ES2354871T3

ES2354871T3 - Matriz de reparación tisular.

Info

Publication number: ES2354871T3
Application number: ES03709281T
Authority: ES
Inventors: Ronald K. Yamamoto; Michael K. Kwan; Stephen D. Pacetti
Original assignee: DePuy Spine LLC
Current assignee: DePuy Spine LLC
Priority date: 2002-02-22
Filing date: 2003-02-21
Publication date: 2011-03-18
Anticipated expiration: 2023-02-21
Also published as: DE60335246D1; JP4695334B2; JP2011019990A; JP2005518250A

Abstract

Matriz porosa, biodegradable, implantable, fijada tridimensionalmente, que tiene memoria de forma, que comprende una red de fibras de biopolímero insoluble en agua, un fármaco, un mineral y un aglutinante soluble en agua; caracterizado porque dicho aglutinante se convierte en insoluble mediante reticulación, de manera que dicha matriz comprende mineral inmovilizado dentro de la matriz.

Description

ANTECEDENTES

La invención se refiere a materiales útiles para la reparación de tejido óseo.

Un número de materiales han sido estudiados para iniciar la reparación ósea y/o para recuperar o reemplazar hueso perdido, para abordar el problema de estimulación de la formación de hueso en sitios específicos. 5

Entre los enfoques usados para abordar este problema, hay un procedimiento conformacional mediante el cual un material de implante, realizado normalmente en cerámica metálica u otro material inorgánico, en una forma diseñada para imitar la forma del hueso perdido, es insertado en el sitio en el que se requiere el reemplazo de hueso. Hay un riesgo de que el huésped rechace el material o de que haya un fallo de integración del implante con el tejido esquelético normal. Algunos materiales cerámicos, tales como fosfato de tricalcio cerámico, aunque son 10 aceptablemente biocompatibles con el huésped y el hueso, cuando se usan como un implante, parecen carecer de propiedades mecánicas suficientes del hueso para la utilidad general y el hueso no crece consistentemente en, y se incorpora al, implante.

Otro enfoque implica la sustitución del tejido óseo perdido con una matriz que funciona como un soporte, en el que puede ocurrir el crecimiento óseo. La teoría es que la matriz atrae las células dedicadas a un camino 15 osteogénico y el hueso nuevo crece en y a través de la matriz, mediante procesos denominados como osteoconducción. Se usan aloinjertos óseos (hueso que no es del huésped) para este procedimiento, sin embargo, hay una tasa de fallos considerablemente alta. Incluso cuando los aloinjertos óseos son aceptados por el huésped, los periodos de cicatrización para la consolidación y la capacidad de estrés mecánico son de una duración comparativamente larga en comparación con el autoinjerto óseo (hueso de huésped). El uso de hueso alogénico 20 presenta también el problema de agentes víricos transmisibles.

Un tercer procedimiento implica el proceso conocido como osteoinducción, que ocurre cuando un material induce el crecimiento del hueso nuevo a partir de tejidos o células no diferenciadas del huésped, normalmente alrededor de una matriz temporal. Un número de compuestos han mostrado tener dicha capacidad. Véase, por ejemplo, las patentes US Nos. 4.440.750 de Glowacki, 4.294.753 y 4.455.256 de Urist y 4.434.094 y 4.627.982 de 25 Seyedin et al. Los más efectivos de entre estos compuestos parecen ser las proteínas que estimulan la osteogénesis. Sin embargo, cuando son sintetizadas de fuentes naturales, las mismas presentan concentraciones extremadamente bajas y requieren grandes cantidades de material inicial para obtener incluso una cantidad diminuta de material para la experimentación. La disponibilidad de dichas proteínas mediante procedimientos recombinantes puede hacer que, eventualmente, el uso de dichas proteínas, per se, sea de un valor práctico mayor. Sin embargo, 30 dichas proteínas todavía necesitarán, probablemente, ser suministradas al sitio deseado en una matriz apropiada.

Se han divulgado composiciones que contienen colágeno y varias formas de fosfato de calcio dirigidas a la cicatrización y al crecimiento óseo.

La patente No. 5.338.772, de Bauer et al., divulga un material compuesto que contiene partículas cerámicas de fosfato de calcio y un polímero bio-absorbible, en el que el material cerámico de fosfato de calcio es al menos el 35 50% en peso y las partículas están unidas mediante puentes poliméricos. Las partículas de fosfato de calcio cerámico se divulgan con un tamaño de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 5 mm.

La patente No. 4.795.467, de Piez et al., divulga una composición que comprende partículas minerales de fosfato de calcio mezcladas con colágeno fibrilar reconstituido con atelopéptidos. Las partículas de mineral de fosfato de calcio se divulgan con un tamaño comprendido en el intervalo de 100 - 2.000 micrómetros. 40

La patente No. 4.780.450, de Sauk et al., divulga una composición para la reparación ósea que comprende un material cerámico de fosfato de calcio policristalino particulado, una sal de calcio de fosfoforina y un colágeno de tipo I en una relación en peso de 775-15:3-0,1:1. Las partículas cerámicas se divulgan como hidroxiapatita densa de aproximadamente 1 a 10 micrómetros de diámetro o partículas cerámicas de hidroxiapatita, densas, de mayor tamaño, de diámetro mayor de aproximadamente 100 micrómetros. 45

La solicitud PCT WO 94115653, de Ammann et al., divulga formulaciones que comprenden fosfato de tricalcio (TCP), TGF-β y, opcionalmente, colágeno. El TCP es divulgado como un vehículo de suministro para el TGF-β, de manera que el TCP es de un tamaño de partícula mayor de 5 micrómetros y preferentemente mayor de aproximadamente 75 micrómetros. El intervalo más preferente para el tamaño de los gránulos de TCP se divulga como de 125-250 micrómetros. 50

La solicitud PCT WO 95/08304 divulga partículas precursoras poliminerálicas de hidroxiapatita mezcladas con colágeno insoluble. El tamaño de partícula de las partículas precursoras poliminerálicas está comprendido en el

intervalo de 0,5 micrómetros a 5 micrómetros. Los minerales precursores son convertidos a hidroxiapatita mediante hidrólisis, y se cree que este procedimiento fusiona el mineral para formar hidroxiapatita monolítica.

La especificación de patente británica 1.271.763, de FMC Corporation, divulga complejos de fosfato de calcio y colágeno.

Una matriz de injerto óseo, tridimensional, biodegradable, que consiste en fibras de biopolímero insoluble en 5 agua y un aglutinante soluble en agua, en la que la matriz está reticulada y comprende un mineral inmovilizado, se divulga en US-A-5264124.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona una matriz biodegradable, porosa e implantable, fijada tridimensionalmente, tal como se define en la reivindicación 1. Las realizaciones preferentes se definen en las reivindicaciones dependientes. 10

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES ESPECÍFICAS

La matriz es producida usando un biopolímero biodegradable insoluble en agua, tal como colágeno, derivado de colágeno o gelatina modificada. Si se usa gelatina, será modificada para que sea insoluble en entornos acuosos. El colágeno puede provenir de fuentes de colágeno mineralizado o no mineralizado, normalmente fuentes de colágeno no mineralizado. De esta manera, el colágeno puede provenir de hueso, tendones, piel o similares, 15 preferentemente colágeno de Tipo I, el cual implica una combinación de cadenas de colágeno de dos hebras α1 y una α2. El colágeno puede ser de una fuente joven, por ejemplo, ternero, o una fuente madura, por ejemplo, vaca de dos o más años. La fuente de colágeno puede ser cualquier fuente animal conveniente, mamífera o aviar, y puede incluir fuentes bovina, porcina, equina, pollo, pavo u otras fuentes domésticas de colágeno. El tejido colágenoso insoluble que se emplea será dispersado, normalmente, en un medio a un pH elevado, usando al menos 20 aproximadamente un pH de 8, más normalmente un pH de aproximadamente 11-12. Normalmente, se emplea hidróxido de sodio, aunque pueden usarse otros hidróxidos, tales como otros hidróxidos de metales alcalinos o hidróxido de amonio.

Puede utilizarse colágeno nativo según la presente invención. El colágeno nativo contiene regiones en cada extremo, que no tienen la secuencia triplete de glicina. Se cree que estas regiones (los telopéptidos) son 25 responsables de la inmunogenicidad asociada con la mayoría de las preparaciones de colágeno. La inmunogenicidad puede ser mitigada mediante la retirada de estas regiones para producir atelopéptido-colágeno mediante digestión con enzimas proteolíticas, tales como tripsina y pepsina.

La concentración de colágeno para la mineralización estará, generalmente, en el intervalo de aproximadamente 0,1 al 10 por ciento en peso, más normalmente, de aproximadamente el 1 al 5 por ciento en peso. 30 El medio de colágeno estará, generalmente, a una concentración de la base en el intervalo de aproximadamente 0,0001 a 0,1 N. Durante el curso de la reacción, el pH se mantiene, generalmente, en el intervalo de aproximadamente 10-13, preferentemente aproximadamente 12.

El colágeno fibrilar, insoluble, es usado preferentemente y puede ser preparado mediante procedimientos rutinarios. Típicamente, esto puede conseguirse mezclando primero isopropanol (IPA), éter de dietilo, hexano, 35 acetato de etilo u otro solvente adecuado y separando el colágeno. El pH se reduce típicamente a aproximadamente 3, a continuación, la mezcla es enfriada a aproximadamente 4ºC, y se deja hinchar. La suspensión acuosa resultante puede ser homogeneizada hasta que se obtiene la viscosidad deseada.

La suspensión acuosa homogeneizada es mezclada con solvente, es agitada y el pH se aumenta a aproximadamente 7. El colágeno fibrilar es separado, es aclarado con agua desionizada y es liofilizado. Para 40 producir colágeno fibrilar mineralizado, las fibrillas de colágeno insoluble purificado pueden ser homogeneizadas, colocadas en un reactor en el que se introducen cloruro de calcio (típicamente, 0,05 m) y fosfato de sodio tribásico (típicamente 0,03 m) a una tasa controlada, con agitación. Se usa hidróxido de sodio para ajustar el pH a 11,0±0,5, según sea necesario, durante este procedimiento. Después de la mineralización, el colágeno es aclarado con agua desionizada o tampón de fosfato, es combinado con el aglutinante y el pH es ajustado dentro de un intervalo de 45 8,0±2,0. Un procedimiento de adición de fosfato e iones de calcio se describe en la patente US 5.231.169.

El fosfato de calcio puede contener otros iones, tales como carbonato, cloruro, fluoruro, sodio o amonio. La presencia de carbonato resulta en un producto que tiene las propiedades de dahllita (hidroxiapatita carbonatada), mientras que el fluoruro proporciona un producto que tiene las propiedades de apatita fluorada. El % en peso de carbonato no excederá, normalmente, el valor 10, mientras que el % en peso de fluoruro no excederá, normalmente, 50 el valor 2, preferentemente estará en el intervalo de 0 a 1. Estos iones pueden estar presentes en conjunción con la fuente de calcio y/o fosfato, siempre que los iones sean compatibles y no resulten en una precipitación en las soluciones de reactivo.

La tasa de adición de los iones de calcio y fosfato es generalmente de aproximadamente una hora y no más de aproximadamente 72 horas, con el fin de conseguir el tamaño de partícula de aproximadamente 5 micrómetros o menos. Generalmente, el periodo de adición está en el intervalo de aproximadamente 2 a 18 horas, más normalmente, en el intervalo de aproximadamente 4 a 16 horas. Se emplean temperaturas suaves, normalmente no más de aproximadamente 40ºC, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 15º a 30ºC. La tasa de peso 5 del colágeno con respecto al mineral de fosfato de calcio estará, generalmente, en el intervalo de aproximadamente 20:1 a 1:1, y típicamente será de aproximadamente 7:3.

Otros aditivos, tales como fármacos, factores o proteínas no colagenosas, tales como BMPs, TGF-β, calcitonina, antibióticos, pueden ser incluidos en la matriz añadiéndolos a la suspensión acuosa de colágeno, antes o subsiguientemente a la adición de calcio y fosfato. Las cantidades de dichos aditivos estarán, generalmente, en el 10 intervalo de aproximadamente 0,0001 al 2% en peso, en base al biopolímero usado como la matriz, tal como colágeno.

La cantidad de colágeno presente en el producto mineralizado estará, generalmente, en el intervalo de aproximadamente el 95% al 30%, en base al peso de las fibras de colágeno exclusivas del aglutinante.

Para formar una matriz de reparación de tejido, porosa, fijada tridimensionalmente, que tiene memoria de 15 forma, las fibras de biopolímero mineralizado son mezcladas con un aglutinante.

Preferentemente, el colágeno soluble purificado es usado como el aglutinante mezclando primero el colágeno soluble con un solvente, tal como isopropanol (IPA), y aislando el colágeno. El pH es reducido a aproximadamente 3,0, a continuación, cuando el colágeno es disuelto, el pH es elevado a 5,0, es lavado dos veces con el solvente, es aclarado con agua desionizada, es tamizado y es liofilizado. 20

Otros aglutinantes que pueden ser usados incluyen, pero no se limitan a, gelatina, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido láctico y glicólico, policaprolactona, carboximetilcelulosa, ésteres de celulosa (tales como ésteres de metilo y etilo), acetato de celulosa, dextrosa, dextrano, chitosan, ácido hialurónico, ficol, sulfato de condroitina, alcohol polivinílico, ácido poliacrílico, polipropilenglicol, polietilenglicol, polímeros de metacrilato o acrilato solubles en agua. 25

Para preparar la matriz porosa, el aglutinante de colágeno soluble preferente es añadido a una suspensión acuosa de biopolímero mineralizado y se mezcla. Preferentemente, el colágeno insoluble es el biopolímero y se usa una proporción de colágeno de aproximadamente el 10% (p:p) soluble a insoluble. El pH es ajustado a 8,0±2,0 según sea necesario. Cuando se consigue el nivel deseado de mezclado, la dispersión es congelada a entre -20ºC y -80ºC. 30

La suspensión acuosa congelada es liofilizada. La matriz porosa puede reticularse para mejorar la estabilidad física, incrementar el tiempo de reabsorción de la matriz y facilitar la manipulación del producto final. La matriz liofilizada es reticulada, preferentemente, usando glutaraldehido en solución (típicamente, 0,01%) o vapor. Si se usa una solución, después de la retirada del exceso de reactivo, la matriz es deshidratada mediante liofilización.

La matriz porosa puede ser formada también filtrando la suspensión acuosa de fibras de colágeno 35 mineralizado y aglutinante, para formar una malla. A continuación, la malla secada puede ser reticulada.

La estructura porosa puede conseguirse también mezclando las fibras de colágeno de biopolímero, aglutinante y partículas lixiviables (sales solubles, tales como cloruro de sodio) y/o sólidos de alta presión de vapor, que pueden ser retirados más tarde, mediante sublimación. La suspensión acuosa puede ser secada, a continuación, las partículas lixiviables o sublimables pueden ser retiradas para formar la estructura porosa. La matriz 40 porosa puede ser reticulada.

Otros beneficios de una matriz reticulada incluyen un mayor tiempo de residencia del implante y retención de forma (sin fragmentación del implante). La matriz tiene una memoria de forma, lo que significa que es compresible partiendo de su tamaño, forma y porosidad iniciales y puede volver desde un estado comprimido a su tamaño, forma y porosidad iniciales. Además, esto puede ocurrir sin pérdida sustancial de sus fibras o aglutinante. La matriz 45 mantendrá también su porosidad en integridad física después de la implantación durante un tiempo superior a aproximadamente catorce días, particularmente cuando se usa para crecimiento óseo.

Pueden usarse otros agentes y procedimientos de reticulación, tales como formaldehído, sales de cromo, di-isocianatos, carbodiimidas, cloruros de ácidos difuncionales, anhídridos difuncionales, succinimidas difuncionales, dibromoisopropanol, epiclorohidrina, diepóxidos, reticulación deshidrotérmica, radiación UV cuando se seca, o 50 radiación gamma y rayos-E en solución acuosa.

La esterilización del producto final puede conseguirse usando radiación gamma, radiación de rayos E, calor

seco u óxido de etileno.

Una ventaja de la presente invención es que las fibrillas de colágeno y el mineral de fosfato de calcio inmovilizado forman una matriz particularmente ventajosa para el reemplazo o aumento de hueso. La matriz mantiene su integridad física y su porosidad durante un periodo mayor que aproximadamente catorce días después del implante, en un entorno fisiológico en el caso de reemplazo óseo. Mediante integridad física se pretende 5 significar que la matriz mantiene también su porosidad, lo cual es importante para el proceso de aumento o reemplazo tisular. La matriz tiene también memoria de forma, tal como se ha descrito anteriormente. Esto es ventajoso en el sentido de que la matriz puede ser comprimida en un vehículo de suministro, tal como una cánula, y el vehículo de suministro puede ser introducido al sitio de crecimiento tisular deseado. Al liberar la matriz desde el vehículo de suministro en el sitio, la matriz vuelve a su tamaño, forma y porosidad iniciales, sin pérdida sustancial de 10 sus fibras y aglutinante. Esto contrasta con las composiciones que, inmediatamente o poco tiempo después del implante, se colapsan en una masa amorfa, no porosa y pierden el mineral.

Eventualmente, la matriz según la presente invención se biodegradará o será reabsorbida, de manera que la porosidad y la integridad física no pueden mantenerse más allá del periodo limitativo. Este proceso toma, de media, un periodo de aproximadamente 2 a 12 semanas, y su curso depende del tamaño de la matriz implantada. Sin 15 embargo, siempre que el periodo después del cual ha habido una absorción o biodegradación completa de la matriz no haya ocurrido antes del proceso de reemplazo o aumento óseo, la tasa de biodegradación será suficiente.

Es un aspecto de la presente invención que los minerales de fosfato de calcio, presentes típicamente como hidroxiapatita, están inmovilizados en la matriz, en vez de ser móviles libremente a lo largo de la matriz. Se ha encontrado que el mineral de fosfato de calcio según la presente invención está inmovilizado dentro de la matriz. La 20 respuesta celular puede ser alterada en el sentido que las células fagocíticas, tales como las células gigantes y los macrófagos, son más prominentes alrededor de los materiales particulados, formando frecuentemente granulomas. Las partículas lo suficientemente pequeñas para ser fagocitadas, aproximadamente de 3 a 5 micrómetros o menos de tamaño, son captadas por las células fagocíticas que estimulan adicionalmente una reacción tisular localizada. Por ejemplo, durante la cicatrización ósea se observa que restos particulados ocasionados por el desgaste, 25 asociados con articulaciones artificiales, se encuentran en los macrófagos del tejido contiguo y están asociados con una resorción ósea incrementada en modelos animales, en una manera dependiente de la dosis ("Macrophage/particle interactions: effect of size, composition, and surface area", Shanbhag AS et al., J. Biomed. Mater. Res. 28(1), 81-90 (1994)). De esta manera, es una ventaja de la invención que el mineral de fosfato de calcio inmovilizado es liberado con el tiempo como partículas de 5 micrómetros o menos, un tamaño ideal para ser captado 30 por las células fagocíticas. Es una ventaja adicional de la invención que cualquier liberación de las partículas de mineral de fosfato de calcio es controlada, lo que es un resultado de que el mineral está inmovilizado dentro de la matriz. Las ventajas del tamaño de partícula y la inmovilización se muestran en el Ejemplo III, más adelante.

El material de la matriz tiene aplicación como una reparación tisular o de cartílago, o material de injerto óseo osteoconductivo para fusión espinal, rellenado de defectos óseos, reparación de fracturas e injertos de defectos 35 peridontales. Al combinar la composición de la invención con material osteogénico, tal como hueso autógeno o médula ósea aspirada autóloga, o factores de crecimiento óseo osteoinductivos, BMPs, calcitonina u otros factores de crecimiento, pueden aumentarse adicionalmente el crecimiento y la inducción ósea. La composición de la invención puede contener también otros aditivos, tales como fármacos, y, en particular, antibióticos. La matriz puede proporcionar también un sustrato al cual pueden unirse factores de crecimiento, de manera que los factores 40 producidos por el huésped o introducidos de manera externa pueden concentrarse en la matriz. Las composiciones de la invención encuentran aplicación en reparación tisular o de cartílago, reparación de fracturas, reconstrucción maxifacial, fusión espinal, reconstrucción de articulaciones y otros usos quirúrgicos ortopédicos.

Los ejemplos siguientes se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la invención, en ningún sentido. 45

Ejemplo I

Implantación de hueso

La matriz de colágeno mineralizado según la invención es implantada en defectos creados en los huesos parietales de ratas de 8 semanas de edad. Las valoraciones histológicas se realizan a los 14 y 28 días. Después de 14 días, se observa el crecimiento óseo desde el borde cortante del defecto en la matriz de colágeno. El hueso tejido 50 recién formado rodea piezas de la matriz residual y zonas de tejido conectivo libre, en las cuales es evidente una vascularización. A los 28 días, ha ocurrido una remodelación considerable, con osteocitos presentes a lo largo del hueso nuevo. Las cavidades del tejido conectivo observadas a los 14 días disminuyeron en tamaño conforme continuó el crecimiento óseo.

Ejemplo II

Implantación en hueso con médula o injerto autógeno

La matriz de colágeno de fosfato de calcio mineralizado del Ejemplo I fue implantada con la adición de médula ósea en conejos machos, blancos, maduros, de Nueva Zelanda (3,7 a 4,1 kilogramos). Se realizó una incisión en la diáfisis media sobre la superficie anterior-media de la pata delantera derecha para exponer el radio. Se creó un 5 defecto crítico retirando un segmento de 1,5 centímetros del radio usando un taladro neumático. Se proporcionó irrigación durante la osteotomía para minimizar un sobrecalentamiento y daño al hueso. El defecto fue rellenado con matriz de colágeno mineralizado mezclado con médula ósea o injerto autógeno. La médula ósea fue aspirada de la tibia del mismo animal. El injerto autógeno era hueso esponjoso recogido de la cresta ilíaca, similar al procedimiento de injerto o aumento óseo actual. Los animales fueron observados diariamente, post-quirúrgicamente, y se tomaron 10 radiografías del radio operado cada dos semanas durante las primeras ocho semanas y mensualmente hasta la necropsia a las 12 semanas. Los conejos fueron planificados para sobrevivir 12 y 24 semanas después de la cirugía.

En la necropsia, se retiraron los radios derecho e izquierdo, y el radio operado fue valorado para señales brutas de cicatrización (unión y formación de callo). El examen incluyó la presencia de hueso que indicaba una unión o la presencia de cartílago, tejido blando o roturas dentro del defecto, que indicaban una unión posiblemente 15 inestable.

A continuación, los radios fueron fijados en formalina tamponada neutral al 10% y fueron procesados para evaluaciones histológicas y morfométricas.

Las radiografías tomadas a las 0, 2, 4, 6, 8 y 12 semanas indicaron una respuesta de cicatrización robusta tan temprana como dos semanas y los sitios de defecto continúan mejorando y remodelándose hacia la reconstitución 20 de las cortezas naturales del radio. La cicatrización progresiva observada era consistente entre los grupos tratados con matriz de colágeno de fosfato de calcio y el grupo de control con autoinjertos. Había una pequeña diferencia entre las uniones radiográficas entre los dos grupos interrelacionados.

En estudios previos, se había mostrado que los defectos que se habían dejado vacíos o sin tratar (control negativo) contenían poco hueso o ninguno. En este ensayo, el autoinjerto (control positivo) formó una unión ósea 25 estable. Los defectos tratados con colágeno de fosfato de calcio que incluían médula ósea, mostraron una formación de puentes constante, siendo comparable el hueso nuevo con el observado con el autoinjerto.

Ejemplo III (EJEMPLO COMPARATIVO)

Se preparó un lote de mineral de fosfato de calcio sin la adición de colágeno. El mineral fue recogido, lavado y liofilizado a un polvo seco. Una espectroscopia de infrarrojos mostró que era hidroxiapatita, en carácter. 30

Una matriz mezclada fue fabricada mezclando fibras de colágeno fibrilar insoluble con colágeno soluble en una relación de 9/1 en peso, a un total de sólidos del 4% en peso. La suspensión acuosa fue mezclada a mano y el mineral libre fue añadido para alcanzar el 25% en peso del total de sólidos. La suspensión acuosa fue vertida en moldes cuadrados de Teflón de 5,08 cm (2 pulgadas) a una profundidad de aproximadamente 5 mm, fue congelada a -80 grados C y fue liofilizada. La matriz seca fue reticulada usando glutaraldehido durante 30 minutos, fue lavada y 35 reliofilizada. La matriz resultante era de aproximadamente 4 mm de grosor y se realizaron muestras de bocados de 8 mm de diámetro de la matriz para la implantación. Para la comparación, se usó un lote recién fabricado de colágeno mineralizado (mineral inmovilizado), con un contenido de ceniza del 28% en peso, para los implantes de bocados de 8 mm de diámetro.

Los implantes fueron colocados subcutáneamente en la fascia torácica, con dos materiales de implante del 40 mismo tipo bilateralmente, en cuatro ratas, en cada punto temporal de implantación de 3, 7 y 14 días. En la necropsia, los implantes fueron puntuados para reacción tisular, y los bloques de tejido fueron recogidos para histología. Se examinaron secciones tintadas con H&E del implante y del tejido circundante para cada animal en cada punto temporal, para caracterizar la integración y la reacción tisular.

OBSERVACIONES EN LA NECROPSIA 45

: Mixta (material no inmovilizado) Colágeno mineralizado

3 días: Tejido circundante claro, implantes pulposos Tejido circundante claro, implantes blandos

7 días: Tejido circundante claro, implantes blandos, pero de sensación espesa Tejido circundante claro, implantes de blandos a firmes

14 días: Tejido circundante inflamado, implantes firmes pero de sensación espesa Tejido circundante claro, implantes firmes

Las observaciones clínicas en la necropsia indican una respuesta inflamatoria y un efecto degradativo mucho mayor en la formulación mixta comparada con el colágeno mineralizado inmovilizado en el modelo de implante subcutáneo en rata. Las observaciones describen un implante pulposo a los tres días. En los días siete y 14, se observa un implante engrosado, probablemente debido a la dramática respuesta de cápsula fibrosa de la 5 formulación mixta, según se observa histológicamente. La formulación con mineral inmovilizado, en comparación, demostró tejido circundante claro y apariencia de implante normal en la totalidad de los tres puntos temporales.

Un examen histológico mostró que la formulación mixta resultó en un nivel alto de inflamación tanto aguda como crónica, según se demostró mediante la actividad PMB tardía (14 días) y la actividad de células gigantes temprana (3 días). Las células gigantes indican que la actividad fagocítica está siendo organizada probablemente en 10 respuesta a la gran cantidad de partículas de mineral libremente asociadas. Todavía se observaba invasión fibroblástica y no había evidencia de necrosis tisular.

Por el contrario, la formulación con partículas minerales inmovilizadas sobre las fibras de colágeno demuestra una reacción implante-tejido más típica. En el punto temporal correspondiente al día 3, se observa inflamación aguda que disminuye rápidamente a una reacción de implante más crónica a los siete días, con solo inflamación 15 moderada mientras ocurren la invasión de fibroblastos y la neovascularización en la periferia del implante. A los 14 días, son visibles signos de inflamación incrementada, indicativos quizás de una liberación de mineral adicional desde las fibras de colágeno debido a una degradación de colágeno.

La formulación mixta del colágeno y componentes de mineral hidroxiapatita demuestra una respuesta inflamatoria considerablemente aguda en implantes subcutáneos en ratas. La inmovilización del componente mineral 20 en la composición de colágeno mineralizado parece reducir la biodisponibilidad del mineral, reduciendo la inflamación mientras continúa soportando la integración tisular durante la cicatrización de la herida.

Ejemplo IV

Implantación en sitios de tejido blanco

La matriz de colágeno mineralizado según la invención fue implantada en el tejido subcutáneo de ratas 25 Sprague Dawley, macho, de 5 semanas de edad y fue evaluada mediante procedimientos histológicos después de 4 y 8 semanas. Después de 4 semanas, se observó el crecimiento hacia dentro del tejido fibroso en la masa ovoide del implante eosinofílico. Se observó también una respuesta inflamatoria, de moderada a marcadamente crónica, con un infiltrado linfocítico. Periféricamente, había presentes tejido fibroso denso y células gigantes multinucleadas. Una cantidad moderada de implante de colágeno mineralizado permaneció en este punto temporal. A las 8 30 semanas, los implantes de colágeno mineralizado mostraron tejido fibroso fino y denso y pequeños espacios vacios. Se observaron también inflamación moderada, principalmente periféricamente, con infiltrados de células inflamatorias crónicas y células multinucleadas gigantes dispersadas. Tres de los seis especímenes mostraron pequeñas cantidades de material de implante residual, mientras que los tres sitios de implante restantes contenían solo trazas de implante. 35

Ejemplo V

Tiempo de residencia de la matriz de colágeno mineralizado implantada

La matriz de colágeno mineralizado según la invención fue combinada con médula ósea autóloga y fue implantada en defectos segmentales de 1,5 cm en el radio de conejos blancos de Nueva Zelanda. Después de 12 semanas, los sitios de implante fueron evaluados histológicamente y mostraron matriz de colágeno mineralizado 40 residual presente y en yuxtaposición cercana a la matriz ósea.

Ejemplo VI

Liberación de MP52

La matriz de colágeno mineralizado según la invención fue hidratada con proteína morfogénica 52 (MP52) a una concentración de 0,1 mg de MP52/cc de matriz. La matriz hidratada fue liofilizada. La matriz liofilizada fue 45 colocada en PBS a 37ºC y se midió la liberación de mP52 desde la matriz. En los puntos temporales siguientes, 15 min, 30 min, 1 hora y 18 horas, la liberación acumulada era del 5%, 7%, 9% y 10%, respectivamente. El 90% de la MP52 cargada fue recuperado después de 18 horas.

Ejemplo VII

Liberación de antibióticos

La matriz de colágeno mineralizado según la invención fue hidratada con vancomicina a una concentración de 10 mg de vancomicina/cc de matriz. La matriz hidratada fue liofilizada. La matriz liofilizada fue colocada en PBS a 37ºC y se midió la liberación de vancomicina desde la matriz. En los puntos temporales siguientes, 6 horas, 24 5 horas, 51 horas, 73 horas y 97 horas, la liberación acumulada era del 40%, 63%, 72%, 80% y 83%, respectivamente.

Ejemplo VIII

Memoria de forma

La matriz de colágeno mineralizado según la invención puede ser hidratada fácilmente colocando la matriz en un fluido. La matriz mantiene su integridad y forma después de la hidratación. La matriz hidratada puede ser 10 comprimida e insertada manualmente a través de una abertura estrecha, pero vuelve a su tamaño y forma originales con una rehidratación. Durante la manipulación y la compresión, la matriz mantiene su integridad sin ninguna pérdida sustancial de fibras.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Matriz porosa, biodegradable, implantable, fijada tridimensionalmente, que tiene memoria de forma, que comprende una red de fibras de biopolímero insoluble en agua, un fármaco, un mineral y un aglutinante soluble en agua;

caracterizado porque dicho aglutinante se convierte en insoluble mediante reticulación, de manera que 5 dicha matriz comprende mineral inmovilizado dentro de la matriz.
2. Matriz según la reivindicación 1, en la que dicho fármaco comprende un antibiótico.
3. Matriz según la reivindicación 1, que comprende además un factor de crecimiento.
4. Matriz según la reivindicación 1, que comprenden además médula.
5. Matriz según la reivindicación 1, en la que dicho aglutinante está seleccionado de entre el grupo que 10 consiste en colágeno soluble, gelatina, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido láctico y glicólico, policaprolactona, carboximetilcelulosa, ésteres de celulosa, dextrosa, dextrano, chitosan, ácido hialurónico, ficol, sulfato de condroitina, alcohol polivinílico, ácido poliacrílico, polipropilenglicol, polietilenglicol, poliacrilatos solubles en agua y polimetacrilatos solubles en agua.
6. Matriz según la reivindicación 1, en la que dicho polímero comprende colágeno fibrilar. 15
7. Matriz según la reivindicación 1, en la que dicho mineral comprende hidroxiapatita.
8. Matriz según la reivindicación 1, en la que dichas fibras biopoliméricas mineralizadas están en la forma de colágeno mineralizado que contiene aproximadamente 30-95% en peso de colágeno.
9. Matriz según la reivindicación 1, que comprende además hueso autógeno.
10. Uso de: 20

una composición que comprende una red de fibras de biopolímero mineralizado insoluble en agua, un mineral y un aglutinante soluble en agua, en el que dicho aglutinante se hace insoluble mediante reticulación en la preparación de una matriz porosa, biodegradable, fijada tridimensionalmente, que tiene memoria de forma, para reparar cartílago o tejido fibroso.
11. Procedimiento de preparación de una matriz porosa, biodegradable, fijada tridimensionalmente, que tiene 25 memoria de forma, para reparar cartílago o tejido fibroso, que comprende:

proporcionar una matriz que comprende una composición que comprende una red de fibras de biopolímero mineralizado insoluble en agua, un mineral y un aglutinante soluble en agua, caracterizado porque dicho aglutinante se hace insoluble mediante reticulación, y

contener la matriz en un vehículo de suministro para suministrar la matriz a un sitio diana de reparación, 30 en un estado relativo comprimido, a un tamaño, forma y porosidad iniciales de dicha matriz;

estando adaptada dicha matriz para volver a dichos tamaño, forma y porosidad iniciales tras la liberación desde dicho vehículo de suministro.
12. Uso según la reivindicación 10 o procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha matriz comprende además un aditivo. 35
13. Uso según la reivindicación 12, cuando sea dependiente de la reivindicación 10, en el que dicho aditivo comprende un fármaco.
14. Uso según la reivindicación 13, en el que dicho fármaco comprende un antibiótico.
15. Uso según la reivindicación 12, cuando sea dependiente de la reivindicación 10, en el que dicho aditivo comprende un factor de crecimiento. 40
16. Uso según la reivindicación 10 o procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha matriz comprende además médula.
17. Uso según la reivindicación 10 o procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho aglutinante es seleccionado de entre el grupo que consiste en colágeno soluble, gelatina, ácido poliláctico, ácido

poliglicólico, copolímeros de ácido láctico y glicólico, policaprolactona, carboximetilcelulosa, ésteres de celulosa, dextrosa, dextrano, chitosan, ácido hialurónico, ficol, sulfato de condroitina, alcohol polivinílico, ácido poliacrílico, polipropilenglicol, polietilenglicol, poliacrilatos solubles en agua y polimetacrilatos solubles en agua.
18. Uso según la reivindicación 10 o procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho biopolímero 5 comprende colágeno fibrilar.
19. Uso según la reivindicación 10 o procedimiento según la reivindicación 11, en el que el mineral de dichas fibras de biopolímero mineralizado comprende hidroxiapatita.
20. Uso según la reivindicación 10 o procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha matriz comprende colágeno y fosfato de calcio inmovilizado en la forma de colágeno mineralizado que contiene 10 aproximadamente 30-95% en peso de colágeno.
21. Uso según la reivindicación 10 o procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha matriz comprende además hueso autógeno.
22. Uso según la reivindicación 17, cuando sea dependiente de la reivindicación 10, en el que dicho aditivo comprende colágeno soluble. 15
23. Procedimiento según la reivindicación 12, cuando sea dependiente de la reivindicación 11, en el que dicho aditivo comprende un fármaco.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que dicho fármaco comprende un antibiótico.
25. Procedimiento según la reivindicación 12, cuando sea dependiente de la reivindicación 11, en el que dicho aditivo comprende un factor de crecimiento. 20