis de cada una de las construcciones ya que permite valorar rápidamente si hay sesgos en el proceso de extracción y si se recuperan todas las especies o algunas con preferencia a otras. La composición de las especies de ácidos nucleicos recuperadas de la mezcla estándar se puede evaluar por medio de la determinación del porcentaje de la presencia en la mezcla de los nucleótidos mutados por pirosecuenciación, los porcentajes de la tabla 6 representan el porcentaje de SNPs en las mezclas tras la extracción por distintas plataformas.Pyrosequencing is a type of sequencing based on the synthesis. A strand of immobilized DNA is used and its complementary complementary strand of the DNA enzyme is synthesized polymerase using another chemiluminescent enzyme. In this way quickly detect base by base as they are added in the synthesis of the complementary strand. The use that is proposed for pyrosequencing, is the analysis of each of the constructions since it allows to quickly assess if there are biases in the extraction process and if all species are recovered or some with preference to others. The composition of the species of nucleic acids recovered from the standard mixture can be evaluated by determining the percentage of presence in the mixture of nucleotides mutated by pyrosequencing, the percentages of table 6 represent the percentage of SNPs in the mixtures after extraction by different platforms.
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Una realización preferida es un método de evaluación de la calidad de los sistemas de extracción de ácidos nucleicos que comprende:A preferred embodiment is a method of quality assessment of acid extraction systems nucleic comprising:
- a.to.
- obtener una mezcla estándar de ADN,get a standard mix of DNA,
- b.b.
- aplicar la mezcla estándar de (a) al sistema de extracción de ADN,apply the standard mixture of (a) to DNA extraction system,
- c.C.
- cuantificar la concentración de ADN extraído en el paso (b) y/o pirosecuenciar un fragmento de dicho ADN, yquantify the DNA concentration extracted in step (b) and / or pyrosequencing a fragment of said DNA, and
- d.d.
- comparar los resultados obtenidos en (c) con los valores de concentración y/o composición nucleotídica de la mezcla estándar.compare the results obtained in (c) with the concentration and / or nucleotide composition values of The standard mix.
El término "mezcla estándar de ADN" tal como se entiende en la presente invención es una mezcla de cantidades iguales de al menos cualquier combinación de los plásmidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4. Para obtener el ADN plasmídico que forma parte de la mezcla estándar, es necesario cultivar células que expresen cualquiera de los plásmidos de la invención y extraer el ADN plasmídico de las células anteriores de forma que el ADN que se obtenga esté libre de otros ácidos nucleicos o componentes. En este caso la extracción del ADN plasmídico puede realizarse, por ejemplo, mediante un sistema de extracción plasmiprep, miniprep, midiprep o maxiprep, sin excluir de esta lista otros sistemas de extracción.The term "standard DNA mixture" such as understood in the present invention is a mixture of equal amounts of at least any combination of the plasmids SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4. To obtain the DNA Plasmid that is part of the standard mixture, it is necessary culturing cells that express any of the plasmids of the invention and extract the plasmid DNA from the previous cells of so that the DNA obtained is free of other nucleic acids or components In this case the extraction of plasmid DNA can be carried out, for example, by an extraction system plasmiprep, miniprep, midiprep or maxiprep, not excluding from this list Other extraction systems.
Las células que expresan cualquiera de los plásmidos de la invención pueden ser todas aquellas que admitan la replicación de los plásmidos descritos con el objeto de conseguir amplificar el número de copias de cada uno de los citados plásmidos.The cells that express any of the plasmids of the invention can be all those that admit the replication of the plasmids described in order to achieve amplify the number of copies of each of those cited plasmids
La calidad en el proceso de extracción de los ácidos nucleicos se entiende como la medida de la concentración y pureza del ADN eluido (ADN recuperado tras el proceso de extracción), que se hace por medio de espectrofotometría y/o fluorimetría (en la presente invención se ha utilizado el método fluorométrico Invitrogen Qubit^{TM}). La determinación de la composición del ADN eluido se puede llevar a cabo por medio de la determinación del porcentaje de la presencia en la mezcla de los nucleótidos mutados que se puede obtener por medio de pirosecuenciación.The quality in the process of extracting the nucleic acids is understood as the measure of concentration and purity of eluted DNA (DNA recovered after the process of extraction), which is done by spectrophotometry and / or fluorimetry (in the present invention the method has been used fluorometric Invitrogen Qubit?). The determination of the eluted DNA composition can be carried out by means of the determination of the percentage of the presence in the mixture of mutated nucleotides that can be obtained by means of Pyrosequencing
Un sexto aspecto es la posibilidad de uso del virión VIH según el tercer aspecto de la presente invención, o cualquiera de sus combinaciones, para evaluar la calidad de los sistemas de extracción de ARN. Una ventaja de este uso es que se puede utilizar el ADN plasmídico o se pueden obtener viriones de cada una de las construcciones y mezclarlos, de forma que, en lugar de usar ADN circular o lineal se puede usar ARN del virión del sobrenadante del cultivo de las células infectadas o de las propias células. Esto hace muy versátil el sistema ya que casi todas las combinaciones son posibles.A sixth aspect is the possibility of using HIV virion according to the third aspect of the present invention, or any of its combinations, to evaluate the quality of the RNA extraction systems. An advantage of this use is that it plasmid DNA can be used or virions of each of the constructions and mix them, so that, instead if using circular or linear DNA, RNA from the virion of the culture supernatant of infected cells or their own cells. This makes the system very versatile since almost all combinations are possible.
Como se ha mencionado anteriormente, los viriones definidos en la presente invención contienen el ARN codificado por la secuencia de los plásmidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4. El virión contiene la secuencia del virus VIH-1, compuesto por dos copias de ARN de cadena sencilla (sARN) en las cuales se encuentra la secuencia de la retrotranscriptasa y la proteasa.As mentioned above, the virions defined in the present invention contain RNA encoded by the sequence of plasmids SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4. The virion contains the virus sequence HIV-1, consisting of two copies of chain RNA simple (sRNA) in which the sequence of the retrotranscriptase and protease.
Asimismo, una realización preferida es un método de evaluación de la calidad de los sistemas de extracción de ácidos nucleicos que comprende:Also, a preferred embodiment is a method. of quality assessment of acid extraction systems nucleic comprising:
- a.to.
- cultivar cualquiera de las células empaquetadoras que contienen los plásmidos de la invención,grow any of the cells packaging machines containing the plasmids of the invention,
- b.b.
- recoger los viriones liberados al medio de cultivo por las células del apartado (a),collect the virions released in the middle of culture by the cells of section (a),
- c.C.
- extraer el ARN de los viriones del apartado (b),extract the RNA from the virions of the section (b),
- d.d.
- obtener una mezcla estándar con el ARN de (c),get a standard mix with the RNA of (c),
- e.and.
- aplicar la mezcla estándar de (d) al sistema de extracción de ARN,apply the standard mixture of (d) to RNA extraction system,
- f.F.
- cuantificar la concentración de ARN extraído en el paso (e) y/o pirosecuenciarloquantify the concentration of RNA extracted in step (e) and / or pyrosequencing it
- g.g.
- comparar los resultados obtenidos en (f) con los valores de concentración y/o composición nucleotídica de la mezcla estándar.compare the results obtained in (f) with the concentration and / or nucleotide composition values of The standard mix.
El término "mezcla estándar de ARN" tal como se entiende en la presente invención es una mezcla de cantidades iguales de al menos cualquier combinación del ARN codificado en los plásmidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4, es decir, el ARN de los viriones que son generados como consecuencia de la transfección de células empaquetadoras con los plásmidos de la invención.The term "standard RNA mix" such as understood in the present invention is a mixture of equal amounts of at least any combination of RNA encoded in plasmids SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, that is, the RNA of the virions that are generated as a result of the transfection of packaging cells with the plasmids of the invention.
La extracción del ARN de los viriones liberados al medio se lleva a cabo mediante sistemas de extracción, de forma que el ARN que se obtenga esté libre de otros ácidos nucleicos o componentes.RNA extraction from released virions the medium is carried out by extraction systems, so that the RNA obtained is free of other nucleic acids or components.
La calidad en el proceso de extracción se evalúa mediante la medida de la concentración y pureza del ARN eluido (ARN recuperado tras el proceso de extracción), que se hace por medio de espectrofotometría y/o fluorimetría. La determinación de la composición del ARN eluido se puede llevar a cabo por medio de la determinación del porcentaje de la presencia en la mezcla de los nucleótidos mutados que se puede obtener por medio de pirosecuenciación.The quality in the extraction process is evaluated by measuring the concentration and purity of eluted RNA (RNA recovered after the extraction process), which is done through spectrophotometry and / or fluorimetry. The determination of the composition of the eluted RNA can be carried out by means of the determination of the percentage of the presence in the mixture of mutated nucleotides that can be obtained by means of Pyrosequencing
Un séptimo aspecto de la presente invención es el uso del plásmido de la invención, o cualquiera de sus combinaciones, para clonar fragmentos del gen pol y de la proteasa del virus VIH-1.A seventh aspect of the present invention is the use of the plasmid of the invention, or any combination thereof, to clone fragments of the pol gene and of the HIV-1 virus protease.
Los fragmentos del gen pol y del gen que codifica para la proteasa proceden de muestras aisladas de personas infectadas. Una vez amplificados los fragmentos, éstos pueden clonarse mediante la linearización por la acción de enzimas de restricción y su posterior ligamiento, es decir, mediante el empleo de técnicas de clonación que forman parte del conocimiento general común. Las enzimas de restricción óptimas para llevar a cabo las clonaciones son los pares de enzimas ApaI/ClaI y ApaI/XmaI para los plásmidos mutados siempre que se hayan empleado cebadores para amplificar los fragmentos deseados de la secuencia del VIH-1 que contengan las secuencias nucleotídicas reconocidas por las enzimas ApaI, ClaI y XmaI. Estos fragmentos solo pueden clonarse en los plásmidos obtenidos en la invención. ApaI es un sitio único común en todas las construcciones de pNL4.3 ya que aparece en la secuencia original.The fragments of the pol gene and the gene that encodes the protease come from isolated samples of infected people. Once the fragments are amplified, they can be cloned by linearization by the action of restriction enzymes and their subsequent ligation, that is, by the use of cloning techniques that are part of the common general knowledge. The optimal restriction enzymes for carrying out the cloning are the Apa I / Cla I and Apa I / Xma I enzyme pairs for mutated plasmids provided primers have been used to amplify the desired fragments of the HIV-1 sequence that contain the nucleotide sequences recognized by the enzymes Apa I, Cla I and Xma I. These fragments can only be cloned into the plasmids obtained in the invention. Apa I is a single common site in all pNL4.3 constructs since it appears in the original sequence.
Tres aspectos más de la presente invención son los usos del plásmido de la invención, o cualquiera de sus combinaciones, los viriones que se obtienen con los plásmidos tal como se ha descrito anteriormente y la célula reporter rsegún el cuarto aspecto de la presente invención, o cualquiera de sus combinaciones, para evaluar la resistencia de fenotipos del virus VIH-1 a antirretrovirales.Three more aspects of the present invention are the uses of the plasmid of the invention, or any combination thereof, virions obtained with plasmids as described above and the reporter cell rsegún the fourth aspect of the present invention, or any of its combinations, to evaluate the resistance of HIV-1 virus phenotypes to antiretrovirals.
El término "fenotipo" hace referencia a cualquier característica detectable de un organismo (estructural, bioquímica, fisiológica o conductual) determinada por una interacción entre su genotipo y el medio en el que se desarrolla.The term "phenotype" refers to any detectable characteristic of an organism (structural, biochemical, physiological or behavioral) determined by a interaction between its genotype and the environment in which it develops
El término "antirretroviral" hace referencia a una sustancia química o fármaco que es capaz de tratar la infección por el virus VIH. Los antirretrovirales actúan en varias etapas del ciclo vital del virus VIH. Los tipos de antirretrovirales pueden ser: Inhibidores de transcriptasa inversa (inhibidores de transcriptasa análogos de nucleósidos, inhibidores de transcriptasa no análogos de nucleótidos (NNRT) e inhibidores de transcriptasa análogos de nucleótidos (NRT)), Inhibidores de proteasa (IP), inhibidores de la integrasa, inhibidores de fusión, anticuerpos monoclonales dirigidos contra co-receptores, además se pueden usar diversas mezclas de los anteriores, así como potenciadores de su efecto.The term "antiretroviral" makes reference to a chemical or drug that is capable of treating HIV virus infection. The antiretrovirals act in several stages of the life cycle of the HIV virus. The types of Antiretrovirals may be: Reverse transcriptase inhibitors (nucleoside analog transcriptase inhibitors, inhibitors of non-nucleotide analog transcriptase (NNRT) and inhibitors of nucleotide analog transcriptase (NRT)), Inhibitors protease (IP), integrase inhibitors, fusion inhibitors, monoclonal antibodies directed against co-receptors, you can also use various mixtures of the above, as well as enhancers of their effect.
Las mutaciones que caracterizan a los virus VIH, cuya tasa de replicación es muy elevada y no tienen sistema de reparación genética, pueden provocar cambios en la resistencia de los virus a los diferentes antirretrovirales que existen en la actualidad. La resistencia puede deberse a cambios en algún aminoácido, estructurales o de cualquier otro tipo que puede tener como consecuencia la pérdida de afinidad del antirretroviral por la proteína con la que interactúa.The mutations that characterize HIV viruses, whose replication rate is very high and have no system of genetic repair, can cause changes in the resistance of the viruses to the different antiretrovirals that exist in the present. Resistance may be due to changes in some amino acid, structural or any other type that may have as a consequence the loss of affinity of the antiretroviral for protein with which it interacts.
Para evaluar la resistencia de diferentes fenotipos de virus VIH a antirretrovirales, es necesaria la clonación, en los plásmidos de la invención, de los fragmentos del gen que codifica para la polimerasa y/o del gen que codifica para la proteasa del virus VIH presente en los pacientes por medio de su amplificación por PCR mediante el uso de un cebador directo común y diferentes cebadores reversos, incluyendo estos últimos, sitios de restricción correspondientes a cada uno de los sitios obtenidos por mutagénesis dirigida en los plásmidos. Posteriormente, se trasnfectarían estos plásmidos en una línea celular empaquetadora, se recogerían los viriones liberados, se emplearían los viriones para infectar células reporter, y tras añadir un antirretroviral a dichas células se mediría la fluorescencia, dando una idea de la resistencia al antirretroviral en cuestión.To evaluate the resistance of different HIV virus phenotypes to antiretrovirals, it is necessary to clone, in the plasmids of the invention, the fragments of the gene encoding the polymerase and / or the gene encoding the HIV virus protease present in patients by means of their PCR amplification through the use of a common direct primer and different reverse primers, including the latter, restriction sites corresponding to each of the sites obtained by plasmid directed mutagenesis. Subsequently, these plasmids would be transfected in a packaging cell line, the released virions would be collected, the virions would be used to infect reporter cells, and after adding an antiretroviral to said cells the fluorescence would be measured, giving an idea of the antiretroviral resistance in question .
Otro aspecto de la presente invención es un método de construcción de un plásmido que comprende:Another aspect of the present invention is a method of construction of a plasmid comprising:
- a.to.
- amplificar la región de ADN del VIH-1 contenida en el plásmido pNL4.3 mediante los cebadores SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6,amplify the DNA region of HIV-1 contained in plasmid pNL4.3 by means of primers SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6,
- b.b.
- clonar la región amplificada en (a) en un vector de expresión,clone the amplified region in (a) in an expression vector,
- c.C.
- realizar mutagénesis dirigidas independientes en el vector del apartado anterior mediante el empleo de pares de cebadores donde el cebador de selección es SEQ ID NO: 11 y el cebador mutagénico se selecciona de la lista que comprende SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10,perform targeted mutagenesis independent in the vector of the previous section through employment of primer pairs where the selection primer is SEQ ID NO: 11 and the mutagenic primer is selected from the list comprising SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10,
- d.d.
- reclonar de forma independiente cada uno de los 4 fragmentos obtenidos obtenidos en (c), en el vector original pNL4.3.independently reclon each one of the 4 fragments obtained obtained in (c), in the vector original pNL4.3.
Para la construcción de los cuatro plásmidos de la invención se ha llevado a cabo un procedimiento estándar de mutagénesis dirigida que se realizo mediante amplificación por PCR de la región de ADN del VIH-1 contenida en el plásmido pNL4.3 con los cebadores que se describen en el paso (a) del presente aspecto. Esta región se clona en un vector de expresión como por ejemplo el vector TOPO TA (Invitrogen) por el procedimiento que indica el proveedor de dicho vector. Un vector de expresión se define como aquel vector que se puede utilizar para clonar al menos un gen y además contiene las secuencias reguladoras necesarias para que la expresión del gen pueda someterse a experimentación. Este tipo de vectores posee, al menos, un origen de replicación, un marcador de selección, uno o varios sitios de clonación.For the construction of the four plasmids of the invention has been carried out a standard procedure of directed mutagenesis that was performed by PCR amplification of the region of HIV-1 DNA contained in the plasmid pNL4.3 with the primers described in step (a) of the present aspect. This region is cloned into an expression vector such as the TOPO TA vector (Invitrogen) by the procedure which indicates the provider of said vector. An expression vector is defined as that vector that can be used to clone at least a gene and also contains the regulatory sequences necessary for that gene expression can undergo experimentation. This type of vectors has at least one origin of replication, a selection marker, one or several cloning sites.
Tras sucesivas digestiones y realización de electroforesis en geles de agarosa, o bien secuenciación, se puede comprobar la correcta orientación de la región amplificada. Posteriormente se llevan a cabo cuatro procedimientos de mutagénesis dirigida de forma individual que origina los plásmidos que se reivindican en la presente invención. Para poder llevar a cabo el procedimiento de mutagénesis dirigida, se puede emplear el "Transformer site-directed mutagenesis kit" y los siguientes cebadores: cebador de selección SEQ ID NO: 11 y cebador mutagénico seleccionado de la lista que comprende SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. Tras obtener las mutaciones en cada uno de los plásmidos de manera independiente se puede seleccionar el fragmento de ADN comprendido entre los sitios de restricción ApaI/PflmI y reclonarlo en el vector original pNL4.3 tras ser digerido previamente con los mismos enzimas de restricción ApaI y PflmI, en este caso. La presente descripción no limita el uso de otros vectores de expresión, métodos de llevar a cabo la mutagénesis dirigida así como los enzimas de restricción necesarios para reclonar el fragmento amplificado.After successive digestions and electrophoresis in agarose gels, or sequencing, the correct orientation of the amplified region can be verified. Subsequently, four processes of individually directed mutagenesis are carried out that originate the plasmids claimed in the present invention. In order to carry out the directed mutagenesis procedure, the " Transformer site-directed mutagenesis kit " and the following primers can be used: selection primer SEQ ID NO: 11 and mutagenic primer selected from the list comprising SEQ ID NO: 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10. After obtaining the mutations in each of the plasmids independently, the DNA fragment between the Apa I / Pflm I restriction sites can be selected and recloning it into the original vector pNL4.3 after being previously digested with the same restriction enzymes Apa I and Pflm I, in this case. The present description does not limit the use of other expression vectors, methods of carrying out the directed mutagenesis as well as the restriction enzymes necessary to reclon the amplified fragment.
Por otra parte, el plásmido original del que se amplifica una región determinada de ADN del virus VIH-1 y en el cual se reclona el fragmento una vez realizadas las mutaciones descritas en la presente invención, podría ser otro distinto al pNL4.3 como por ejemplo, el plásmido pCHUS. El plásmido pCHUS es un plásmido mínimo desarrollado y publicado por los inventores de la presente invención que contiene el genoma completo del VIH-1 procedente del vector pNL4.3, así como el gen de resistencia a ampicilina y el origen de replicación derivados de pUC18, que permiten su propagación en E. coli. El plásmido tiene un tamaño de 11.538 bp y posee varios sitios de restricción únicos nuevos. Este vector minimizado puede facilitar no sólo su propia manipulación genética, sino también los procesos de transformación tanto en E. coli como en otros cultivos celulares e incluso podría permitir la mutagénesis in vitro directamente, sin necesidad de clonaciones y subclonaciones, siendo una alternativa compatible con las utilidades antes indicadas.On the other hand, the original plasmid from which a particular region of HIV-1 virus DNA is amplified and in which the fragment is reclining once the mutations described in the present invention could be made, could be another one different from pNL4.3 as per example, plasmid pCHUS. Plasmid pCHUS is a minimum plasmid developed and published by the inventors of the present invention that contains the complete HIV-1 genome from the pNL4.3 vector, as well as the ampicillin resistance gene and the origin of replication derived from pUC18, that allow its propagation in E. coli . The plasmid is 11,538 bp in size and has several new unique restriction sites. This minimized vector can facilitate not only its own genetic manipulation, but also the transformation processes in both E. coli and other cell cultures and could even allow in vitro mutagenesis directly, without the need for cloning and subcloning, being an alternative compatible with the utilities indicated above.
Otro aspecto de la presente invención es un kit para evaluar la calidad de los sistemas de extracción de ácidos nucleicos que comprende una mezcla estándar de ADN y/o ARN.Another aspect of the present invention is a kit to evaluate the quality of acid extraction systems nucleic acids comprising a standard mixture of DNA and / or RNA.
La mezcla estándar de ADN es una mezcla de cantidades iguales de al menos cualquier combinación de los plásmidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4. La mezcla estándar de ARN es una mezcla de cantidades iguales de al menos cualquier combinación del ARN codificado en los plásmidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4, es decir, el ARN de los viriones que son generados como consecuencia de la transfección de células empaquetadoras con los plásmidos de la invención. Las mezclas anteriores no excluyen la adición de otros ADNs y/o ARNs como por ejemplo el plásmido original pNL4.3 y/o el ARN codificado por la secuencia nucleotídica de los viriones obtenidos por la transfección de células empaquetadoras con pNL4.3.The standard DNA mixture is a mixture of equal amounts of at least any combination of the plasmids SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4. The standard RNA mixture is a mixture of equal amounts of at least any combination of the RNA encoded in plasmids SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, is say, the RNA of the virions that are generated as a result of the transfection of packaging cells with the plasmids of the invention. The above mixtures do not exclude the addition of others DNAs and / or RNAs such as the original plasmid pNL4.3 and / or the RNA encoded by the nucleotide sequence of virions obtained by the transfection of packaging cells with pNL4.3.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants not they intend to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be partly detached of the description and in part of the practice of the invention. The following figures and examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
Fig 1. Muestra el mapa genético del plásmido pNL4.3 CLA 4254 definido por la secuencia SEQ ID NO: 1.Fig 1. Shows the genetic map of plasmid pNL4.3 CLA 4254 defined by the sequence SEQ ID NO: 1 .
En el mapa se muestra la posición relativa de los genes gag (GAG), pol (POL), env (ENV) y otros fragmentos (LTR; Long Terminal Repeat, pUC18; fragmento procedente del vector pUC18,...) así como los sitios de restricción más comunes para llevar a cabo cortes por enzimas de restricción. También se muestra la posición de la mutación que da lugar a este plásmido, en el nucleótido que ocupa la posición 4254.The map shows the relative position of the genes gag (GAG), pol (POL), env (ENV) and other fragments (LTR; Long Terminal Repeat , pUC18; fragment from the vector pUC18, ...) as well as the most common restriction sites for restriction enzyme cuts. The position of the mutation that gives rise to this plasmid is also shown, in the nucleotide that occupies position 4254.
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Fig 2. Muestra el mapa genético del plásmido pNL4.3 XMA 4411 definido por la secuencia SEQ ID NO: 2.Fig 2. Shows the genetic map of plasmid pNL4.3 XMA 4411 defined by the sequence SEQ ID NO: 2 .
En el mapa se muestra la posición relativa de los genes gag (GAG), pol (POL), env (ENV) y otros fragmentos (LTR; Long Terminal Repeat, pUC18; fragmento procedente del vector pUC18,...) así como los sitios de restricción más comunes para llevar a cabo cortes por enzimas de restricción. También se muestra la posición de la mutación que da lugar a este plásmido, en el nucleótido que ocupa la posición 4411.The map shows the relative position of the genes gag (GAG), pol (POL), env (ENV) and other fragments (LTR; Long Terminal Repeat , pUC18; fragment from the vector pUC18, ...) as well as the most common restriction sites for restriction enzyme cuts. It also shows the position of the mutation that gives rise to this plasmid, in the nucleotide that occupies position 4411.
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Fig 3. Muestra el mapa genético del plásmido pNL4.3 XMA 4634 definido por la secuencia SEQ ID NO: 3.Fig 3. Shows the genetic map of plasmid pNL4.3 XMA 4634 defined by the sequence SEQ ID NO: 3 .
En el mapa se muestra la posición relativa de los genes gag (GAG), pol (POL), env (ENV) y otros fragmentos (LTR; Long Terminal Repeat, pUC18; fragmento procedente del vector pUC18,...) así como los sitios de restricción más comunes para llevar a cabo cortes por enzimas de restricción. También se muestra la posición de la mutación que da lugar a este plásmido, en el nucleótido que ocupa la posición 4634.The map shows the relative position of the genes gag (GAG), pol (POL), env (ENV) and other fragments (LTR; Long Terminal Repeat , pUC18; fragment from the vector pUC18, ...) as well as the most common restriction sites for restriction enzyme cuts. It also shows the position of the mutation that gives rise to this plasmid, in the nucleotide that occupies position 4634.
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Fig 4. Muestra el mapa genético del plásmido pNL4.3 CLA 4696 definido por la secuencia SEQ ID NO: 4.Fig 4. Shows the genetic map of plasmid pNL4.3 CLA 4696 defined by the sequence SEQ ID NO: 4 .
En el mapa se muestra la posición relativa de los genes gag (GAG), pol (POL), env (ENV) y otros fragmentos (LTR; Long Terminal Repeat, pUC18; fragmento procedente del vector pUC18,...) así como los sitios de restricción más comunes para llevar a cabo cortes por enzimas de restricción. También se muestra la posición de la mutación que da lugar a este plásmido, en el nucleótido que ocupa la posición 4696.The map shows the relative position of the genes gag (GAG), pol (POL), env (ENV) and other fragments (LTR; Long Terminal Repeat , pUC18; fragment from the vector pUC18, ...) as well as the most common restriction sites for restriction enzyme cuts. It also shows the position of the mutation that gives rise to this plasmid, in the nucleotide that occupies position 4696.
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Fig 5. Muestra el patrón de migración en gel de agarosa de los diferentes fragmentos diferenciales de los plásmidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4.Fig 5. Shows the agarose gel migration pattern of the different differential fragments of the plasmids defined by the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 .
Patrón electroforético de los cortes de los plásmidos con enzimas de restricción: (A) Control PM, (B) pNL4.3 cortado con ApaI y PinAI (fragmento 1480 bp), (C) pNL4.3 C4254 (SEQ ID NO: 1) cortado con ApaI y ClaI (fragmento 2248 bp), (D) pNL4.3 X4411 (SEQ ID NO: 2) cortado con ApaI y XmaI (fragmento 2405 bp), (E) pNL4.3 X4634 (SEQ ID NO: 3) cortado con ApaI y XmaI (fragmento 2628 bp) y (F) pNL4.3 X4696 (SEQ ID NO: 4) cortado con ApaI y ClaI (fragmento 2690 bp).Electrophoretic pattern of plasmid cuts with restriction enzymes: (A) PM Control, (B) pNL4.3 cut with Apa I and Pin AI (fragment 1480 bp), (C) pNL4.3 C4254 (SEQ ID NO: 1) cut with Apa I and Cla I (fragment 2248 bp), (D) pNL4.3 X4411 (SEQ ID NO: 2) cut with Apa I and Xma I (fragment 2405 bp), (E) pNL4.3 X4634 ( SEQ ID NO: 3) cut with Apa I and Xma I (fragment 2628 bp) and (F) pNL4.3 X4696 (SEQ ID NO: 4) cut with Apa I and Cla I (fragment 2690 bp).
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Fig 6. Muestra los pasos del análisis fenotípico de resistencias de VIH-1 a antirretrovirales.Fig 6. It shows the steps of the phenotypic analysis of resistance of HIV-1 to antiretrovirals .
En esta figura se muestra el esquema de los procesos llevados a cabo para evaluar la resistencia de los diferentes virus VIH-1 a antirretrovirales.This figure shows the scheme of processes carried out to assess the resistance of different HIV-1 viruses to antiretrovirals.
El plásmido construido se transfecta en células 293T/17. Los viriones infecciosos con el fragmento del gen pol se titulan en células MT2 formadoras de sinticios y, a continuación, se infectan células CEM-GFP para que pueda medirse el nivel de fluorescencia emitida tras añadir fármacos antirretrovirales.The constructed plasmid is transfected into 293T / 17 cells. Infectious virions with the pol gene fragment are titrated into MT2 cells forming syncytia and then CEM-GFP cells are infected so that the level of fluorescence emitted after adding antiretroviral drugs can be measured.
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Fig 7. Muestra un ejemplo demostrativo de las curvas de inhibición de las células CEM-GFP infectadas con SEQ ID NO: 1 respecto de las infectadas con pNL4.3 (control) cuando son tratadas con el antirretroviral INDINAVIR.Fig 7. Shows a demonstrative example of the inhibition curves of CEM-GFP cells infected with SEQ ID NO: 1 with respect to those infected with pNL4.3 (control) when treated with the INDINAVIR antiretroviral .
NL4.3 con la mutación 4254 hace referencia a SEQ ID NO: 1.NL4.3 with mutation 4254 refers to SEQ ID NO: 1.
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Fig 8. Muestra un ejemplo demostrativo de las curvas de inhibición de las células CEM-GFP infectadas con SEQ ID NO: 2 respecto de las infectadas con pNL4.3 (control) cuando son tratadas con un antirretroviral INDINAVIR.Fig 8. Shows a demonstrative example of the inhibition curves of CEM-GFP cells infected with SEQ ID NO: 2 with respect to those infected with pNL4.3 (control) when treated with an INDINAVIR antiretroviral .
NL4.3 con la mutación 4411 hace referencia a SEQ ID NO: 2.NL4.3 with mutation 4411 refers to SEQ ID NO: 2.
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Fig 9. Muestra un ejemplo demostrativo de las curvas de inhibición de las células CEM-GFP infectadas con SEQ ID NO: 4 respecto de las infectadas con pNL4.3 (control) cuando son tratadas con un antirretroviral INDINAVIR.Fig 9. Shows a demonstrative example of the inhibition curves of CEM-GFP cells infected with SEQ ID NO: 4 with respect to those infected with pNL4.3 (control) when treated with an INDINAVIR antiretroviral .
NL4.3 con la mutación 4696 hace referencia a SEQ ID NO: 4.NL4.3 with mutation 4696 refers to SEQ ID NO: 4.
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen la obtención de los nuevos plásmidos y su ensayo en la evaluación de los sistemas de extracción de ácidos nucleicos así como en la evaluación de su resistencia a antirretrovirales.The invention will be illustrated below by means of tests carried out by the inventors that describe the obtaining the new plasmids and their test in the evaluation of nucleic acid extraction systems as well as in the evaluation of its resistance to antiretrovirals.
Las construcciones se crearon con mutaciones dirigidas a un sitio concreto en el gen pol del virus VIH-1.The constructs were created with mutations directed to a specific site in the pol gene of the HIV-1 virus.
Para ello, la región del pNL4.3 entre los lugares de secuencia 1548 y 5979 se amplificó con el cebador directo SEQ ID NO: 5 y con el cebador reverso SEQ ID NO: 6. Ambos corresponden a porciones de secuencia en el gen pol, se usó con este propósito polimerasa de alta fidelidad (Expand high fidelity PCR System). El fragmento amplificado se clonó en el vector TOPO TA (Invitrogen). Una vez probada la correcta orientación de los insertos realizados se procedió a llevar a cabo cuatro de mutagénesis dirigidas individuales (Transformer Site-Directed Mutagénesis Kit (Clontech)) usando los cuatro cebadores para mutagénesis siguientes: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.For this, the region of pNL4.3 between sequence sites 1548 and 5979 was amplified with the direct primer SEQ ID NO: 5 and with the reverse primer SEQ ID NO: 6. Both correspond to portions of sequence in the pol gene, High fidelity PCR System was used for this purpose. The amplified fragment was cloned into the TOPO TA vector (Invitrogen). Once the correct orientation of the inserts was tested, four individual directed mutagenesis ( Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit ( Clontech )) were carried out using the four primers for the following mutagenesis: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
Se utilizó otro cebador para selección que incluye el sitio de restricción NcoI definida por la secuencia SEQ ID NO: 11. Tras obtener las mutaciones se cortó el fragmento, ApaI/PflmI que incluye cada mutación y se reinsertó en el fragmento correspondiente obtenido en pNL4.3, de esta forma se obtuvieron los cuatro plásmidos mutados.Another primer was used for selection that includes the Nco I restriction site defined by the sequence SEQ ID NO: 11. After obtaining the mutations, the fragment, Apa I / Pflm I including each mutation was cut and reinserted into the corresponding fragment obtained in pNL4.3, in this way the four mutated plasmids were obtained.
Los cuatro plásmidos que se obtuvieron tras el proceso de mutagénesis dirigida fueron:The four plasmids that were obtained after Process of directed mutagenesis were:
- SEQ ID NO: 1 (pNL4.3 CLA 4254) (Fig 1): Se sustituyó el nucleótido que ocupaba la posición 4243 del plásmido original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió el codón ATA (codifica para el aminoácido isoleucina) por ATC (también codifica para el aminoácido isoleucina), generándose de ese modo un nuevo sitio de restricción ClaI. El fragmento generado va desde la posición que ocupa el sitio de restricción ApaI a ClaI con un tamaño de 2248 pb.- SEQ ID NO: 1 (pNL4.3 CLA 4254) (Fig 1): The nucleotide occupying position 4243 of the original plasmid pNL4.3 corresponding to the pol gene that changed the ATA codon (encoding the amino acid isoleucine) was replaced by ATC (also encodes the amino acid isoleucine), thereby generating a new Cla I restriction site. The fragment generated goes from the position occupied by the Apa I to Cla I restriction site with a size of 2248 bp.
- SEQ ID NO: 2 (pNL4.3 XMA 4411) (Fig 2): Se sustituyó el nucleótido que ocupaba la posición 4403 del plásmido original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió el codón CCA (codifica para el aminoácido prolina) por CCG (también codifica para el aminoácido prolina), generándose de ese modo un nuevo sitio de restricción XmaI. El fragmento generado va desde la posición que ocupa el sitio de restricción ApaI a XmaI con un tamaño de 2405 pb.- SEQ ID NO: 2 (pNL4.3 XMA 4411) (Fig 2): The nucleotide occupying position 4403 of the original plasmid pNL4.3 corresponding to the pol gene that changed the CCA codon (encoding the proline amino acid) was replaced by CCG (also encodes the amino acid proline), thereby generating a new restriction site Xma I. The fragment generated goes from the position occupied by the restriction site Apa I to Xma I with a size of 2405 bp.
- SEQ ID NO: 3 (pNL4.3 XMA 4634) (Fig 3): Se sustituyeron dos nucleótidos que ocupaban las posiciones 4625 y 4626 del plásmido original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió la secuencia TGGGCG por TGCCCG. Se produjeron dos cambios de aminoácido TGG (codifica para el aminoácido triptófano) por TGC (codifica para el aminoácido cisteína) y GCG (codifica para el aminoácido alanina) por CCG (codifica para el aminoácido prolina), generándose de ese modo un nuevo sitio de restricción XmaI. El fragmento generado va desde la posición que ocupa el sitio de restricción ApaI a XmaI con un tamaño de 2628 pb. El virus producido resultó no infeccioso e incapaz de producir sinticios, por tanto, puede ser considerado como control negativo.- SEQ ID NO: 3 (pNL4.3 XMA 4634) (Fig 3): Two nucleotides occupying positions 4625 and 4626 of the original plasmid pNL4.3 corresponding to the pol gene that changed the TG GG CG sequence to TG CC CG were replaced . Two changes of the amino acid TGG (coding for the amino acid tryptophan) were produced by TGC (encoding the amino acid cysteine) and GCG (encoding the amino acid alanine) by CCG (encoding the amino acid proline), thereby generating a new site of Xma I restriction. The fragment generated goes from the position occupied by the restriction site Apa I to Xma I with a size of 2628 bp. The virus produced was non-infectious and unable to produce sites, therefore, it can be considered as a negative control.
- SEQ ID NO: 4 (pNL4.3 CLA 4696) (Fig 4): Se sustituyó el nucleótido que ocupaba la posición 4688 del plásmido original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió el codón TCT (codifica para el aminoácido serina) por TCG (también codifica para el aminoácido serina), generándose de ese modo un nuevo sitio de restricción ClaI. El fragmento generado va desde la posición que ocupa el sitio de restricción ApaI a ClaI con un tamaño de 2690 pb.- SEQ ID NO: 4 (pNL4.3 CLA 4696) (Fig 4): The nucleotide occupying position 4688 of the original plasmid pNL4.3 corresponding to the pol gene that changed the TCT codon (encoding the serine amino acid) was replaced by TCG (also encodes the serine amino acid), thereby generating a new Cla I restriction site. The fragment generated goes from the position occupied by the Apa I to Cla I restriction site with a size of 2690 bp.
El control de las mutaciones se llevó a cabo mediante digestión de los plásmidos con las enzimas de restricción apropiadas así como mediante la secuenciación de las construcciones. En la columna 1 de la Fig 5 se muestra el patrón de bandas de un ADN control cuyo tamaño de banda (nº de pares de bases) es conocido y por tanto, sirve de referencia para determinar el tamaño de las bandas obtenidas tras la digestión de cada uno de los plásmidos construidos. En el resto de columnas se muestran dos bandas correspondientes a ADN lineal obtenido mediante corte por digestión de los enzimas de restricción ApaI/Pin AI, ApaI/ClaI, ApaI/XmaI, ApaI/XmaI y ApaI/ClaI que proceden de los plásmidos pNL4.3 (plásmido original), p4254 (SEQ ID NO: 1), p4411 (SEQ ID NO: 2), p4634 (SEQ ID NO: 3) y p4696 (SEQ ID NO: 4), respectivamente. La banda más grande (migra más lentamente), correspondiente a cada uno de los plásmidos, pertenece a la mayor parte del ADN del plásmido y las bandas más pequeñas (migran más lentamente) pertenecen al ADN de parte del gen gag y pol del virus VIH-1.Mutation control was carried out by digestion of the plasmids with the appropriate restriction enzymes as well as by sequencing the constructs. Column 1 of Fig 5 shows the pattern of bands of a control DNA whose band size (number of base pairs) is known and therefore serves as a reference to determine the size of the bands obtained after digestion of each of the plasmids constructed. The remaining columns show two bands corresponding to linear DNA obtained by digestion of the restriction enzymes Apa I / Pin AI, Apa I / Cla I, Apa I / Xma I, Apa I / Xma I and Apa I / Cla I originating from plasmids pNL4.3 (original plasmid), p4254 (SEQ ID NO: 1), p4411 (SEQ ID NO: 2), p4634 (SEQ ID NO: 3) and p4696 (SEQ ID NO: 4) respectively. The largest band (migrates more slowly), corresponding to each of the plasmids, belongs to most of the plasmid DNA and the smallest bands (migrates more slowly) belong to the DNA from the gag and pol gene of the HIV virus -one.
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Utilizando métodos fluorométricos y espectrofotométricos para calcular los contenidos de ADN circular y lineal, se construyó un estándar. Dicho estándar incluye las cuatro especies de ADN plasmídico de la presente invención más el plásmido original pNL4.3. Un ejemplo de la aplicación de este estándar es su uso con varios sistemas que usan nanopartículas magnéticas o un sistema comercial de extracción por columnas de filtración de uso habitual.Using fluorometric methods and spectrophotometric to calculate the contents of circular DNA and linear, a standard was built. This standard includes the four plasmid DNA species of the present invention plus the plasmid original pNL4.3. An example of the application of this standard is its use with several systems that use magnetic nanoparticles or a commercial use filtration column extraction system habitual.
El ADN de la mezcla estándar se aplicó a los sistemas de extracción. El ADN presente en la mezcla estándar es ADN plasmídico previamente obtenido desde una plasmiprep y mezclado después de digerir (con ApaI) para obtener el ADN linearizado o sin digerir. Éste ADN se valoró por fluorimetría y se mezclaron volúmenes equivalentes de los cinco plásmidos. Se utilizó una concentración de partida de 2740 ng, pero pueden usarse otras concentraciones obtenidas por concentración mediante precipitación con etanol o por dilución que pueden permitir el diseño de curvas de saturación que permita valorar el rendimiento de cualquier proceso de extracción. Otra alternativa que plantean los inventores es el empleo del sobrenadante de cultivo de células 293T transfectadas con cada uno de los plásmidos. De esta forma la mezcla estaría compuesta, en lugar de ADN lineal o circular, por los cinco tipos de viriones y su ácido nucleico sería ARN. La concentración de cada plásmido puede variarse y la de los viriones titularse de forma independiente con células MT2 o valorando la presencia de la proteína p24 (que es sintetizada si el virión es infectivo).The DNA of the standard mixture was applied to the extraction systems. The DNA present in the standard mixture is plasmid DNA previously obtained from a plasmiprep and mixed after digesting (with Apa I) to obtain linearized or undigested DNA. This DNA was titrated by fluorimetry and equivalent volumes of the five plasmids were mixed. A starting concentration of 2740 ng was used, but other concentrations obtained by concentration by precipitation with ethanol or by dilution that can allow the design of saturation curves that allow the performance of any extraction process to be evaluated can be used. Another alternative proposed by the inventors is the use of the culture supernatant of 293T cells transfected with each of the plasmids. In this way the mixture would be composed, instead of linear or circular DNA, of the five types of virions and their nucleic acid would be RNA. The concentration of each plasmid can be varied and that of the virions can be titrated independently with MT2 cells or by assessing the presence of the p24 protein (which is synthesized if the virion is infective).
En la tabla 1 se muestran los valores iniciales de la mezcla estándar y los porcentajes de cada población obtenidos tras pasar la muestra estándar (como ADN lineal, tras corte con el enzima ApaI, o como ADN circular, en forma circular) por varios sistemas de extracción automática comerciales: Siemens, Easymag (Biomerieux), Ampliprep, Magnapure (Roche) y Qiagen. Todos ellos están basados en nanopartículas magnéticas y extracción estándar en Qiagen (basado en filtración por columna).Table 1 shows the initial values of the standard mixture and the percentages of each population obtained after passing the standard sample (as linear DNA, after cutting with the Apa I enzyme, or as circular DNA, in circular form) by various systems. Commercial automatic extraction: Siemens, Easymag (Biomerieux), Ampliprep, Magnapure (Roche) and Qiagen. All of them are based on magnetic nanoparticles and standard extraction in Qiagen (based on column filtration).
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La capacidad de extracción de los diferentes ácidos nucleicos integrados en la mezcla estándar se puede evaluar, tras la extracción del ADN, por análisis clonal por pirosecuenciación.The extraction capacity of the different nucleic acids integrated into the standard mixture can be evaluated, after DNA extraction, by clonal analysis by Pyrosequencing
Así pues, cada set de cebadores permite analizar el porcentaje de presencia de especies de ADN con el nucleótido (SNP) mutado o sin mutar, cada set corresponde a cada una de las mutaciones estudiadas y nos permite ver si las especies individuales de ADN extraído se ven afectadas en el proceso de absorción inespecífica que tiene lugar al utilizar diferentes nanopartículas o matrices durante la extracción. Para llevar a cabo la pirosecuenciación se ha empleado el sistema PYROMARK (Isogen):Thus, each set of primers allows to analyze the percentage of presence of DNA species with the nucleotide (SNP) mutated or not mutated, each set corresponds to each of the studied mutations and allows us to see if individual species of extracted DNA are affected in the absorption process nonspecific that takes place when using different nanoparticles or matrices during extraction. To carry out the Pyrosequencing has been used the PYROMARK (Isogen) system:
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Los set de cebadores son:The primer sets are:
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Los porcentajes de las bases nucleotídicas que integran las secuencias de cada uno de los sets, se describen en la tabla 6.The percentages of the nucleotide bases that they integrate the sequences of each of the sets, they are described in the table 6.
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Mediante el empleo de la técnica de amplificación por RT-PCRs se obtuvieron fragmentos del gen pol del virus VIH-1 de pacientes infectados. Se usaron los pares de cebadores SEQ ID NO: 12 (cebador directo con el sitio de restricción ApaI) y SEQ ID NO: 7 (cebador reverso con el sitio de restricción ClaI), SEQ ID NO: 8 (cebador reverso con el sitio de restricción XmaI), SEQ ID NO: 9 (cebador reverso con el sitio de restricción XmaI) o SEQ ID NO: 10 (cebador reverso con el sitio de restricción ClaI).Using the technique of amplification by RT-PCRs, fragments of the pol gene of the HIV-1 virus were obtained from infected patients. Primer pairs SEQ ID NO: 12 (direct primer with restriction site Apa I) and SEQ ID NO: 7 (reverse primer with restriction site Cla I) were used, SEQ ID NO: 8 (reverse primer with restriction site Xma I), SEQ ID NO: 9 (reverse primer with restriction site Xma I) or SEQ ID NO: 10 (reverse primer with restriction site Cla I).
Los cebadores fueron diseñados con la ayuda del programa Primer3 Output (http://www-genome.wi.mit.edu) incluyendo el sitio de restricción de ApaI en el cebador directo y el XmaI/ClaI en cada cebador reverso, necesarios para el posterior ligamiento de los fragmentos de ApaI-XmaI/ClaI del paciente en cada uno de los cuatro plásmidos generados.The primers were designed with the help of the Primer3 Output program (http://www-genome.wi.mit.edu) including the Apa I restriction site in the direct primer and the Xma I / Cla I in each reverse primer, necessary for the subsequent ligation of the Apa I- Xma I / Cla I fragments of the patient in each of the four plasmids generated.
Es decir, se generaron cuatro alternativas viables para la construcción de virus para el análisis de resistencias fenotípicas con fragmentos más largos que los tradicionalmente usados ApaI-PlnAI.That is, four viable alternatives were generated for the construction of viruses for the analysis of phenotypic resistances with fragments longer than those traditionally used Apa I- Pln AI.
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Experimento IExperiment I
Para construir un sistema de valoración fenotípica de la infección del VIH-1, que ampliase las posibilidades de pseudotipado del virus VIH-1 con el fragmento de la región gag-pol estudiada actualmente (ApaI2010-PinAI3486 = 1476 pb), fueron introducidas en el gen pol cuatro mutaciones mediante mutagénesis dirigida de manera que se formaran cuatro nuevos sitios de reconocimiento para enzimas de restricción (dos sitios para ClaI y dos para XmaI). De este modo se amplían los posibles fragmentos genéticos a estudiar en los virus recombinados a 2248, 2405, 2628 y 2690 pb hasta abarcar toda la región de la proteasa y de la retrotranscriptasa.To construct a phenotypic assessment system for HIV-1 infection, which expanded the chances of HIV-1 virus pseudotyping with the gag - pol region fragment currently studied ( Apa I2010- Pin AI3486 = 1476 bp), were introduced in the pol gene four mutations by directed mutagenesis so that four new recognition sites for restriction enzymes will be formed (two sites for Cla I and two for Xma I). In this way, the possible genetic fragments to be studied in the viruses recombined at 2248, 2405, 2628 and 2690 bp are extended to cover the entire region of the protease and retrotranscriptase.
Las mutaciones se realizaron en el vector pNL4.3, tras lo cual cada uno fue transfectado mediante fosfato cálcico en la línea celular empaquetadora 293-T. 48-72 horas post-transfección se cosecharon los sobrenadantes que contenían los viriones liberados al medio y se titularon por el método de formación de sincitios en la línea celular MT-2. En este punto conviene recordar que el virus que incluye el plásmido definido por SEQ ID NO: 3 (pNL4.3X4634) (Fig 3) resultó no infeccioso e incapaz de producir sinticios, por tanto, puede ser considerado como control negativo. Se utilizaron inóculos virales de 5x10^{5} dosis infectivas/ml para infectar células reporter CEM-GFP. Los ensayos de infección in vitro se optimizaron y protocolizaron para su aplicación en la determinación de la replicación viral (Fig 6).The mutations were made in the pNL4.3 vector, after which each was transfected by calcium phosphate in the 293-T packaging cell line. 48-72 hours after transfection, the supernatants containing the virions released to the medium were harvested and titrated by the syncytium formation method in the MT-2 cell line. At this point it should be remembered that the virus that includes the plasmid defined by SEQ ID NO: 3 (pNL4.3X4634) (Fig 3) was non-infectious and unable to produce sites, therefore, it can be considered as a negative control. Viral inoculums of 5x105 infective doses / ml were used to infect CEM-GFP reporter cells. In vitro infection assays were optimized and protocolized for application in the determination of viral replication (Fig 6).
Las células CEM-GFP son células T humanas que contienen un promotor LTR (Long Terminal Repeat) que dirigen la expresión de la proteína "reporter" GFP (Green Fluorescent Protein). El promotor LTR tiene una región, transactivating responsive sequence (TAR), que reconoce la proteína TAT (Trans-activating proteína). La proteína TAT es liberada al medio extracelular por las células infectadas y es recogida por las células sanas donde activa la replicación del virus VIH induciendo la fosforilación del dominio C-terminal de la ARN polimerasa II. Las células infectadas por el virus VIH (en el caso de esta invención, los plásmidos que contienen la secuencia de los genes gag-pol del virus) expresan el gen GFP tanto más cuanto mayor es la infección. De este modo, cuando se añade un antirretroviral después de una infección por VIH, la medida de la expresión del gen GFP variará en base al nivel de resistencia del virus infectado.CEM-GFP cells are human T cells that contain an LTR promoter ( Long Terminal Repeat ) that direct the expression of the GFP ( Green Fluorescent Protein ) " reporter " protein. The LTR promoter has a region, transactivating responsive sequence (TAR), that recognizes the TAT (Trans-activating protein) protein. The TAT protein is released to the extracellular medium by infected cells and is collected by healthy cells where it activates HIV virus replication by inducing phosphorylation of the C-terminal domain of RNA polymerase II. Cells infected by the HIV virus (in the case of this invention, plasmids containing the sequence of the virus's gag - pol genes) express the GFP gene all the more the greater the infection. Thus, when an antiretroviral is added after an HIV infection, the measure of GFP gene expression will vary based on the level of resistance of the infected virus.
Las mediciones de los niveles de fluorescencia emitidos por las células en cultivo en cada caso fueron realizadas mediante fluorimetría, procesadas en una hoja de cálculo creada con el programa Excel (Microsoft) y utilizada para el cálculo de las IC 50 que se realizó con el programa GraFit32.Measurements of fluorescence levels emitted by the cells in culture in each case were performed by fluorimetry, processed in a spreadsheet created with the Excel program (Microsoft) and used to calculate the IC 50 that was carried out with the GraFit32 program.
Se ensayaron in vitro infecciones del plásmido base pNL4.3, de un plásmido semejante pero con mutaciones que lo hacen resistente a inhibidores de proteasa, pL10R/M46I/L63P/V82T/184V* (L10R), y de los plásmidos de la presente invención, mutados en el gen pol. A partir de los resultados obtenidos en estos ensayos se pudo establecer la dinámica de la infección con estos virus y comparar su comportamiento modificando de forma secuencial las características de su gen pol. In vitro infections of the plasmid base pNL4.3, of a similar plasmid but with mutations that make it resistant to protease inhibitors, pL10R / M46I / L63P / V82T / 184V * (L10R), and of the plasmids of the present invention were tested , mutated in the pol gene. From the results obtained in these tests, it was possible to establish the dynamics of infection with these viruses and compare their behavior by sequentially modifying the characteristics of their pol gene.
Tras los primeros resultados, se consiguieron testar las construcciones de la presente invención con los métodos de la empresa VIRCO. Los resultados se presentan en la tabla 7.After the first results, they were achieved test the constructions of the present invention with the methods of the company VIRCO. The results are presented in table 7.
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- Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor (NRTI), Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor (NRTI),
- Non-Nucleoside Reverse Transcriptase lnhibitor (NNRTI), Non-Nucleoside Reverse Transcriptase lnhibitor (NNRTI),
- Protease Inhibitor (IP) Protease Inhibitor (IP)
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Los resultados realizados por triplicado y en colaboración con VIRCO (Mechelen (Bélgica)) mostraron la concordancia entre las predicciones fenotípicas y genotípicas al comparar los resultados del fenotipado con las predicciones del sistema VIRCOType.The results performed in triplicate and in collaboration with VIRCO (Mechelen (Belgium)) showed the agreement between the phenotypic and genotypic predictions when comparing the results of the phenotyping with the predictions of the VIRCOType system.
El valor a partir del cual se considera resistente fue establecido por la empresa VIRCO (www.vircolab.com) y se basa en valores en la lectura de fluorescencia de más de 3 y criterios de respuesta clínica.The value from which it is considered resistant was established by the company VIRCO (www.vircolab.com) and It is based on values in the fluorescence reading of more than 3 and clinical response criteria.
Conclusión preliminar: Las construcciones realizadas y su funcionamiento tras la inclusión de los fragmentos correspondientes posibilita el trabajo con fragmentos más amplios y es aplicable al estudio de efectos de mutaciones a más distancia de las convencionales ApaI-PinAI.Preliminary conclusion: The constructions made and their operation after the inclusion of the corresponding fragments make it possible to work with larger fragments and is applicable to the study of effects of mutations at a greater distance than the conventional Apa I- Pin AI.
Experimento IIExperiment II
Se ha desarrollado según lo previsto en el proyecto un método de evaluación de las resistencias fenotípicas propio. Dicho método presentó diferencias con las estrategias de evaluación del método desarrollado por VIRCO o Virologic pero los resultados obtenidos fueron coherentes con los obtenidos en las pruebas realizadas en colaboración con VIRCO.A method of evaluation of the phenotypic resistances has been developed as planned in the project. This method presented differences with the evaluation strategies of the method developed by VIRCO or Virologic but the results obtained were consistent with those obtained in the tests carried out in collaboration with VIRCO.
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Los valores en negrita indican resistencia a antirretrovirales.Bold values indicate resistance to antiretrovirals
El plásmido pCHUS es un vector mínimo que contiene el genoma completo HIV procedente de pNL4.3, así como el gen de resistencia a ampicilina y el origen de replicación derivados de pUC18, que permiten su propagación en E. coli. El plásmido tiene un tamaño de 11.538 pb y posee varios sitios de restricción únicos nuevos. Este vector minimizado puede facilitar no sólo su propia manipulación genética, sino también los procesos de transformación tanto en E. coli como en cultivos celulares e incluso podría permitir la mutagénesis in vitro directamente, sin necesidad de clonaciones y subclonaciones (Molecular Biotechnology. 2004. 28:87-95).Plasmid pCHUS is a minimal vector that contains the complete HIV genome from pNL4.3, as well as the ampicillin resistance gene and the origin of replication derived from pUC18, which allow its propagation in E. coli . The plasmid is 11,538 bp in size and has several new unique restriction sites. This minimized vector can facilitate not only its own genetic manipulation, but also the transformation processes in both E. coli and cell cultures and could even allow in vitro mutagenesis directly, without the need for cloning and subcloning ( Molecular Biotechnology . 2004. 28 : 87-95).
Conclusión preliminar: el modelo desarrollado y su medida posibilita el estudio de la infección por virus VIH en un modelo fenotípico con un rendimiento adecuado y permitiría testar antirretrovirales convencionales usando las construcciones de la presente invención personalizadas con secuencias pol del virus de pacientes.Preliminary conclusion: the model developed and its measurement allows the study of HIV virus infection in a phenotypic model with adequate performance and would allow testing of conventional antiretrovirals using the constructs of the present invention customized with pol sequences of the virus of patients.
En las Fig 7, 8 y 9 se muestran las curvas de respuesta de los plásmidos definidos según las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4 respectivamente.In Figs 7, 8 and 9 the curves of response of plasmids defined according to sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 respectively.
A continuación mostramos los resultados numéricos de cada una de las curvas de respuesta.Below we show the results numerical of each of the response curves.
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- IC_{50}: 1,17IC_ {50}: 1.17
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- IC_{50}: 1,23IC_ {50}: 1.23
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- IC_{50}: 1,04IC_ {50}: 1.04
<110> Universidade de Santiago de Compostela<110> University of Santiago de Compostela
\hskip1cmNanogap
\ hskip1cmNanogap
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<120> Plásmidos que incluyen la secuencia del virus VIH-1 y sus usos<120> Plasmids that include the sequence of the HIV-1 virus and its uses
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<130> 1596.15-1<130> 1596.15-1
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<160> 24<160> 24
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\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<170> PatentIn version 3.5<170> PatentIn version 3.5
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<210> 1<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 14883<211> 14883
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<212> DNA<212> DNA
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<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
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\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> misc_recomb<220> misc_recomb
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<223> Plásmido p4254<223> Plasmid p4254
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<400> 1<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 2<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 14883<211> 14883
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
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\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> misc_recomb<220> misc_recomb
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> p4411<223> p4411
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\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 2<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 3<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 14883<211> 14883
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> misc_recomb<220> misc_recomb
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> p4634<223> p4634
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<400> 3<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 4<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 14883<211> 14883
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> misc_recomb<220> misc_recomb
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> p4696<223> p4696
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<400> 4<400> 4
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<210> 5<210> 5
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<211> 23<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
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<213> virus de la inmunodeficiencia humana<213> immunodeficiency virus human
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\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 5<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\hskip1cm\ hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 6<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 20<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia humana<213> Immunodeficiency virus human
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
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<400> 6<400> 6
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\hskip1cm\ hskip1cm
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<210> 7<210> 7
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<211> 22<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
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<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Usado en la mutagénesis directa<223> Used in direct mutagenesis
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 7<400> 7
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\hskip1cm\ hskip1cm
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<210> 8<210> 8
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<211> 20<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Usado en la mutagénesis directa<223> Used in direct mutagenesis
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 8<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\hskip1cm\ hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 9<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 24<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Usado en la mutagénesis directa<223> Used in direct mutagenesis
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 9<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\hskip1cm\ hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 10<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 28<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Usado en la mutagénesis directa<223> Used in direct mutagenesis
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 10<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\hskip1cm\ hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 11<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 24<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> usado en la mutagénesis directa<223> used in direct mutagenesis
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 11<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\hskip1cm\ hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 12<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 20<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Sitio de restricción ApaI<223> ApaI restriction site
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 12<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\hskip1cm\ hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 13<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 24<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Cebador para SEQ ID NO: 1<223> Primer for SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 13<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\hskip1cm\ hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 14<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 23<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Cebador para SEQ ID NO: 1<223> Primer for SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 14<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\hskip1cm\ hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 15<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 16<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Cebador para SEQ ID NO: 1<223> Primer for SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 15<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\hskip1cm\ hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 16<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 23<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Cebador para SEQ ID NO: 2<223> Primer for SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 16<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\hskip1cm\ hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 17<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 21<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Cebador para SEQ ID NO: 2<223> Primer for SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 17<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\hskip1cm\ hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 18<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 17<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Cebador para SEQ ID NO: 2<223> Primer for SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 18<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\hskip1cm\ hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 19<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<211> 24<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Cebador para SEQ ID NO: 3<223> Primer for SEQ ID NO: 3
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<400> 19<400> 19
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<210> 20<210> 20
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<211> 21<211> 21
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<212> DNA<212> DNA
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<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
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<220> primer_bind<220> first_bind
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<223> Cebador para SEQ ID NO: 3<223> Primer for SEQ ID NO: 3
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<400> 20<400> 20
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<210> 21<210> 21
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<211> 15<211> 15
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<212> DNA<212> DNA
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<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
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<220> primer_bind<220> first_bind
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<223> Cebador para SEQ ID NO: 3<223> Primer for SEQ ID NO: 3
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<400> 21<400> 21
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\hskip1cm\ hskip1cm
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<210> 22<210> 22
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<211> 22<211> 22
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<212> DNA<212> DNA
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<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Cebador para SEQ ID NO: 4<223> Primer for SEQ ID NO: 4
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<400> 22<400> 22
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\hskip1cm\ hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 23<210> 23
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<211> 24<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<212> DNA<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
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<223> Cebador para SEQ ID NO: 4<223> Primer for SEQ ID NO: 4
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\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<400> 23<400> 23
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\hskip1cm\ hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<210> 24<210> 24
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<211> 19<211> 19
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<212> DNA<212> DNA
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<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<220> primer_bind<220> first_bind
\vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
<223> Cebador para SEQ ID NO: 4<223> Primer for SEQ ID NO: 4
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<400> 24<400> 24
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\hskip1cm\ hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
Claims (13)
- a.to.
- amplificar la región de ADN del VIH-1 contenida en el plásmido pNL4.3 mediante los cebadores SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6,amplify the DNA region of HIV-1 contained in plasmid pNL4.3 by means of primers SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6,
- b.b.
- clonar la región amplificada en (a) en un vector de expresión,clone the amplified region in (a) in an expression vector,
- c.C.
- realizar mutagénesis dirigidas independientes en el vector del apartado anterior mediante el empleo de pares de cebadores donde el cebador de selección es SEQ ID NO: 11 y el cebador mutagénico se selecciona de la lista que comprende SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, yperform targeted mutagenesis independent in the vector of the previous section through employment of primer pairs where the selection primer is SEQ ID NO: 11 and the mutagenic primer is selected from the list comprising SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10, and
- d.d.
- reclonar de forma independiente cada uno de los 4 fragmentos obtenidos en (c), en el vector original pNL4.3.independently reclon each one of the 4 fragments obtained in (c), in the original vector pNL4.3.
- a.to.
- cultivar cualquiera de las células según la reivindicación 2,grow any of the cells according to claim 2,
- b.b.
- recoger los viriones liberados al medio de cultivo por las células del apartado (a),collect the virions released in the middle of culture by the cells of section (a),
- c.C.
- extraer el ARN de los viriones del apartado (b),extract the RNA from the virions of the section (b),
- d.d.
- obtener una mezcla estándar con el ARN de (c),get a standard mix with the RNA of (c),
- e.and.
- aplicar la mezcla estándar de (d) al sistema de extracción de ARN,apply the standard mixture of (d) to RNA extraction system,
- f.F.
- cuantificar la concentración de ARN extraído en el paso (e) y/o pirosecuenciarlo yquantify the concentration of RNA extracted in step (e) and / or pyrosequencing it and
- g.g.
- comparar los resultados obtenidos en (f) con los valores de concentración y/o composición nucleotídica de la mezcla estándar de ARN.compare the results obtained in (f) with the concentration and / or nucleotide composition values of the standard RNA mix.
Priority Applications (1)
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