ES2353882T3 - Péptidos dirigidos a humanos y ratones identificados por fago. - Google Patents

Abstract

Un péptido aislado de un tamaño de 100 aminoácidos o menos que comprende una secuencia dirigida al tejido adiposo seleccionada de las secuencias SEQ ID NO: 47 a la SEQ ID NO: 55.

Description

CONTEXTO DE LA INVENCIÓN

Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Nº 60/231,266 presentada el 8 de septiembre del 2000 y de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 09/765,101 presentada el 17 de enero del 2001. Esta invención se ha hecho con el apoyo gubernamental bajo las concesiones DAMD 17-98-1-8041 y 17-98-1-8581 del Ejército de Estados Unidos y concesiones 1R01CA78512-01A1, 1R1CA90810-01 y 1R01CA82976-01 del Instituto Nacional de Salud. El gobierno posee ciertos derechos sobre esta invención.

1. Campo de la Invención La presente invención hace referencia a los campos de medicina molecular y envío dirigido de agentes terapéuticos. Más en concreto, la presente invención hace referencia a composiciones y métodos para la identificación y uso de péptidos que de manera selectiva se dirigen a tejidos de órganos o tipos de células in vivo o in vitro; Descripción de la Técnica Relacionada

El tratamiento terapéutico de muchos estados enfermos está limitado por la toxicidad sistémica de los agentes terapéuticos empleados. En particular, los agentes terapéuticos del cáncer muestran un índice terapéutico muy bajo, con tejidos normales que crecen rápidamente como la piel o la médula ósea afectada en concentraciones de agente que no son mucho más granes que las concentraciones usadas para matar células tumorales. El tratamiento de cáncer y de otros tipos de enfermedades restringidos a órganos, tejidos o tipos de células se facilitaría en gran medida mediante el desarrollo de composiciones y métodos para un envío de un agente terapéutico dirigido a un órgano, tejido o tipo de célula deseado.

Recientemente, se ha desarrollado un sistema de selección in vivo que usa bibliotecas de expresión en fagos para identificar el tipo de órgano, tejido o célula al que se dirigen los péptidos en un sistema con modelo de ratón. Las bibliotecas de expresión en fagos que expresan péptidos transgénicos sobre la superficie del bacteriófago se desarrollaron inicialmente para trazar los puntos de enlace del epítopo de inmunoglobulinas (Smith y Scott, 1986, 1993). Dichas bibliotecas pueden generarse insertando oligonucleótidos al azar en cADNs que codifican una proteína con superficie de fago, generando colecciones de partículas de fago que demuestran péptidos únicos en 109 permutaciones. (Pasqualini y Ruoslahti, 1996, Arap et al., 1998a; Arap et al., 1998b).

La administración intravenosa de bibliotecas de expresión en fagos fue seguida de la recuperación de fagos de órganos individuales (Pasqualini y Ruoslahti, 1996). Se recuperaron los fagos que fueron capaces de alojarse de manera selectiva en las camas vasculares de diferentes tipos de órganos, tejidos y células de ratones, en base a las secuencias específicas de dirección de péptidos expresadas sobre la superficie externa de los fagos (Pasqualini y Ruoslahti, 1996). Mediante este método (Rajotte et al., 1998, 1999; Koivunen et al., 1999; Burg et al., 1999; Pasqualini, 1999) se han identificado una variedad de péptidos buscadores de órganos y tumores. Cada uno de estos péptidos guías se unió a diferentes receptores que se expresaron de manera selectiva sobre la vasculatura del tejido objetivo del ratón (Pasqualini, 1999; Pasqualini et al., 2000; Folkman, 1995; Folkman 1997). Los péptidos buscadores de tumores se unieron a receptores que se regularon de manera ascendente en la vasculatura angiogénica tumoral de los ratones ((Brooks et al., 1994; Pasqualini et al., 2000). Además de identificar péptidos guiados individuales selectivos de un tipo de órgano, tejido o célula ((Pasqualini y Ruoslahti, 1996; Arap et al, 1998a; Koivunen et al., 1999), este sistema se ha empleado para identificar marcadores de superficie celular endotelial que se expresan en ratones in vivo (Rajotte y Ruoslahti, 1999).

La unión de agentes terapéuticos con péptidos dirigentes dio como resultado el envío selectivo del agente al tipo de órgano, tejido

o célula deseado en el sistema con modelo de ratón. El envío dirigido de agentes quimioterapéuticos y péptidos proapoptóticos a receptores localizados en vasculatura angiogénica tumoral dio como resultado un incremento notable en la eficacia terapéutica y un descenso en la toxicidad sistémica en modelos de ratones con tumor (Arap et al., 1998a, 1998b; Ellerby et al., 1999).

Bajo el Número de Acceso Uniprot Q9R1H5 se describe un gen receptor de insulina de rata que consiste en 32 aminoácidos.

En algunos casos, métodos previos in vivo para selección de expresión de fagos resultaron en antecedentes relativamente altos de enlace de fago no específico. Esto fue particularmente cierto para tejidos que pertenecían al sistema reticuloendotelial.

También existe una necesidad de receptores objetivos para poblaciones celulares específicas en un tipo de órgano, tejido o célula. En muchos casos, los tejidos u órganos pueden contener poblaciones heterólogas de diferentes tipos de células.

Existe una necesidad de identificar parejas ligando-receptor en órganos y tejidos. Intentos anteriores por identificar receptores guiados y ligandos unidos a receptores han captado un único ligando en el momento de la investigación. La identificación de receptores previamente desconocidos y ligando previamente no caracterizados ha sido un proceso muy lento y laborioso. Estos nuevos receptores y ligandos pueden proporcionar la base para nuevas terapias para una variedad de enfermedades, como diabetes mellitus, enfermedades inflamatorias, artritis, aterosclerosis, cáncer, enfermedad autoinmune, infección bacteriana, infección viral, enfermedad cardiovascular y enfermedad degenerativa. RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invención ofrece un método de envío dirigido a tejido adiposo que consiste en la administración del péptido de SEQ ID NO: 47-55 o fragmentos del mismo unidos a un agente a un sujeto.

En la presente invención se han identificado péptidos dirigidos a tejido adiposo.

En una realización, un péptido aislado de 100 aminoácidos o menos en tamaño consiste en secuencia dirigida a tejido adiposo seleccionado de SEQ ID NO: 47 a SEQ ID NO: 55.

En otra realización este péptido es 50 aminoácidos o menos en tamaño.

En otra realización este péptido es 25 aminoácidos o menos en tamaño.

En otra realización este péptido es 10 aminoácidos o menos en tamaño.

En otra realización este péptido es 7 aminoácidos o menos en tamaño.

En otra realización este péptido está unido a una molécula.

En otra realización esta molécula es un fármaco, un agente quimioterapéutico, un radioisótopo, un agente pro-apoptosis, un agente antiangiogénico, una hormona, una citoquina, un factor de crecimiento, un agente citotóxico, un péptido, una proteína, un antibiótico, un fragmento Fab de un anticuerpo, un agente visualizador, un factor de supervivencia, un agente anti-apoptótico, un antagonista de hormona o un antígeno.

En otra realización, dicho agente pro-apoptosis es gramicidina, magainina, mellitina, defensina, cecropina, (KLAKLAK) 2, (SEQ ID NO: 1), (KLAKKLA)2 (SEQ ID NO: 2), (KAAKKAA)2 (SEQ ID NO: 3) o (KLGKKLG)3 (SEQ ID NO: 4).

En otra realización este péptido se une a un complejo macromolecular.

En otra realización este complejo es un virus, un bacteriófago, una bacteria, un liposoma, una micropartícula, una gota magnética, una célula de levadura, una célula de mamífero o una célula.

En otra realización este péptido se une a un vector de expresión eucariótica.

En otra realización este vector es un vector de terapia genética.

En otra realización, un anticuerpo se enlaza de manera selectiva con un péptido aislado, consistiendo el péptido en una secuencia dirigida al tejido adiposo seleccionada de las secuencias SEQ ID NO: 47 a SEQ ID NO: 55.

En otra realización, el vector expresa una secuencia de péptido diana como parte de una proteína superficial, consistiendo el péptido diana en una secuencia dirigida al tejido adiposo seleccionada de las secuencias SEQ ID NO: 47 a SEQ ID NO: 55.

En otra realización, se usa un agente en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad, donde el agente se une a un péptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 para formar un complejo para focalizar el envío hacia el tejido adiposo.

En otra realización el agente es un agente visualizador, un fármaco, un agente quimioterapéutico, un radioisótopo, un agente antiangiogénico, una enzima, una hormona, una citoquina, un factor de crecimiento, un agente citotóxico, un péptido, una proteína, un antibiótico, un anticuerpo, un fragmento Fab de un anticuerpo, un antígeno, un factor de supervivencia, un agente anti-apoptótico, un antagonista de hormona, un virus, un bacteriófago, una bacteria, un liposoma, una micropartícula, una gota magnética, un microdispositivo, una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula o un vector de expresión.

En otra realización, el agente se usa para el tratamiento de obesidad.

En otra realización, dicho agente pro-apoptosis es gramicidina, magainina, mellitina, defensina, cecropina, (KLAKLAK) 2, (SEQ ID NO: 1), (KLAKKLA)2 (SEQ ID NO: 2), (KAAKKAA)2 (SEQ ID NO: 3) o (KLGKKLG)3 (SEQ ID NO: 4).

Ciertas realizaciones incluyen métodos para obtener anticuerpos contra un antígeno. En realizaciones preferentes, el antígeno comprende uno o más péptidos diana. Los péptidos dianas se preparan e inmovilizan sobre un soporte sólido, se añade suero que contiene anticuerpos y se recogen los anticuerpos que se enlazan con los péptidos dianas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los siguientes dibujos, Fig. 1 y Fig. 3 a 31, no forman parte de la presente memoria. La invención puede comprenderse mejor mediante referencias a uno o más de estos dibujos junto con la descripción detallada de realizaciones específicas aquí presentadas.

FIG. 1. Validación de fago buscador de placenta. Los péptidos dianas que tienen fagos identificados en el Ejemplo 3 se inyectaron a ratas preñadas y su recuperación de placenta se comparó con los fagos de control fd-tet sin secuencias dianas. Los clones de fago buscadores de placenta fueron: PA -TPKTSVT (SEQ ID NO: 39), PC -RAPGGVR (SEQ ID NO: 41), PE -LGLRSVG (SEQ ID NO: 44), PF

- YIRPFTL (SEQ ID NO: 43).

FIG. 2. Validación de péptidos buscadores de tejido adiposo. Los péptidos dianas que tienen fagos identificados en el Ejemplo 3 se inyectaron a ratas preñadas y su recuperación de tejido adiposo se comparó con los fagos de control fd-tet sin secuencias dianas.

FIG. 3. Focalización del bazo in vitro usando BRASIL. La unión de los clones Fab #2, #6, #10, #12 y el clon Fab de control NPC-3TT se comparó con el enlace del fago de control Fd-tet.

FIG. 4. Focalización del bazo in vitro usando BRASIL. La unión de los clones Fab #2, #6, #10, #12 y el clon Fab de control NPC-3TT se compararon directamente uno con otro.

FIG. 5. Focalización del bazo in vivo usando BRASIL. La unión de los clones Fab #2, #6, #10, #12 se comparó con la unión del fago Fd-tet.

FIG. 6. Focalización del bazo in vivo usando BRASIL. La unión del clon Fab #10 con el tejido del bazo se comparó con el enlace del clon control Fab NPC-3TT y el fago Fd-tet.

FIG. 7. La unión del clon Fab #10 con el bazo frente a la médula ósea en comparación con el fago Fd-tet.

FIG. 8. La unión de clones Fab de una biblioteca de sarcoma anti-Kaposi con retina angiogénica.

FIG. 9. La unión del fago seleccionado con dominio citoplásmico β3 con proteínas inmovilizadas. Las proteínas GST de fusión o GST solas fueron cubiertas en pozos de microtítulo a 10 µg/ml y se usaron para enlazar fagos que expresan péptidos dirigidos a endostatina. Cada fago se identifica por la secuencia peptídica que muestra: GLDTYRGSP (SEQ ID NO:96); YDWWYPWSW (SEQ ID NO:95); CLRQSYSYNC (SEQ ID NO:104); SDNRYIGSW (SEQ ID NO:97); CEQRQTQEGC (SEQ ID NO:93); CFQNRC (SEQ ID NO:102).

Los datos representan los cómputos medios de colonias a partir de pozos por triplicado, con el error estándar inferior al 10% de la media.

FIG. 10. La unión del fago seleccionado con dominio citoplásmico β5 con proteínas inmovilizadas. Las proteínas GST de fusión o GST solas fueron cubiertas en pozos de microtítulo a 10 µg/ml y se usaron para enlazar fagos que expresan péptidos dirigidos a endostatina. Cada fago se identifica por la secuencia peptídica que muestra: (A) DEEGYYMMR (SEQ ID NO:110); (B) KQFSYRYLL (SEQ ID NO:111); (C) CEPYWDGWFC (SEQ ID NO:106); (D) VVISYSMPD (SEQ ID NO: 112); and (E) CYIWPDSGLC (SEQ ID NO:105). Los datos representan los cómputos medios de colonias a partir de pozos por triplicado, con el error estándar inferior al 10% de la media.

FIG. 11. Enlace de fagos de enlace con dominio citoplásmico con proteína β3 inmovilizada e inhibición con el péptido sintético. Los fagos se incubaron sobre pozos cubiertos con GST-β3cito en presencia de concentraciones crecientes del péptido sintético correspondiente o un péptido control. Los datos representan los cómputos medios de colonias a partir de pozos por triplicado, con el error estándar inferior al 10% de la media.

FIG. 12. Enlace de fagos de enlace con dominio citoplásmico con proteína β5 inmovilizada e inhibición con el péptido sintético. Los fagos se incubaron sobre pozos cubiertos con GST-β5cito en presencia de concentraciones crecientes del péptido sintético correspondiente o un péptido control. Los datos representan los cómputos medios de colonias a partir de pozos por triplicado, con el error estándar inferior al 10% de la media.

FIG. 13. Enlace de fagos con β3-GST y β5-GST inmovilizadas tras fosforilación. Los fagos se fosforilaron con quinasa Fyn. Fagos sin inserciones se usaron como control. Los fagos se incubaron en pozos cubiertos con GST-β3cito o GST-β5cito. Los datos representan los cómputos medios de colonias a partir de pozos por triplicado, con el error estándar inferior al 10% de la media.

FIG. 14. Enlace de fagos con proteínas de fusión GST inmovilizadas tras fosforilación. Los fagos se fosforilaron con quinasa Fyn. Fagos sin inserciones se usaron como control. Los fagos se incubaron en pozos cubiertos con dominios GST-citoplásmicos. Los datos representan los cómputos medios de colonias a partir de pozos por triplicado, con el error estándar inferior al 10% de la media.

FIG. 15. Efecto de péptidos que se unen al dominio citoplásmico de integrina sobre proliferación celular. Células privadas de suero se cultivaron durante 24 horas y la proliferación se determinó mediante medidas de respuesta a [3H] timidina (1µCi/m). En un control positivo se añadió VEGF de nuevo a las células privadas de suero. Cada experimento se llevó a cabo tres veces con triplicados, y los resultados se expresaron como la media +/- SD.

FIG. 16. Efecto de quimeras de péptido de penetratina sobre migración celular endotelial. En ensayo de migración celular se llevó a cabo en una cámara micro-quimiotaxis con 48 pozos. Se contabilizaron cinco campos de alta potencia al azar (magnitud 40x) en cada pozo. Los resultados muestran que ambos péptidos de enlace con dominio citoplásmico β3-integrina (Y-18 y TYR-11) aumentan la migración celular mientras la penetratina no afecta a las células.

FIG. 17. El enlace de quimeras de péptido de penetratina provoca muerte celular programada. 106 células HUVEC se cosecharon en un medio completo y se añadieron 15 µM de quimeras de péptido de penetratina a las células. Después de cuatro, ocho y doce horas las células se tintaron con Ioduro de Propidio (IP) y la inducción y la apoptosis se analizaron mediante análisis citométrico. a) Perfil obtenido con células privadas de nutrientes después de 24 horas. b) Células confluentes en medio completo. c) 15 µM de penetratina después de cuatro horas. d) 15 µM de quimera VISY-penetratina después de cuatro horas. Las células analizadas tras ocho y doce horas mostraron perfiles similares al porcentaje G0/G1.

FIG. 18. Especificidad de los anticuerpos aumentada frente a fagos seleccionados β3 o β5 (ELISA). Las diluciones crecientes de suero obtenidas tras tres inmunizaciones con GLDTYRGSP (SEQ ID NO:96) o SDNRYIGSW (SEQ ID NO:97) conjugadas con KLH se incubaron en pozos de microtítulo cubiertos por 10 µg de SDNRYIGSW (SEQ ID NO:97, Y-18), GLDTYRGSP (SEQ ID NO:96, TYR-11) o péptido de control. Los preinmunosueros se usaron como controles. Tras la incubación con HRP cabra anti-conejo, el OD se midió a 405 nm. Los datos representan las medias de pozos por triplicado, con un error estándar inferior al 10%.

FIG. 19. Especificidad de los anticuerpos aumentada frente a fagos seleccionados β3 o β5 (ELISA). Los sueros obtenidos tras tres inmunizaciones con SDNRYIGSW (SEQ ID NO:97, Y-18) o GLDTYRGSP (SEQ ID NO:96, TYR-11) conjugados con KLH se incubaron en pozos de microtítulo cubiertos por 10 µg de TYR-11 o Y-18. GLDTYRGSP (SEQ ID NO:96) o SDNRYIGSW (SEQ ID NO:97) y péptidos de control se añadieron en solución. Tras la incubación con HRP cabra anti-conejo, el OD se midió a 405 nm. Los datos representan las medias de pozos por triplicado, con un error estándar inferior al 10%. Los péptidos añadidos en solución bloquean de manera específica la reactividad con los péptidos inmovilizados.

FIG. 20A. Enlace competitivo de Anexina V con integrina β5 con péptido VISY. Los ensayos de enlace se realizaron con ELISA.

FIG. 20B. Niveles relativos al enlace de anticuerpo anti-Anexina V con proteína Anexina V purificada y péptido VISY.

FIG. 21. Péptido quimérico que contiene péptido VISY unido a penetratina (antennapedia) provoca apoptosis. La apoptosis provocada por VISY se inhibió mediante la adición de un inhibidor de caspasa (zVAD).

FIG. 22. Los fagos que se enlazan con APA se unen de manera específica con tumores. Cantidades iguales de fagos se inyectaron en las venas de la cola de ratones que tenían tumores derivados de MDA-MB-435 y los fagos se recuperaron tras perfusión. Los valores medios para los fagos recuperados del tejido tumoral o tejido control (cerebro) y se muestran los errores estándares de placas por triplicado.

FIG. 23. CPRECESIC (SEQ ID NO:123) es un inhibidor específico de actividad APA. La actividad de la enzima APA se comprobó en presencia de concentraciones crecientes de GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) (control) o péptido CPRECESIC (SEQ ID NO: 123). IC50 para inhibición de APA por CPRECESIC (SEQ ID NO:123) se estimó en 800 µM. Las barras de error representan el error estándar de las medias de pozos triplicados. El experimento se repitió tres veces con resultados similares.

FIG. 24. CPRECESIC (SEQ ID NO:123) inhibe la migración de HUVEC. Los HUVECs se estimulan con VEGF-A (10 ng/ml). El ensayo se realizó en una cámara de microquimiotaxis Boyden, y se dejó que las células migraran a través de un filtro con poro de 8 µm durante 5 horas a 37ºC. GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) (control) y péptidos CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) se testaron en una concentración de 1 mM. Las células migradas se tintaron y se consideraron cinco campos de alta potencia (magnitud 100x) para cada micropozo. Las barras de error representan el error estándar de las medias de pozos triplicados.

FIG. 25. CPRECESIC (SEQ ID NO:123) inhibe la proliferación de HUVEC. Las células se estimularon con VEGF-A (10 ng/ml), y el crecimiento se evaluó en los tiempos indicados por un ensayo colorimétrico basado en tinción violeta cristal. Las barras de error representan el error estándar de las medias de pozos triplicados. El experimento se repitió tres veces con resultados similares.

FIG. 26. Protocolo para ciclos de selección in vivo para fagos dirigidos en páncreas, riñones, hígado, pulmones y glándula suprarrenal en ratón.

FIG. 27. Protocolo para la recuperación de fagos mediante la infección de E. coli o recuperación de ADN de fagos mediante amplificación y subclonación.

FIG. 28. Péptidos que se dirigen al islote pancreático y proteínas homólogas. Las proteínas endógenas candidatas imitadas por los péptidos que se dirigen al islote pancreático CVSNPRWKC (SEQ ID NO:197), CVPRRWDVC (SEQ ID NO: 194), CQHTSGRGC (SEQ ID NO:195) y CRARGWLLC (SEQ ID NO:196), identificadas por búsquedas de homología estándar.

FIG. 29. Péptidos que se dirigen al islote pancreático y proteínas homólogas. Las proteínas endógenas candidatas imitadas por los péptidos que se dirigen al islote pancreático CGGVHALRC (SEQ ID NO:175), CFNRTWIGC (SEQ ID NO:198) y CWSRQGGC (SEQ ID NO:200), identificadas por búsquedas de homología estándar.

FIG. 30. Péptidos que se dirigen al islote pancreático y proteínas homólogas. Las proteínas endógenas candidatas imitadas por los péptidos que se dirigen al islote pancreático CLASGMDAC (SEQ ID NO:204), CHDERTGRC (SEQ ID NO:205), CAHHALMEC (SEQ ID NO:206) y CMQGARTSC (SEQ ID NO:208), identificadas por búsquedas de homología estándar.

FIG. 31. Péptidos que se dirigen al islote pancreático y proteínas homólogas. Las proteínas endógenas candidatas imitadas por los péptidos que se dirigen al islote pancreático CHVLWSTRC (SEQ ID NO:201), CMSSPGVAC (SEQ ID NO:203) y CLGLLMAGC (SEQ ID NO:202), identificadas por búsquedas de homología estándar. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

Tal y como se usa en la memoria, “un” o “uno” pueden significar lo mismo. Tal y como se emplea en las reivindicaciones, junto con la palabra “consiste”, las palabras “un” o “uno” pueden tener el mismo significado. Tal y como aquí se emplea, “otro” puede significar al menos un segundo u otra unidad.

Un “péptido enfocado o dirigido” es un péptido que consiste en una secuencia contigua de aminoácidos, que se caracteriza por una localización selectiva hacia un tipo de órgano, tejido o célula. La localización selectiva puede determinarse, por ejemplo, mediante métodos descritos a continuación, donde la secuencia de péptido enfocado putativo se incorpora a una proteína que se muestra sobre la superficie externa de un fago. La administración a un sujeto de una biblioteca de tales fagos se ha realizado genéticamente para expresar una multitud de tales péptidos dirigidos de diferentes secuencias de aminoácidos va seguida por la recogida de uno o más tipos de órganos, tejidos o células del sujeto y de la identificación de fagos encontrados en esos tipos de órganos, tejidos o células. Un fago que expresa un péptido enfocado se considera que está selectivamente localizado en un tejido u órgano si muestra una mayor unión en ese tejido u órgano en comparación con un tejido u órgano de control. Preferiblemente, lo localización selectiva de un péptido dirigido debería resultar en un enriquecimiento doble o mayor del fago en el tipo de órgano, tejido o célula objetivo en comparación con un tipo de órgano, tejido o célula de control. La localización selectiva que da como resultado un enriquecimiento multiplicado por tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más es más preferente. De manera alternativa, un fago que expresa una secuencia de péptido dirigido que muestra localización selectiva preferiblemente muestra un mayor enriquecimiento en el órgano objetivo en comparación con un órgano control cuando los fagos recuperados del órgano objetivo se vuelven a inyectar en un segundo huésped para otra serie de análisis. Puede mostrarse un mayor enriquecimiento siguiendo una tercera serie de análisis. Otros medios alternativos para determinar localización selectiva consisten en que los fagos que expresan el péptido objetivo putativo preferiblemente muestran un enriquecimiento multiplicado por dos, más preferiblemente por tres o mayor en el órgano objetivo en comparación con los fagos control que expresan un péptido no específico o que no se han producido genéticamente para expresar ningún péptido objetivo putativo. Otros medios para determinar la localización selectiva es que la localización hacia el órgano objetivo

o los fagos que expresan el péptido objetivo se bloqueen al menos parcialmente por la co-administración de un péptido sintético que contiene la secuencia péptido objetivo. “Péptido dirigido” y “péptido buscador” aquí se usan como sinónimos.

Una “biblioteca de expresión en fagos” significa una colección de fagos que se han producido genéticamente para expresar un conjunto de péptidos dirigidos putativos sobre su superficie externa. En realizaciones preferentes, las secuencias de ADN que codifican los péptidos dirigidos putativos se insertan estructuralmente en un gen codificador de una proteína capsular de fago. En otras realizaciones preferentes, las secuencias de péptidos dirigidos putativos son en parte una mezcla arbitraria de los veinte aminoácidos y en parte no arbitraria. En ciertas realizaciones preferentes, los péptidos dirigidos putativos de la biblioteca de expresión en fagos muestran uno o más residuos de cisteína en localizaciones fijadas dentro de las secuencia de péptido dirigido.

Un “complejo macromolecular” hace referencia a una colección de moléculas que pueden estar arbitrariamente colocadas, ordenadas o parcialmente ordenadas en su disposición. El término engloba organismos biológicos como bacteriófagos, virus, bacterias, organismos patogénicos unicelulares, organismos patogénicos multicelulares y células procarióticas y eucarióticas. El término también engloba colecciones inertes de moléculas, como liposomas, microcápsulas, micropartículas, gotas magnéticas y microdispositivos. El único requisito es que el complejo contenga más de una molécula. Las moléculas pueden ser idénticas, o pueden ser diferentes entre sí.

Un “receptor” para un péptido dirigido incluye, aunque no se limita a, cualquier molécula o complejo de moléculas que se una a un péptido dirigido. Ejemplos no limitativos de receptores incluyen péptidos, proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, epítopos, lípidos, carbohidratos, estructuras multimoleculares, una conformación específica de una o más moléculas y una entidad morfoanatómica. En realizaciones preferentes, un “receptor” es una molécula o un complejo de moléculas que ocurren de manera natural y que están presentes en la superficie luminal de células formando vasos sanguíneos en el interior de un tipo de órgano, tejido o célula.

Un “sujeto” generalmente hace referencia a un mamífero. En ciertas realizaciones preferentes, el sujeto es un ratón o un conejo. En realizaciones incluso más preferentes, el sujeto es un humano. Expresión de Fagos (no forma parte de la invención).

Los métodos aquí descritos para la identificación de péptidos dirigidos implican la administración in vivo de bibliotecas de expresión en fagos. En la técnica se conocen muy bien varios métodos de expresión en fagos y métodos para producir diversas poblaciones de péptidos. Por ejemplo, las Patente de Estados Unidos Números 5,223,409; 5,622,699 y 6,068,829 describen métodos para preparar la expresión de fagos. La técnica de expresión de fagos implica la manipulación genética de bacteriófago de manera que los péptidos pequeños se puedan expresar sobre su superficie (Smith et al., 1985, 1993). La potencial variedad de aplicaciones para esta técnica es bastante amplia, y la pasada década ha sido testigo de un considerable progreso en la construcción de bibliotecas de péptidos de expresión en fagos y en el desarrollo de métodos de selección en los que las bibliotecas se usan para aislar ligandos péptidos. Por ejemplo, el uso de bibliotecas de péptidos ha hecho posible la caracterización de puntos de interacción y motivos de enlace receptor-ligando en muchas proteínas, como los anticuerpos que participan en reacciones inflamatorias o integrinas que median adherencia celular. Este método también se ha usado para identificar ligandos péptidos nuevos que sirven como guías en el desarrollo de fármacos peptidomiméticos o agentes visualizadores (Arap et al., 1998a).

Secuencias de aminoácido dirigidas selectivas para un tipo de órgano, tejido o células pueden aislarse mediante una técnica de selección por afinidad (Pasqualini y Ruoslahti, 1996; Pasqualini, 1999). En resumen, una biblioteca de fagos que contiene péptidos dirigidos es administrada a un animal o humano y se recogen muestras de tipos de órganos, tejidos o céulas que contiene los fagos. En realizaciones preferentes que utilizan fagos filamentosos, los fagos pueden propagarse in vitro entre series de selección por afinidad en bacterias pilus-positivas. Las bacterias no se lisan por el fago sino por múltiples copias segregadas de fagos que expresan una inserción particular. Los fagos que se enlazan con una molécula particular se pueden eluir del tipo de órgano, tejido o célula y a continuación amplificarse haciéndolos crecer en una bacteria huésped. Si se desea, los fagos amplificados pueden administrarse a un huésped y las muestras de los tipos de órganos, tejidos o células se recogen. Pueden realizarse múltiples series utilizando la técnica de selección por afinidad hasta que se obtenga una población de aglutinantes selectivos. La secuencia de aminoácido de los péptidos se determina secuenciando el ADN correspondiente a la inserción del péptido dirigido en el genoma del fago. A continuación, el péptido dirigido identificado puede producirse como un péptido sintético mediante técnicas estándares de química proteica (Arap et al., 1998a, Smith et al., 1985). Esta técnica permite que los péptidos dirigidos circulantes sean detectados en un ensayo funcional imparcial, sin ninguna noción preconcebida sobre la naturaleza de su objetivo. Una vez que se ha identificado un candidato como receptor de un péptido dirigido, puede aislarse, purificarse y clonarse usando métodos bioquímicos normales (Pasqualini 1999; Rajotte y Ruoslahti, 1999).

En ciertas realizaciones, se usa un protocolo de sustracción para además reducir en enlace de fagos antecedentes. El fin de la substracción es retirar los fagos de la biblioteca que están unidos a las células diferentes a las células de interés, o que se unen a células inactivas. En realizaciones alternativas, la biblioteca de fagos puede preseleccionarse en un sujeto que no posee la célula, tejido u órgano objetivo. Por ejemplo, los péptidos que se unen a placenta pueden identificarse tras una preselección de una biblioteca en un sujeto macho o hembra no preñada. Tras la sustracción, la biblioteca puede seleccionarse en una célula, tejido o célula de interés. En otra realización alternativa, un tipo de célula, tejido u órgano no estimulado e inactivo puede seleccionarse en una biblioteca y retirarse el fago de enlace. A continuación, la línea celular, tejido u órgano se activa mediante la administración de una hormona, factor de crecimiento, citoquina o quimioquina y el tipo celular, tejido u órgano activado se selecciona en la librería de fagos sustraída.

Se conocen otros métodos de protocolos de sustracción y pueden usarse en la práctica de la presente invención, por ejemplo tal y como se describe en las Patente de Estados Unidos Números 5,840,841,5,705,610,5,670,312 and 5,492,807. Elección de sistema de expresión en fago

Estudios previos de selección in vivo llevados a cabo en ratones preferentemente emplearon bibliotecas de péptidos arbitrarios expresados como proteínas de fusión con la proteína capsular del gen III en el vector fUSE5 (Pasqualini y Ruoslahti, 1996). El número y diversidad de clones individuales presentes en una determinada biblioteca es un factor significativo para el éxito de la selección in vivo. Es preferible usar bibliotecas primarias, que tienen menos posibilidades de tener una sobrerrepresentación de clones de fagos defectuosos (Koivunen et al., 1999). La preparación de una biblioteca debería optimizarse hasta entre 108-109 unidades transductoras (T.U)/ml. En ciertas realizaciones, se aplica una estrategia de amplificación masiva entre cada serie de selección.

Las bibliotecas de fago que muestran péptidos lineales, cíclicos, o doble cíclicos pueden usarse dentro del alcance de la presente invención. Sin embargo, las bibliotecas de fagos que muestran de 3 a 10 residuos arbitrarios en una inserción cíclica (CX310C) son preferentes, ya que los péptidos cíclicos sencillos tienden a tener mayor afinidad con el órgano objetivo que los péptidos lineales. Las bibliotecas que muestran péptidos doble cíclicos (como CX3C X3CX3C; Rojotte et al., 1998) se han usado con buenos resultados. Sin embargo, la producción de péptidos sintéticos cognatos, aunque es posible, puede resultar compleja debido a los múltiples conformadores con diferentes disposiciones del soporte de disulfuro. Identificación de péptidos buscadores y receptores mediante exposición en fagos in vivo en ratones

La selección in vivo de péptidos a partir de bibliotecas de péptidos con exposición de fagos administrados a ratones se ha usado para identificar péptidos dirigidos selectivos para cerebro, riñón, pulmón, piel, páncreas, retina, intestina, uretra, próstata y glándula suprarrenal normales de ratones (Pasqualini y Ruoslahti, 1996; Pasqualini, 1999; Rajotte et al., 1998). Estos resultados muestran que el endotelio vascular de órganos normales es lo suficientemente heterogéneo como para permitir una focalización diferencial con sondas de péptidos ((Pasqualini y Ruoslahti, 1996; Rajotte et al., 1998). Se ha creado un medio para identificar péptidos que se dirigen a la vasculatura angiogénica de tumores, tal y como se describe a continuación. Se ha ideado un panel de motivos de péptido que se dirigen a los vasos sanguíneos de xenoinjertos tumorales en ratones que no han sido sometidos a ningún tratamiento (Arap et al., 1998a; revisado en Pasqualini, 1999). Estos motivos incluyen las secuencias RGD-4C, NGR y GSL. El péptido RGD-4 se ha identificado previamente por enlazarse de manera selectiva con integrinas αv y ha demostrado estar localizado en la vasculatura de xenoinjertos tumorales en ratones que no han sido sometidos a ningún tratamiento (Arap et 1998a, 1998b; Pasqualini et al., 1999).

Los receptores para el péptido dirigido RGD4C localizado en el tumor han sido identificados como integrinas αv (Pasqualini et al., 1997). Las integrinas αv juegan un papel muy importante en angiogénesis. Las integrinas αvβ3 y αvβ5 están ausentes o se expresan a bajos niveles en células endoteliales normales pero son provocadas en vasculatura angiogénica de tumores (Brooks et al., 1994; Hammes et al., 1996). Aminopeptidasa N/CD13 se ha identificado recientemente como un receptor angiogénico para el motivo NGR (Burg et al., 1999). Aminopeptidasa N/CD13 se expresa de manera muy clara no solamente en vasos sanguíneos angiogénicos de cáncer de próstata en TRAMP sino también en tejido de próstata endotelial normal.

Los fagos dirigidos al tumor se co-localizan con sus receptores en la vasculatura angiogénica de tumores pero en no en los vasos sanguíneos no-angiogénicos en tejidos normales (Arap et al., 1998b). La evidencia inmunohistoquímica demuestra que los fagos dirigidos vasculares se unen a vasos sanguíneos tumorales humanos en sección del tejido (Pasqualini et al., 2000) pero no a vasos sanguíneos normales. Un fago de control negativo con ninguna inserción (fago fd) no se unió a secciones de tejido tumoral ni normal. La expresión de receptores angiogénicos se evaluó en líneas celulares, en vasos sanguíneos no proliferativos y en vasos sanguíneos activados de tumores y otros tejidos angiogénicos como cuerpo lúteo. La citometría de flujo y la inmunohistoquímica mostraron que estos receptores se expresan en un número de células tumorales y en HUVECs activados (datos no mostrados). Los receptores angiogénicos no fueron detectados en la vasculatura de órganos normales de tejidos de ratones o humanos.

La distribución de estos receptores se analizó con inmunohistoquímica en células tumorales, vasculatura tumoral y vasculatura normal. Las integrinas Alfa v, CD13, aminopeptidasa A, NG2 y MMP-2/MMP-9 – los receptores conocidos en vasos sanguíneos tumorales – se expresan de manera específica en células endoteliales angiogénicas y pericitos de origen humano y murino. La neovasculatura angiogénica expresa marcadores que bien se expresan a niveles muy bajo o no se expresan en célula endoteliales no proliferativas (datos no mostrados).

Los marcadores de endotelio angiogénico incluyen receptores para factores de crecimiento vascular, como subtipos específicos de VEGF y receptores básicos FGF, e integrinas αv, entre otros (Mustonen y Alitalo, 1995). Hasta el momento, la identificación y aislamiento de moléculas nuevas características de vasculatura angiogénica ha sido lenta, principalmente debido a que las células endoteliales sufren grandes cambios fenotípicos cuando crecen en cultivo (Watson et al., 1995).

Muchos de estos marcadores vasculares de tumor son proteasas y algunos de los marcadores sirven como receptores virales. Las integrinas Alfa v son receptores para adenovirus (Wickham et al., 1997c) y CD13 es un receptor par coronavirus (Look et al., 1989). MMP-2 y MMP-9 son receptores para ecovirus (Koivunen et al., 1999). Aminopeptidasa A también parece ser un receptor viral. Los bacteriófagos pueden usar los mismos receptores celulares que los virus eucarióticos. Estos hechos sugieren que los receptores aislados por la exposición de fagos in vivo tendrán capacidad de internalización celular, una característica clave para utilizar los motivos identificados de péptido como portadores en terapia de genes dirigidos. Envío Dirigido

Los péptidos que se dirigen a la vasculatura tumoral se han unido a fármacos citotóxicos o péptidos proapoptóticos para producir compuestos que han sido más efectivos y menos tóxicos que los compuestos parentales en modelos experimentales de ratones con xenoinjertos tumorales (Arap et al. 1998a; Ellerby et al., 1999). Tal y como se describe a continuación, la inserción del péptido RGD-4C en la proteína superficial de un adenovirus ha producido un vector adenoviral que puede usarse para terapia de genes dirigida a tumores (Arap et al., 1998b).

BRASIL

En realizaciones preferentes, la separación de un fago unido a las células de un órgano, tejido o tipo celular objetivo a partir de fagos separados se consigue usando la técnica BRASIL (Solicitud de Patente Provisional Nº 60/231,266 presentada el 8 de septiembre; Solicitud de Patente de Estados Unidos titulada "Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interactive Ligands (BRASIL)" por Arap, Pasqualini y Giordano, presentada simultáneamente con ésta. En BRASIL ("Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interactive Ligands” – Selección por Afinidad y Análisis Rápido de Ligandos Interactivos), un órgano, tejido o tipo celular se separa cuidadosamente en células o pequeños grupos celulares que se suspenden en una fase acuosa. La fase acuosa se capea sobre una fase orgánica de densidad apropiada y se centrifuga. Las células adjuntas al fago unido se transforman en pequeñas bolas en el fondo del tubo centrifugador, mientras que los fagos no unidos permanecen en la fase acuosa. Esto permite una separación más eficiente entre los fagos unidos y no unidos, mientras que se mantiene la interacción entre el fago y la célula. BRASIL puede realizarse en un protocolo in vivo, en el que los tipos de órganos, tejidos o células se exponen a una biblioteca de expresión de fagos a través de administración intravenosa, o en un protocolo ex vivo, en el que las células se exponen a la biblioteca de fagos en la fase acuosa antes de la centrifugación. Proteínas y Péptidos

En ciertas realizaciones, la presente invención se ocupa de composiciones nuevas que consisten en al menos una proteína o péptido. Tal y como aquí se usa, una proteína o péptido generalmente hace referencia a, aunque no se limita a, una proteína y/o péptido de desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 100 aminoácidos. Por conveniencia, los términos “proteína”, “polipéptido” y “péptido” aquí se usan de manera intercambiable.

En ciertas realizaciones, el tamaño de al menos una proteína o péptido puede ser, pero no limitarse a, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,

5 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 residuos de aminoácido.

Tal y como aquí se emplea, un “residuo de aminoácido” hace

10 referencia a un aminoácido, un derivado de aminoácido o un imitador de aminoácido conocido en la técnica que ocurra de manera natural. En ciertas realizaciones, los residuos de la proteína o péptido son secuenciales, sin ningún no-aminoácido interrumpiendo la secuencia de residuos de aminoácido. En otras realizaciones, la secuencia

15 puede estar formada por uno o más radicales de no-aminoácido. En realizaciones particulares, la secuencia de residuos de la proteína o péptido puede estar interrumpida por uno o más radicales noaminoácidos. Por consiguiente, el término “proteína o péptido” engloba

20 secuencias de aminoácidos que tienen al menos 20 aminoácidos comunes encontrados en proteínas que ocurren de manera natural, o al menos un aminoácido modificado o inusual, que incluye, aunque no se limita a, los mostrados en la Tabla 1 a continuación.

TABLA 1 25 Aminoácidos Modificados o Inusuales

30

imagen1

Las proteínas o péptidos pueden hacerse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica, entre las que se incluyen la expresión de proteínas, polipéptidos o péptidos a través de técnicas biológicas moleculares habituales, el aislamiento de proteínas o péptidos de fuentes naturales, o la síntesis química de proteínas o péptidos. Las secuencias de nucleótidos y proteínas, polipéptido y péptido correspondientes a varios genes se han descrito previamente, y pueden encontrarse en bases de datos computarizadas conocidas por los expertos en la técnica. Una de estas bases de datos es la base de datos Genbank y GenpPept del Centro Nacional para la Información de la Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Las regiones codificadoras para los genes conocidos pueden amplificarse y/o expresarse usando las técnicas aquí descritas o aquellas conocidas por los expertos en la técnica. Como alternativa, los expertos en la técnica conocen varias preparaciones comerciales de proteínas, polipéptidos y péptidos. Análogos de Péptidos

Otra realización para la preparación de polipéptidos de acuerdo con la invención es el uso de imitadores o análogos de péptidos. Los imitadores son moléculas que contienen péptidos que imitan a los elementos de la estructura secundaria proteica. Ver, por ejemplo, Johnson et al., “Peptide Turn Mimetics” en BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds. Chapman and Hall, Nueva York (1993). La base principal del uso de imitadores o análogos de péptido es que el eje peptídico de las proteínas existe principalmente para orientar las cadenas laterales de aminoácido de modo que faciliten las interacciones moleculares, como las del anticuerpo y antígeno. Se espera que un imitador peptídico permita interacciones moleculares similares a las de la molécula natural. Estos principios pueden usarse para producir moléculas de segunda generación que tengan muchas de las propiedades naturales de los péptidos dirigidos aquí descritos, peor con características alteradas e incluso modificadas.

Proteínas de Fusión

Otras realizaciones de la presente invención tratan sobre proteínas de fusión. Estas moléculas generalmente tienen todas las partes o una parte sustancial de un péptido dirigido, unida a la terminal N o C de todo o una parte de un segundo polipéptido o proteína. Por ejemplo, las fusiones pueden emplear secuencias líderes procedentes de otras especies para permitir la expresión recombinante de una proteína en un huésped heterólogo. Otra fusión útil incluye la adición de un dominio inmunológicamente activo, como un epítopo de anticuerpo, para facilitar la purificación de la proteína de fusión. La inclusión de un punto de partición o división en o cerca de la unión de la fusión facilitará la retirada del polipéptido externo tras la purificación. Otras fusiones útiles incluyen la unión de dominios funcionales, como sitios activos de enzimas, dominios de glicosilación, señales dirigidas celulares o regiones en la transmembrana. En realizaciones preferentes, las proteínas de fusión de la presente invención comprenden un péptido dirigido unido a una proteína o péptido terapéuticos. Ejemplos de proteínas o péptidos que pueden incorporarse a una proteína de fusión incluyen proteínas citostáticas, proteínas citocidales, agentes pro-apoptosis, agentes antiangiogénicos, hormonas, citoquinas, factores del crecimiento, fármacos peptídicos, anticuerpos, anticuerpos de fragmentos Fab, antígenos, proteínas receptoras, enzimas, lectinas, proteínas MHC, proteínas de adhesión celular y proteínas de enlace. Estos ejemplos no pretenden ser limitativos y dentro del alcance de la presente invención se contemplan virtualmente proteínas y péptidos que podrían estar incorporados a la proteínas de fusión que forma un péptido dirigido. Métodos para generar proteínas de fusión son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Dichas proteínas pueden producirse, por ejemplo, mediante uniones químicas usando reagentes bifuncionales entrecruzados, mediante la síntesis de novo de la proteína de fusión completa, o uniendo una secuencia de ADN codificadora del péptido dirigido con una secuencia de ADN codificadora del segundo péptido o proteína, seguido de la expresión de la proteína intacta de fusión.

Purificación de Proteínas

En ciertas realizaciones una proteínas o péptido puede aislarse

o purificarse. Las técnicas de purificación de proteínas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas técnicas implican, a un nivel, la homogenización y fraccionamiento crudo de las células, tejido u órgano con las fracciones del polipéptido o no-polipéptido. La proteína o polipéptido de interés puede además purificarse usando técnicas cromatográficas o electroforéticas para conseguir una purificación parcial o completa (o purificación hasta homogeneidad). Métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de un péptido puro son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de gel, electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad y enfoque isoeléctrico. Un ejemplo de purificación de proteína recetora mediante cromatografía de afinidad se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5,206,347. Un método particularmente eficiente para purificar péptidos es cromatografía líquida de la proteína rápida (FPLC) o incluso HPLC.

Una proteína o un péptido purificado hace referencia a una composición, aislable de otro componente, donde la proteína o péptido se purifica hasta un grado en relación con sus estado naturalmente obtenible. Una proteína o péptido aislado o purificado, por consiguiente, también hace referencia a una proteína o péptido libre del medio en el que puede darse de manera natural. Generalmente “purificado/a” hará referencia a una composición de péptido o proteína que ha sido sometida a fraccionamiento con el fin de retirar otros componentes, y cuya composición retiene sustancialmente su actividad biológica expresada. Donde se emplea el término “sustancialmente purificado”, esta designación hará referencia a una composición en la que la proteína o el péptido forma el principal componente de la composición, de modo que constituya aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, o más de las proteínas en la composición.

Los expertos en la técnica conocen varios métodos para cuantificar el grado de purificación de la proteína o péptido a la vista de la presente descripción. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad específica de una fracción activa, o evaluar la cantidad de polipéptidos dentro de una fracción mediante análisis SDS/PAGE. Un método preferente para evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la fracción, compararla con la actividad específica del extracto inicial, y a continuación calcular el grado de pureza, calculado por un “número de purificación x-veces”. Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad dependerán por supuesto de la técnica elegida para el ensayo particular en el proceso de purificación, y de si la proteína o el péptido expresado muestra una actividad detectable.

Varias técnicas adecuadas para uso en la purificación de proteínas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Éstas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y similares, o mediante desnaturalización con calor seguido de centrifugación; pasos de cromatografía como cromatografía de intercambio iónico, filtración de gel, fase inversa, hidroxilapatita y afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel; y combinaciones de estas y otras técnicas. Como se conoce en términos generales en la técnica, se cree que el orden de llevar a cabo los pasos de purificación pueden cambiarse, o que ciertos pasos pueden omitirse, y aún así los resultados serán adecuados para un método de preparación de proteínas o péptidos sustancialmente purificados.

No existe un requisito general que establezca que la proteína o péptido siempre tengan que estar en sus estado más purificado. De hecho, se contempla que productos sustancialmente menos purificados tendrán utilidad en ciertas realizaciones. Una purificación parcial puede realizarse usando menos pasos de purificación en combinación, o utilizando diferentes formas del mismo esquema general de purificación. Por ejemplo, se aprecia que una cromatografía de columna con intercambio de catión realizada utilizando un aparato HPLC generalmente resultará en una purificación superior en “x veces” que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía de menor presión. Los métodos que muestran un menor grado de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del producto de proteína, o en el mantenimiento de actividad de una proteína expresada.

La cromatografía de afinidad es un procedimiento cromatográfico que se basa en la afinidad específica entre una sustancia que va a aislarse y una molécula con la que se enlaza de manera específica. Este un tipo de interacción receptor-ligando. El material de la columna se sintetiza mediante enlace covalente de una de las partes del enlace con una matriz insoluble. A continuación, el material de columna es capaz de adsorber específicamente la sustancia de la solución. La elución ocurre cambiando las condiciones a aquellas en las que el enlace no ocurrirá (p. ej., pH alterado, fuerza iónica, temperatura, etc.). La matriz debería ser una sustancia que por sí misma no adsorbe moléculas hasta un punto significativo y tiene un gran índice de estabilidad química, física y termal. El ligando debería enlazarse de tal manera que no afecte a sus propiedades de enlace. El ligando también debería proporcionar un enlace relativamente ajustados. Y debería ser posible eluir la sustancia sin destruir la muestra o el ligando.

Péptidos Sintéticos

Debido a su tamaño relativamente pequeño, los péptidos dirigidos de la invención pueden sintetizarse en solución o en un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. En el mercado se encuentran disponibles varios sintetizadores automáticos y pueden usarse de acuerdo con los protocolos conocidos. Ver, por ejemplo, Stewart y Young, (1984); Tam et al., (1983); Merrifield, (1986); y Barany y Merrifield (1979). Secuencias peptídicas cortas, normalmente desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 35 a 50 aminoácidos, pueden sintetizarse sencillamente usando estos métodos. Como alternativa, puede emplearse tecnología recombinante de ADN donde una secuencia de nucleótido que codifica un péptido de la invención se inserta en un vector de expresión, transformada o transfectada a una célula apropiada de huésped, y se cultiva bajo condiciones adecuadas para la expresión. Anticuerpos

En ciertas realizaciones, puede ser deseable hacer anticuerpos contra los péptidos dirigidos identificados o sus receptores. El péptido dirigido o receptor adecuado, o porciones de los mismos, pueden enlazarse, unirse, engancharse, conjugarse o unirse químicamente con uno más agentes por medio de conectores, policonectores, o aminoácidos derivados. Esto puede realizarse de modo que se produzca una composición o una vacuna biespecífica o multivalente. Además se considera que los métodos usados en la preparación de estas composiciones son familiares para aquellos expertos en la técnica y debería adecuados para administración a humanos, es decir, farmacéuticamente aceptables. Agentes preferentes como portadores son hemocianina de lapa californiana (KLH) y albúmina de suero bovino (BSA).

El término “anticuerpo” se usa para hacer referencia a una molécula del tipo anticuerpo que tiene una región de enlace de antígeno y que incluye fragmentos de anticuerpo como Fab’, FAb, F(ab’)2, anticuerpos de dominio sencillo (DABs), Fv, scFv (Fv de cadena sencilla) y similares. Técnicas para preparar y usar varias construcciones y fragmentos basados en anticuerpos son bien conocidas en la técnica. Medios para preparar y caracterizar anticuerpos también son bien conocidos en la técnica. (Ver, p. ej., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Citoquinas y quimioquinas

En ciertas realizaciones, puede desearse enlazar agentes bioactivos específicos con uno o más péptidos dirigidos para un envío dirigido a un órgano, tejido o tipo celular. Dichos agentes incluyen, pero no se limitan a, citoquinas, quimioquinas, factores pro-apoptosis y factores anti-angiogénicos. El término “citoquina” es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otros mediadores celulares o intercelulares. Ejemplos de estas citoquinas son linfoquinas, monoquinas, factores del crecimiento y hormonas tradicionales de polipéptido. Se incluyen entre las citoquinas las hormonas del crecimiento como hormona del crecimiento humano, hormona del crecimiento humano Nmetionilo, y hormona del crecimiento humano bovino; hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteína como hormona estimuladora del folículo (FSH); hormona estimuladora de tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor del crecimiento hepático; prostaglandina, factor del crecimiento fibroblasto; prolactina; lactógeno placentario; proteína OB; factor alfa y beta de necrosis tumoral; sustancia inhibidora del conducto de Müller; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores del crecimiento nervioso como NGF-beta; factor de crecimiento de plaquetas; factores transformadores del crecimiento (TGFs) como TGF-alfa y TGF-beta; factor I y II del crecimiento del tipo insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones como interferón-α, -β y –γ; factores estimuladores de colonias (CSFs) como macrófago-CSF (M-CSF); granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleuquinas (ILs) como IL-1, IL-1.alfa., IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL18, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, kit ligandos o FLT-3, angiostatina, trombospondina, endostatina, factor de necrosis tumoral. Tal y como aquí se emplea, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.

Las quimioquinas generalmente actúan como quimioatrayentes para reclutar células efectoras en el punto de la expresión de quimioquina. Puede resultar ventajoso expresar un gen particular de quimioquina en combinación con, por ejemplo, un gen de citoquina con el fin de mejorar el reclutamiento de otros componentes del sistema inmune en el punto del tratamiento. Las quimioquinas incluyen, aunque no se limitan a, RANTES, MCAF, MIP1-alfa, MIPI-Beta e IP-10. El experto en la técnica reconocerá que ciertas citoquinas son también conocidas por tener efectos quimioatrayentes y también podrían clasificarse bajo el término quimioquinas. Agentes visualizadores y radioisótopos

En ciertas realizaciones, los péptidos o proteínas reivindicados de la presente invención pueden unirse a agentes visualizadores de uso en visualización y diagnóstico de varios tipos de órganos, tejidos

o células enfermas. En la técnica se conocen muchos agentes visualizadores apropiados, así como métodos para su unión a proteínas o péptidos (ver, p. ej., Patentes de Estados Unidos 5,021,236 y 4,472,509. Ciertos métodos de unión incluyen el uso de un complejo metálico quelante que emplea, por ejemplo, un agente quelante orgánico como un DTPA unido a la proteína o péptido (Patente de Estados Unidos 4,472,509). Las proteínas o péptidos también pueden reaccionar con una enzima en presencia de un agente de enlace como glutaraldehído o periodato. Los conjugados con marcadores de fluoresceína se preparan en presencia de estos agentes de enlace o mediante reacción con un isotiocianato.

Ejemplos no limitativos de iones paramagnéticos de uso potencial como agentes visualizadores incluyen cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hiero (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) y erbio (III), siendo gadolinio el preferente. Iones útiles en otros contextos, como visualización con rayos X, incluyen, aunque no se limitan a, lantano (III), oro (III), plomo

(II) y especialmente bismuto (III):

Los radioisótopos de uso potencial como agentes visualizadores o terapéuticos incluyen astatina211 , 14carbono, 51cromo, 36cloro, 57cobalto, cobre67, 152Eu, galio67 , 3hidrogeno, yodo123, yodo125, yodo131, indio111 , 59hierro, 32fósforo, renio186, renio188 , 75selenio, 35sulfuro, tecnicio99m e itrio90 . 125I es a menudo el preferente para uso en ciertas realizaciones, y tecnicio99m e indio111 son también a menudo preferentes debido a su baja energía y a su adecuación para detección a gran escala.

Las proteínas o péptidos radioactivamente etiquetados de la presente invención pueden producirse de acuerdo a métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden convertirse en yoduro al entrar en contacto con yoduro de sodio o potasio y un agente oxidante químico como hipoclorito de sodio, o un agente oxidante enzimático como lactoperoxidasa. Las proteínas o péptidos de acuerdo con la invención pueden etiquetarse con tecnecio99m mediante un proceso de intercambio de ligando, por ejemplo, reduciendo el pertecnetato con solución de estaño, sometiendo a quelación el tecnecio reducido en una columna Sephadex y aplicando el péptido a esta columna o mediante técnicas de etiquetaje directo, por ejemplo, incubando pertecnetato, un agente reductor como SNCl2, una solución de búfer como solución sodioftalato de potasio y el péptido. Los grupos intermedios funcionales que a menudos se usan para unir radioisótopos que existen como iones metálicos con los péptidos son ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y ácido diaminotetracético etileno (EDTA). También se contempla el uso de etiquetas fluorescentes, incluyendo rodamina, isotiocianato fluorescente y renografina.

En ciertas realizaciones, las proteínas y péptidos reivindicados pueden unirse a un ligando de enlace secundario o a una enzima (una etiqueta de enzima) que generará un producto coloreado tras entrar en contacto con un sustrato cromogénico. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen ureasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa de hidrógeno (rábano picante) y oxidasa de glucosa. Los ligandos secundarios de enlace preferentes son compuestos de biotina y avidina o estreptavidina. El uso de estas etiquetas es bien conocido por los expertos en la técnica a la luz de lo descrito, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 y 4,366,241. Entrecruzadores

Reagentes entrecruzadores bifuncionales se han usado en gran medida para una variedad de fines incluyendo la preparación de matrices de afinidad, modificación y estabilización de diversas estructuras, identificación de puntos de enlace de ligando y receptor y estudios estructurales. Los reagentes homobifuncionales que transportan dos grupos funcionales idénticos demostraron ser muy eficientes a la hora de provocar un ligamiento cruzado entre macromoléculas o subunidades de macromoléculas idénticas o diferentes, y uniendo ligandos de polipéptido con sus puntos específicos de enlace. Los reagentes heterobifuncionales contienen dos grupos funcionales diferentes. Tomando ventaja de las reactividades diferenciales de los dos grupos funcionales diferentes, el ligando cruzado puede controlarse tanto selectivamente como secuencialmente. Los reagentes entrecruzadores bifuncionales pueden dividirse de acuerdo con la especificidad de sus grupos funcionales, es decir, grupos específicos de amino, sulfhidrilo, guanidino, indol, carboxil. De estos, los reagentes dirigidos a grupos libres de amino han sido especialmente populares debido a su disponibilidad comercial, facilidad de síntesis y las condiciones de reacción ligeras bajo las que se aplican. Una mayor parte de agentes entrecruzadores heterobifuncionales contiene un grupo primario amino-activo y un grupo tiol-reactivo.

Métodos ejemplares para ligandos entrecruzados con liposomas se describen en las Patentes de Estados Unidos 5,603,872 y 5,401,511. Varios ligandos pueden enlazarse covalentemente con superficies liposomales a través del entrecruzamiento de residuos de amino. Los liposomas, en particular vesículas multilamelares (MLV) y granes liposomas unilamelares (LUVET), conteniendo cada uno de ellos fosfatidiletanolamina (PE), se han preparado mediante los procedimientos establecidos. La inclusión de PE en el liposoma proporciona un residuo funcional activo, una amina primaria sobre la superficie liposomal para fines de entrecruzamiento. Ligandos como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) se han unido de manera exitosa con las superficies de los liposomas. Los ligandos se enlazan covalentemente en puntos discretos sobre las superficies de los liposomas. El número y densidad superficial de estos puntos se dictan por la formación del liposoma y por el tipo de liposoma. Las superficies liposomales pueden también tener puntos para asociación o covalente. Parar formar conjugados covalentes de ligandos y liposomas, los reagentes entrecruzadores se han estudiado en relación a su eficacia y biocompatibilidad. Reagentes entrecruzadores incluyen glutaraldehído (GAD), oxirano bifuncional (OXR), éter diglicidil de glicol de etileno (EGDE), y una carbodiimida soluble en agua, preferiblemente 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo) carbodiimida (EDC). A través de la compleja química del enlace cruzado, se establece la unión de los residuos de amina de la sustancia reconocedora y los liposomas.

En otro ejemplo, se describen reagentes entrecruzadores heterobifuncionales y métodos de uso de los reagentes entrecruzadores (Patente de Estados Unidos 5,889,155). Los reagentes entrecruzadores combinan un residuo de hidracida nucleofílico con un residuo de maleimida electrofílico, permitiendo el enlace en un ejemplo de aldehídos con tioles libres. El reagente entrecruzador puede modificarse para entrecruzar varios grupos funcionales. Ácidos Nucleicos (no forman parte de la invención)

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden codificar un péptido dirigidos, una proteína receptora o una proteína de fusión. El ácido nucleico puede derivarse de ADN genómico, ADN complementario (cADN) o ADN sintético. Cuando se desea una incorporación a un vector de expresión, el ácido nucleico puede también comprender un intrón natural o un intrón derivado de otro gen. Estas moléculas producidas a veces son referidas como “minigenes”.

Un “ácido nucleico” tal y como aquí se emplea incluye moléculas de cadena sencilla y doble cadena, así como ADN, ARN, ácidos nucleicos químicamente modificados y análogos de ácidos nucleicos. Se contempla que un ácido nucleico dentro del alcance de la presente invención puede tener 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 1.7, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230, aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 275, aproximadamente 300, aproximadamente 325, aproximadamente 350, aproximadamente 375, aproximadamente 400, aproximadamente 425, aproximadamente 450, aproximadamente 475, aproximadamente 500, aproximadamente 525, aproximadamente 550, aproximadamente 575, aproximadamente 600, aproximadamente 625, aproximadamente 650, aproximadamente 675, aproximadamente 700, aproximadamente 725, aproximadamente 750, aproximadamente 775, aproximadamente 800, aproximadamente 825, aproximadamente 850, aproximadamente 875, aproximadamente 900, aproximadamente 925, aproximadamente 950, aproximadamente 975, aproximadamente 1000, aproximadamente 1100, aproximadamente 1200, aproximadamente 1300, aproximadamente 1400, aproximadamente 1500, aproximadamente 1750, aproximadamente 2000, aproximadamente

5 2250, aproximadamente 2500 o más residuos nucleótidos en longitud.

Se contempla que los péptidos dirigidos, proteínas de fusión y receptores pueden codificarse por acción de una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia apropiada de aminoácido. El

10 diseño y la producción de ácidos nucleicos que codifican una secuencia determinada de aminoácido son bien conocidos por los expertos en la técnica, que utilizan tablas estandarizadas de codón (ver Tabla 2 a continuación). En realizaciones preferentes, los codones seleccionados para codificar cada aminoácido pueden

15 modificarse para optimizar la expresión del ácido nucleico en la célula huésped que interesa. Los codones preferentes para varias especies de célula huésped son bien conocidos en la técnica. TABLA 2

imagen2

Además de los ácidos nucleicos que codifican el péptido dirigido deseado, la proteína de fusión o la secuencia receptora de aminoácido, la presente invención abarca ácidos nucleicos complementarios que se hibridizan bajo elevadas condiciones muy rigurosas para hibridización de ácido nucleico son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, las condiciones pueden consistir en condiciones de sal baja y/o alta temperatura, como las provistas por

0.02 M hasta aproximadamente 0.15 M NaCl a temperaturas desde aproximadamente 50ºC hasta aproximadamente 70ºC. Se entiende que la temperatura y la fuerza iónica de una rigurosidad determinada se determinan en parte por la longitud de los ácidos nucleicos particulares, la longitud y el contenido nucleótido de la secuencia objetivo, la composición de carga de los ácidos nucleicos y la presencia o concentración de formamida, cloruro de tetrametilamonio u otros solventes en una mezcla de hibridización.

Vectores para Clonación, Transferencia Genética y Expresión

En ciertas realizaciones, se emplean vectores de expresión para expresar el péptido dirigido o la proteína de fusión, que a continuación se purificará y usará. En otras realizaciones, los vectores de expresión se usan en terapia genética. La expresión requiere que existan señales apropiadas en los vectores, y que incluyan varios elementos reguladores, como realzadores/impulsores de fuentes tanto virales como mamíferas que conducen la expresión de los genes de interés a las células huéspedes. Los elementos diseñados para optimizar la estabilidad y traslación del ARN mensajero en las células huéspedes son también conocidos. Elementos Reguladores

Los términos “construcción de expresión” o “vector de expresión” pretenden incluir cualquier tipo de construcción genética que contenga un ácido nucleico codificador de un gen en el que toda

o parte de la secuencia codificadora de ácido nucleico es capaz de ser transcrita. En realizaciones preferentes, el ácido nucleico que codifica un gen está bajo control transcripcional de un promotor o impulsor. Un “promotor” hace referencia a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida requerida para iniciar la transcripción específica de un gen. La expresión “bajo control transcripcional” significa que el promotor se encuentra en la localización y orientación correcta en relación con el ácido nucleico para controlar el inicio de polimerasa ARN y la expresión del gen.

Se considera que el promotor particular empleado para controlar la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés no es importante, siempre y cuando sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico a la célula objetivo. Por lo tanto, cuando el objetivo es una célula humana, es preferible posicionar el ácido nucleico codificador de la región adyacente o bajo el control de un promotor que sea capaz de expresarse en una célula humana. En términos generales, dicho promotor podría incluir bien un promotor humano o viral.

En varias realizaciones, el promotor genético temprano inmediato de citomegalovirus humano (CVM), el promotor temprano SV40, la repetición de la terminal larga del virus de sarcoma de Rous, el promotor de insulina de rata, y el promotor dehidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato pueden usarse para obtener expresión de alto nivel de la secuencia codificadora de interés. El uso de otros promotores de fagos virales, celulares mamíferos o bacterianos que son bien conocidos en la técnica para conseguir la expresión de una secuencia codificadora de interés también se contempla, siempre y cuando los niveles de expresión sean suficientes para un fin específico.

Cuando se emplea una inserción de cADN, normalmente se incluirá una señal de poliadenilación para efectuar una poliadenilación apropiada de la transcripción del gen. La naturaleza de la señal de poliadenilación es crucial en la práctica exitosa de la invención, y puede emplearse cualquiera de estas secuencias, como señales de la hormona del crecimiento humano y señales de poliadenilación SV40. También se considera que un finalizador es un elemento de la construcción de expresión. Estos elementos pueden servir para aumentar los niveles del mensaje y para minimizar la lectura desde la construcción a otras secuencias.

Marcadores Seleccionables

En ciertas realizaciones de la invención, las células que contienen constructos de ácido nucleico de la presente invención pueden identificarse in vitro o in vivo incluyendo un marcador en el constructo de expresión. Estos marcadores conferirán un cambio identificable a la célula lo que permite una sencilla identificación de células que contienen el constructo de expresión. Normalmente, la inclusión de un marcador en la selección de un fármaco ayuda a clonar y a seleccionar los transformantes. Por ejemplo, genes que confieren resistencia a la neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son útiles marcadores seleccionables. Como alternativa, pueden emplearse enzimas tales como quinasa de timidina del virus herpes simple (tk) o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). También pueden emplearse marcadores inmunológicos. Se cree que no es importante el marcador seleccionable empleado, siempre y cuando sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico codificador del gen. Los expertos en la técnica conocen más ejemplos de marcadores seleccionables. Envío de Vectores de Expresión

Existe un número de maneras en las que vectores de expresión pueden introducirse en células. En ciertas realizaciones de la invención, el constructo de expresión comprende un virus o un constructo fabricado derivado de un genoma viral. La habilidad de ciertos virus para entrar en células por medio de endocitosis mediada por receptores, para integrarse en el genoma de la célula huésped, y para expresar genes virales establemente y eficientemente les han convertido en atractivos candidatos para la transferencia de genes externos a células mamarias (Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Temin, 1986). Los vectores preferentes para terapia genética son generalmente los vectores virales.

A pesar de que algunos virus que pueden aceptar material genético externo se limitan al número de nucleótidos que pueden acomodar y la variedad de células que infectan, estos virus han demostrado con éxito efectuar expresión genética. Sin embargo, los adenovirus no integran su material genético al genoma del huésped, y por lo tanto no requieren réplica del huésped para la expresión genética lo que les hace idealmente adecuados para una expresión genética rápida, eficiente y heteróloga. Técnicas para la preparación de virus infecciosos de réplica son bien conocidas en la técnica.

Al usar sistemas de envío virales, se deseará purificar el virión lo suficiente como para dejarlo libre de contaminantes no deseables, como partículas virales infecciosas que se entrometen o endotoxinas y otros pirógenos de modo que no provocará ninguna reacción adversa en la célula, animal o individual que reciba el constructo de expresión. Medios preferentes para purificar el vector incluyen el uso de gradientes de densidad flotante, como centrifugación con gradiente de cloruro de cesio.

Los virus de ADN usados como vectores de gen incluyen el papovavirus (p. ej., virus simiesco 40, virus del papiloma bovino, y polioma) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986) y adenovirus (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986).

Uno de los métodos preferentes para envío in vivo incluye el uso de un vector de expresión de adenovirus. Aunque los vectores de adenovirus son conocidos por tener poco capacidad de integración en ADN genómico, esta caracteriza sirve de contrapeso a la elevada eficiencia de transferencia de gen producido por estos vectores. “Vector de expresión de adenovirus” pretende incluir, aunque no se limita a, construcciones que tienen suficientes secuencias de adenovirus como para (a) soportar el empaquetamiento del constructo y (b) expresar un polinucleótido sentido o antisentido que se ha clonado aquí.

El vector de expresión comprende una forma de adenovirus genéticamente producida. El conocimiento de la organización genética del adenovirus, un virus de ADN de cadena doble, lineal y 36 kb, permite la sustitución de granes piezas de ADN adenoviral por secuencias externas de hasta 7 kb (Grunhaus y Horwitz, 1992). A diferencia de la infección retroviral, la infección adenoviral de células huéspedes no da como resultado la integración cromosomal porque ADN adenoviral puede replicar de una manera episomal sin genotoxicidad potencial. Además, los adenovirus son estructuralmente estables, y no se ha detectado ninguna reorganización genómica tras la extensa amplificación. Los adenovirus pueden virtualmente infectar todas las céulas epiteliales con independencia de su estado en el ciclo celular. Hasta ahora, la infección adenoviral parece estar unida solamente a enfermedades leves como enfermedad respiratoria aguda en humanos.

Adenovirus es particularmente adecuado para uso como vector de transferencia genética debido a su genoma de tamaño medio, fácil manipulación, elevado título, amplia gama de células objetivo y elevada infectividad. Ambos extremos del genoma viral contienen 100-200 repeticiones invertidas de parejas base (ITRs), que son elementos cis necesarios para la réplica de ADN y el envasado. Las región temprana (E) y tardía (L) del genoma contienen diferentes unidades de transcripción que se dividen tras la aparición de la réplica viral de ADN. La región E1 (E1A y E1B) codifica las proteínas responsables de la regulación y transcripción del genoma viral y unos pocos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) da como resultado la síntesis de las proteínas para réplica viral de ADN. Estas proteínas están incluidas en la réplica de ADN, expresión de gen tardío y desactivación de la célula del huésped (Renan, 1990). Estos productos de los genes tardíos, incluyendo la mayoría de las proteínas de la cápside viral, solamente se expresan tras un significante proceso de una transcripción primaria sencilla emitida por el principal promotor temprano (MLP). El MLP (localizado en 16.8 m.u) es particularmente eficiente durante la fase tardía de la infección, y los mARNs emitidos desde este promotor poseen un líder tripartito en 5’ (TPL), secuencia que les hace mARNs preferentes para la traslación.

En sistemas usados en la actualidad, el adenovirus recombinante se genera a partir de una recombinación homóloga entre el vector lanzadera y vector provirus. Debido a la posible recombinación entre los dos vectores provirales, el adenovirus de tipo salvaje puede generarse a partir de este proceso. Por lo tanto, es crucial aislar un único clon del virus de una placa individual para examinar su estructura genómica.

La generación y propagación de vectores adenovirus que no tienen réplica depende de una única línea celular ayudante, designada 293, que se transforma a partir de células embriónicas del riñón humano por fragmentos ADN Ad5 y expresa de manera constitutiva proteínas E1 (Graham et al., 1977). Debido a que la región E3 es prescindible del genoma adenovirus (Jones y Shenk, 1978), los vectores adenovirus actuales, con la ayuda de células 293, transportan ADN externo en E1, E3 o en ambas regiones (Graham and Prevec, 1991). De por sí, los adenovirus pueden empaquetar aproximadamente 105% del genoma del tipo salvaje (Ghosh-Choudhuri et al., 1987), proporcionando capacidad para aproximadamente 2 extra kb de ADN. En combinación con los aproximadamente 5.5 kb de ADN que es sustituible en las regiones E1 y E3, la capacidad máxima del vector adenovirus actual está por debajo de 7.5 kb, o aproximadamente 15% de la longitud total del vector. Más del 80% del genoma viral de adenovirus se queda en el eje del vector y es la fuente de la toxicidad contenida en el vector. Así mismo, la deficiencia de réplica del virus eliminado en E1 es incompleta. Por ejemplo, se ha observado escape de expresión genética viral con los vectores actualmente disponibles en elevadas multiplicidades de infección (MOI) (Mulligan, 1993).

Las líneas celulares de ayuda pueden derivarse de células humanas como células embriónicas del riñón humano, células musculares, células hematopoyéticas u otras células mesenquimales

o epiteliales embriónicas humanas. Como alternativa, las células ayudantes pueden derivarse de células u otras especies mamíferas que son permisivas para adenovirus humano. Estas células incluyen, por ejemplo, células Vero y otras células mesenquimales o epiteliales embriónicas del mono. Tal y como se ha debatido, la línea celular ayudante preferente es 293.

Racher et al. (1995) describió métodos mejorados para cultivar células 293 propagando adenovirus. En un formato, los agregados celulares naturales crecen mediante inoculación de células individuales en frascos centrifugadores con silicona de 1 litro (Techne, Cambridge, UK) que contienen 100-200 ml de medio. Tras agitación a 40 rpm, se estima la viabilidad de las células con azul tripán. En otro formato, se emplean microportadores Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/l) del siguiente modo. Un inóculo celular, resuspendido en 5 ml de medio, se añade al portador (50 ml) en un matraz Erlenmeyer y se deja inmóvil, con agitación ocasional, de 1 a 4 horas. A continuación, el medio se sustituye con 50 ml de medio fresco y se inicia la agitación. Para la producción de virus, se deja crecer las células hasta lograr una confluencia del 80%, y a continuación el medio se reemplaza (hasta el 25% del volumen final) y se añade adenovirus a MOI de 0.05. Los cultivos se dejan inmóviles durante la noche, y después el volumen se aumenta hasta el 100% y se comienza la agitación durante otras 72 horas.

Aparte del requisito de que el vector adenoviral carece de réplica, o al menos es condicionalmente defectuoso, se cree que la naturaleza del vector adenoviral no es crucial para la buena práctica de la invención. El adenovirus puede ser de cualquiera de los 42 diferentes serotipos conocidos o subgrupos A-F. El adenovirus tipo 5

o subgrupo C es el material inicial preferente con el fin de obtener el condicional vector adenoviral defectuoso de réplica para uso en la presente invención. Esto es porque el Adenovirus tipo 5 es un adenovirus humano sobre el que se conoce mucha información bioquímica y genética e históricamente se ha empleado par la mayor parte de las construcciones que emplean adenovirus como un vector.

Un vector habitual aplicable para practicar la presente invención es defectuoso de réplica y no tendrá una región E1 de adenovirus. Por lo tanto, resulta más conveniente introducir el polinucleótido que codifica el gen en la posición desde la cual se han retirado las secuencias codificadoras de E1. Sin embargo, la posición de inserción del constructo dentro de las secuencias del adenovirus no tiene importancia fundamental. El polinucleótido que codifica el gen de interés también puede insertase en lugar de la región eliminada E3 en los vectores de sustitución de E3 tal y como describe Karlsson et al., (1986) o en la región E4 donde una línea celular ayudante o un virus ayudante complementan el defecto de E4.

Los adenovirus son fáciles de madurar y manipular y muestran una amplia variedad de huéspedes in vivo e in vivo. Este grupo de virus puede obtenerse en elevados títulos, por ejemplo, 109-1011 unidades formadoras de placa por ml, y son muy infectivos. El ciclo de vida de adenovirus no requiere integración en el genoma de célula huésped. Los genes externos enviados por los vectores de adenovirus son episomales y, por lo tanto, tienen baja genotoxicidad en las células huéspedes. No se han observado efectos secundarios en los estudios de vacunación con adenovirus de tipo salvaje (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), lo que demuestra seguridad y potencial terapéutico como vectores de transferencia genética in vivo.

Los vectores adenovirales se han usado en expresión de gen eucariótico (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al.,1992) y desarrollo de vacunas (Grunhaus y Horwitz, 1992; Graham y Prevec, 1991). Estudios animales han demostrado han sugerido que pueden usarse adenovirus recombinantes para terapia genética (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Estudios para la administración de adenovirus recombinante a diferentes tejidos incluyen la instilación traqueal (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), inyección muscular (Ragot et al., 1993), inyecciones intravenosas periféricas (Herz y Gerard, 1993) e inoculación estereostática en el cerebro (Le Gal La Salle et al., 1993).

Pueden construirse otros vectores de transferencia genética a partir de retrovirus. Los retrovirus son un grupo de virus de ARN de cadena sencilla caracterizados por su habilidad para convertir sus ARN a ADN de doble cadena en células infectadas mediante un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990). A continuación, el ADN resultante se integra de manera estable en los cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de proteínas virales. La integración resulta en la retención de las secuencias genéticas virales en la célula recipiente y en sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes, gag, pol y env, que codifican las proteínas de la cápside, enzima de polimerasa y componentes de envoltura, respectivamente. Una secuencia encontrada en dirección descendente desde el gen gag contiene una señal para empaquetar el genoma en viriones. Dos secuencias de repetición terminales largas (LTR) están presentes en los extremos 5’ y 3’ del genoma viral. Estas contienen fuertes secuencias promotoras y aumentadoras, y también son necesarias para la integración del genoma de la célula huésped (Coffin, 1990).

Con el fin de construir un vector retroviral, un ácido nucleico que codifica la proteína de interés se inserta en el genoma viral en el lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que sea defectuoso de réplica. Con el fin de producir virones, se construye una línea celular empaquetadora que contiene los genes gag, pol y env, pero sin LTR y componente empaquetadores (Mann et al., 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene un cADN, junto con LTR retroviral y secuencias empaquetadoras se introduce en esta línea celular (por ejemplo, con un precipitador de fosfato cálcico), la secuencia empaquetadora permite que la transcripción de ARN del plásmido recombinante se pueda empaquetar en partículas virales, que a continuación se segregan en el medio de cultivo (Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). El medio que contiene los retrovirus recombinantes se recoge a continuación, opcionalmente se concentra y se usa para transferencia genética. Los vectores retrovirales son capaces de infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la integración y la expresión estable requieren la división de células huéspedes (Paskind et al., 1975).

Existen ciertas limitaciones en el uso de vectores retrovirales. Por ejemplo, los vectores retrovirales normalmente se integran en puntos arbitrarios en el genoma celular. Esto puede llevar a mutagénesis insercional a través de la interrupción de genes huéspedes o a través de la inserción de secuencias virales reguladoras que pueden interferir en la función de genes adyacentes (Varmus et al., 1981). Otra preocupación sobre el uso de vectores retrovirales defectuosos consiste en la potencial aparición de virus competente de réplica de tipo salvaje en las céulas empaquetadoras. Esto puede ser el resultado de procesos de recombinación en los que la secuencia intacta del virus recombinante se inserta en dirección ascendentes desde la secuencia gag, pol, env integradas en el genoma de célula huésped. Sin embargo, actualmente nuevas líneas celulares empaquetadoras se encuentran disponibles que deberían hacer descender en gran medida la probabilidad de recombinación (Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).

Pueden emplearse otros vectores virales como constructos de expresión. Pueden emplearse vectores derivados del virus vaccinia (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), virus adeno-asociado (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Hermonat and Muzycska, 1984), y virus del herpes. Ofrecen varias características atractivas para varias células de mamíferos (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).

La presente invención contempla varios métodos no-virales para la transferencia de constructos de expresión a células cultivadas de mamíferos. Estos incluyen precipitación de fosfato cálcico (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporación (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), microinyección directa, Liposomas cargados de ADN y complejos lipfectamina-ADN, sonicación celular, bombardeo genético usando micropoyectiles de velocidad y transfección mediada por receptor (Wu and Wu, 1987; Wu y Wu, 1988). Algunas te estas técnicas pueden adaptarse de manera correcta al uso in vivo o ex vivo.

En una realización adicional de esta invención, el constructo de expresión puede atraparse en un liposoma. Los liposomas son estructura vesiculares caracterizadas por una membrana bicapa fosfolípida y por un medio acuoso interno. Los liposomas multilamerales tienen múltiples capas lípidas separadas por el medio acuoso. Se forman de manera espontánea cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de medio acuoso. Los componentes lípidos sufren una auto-reorganización antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lípidas. También se contemplan complejos lipofectamina-ADN.

El envío de ácido nucleico mediado por liposomas y la expresión de ADN externo in vitro ha obtenido muy buenos resultados. Wong et al., (1980) demostró la viabilidad de envío y expresión de ADN externo mediado por liposomas en embrión cultivado de pollito, HeLa, y células de hepatoma. Nicolau et al., (1987) consiguió con buenos resultados una transferencia genética mediada por liposomas en ratas tras inyección intravenosa.

Pueden usarse varios sistemas de selección entre los que se incluyen, aunque no se limitan a, HSV timidina quinasa, hipoxantinaguanina fosforribosiltransferasa y genes adenina fosforribosiltransferasa en células tk-, hgprt-o aprt-, respectivamente. Así mismo, puede usarse resistencia antimetabolito como base de selección de dhfr, que confiere resistencia a metotrexato; gpt, que confiere resistencia al aminoglicósido G418; e hygro, que confiere resistencia a higromicina. Composiciones Farmacéuticas

Cuando se contemplan aplicaciones clínicas, puede ser necesario preparar composiciones farmacéuticas – vectores de expresión, stocks de virus, proteínas, anticuerpos y fármacos – en una forma apropiada para su posterior aplicación. En general, esto implicará la preparación de composiciones que están esencialmente libres de impurezas que podrían ser perjudiciales para los humanos o animales.

En términos generales, se deseará emplear sales y búferes apropiados que consigan vectores estables de envío y que permitan la respuesta de células objetivo. También se emplean búferes cuando las células recombinantes se introducen en el paciente. Las composiciones acuosas de la presente invención están formadas por una cantidad efectiva de la proteína o péptidos, disueltos o dispersos en un portador o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones son llamadas inóculos. La frase “farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable” hace referencia a entidades o composiciones moleculares que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones perjudiciales cuando se administran a un animal o humano. Tal y como aquí se emplea, “portador farmacéuticamente aceptable” incluye cualquier o todos los solventes, medios de dispersión, baños

o capas, agentes antibacteriano o antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de absorción y similares. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto que los medios o agentes convencionales sean incompatibles con las proteínas o péptidos de la presente invención, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. Ingredientes activos complementarios también pueden incorporarse a las composiciones.

Las composiciones activas de la presente invención pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de estas composiciones de acuerdo con la presente invención se realiza vía cualquiera de las rutas comunes siempre y cuando el tejido objetivo se encuentre disponible a través de esta vía. Estas rutas incluyen oral, nasal, bucal, rectal, vaginal y tópica. Como alternativa, la administración puede ser a través de inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial

o intravenosa. Estas composiciones normalmente se administrarán como composiciones farmacéuticamente aceptables, tal y como se ha indicado anteriormente.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y deben ser fluidos de modo que la adaptación a una jeringa sea sencilla. Deben ser estables bajo las condiciones de fabricación y almacenaje y deben preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, glicol de propileno, y glicol de polietileno líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, usando una capa, como lecitina, para el mantenimiento del tamaño requerido de partícula en caso de dispersión y usando surfactantes. La prevención de acción de microorganismos puede conseguirse con varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcar o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse usando composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones estériles inyectables se preparan incorporando compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios otros ingredientes anteriormente enumerados, si es necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando varios ingredientes activos esterilizados a un vehículo estéril que contiene el medio básico de dispersión y el resto de ingredientes necesarios de los anteriormente enumerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos preferentes de preparación son las técnicas de secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más ingredientes adicionales deseados a partir de una solución previamente filtrada y estéril. Agentes terapéuticos

En ciertas realizaciones, los agentes quimioterapéuticos pueden unirse al péptido o proteína de fusión dirigidos para el envío selectivo a un tumor. Agentes o factores adecuados para uso pueden incluir cualquier compuesto químico que induce daño de ADN cuando se aplica a una célula. Agentes quimioterapéuticos incluyen, aunque no se limitan a, 5-fluorouracil, bleomicina, busulfán, camptotecina, carboplatino, clorambucil, cisplatina (CDDP), ciclofosfamida, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, agentes de enlace de receptor de estrógeno, mecloretamina, melfalán, mitomicina, navelbina, nitrosourea, plicomicina, procarbazina, raloxifeno, tamoxifeno, taxol, temozolomida (una forma acuosa de DTIC), transplatino, vinblastina y metotrexato, vincristina o un análogo o variante derivada de los citados. La mayoría de los agentes quimioterapéuticos corresponden a las siguientes categorías: agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, hormonas corticosteroides, inhibidores mitóticos, y nitrosoureas, agentes hormonales, agentes misceláneos, y análogos

o variantes derivadas de los mismos.

Agentes quimioterapéuticos y métodos de administración, dosis, etc, son bien conocidos por parte de aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, “Physician Desk Reference”, Goodman y Gilman “The Pharmacological Basis of Therapeutics” y en “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, aquí incorporado a modo de referencia en partes relevantes), y pueden combinarse con la invención a la luz de las descripciones aquí presentadas. Necesariamente se dará alguna variación en la dosis dependiendo de la condición del sujeto que está siendo tratado. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos específicos aquí descritos son ejemplares más que limitativos, y un experto en la técnica puede usar otras dosis o agentes para un paciente o aplicación específica. También se espera que se use en la invención una dosis entre estos puntos o rangos aquí derivables. Agentes alquilantes

Los agentes alquilantes son fármacos que directamente interactúan con ADN genómico para evitar la proliferación de céulas cancerígenas. Esta categoría de fármacos quimioterapéuticos representa agentes que afectan a todas las fases del ciclo celular, es decir, no son específicas de fase. Un agente alquilante, puede incluir, aunque no se limita a, mostaza de nitrógeno, un etilenimina, una metilmelamina, un sulfonato de alquilo, una nitrosourea o triazinas. Incluyen pero no se limitan a: busulfán, clorambucil, cisplatino, ciclofosfamida (cytoxan), dacarbazina, ifosfamida, mecloretamina (mustargen) y melfalán. Antimetabolitos

Los antimetabolitos afectan la síntesis de ADN y ARN. A diferencia de los agentes alquilantes, ejercen influencia sobre el ciclo celular durante la fase S. Los antimetabolitos pueden diferenciarse en varias categorías, como análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina y análogos de purina y compuestos inhibidores relacionados. Los antimetabolitos incluyen pero no se limitan a 5-fluorouracil (5-FU), citarabina (Ara-C), fludarabina, gemcitabina y metotrexato. Productos Naturales

Los productos naturales generalmente hacen referencia a compuestos originalmente aislados de una fuente natural, e identificados por tener una actividad farmacológica. Dichos compuestos, análogos y derivados de los mismos pueden asilarse de una fuente natural, sintetizarse químicamente o producirse recombinantemente empleando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Los productos naturales incluyen varias categorías como inhibidores mitóticos, antibióticos antitumorales, enzimas y modificadores de respuesta biológica.

Los inhibidores mitóticos incluyen alcaloides de planteas y otros agentes naturales que pueden inhibir síntesis proteica necesaria para la división celular o mitosis. Funcionan durante una fase específica durante el ciclo celular. Los inhibidores mitóticos incluyen, por ejemplo, docetaxel, etopósido (VP16), tenipósido, paclitaxel, taxol, vinblastina, vincristina y vinorelbina.

Los taxoides son una clase de compuestos relacionados aislados de la corteza del fresno, Taxus brevifolia. Los taxoides incluyen, aunque no se limitan a, compuestos como docetaxel y paclitaxel. Paclitaxel se une a tubulina (en un punto distinto del usado por los alcaloides de la vinca) y promueve la formación de microtúbulos. Los alcaloides de la vinca son un tipo de alcaloide de planta identificados por tener actividad farmacéutica. Incluyen compuestos como vinblastina (VLB) y vincristina. Antibióticos Antitumorales

Los antibióticos antitumorales tienen actividad antimicrobial y citotóxica. Estos fármacos pueden interferir con ADN inhibiendo químicamente las enzimas y mitosis o alterando las membranas celulares. Estos agentes no son específicos de fase de modo que funcionan en todas las fases del ciclo celular. Ejemplos de antibióticos tumorales incluyen, pero no se limitan a, bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina (Adriamicina), plicamicina (mitramicina) e idarubicina. Hormonas

Se considera que las hormonas corticosteroides son fármacos para quimioterapia cuando se implementan para eliminar o ralentizar el crecimiento de células cancerígenas. Las hormonas corticosteroides pueden aumentar su eficacia de otros agentes quimioterapéuticos, y como consecuencia, con frecuencia se emplean en tratamientos de combinación. Prednisona y dexametasona son ejemplos de hormonas corticosteroides.

Progestinas, como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y acetato de megestrol se han usado en cánceres de endometrio y pecho. Estrógenos como dietilestilbestrol y etinil estradiol se han usado en cánceres como de pecho y próstata. Antiestrógenos como tamoxifeno se han usado en cánceres como de pecho. Andrógenos como propionato de testosterona y fluoximesterona también se han usado en el tratamiento de cáncer de pecho. Antiandrógenos como flutamida se han usado en el tratamiento de cáncer de próstata. Los análogos de hormona que liberan gonadotropina como leuprolida se han usado en el tratamiento de cáncer de próstata. Agentes Misceláneos

Algunos agentes quimioterapéuticos no corresponden a las categorías previas en base a sus actividades. Incluyen, pero no se limitan a, complejos de coordinación de platino, antracenodiona urea sustituida, derivado de hidracina de metilo, inhibidor adrenal cortical, amsacrina, L-asparagina y tretinoina. Se considera que pueden usarse en composiciones y métodos de la presente invención.

Los complejos de coordinación de platino incluyen compuestos tales como carboplatina y cisplatina (cis-DDP). Un antracenodiona como mitoxantrona se ha usado para tratar leucemia granulocítica aguda y cáncer de pecho. Una urea sustituida como hidroxiurea se ha usado para tratar leucemia granulocítica aguda, policitemia vera, trombocitosis esencial y melanoma maligno. Un derivado de hidrazina de metilo como procarbazina (N-metilhidrazina, MIH) se ha usado en el tratamiento de enfermedad de Hodgkin. Un inhibidor adrenocortical como mitotano se ha usado para tratar cáncer de corteza adrenal, mientras que aminoglutetimidina se ha usado para tratar enfermedad de Hodgkin.

Reguladores de Muerte Celular Programada

Apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso esencial para el desarrollo embriónico normal, manteniendo homeostasis en tejidos adultos, y suprimiendo carcinogénesis (Kerr et al., 1972). La familia Bcl-2 de proteínas y las proteasas similares a ICE han demostrado ser importantes reguladores y efectores de apoptosis en otros sistemas. La proteínas Bcl-2, descubierta en asociación con linfoma folicular, juega un papel primordial en el control de apoptosis y en el incremento de supervivencia celular en respuesta a diversos estímulos apoptóticos (Bakhshi et al., 1985; Cleary y Sklar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto y Croce, 1986). La proteína Bcl-2 conservada en la evolución ha sido ahora reconocida como miembro de una familia de proteínas relacionadas, que pueden categorizarse como agonistas de muerte o antagonistas de muerte.

Tras este descubrimiento, se demostró que Bcl-2 actúa para eliminar la muerte celular provocada por una serie de estímulos. Así mismo, ahora resulta obvio que existe una familia de proteínas Bcl-2 reguladoras de muerte celular que comparten estructuras y homologías secuenciales comunes. Estos miembros de diferente familia han demostrado tener funciones similares a Bcl-2 (p. ej., BclXL, BclW, BclS, Mcl-1, A1, Bf1-1) o contrarrestan la función de Bcl-2 y promueven la muerte celular (p. ej., Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri).

Ejemplos no limitativos de agentes proapoptosis dentro del alcance de la presente invención incluyen gramicidina, magainina, melitina, defensina, cecropina, (KLAKLAK)2 (SEQ ID NO:1), (KLAKKLA)2 (SEQ ID NO:2), (KAAKKAA)2 (SEQ ID NO:3) o (KLGKKLG)3 (SEQ ID NO:4).

Inhibidores angiogénicos

En ciertas realizaciones la presente invención puede incluir la administración de péptidos dirigidos unidos a agentes angiogénicos, como angiotensina, péptidos de laminina, péptidos de fibronectina, inhibidores de activador del plasminógeno, inhibidores de metaloproteinasa de tejido, interferones, interleuquina 12, factor plaquetario 4, IP-10, Gro-β, trombospondina, 2-metoxioestradiol, proteína relacionada con proliferina, carboxiamida triazol, CM101, Marimastat, polisulfato de pentosan, angiopoyetina 2 (Regeneron), interferón-alfa, herbimicina A, PNU145156E, fragmento de prolactina 16K, Linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteína, TNP-470, endostatina, paclitaxel, acutina, angiostatina, cidofovorin, vincristina, bleomicina, AGM-1470, factor plaquetario 4 o minociclina. Dosis

El experto en la técnica se dirige a “Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15ª edición, capítulo 33, y en particular a las páginas 624-652. Necesariamente existirán variaciones en la dosis dependiendo del la condición del sujeto a ser tratado. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para administración humana, las preparaciones deben cumplir los estándares de esterilidad, pirogenicidad yseguridad ypureza general requeridos por la Oficina de Biología de la Administración de Drogas y Alimentos de Estados Unidos. EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos 1 y 2, 4 y 9 no son realizaciones de la invención. El experto en la técnica apreciará que las técnicas descritas en los ejemplos a continuación representan técnicas descubiertas por los inventores para funcionar de manera adecuada en la práctica de la invención, y por lo tanto pueden considerarse como modelos preferentes para su práctica. Ejemplo 1. Péptidos Dirigidos a la Médula Ósea

Un ejemplo no limitativo de órgano de especial interés para péptidos dirigidos es la médula ósea. El hueso es el lugar preferente de metástasis en la gran mayoría de pacientes con cáncer de próstata (Fidler, 1999). Esta sorprendente selectividad ha sido vista como un ejemplo de interacciones específicas de lugar que fueron esenciales para la progresión de cáncer (Rak, 1995; Zetter, 1998). A pesar de la relevancia clínica, se sabe poco sobre los mecanismos que controlan la extensión del cáncer de próstata al hueso. Además, no se encontraron estrategias selectivas para dirigir agentes terapéuticos en el tratamiento de cáncer metastático de próstata (Brodt, et al., 19996).

Un subconjunto de péptidos capaces de dirigirse de manera selectiva a la médula ósea a través de la circulación tiene posibilidades de estimular el comportamiento de células cancerígenas de la próstata durante la formación de metástasis en el hueso. Los marcadores vasculares dirigidos usando exposición del fago también pueden utilizarse por parte de céulas tumorales para provocar metástasis. Este concepto ya ha demostrado ser cierto para péptidos dirigidos a los pulmones. Los péptidos que se dirigen a los vasos sanguíneos de los pulmones inhiben metástasis experimental. Estos resultados encajan en un modelo de “semilla y tierra modificadas”, en el que la base para la metástasis específica del sitio es la presencia de receptores dirigidos en los vasos sanguíneos de ciertos tejidos en los que la metástasis preferentemente se da. Estos marcadores vasculares selectivos se exponen a las células tumorales durante la adhesión, el primer paso de la cascada metastática. El aislamiento de péptidos dirigidos a la médula ósea es de utilidad para identificar aquellos marcadores vasculares que median la dirección a la célula cancerígena de la próstata durante el proceso metastático, y para una potencial intervención terapéutica en la prevención de metástasis en la médula, o para representar de manera visual y selectiva y/o tratar cáncer que ya se ha extendido al hueso. Métodos

Se usó una selección in vivo de bibliotecas de fagos para aislar péptidos que se enlazan con la médula ósea en ratones. Los péptidos dirigidos a la médula ósea se caracterizaron con respecto a su habilidad para inhibir metástasis en modelos de ratón con cáncer de próstata. Se usaron cromatografía de afinidad y clonación molecular para identificar los receptores los péptidos dirigidos a la médula ósea. Las composiciones y métodos aquí descritos se usaron para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas contra el cáncer de próstata que se centraran en la prevención y en el tratamiento de metástasis ósea.

Selecciones in vivo para aislar péptidos que se dirigen a la médula ósea en ratones.

Bibliotecas de fago se inyectaron intravenosamente. Las bibliotecas se prepararon de acuerdo con el protocolo de Smith y Scott (1985) con mejoras, comentadas a continuación. El fago en estas bibliotecas mostró inserciones que oscilaron entre 5 y 11 residuos. Muestras de tejido se procesaron para el rescate de fago mediante transferencia a 1 ml DMEM-PI en un tubo de cristal y se homogenizaron con un molinillo. La médula ósea no necesita homogenización, mientras que otros órganos que se usaron como controles necesitaban molerse antes de homogeneizarse eficientemente. Las muestras se transfirieron a tubos Eppendorf autoclavados de 2 ml. Las muestras se lavaron con DMEM-PI helado que contenía 1% BSA. Después de 3 lavados, las bolitas se volvieron a suspender y se pusieron a 37ºC antes de añadir las bacterias. La incubación de las muestras de tejidos lavadas con 1.5 ml de bacteria K91-kan competente (OD600 0.2 en 1:10 dil.) durante una hora a temperatura ambiente se usó para recuperar las partículas fágicas.

Múltiples alícuotas se emplataron en placas o platos LB tet/kan que contenían 40 µg/ml de tetraciclina y 100 µg/ml de kanamicina. La colocación en placas se realizó en varias concentraciones, cubriendo una gran parte de la muestra, es decir, 3 ml, 1 ml, 300 µl, 100 µl, 30 µl. Las gotas que se usaron para emplatar se pasaron a dos placas LB tet/kan de 10 cm para recuperar todos los clones bacterianos potencialmente infectados atrapados en la superficie de la gota. Los platos se incubaron durante la noche a 37ºC. El resto del cultivo infectado, 2-3 ml (incluyendo el tejido homogenizado) se transfirió a 10 ml de medio LB que contenía 40 µg/ml tetraciclina y 100 µg/ml kanamicina (LB tet/kan) y se colocaron en un agitador a 37ºC durante 2 horas. Los cultivos de 12 ml se expandieron a LB tet/kan de 1 litro y crecieron durante la noche en el agitador a 37ºC. Los fagos se rescataron del total de cultivo bacteriano amplificado después de 12-16 horas, de acuerdo con los protocolos estándares y se guardaron para posteriores rondas de selección. De las placas/platos en la incubadora, se secuenciaron colonias bien separadas de la médula ósea. Las colonias se transfirieron a placas con 96 pozos que contenían 20 µl PBS/pozo para secuenciar.

Se usó tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-M13 para examinar los pagos dirigidos en varios tejidos (Pasqualini y Ruoslahti, 1996; Arap et al, 1998). Los pagos se inyectaron IV y se dejaron circular durante 5 minutos o 24 horas. Los ratones en el experimento de 5 minutos fueron sometidos a perfusión con DMEM tras la inyección de fago para retirar el fago separado de la circulación. Hubo pocos fagos circulando después de 24 horas (Arap et al., 1998 a, 1998b). Los animales fueron sacrificados, los tejidos recogidos, fijados con solución de Bouin, seccionados y tintados con anticuerpos contra los fagos. Resultados Médula ósea murina dirigida in vivo en ratones

Los motivos secuenciales dirigidos de médula ósea se identificaron inyectando por vía intravenosa bibliotecas de fagos a ratones y recuperando fagos de la médula ósea. Los fagos se inyectaron intravenosamente, se recuperaron de la médula ósea, se amplificaron repetitivamente in vitro y se volvieron a inyectar para obtener suficiente enriquecimiento. Después de tres series de selección, se obtuvieron las preparaciones de fagos que se dirigían a la médula ósea del ratón. Los fagos individuales mostraron una especificidad al órgano similar a la de los fagos reunidos tras la inyección intravenosa. Varios motivos peptídicos fueron identificados y caracterizados. La mayoría de los motivos prometedores que muestran especificidad in vivo se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Secuencias en fagos que captan médula ósea murina in vivo.

CX3CX3CX3C biblioteca peptídica CVMT CAPRC F E H C (SEQ ID NO:5) CDGV CAPRC G E R C (SEQ ID NO:6) C T G G C V V D C L S I C (SEQ ID NO:7) CGVP CRPAC R G L C (SEQ ID NO: 8) C A G F C V P G C H S K C (SEQ ID NO: 9) C A G A C P V G C G T G C (SEQ ID NO: 10) X6 biblioteca peptídica AE RLWR S (SEQ ID NO:11) S Q H V V S G (SEQ ID NO: 12) IA WRLE H (SEQ ID NO: 13) W Y T V M S W (SEQ ID NO: 14) RL T Y K L Q (SEQ ID NO:15) W Q R L Y A W (SEQ ID NO:16) E F R L G S K (SEQ ID NO: 17) L G S N S K A (SEQ ID NO: 18) C G V V K F A (SEQ ID NO:19)

El experto en la técnica se dará cuenta de que las secuencias peptídicas dirigidas a la médula ósea aquí identificadas se podrán usar en numerosas aplicaciones dentro del alcance de la presente invención, incluyendo pero sin limitar, el envió dirigidos de agentes terapéuticos o terapia genética, visualización in vivo de órganos, tejidos o tipos celulares normales o enfermos, identificación de receptores y ligandos de receptores en órganos, tejidos y tipos celulares, y tratamiento terapéutico en un número de enfermedades humanas, en particular cáncer de próstata metastático. Ejemplo 2. Péptidos dirigidos a Próstata y Cáncer de Próstata

Otro órgano no limitativo de particular interés para su dirección es la próstata. La próstata es un órgano inusual porque continúa creciendo durante la vida adulta. Como resultado, hipertrofia benigna de próstata (BPH) afecta a la mayoría de los hombres mayores en más o menos grado. Y lo que es más serio, la próstata es un punto habitual de tumores malignos. Debido a que los marcadores de suero para cáncer de próstata han estado disponibles, muchos de estos tumores malignos se detectaron pronto en el curso de la enfermedad. Ante la ausencia de métodos fiables para predecir cuáles progresarían clínicamente, muchos se trataron de manera agresiva con cirugía o radioterapia, a menudos con devastadores efectos secundarios como incontinencia e impotencia (Lane y Shah, 1999, Mikolajczyk et al., 2000). Existe una clara necesidad de obtener métodos mejorados para la detección, prognosis y tratamiento de cáncer de próstata en humanos.

Muchos genes interesantes en la próstata pueden expresare en localizaciones celulares restringidas, pero quizás muy específicas y accesibles, como la vasculatura prostática. Por lo tanto, pueden observarse objetivos potenciales para la intervención mediantes secuencias de alto rendimiento o técnicas de selección genética que no representan la heterogeneidad molecular intrínseca a contextos microanatómicos o fisiológicos.

Los métodos de la presente invención permiten la identificación de péptidos que se dirigen a objetivos específicos in vivo (Pasqualini et al., 1996, 1997, Koivunen et al., 1999; Pasqualini, 1999). La selección in vivo de bibliotecas peptídicas de fagos produce péptidos que son capaces de dirigirse a receptores específicos en tejidos objetivo a través de la circulación. Estos estudios han revelado un sorprendente grado de especialización en varios tejidos normales (Pasqualini, 1999; Rajotte et al., 1998, 1999). El ejemplo presente se ocupa de composiciones y métodos de uso de péptidos dirigidos a la próstata. Métodos Dirección fágica in vivo de la próstata

Bibliotecas de exposición fágica se inyectaron intravenosamente. Las muestras se dejaron en hielo en todos los momentos. Las muestras de tejió prostático se procesaron del siguiente modo. La primera muestra se almacenó a -80ºC como reserva de seguridad. La segunda muestra se procesó para histología/patología y HE o inmunotinción fágica anti-M13. La tercera muestra se dividió bajo condiciones claras para obtener tres fragmentos con el mismo peso.

Los triplicados de la tercera muestra de próstata se procesaron para infección bacteriana del huésped y recuperación fágica. La muestra de próstata se transfiere a inhibidores de proteasa de 1 ml DMEM (PI) en un molinillo de tejidos de cristal, se homogenizó y la suspensión celular se transfirió a un tubo Eppendorf autoclavado de 2 ml. A continuación, las muestras de los tejidos de próstata se lavaron tres veces con DMEM-PI muy frío que contenía 1 % BSA. El tejido se mezcló con DMEM-PI y se removió durante 30 segundos después de cada lavado. Tras girar a 4.000 rpm durante 3 minutos, el sobrenadante se descartó cuidadosamente (el precipitado del tejido debería dejarse intacta). A continuación, se añadieron 15 ml DMEM-PI/BSA. Después del tercer lavado, el precipitado se removió brevemente para volver a suspender el precipitado disuelto calentado brevemente a 37ºC antes de añadir la bacteria huésped. A continuación, la mezcla se incubó con 1.5 ml de bacteria K91-kan competente (OD600=2) durante una hora a temperatura ambiente.

La mezcla se transfirió a tubos Falcon que contenían 10 ml de medio LB más 0.2 µg/ml de tetraciclina a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las múltiples alícuotas se emplataron en placas

o platos LB tet/kan que contenían 40 µg/ml de tetraciclina y 100 µg/ml de kanamicina. Finalmente, los platos se incubaron a 37ºC y se determinó el total de unidades transductoras de fago tras una incubación durante toda la noche.

Dirección al Cáncer de Próstata

Los vasos sanguíneos tumorales son conocidos por estar agujereados. Una exposición a largo plazo del sujeto ratón a un biblioteca de exposición de fagos puede dar como resultado la migración de fagos y la unión a marcadores celulares de cáncer de próstata. Los ratones se incubaron con una biblioteca fágica durante 24 horas para alcanzar los marcadores celulares cancerígenos.

Los ratones macho que no habían sido sometidos al tratamiento (4 ratones) fueron inyectados con 106 DU-145 células en PBS. Tras el crecimiento del tumor, a los ratones se les inyectó cualquiera de las bibliotecas de exposición fágica CX10C. Después de dejar que la biblioteca circulara durante 24 horas, los ratones fueron sacrificados y se recogieron las muestras de los tejidos. Las muestras se homogenizaron en un homogeneizador Dounce y se añadieron bacterias D91 a una serie de diluciones. Las bacterias se emplataron en placas kan/tet LB en triplicado en una serie de diluciones. El resto de homogenado tumoral con bacterias se incubó durante 1 horas a temperatura ambiente con 10 ml de LB/tet/kan. Se añadieron otros 10 ml de LK/tet/kan y se incubó a 37ºC en un rotador par proporcionar el stock fágico total. Se recogieron 216 colonias de las placas para hacer un stock combinado para una segunda selección. Después de amplificar los clones, se juntaron y los fagos se precipitaron con PEG/NaCl. Los ratones desnudos con tumores de próstata fueron sometidos a una segunda serie de selección tal y como se ha descrito anteriormente, usando los fagos unidos recuperados de la serie 1. Una tercera serie de selección se realizó de la forma descrita.

Resultados

Próstata de Ratón Normal

Los motivos peptídicos dirigidos a próstata de ratón obtenidos con los métodos anteriormente descritos se muestran en la Tabla 4. Tabla 4. Péptidos Dirigidos a Próstata de Ratón Obtenidos por Exposición Fágica In vivo RVGTWGR SEQ ID NO:20 YICPGPC SEQ ID NO:30 GRGRWGS SEQ ID NO:21 SYQSPGP SEQ ID NO:31 VQGIGRL SEQ ID NO:22 AAAGSKH SEQ ID NO:32 VGSGRLS SEQ ID NO:23 GSRIRTP SEQ ID NO:33 GWTVRDG SEQ ID NO:24 SWGSRIR SEQ ID NO:34 GSRIRTP SEQ ID NO:25 GGGSRIS SEQ ID NO:35 GGGSRIS SEQ ID NO:26 RVVGSRS SEQ ID NO:36 VMGGVVS SEQ ID NO:27 DGSTNLS SEQ ID NO:37 YGNDRRN SEQ ID NO:28 VGSGRLS SEQ ID NO:38 SGKDRRS SEQ ID NO:29 Cáncer de Próstata

Mediante la tercera ronda de la selección in vivo, se obtuvieron fagos que mostraron elevada selectividad para localización tumoral en comparación con el tejido de hígado normal de control (no mostrado). Las secuencias dirigidas al cáncer de próstata identificadas el ADN que secuencia las inserciones fágicas se listan en la Tabla 5.

Tabla 5. Péptidos dirigidos a cáncer de próstata

LSRLVTGDVIC (SEQ ID NO: 210)

CGNMGGSLYYVC (SEQ ID NO: 211)

CLHWEATFNPQC (SEQ ID NO:212)

CRTEVWRSNQRC (SEQ ID NO: 213)

CHVRDEHHEQGC (SEQ ID NO: 214)

CPMQATRNLWHC (SEQ ID NO: 215)

CRDDAKVMRYNC (SEQ ID NO: 216)

CNNWGELLGFNC (SEQ ID NO: 217)

CEGGYENLVLKC (SEQ ID NO: 218)

CRNAWNKHGSRC (SEQ ID NO: 219)

CKERMYREQRRC (SEQ ID NO: 220)

CRTIDIENNELC (SEQ ID NO: 221)

CHRGINRSTTDC (SEQ ID NO: 222)

CETGREIDRSDC (SEQ ID NO: 223)

CCGRKTRGVAIC (SEQ ID NO: 224)

CLASMLNMSTLC (SEQ ID NO: 225)

CGQGFAPRNLVC (SEQ ID NO: 226)

CLGKWKSSRGTC (SEQ ID NO: 227)

CGEGFGSEWPPC (SEQ ID NO: 228)

CKPDYMDSNKMC (SEQ ID NO: 229)

CTRNITKSRMMC (SEQ ID NO: 230)

CVRNVDQNTNTC (SEQ ID NO: 231)

CFWTRENRGWTC (SEQ ID NO: 232)

CRIRGIQLRPAC (SEQ ID NO:233)

CEVGLSAAMAYCC (SEQ ID NO:234) El experto en la técnica se dará cuenta de que las secuencias

peptídicas dirigidas la próstata aquí identificadas se podrán usar en

numerosas aplicaciones dentro del alcance de la presente invención,

incluyendo pero sin limitar, el envió dirigidos de agentes terapéuticos o terapia genética, visualización in vivo de órganos, tejidos o tipos celulares normales o enfermos, identificación de receptores y ligandos de receptores en órganos, tejidos y tipos celulares, y tratamiento terapéutico en un número de enfermedades, en particular cáncer de próstata.

Ejemplo 3. Identificación de péptidos dirigidos a placenta, tejido adiposo, ovario y uretra en ratones

Identificación de péptidos dirigidos a placenta

Los péptidos dirigidos a la placenta de ratones se identificaron mediante un protocolo post-aclaramiento usando una biblioteca de exposición fágica. Una primera serie de biopanning (técnica de selección por afinidad) se llevó a cabo en los ratones preñados. Se retiraron muestras de placenta y los fagos se rescataron de acuerdo con los protocolos estándares anteriormente descritos, con una modificación. En el protocolo habitual de técnica de selección por afinidad, pueden recuperarse cientos de fagos de un solo tipo de órgano, tejido o célula. Habitualmente, se seleccionaron 200 y 300 colonias individuales de los fagos emplatados y estos se amplificaron y unieron para formar la biblioteca de exposición fágica para la segunda y tercera serie de la técnica de selección por afinidad. En este ejemplo, todos los fagos rescatados de la primera serie de la técnica se amplificaron en grandes cantidades sobre un medio sólido y a continuación se unieron para formar la biblioteca de exposición fágica para la segunda serie de la técnica de selección de fagos por afinidad. Es decir, no hubo restricción de los fagos rescatados de la primera serie de la selección. Esta selección in vivo sin restricción se realizó en tres series (series I-II), y a continuación se usó un procedimiento post-aclaramiento.

En el protocolo post-aclaramiento (serie IV), los fagos se administraron a un ratón no preñado. Los fagos que se unieron a tejidos diferentes de la placenta se absorbieron de la circulación. El resto de los fagos se recuperaron del plasma del ratón no preñado. El protocolo se diseñó para aislar fagos que se unen a placenta pero no a otros tipos de órganos, tejidos y células de ratones. Se identificaron los siguientes péptidos dirigidos a placenta, junto con sus frecuencias. Una búsqueda de la base de datos de GenBank explicó que ninguna de los número de SEQ ID listadas a continuación fue 100% homóloga con ninguna secuencia peptídica conocida. TPKTSVT (SEQ ID NO:39) 7.4% en serie III, 8.5% en serie IV RMDGPVR (SEQ ID NO:40) 3.1% en serie III, 8.5% en serie IV RAPGGVR (SEQ ID NO:41) <1% en serie III, 8.5% en serie IV VGLHARA (SEQ ID NO:42) 4.2% en serie III, 7.4% en serie IV YIRPFTL (SEQ ID NO:43) 2.1% en serie III, 5.3% en serie IV LGLRSVG (SEQ ID NO:44) <1% en serie III, 5.3% en serie IV PSERSPS (SEQ ID NO:45) (datos no disponibles)

Tal y como se puede observar, el uso de un procedimiento post-aclaramiento resultó en un sustancial enriquecimiento de fagos con péptidos dirigidos a placenta. Aunque este procedimiento se usó para placenta, los expertos en la técnica de darán cuenta de que el post-aclaramiento puede realizarse con cualquier tipo de órgano, tejido o célula donde una biblioteca fágica pueda administrarse a un sujeto que carezca de dicho tipo de órgano, tejido o célula. Por ejemplo, un procedimiento post-aclaramiento para péptidos hacia próstata o testículo podría realizarse en un sujeto femenino, y para ovario, vagina o útero en un sujeto masculino.

Una búsqueda de homología identificó varias proteínas candidatas como análogos endógenos de los péptidos dirigidos a la placenta, incluyendo TCR gama-1 (TPKTSVT, SEQ ID NO:39), tenascina (RMDGPVR, SEQ ID NO:40 y RAPGGVR, SEQ ID NO:41), MHC Clase II (LGLRSVG, SEQ ID NO:44), angiotensina I (YIRPFTL, SEQ ID NO:43) y MHC H2-D-q cadena alfa (VGLHARA, SEQ ID NO:42). Validación de péptidos dirigidos a placenta e inhibición de embarazo

Los péptidos dirigidos a la placenta fueron validados in vivo mediante inyección a ratones preñados y recuperación de la placenta. La FIG. 1 muestra los resultados de los estudios de validación para fagos dirigidos a placenta. Los clones fágicos se identificaron como: PA -TPKTSVT (SEQ ID NO:39), PC RAPGGVR (SEQ ID NO:41), PE - LGLRSVG (SEQ ID NO:44), PF -YIRPFTL (SEQ ID NO:43). Puede observarse que el clon PA mostró dirección placentaria en un orden superior al observado con el fago de control fd-tet. El clon PC también demostró una localización placentaria sustancialmente mayor, mientras que los

5 clones PE y PF no se enriquecieron los suficiente en la placenta en comparación con el fago de control.

A pesar de la ausencia de aparente enriquecimiento del clon PF en tejido placentario, tanto los péptidos PA como PF mostraron actividad anti-plancentaria. La Tabla 6 muestra los efecto de los

10 péptidos PA y PF dirigidos a la placenta inyectados en ratones preñados, unidos a FITC (isotiocianato de fluoresceína), GST (glutatión S-transferasa) o al fago. En bajas dosis (450 µg total), PA y PF conjugados con FITC mostraron un ligero efecto sobre el embarazo (Tabla 6). En dosis más altas (800 a 1000 µg proteína o

15 4.5 x 1010 fago), los péptidos PA y PF conjugados con la proteína y el fago interfirieron de manera sustancial con el desarrollo fetal (Tabla 6), aparentemente resultando en la muerte de los fetos en la mayoría de los casos. El péptido CARAC (SEQ ID NO: 46), un péptido dirigido al tejido adiposo (FE, TREVHRS, SEQ ID NO:47) o los fagos

20 fd-tet se usaron como controles dirigidos no placentarios.

TABLA 6

25

30

imagen1

Estos resultados validan las secuencias peptídicas dirigidas a la placenta anteriormente identificadas. Además demuestran que incluso en ausencia de suficiente enriquecimiento de fagos con secuencia dirigida al órgano objetivo (p. ej., péptidos PF, FIG. 1), el péptido guía puede, sin embargo, proporcionar el envío dirigidos de agentes terapéuticos hacia el órgano objetivo. En este estudio, se dio la impresión de que en dosis más bajas el péptido PF fue más efectivo que el péptido PA a la hora de interferir con el embarazo, a pesar que se observó que el péptido PA produjo un nivel mucho mayor de localización fágica para placenta.

El experto en la técnica comprobará que los métodos y péptidos aquí descritos pueden usarse para envío dirigidos de agentes terapéuticos al feto a través de la placenta, así como para nuevas técnicas de acabar con el embarazo. Péptidos dirigidos al tejido adiposo

Se usó un protocolo similar para aislar péptidos dirigidos a la grasa de un ratón genéticamente obeso (Zhang et al., 1994; Pelleymounter et al., 1995), con un post-aclaramiento realizado en un ratón normal. Los péptidos aislados dirigidos a la grasa incluyeron TRNTGNI (SEQ ID NO:48), FDGQDRS (SEQ ID NO:49); WGPKRL (SEQ ID NO:50); WGESRL (SEQ ID NO: 51); VMGSVTG (SEQ ID NO:52), KGGRAKD (SEQ ID NO:53), RGEVLWS (SEQ ID NO:54), TREVHRS (SEQ ID NO: 47) and HGQGVRP (SEQ ID NO:55).

Estudios homológicos identificaron varias proteínas candidatas como análogos endógenos de los péptidos dirigidos a la grasa, incluyendo el factor de crecimiento de la célula madre (SCGF) (KGGRAKD, SEQ ID NO:53), atractina (caoba) (RGEVLWS, SEQ ID NO:54), factor adiposo relacionado con angiopoyetina (FIAF) (TREVHRS, SEQ ID NO:47), adipofilina (ADRP) (VMGSVTG, SEQ ID NO:52), Flt-1 o procolágeno tipo XVII (TRNTGNI, SEQ ID NO:48) y fibrilina 2 o proteína p97 del tipo transferina (HGQGVRP, SEQ ID NO:55)Validación de péptidos dirigidos a tejido adiposo

Los péptidos dirigidos a la grasa se validaron mediante una dirección in vivo, tal y como se muestra en la FIG. 2. Los clones dirigidos a la grasa seleccionados fueron: FA -KGGRAKD (SEQ ID NO:53), FC -RGEVLWS (SEQ ID NO:54), FE -TREVHRS (SEQ ID NO:47) y FX -VMGSVTG (SEQ ID NO:52). Tal y como se observa en la FIG. 2, todos estos clones mostraron varios órdenes de localización de adiposa de mayor magnitud que el fago de control fdtet. El clon FX también mostró una localización sustancialmente mayor que la de otros clones seleccionados dirigidos a la grasa. Sin embargo, mediante analogía con los péptidos anteriormente descritos dirigidos a la placenta, el experto en la técnica observará que los clones dirigidos a la grasa que muestran niveles más bajos de localización en tejido adiposo se pueden seguir usando para envío dirigido de agentes terapéuticos.

El experto en la técnica observará que los péptidos dirigidos selectivos de la vasculatura angiogénica en el tejido adiposo podrían usarse para reducción de peso o para evitar ganar peso. Uniendo radicales anti-angiogénicos o tóxicos con un péptido dirigido al tejido adiposo, los vasos sanguíneos que suministran nuevos tejidos grasos podrían inhibirse de manera selectiva, evitando el crecimiento de nuevos depósitos de grasa y eliminando potencialmente los depósitos existentes de grasa. Péptidos dirigidos a ovario y ascitis

Se han identificado péptidos dirigidos adicionales contra el ovario de ratón y fluido ascítico, listados a continuación.

Los péptidos dirigidos al ovario de ratón incluyen GLAKLIP (SEQ ID NO:56), HLISDMS (SEQ ID NO:57), LQHWLLS (SEQ ID NO:58), ALVLQG (SEQ ID NO:59). TGVALQS (SEQ ID NO:60), YVQSREG (SEQ ID NO:61), PLFWPYS (SEQ ID NO:62), DGSG (SEQ ID NO:63), EGSG (SEQ ID NO:64), SSPRPGV (SEQ ID NO:65), DGYPAIA (SEQ ID NO:66) GHAIE (SEQ ID NO:67) and IWSTSER (SEQ ID NO:68). Los péptidos dirigidos al líquido ascítico de ratón incluyen YRLRG (SEQ ID NO:69), YRARG (SEQ ID NO:70), SQPLG (SEQ ID NO:71), SQPWG (SEQ ID NO:72), QRLVTP (SEQ ID NO:73), QVLVTP (SEQ ID NO:74), QRLVHP (SEQ ID NO:75), QVLVHP (SEQ ID NO:76), ITRWRYL (SEQ ID NO:77), SLGGMSG (SEQ ID NO:78), SQLAAG (SEQ ID NO: 79), SLLAAG (SEQ ID NO:80), SQLVAG (SEQ ID NO:81), SLLAAG (SEQ ID NO:82), GLPSGLL (SEQ ID NO:83), HGGSANP (SEQ ID NO:84), SLEAFFL (SEQ ID NO:85), CVPELGHEC (SEQ ID NO:86), CELGFELGC (SEQ ID NO: 87) AND CFFLRDWFC (SEQ ID NO:88).

Péptidos dirigidos a la uretra

Se usaron protocolos similares para identificar péptidos dirigidos a la uretra en ratones C57B1, expuestos en la Tabla 7.

Tabla 7. Péptidos dirigidos a la uretra

Motivo

Péptido

LRXGN

GVMLRRG (SEQ ID NO:238)

(SEQ ID NO:235)

YSLRIGL (SEQ ID NO:239)

LRDGNGE (SEQ ID NO:240)

CLRGGNLR (SEQ ID NO:241)

RGAG

VRGLAAA (SEQ ID NO:242)

(SEQ ID NO:236)

ARGAGLA (SEQ ID NO:243)

RGAGTGWT (SEQ ID NO:244)

ARGVNGA (SEQ ID NO:245)

DLLR

DLLRARW (SEQ ID NO:246)

(SEQ ID NO:237)

DLLRTEW (SEQ ID NO:247)

EFDLVRQ (SEQ ID NO:248)

ninguno

GCDEGGG (SEQ ID NO:249)

ninguno

GDSPVES (SEQ ID NO:250)

Ejemplo 4: Selección de una biblioteca de anticuerpo alfa-bazo in vivo con BRASIL

Los péptidos dirigidos contra el bazo no se han identificado previamente. Como parte del sistema retículo-endotelial, la selección de fagos por afinidad contra el tejido del bazo es complicada debido a la elevada base de localización fágica no específica para el bazo. La menor base observada en la selección con el método BRASIL es ventajosa para identificar los péptidos dirigidos contra tejidos como el bazo.

Este ejemplo demuestra una realización ilustrativa del método BRASIL. Se desarrolló una biblioteca fágica en base a las inmunoglobulinas derivadas contra el órgano objetivo (bazo de ratón) y a continuación se sometió a una selección de fagos por afinidad in vivo. Para construir la biblioteca de inmunoglobulina, se inyectó el bazo del ratón en un pollo. Tras la estimulación, se recogió el bazo del pollo y se obtuvieron secuencias del domino variable de inmunoglobulina mediante amplificación PCR™ del mARN del bazo del pollo. Las secuencias variables de inmunoglobulina amplificada se insertaron en una biblioteca de exposición de fagos (biblioteca α) que posteriormente se usó para la selección de fagos in vivo contra un bazo de ratón. Por lo tanto, las secuencias peptídicas dirigidas al bazo obtenidas del fago localizado en el bazo del ratón se derivaron de fragmentos de anticuerpo producidos en el pollo en respuesta a los antígenos del bazo murino. El éxito de este ejemplo muestra además la amplia utilidad del método BRASIL. El experto en la técnica observará que la presente invención no se limita a las realizaciones aquí descritas y que otros desarrollos de la metodología BRASIL se incluyen en el alcance de la presente invención.

Materiales y Métodos

Construcción de Biblioteca

Un pollo Leghorn blanco fue inmunizado con bazo homogenizado (aproximadamente 150 mg por inyección) de un ratón Balb/c impregnado (10 ml MEM). El pollo recibió refuerzos de bazo homogenizado a las 4 semanas y a las 8 semanas tras la inmunización inicial. La respuesta inmune al bazo del ratón mediante el análisis FACS demostró que el suero inmune del pollo contenía anticuerpos contra una línea celular del ratón (TRAMP-C1). El pollo fue sacrificado y su bazo se retiró para el Reagente TR (Molecular Research Center, Inc., Cincinatti, OH) 12 semanas después de la primera inmunización.

El ARN total se preparó a partir del bazo del pollo usando el protocolo del fabricante para el reagente TRI. cADN se preparó a partir del ARN total usando cebadores oligo(dT) y enzima Superscript (Life Technologies). cADNS que codifican las regiones variables de inmunoglobulina de bazo de pollo se amplificaron mediante cebadores CHybVH y ChybIgB (V pesado) o mediante CSCVK y CHHybL-B (V kappa) de acuerdo con las técnicas estándares. Las regiones variables y las regiones constantes de la cadena ligera se amplificaron usando PCR™ junto con el uso de cebadores CSC-F y lead-B y las plantillas Vkappa y Ckappa. . Las regiones variables y las regiones constantes de la cadena pesada se amplificaron usando PCR™ junto con el uso de cebadores dp-seq y lead-F y las plantillas Vpesada y C pesada. Los fragmentos de cadena ligera y pesada se amplificaron con PCR™ junto con el uso de cebadores CSC-F y dp-Ex. Los cebadores PcR se compraron en Genosys o GenBase, usando secuencias cebadoras listadas en el manual del curso de laboratorio de Cold Spring Harbor, “Exposición Fágica de Bibliotecas Combinatorias de Anticuerpos” (Barbas et al., 2000).

Tras la digestión con Sfi I, los productos de amplificación se ligaron a pComb3x digerido por SfiI para su inserción en la biblioteca fágica. El plásmido pComb3-123 ligado se sometió a electroporación en ER2537-E.coli y la producción de fago comenzó con la posterior infección de VCM13 (fago ayudante). El tamaño de la bibioteca resultante fue aproximadamente de 5 x 106 cfu. Selección in vivo de biblioteca α-bazo usando BRASIL

Se realizaron cuatro series de selección in vivo en ratones usando la biblioteca α-bazo de pollo. Se inyectaron aproximadamente 0.8 a 2.0 x 1010 TU en un ratón Balb/c. De dejó que la biblioteca circulara durante 5 minutos. Tras el sacrificio, el bazo del ratón se recuperó y se preparó una suspensión celular sencilla presionando el bazo a través de una malla coladora de nylon de 70 µm. La suspensión de célula sencilla se centrifugó en aceite (9:1 ftalato de dibutilo:ciclohexano) usando la técnica BRASIL y 200 µl de E. coli ER2537 en fase logarítmica se infectaron con el precipitado. Se uso un fago amplificado recuperado del bazo del ratón para la siguiente serie de selección. No se observó un enriquecimiento claro en las series de selección en el número de fagos dirigidos al bazo y cerebro en comparación con el método convencional de selección de fagos, usando una pieza de bazo obtenida antes de BRASIL:

Los fagos localizados en el bazo del ratón de la cuarta serie de selección de las inserciones Fab del pollo se amplificaron con PCR™ y el producto PCR se digirió con Bst I. La mitad de los clones de los 90 analizados produjeron un patrón similar de restricción. De ellos, 20 clones se secuenciaron de los cuales solamente dos tuvieron un patrón idéntico de restricción. Cuatro de los clones fágicos basados en anticuerpo (números 2, 6, 10 y 12) fueron sometidos a análisis adicionales usando ensayos de enlace y de localización. Testar los clones in vitro usando BRASIL

Una suspensión de célula sencilla se preparó a partir de dos bazos de ratón. La suspensión se dividió en cinco tubos y se incubó en hielo con 3x109 TU de clones Fab #2, #6, #10, #12 y 2x109 TU tetfago. Los fagos unidos a las células del bazo del ratón se recuperaron con BRASIL. 200 µl de E. coli ER2537 en fase logarítmica se infectaron con el precipitado y diluciones en serie se emplataron en placas LB/carbenicilina y LB/tetraciclina para evaluar el enlace fágico. Fd-tet se usó como control interno para normalizar todos los experimentos sobre dirección fágica. Testar los clones in vivo con BRASIL

Los fagos (3x109) de los clones Fab #2, #6, #10, #12 y 2x109 TU tet-fago se inyectaron en venas de la cola en ratones Balb/c y se dejaron circular durante 5 minutos. Los bazos se recuperaron y se prepararon suspensiones de célula sencilla sobre hielo a partir de los bazos completos. Los fagos unidos a la célula se recuperaron con BRASIL. 200 µl de E. coli ER2537 en fase logarítmica se infectaron con el precipitado y diluciones en serie se emplataron en placas LB/carbenicilina y LB/tetraciclina para evaluar la recuperación fágica. Testar clon #10 contra el fago de control NPC-3TT in vivo con BRASIL

Los fagos (3x109) del clon Fab #10 y NPC-3TT (fago Fab de control) y 1x109 TU del fago de control Fd-tet se inyectaron a ratones (2 ratones para NPC-3TT, 2 ratones para el clon #10) y se dejaron circular durante 5 minutos. Los bazos se recuperaron y se prepararon suspensiones de célula sencilla sobre hielo. Los fagos unidos a la célula se recuperaron con BRASIL. 200 µl de E. coli ER2537 en fase logarítmica se infectaron con el precipitado y diluciones en serie se emplataron en placas LB/carbenicilina y LB/tetraciclina. El fago NPC3TT es un fago humano que presenta el fragmento Fab de toxina anti-tetánica.

Dirección del clon Fab #10 al bazo contra la médula ósea

Los fagos (3x109) del clon Fab #10 y el control NPC-3TT y 1x109 TU Fd-tet fago de control se inyectaron a ratones (2 ratones para NPC-3TT, 2 ratones para el clon #10) y se dejaron circular durante 5 minutos. Los bazos se recuperaron y se prepararon suspensiones de célula sencilla. La médula ósea se recuperó de los mismos ratones (ambos fémures) como un control para dirección específica a un órgano. Los fagos unidos a células se recuperaron con BRASIL. Producción de fragmentos Fab

El plásmido pComb3 que contiene las inserciones Fab de pollo se sometió a electroporación en bacterias ER2537. Diluciones en serie se emplataron en placas LB/carbenicilina y se incubaron durante la noche a 37ºC. El cultivo de producción de Fab (en caldo súper con 100 µg/ml carbenicilina) comenzó a partir de una única colonia emplatada. La producción de Fab fue inducida con 1 mM IPTG durante 7 horas a 30ºC. El fragmento Fab se purificó a partir de la fracción periplásmica SN2 por purificación de afinidad tras la determinación de concentración Fab en el sobrenadante bacteriano, fracciones periplásmicas SN1 y SN2 y en el lisado bacteriano mediante ELISA. Una columna α-Fab-Proteína G se unió (2 mg/ml) con dimetilpimelimidato (DMP) usando protocolos estándares (Harlow y Lane, 1988).

Para purificar fragmentos Fab se usó el siguiente método. La fracción SN2 se cargó a 1 ml de columna G-α-Fab HiTrap-proteína (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) bien durante 2 horas (si se usan menos de 50 ml de volumen con súper onda) o durante toda la noche (con más de 50 ml de volumen usando una bomba peristáltica). La columna se lavó con 10-20 ml de PBS (salina de búfer fosfato). Los fragmentos Fab se eluyeron con 10 ml de 20 mM búfer de glicina, pH 2.2, 150 mM NaCl y se recogieron 1 ml de fracciones. Las fracciones se neutralizaron con 1 M Tris inmediatamente tras la elución. Las concentraciones de proteína se cuantificaron con A280.

Tinción intravascular

Para determinar la distribución in vivo de los fragmentos Fab recuperados, se inyectaron de 50 a 60 µg de fragmento Fab (Fab#10, NPC3-tt o R#16) en la vena de la cola de un ratón Balb/c y se dejaron circular durante 8 minutos. Se inyectaron 50 µg de lectina-FITC L.esculentum en el ratón y los tejidos del ratón fueron fijados mediante perfusión con 25 a 30 ml de paraformaldehído/PBS 4% después de 2 minutos de la circulación de lectina. Se recogieron los tejidos y se post-fijaron en paraformaldehído 4% durante una hora. Los tejidos fijados se incubaron en sacarosa/PBS 30% durante la noche a 4ºC, cambiando la solución al menos dos veces. Los tejidos se incrustaron en el medio de congelación y se congelaron en hielo seco.

Las secciones de tejido fijado se tintaron para Fab de la siguiente manera. Las secciones congeladas de tejido (55 µm) se cortaron sobre un micrótomo y se lavaron 3x con PBS. Las secciones finas se bloquearon con suero de cabra PBS/0.3%Triton-X-100/5% durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con anticuerpo humano-α anti-Fab.1:400 Cy3 conjugado. Las secciones conjugadas se lavaron 6x con PBS/0.3% Tritón X-100, 3x con PBS y se fijaron con formaldehído 4% durante 15 minutos. Tras la fijación, las secciones se lavaron contra 2x con PBS y 2x con agua destilada, y a continuación se montaron sobre portaobjetos usando VectorShield. Resultados

La localización in vitro para células del bazo de ratón de clones fágicos que expresan fragmentos Fab de pollo se examinó con BRASIL. Tal y como se muestra en la FIG. 3, los clones fágicos Fab aislados con BRASIL mostraron una unión diferencial con las células del bazo de ratón en comparación con los fagos de control sin inserción Fd-tet. El clon #6 mostró el grado más bajo de unión diferencial, similar al fago de control NPC-3TT, que contenía un fragmento Fab pero no se aisló del bazo del ratón. Los clones #2, #10 y #12 mostraron una unió selectiva con las células del bazo de ratón en comparación con el control Fd-tet, con al menos una unión aumentada por 2 observada para los clones #2 y #10. Las secuencias de aminoácido determinadas para las inserciones del clon fueron: Clon #2:

imagen1

Clon #6:

imagen1

Clon #10:

imagen1

Clon #12:

imagen1

Se realizó una comparación directa de la unió in vitro para los clones Fab en comparación con NPC-3TT. Tal y como se muestra en la FIG. 4, los clones #2 y #10 mostraron los niveles más altos de enlace con células del bazo en ratón in vitro. Los clones #6 y #12 mostraron niveles de unión con el bazo del ratón fue solamente ligeramente más altos que la unión del fago NPC-3TT.

La unión preferencial de los clones fágicos Fab del pollo fue confirmada por los estudios in vitro usando BRASIL. Tal y como se muestra en la FIG. 5, la localización selectiva para el bazo del ratón fue incluso más drástica in vivo, con los clones #2, #6 y #10 mostrando un mayor enlace con el bazo muy multiplicado en comparación con el fago Fd-tet. Sin embargo, el clon #12 no mostró una unión significativamente elevada con el bazo del ratón en comparación con el fago Fd-tet. Estos resultados muestran que los resultados in vitro obtenidos con los fagos dirigidos al bazo se confirman in vivo.

El clon Fab #10 fue seleccionado para caracterización adicional mediante localización in vivo con el bazo del ratón. Los resultados, mostrados en la FIG. 6, confirman que el clon Fab #10 mostró un enriquecimiento multiplicado por 3 a 10 veces en el bazo en comparación con Fd-tet. Este efecto no fue debido a la unión general de Fab, ya que el fago NPC-3TT fágico de control no mostró localización selectiva en el bazo en comparación con el fago sin inserción Fd-tet.

La unión del clon Fab #10 fue específica de órgano, tal y como se demuestra en la FIG. 7. Los fagos del clon Fab #10 y el control NPC-3TT se recuperaron del tejido del bazo y la médula ósea de los mismos ratones inyectados. En la FIG. 7 se puede observar que el clon Fab #10 mostró localización selectiva para el bazo pero no para el tejido de la médula ósea. El fago de control no mostró localización selectiva para la médula ósea (FIG. 7) o bazo (no mostrado).

Estos resultados muestran que el clon fágico Fab #10 se dirige de manera selectiva al tejido del bazo de ratón para unirse tanto in vitro como in vivo. Estos resultados fueron validados además por la tinción vascular para la distribución fágica in vivo. Los fagos de control usados para este estudio fueron clones NPC-3TT (fragmento Fab) y clon R#16 (aislados de la selección de retina angiogénica).

Se observó que el clon Fab #10 se unió con el tejido del bazo de ratón in vivo mediante tinción fluorescente (no mostrada). Los fagos de control NPC-3TT y R#16 no tiñeron el tejido del bazo bajo las mismas condiciones. Se observó que el clon #10 y el fago NPC3TT tintaron de manera intensa los riñones de los animales inyectados, quizás debido a la filtración glomerular (no mostrada). Otros órganos de control (pulmón, cerebro, hígado, corazón y musculatura del esqueleto) no mostraron tinción con el clon #10 (no

se muestra).

Estos resultados demuestran que los péptidos fágicos dirigidos al bazo pueden identificarse mediante el método BRASIL. Muestran además la viabilidad de la técnica de expresión en fagos usando fragmentos de anticuerpo frente a un órgano, tejido o tipo celular para obtener una biblioteca fágica inicial. La habilidad para obtener péptidos dirigidos frente a bazo, un tejido que ha demostrado ser refractario en la selección de fagos usando protocolos estándares de exposición de fagos debido a la elevada base no específica, demuestra las ventajas del método BRASIL. Ejemplo 5: Selección in vivo de biblioteca de sarcoma de Kaposi α en retinas angiogénicas

Se ha desarrollado un sistema retiniano angiogénico como modelo para tejidos tumorales angiogénicos. Hipoxia en ratones neonatales provoca una respuesta angiogénica en la retina. Los receptores de tejido retiniano angiogénico muestran similitudes con los tejidos tumorales angiogénicos en la unión de exposición de fagos. Materiales y Métodos Sistema de modelo angiogénico

Ratones C57BL/6J de una semana de edad fueron expuestos a una atmósfera 75% oxígeno durante 5 días y a continuación se mantuvieron a temperatura ambiente durante otros cinco días. La respuesta neovascular proliferativa se cuantificó contabilizando los núcleos de nuevos vasos que se extendieron desde la retina a la región vítrea en una sección transversal de 6 µm. Este modelo se usó para evaluar la unión a los vasos angiogénicos recién formados de una biblioteca de exposición fágica inyectada intravenosamente a los ratones. El pico de neovascularización se observó entre los días posnatales 17 y 21. Exposición fágica

Se produjo una biblioteca de fagos Fab (α-KS) contra el tejido tumoral de sarcoma de Kaposi que había sido inmunizado en un conejo, usando los mismos métodos descritos anteriormente para el bazo. Se realizaron tres series de selección in vivo usando la biblioteca α-KS en el sistema de modelo retiniano angiogénico. Se inyectaron aproximadamente 3 x 1010 TU de fago α-KS en 2 ratones C57BL/6 con neovascularización retiniana inducida por hipoxia en los días postnatales 18 a 20. La biblioteca circuló durante 5 minutos. Los ojos se enuclearon y las retinas se separaron del resto del ojo. Se preparó una suspensión de célula sencilla a partir de las retinas aplastándolas entre dos portaobjetos de cristal. Las suspensiones de célula sencilla se procesaron con BRASIL tal y como se ha descrito anteriormente y 200 µl de E. coli ER2537 en fase logarítmica se infectaron con el precipitado. Los fagos que se habían amplificado durante la noche se recuperaron del tejido retiniano y se usaron para posteriores series de selección. La recuperación después de cada serie de selección fue entre 3400-5000 TU.

Después de tres series de selección, 90 clones seleccionados fueron testados para comprobar su habilidad para unirse con células HUVEC. Pozos de microtítulo fueron cubiertos con HUVECs en un medio completo. Las células se fijaron y se incubaron durante la noche con sobrenadante a partir de cultivos inducidos por IPTG de las bacterias infectadas por los fagos. La producción de Fab fue detectada por ELISA α-Fab. La unión Fab con HUVECs se detectó mediante ELISA α-Fab-AFOS.

FIG. 8 muestra los resultados de la unión del clon Fab con HUVECs usando una biblioteca fágica α-KS. El clon #16 pareció enlazarse de manera correcta con HUVECs in vitro.

Estos resultados confirman la utilidad de usar fragmentos de anticuerpo Fab para la producción de bibliotecas de exposición de fagos. Dichas bibliotecas deberían enriquecerse en secuencias peptídicas dirigidas al tipo específico de órgano, tejido o célula usadas para inmunizar el animal huésped, en comparación con las bibliotecas de exposición de fagos de secuencias arbitrarias que se han usado en previos métodos de selección de fagos por afinidad. Estos resultados también confirman la utilidad del método BRASIL para identificar secuencias peptídicas dirigidas. Ejemplo 6. Identificación de Parejas Receptor/Ligando: Péptidos Dirigidos Contra Receptores de Integrina

Ciertas realizaciones de la presente invención se ocupan de la identificación de parejas receptor/ligando para varias aplicaciones. Los péptidos dirigidos selectivos para órganos, tejidos o tipos de célula se unen a receptores (tal y como se ha definido anteriormente), normalmente localizados en la superficie del lumen de vasos sanguíneos dentro del objetivo. En ciertas realizaciones, pueden usarse péptidos dirigidos para identificar o caracterizar dichos receptores, bien directamente o indirectamente. Además de su uso como objetivos para el envío de vectores de terapia genética, pueden usarse otros agentes terapéuticos o agentes visualizadores para visualización in vivo, como los receptores que ocurren de manera natural como objetivos potenciales para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos dirigidos contra el propio receptor, para el desarrollo de vacunas dirigida al receptor, y para entender los mecanismos moleculares que subyacen varias enfermedades. Naturalmente, los propios péptidos dirigidos pueden servir como base para nuevos agentes terapéuticos dirigidos a los receptores.

Con frecuencia, los péptidos dirigidos actúan como mimótopos de ligandos endógenos que se unen con el receptor objetivo. En otras realizaciones, los ligandos endógenos pueden identificarse y caracterizarse usando los métodos descritos. Dichos ligandos se usan potencialmente como objetivos para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos, etc.

El ejemplo presente ilustra una realización relacionada con la identificación de parejas receptor/ligando, en este caso, receptores de integrina. Ejemplos no limitativos de aplicaciones para péptidos dirigidos hacia integrinas incluyen la regulación de proliferación celular y quimiotaxis, pro-apoptosis y anti-angiogénesis. En esta realización, se usaron integrinas unidas a un sustrato sólido para seleccionar bibliotecas de exposición de fagos con el fin de identificar péptidos dirigidos a integrinas. Contexto

La función de la integrina es regulada por citoquinas y otros factores solubles en una variedad de sistemas biológicos. Más comúnmente, la exposición a estos factores lleva a alteraciones conformacionales que resultan en cambios en el estado de activación de los receptores (p. ej., mayor o menor afinidad para un ligando y/o receptor determinado que se agrupa en la membrana de plasma). Los cambios en la adhesión dependiente de integrina activan a la larga variar rutas complejas de transducción de señal. En el nivel molecular, la co-localización inducida de proteínas citoesqueletales con los dominios citoplásmicos de integrina controla la transducción de señal.

Los dominios citoplásmicos son reguladores clave de la función de integrina (revisado en Hynes, 1992; Ruoslahti, 1996). Los dominios citoplásmicos individuales con subunidad α y β se conservan en gran medida entre diferentes especies (Hemler et al., 1994). Aunque los dominios citoplásmicos de varias subunidades β comparten estructuras primarias similares, difieren en ciertas características funcionales. Experimentos con integrinas quiméricas han demostrado que los dominios citoplásmicos de cadenas β son responsables de regular la distribución del receptor y del reclutamiento en puntos focales de adhesión (Pasqualini y Hemler, 1994). Por lo tanto, ciertos dominios citoplásmicos son cruciales para la señalización mediada por integrina en la célula (señalización externa) y la activación de la actividad de enlace integrina-ligando (señalización interna) (Hemler et al., 1994).

Las integrinas αvβ3 y αvβ5 se expresan selectivamente en vasculatura angiogénica pero no en vasculatura normal (Brooks et al., 1994a, 1994b; Pasqualini et al., 1997; Arap et al., 1998). Además, los antagonistas de integrina αv han demostrado bloquear el crecimiento de nuevos vasos (Brooks et al., 1994a, 1994b, 1995; Hammes et al., 1996). En estos experimentos, la apoptosis de célula endotelial fue identificada como el mecanismo para la inhibición de angiogénesis (Brooks et al., 1994a, 1994b, 1995). Angiogénesis iniciada por bFGF puede inhibirse mediante la acción de un anticuerpo bloqueador anti-αvβ3, mientras que la angiogénesis mediada por VEGF puede evitarse mediante un anticuerpo bloqueador contra αvβ5. Las integrinas αvβ3 y αvβ5 han demostrado que se expresan de manera preferente en diferentes tipos de enfermedad neovascular ocular (Friedlander et al., 1995, 1996). Por lo tanto, distintas rutas inducidas por citoquina que provocan angiogénesis parecen depender de integrinas αv específicas.

Aunque ambas integrinas, αvβ3 y αvβ5, se unen a vitronectina, probablemente median diferentes circunstancias de unión post-ligando. Por ejemplo, ante la ausencia de factores solubles exógenos, la integrina αvβ5 falla al potenciar la adhesión celular, migración y angiogénesis. Por otra parte, la integrina αvβ3 puede inducir estas circunstancias sin estimulación adicional por parte de citoquinas (Klemke et al., 1994; Lewis et al., 1996; Friedlander et al., 1995).

Los experimentos diseñados para el estudio de las bases moleculares para regulación de citoquinas de la función αvβ5 han demostrado que tras la unión con la vitronectina inmovilizada, αvβ5 inactivada es apenas detectable en asociación con actina, α-actinina, talin, tensina, p130cas y vinculina. Sin embargo, αvβ3 induce acumulación localizada de estas moléculas. Tras la activación de proteína quinasa C (PKC), αvβ5 se comporta de manera similar a αvβ3, pero no puede reclutar talin (Lewis et al., 1996). Además, calfostina C, un inhibidor de PKC, parece bloquear angiogénesis mediada por αvβ5 pero no por αvβ3 (Friedlander et al., 1995). Estas observaciones sugieren que la activación de PCK probablemente afecta al estado de conformación o fosforilación del dominio citoplásmico β5. También pueden darse cambios similares en proteínas citoplásmicas (Kolanus y Seed, 1997). La regulación de citoquina de integrina αvβ5 no es usual ya que la unión del ligando no se cambia, pero el acontecimiento que sigue a la unión del ligando difiere (Lewis et al., 1996). Por lo tanto, las circunstancias celulares mediadas por αvβ3 o αvβ5 están claramente controladas por mecanismos diferentes (Filardo y Cheresh, 1994b).

La búsqueda de moléculas asociadas a integrina αv se ha visto obstaculizada por dificultades técnicas. En primer lugar, las asociaciones físicas implicadas probablemente se basan en un montaje de ligandos multiméricos que no existen cuando las células no están intactas. En segundo lugar, su asociación con integrinas tiene normalmente una baja afinidad. Finalmente, los cambios en los estados de conformación y fosforilación de las proteínas asociantes pueden añadir un nivel adicional de complejidad en estas interacciones temporalmente moduladas. Debido a estos problemas, solamente se han identificado un número limitado de proteínas que se enlazan con dominios citoplásmicos de integrina. Estas proteínas, como paxilina e ICAP-1, principalmente asociadas con la cadena β (Shattil y Ginsberg, 1997). Citohesina-1 y filamina se asocian con el dominio citoplásmico de β2.

Según se ha informado, otras proteínas interactúan con dominios citoplásmicos de integrina β en general: talin, filamina, αactinina, quinasa de adhesión focal, la serina/quinasa treonina ILK y esquelemina. Talin, α-actinina y quinasa de adhesión focal no colocalizan con integrinas β1 tras la eliminación de sus puntos de unión putativos en el dominio citoplásmico β1. Otros enfoques han demostrado que otras proteínas asociadas al citoesqueleto y moléculas señalizadora colocalizan con integrinas.

Las integrinas se asocian con moléculas que participan en la señalización del factor del crecimiento. Además de la proteína 190kDa e IRS-1, que pueden encontrarse en asociación con αvβ3 (Vuori y Ruoslathi, 1994), el análisis de la asociación de la integrina αvβ3 con moléculas relacionadas con la insulina y las rutas señalizadoras de PDGF reveló que tanto la insulina como los receptores PDGFβ co-inmuoprecipitan con αvβ3. Las moléculas receptoras asociadas con la integrina representan una subfracción altamente fosforilada y altamente activada de dichas moléculas. Estos resultados son importantes porque refuerzan la noción de que la unión celular mediada por integrina coordina respuestas celulares a factores del crecimiento. Los procesos señalizadores dependientes de integrina actúan en sinergia con señales de proliferación (Frisch y Ruoslahti, 1997; Clark y Brugge, 1995; Longhurst y Jennings, 1998).

La fosforilación proteica es uno de los hechos que más temprano se detectan en respuesta a la estimulación de integrina. La habilidad de los inhibidores de tirosina quinasa para obstruir la formación de adhesiones focales sugiere un papel para la fosforilación de tirosina en las rutas de señalización unidas a los receptores de integrina (Defilippi et al., 1994). Las familias de serina/treonina quinasa, como la proteína quinasa C (PKC) o proteína quinasa activada por mitógenos (MAP, también se activan tras la estimulación de integrina, y los inhibidores de PKC bloquean la unión y extensión celular en ciertos sistemas celulares (Vuori y Ruoslahti, 1993). Las integrinas parecen afectar a la supervivencia celular regulando la muerte celular programada, una respuesta que también depende de la fosforilación de tirosina. Varias proteínas que se asocian con complejos proteicos de integrina contienen dominios modulares, llamados Src homología 2 (SH2) y 3 (SH3) que de manera específica median el enlace proteína-proteína. Los dominios SH2 se unen con proteínas por medio de interacciones con motivos peptídicos específicos que contienen fosfotirosina, mientras que los dominios SH3 se unen a motivos peptíticos cortos ricos en prolina en sus objetivos proteicos (Clark y Brugge, 1995). La adhesión celular mediada por integrina causa la activación de quinasas MAP y el incremento de fosforilación de tirosina de la quinasa de adhesión focal (FAK). La autofosforilación de FAK lleva al enlace de las proteínas del dominio SH2 que incluyen las quinasas de la familia Srce y el complejo Grb-2-Sos. Una hipótesis plausible es que la fosforilación de tirosina mediada por integrina de FAK lleva a la activación de la cascada Ras y finalmente a la activación de quinasa MAP. Sin embargo, la activación de quinasa MAP mediada por integrina ha demostrado ser independiente de FAK, lo que indica que puedan existir al menos dos rutas distintas señalizadoras de integrina: (i) activación de quinasa MAP, que puede jugar un papel en las señales mitogénicas y de supervivencia, y (ii) fosforilación de tirosina FAK, que claramente participa en la organización citoesqueletal (Lin et al., 1997).

Estudios previos sobre sustratos peptídicos y modelos moleculares basados en homología sugirieron que aproximadamente 9-13 residuos de un sustrato peptídico contactan con el lugar activo partido del dominio de quinasa (Bossemeyer et al., 1993). Las técnicas de exposición en fagos ofrecen una técnica alternativa para generar y seleccionar diversas bibliotecas de péptidos combinatorios (Smith, 1991; Wells y Lowman, 1992). Debido a que la diversidad química en una biblioteca de exposición fágica se codifica por ADN que puede replicarse y amplificarse, la selección de una biblioteca fágica puede realizarse en varias series, lo que permite que puedan identificarse motivos incluso raros. A diferencia de las bibliotecas químicas sintéticas, la exposición fágica permite el análisis de especies solas en lugar de especies juntas. El poder de esta técnica ha sido demostrado principalmente a través de la selección de anticuerpos o péptidos raros a partir de grandes bibliotecas combinatorias.

Se ha usado una biblioteca fágica combinatoria para determinar las secuencias preferentes de sustrato para diferentes quinasas proteína-tirosina (PTKs), siendo todas ellas miembros muy relacionados con la familia Src y una PTK relacionada con más distancia, Syk (Schmitz et al., 1996). La posterior fosforilación mediante PTKs recombinantes y la selección de fagos fosforilados mediante un anticuerpo anti-fosfotirosina se usaron para enriquecer los fagos que mostraron los péptidos de sustrato. Tras varias series de selección, se encontraron diferentes secuencias de sustrato para cada una de las PTKs testadas. Para las PTKs relacionadas con la familia Sr, las características importantes de estas secuencias canónicas fueron recapituladas en sustratos proteicos conocidos o supuestos. En concreto, se descubrió que los aminoácidos que directamente flanqueaban el residuo invariante de tirosina estaban más conservados y eran más específicos para cada una de las PTKs testadas. Por lo tanto, los motivos identificados ofrecen una base racional para desarrollar inhibidores pequeños y específicos del dominio catalítico de PTKs (Schmitz et al., 1996).

Otros estudios extendieron el alcance de la tecnología de exposición fágica mostrando cómo las bibliotecas peptídicas pueden usarse para investigar la especificidad en el sustrato de Fyn, una proteína quinasa de la familia Src (Dente et al., 1997; Gram et al., 1997). Otros experimentos relacionados se centraron en la identificación de ligandos fosfopeptídicos que interactúan con el dominio Src homología 2 (SH2) de la proteína adaptadora Grb2 seleccionando una biblioteca peptídica arbitraria establecida en un fago. Los fagos se sometieron a fosforilación in vitro en un residuo no variante de tirosina con una mezcla de las quinasas de fosfotirosina c-Src, Blk y Syk. Los motivos de enlace se seleccionaron mediante interacción de la biblioteca con el dominio SH2 recombinante de Grb2 expresado como proteína de fusión glutatión-S-transferasa (GST). Varios ciclos posteriores llevaron al enriquecimiento de fagos que se unieron al dominio GST-Grb2 SH2 solamente cuando previamente se fosforilaron. Análisis posteriores revelaron que todos los fagos seleccionados expresaron péptidos con el motivo de consenso Y*M/NW (Y* denota fosforilación). Un péptido se unió al dominio Grb2 SH2 con 3 veces la afinidad del motivo peptídico Y*VNV, que se deriva del ligando natural Shc. Estos hechos demuestran que la exposición de fagos puede usarse para identificar rápidamente los ligandos de elevada afinidad con los dominios SH2 y otras proteínas que interactúan implicadas en la transducción señalizadora.

El dominio citoplásmico de β5 es estructuralmente y funcionalmente único con respecto a otras subunidades de integrina (Tabla 8) y comparte solamente el 38% de homología con el dominio citoplásmico de β3 (Hemler et al., 1994). Se ha propuesto que los requisitos estructurales para asociación con αv evitaron posteriores divergencias de secuencia primaria entre β3 y β5; incluso las diferencias existentes probablemente explican la reducida interacción de αvβ5 con talin (Lewis et al., 1996). El dominio citoplásmico de β5, cuando se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO) como quimeras con el dominio extracelular de β1, provocó que el receptor quimérico se comportase como β5, impulsando la migración celular y la pérdida de localización a adhesiones focales (Pasqualini y Hemler, 1994). Sin embargo, los dominios citoplásmicos de las subunidades de integrina β1 y β3, demostraron ser funcionalmente intercambiables (Solowska et al., 1991). Otros estudios han demostrado que αvβ3 y αvβ5 difieren en términos de localización a adhesión focal y su contribución a la migración celular (Delannet et al., 1994; Filardo et al., 1995). Sin embargo, estas divergencias funcionales no se han trazado para dominios específicos.

Tabla 8. Alineación de dominios similares citoplásmicos de subunidad β de integrina.

Las principales diferencias entre β3 y β5 citoplásmico están subrayadas. β1 H D R R E F A K F E K E K M N A K W D T G E N P I Y

K S A V T T V V N P K Y E G K β2 S D L R E Y R R F E K E K L K S Q W N N - D N P L F K

SATTTVMNPKFAES β3 H D RK EFAKFEE ERA RAKWDTANNPLYKE

A TS T FT N IT YR G β5 HDRR EFAKFQS ERS RARYEMASNPLYR

K P IS T H T V D FT FN K S YN G T V D

Tras provocar el cambio de angiogénesis, posiblemente distintas moléculas se asociarán con β3 o β5. Además, también pueden ser posibles asociaciones selectivas con el domino citoplásmico αv, en el contexto de cada uno de los heterodímeros. Por ejemplo, un turno de β en la cola citoplásmica de la subunidad αv de integrina ha demostrado influenciar en la conformación y la unión de ligando de αvβ3 (Filardo y Cheresh, 1994). La base de las propiedades de señalización selectiva puede ser el montaje de moléculas específicas que se asocian con los respectivos dominios citoplásmicos. El presente estudio define las moléculas implicadas en la señalización angiogénica selectiva αvβ3 y αvβ5 explorando una nueva estrategia, cribando bibliotecas peptídicas de exposición de fagos sobre dominios citoplásmicos β3 y β5 y determinando las propiedades biológicas de los péptidos que se unen al dominio citoplásmico.

Los métodos descritos tienen varias ventajas en relación a técnicas anteriores: (i) la habilidad para caracterizar moléculas intracelulares que directamente o indirectamente interactúan con dominios citoplásmicos de integrina; (ii) el desarrollo de anticuerpos contra moléculas que se unen con los dominios citoplásmicos de integrina en cantidades muy bajas; y (iii) las selecciones de bibliotecas de exposición de fagos dará lugar a la identificación de péptidos que imitan las proteínas de enlace de dominio citoplásmico.

Métodos

Cultivo celular bidimensional

Se usaron tres líneas celulares endoteliales humanas que expresaban integrinas β3 y β5v: células KS 1767 s (Herndier et al., 1996), HUVECs (ATCC), y células BCE (Solowska et al., 1991). Se usaron cubreobjetos estériles de cristal cubiertos por diferentes proteínas (p. ej., vitronectina, fibronectina, colágeno o laminina) como sustratos. Después de que las células se unieran y extendieran, las monocapas se quedaron inactivas en una incubación de 12 horas en un medio que contenía 0.05% suero de ternero fetal. Los péptidos se introdujeron en las células usando la etiqueta permeable con membrana de penetratina (ver a continuación). Las células se emplataron en proteínas ECM para adhesión y extensión. La monocapa fue estimulada durante 6 horas con cada uno de los factores de crecimiento que tomaron parte en la angiogénesis mediada por αv, incluyendo bFGF, TNFα, VEGF y TGFβ. Las células no tratadas fueron los controles negativos. Cultivo celular tridimensional

Se añadieron 150 µl de Matrigen por pozo de las placas de cultivo de tejido de 24 pozos y se dejaron gelificar a 37ºC durante 10 minutos. Se usaron HUVECs que fueron privadas de nutrientes durante 24 horas en un medio M199 complementado con 2% FCS antes de ser tripsinizadas. Se añadieron cuidadosamente 104 células de cada uno de los pozos triplicados y se dejaron adherir a la capa de gel durante 30 minutos a 37ºC. A continuación, el medio fue sustituido por péptidos en un medio completo. Las placas se controlaron y fotografiaron después de 24 horas con un microscopio invertido (Canon). Ensayos de Quimiotaxis:

Los ensayos de migración celular se realizaron del siguiente modo: Filtros de policarbonato libres de polivinilpirrolidona (Nucleopore, Cambridge, MA) con poros de 8 µm fueron cubiertos con 1% gelatina durante 10 minutos a temperatura ambiente y se equilibraron en un medio M199 complementado con 2% FCS. Los péptidos se colocaron en el compartimiento inferior de una cámara Boyden en M199 complementado con 2% FCS, 20 ng/ml VEGF-A (R&D System) y 1 U/ml heparina. Los cultivos subconfluentes privados de nutrientes durante la noche se tripsinizaron rápidamente y se volvieron a suspender en M199 que contenía 2% FCS en una concentración final de 2x106 células/ml. Después de colocar el filtro entre la cámara inferior y superior, 50 µl de suspensión celular se sembró en el compartimiento superior. Las células migraron durante 5 horas a 37ºC en una atmósfera humidificada con 5% CO2. A continuación el filtro se retiró, y las células de la parte superior se desecharon con una espátula de goma. Las células migradas se fijaron en metanol y se tiñeron con solución Giemsa (Diff-Quick, Baxter Diagnostics, Roma, Italia). Se contabilizaron cinco campos arbitrarios de gran potencia (magnitud 40x) en cada pozo.

Ensayo de Proliferación:

La proliferación celular se midió tal y como se ha descrito (Pasqualini y Helmer, 1994). En resumen, 4 x 104 HUVECs se incubaron en placas con 24 pozos. Las células fueron privadas de nutrientes durante 24 horas, y a continuación el medio se retiró y se recolocó en presencia de VEGF y 15 µM de cada péptido y se incubó durante 18 horas. Después, se añadieron 50 µl de medio que contenía [3H]timidina (1 µCi/ml) a los pozos, y tras 6 horas adicionales de incubación a 37ºC, el medio se retiró y las células se fijaron en 10% TCA durante 30 min a 4ºC, se lavaron con etanol, y se solubilizaron en 0.5 N NaOH. La radioactividad se contabilizó mediante centelleo líquido con un contador de centelleo LS 6000SC Beckman. Cada experimento se realizó tres veces con triplicados, y los resultados se expresaron como el promedio ±SDS. Ensayo de Apoptosis (población subdiploide con tinción de yoduro de propidio)

Aproximadamente 1 x 106 células se cosecharon en medio completo y 15 µM de péptido se añadieron a las 4, 8 y 12 horas. Las células posteriormente se lavaron en PBS y se volvieron a suspender en 0.5 ml de solución de yoduro de propidio (50 µg/ml PI, 0.1% Tritón X-100, 0.1% citrato sódico). Tras una incubación de 24 horas a 4ºC, las células se contabilizaron con un Contador XL (Coulter Corporation) con un láser 488-nm; se contabilizaron 12.000 células para cada histograma, y las distribuciones de ciclo celular se analizaron con el programa Multiciclo.

Tras la microinyección o la internalización mediada por penetratina de los péptidos y los controles apropiados, la apoptosis celular se controló usando el kit ApopTag. Los experimentos se llevaron a cabo en presencia de inhibidores de caspasa y anticuerpos contra caspasas específicas. Ensayos de Angiogénesis inducidos por Citoquina y Tumor

Los factores angiogénicos y las células tumorales implantadas en CAM estimulan el crecimiento de nuevos capilares. La angiogénesis fue inducida en CAMs desde el día 10 en embriones de pollo mediante filtros VEGF o bFGF implantados en regiones que previamente eran avasculares. Se aplicaron diferentes tratamientos (péptidos de penetratina y controles) tópicamente y, después de 3 días, los filtros y CAMs de alrededor fueron retirados y se fijaron en formalina. El número de vasos sanguíneos que entraron al disco se cuantificó dentro del plano focal del CAM con un estereomicroscopio. Se compararon el número medio de vasos y los errores estándares de 8 CAMs en cada grupo. Fosforilación y Criba de bibliotecas fágicas fosforiladas:

La fosforilación de bibliotecas peptídicas con quinasas proteicas de la familia src (Fyn, c-Src, Lyn y Syc) y quinasas serina/treonina como una quinasa MAP se realizó como se ha descrito previamente (Schmitz et al., 1996; Dente et al., 1997; Gram et al., 1997). En resumen, se recogieron partículas fágicas de los sobrenadantes del cultivo mediante una doble precipitación con 20% glicol de polietileno 8000 en 2.5 M NaCl. Las partículas se disolvieron en 1012 partículas/ml. Los fagos purificados (10 µl) se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente con diferentes concentraciones (35 a 3.500 unidades) de proteínas quinasa en un volumen de 50 µl de búfer de reacción. Las mezclas con la reacción se transfirieron a tubos que contenían 10 µg de anticuerpos monoclonales agarosa-conjugados anti-P-Tyr, anti-P-ser o anti-P-Thr para seleccionar los fagos que muestran péptidos fosforilados. Los fagos unidos se eluyeron lavando la columna con 0.3 ml de búfer de elución (0.1 m NaCl/glicina/1 mg/ml BSA, pH 2.35). Los eluatos se neutralizaron con 2 M Tris-base y se incubaron con 2 ml de un cultivo de bacteria de logaritmo medio. Las alícuotas de 20 µl se retiraron de las placas, y los fagos se cosecharon tal y como se ha descrito. El paso de fosforilación-selección se repitió. Los péptidos fosforilados que se unieron a los dominios citoplásmicos β3 y β5 fueron analizados tal y como se ha descrito en la sección anterior.

La espectrometría de masas desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF) se usó para trazar in vitro puntos de fosforilación en los dominios citoplásmicos β3 y β5 y en los péptidos que se unen con dominios citoplásmicos. Las proteínas de fusión o los péptidos se fosforilaron in vitro tal y como se ha descrito y se purificaron con columnas RP-HPLC o RP microtip. Los péptidos fosforilados se identificaron mediante tres métodos: (1) cambios de masa 80-Da tras reacciones de quinasa; (2) pérdida de 80 Da tras el tratamiento con fosfatasa; o (3) pérdida de 80 Da o 98 Da en modo reflector vs. Lineal para tirosina fosforilada o serina, péptidos fosforilados de treonina, respectivamente. Cuando se necesitó, los péptidos se purificaron con RP-HPLC y se sometieron a digestiones con carboxipeptidasa y aminopeptidasa para producir escaleras secuenciales. Esto fue particularmente útil cuando un péptido alberga uno o más puntos de fosforilación. Cribas sobre proteínas de fusión GST fosforiladas

Las proteínas de fusión GST se fosforilaron in vitro tal y como se ha descrito (Schmitz et al., 1996; Dente et al., 1997; Gram et al., 1997). En resumen, 10 µg/ml se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente con 5.5 unidades de proteína quinasa Fyn en búfer de reacción (50 mM Tris, 5mM MgCl2, 500 µM Na3VO4, 500 µM ATP en un volumen total de 50 µl). La reacción se frenó añadiendo 40% de TCA. Después de precipitar la proteína de sustrato quinasa, se volvió a suspender en PBS y se cubrió sobre pozos de microtítulo en 10 µg/pozo. Una alícuota de biblioteca CX7C (2.5 x 1011 unidades transductoras) se incubó en las proteínas de fusión GST. Los fagos se secuenciaron a partir de clones arbitrariamente seleccionados.

Estudios de Espectrometría de Masas

El trazado de masas de péptidos espectrométricos de masas se usó para identificar nuevos ligandos para dominios citoplásmicos β3 y/o β5. Los anticuerpos policlonales y monoclonales que aparecieron contra los péptidos que se unieron al dominio citoplásmico se usaron para purificar proteínas objetivo (moléculas citoesqueletales o señalizadora). Estas proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE, se extrajeron de los geles SDS y se digirieron en gel con tripsina. Tras la extracción de los péptidos, el análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF se llevó a cabo para producir una lista de masas peptídicas. La lista de masas peptídicas, en combinación con la especificidad de proteasa, produce una “firma” relativamente específica que pude usarse para buscar bases de datos secuenciales. Si la secuencia de la proteína está presente en esta base de datos, la proteína puede identificarse con gran seguridad mediante este método. El menor límite de detección para esta técnica se encuentra actualmente en 1 pmol, al menos 10-20 veces mejor que los métodos secuenciales N-terminal Edman. Resultados Criba de bibliotecas peptídicas de fagos en dominios citoplásmicos β3 o β5

Los péptidos que se unen a los dominios citoplásmicos β3 y β5 se aislaron seleccionando múltiples bibliotecas fágicas con proteínas recombinantes de fusión GST que contenían bien GST-β3cito o GST-β5cito cubierto sobre pozos de microtítulo. GST inmovilizado se usó como control negativo para enriquecimiento durante la criba de cada dominio citoplásmico. Los fagos se secuenciaron a partir de clones arbitrariamente seleccionados después de tres rondas de criba tal y como se describe en otros documentos (Koivunen et al., 1995; Pasqualini et al., 1995). Las distintas secuencias que interactuaron específicamente con los dominios citoplásmicos β3 o β5 (Tabla 9) se aislaron. Clones arbitrariamente seleccionados de las rondas II y III de la criba se secuenciaron. Las secuencias de aminoácido de los péptidos fagémidos codificados se dedujeron de secuencias de nucleótidos. Los motivos más frecuentes encontrados tras la criba con las bibliotecas indicadas se muestran en la Tabla 9.

5 Los radios se calcularon dividiendo el número de colonias recuperadas de los pozos cubiertos por β3-GST y los recuperados de GST o BSA.

Tabla 9. Secuencias mostradas por los fagos que se unen a los dominios citoplásmicos de integrina β3 o β5.

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imagen3

La especificidad de la interacción con los dominios citoplásmicos β3 o β5 se determinó calculando los radios entre el número de fagos unidos al dominio citoplásmico que contiene proteínas de fusión (β3 o β5) contra GST solo (control negativo). FIG. 9 muestra los resultados de los ensayos de enlace realizados con el fago de enlace GST-β3cito. Se testaron seis fagos que mostraron los motivos encontrados con más frecuencia durante la segunda y tercera serie de la criba. Cada panel muestra los resultados de los ensayos de enlace para los fagos mostrando diferentes péptidos que se enlazan con el dominio citoplásmico β3, tal y como se indica. Los fagos sin inserción o bibliotecas no seleccionadas se usaron como controles negativos y no mostraron la unión mencionada. Se mostraron dos diluciones en placas para cada ensayo.

Se usó una estrategia similar para determinar la especificidad de los fagos aislados en las selecciones en las que participa la proteína de fusión del dominio citoplásmico β5. Los ensayos de enlace se realizaron con fagos individualmente amplificados, mostrados en la FIG. 10. Se testaron cinco fagos que mostraron los motivos encontrados con más frecuencia durante la segunda y tercera serie de la criba. Cada panel muestra los resultados de los ensayos de enlace para los fagos mostrando diferentes péptidos que se enlazan con el dominio citoplásmico β5. Los fagos sin inserción o bibliotecas no seleccionadas se usaron como controles negativos y no mostraron la unión mencionada.

Para determinar si la unión de los motivos seleccionados era específica para cada dominio citoplásmico, los ensayos de unión se realizaron comparando la interacción de motivos fágicos individuales con proteínas de fusión del dominio citoplásmico β1, β3 o β5. ELISA con anticuerpos anti-GST muestra que las tres proteínas pueden cubrirse con plástico con una eficiencia equivalente, y por lo tanto las diferencias en el enlace no reflejan diferencias en concentraciones de cobertura (no mostradas). Tanto los fagos seleccionados β3 como β5 interactúan de manera selectiva con las proteínas de las que originalmente se seleccionaron, con selectividades medias de enlace observadas de β3/β1 = 3.9, β3/β5 = 3.7, β5/β1 = 4.8 y β5/β3 = 6.9

(no mostrados). La selectividad media para dominios citoplásmicos de integrina en comparación con BSA fue aproximadamente de uno a dos órdenes de magnitud (no mostrado). Ninguno de los fagos mostrados pareció tener una unión sólida con el dominio citoplásmico β1 (no mostrado).

Caracterización de péptidos sintéticos correspondientes a las secuencias mostradas por fagos de unión a dominio citoplásmico de integrina

Se seleccionaron fagos específicos para estudios adicionales en base a sus propiedades de enlace. Se usaron péptidos sintéticos correspondientes a la secuencia mostrada por cada fago para realizar los estudios de inhibición de enlace. Este ensayo determinó si en enlace fágico estuvo completamente mediado por el péptido dirigido expresado por los fagos o si también incluyó un componente no específico. Tal y como se esperaba, los péptidos sintéticos inhibieron el enlace de los fagos correspondientes de un modo dependiente de dosis (FIG. 11 y FIG. 12). Un péptido de control que contenía aminoácidos no relacionados no tuvo ningún efecto sobre el enlace fágico cuando se testó en idénticas concentraciones. Procesos de fosforilación modulan la interacción de los péptidos seleccionados con dominios citoplásmicos

Procesos que implican fosforilación son importantes para regular la transducción señalizadora. El sistema de expresión fágica se usó para evaluar el efecto de fosforilación de tirosina en dos niveles. En primer lugar, se usaron proteínas de fusión recombinantes que contenían los dominios β3 o β5 para cribar las bibliotecas fágicas que muestran péptidos que contienen tirosina. En segundo lugar, los propios dominios citoplásmicos fueron fosforilados antes de realizar la selección de fagos. Se realizaron experimentos para investigar la capacidad de tirosinas quinasas para modular la interacción de los péptidos seleccionados con los dominios citoplásmicos. Los resultados obtenidos de la criba de bibliotecas fágicas mostrando péptidos que contenían tirosina se muestran en la Tabla 10.

Clones arbitrariamente seleccionados de las series III y IV fueron secuenciados desde la biblioteca fosforilada X4YX4 con Fyn. Las secuencias de aminoácido de los péptidos codificados fagémidos se dedujeron de las secuencias de nucleótidos. La Tabla 10 muestra los motivos más frecuentemente encontrados después de cribar las bibliotecas indicadas con β3 o β5. El radio de enlace de β3 o β5 se calculó dividiendo el número de colonias β3 o β5 entre las colonias GST o BSA encontradas tras la criba. El radio de enlace para β3 o β5 con fagos fosforilados por Fyn contra los fagos no fosforilados se calculó dividiendo el número de colonias encontradas tras la criba. Tabla 10. Secuencias expuestas por enlace fágico fosforilado con dominios citoplásmicos de integrina.

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Se examinó el efecto de fosforilación sobre la afinidad y especificidad del enlace de dominio citoplásmico. Los fagos que mostraron los péptidos de enlace con dominio citoplásmico β3 y β5 fueron fosforilados in vitro como se ha descrito previamente (Schmitz et al., 1996; Dente et al., 1997; Gram et al., 1997), usando quinasa Fyn. La fosforilación específica del péptido que contiene tirosina sobre la superficie se confirmó usando 31P-gamma ADTP en la reacción de quinasa y separando la proteína pIII del fago con SDSPAGE.

Los fagos fosforilados in vitro mostraron una mayor afinidad y especificidad de enlace con el dominio citoplásmico de integrina β3 (FIG. 13). El fago TLRKYFHSS (SEQ ID NO: 120) también se testó en ensayos que incluyeron otras proteínas de fusión de dominio citoplásmico GST para determinar la especificidad (FIG. 14).

Similitud secuencial de péptidos de enlace con integrina sin proteínas 5 conocidas esqueletales o señalizadoras.

Los péptidos mostrados por los fagos de enlace con dominio citoplásmico de integrina fueron similares a ciertas regiones encontradas en proteínas citoesqueletales y proteínas implicadas en la transducción señalizadora (Tabla 11). La similitud de algunos de

10 los péptidos aislados con una región de proteínas quinasa 5 activada por mitógenos (MAPK5, aminoácidos 227-234) fue particularmente interesante. Se ha propuesto una conexión que implica la cascada MAPK, la adhesión, migración y proliferación celular (Lin et al., 1997).

15 Tabla 11. Similitud secuencial de péptidos de enlace de integrina con proteínas citoesqueletales y señalizadoras conocidas.

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Péptidos con membrana permeable

La penetratina es un péptido que puede desplazar compuestos hidrofílicos a lo largo de la membrana plasmática. La fusión con el radical que penetra permite que los oligopéptidos vayan directamente al citoplasma, núcleo o ambos sin aparente degradación (Derossi et al., 1994). Este péptido de membrana permeable consiste en 16 residuos (RQIKIWFQNRRMKWKK, SEQ ID NO: 122) correspondientes a los aminoácidos 43-58 del homeodominio de Antennapedia, un factor de transcripción de Drosophila (Joliet et al., 1991a, 1991b; Le Roux et al., 1993). La internalización mediada por penetratina ocurre a 37ºC y 4ºC, y el péptido internalizado puede recuperarse intacto de las células.

Se diseñaron péptidos que contenían secuencias de penetratina fusionadas con las secuencias o motivos encontrados para unirse con los dominios citoplásmicos β3 o β5. Los péptidos se sintetizaron en un sintetizador de péptidos 431 Applied Biosystems usando resina p-hidroximetilfenoxi metil poliestireno (HMP) y química Fmoc estándar. La internalización y visualización del péptido se realizó tal y como se ha descrito (Derossi et al., 1994; Hall et al., 1996; Theodore et al., 1995).

En resumen, se añadieron 10-50 µg/ml del péptido biotinilado a las células en el cultivo. Los péptidos se incubaron con células emplatadas. Después de 2-4 horas, los cultivos se lavaron tres veces con medio de cultivo de tejido, se fijaron y permeabilizaron usando etanol:ácido acético (9:1) durante 5 minutos a -20ºC. Los puntos de enlace de proteína no específicos se bloquearon incubando los cultivos durante 30 minutos con solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía 10% suero de ternero fetal (FCS) y 0.02% Tween. Los cultivos se incubaron en el mismo búfer que contenía Estreptavidina conjugada con FITC (dilución 1:200) y se lavó con TBS antes de ser montada para verse mediante microscopio confocal. Los péptidos unidos a penetratina se internalizaron de manera bastante eficiente (datos no mostrados).

Los datos funcionales mostraron que los péptidos de enlace con dominio citoplásmico seleccionados en β3 o β5 interfieren con la señalización mediada por integrina y con la posterior respuesta celular (es decir, la adhesión celular endotelial, extensión, proliferación y migración). Se obtuvo un panel comercial de versiones “internalizables” de los motivos sintéticos encontrados por las selecciones fágicas (SDNRYIGSW, SEQ ID NO:97; y CEQRQTQEGC, SEQ ID NO:93; péptidos de enlace β3 y VVISYSMPD, SEQ ID NO: 112; un péptido de enlace β5). Los péptidos quiméricos complejos consisten en los péptidos más selectivos del grupo que se enlaza con el dominio citoplásmico β3 o β5 enganchados a penetratina, más un radical de biotina que permite que los péptidos puedan rastrearse una vez que han sido internalizados en células intactas. Estas formas con membrana permeable de los péptidos se internalizan y pueden afectar los procesos celulares de enlace post-ligando β3 y β5 y pueden inducir apoptosis masiva (datos no mostrados).

Proliferación celular endotelial, quimiotaxis y apoptosis

El efecto de motivos de enlace con dominio citoplásmico de integrina β3 y β5 sobre la proliferación celular endotelial se evaluó tras la estimulación con factores que activan células endoteliales (FIG. 15). La proliferación celular se midió de acurdo con Pasqualini y Hemler (1994). En resumen, 4x104 HUVECs se incubaron en placas con 24 pozos y fueron privadas de proteínas durante 24 horas, periodo después del cual el medio fue retirado y sustituido en presencia de VEGF y 15 µM de cada péptido. Tras otras 18 h de incubación, se añadieron 50 µl de medio que contenía [3H]timidina (1µCi/ml) a los pozos. Tras 6 horas adicinoales de incubación a 37ºC, el medio fue retirado y las células se fijaron en 10% TCA durante 30 minutos a 4ºC, se lavaron con etanol y se solubilizaron en

0.5 N NaOH. La radioactividad se contabilizó mediante destello líquido usando un contador de destellos Beckman LS 6000SC. Cada experimento se llevó a cabo tres veces con triplicados, y los resultados se expresaron como la media ±SDS.

El efecto de motivos de enlace con dominio citoplásmico de integrina β3 y β5 sobre la proliferación celular endotelial se evaluó tras la estimulación con factores que activan células endoteliales.

Los péptidos testados afectaron a la función celular de un modo dependiente de dosis y especifico. Sus propiedades parecen ser intrínsecas al dominio citoplásmico β3 o β5 (FIG. 16).

Ensayo de Quimiotaxis

La migración celular fue sometida a ensayo en una cámara de quimiotaxis con 48 pozos. Filtros de policarbonato libres de polivinilpirrolidona con poros de 8 µm se cubrieron con 1% gelatina durante 10 minutos con 2% FCS. Los péptidos se colocaron en el compartimiento inferior de una cámara Boyden en M199 complementado con 2% FCS, 20 ng/ml VEGF-A (R&D System) y 1 U/ml heparina. Los cultivos subconfluentes privados de nutrientes durante la noche se tripsinizaron rápidamente, y se volvieron a suspender en M199 que contenía 2% FCS en una concentración final de 2x106 células/ml. Después de colocar el filtro entre la cámara inferior y superior, 50 µl de la suspensión celular se sembraron en el compartimiento superior. Las células migraron durante 5 h a 37ºC en una atmósfera humidificada con 5% CO2. A continuación, el filtro se retiró y las células sobre la parte superior se desecharon con una espátula de goma. Las células migradas se fijaron en metanol y se tiñeron con solución Giemsa. Cinco campos arbitrarios de gran potencia (magnitud 40x) se contabilizaron en cada pozo. Los resultados muestran que los péptidos de enlace con los dominios citoplásmicos de integrina β3 incrementaron la migración celular pero que la penetratina no afectó a las células. Ensayo de Apoptosis (Yoduro de Propidio que tinta población subdiploide).

Se cosecharon aproximadamente 1x106 células en un medio completo, y se añadieron 15 µM de péptido a las 4, 8 y 12 horas. A continuación, las células se lavaron en PBS y se volvieron a suspender en 0.5 ml de solución de yoduro de propidio (50 µg/ml PI, 0.1% Tritón X-100, 0.1% citrato sódico). Después de una incubación de 24 horas a 4ºC, las células se contabilizaron con un Coulter XL (Coulter Corporation) con un láser de 488 nm; se contabilizaron

12.000 células para cada histograma, y las distribuciones de ciclos celulares se analizaron con el programa Multicycle.

El tratamiento de células con quimeras VISY-penetratina dio como resultado la apoptosis (FIG. 17, panel d). Los efectos proapoptóticos no se observaron cuando las células fueron expuestas a otros factores del crecimiento (no mostrados). La penetratina sola u otras quimeras de penetratina también podían provocar efectos similares (FIG. 17, panel c). Estos hechos muestran que pueden desarrollarse nuevas técnicas para inhibir angiogénesis basándose en el uso de péptidos dirigidos a integrina. Inmunización con péptidos de enlace de dominio citoplásmico y caracterización de los anticuerpos resultantes

Anticuerpos policlonales que reconocen péptidos de enlace con αvβ3 y αvβ5 fueron generados usando conjugados KLH hecho con los péptidos sintéticos, de acuerdo con las técnicas habituales. Se han producido anticuerpos contra dos péptidos diferentes sintéticos (FIG. 18). Los sueros no sólo reconocieron los péptidos inmovilizados, sino que también reconocieron proteínas específicas en el total de extractos celulares, tal y como los muestran los análisis de Western Blot (FIG. 19).

Se inmunizaron conejos con conjugados KLH SDNRYIGSW (SEQ ID NO:97) o GLDTYRGSP (SEQ ID NO:96). A cada conejo se le inyectaron 200 µg de péptido conjugado con KLH en Adyuvante Completo de Freund. Entre 20 y 60 días más tarde, a los conejos se les inyectaron 100 µg de Adyuvante Incompleto de Freund. Tras la tercera inmunización, se recogieron los sueros. El suero preinmune obtenido antes de la primera inmunización se usó como un control adicional en el experimento.

Los anticuerpos policlonales se testaron con ELISA, Western blot e inmunoprecipitación. En el ensayo de ELISA, placas de pozo de microtítulo fueron cubiertas con 10 µg/ml de péptidos. Las placas se secaron a 37ºC, se bloquearon con PBS+3% BSA, y se incubaron con diferentes diluciones de suero en PBS+1% BSA. Tras el lavado y la incubación con el anticuerpo secundario, se añadió un sustrato de fosfato alcalino y el enlace de anticuerpo se detectó a 405 nm. La reactividad observada en los sueros policlonales del ratón y el conejo fue muy específica. En todos los casos, la unión de anticuerpo pudo anularse mediante una preincubación con el péptido correspondiente que se usó para la inmunización, pero no por el péptido de control (FIG. 18 y FIG. 19). Los anticuerpos que aparecen contra dos de los péptidos de enlace de dominio citoplásmico β3 reconocen bandas específicas en el total de extractos celulares y en experimentos de inmunoprecipitación que usan extractos etiquetados con 35S. Se obtuvieron resultados similares con sueros policlonales y IgGs purificados (no se muestra).

El presente ejemplo muestra que los péptidos dirigidos contra dominios específicos de receptores celulares pueden identificarse mediante exposición fágica. Dichos péptidos pueden usarse para identificar los ligandos endógenos para receptores de células, como endostatina. Además, los propios péptidos pueden tener efectos terapéuticos, o pueden servir como base para la identificación de agentes terapéuticos más efectivos. Los péptidos dirigidos a endostatina aquí identificados, cuando se introducen en células, mostraron efectos sobre la proliferación celular, quimiotaxis y apoptosis. El experto en la técnica se dará cuenta de que la presente invención no se limita a los péptidos o efectos terapéuticos descritos. Otros receptores y ligandos, así como inhibidores o activadores de los mismos, pueden identificarse con los métodos descritos. Ejemplo 7. Inducción de Apoptosis con Péptidos Unidos a Integrina (Endothanos)

El Ejemplo 9 muestra que el péptido VISY (VVISYSMPD, SEQ ID NO:112), importado a células mediante unión a penetratina, podría inducir apoptosis en células HUVEC. Los anticuerpos contra el péptido VISY se usaron para identificar el análogo celular endógeno del péptido, aquí identificado como Anexina V. Los resultados indican que la Anexina V es un ligando endógeno para las integrinas que participa en una ruta nueva para apoptosis. Métodos Purificación Proteica

Se prepararon anticuerpos policlonales contra el péptido VISY (VVISYSMPD, SEQ ID NO:112), usando los métodos descritos en el Ejemplo 9 anterior. Se usaron células de carcinoma de pecho MDAMB-435 para purificación del análogo de péptido endógeno VISY. Las células se lavaron tres veces con PBS helado y se lisaron con agua helada durante 20 minutos. Los extractos celulares se centrifugaron durante 30 minutos a 100.000 x g para separar la fracción citoplásmica de la fracción de membrana. La fracción citoplásmica se sometió a cromatografía de columna sobre una columna de filtración de gel (10-50kDa) y una columna de intercambio de anión (mono Q). La columna de intercambio de anión se eluyó con un gradiente de sal desde 50 mM hasta 1 M NaCl. Se recogieron fracciones de un ml, funcionaron sobre SDS-PAGE y se testaron con Western Blot para la presencia de proteínas endógenas reactivas con el anticuerpo anti-VISY. La fracción de interés, que contenía una banda de anticuerpo de 36 kDa, eluyó a aproximadamente 300 mM NaCl.

Los 36 kDa siempre aparecieron en fracciones que mostraban reactividad positiva con el anticuerpo anti-VISY. Las fracciones se analizaron con SDS-PaGE y electroforesis de gel 2-D, y a continuación con Western Blot. Se observó un sustancial enriquecimiento de la proteína de 36 kDa tras la cromatografía de columna (no mostrada). El péptido de 36 kDa se cortó del gel SDSPAGE y se analizó mediante espectroscopia de masa para obtener su secuencia. Los cinco péptidos que se obtuvieron mediante espectroscopia de masa mostraron 100% de homología con la secuencia aportada de Anexina V (GenBank Nº de Acceso GI_468888). Además de su presencia en 435 células, la banda 36 kDa también se ha visto en células de sarcoma de Kaposi, SKOV y HUVEC (no se muestran).

Se obtuvieron anticuerpos comerciales contra Anexina V (Santa Cruz Biologics, Santa Cruz, CA). Se realizaron ensayos Western Blot comparativos usando el anticuerpo anti-VISY y el anticuerpo anti-Anexina V. Ambos anticuerpos mostraron reactividad con la proteínas 36 kDa (no se muestra). Estos resultados indican que la proteína análoga endógena del péptido VISY es Anexina V.

Interacción proteína-proteína con Anexina V y el dominio citoplásmico β5.

Se realizaron ensayos de enlace competitivos para examinar la unión de Anexina V con integrina β5 y el efecto del péptido VISY. Las placas se cubrieron con proteínas de fusión GST de los dominios ciotoplásmicos de varias integrinas y se añadió Anexina V a las polacas. La unión de Anexina V se determinó usando anticuerpos anti-Anexina V. Tal y como se muestra en la FIG. 20A, Anexina V no se unió ni a integrinas GST-β1 ni a GST-β3. Anexina V se unió de manera muy estable a la integrina GST- β5, pero la unión fue dependiente del búfer usado (FIG. 20A). Se observó una unión débil en salina tamponada con Tris (TBS), mientras que se observó una unión sólida en “búfer citoplásmico” (100 mM KCl, 3 mM NaCl, 3.5 mM MgCl2, 10 mM PIPES, 3 mM DTT) con o sin calcio añadido (2 mM) (FIG. 20A). El calcio se usó porque se ha demostrado que la actividad de Anexina V se modula con calcio. La unión de Anexina V con GST-β5 se bloqueó añadiendo el péptido VISY (FIG. 20A). FIG. 20B muestra los niveles relativos de enlace de anticuerpo anti-Anexina V con Anexina V purificada y con péptido VISY.

Se realizó un estudio recíproco, usando Anexina V para cubrir placas y añadiendo proteínas de fusión GST de dominios citoplásmicos de integrina. La unión se evaluó usando anticuerpos de proteínas de fusión anti-GST. Tal y como se esperaba, solamente GST-β5 mostró una unión sustancial con Anexina V, mientras que GST-β1 y GST-β3 mostraron bajos niveles de unión a Anexina V (no se muestran). En algunos estudios, ión cálcico pareció interferir en la interacción de enlace entre GST-β5 y Anexina V, y se observó una menor unión en presencia de calcio (no se muestra). Se observó un mayor grado de inhibición de Anexina V unida a GST-β5 por el péptido VISY en presencia de calcio (67% de inhibición) que en ausencia de calcio (45%) (FIG. 20A). Quimeras de péptido de penetratina unidas al dominio citoplásmico β5 inducen muerte celular programada.

Se confirmó la inducción de apoptosis por el péptido VISY mostrada en el Ejemplo 9. 106 HUVEC fueron tratadas con 15 µM de quimeras de antennapedia (penetratina) o 15 µM de péptido de antennapedia (penetratina) solo durante 2-4 horas y la fragmentación de cromatina se analizó mediante electroforesis en un gel de agarosa. FIG. 21 muestra la inducción de apoptosis mediante VISYant (penetratina), tal y como lo indica la fragmentación de cromatina. Ni VISY ni penetratina sola indujeron apoptosis. La inducción de apoptosis se inhibió hasta el 70% cuando se añadió un inhibidor de caspasa (zVAD, inhibidor I de caspasa, Calbiochem #627610, San Diego, CA) al medio al mismo tiempo que el péptido quimérico VISY.

Una distinción entres el mecanismo de muerte celular inducido por péptido VISY y otros agentes pro-apoptosis es que otros mecanismos apoptóticos evaluados en cultivo celular normalmente implican el desprendimiento de las células del sustrato, seguido de muerte celular. Sin embargo, en muerte celular inducida por VISY, las células no se desprenden del sustrato antes de morir. Por lo tanto, endothanos (muerte desde el interior) parece diferir de anoikis (falta de vivienda).

El Ejemplo 9 y los resultados presentes muestran que los péptidos VISY activan una ruta de apoptosis dependiente de integrina. El ejemplo presente muestra que el análogo endógeno para el péptido VISY es Anexina V. Estos resultados demuestran la existencia de una nueva ruta apoptótica, mediad por una interacción entre Anexina V e integrina β5 y dependiente de la actividad de caspasa. Este nuevo mecanismo apoptóticos se denomina endothanos. El experto en la técnica sabrá que la existencia de un nuevo mecanismo para inducir o inhibir apoptosis es útil para uso en una variedad de aplicaciones, como terapia cancerígena. Ejemplo 8. Identificación de Parejas Receptor/Ligando: Aminopeptidasa A regula la función celular endotelial y angiogénesis

Células endoteliales en vasos tumorales expresan marcadores angiogénicos específicos. Aminopeptidasa A (APA, EC 3.4.11.7) se regula por incremento en microvasos que sufren angiogénesis. APA es una metalopeptidasa homodimérica de zinc unida a la membrana que hidroliza residuos de glutamil o aspartil en terminal N de oligopéptidos (Nanus et al., 1993). In vivo, APA convierte angiotensina II a angiotensina III. El sistema renina-angiotensina juega un importante papel en la regulación de varias funciones endocrinas, cardiovasculares y de compartimiento (Ardaillou, 1997; Stroth y Unger, 1999). Estudios recientes también sugieren un papel para angiotensinas en angiogénesis (Andrade et al., 1996), pero la función de APA en el proceso angiogénico aún no se ha investigado.

En el ejemplo presente, los péptidos dirigidos capaces de unirse a APA fueron identificados seleccionado bibliotecas de fagos en células que expresaban APA. Los péptidos unidos a APA que contenían el motivo CPRECESIC (SEQ ID NO:123) inhibieron específicamente la actividad enzimática de APA. El péptido soluble CPRECESIC (SEQ ID NO:123) inhibió la migración, proliferación y morfogénesis de células endoteliales in vitro e interfirió con angiogénesis in vivo en un ensayo con membrana corioalantoidea de embrión de pollito (CAM). Además, ratones nulos APA tuvieron una menor cantidad de neovascularización retiniana en comparación con ratones de tipo salvaje (wt) en retinopatía inducida por hipoxia en ratones prematuros. Estos resultados pueden llevar a una mejor comprensión del papel de APA en angiogénesis y en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas anti-tumor. Materiales y Métodos Cultivos celulares

La línea celular de carcinoma renal SK-RC-49 fue transfectada con un vector de expresión que codificaba APA cADN de longitud completa (Geng et al., 1998). Las células se mantuvieron en MEM (Irvine Scientifics, Santa Ana, C), complementadas con 2 mM glutamina, 1% aminoácidos no esenciales, 1% vitaminas (Gibco BRL), 100 U/ml estreptomicina, 100 U/ml penicilina (Irvine Scientifics), 10 mM piruvato sódico (Sigma-Aldrich), y 10% suero de ternero fetal (FCS) (Cultivo de Tejido Biológico, Tulare, CA). Las células establemente transfectadas se mantuvieron en un medio que contenía G418. HUVECs se aislaron mediante tratamiento con colagenasa y se usaron entre los pasos 1 a 4. Las células crecieron en un plástico cubierto por gelatina en medio M199 (Sigma) complementado con 20% FCS, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (50 µg/ml), heparina (50 µg/ml), y extracto de cerebro bovino (100 µg/ml). Todos los complementos para el medio se obtuvieron en el mercado (Life Technologies, Inc., Milán, Italia).

Anticuerpos y Péptidos

El RC38 anti-APA mAb (Schlingemann et al., 1996) se usó para inmunocapturar APA de lisados celulares transfectadas. Los péptidos cíclicos CPRECESIC (SEQ ID NO:123) y GACVRLSACGA (SEQ ID NO:124) se sintetizaron químicamente, se ciclaron de manera espontánea en condiciones no reductoras y se purificaron mediante espectrometría de masa (AnaSpec San Jose, CA). El análisis con el espectrómetro de masas del péptido CPRECESIC (SEQ ID NO:123) reveló seis picos diferentes, que posiblemente reflejen diferentes posiciones del enlace de disulfuro y la formación de dímeros. Debido al comportamiento similar de las diferentes fracciones en la actividad enzimática de APA, se usó una mezcla de los seis picos en todos los procedimientos descritos a continuación. Inmunocaptura APA

Las células se descartaron de las polcas semi-confluentes en PBS frío que contenía 100 mM N-octil-β-glucopiranósido (Calbiochem), se lisaron en hielo durante 2 horas y se centrifugaron a 13.000 x g durante 15 min. Pozos con el fondo circular de microtítulo (Falcon) fueron cubiertos con 2 µg de RC38 durante 4 horas a temperatura ambiente y se bloquearon con PBS/3% BSA (Intergen, Purchase, NY) durante 1 hora a temperatura ambiente, después de lo cual 150 µl de lisado celular (1 mg/ml) se incubó en los pozos cubiertos por mAb durante la noche a 4ºC, se lavaron cinco veces con PBS/0.1% Tween-20 (Sigma) y se lavaron dos veces con PBS. Ensayo con enzima APA

Las células y proteínas inmunocapturadas fueron testadas en busca de actividad enzimática específica por Linl et al., (1998). En resumen las células adherentes o extractos celulares inmunocapturados por RC38 se incubaron durante 2 horas a 37ºc con PBS que contenía 3 mM de α-L-glutamil-p-nitroanilina (Fluka) y 1 mM CaCl2. La actividad enzimática se determinó leyendo la absorbencia óptica (O.D.) a 405 nm en un lector de microplaca (Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA).

Criba celular

Se preparó una biblioteca CX3CX3CX3C (C, cisteína; X, cualquier aminoácido) (Rajotte et al., 1998). La amplificación y purificación de las partículas fágicas y la secuenciación de ADN de las inserciones expresadas por los fagos se realizaron tal y como se ha descrito previamente. Las células se separaron mediante incubación con 2.5 mM EDTA en PBS, se lavaron una vez en medio de enlace (glucosa alta DEM complementada con 20 mM HEPES y 2% FCS) y se volvió a suspender en el mismo medio en una concentración de 2x106 células/ml. Se añadieron 1010 TU de fagos a 500 µl de la suspensión celular, y la mezcla se incubó durante la noche (primera serie) o durante 2 horas (series posteriores) a 4ºC con suave rotación. Las células se lavaron cinco veces en medio de enlace a temperatura ambiente y se volvieron a suspender en 100 µl del mismo medio. Los fagos se rescataron añadiendo 1 ml de bacteria Escherichia coli K91Kan exponencialmente creciente e incubando la mezcla durante 1 horas a temperatura ambiente. Las bacterias se diluyeron en 10 ml de medio LB complementado con 0.2 µg/ml tetraciclina y se incubaron durante otros 20 minutos a temperatura ambiente.

Las diluciones en serie se emplataron en placas LB que contenían 40 µg/ml tetraciclina, y las placas se incubaron a 37º1C durante la noche antes de contar las colonias. Ensayo de especificidad de enlace fágico

El ensayo de enlace celular se realizó con una aportación de 109 TU tal y como se ha descrito para la criba celular. La especificidad se confirmó añadiendo el péptido CPRECESIC (SEQ ID NO:123) al medio de enlace en concentraciones crecientes. Para la unión fágica en APA inmunocapturado, los pozos se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con PBS/3% BSA y se incubaron con 109 TU durante 1 h a temperatura ambiente en 50 µl PBS/3% BSA. Tras ocho lavados en PBS/1% BSA/0.01% Tween20 y dos lavados en PBS, los fagos se rescataron añadiendo 200 µl de E. coli K91Kan exponencialmente creciente. Cada experimento se repitió al menos tres veces.

Dirección tumoral in vivo de fagos que se unen a APA

Se establecieron xenoinjertos de tumor derivados de MDA-MB435 en ratones hembras que no habían sido sometidos a otros tratamientos de 2 meses de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine). Los ratones fueron anestesiados con Avertin y se les inyectaron por ruta intravenosa a través de la vena de la cola 109 TU de los fagos en un volumen de 200 µl de DMEM. Los fagos circularon durante 5 min, y los animales fueron sometidos a perfusión a través del corazón con 5 ml de DMEM. De cada ratón se diseccionaron el tumor y el cerebro, se pesaron y homogenizaron partes iguales del tejido. Los homogenados del tejido se lavaron tres veces con DMEM helado que contenía un cocktail inhibidor de proteasa y 0.1% BSA. Los fagos unidos se rescataron y contabilizaron tal y como se ha descrito para la criba celular. El fago Fd-tet se inyectó en la misma carga como control. El experimento se repitió dos veces. En paralelo, parte de las mismas muestras de tejido se fijaron en solución Bouin, y se insertó en parafina para la preparación de secciones de tejido. Se usó un anticuerpo con el fago M-13 (Amersham-Pharmacia) para la tinción. Ensayo de crecimiento celular

Se sembraron HUVECs en placas con 48 pozos (104 céulas/pozo) y se dejaron unir durante 24 h en medio completo M199. A continuación, se privó a las células de nutrientes en el medio M199 que contenía 2% FCS durante 24 h. El péptido CPRECESIC (SEQ ID NO:123) o el péptido de control GACVRLSACGA (SEQ ID NO:124) (1 mM) se añadió a los pozos en el medio que contenía 2% FCS y 10 ng/ml VEGF-A (R&D System, Abingdom, UK). Tras incubación durante los tiempos indicados, las células se fijaron en 2.5% glutaraldehído, se tintaron con 0.1% violeta cristal en 20% metanol, y se solubilizaron en 10% ácido acético. Todos los tratamientos se hicieron por triplicado. El crecimiento celular se evaluó midiendo O.D en 590 nm en un lector de microplaca (Biorad, Hercules, CA). Se estableció una curva de calibración y se observó una correlación lineal entre O.D y los totales celulares entre 103 y 105 células. Ensayo de Quimiotaxis

Se realizó un ensayo de migración celular en una cámara de microquimiotaxis con 48 pozos (NeuroProbe, Gaithersburg, MD) de acuerdo con Bussolini et al. (1995). Filtros de policarbonato libres de polivinilpirrolidona (Nucleopore, Cambridge, MA) con poros de 8 µm se cubrieron con 1% gelatina durante 10 min a temperatura ambiente y se equilibraron en medio M199 complementado con 2% FCS. El péptido CPRECESIC (SEQ ID NO:123) o el control GACVRLSACGA (SEQ ID NO:124) (1 mM) se colocó en el compartimiento inferior de una cámara Boyden en medio M199 complementado con 2% FCS y 10 ng/ml VEGF-A (R&D System). Los cultivos subclonfuentes que habían sido privados de nutrientes durante la noche se cosecharon en PBS que contenía 2.5 mM EDTA, se lavaron una vez en PBS, y se volvieron a suspender en medio M199 que contenía 2% FCS en una concentración final de 2x106 células/ml. Después de colocar el filtro entre la cámara inferior y superior, se sembraron 50 µl de suspensión celular en el compartimiento superior, y las células migraron durante 5 h a 37ºC en una atmósfera humidificada con 5% CO2. Posteriormente, el filtro se retiró y las células en la parte superior se descartaron con una espátula de goma. Las células migradas se fijaron en metanol y se tiñeron con solución Giemsa (Diff-Quick, Baxter Diagnostics, Roma, Italia). Se contabilizaron cinco campos arbitrarios de alta potencia (magnitud 100x) en cada pozo. Cada ensayo se realizó por triplicado. Cultivo celular tridimensional

Se añadió Matrigel (Collaborative Research, Bedford, MA) en 100 µl por pozo a placas de cultivo de tejido de 48 pozos y se dejaron solidificar durante 10 min a 37ºC. HUVECs fueron privadas de nutrientes durante 24 h en medio M199 complementado con 2% FCS antes de cosecharse en PBS que contenía 2.5 mM EDTA. Se añadieron suavemente 104 células a cada uno de los pozos triplicados y se dejaron adherir a la capa de gel durante 30 min a 37ºC. A continuación, el medio se sustituyó por las concentraciones indicadas de péptidos CPRECESIC (SEQ ID NO:123) o GACVRLSACGA (SEQ ID NO:124) en medio completo. Las placas se fotografiaron después de 24 horas con un microscopio invertido (Canon). El ensayo se repitió tres veces.

Ensayo CAM

La angiogénesis in vivo se evaluó con un ensayo CAM (Ribatti et al., 1994). Huevos fertilizados de pollos Leghorn blancos se mantuvieron en humedad constante a 37ºC. El tercer día de incubación, se abrió una ventana cuadrada en la cáscara del huevo y se retiraron 2-3 ml de albumen para separar el CAM desarrollante de la cáscara. La ventana se selló con una placa de cristal del mismo tamaño y los huevos volvieron a la incubadora. En día 8, 1 mm3 de esponjas de gelatina esterilizadas (Gelfoam, Upjohn Co., Kalamazoo, Milán) se adsorbieron con VEGF-A (20 ng, R&D System) y con el péptido CPRECESIC (SEQ ID NO:123) o con el control GACVRLSACGA (SEQ ID NO:124) (1mM) en 3 µl PBS y se implantaron en la parte superior del CAM creciente bajo condiciones estériles. CAMs se examinaron diariamente hasta el día 12 y se fotografiaron in ovo con un estereomicroscopio Leica. Se contabilizaron los capilares emergentes de la esponja. El ensayo se repitió dos veces. Inducción de neovascularización retiniana

Se han descrito ratones con pérdida de APA (Lin et al., 1998). Crías de ratones el P7 (7º días tras el parto) con sus madres fueron expuestos a 75% oxígeno durante 5 días. Los ratones fueron devueltos al oxígeno normal (aire ambiente) el P12. Para análisis histológico, se mataron a los ratones entre P17 y P21 y los ojos se retiraron y fijaron en 4% paraformaldehído en PBS durante la noche a +4ºC. Los ojos fijados se insertaron en parafina y se cortaron secciones en serie de 5 µl. Las secciones se tintaron con solución hematoxilina/eosina (h/e). Los núcleos neovasculares en el lado vítreo de la membrana limítrofe interna se contabilizaron desde 20 secciones teñidas con h/e por cada ojo. El número medio de núcleos neovasculares por sección se calculó y comparó entre grupos de animales usando la prueba t de Student.

Resultados Criba celular con exposición fágica y selección de motivo de enlace con APA

Para identificar un péptido capaz de unirse a APA, las células se sometieron a una selección con una biblioteca fágica de péptidos arbitraria. En primer lugar, células de carcinoma renal SK-RC-49, que no expresan APA, se transfectaron con cADN APA de longitud completa para obtener un modelo de expresión APA en la conformación nativa. APA expresado como un resultado de transfección estuvo funcionalmente activo, tal y como lo evidencia el ensayo de enzima APA (no mostrado) pero las células parenterales SK-RC-49 no mostraron ni expresión APA ni actividad (no se muestra).

La biblioteca fágica CX3CX3CX3C (1010 unidades transductoras [TU]) se preadsorbió en células parentales SK-RC-49 para disminuir la unión no específica. Las células SK-RC-49/APA se seleccionaron con fagos que no se unieron a las células madres. Los fagos unidos a SK-RC-49/APA se amplificaron y usaron para dos series consecutivas de selección. Se observó un aumento en la unión fágica con células SK-RC-49/APA en relación al enlace fágico con células parentales SK-RC-49 en la segunda y tercera serie (no mostradas).

La posterior secuenciación de los fagos reveló un enriquecimiento específico de un inserto peptídico, CYNLCIRECESICGADGACWTWCADGCSRSC (SEQ ID NO:125), con una repetición en tándem de la secuencia general de la biblioteca CX3CX3CX3C. esta secuencia representó el 50% de 18 inserciones fágicas seleccionadas arbitrariamente de la serie 2 y el 100% de las inserciones fágicas de la serie 3. Cuatro inserciones peptídicas derivadas de la serie 2 compartieron similitud secuencial con el fago tándem (Tabla 12, en negrita). Se observaron otros motivos aparentemente conservados entre los péptidos de la serie 2 (Tabla 12, subrayado o en cursiva).

Uno de estos coincidió en parte con la secuencia repetida tándem. Una búsqueda de homología secuencial de los péptidos seleccionados con las bases de datos de humanos no dio significativa coincidencia.

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Inserciones seleccionadas de fago son ligandos APA específicos

Los fagos que expresan las inserciones peptídicas CYNLCIRECESICGADGACWTWCADGCSRSC (SEQ ID NO:125), CPKVCPRECESNC (SEQ ID NO:127) o CLGQCASICVNDC (SEQ ID NO:126) se testaron individualmente para unión APA. Los tres fagos específicamente unidos a la superficie de las células SK-RC49/APA (no se muestra), con un patrón similar con un enriquecimiento multiplicado por 6 en relación con células parentales SK-RC-49. El control, el fago sin inserción, no mostró preferencia de unión (no mostrada). CGTGCAVECEVVC (SEQ ID NO:128) yel otro fago seleccionado en la serie 2 no mostraron enlace selectivo con células 49/APA (datos no mostrados). Se sintetizó un péptido soluble, CPRECESIC (SEQ ID NO:123) que contenía una secuencia de consenso que reproduce las inserciones fágicas de unión con APA.

Se llevaron a cabo ensayos de enlace con el fago CPKVCPRECESNC (SEQ ID NO:127) en presencia del péptido CPRECESIC (SEQ ID NO:123). El péptido soluble CPRECESIC (SEQ ID NO:123) compitió con el fago CPKVCPRECESNC (SEQ ID NO:127) en el enlace con células SK-RC-49/APA, pero no tuvieron ningún efecto sobre el enlace no específico con células parentales SK-RC-49 (no se muestra). El péptido cíclico no relacionado GACVRLSACGA (SEQ ID NO:124) no tuvo actividad competitiva (no se muestra). En enlace del fago CYNLCIRECESICGADGACWTWCADGCSRSC (SEQ ID NO:125) también fue desplazado por el péptido CPRECESIC (SEQ ID NO:123), pero el enlace del fago CLGQCASICVNDC (SEQ ID NO:126) no se vio afectado (datos no mostrados).

Además, para confirmar la especificidad del sustrato de las inserciones peptídicas seleccionadas, APA se purificó parcialmente a partir de extractos celulares transfectados con APA mediante inmunocaptura con mAb RC38. La proteína APA inmovilizada en micropozos cubiertos con RC38 fue funcional, tal y como lo confirmó en ensayo de encima (no mostrado). Los fagos CYNLCIRECESICGADGACWTWCADGCSRSC (SEQ ID NO:125), CPKVCPRECESNC (SEQ ID NO:127), y CLGQCASICVNDC (SEQ ID NO:126) unidos de manera selectiva inmunocapturaron APA, con un enriquecimiento multiplicado por 10 y 20 en comparación con los fatos que se unen a lisados celulares inmunocapturados por RC38 de células parentales SK-RC-49 (no mostrados). Fagos unidos a APA dirigidos a tumores in vivo

Se evaluó la habilidad del péptido identificado para dirigirse a tumores usando ratones que no habían sido sometidos a ningún tratamiento implantados con xenoinjertos de tumor de pecho como sistema modélico. Se inyectaron fagos en la vena de la cola de ratones con cáncer, y la dirección se evaluó mediante la recuperación de fagos de homogenados de tejido. El fago CPKVCPRECESNC (SEQ ID NO:127) tuvo un enriquecimiento multiplicado por 4 en xenoinjertos tumorales en comparación con el tejido del cerebro, que se usó como control (FIG. 22). Los fagos sin inserción no se dirigieron a los tumores (FIG. 22). Ni los fagos CYNLCIRECESICGADGACWTWCADGCSRSC (SEQ ID NO:125) ni CLGQCASICVNDC (SEQ ID NO:126 mostraron ninguna preferencia sobre una dirección al tumo (datos no mostrados).

La dirección de CPKVCPRECESNC (SEQ ID NO:127) se confirmó mediante inmunotinción anti-M13 sobre secciones del tejido (no se muestran). Una fuerte tinción fágica se observó en vasculatura tumoral pero no en vasculatura normal (no mostrada). Los fagos sin inserciones no se unieron a vasos tumorales. CPRECESIC (SEQ ID NO:123) es un inhibidor específico de actividad APA

Para investigar el efecto de CPRECESIC (SEQ ID NO:123) en la actividad de la enzima APA, se incubaron células SK-RC49/APA con un sustrato específico de APA α-glutamil-p-nitroanilina en presencia de concentraciones crecientes de los péptidos CPRECESIC (SEQ ID NO:123) o del control GACVRLSACGA (SEQ ID NO:124). La actividad enzimática se evaluó con un ensayo colorimétrico tras 2 h de incubación a 37ºC. CPRECESIC (SEQ ID NO:123) inhibió la actividad enzimática de APA, con una reducción del 60% en la concentración más alta testada (FIG. 23). El IC50 de CPRECESIC (SEQ ID NO:123) para la inhibición de enzima se calculó para que fuera 800 µM. CPRECESIC (SEQ ID NO:123) no afectó a la actividad de una proteasa muy relacionada, aminopeptidasa N (datos no mostrados). CPRECESIC (SEQ ID NO:123) inhibe la migración y proliferaciónde células endoteliales.

Se determinó el potencial uso del péptido CPRECESIC (SEQ ID NO:123) como fármaco anti-angiogénico. En primer lugar, se examinó el efecto de inhibición APA por el péptido CPRECESIC (SEQ ID NO:123 in vitro en la migración y proliferación de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) estimulado con VEGF-A (10 ng/ml). La presencia de APA funcional en HUVECs se evaluó mediante un ensayo enzimático (no mostrado). En la concentración más alta testada (1mM), el péptido CPRECESIC (SEQ ID NO:123) inhibió quimiotaxis de HUVECs en un 70% en un ensayo con cámara Boyden (FIG. 24). Concentraciones más bajas de péptido CPRECESIC (SEQ ID NO:123) o el péptido de control GACVRLSACGA (SEQ ID NO:124) no tuvieron ningún efecto significativo en la migración o proliferación celular (no mostrada).

CPRECESIC (SEQ ID NO:123) inhibe angiogénesis in vitro e in vivo

Se examinó el efecto inhibidor del péptido CPRECESIC (SEQ ID NO:123) en diferentes modelos in vitro e in vivo de angiogénesis. HUVECs emplatadas en gel de matriz tridimensional se distinguieron en la estructura de tipo capilar, proporcionando un modelo in vitro para angiogénesis. Las concentraciones crecientes de péptido CPRECESIC (SEQ ID NO:123) dieron como resultado una progresiva incapacidad para la formación de esta red (no mostrada). En una concentración peptídica de 1 mM, las estructuras ramificantes de tipo vaso fueron significativamente menos y más cortas, y como resultado, no pudieron formar una organización organizada en red (no mostrada). El péptido de control GACVRLSACGA (SEQ ID NO:124) no afectó a la morfogénesis de HUVEC (no se muestra).

Un modelo comúnmente usado de angiogénesis amplificada in vivo es la membrana corioalantoidea de pollo (CAM), en la que la neovascularización puede estimularse durante el desarrollo embriónico. Un estímulo apropiado, adsorbido en una esponja de gelatina, induce el reclutamiento de microvasos hacia la propia esponja, acompañado de una remodelación y ramificación de los nuevos capilares. CAMs de huevo de pollo de ocho días de edad se estimularon solamente con VEGF-A (20 ng) o con VEGF-A más los péptidos CPRECESIC (SEQ ID NO:123) o GACVRLSACGA (SEQ ID NO:124) (1 mM). Los CAMs se fotografiaron el día 12. La neovascularización inducida por VEGF-A fue inhibida por CPRECESIC (SEQ ID NO:123) en un 40% en base al número de capilares emergentes de la esponja (Tabla 13). Los nuevos vasos no mostraron las estructuras capilares altamente ramificadas vistas tras la estimulación de VEGF-A (no se muestra). El tratamiento con el péptido de control GACVRLSACGA (SEQ ID NO:124) o con menores concentraciones peptídicas de CPRECESIC (SEQ ID NO:123) no tuvieron ningún efecto sobre el número de vasos crecientes (no se muestran).

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Ratones deficientes de APA muestran neovascularización dañada

La habilidad de ratones sin tratamiento APA+/-y APA-/-para sufrir neovascularización se examinó en un modelo de retinopatía hipóxica en ratones prematuros. La inducción de neovascularización retiniana mediante hipoxia relativa ya estuvo presente en ratones APA+/-en comparación con ratones de tipo salvaje (no mostrados). La neovascularización se cuantificó contando núcleos neovasculares salientes vítreos a partir de 20 secciones de ojos hipóxicos. Se observó una significativa inducción de neovascularización retiniana

(16.17 ± 1.19 núcleos vasculares/sección ocular) en ratones de tipo salvaje el día postnatal (P17) después de un tratamiento con 75% oxígeno de P7 a P12. Se observaron cantidades decrecientes de núcleos neovasculares en las retinas de APA+/-(10.76 ± 1.03 núcleos vasculares/sección ocular) y ratones nulos APA (4.25 ± 0.45 núcleos vasculares/sección ocular) el P17 tras exposición a oxígeno 75% desde P7 a P12.

Discusión

In vivo, APA se sobreexpresa mediante microvasos activados, incluyendo aquellos en tumores, pero apenas es detectables en vasculatura inactiva, haciendo que sea un objetivo adecuado para terapia tumoral dirigida a vasos. El ejemplo presente identificó un nuevo ligando peptídico dirigido para APA, CPRECESIC (SEQ ID NO:123). El péptido soluble CPRECESIC (SEQ ID NO:123) inhibió la actividad enzimática con un IC50 de 800 µM.

Usando HUVECs cultivadas como un modelo in vitro de angiogénesis, el péptido soluble CPRECESIC (SEQ ID NO:123) inhibió la migración y proliferación de HUVECs inducida por VEGF

A. Estos datos son consistentes con un requisito para la migración y proliferación de células endoteliales durante angiogénesis. CPRECESIC (SEQ ID NO:123) también bloqueó la formación de estructuras de tipo capilar en un modelo Matrigel e inhibió angiogénesis en CAMs estimulados con VEGF-A.

APA demostró jugar un papel importante en la neovascularización inducida por hipoxia relativa, ya que ratones APA invalidados tuvieron una neovascularización retiniana significativamente baja en comparación con ratones wt. Estos resultados dan más fuerza al potencial de usar APA como un objetivo específico para la inhibición de angiogénesis tumoral.

En resumen, el péptido soluble CPRECESIC (SEQ ID NO:123) es un ligando e inhibidor APA selectivo. La inhibición de APA por parte de CPRECESIC (SEQ ID NO:123) llevó a la inhibición de angiogénesis en diferentes ensayos in vitro e in vivo, lo que demuestra por primera vez el destacado papel de APA en el proceso angiogénico. Además, los fagos que se unen a APA pueden dirigirse a vasos sanguíneos tumorales, lo que sugiere posibles usos terapéuticos de CPRECESIC (SEQ ID NO:123) como inhibidor de neovascularización tumoral. El análogo endógeno de CPRECESIC (SEQ ID NO:123) puede identificarse con un anticuerpo basándose en métodos de purificación o identificación, similares a los descritos con anterioridad. Ejemplo 9. Selección de Bibliotecas Fágicas con PALM

En ciertas realización, es deseable ser capaz de seleccionar tipos celulares específicos de una muestra heteróloga de un órgano

o tejido. Un método para realizar dicho muestreo selectivo es PALM (Posicionamiento y Ablación con Microhaces de Láser).

El Robot-MicroBeam de PALM usa un láser preciso y guiado por ordenador para microablación. Un láser pulsado ultravioleta (UV) se conecta a un microscopio y se enfoca a través de un objetivo hasta conseguir un tamaño de haz o menos de 1 micrómetro de diámetro. El principio del corte con láser es un proceso de fotodescomposición ablativa localmente restringida sin calor (Hendrix, 1999). La energía efectiva de láser se concentra solamente en la diminuta área focal y la mayoría de los objetos biológicos son transparentes para las longitudes de onda del láser aplicado. Este sistema parece ser la herramienta adecuada para la recuperación de fagos. Las muestras de tejido pueden recuperarse circuncidando una zona seleccionada o una única célula tras la administración de fagos al paciente. Normalmente se obtiene un claro hueco de corte entre el área seleccionada y el área no seleccionada. El espécimen de tejido aislado puede expulsarse del plano del objeto y catapultarse directamente a la tapa de un tubo de microfuga común de una manera en la que no haya ningún contacto. Lo esencial para este método llamado Catapultado por Presión de Láser (LPC) se cree que es la fuerza de la presión de láser que se desarrolla bajo el espécimen, causada por la densidad extremadamente alta del fotón de microhaz de láser enfocado con precisión. Esta técnica de cosecha de tejidos permite que el fago sobreviva al proceso de microdisección y pueda ser rescatado.

En el presente ejemplo PALM se usó para seleccionar fagos dirigidos para tejido pancreático de ratón, tal y como se describe a continuación. Materiales y Métodos Selección in vivo e in situ

Una biblioteca de fagos peptídicos CX7C (109 TU) se inyectó a la vena de de la cola de un ratón macho C57BL/6, y el páncreas se cosechó para recuperar los fagos mediante infección bacteriana. Los fagos de 246 colonias crecieron por separado en 5 mls LB/kanamicina (100 µg)/tetraciclina (40 µg/ml) a 37ºC en la oscuridad con agitación. Durante la noche los cultivos se unieron y los fagos se purificaron con precipitación de NaCl/PEG para otra serie de bioselección in vivo. Se recogieron trescientas colinas para la segunda serie de selección, y los fagos se recuperaron con precipitación. Los fagos de la segunda serie de bio-selección se usaron posteriormente para otra serie de selección in vivo y también se incubaron con secciones pancreáticas descongelada y congeladas de ratones para una serie de criba in situ.

Para la tercera serie de criba in vivo, 109 TU fagos se inyectaron en un tercer ratón y se dejaron circular durante seis minutos, a lo que siguió una inyección intravenosa de 50 µl de FTIClectina (Laboratorios Vector, Inc.). Tras dos minutos de circulación, el ratón fue sometido a perfusión por el ventrículo izquierdo con 3 mls MEM con sales de Earle. El páncreas se cosechó, se congeló a 80ºC en Tejido Tek (Sakura) y se seccionó en portaobjetos preparados.

Para la tercera serie in situ, los fagos purificados, aislados de la segunda serie, se incubaron con 4-14 µm secciones pancreáticas descongeladas de ratón en hielo durante 30 minutos. Las secciones se aclararon con 100 µl PBS helado 8x a temperatura ambiente (TA). Los fagos unidos se recuperaron de cada sección añadiendo 100 µl K91 KanR (OD600=2.03) para infectar a TA durante 30-60 minutos. K91 KanR infectados se retiraron de cda sección y se recuperaron en 10 mls LB/Kan/Tet (0.2 µg/ml) durante 20 minutos en la oscuridad. Las alícuotas de cada cultivo se emplataron en placas LB/Kan/Tet (40 µg/ml) y se incubaron durante la noche en oscuridad a 37ºC. La concentración de tetraciclina del resto de cada cultivo aumentó hasta 40 µg/ml y los cultivos se incubaron durante la noche a 37ºC con agitación para amplificación y purificación de fagos. Amplificación de ADN

Los fagos se recuperaron de islotes pancreáticos de ratones teñidos con FITC-lectina criopreservados y de las células acinares de alrededor que se habían microdiseccionado de secciones de 14 µm usando el sistema de catapultado por presión de láser frío de PALM (Posicionamiento y Ablación con Microhaces de Láser). El islote pancreático y las secciones de control fueron catapultadas en 1 mM EDTA, pH 8 y se congelaron a -20ºC hasta que se recogió suficiente material para amplificación PCR. El ADN fágico se amplificó con cebadores fUSE5: cebador sentido 5’ TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AAG CTG ATA AAC CGA TAC AATT 3’ (SEQ ID NO: 132), cebador antisentido 5’ CCC TCA TAG TTA GCG TAA CGA TCT 3’ (SEQ ID NO:133). Los productos PCR fueron sometidos a otra serie de PCR usando un conjunto anidado de cebadores. El extremo 3’ del segundo cebador establecido disminuyó con el cebador antisentido M13 con fines secuenciales. El conjunto de cebador anidado usado fue: cebador anidado sentido 5’ CCTTTCTATTCTCACTCGGCCG 3’ (SEQ ID NO:134), cebador anidado antisentido 5’ CAGGAAACAGCTATGACCGCTAAACAACTTTCAACAGTTTCGGC 3’ (SEQ ID NO:135). Para genera la secuencia de inserción peptídica que contiene puntos de restricción flanqueantes SfiI, se usaron dos cebadores más: cebador de biblioteca sentido 5’ CACTCGGCCGACGGGGC 3’ (SEQ ID NO:136), cebador antisentido 5’ CAGTTTCGGCCCCAGCGGCCC 3’ (SEQ ID NO:137). Los productos PCR generados de los cebadores anidados se purificaron con gel (Qiagen) y se confirmó la presencia de una secuencia de inserción peptídica CX7C que usa el cebador antisentido M13 mediante secuenciación automatizada. Los productos PCR generados de los cebadores de la biblioteca se purificaron con gel (Qiagen), se ligaron a fUSE5/SfiI purificado con CsCl2, se sometieron a electroporación en células MC1061 electrocompetentes y se emplataron en placas de agar con LB/estreptomicina (100 µg/ml)/tetraciclina (40 µg/ml). Las colonias solas se sometieron a PCR de colonia usando los cebadores fUSE5 para verificar la presencia de una secuencia de inserción CX7C a través de electroforesis de gel. Los clones positivos de secuenciaron usando terminadores BigDye (Perkin Elmer).

Infección Fágica

El islote pancreático y las secciones de control se catapultaron en 1 mM AEBSF, 20 µg/ml aprotinina, 10 µg/ml leupeptina, 1 mM inhibidor de elastasa I, 0.1 mM TPCK, 1 mM pepstatina A en PBS, pH 7.4 y se congelaron durante 48 horas o menos hasta que se recogió suficiente material. Las secciones se descongelaron en hielo y el volumen se ajustó a 200 µl con PbS, pH 7.4. Las muestras se incubaron con 1 ml K91 KanR (OD=0.22) durante dos horas a TA en un Nutator. Cada cultivo se transfectó a 1.2 mls LB/Kan/Tet (0.2

µg/ml) y se incubó en la oscuridad a TA durante 40 minutos. La concentración de tetraciclina aumento a 40 µg/ml paracadacultivo,y los cultivos se incubaron durante la noche a 37ºC con agitación. Cada cultivo se emplató al día siguiente en palcas agar LB/Kan/Tety

5 se incubaron durante 14 horas a 37ºC en la oscuridad. Los clones positivos se recogieron para PCR de colonia y secuenciación automatizado.

Resultados

El esquema general para criba in vivo usando PALM se ilustra

10 en la FIG. 26. Tras una serie inicial de selección in vivo, los fagos se amplificaron en grandes cantidades y también colonias sencillas de fagos de páncreas, riñón, pulmón y glándulas adrenales se amplificaron y fueron sometidas a series adicionales de selección in vivo. Tanto los fagos de páncreas de ratones amplificados en

15 grandes cantidades o por colonias mostraron un sucesivo enriquecimiento a medida que aumentaban las series de selección (no se muestra). Tras tres series de selección, losfagosamplificados por colonias mostraron casi un orden de enriquecimiento de mayor magnitud que los fagos amplificados en grandes cantidades (no se

20 muestra). La Tabla 14 lista secuencias dirigidas seleccionadas ymotivos de consenso identificados por la selección pancreática. Tabla 14. Péptidos Dirigidos y Motivos Pancreáticos

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FIG. 27 muestra un protocolo general para la recuperación de secuencias de inserción en fagos de PALM que selecciona materiales de sección fina. Tal y como se indica, los fagos pueden recuperarse mediante infección directa de bacteria huésped E. coli, tras digestión de proteasa de la muestra de sección fina. Como alternativa, las inserciones fágicas pueden recuperarse mediante amplificación PCR y clonarse a un nueva vector ADN, para a continuación someterse a electroforación o sino transformarse en bacteria de huésped para clonación.

Ambos métodos de PALM para recuperar fagos funcionaron muy bien en la recuperación de secuencias dirigidas pancreática. Las secuencias pancreáticas recuperadas mediante infección bacteriana directa incluyeron (SEQ ID NO:195), CRARGWLLC (SEQ ID NO:196), CVSNPRWKC (SEQ ID NO:197), CGGVHALRC (SEQ ID NO:175), CFNRTWIGC (SEQ ID NO:198) y CSRGPAWGC (SEQ ID NO:199). Secuencias dirigidas pancreáticas recuperadas mediante amplificación de inserciones de fagos y clonación a fagos incluyen CWSRGQGGC (SEQ ID NO:200), CHVLWSTRC (SEQ ID NO:201), CLGLLMAGC (SEQ ID NO:202), CMSSPGVAC (SEQ ID NO:203), CLASGMDAC (SEQ ID NO:204), CHDERTGRC (SEQ ID NO:205), CAHHALMEC (SEQ ID NO:206), CMQGAATSC (SEQ ID NO:207), CMQGARTSC (SEQ ID NO:208) y CVRDLLTGC (SEQ ID NO:209).

Desde la FIG. 28 a la FIG. 31 se muestran homologías secuenciales identificadas para secuencias seleccionadas dirigidas al páncreas. Se identificaron varias proteínas conocidas por estar presentes en tejidos pancreáticos. Los resultados de este ejemplo muestran que el método PALM puede usarse para seleccionar tipos de células a partir de secciones finas de tejidos y recuperar secuencias de fagos dirigidos. El experto en la técnica observará que este método podría usarse virtualmente con cualquier tejido para obtener secuencias dirigidas a tipos específicos de células en órganos o tejidos heterólogos.

Todas las COMPOSICIONES, MÉTODOS Y APARATOS aquí descritos y reivindicados pueden hacerse y ejecutarse sin demasiada experimentación a la luz de la presente descripción. Mientras que las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de realizaciones preferentes, para los expertos en la técnica resultará evidente el hecho de que pueden realizarse variaciones a las COMPOSICIONES, MÉTODOS Y APARATOS y en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos aquí descritos. Más en concreto, está claro que ciertos agentes que están tanto químicamente como fisiológicamente relacionados pueden sustituirse por agentes aquí descritos mientras que se podrían conseguir resultados iguales o similares. Se considera que dichos sustituyentes y modificaciones aparentes para aquellos expertos en la técnica están definidos por las reivindicaciones adjuntas. REFERENCIAS

Las siguientes referencias se listan a continuación hasta el alcance de que proporcionen detalles sobre el procedimiento ejemplar y otros detalles complementarios a los aquí establecidos. Any-Apte B, Pepper MS, Voest E, Montesano R, Olsen B, Murphy G, Apte SS y Zetter B. Inhibición de angiogénesis mediante inhibidor de tejido metaloproteinasa-3. Invest. Opthamol. Vis. Sci.38: 817-823, 1997. Arap W, Pasqualini R, y Ruoslahti E. Quimioterapia dirigida a vasculatura tumoral. Curr. Opin. Oncol., 1998b. Arap, W., Pasqualini R., y Ruoslahti, E. Tratamiento de cáncer con envío de fármacos dirigidos a vasculatura tumoral. Science 279:377380, 1998a. Arap, W., Pasqualini, R. & Ruoslahti, E. Quimioterapia dirigida a vasculatura tumoral. Curr Opin Oncol 10, 560-565 (1998).

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2001-09-07

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<223> Unidentified amino acid

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<223> Unidentified amino acid

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Claims (1)

1ª. – Un péptido aislado de un tamaño de 100 aminoácidos o menos que comprende una secuencia dirigida al tejido adiposo seleccionada de las secuencias SEQ ID NO: 47 a la SEQ ID NO: 55.

2ª. – El péptido aislado de la reivindicación 1, donde dicho péptido tiene un tamaño de 50 aminoácidos o menos.

3ª. – El péptido aislado de la reivindicación 1, donde dicho péptido tiene un tamaño de 25 aminoácidos o menos.

4ª. – El péptido aislado de la reivindicación 1, donde dicho péptido tiene un tamaño de 10 aminoácidos o menos.

5ª. – El péptido aislado de la reivindicación 1, donde dicho péptido tiene un tamaño de 7 aminoácidos o menos.

6ª. – El péptido aislado de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho péptido se une a una molécula.

7ª. – El péptido aislado de la reivindicación 6, donde dicha molécula es un fármaco, un agente quimioterapéutico, un radioisótopo, un agente pro-apoptosis, un agente antiangiogénico, una hormona, una citoquina, un factor de crecimiento, un agente citotóxico, un péptido, una proteína, un antibiótico, un anticuerpo, un fragmento Fab de un anticuerpo, un agente visualizador, un factor de supervivencia, un agente anti-apoptótico, un antagonista de hormona

o un antígeno.

8ª. – El péptido aislado de la reivindicación 7, donde dicho agente pro-apoptosis es gramicidina, magainina, mellitina, defensina, cecropina, (KLAKLAK)2, (SEQ ID NO: 1), (KLAKKLA)2 (SEQ ID NO: 2), (KAAKKAA)2 (SEQ ID NO: 3) o (KLGKKLG)3 (SEQ ID NO: 4).

9ª. – El péptido aislado de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho péptido se une a un complejo macromolecular.

10ª. – El péptido aislado de la reivindicación 9, donde dicho complejo es un virus, un bacteriófago, una bacteria, un liposoma, una micropartícula, una gota magnética, una célula de levadura, una célula de mamífero o una célula.

11ª. -El péptido aislado de la reivindicación 9, donde dicho péptido se une a un vector de expresión eucariótica. 12ª. – El péptido aislado de la reivindicación 11, donde dicho

vector es un vector de terapia genética.

13ª. – Un anticuerpo que se enlaza de manera selectiva con un péptido aislado, consistiendo el péptido en una secuencia dirigida al tejido adiposo seleccionada de las secuencias SEQ ID NO: 47 a

5 SEQ ID NO: 55.

14ª. – Un vector de terapia genética, donde el vector expresa una secuencia de péptido diana como parte de una proteína superficial, consistiendo el péptido diana en una secuencia dirigida al tejido adiposo seleccionada de las secuencias SEQ ID NO: 47 a

10 SEQ ID NO: 55. 15ª.-Uso de un agente en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad, donde el agente se une a un péptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 para formar un complejo para focalizar el envío hacia el tejido

15 adiposo. 16ª. – Uso de acuerdo con la reivindicación 15 donde el agente es un agente visualizador, un fármaco, un agente quimioterapéutico, un radioisótopo, un agente pro-apoptosis, un agente antiangiogénico, una enzima, una hormona, una citoquina, un factor de crecimiento,

20 un agente citotóxico, un péptido, una proteína, un antibiótico, un anticuerpo, un fragmento Fab de un anticuerpo, un antígeno, un factor de supervivencia, un agente anti-apoptótico, un antagonista de hormona, un virus, un bacteriófago, una bacteria, un liposoma, una micropartícula, una gota magnética, un microdispositivo, una célula

25 de levadura, una célula de mamífero, una célula o un vector de expresión. 17ª. – Uso de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicho agente pro-apoptosis es gramicidina, magainina, mellitina, defensina, cecropina, (KLAKLAK)2, (SEQ ID NO: 1), (KLAKKLA)2 (SEQ ID NO:

30 2), (KAAKKAA)2 (SEQ ID NO: 3) o (KLGKKLG)3 (SEQ ID NO: 4).

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