ES2352634B1

ES2352634B1 - Hidrogeles basados en poloxameros con estructura de estrella para liberacion controlada de sustancias activas

Info

Publication number: ES2352634B1
Application number: ES200930587A
Authority: ES
Inventors: Francisco Jesus Parra Ruiz; Julio San Roman Del Barrio; Lucena Rodriguez Alonso; Maria Del Rocio Herrero Vanrell; Blanca Vazquez Lasa
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Complutense de Madrid
Current assignee: Universidad Complutense de Madrid
Priority date: 2009-08-10
Filing date: 2009-08-10
Publication date: 2011-12-30
Anticipated expiration: 2029-08-10
Also published as: WO2011018541A3; WO2011018541A2; ES2352634A1

Abstract

Hidrogeles basados en poloxámeros con estructura de estrella para liberación controlada de sustancias activas.#La presente invención describe una serie de compuestos basa. La presente invención describe un compuesto basado en poloxámeros y un hidrogel que comprende estos compuestos, así como el uso de estos hidrogeles como vehículos para la administración de sustancias activas o como adyuvantes en composiciones farmacéuticas, especialmente en las que se administran por vía tópica ocular.

Description

Hidrogeles basados en poloxámeros con estructura de estrella para liberación controlada de sustancias activas.

La presente invención describe un compuesto basado en poloxámeros y un hidrogel que comprende estos compuestos, así como el uso de estos hidrogeles como vehículos para la administración de sustancias activas o como adyuvantes en composiciones farmacéuticas, especialmente en las que se administran por vía tópica ocular.

Estado de la técnica anterior

Los sistemas poliméricos sensibles a estímulos son aquellos que presentan un cambio intenso en sus propiedades como respuesta a un cambio ligero en las condiciones del medio. Entre estos sistemas, los que responden a cambios en la temperatura del medio (también llamados termosensibles) son unos de los más interesantes desde un punto de vista biomédico. Los sistemas lineales y solubles en el medio acuoso responden al cambio de T pasando de un estado monofásico, en el que el polímero es soluble, a un estado bifásico o de precipitación, teniendo lugar la transición denominada sol-gel. Dentro de este grupo se encuentran aquellos sistemas que poseen propiedades anﬁfílicas, siendo los más representativos los sistemas a base de poloxámeros, que son copolímeros de bloque que alternan secuencias hidróﬁlas e hidrófobas. Los copolímeros de bloque basados en secuencias de polióxido de etileno (también denominado polietilenglicol, (PEG)) y polióxido de propileno (también denominado polipropilenglicol (PPG)) constituyen una familia que se comercializa con los nombres de Pluronics® o Poloxamers® y Tetronics® (BASF), estando algunos de ellos aprobados por la FDA (Food and Drug Administration) y la EPA (Environmental Protection Agency) para aplicaciones como sistemas de liberación de fármacos e ingeniería de tejidos. Estos sistemas presentan una transición sol-gel alrededor de los 50ºC y son termorreversibles. Se caracterizan por formar disoluciones micelares en agua en un intervalo amplio de temperatura, y al llegar a la temperatura de transición, ciertos cambios en las propiedades micelares provocan la agregación del polímero y la consiguiente precipitación. La temperatura de transición varía fundamentalmente con la composición del copolímero y la concentración. Por ejemplo, el Pluronic F127 forma geles a 37ºC a una concentración de 20%-p del polímero. La transición sol-gel de los Pluronics los ha hecho muy atractivos para ser utilizados como vehículos inyectables para la liberación controlada de sustancias activas.

El Poloxamer® 407, que es un copolímero tribloque de PEG/PPG/PEG, ha sido el más utilizado en este tipo de aplicación, siendo ensayado para la liberación de proteínas y factores de crecimiento y mostrando perﬁles de liberación sostenida durante varias horas (Jeong B, Kim SW, Bae YH. Thermosensitive sol-gel reversible hydrogels. Adv. Drug Deliv Rev. 2002; 54: 37-51). Otros sistemas termorreversibles incorporan, además, bloques biodegradables. Tal es el caso de los copolímeros tribloque de PEG-PLLA-PEG y dibloque PEG-PLLA que incorporan poli(ácido L-láctico) (PLLA) así como los copolímeros dibloque de PEG-PLGA (poli(ácido láctico-glicólico) y tribloque PEG-PLGA-PEG, que incorporan PLGA, y que presentan transiciones sol-gel en disoluciones acuosas alrededor de 30ºC, dando lugar a geles con bastante integridad estructural y resistencia mecánica (Jeong B, Bae YH, Kim SW. In situ gelation of PEGPLGA-PEG triblock copolymer aqueous solutions and degradation thereof. J. Biomed. Mater. Res. 2000; 50; 171-177). Estos sistemas también se han evaluado para liberación de fármacos de carácter hidróﬁlo e hidrófobo, con períodos de liberación que van desde 2 semanas a 2 meses (Jeong B, Bae YH, Kim SW. Drug release from biodegradable injectable thermosensitive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers. J Control. Release 2000; 63: 155-163). Otros sistemas termosensibles son los basados en copolímeros de injerto biodegradables de PEG-g-PLGA y PLGA-g-PEG y que forman geles a 37ºC. Los poloxámeros de última generación conocidos como Tetronics®, poseen una estructura tipo estrella con un núcleo central de etilén diamina del que parten cuatro ramas formadas por bloquesde PPG-PEG (Álvarez-Lorenzo C, González-López J, Fernández-Tarrio M, Sánchez-Macho I, Concheiro A. Tetronic micellization, gelation and drug solubilization: Inﬂuence of pH and ionic strength. Eur. J Pharm Biopharm 2007; 66: 244-252).

El poloxámero Tetronic® T1107 ha sido funcionalizado por reacción de los cuatro grupos hidroxilo terminales para formar acrilatos por un lado y grupos tioles por otro, y mediante reacción posterior entre ambos tipos de derivados se han obtenido hidrogeles entrecruzados, adecuados para ser utilizados en encapsulación celular (Cellesi F, Tirelli N, Hubbell JA. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and Chemicals cross-linking. Biomaterials 2004; 25: 5115-5124). Los Tetronics® de última generación, Tetronics® R, están formados por cuatro ramas de bloques PEG-PPG, siendo las secuencias terminales las de PPG, lo cuál les conﬁere unas características especíﬁcas en cuanto a la biodegradabilidad se reﬁere.

Por otra parte, dentro de los polímeros acrílicos lineales sensibles a la temperatura se encuentra la familia de las poli(acrilamidas N-sustituidas), siendo el miembro más representativo la poli(N,N-isopropil acrilamida) (PNIPAAm), con una temperatura crítica de disolución o LCST (del inglés, Lower Critical Solution Temperature) de 32ºC en agua (Zhang X, Zhuo R, Yang Y. Using mixed solvent to synthesize temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) gel with rapid dynamic properties. Biomaterials 2002; 26: 1313-1318). Por debajo de la LCST, el polímero es soluble en agua debido al predominio de las interacciones hidróﬁlas por puentes de hidrógeno con el agua, mientras que por encima de la LCST, se produce la separación de fases, también llamada punto nube, como consecuencia de un cambio en las interacciones hidróﬁlas, y adquiriendo preponderancia las interacciones hidrófobas. A partir de estos polímeros se han preparado hidrogeles por entrecruzamiento de los mismos. En estos sistemas entrecruzados, pequeños cambios en la temperatura próximos a la temperatura crítica provocan que las cadenas del polímero se colapsen o se expandan debido a una nueva organización de las interacciones entre las macromoléculas y el medio acuoso, resultando en cambios en los valores de hinchamiento del sistema. Ciertos valores como el de la temperatura crítica, las velocidades de hinchamiento y contracción así como las velocidades de liberación de sustancias activas a partir de estos hidrogeles se puede modular mediante introducción de otros monómeros, sean más hidróﬁlos o más hidrófobos (Kaneko Y, Nakamura S, Sakai K et al. Rapid swelling response of Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels by the formation of water release channels using poly(ethylene oxide) grafts chains. Macromolecules 1998; 31: 6099-6105) o mediante la obtención de estructuras moleculares más complejas, por ejemplo estructuras tipo peine (Uchida K, Keneko Y, Sakai K et al. Comb-like grafted hydrogels with rapid deswelling response to temperature changes. Nature 1995;

374: 240-242). Los polímeros con LCST se han ensayado como sistemas de liberación de sustancias activas dando perﬁles de liberación on-off como respuesta a pequeños cambios de temperatura en forma de pulsos. Por ejemplo, los terpolímeros de NIPAAm, acrilamida y metacrilato de butilo, con una LCST muy cercana a la temperatura ﬁsiológica, han resultado adecuados para la liberación de indometacina (Yoshida R, Sakai K, Okano T, Sakurai Y. Modulating the phase transition and the thermosensitivity in N-isopropylacrylamide copolymer gels. J Biomater Sci Polym Ed 1994;

75: 55-67).

Descripción de la invención

La presente invención describe compuestos de carácter monomérico derivados de poloxámeros con estructura de estrella de tres ramas, hidrogeles que comprenden estos compuestos, así como uso de estos hidrogeles en forma de micro o nanopartículas como sistemas de liberación controlada de sustancias activas, particularmente adecuados en oftalmología para administración tópica.

En un primer aspecto, la presente invención se reﬁere a un compuesto de fórmula (I):

donde:

-: PEG representa un grupo polietilenglicol y PPG un grupo polipropilenglicol

-: R1 se selecciona entre hidrógeno o alquilo C1-C6,

-: n tiene un valor entre2y10,

-: m tiene un valor entre 5 y 50.

El término poloxámeros en la presente invención se reﬁere a copolímeros de bloque no iónicos compuestos de tres ramas cada una de ellas formada por un bloque hidrófobo central de polióxido de propileno (o polipropilenglicol) y un bloque hidróﬁlo exterior de polióxido de etileno (o polietilenglicol).

El término “alquilo” se reﬁere, en la presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramiﬁcadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 6 átomos de carbono. Más preferiblemente metilo, etilo, propilo o butilo. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, ácido carboxílico, amino, amido, éster carboxílico. Cuando el grupo alquilo está sustituido, lo está preferentemente por un o varios grupos amina, amida o éter, que a su vez pueden estar o no sustituidos por grupos alquilo, amida, cicloalquilo o éteres y estos a su vez, pueden estar igualmente sustituidos o no.

En una realización preferida, en el compuesto de fórmula (I): -R1 es un grupo metilo, -n tiene un valor entre4y8, -m tiene un valor entre 20 y 30.

En una realización más preferida, en el compuesto de fórmula (I): -n tiene un valor de 5, -m tiene un valor de 25.

En otro aspecto, la presente invención se reﬁere a un procedimiento de obtención del compuesto descrito anteriormente, que comprende las siguientes etapas: i) disolver un poloxámero y un exceso de trietilamina en diclorometano, ii) adicionar a la disolución de la etapa (i) una disolución de cloruro de acriloílo en diclorometano

Una forma preferida de realizar este procedimiento es a temperatura ambiente y con agitación. En estas condiciones se dejar reaccionar durante 24-120 horas. La puriﬁcación del producto obtenido puede realizar mediante distintas técnicas conocidas, resultando preferible mediante una cromatografía de columna sobre gel de sílice.

En otro aspecto, la presente invención se reﬁere a un hidrogel que comprende el compuesto de fórmula (I) descrito anteriormente y un monómero acrílico hidróﬁlo.

El término hidrogeles en la presente invención se reﬁere a sustancias en estado coloidal con apariencia sólida. Una de las propiedades de los hidrogeles es la de hincharse y aumentar de volumen por absorción de agua y sustancias en ella disueltas, propiedad común a todos los tejidos de los organismos formados por materias coloidales.

Por monómeros acrílicos de carácter hidróﬁlo se entiende en la presente invención, monómeros con grupos hidroxilo tales como el metacrilato de 2-hidroxietilo, metacrilato de 2-hidroxipropilo, etc., que tienen aﬁnidad por el agua. En una disolución o coloide, estos monómeros hidróﬁlos tienden a acercarse y mantener contacto con el agua a través de puentes de hidrógeno.

En una realización preferida, el monómero acrílico hiodróﬁlo que comprende el hidrogel se representa por la Fórmula (II):

donde: -R2 es un alquilo C1-C6, -R3 se selecciona entre H o -OH, -q tiene un valor entre0y4.

Más preferiblemente:

-: R2 es un alquilo C1-C4,

-: R3esH

-: q tiene un valor entre0y2.

Aun más preferiblemente:

-: R2 es un grupo metilo,

-: q tiene un valor de 1.

Los monómeros acrílicos de carácter hidróﬁlo adecuados para su uso en la preparación del hidrogel de la invención comprenden α-alquil acrilatos de N-hidroxialquilo y cualquiera de sus combinaciones.

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere a un procedimiento de obtención del hidrogel de la invención que comprende una copolimerización de un compuesto de Fórmula (I) descrito en la invención, como primer monómero, con un monómero acrílico hidróﬁlo cualquiera de los anteriormente descritos, de Fórmula (II), como segundo monómero, en presencia de un iniciador radical.

Este se lleva a cabo disolviendo los correspondientes monómeros en dioxano y utilizando azobisisobutironitrilo (AIBN) como iniciador radical, a una temperatura de 50-60ºC, dejando reaccionar la mezcla un tiempo de 24-48 h.

En otro aspecto, la presente invención se reﬁere al uso del hidrogel descrito anteriormente como vehículo para la liberación controlada de sustancias activas. Preferiblemente dicha sustancia es un fármaco.

Un último aspecto de la presente invención se reﬁere al uso del hidrogel descrito anteriormente como adyuvante en una composición farmacéutica. Preferiblemente, dicha composición farmacéutica se administra por vía tópica ocular.

Los hidrogeles obtenidos se caracterizan por tener las siguientes propiedades:

-: Son sistemas termosensibles que presentan una temperatura crítica mínima de transición o LCST en el intervalo de 30-35ºC, es decir, en el intervalo de temperatura de la córnea.

-: Son sistemas que sufren una lenta degradación hidrolítica en el medio ﬁsiológico debido principalmente a la hidrólisis de los grupos éster carboxílicos de la cadena principal.

-: Son sistemas que presentan propiedades bioadhesivas, muy interesantes para su administración por vía tópica.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Los expertos en la materia valorarán que la presente invención pueda realizarse dentro de un amplio margen de parámetros, concentraciones y condiciones equivalentes sin alejarse del espíritu y del alcance de la invención y sin experimentaciones indebidas. Si bien esta invención se ha descrito en relación con dichos modos de realización, se entiende que puede ser objeto de modiﬁcaciones adicionales. Este documento pretende abarcar cualquier variante, uso

o adaptación de la invención siguiendo los principios generales de la misma e incluyendo las variantes procedentes de la presente divulgación, tal como lo disponen las prácticas conocidas o consuetudinarias del sector técnico al cual pertenece la invención.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan como guía adicional para el experto medio en la materia y en ningún caso deben considerarse como una limitación de la invención.

Ejemplo 1

Síntesis del derivado metacrílico del poloxámero Bayﬁt®10WF15

El poloxámero utilizado ha sido un producto comercial de nombre Bayﬁt®10WF15 suministrado por Bayer. Este producto se ha caracterizado por resonancia magnética nuclear (RMN) mediante análisis de los espectros de protón (1H-RMN) y carbono (13C-RMN), así como experimentos bidimensionales de correlación protón-protón (COSY, NOESY) y de correlación protón-carbono (HSQC, HMBC). Los experimentos de RMN han sido realizados en equipos de 400 MHz (Varian Mercury-400 y Varian Inova-400) y de 500 MHz (Varian-500), utilizando TMS como referencia interna. Los experimentos de 13C han sido realizados a 100 ó 125 MHz. El análisis ha puesto de maniﬁesto que el poloxámero Bayﬁt®10WF15 por su naturaleza macromolecular contiene una mezcla de macromoléculas derivadas de la glicerina que contienen tres ramas, en su mayoría formadas por bloques de PPG25-PEG5 y, en una cierta proporción, por bloques de PPG25.

(1H-RMN, 500 MHz, CDCl3) δH: 3.64 (m, HO-CH2-(PEG)), 3.64-3.54 (m, -CH2-(PEG)), 3.38-3.54 (m, -CH(PPG), 3.38-3.54 (m, -CH2a-(PPG)), 3.20-3.33 (m, -CH2b-(PPG)), 1.10 (2xd, J=5,7 Hz, CH3-(PPG)).

(13C-RMN, 125 MHz, CDCl3) δC: 78.8, 76.9, 76.2, 76.1, 76.0, 75.9, 75.6, 75.5, 75.3, 75.2, 75.15, 75.0 74.8, 74.7, 74.6, 74.5, 74.2, 74.0, 73.9, 73.8, 73.5, 73.3, 73.14, 73.09, 73.05, 73.01, 72.7, 72.3, 71.6, 71.0, 70.9, 70.8, 70.7, 70.5, 68.8, 68.7, 61.8, 17.6, 17.5.

Para la preparación del metacrilato de Bayﬁt®10WF15, se introdujo el poloxámero Bayﬁt®10WF15 en un matraz de tres bocas y se disolvió en diclorometano a temperatura ambiente. Seguidamente, se adicionó trietilamina en exceso (150%) y se mantuvo agitación constante durante 30 min. Pasado este tiempo, se adicionó gota a gota y muy lentamente una cantidad equimolar, con relación a la base, de cloruro de metacriloilo disuelto en diclorometano durante un tiempo de 6 horas en atmósfera de nitrógeno. Finalizada la adición, se mantuvo la agitación y se dejó reaccionar la mezcla durante 5 días a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se ﬁltró para separar el clorhidrato de amina formado y la disolución orgánica se lavó con disoluciones de NaOH, NaHCO3 y NaCl al 5%. Finalmente, el bruto de reacción se aisló por evaporación del disolvente a presión reducida. El producto se puriﬁcó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice utilizando hexano/cloroformo 3/7 como fase móvil para separar el Bayﬁt®10WF15 sin reaccionar, y cloroformo/metanol 1/1 como fase móvil para aislar el macromonómero. El rendimiento de la reacción fue del 83%. El producto resultante se caracterizó por resonancia magnética nuclear (RMN) utilizando cloroformo deuterado (Cl3DC) (5% p/v) como disolvente y tetrametilsilano (TMS) como referencia interna. El análisis de los espectros de 1H-RMN y 13C-RMN, así como de los experimentos bidimensionales de correlación carbono-protón HSQC y HMBC, conﬁrmaron la incorporación de tres unidades metacrílicas a los ﬁnales de cadena.

(1H-RMN, 500 MHz, CDCl3) δH: 6.08 (sa, -C=CH2a), 5.52 (sa, -C=CH2b), 4.24 (m, -CH2-OC(O)-), 3.68 (m, -CH2-CH2-OC(O)-), 3.61-3.58 (m, -CH2-(PEG)), 3.56-3.40 (m, -CH-(PPG), -CH2a-(PPG)), 3.40-3.29 (m, -CH2b-(PPG)),

1.89 (s, =C(CH3)), 1.08 (s, CH3-(PPG)).

(13C-RMN), 125 MHz, CDCl3,) δC: 167.2, 136.0, 125.6, 75.4, 75.2, 75.1, 73.3, 73.2, 72.8, 72.7, 70.4, 63.2, 18.2, 17.3, 17.2.

Los pesos moleculares promedios en número (Mn) y en peso (Mw) del poloxámero Bayﬁt®10WF15 y del derivado metacrílico se determinaron por espectrometría de masas MALDI-TOF. Los experimentos se realizaron en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo con ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF) modelo Voyager-DE PRO (Applied Biosystems), ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) como matriz, con una concentración de 10 mg/ml en agua miliQ y un láser de N2 pulsado (λ = 217 nm, una anchura de pulso de 3 nm y una frecuencia de 3 Hz). Los valores obtenidos para el Bayﬁt®10WF15 fueron Mn = 4997, Mw = 5151, con un índice de polidispersidad (Mw/Mn) de 1.03. Los valores obtenidos para el macromonómero fueron Mn = 5221, Mw = 5391 y Mw/Mn = 1.03, que indican una ganancia en peso correspondiente a tres grupos metacrilatos con relación al peso molecular del poloxámero (Mn = 4997, Mw = 5151, Mw/Mn = 1.03). Así, el producto obtenido se correspondió con un macromonómero trimetacrílico, en adelante Mm, susceptible de polimerizar y participar en reacciones de copolimerización.

Ejemplo 2

Preparación de copolímeros a partir del macromonómero metacrilato de Bayﬁt®10WF15 y metacrilato de 2-hidroxietilo

Se prepararon copolímeros por reacción del macromonómero trimetacrílico del Bayﬁt®10WF15 (Mm) obtenido según se describe en el Ejemplo 1, y metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA) como monómero hidróﬁlo a partir de composiciones en la alimentación (%-p) HEMA:Mm de 99:1, 95:5 y 90:10.

La reacción de copolimerización se realizó en disolución de los monómeros en dioxano (1 M) y se utilizó azobisisobutironitrilo (AIBN) como iniciador radical en una concentración de 1.5 10−2 M. La disolución de los monómeros se desoxigenó mediante corriente de nitrógeno durante 15 min, aplicando agitación magnética y a temperatura ambiente. Seguidamente, se adicionó el iniciador y se mantuvo la agitación durante 30 min. Pasado este tiempo, la mezcla de reacción se introdujo en una estufa termostatizada a 60ºC y se dejó reaccionar durante 24 h sin agitación. Pasado este tiempo, se obtuvo un precipitado que se aisló por ﬁltración y se lavó sucesivamente con mezclas dioxanoagua. Finalmente, el precipitado se congeló y lioﬁlizó hasta pesada constante. Los copolímeros obtenidos a partir de alimentaciones HEMA:Mm (%-p) de 99:1 y 95:5 fueron polvos blancos solubles en disolventes orgánicos apróticos y próticos, mientras que el copolímero obtenido de una alimentación 90:10 fue sólo soluble en el disolvente prótico metanol. La solubilidad de los copolímeros se muestra en la Tabla I.

TABLA I

Composición de la alimentación y solubilidad de los copolímeros preparados

La estructura de los copolímeros se determinó por resonancia magnética nuclear (RMN). Para un copolímero obtenido a partir de una alimentación HEMA:Mm (%-p) de 95:5:

(1H-RMN 400 MHz, CD3OD) δH: 4.58 (s, -CH2-CH2-OH (HEMA)), 4.05 (sa, -CH2-CH2-OH (HEMA)), 3.79 (sa, -CH2-CH2-OH (HEMA)), 3.66-3.59 (m, -CH2-(PEG)), 3.53-3.47 (m, -CH-(PPG), -CH2a-(PPG)), 3.46-3.44 (m, -CH2b-(PPG)), 2.22-1.96 (m, -CH2 β -(HEMA), 1.13 (m, CH3-(PPG)), 1.13-0.95 (m, -CH3 α (HEMA)).

(13C-RMN 125 MHz, CD3OD) δC: 179.7, 179.5, 178.6 (-C(O)O-(HEMA)), 76.8, 76.7, 76.5 (-CH-(PPG)), 74.4,

74.1 (-CH2-(PPG)), 71.6 (-CH2-(PEG)), 68.1, 67.7 (-CH2-CH2-OH (HEMA)), 60.6, 60.7 (-CH2-CH2-OH (HEMA)), 55.6, 55.3, 55.1, 53.3, 53.2 (-CH2 β -(HEMA)), 46.4, 46.1 (Cα (HEMA)), 19.7 (-CH3 α (HEMA)), 17.7, 17.5 (CH3-(PPG), -CH3 α (HEMA)).

La composición de los diferentes copolímeros se calculó a partir de sus correspondientes espectros de 1H RMN, en los cuales se realizó la integración de la señal multiplete de los protones CH2a del bloque de PPG (δH, 3.53-3.47 ppm), correspondiente al macromonómero del poloxámero, y de la señal singlete de los protones oxietilénicos, -CH2CH2-OH (δH, 4.05), correspondiente a la unidad de HEMA. La Tabla II muestra los valores de composición obtenidos junto con los valores del rendimiento de cada reacción.

TABLA II

Valores de las fracciones en peso de los monómeros en la alimentación y en los copolímeros del sistema metacrilato

de 2-hidroxietilo-macromonómero metacrílico del Bayﬁt®10WF15, y valores de los rendimientos de las reacciones

Mediante cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) se determinaron los pesos moleculares promedio en número (Mn) y promedio en peso (Mw) de los copolímeros utilizando un aparato Perkin-Elmer equipado con una bomba isocrática Serie 250 y un detector de índice de refracción Serie 200. Las muestras se eluyeron a través de tres columnas conectadas en serie de poliestireno-divinilbenceno PL-gel de 500, 104 y105 nm de tamaño de poro (Polymer Laboratories) a 25ºC. Las muestras se prepararon disolviendo 13 mg de copolímero en 5 ml de dimetil formamida (DMF) conteniendo 0.1% de LiBr, y se eluyeron con un ﬂujo de 1 ml/min. Para la calibración se utilizaron patrones de poliestireno de peso molecular entre 1300 y 950000 Da.

La medida de la temperatura de transición vítrea (Tg) de los copolímeros se realizó en un calorímetro diferencial de barrido (Perkin Elmer DSC7 conectado a un analizador TAC 7/DX). Para ello, se depositaron 20 mg de la muestra seca en el interior de una cápsula de aluminio sellada y se calentó a velocidad constante de 20ºC/min con un ﬂujo de N2 de 50 ml/min. Se realizaron barridos en el intervalo de temperaturas de -10 a 200ºC. El calibrado del aparato se llevó a cabo con patrones de indio y zinc. La temperatura de transición vítrea (Tg) se determinó como el punto medio de la transición de la capacidad caloríﬁca observada en el termograma correspondiente al segundo barrido. Se analizaron al menos dos muestras de cada composición.

La Tabla III muestra los valores de los pesos moleculares y de la temperatura de transición vítrea de cada copolímero sintetizado.

TABLA III

Valores de los pesos moleculares promedios, polidispersidad y temperaturas de transición vítrea de los copolímeros preparados

El grado de hidratación de estos copolímeros se determinó sumergiendo las muestras en una disolución de tampón fosfato (PBS) de pH = 7.4 y a 37ºC para simular las condiciones ﬁsiológicas. Se extrajo la correspondiente muestra a distintos tiempos, se secó su superﬁcie cuidadosamente con papel de ﬁltro y se pesó para obtener el peso de la muestra hinchada a tiempo t. A continuación, la muestra se deshidrató en una estufa de vacío, donde se mantuvo hasta pesada constante, con el ﬁn de obtener el peso seco de la muestra a tiempo t. Los grados de hidratación (H) y de pérdida de peso (PP) se calcularon mediante las ecuaciones siguientes:

Donde, PH es el peso de la muestra hinchada a tiempo t, PS es el peso de la muestra seca a tiempotyPo el peso inicial de la muestra.

Los valores del grado de hidratación después de un mes de inmersión son 0.92 para el copolímero preparado con 10%-p del Mm y de 1.11 y 1.22 para los copolímeros preparados con 1 y 5%-p de Mm, respectivamente. De los resultados obtenidos cabe destacar que la incorporación de contenidos relativamente bajos del derivado metacrílico del poloxámero (entre 1 y 5%-p) aproximadamente triplicó el grado de hidratación del polímero PHEMA, que oscila en torno al 0.4. También cabe destacar que al aumentar el contenido de poloxámero funcionalizado al 10%-p el aumento del grado de hidratación se redujo, obteniéndose valores que duplican aquel del PHEMA.

En cuanto a la pérdida de peso, no se encontraron diferencias signiﬁcativas con la composición del copolímero, obteniéndose pérdidas de peso alrededor del 10% a un tiempo de 1 mes, en los tres casos. Estos resultados ponen de maniﬁesto la degradabilidad de estos sistemas, que provendrá principalmente de la hidrólisis de los grupos éster que se encuentran en los extremos de cadena del poloxámero funcionalizado. Con el ﬁn de asemejarse a las características de los ﬂuidos ﬁsiológicos, se realizó el estudio de degradación de los tres sistemas incorporando a la disolución de PBS carboxilesterasa de porcino (20 unidades/ml). Para mantener la enzima activa en todo momento, se procedió al cambio del medio cada 12 h. La pérdida de peso se determinó aplicando la ecuación descrita anteriormente. De estos ensayos, se obtuvieron valores del porcentaje de PP alrededor del 10% en un tiempo de 3 días, lo que indica que la hidrólisis enzimática de los grupos ésteres acelera la degradación de estos sistemas, lo que hay que tener en cuenta cuando se lleve a cabo la biodegradación en condiciones ﬁsiológicas.

Ejemplo 3

Termosensibilidad del poloxámero Bayﬁt®10WF15 y de los hidrogeles de HEMA y de metacrilato de Bayﬁt®10WF15

La termosensibilidad del poloxámero Bayﬁt®10WF15 se estudió partiendo de concentraciones acuosas del 0.5, 1,5, 10, 15 y 20%-p del poloxámero, en un intervalo de temperaturas de 0 a 90ºC. A temperatura ambiente, el poloxámero se encontraba precipitado en todas las concentraciones. Las dispersiones se fueron enfriando cubriendo el intervalo de temperatura señalado. En estas condiciones, se observó visualmente un cambio brusco del estado de agregación del sistema para la concentración de 0.5%-p a 13ºC, temperatura en la que el poloxámero se hacía totalmente soluble en agua. Para el resto de las concentraciones no se observó tal transición sino un aumento de la solubilidad al disminuir la temperatura en el intervalo estudiado. A continuación, la temperatura de transición o LCST de una disolución acuosa del 0.5% del poloxámero se midió siguiendo el método de punto de nube. Para ello, se midió la absorbancia a 400 nm de la disolución en un espectrofotómetro Cary 300 (VARIAN) siguiendo una velocidad de enfriamiento o calentamiento de 1ºC/min. Se cubrió un intervalo de temperatura entre 10 y 40ºC. Se determinó la temperatura LCST, como aquella a la cual la disolución acuosa tiene una absorbancia diferente de cero y es la lectura de temperatura más próxima a la de absorbancia cero. Las medidas se realizaron por triplicado. Se obtuvo una LCST de la disolución 0.5% del poloxámero alrededor de 13-14ºC en régimen de enfriamiento y una LCST alrededor de 17-18ºC en régimen de calentamiento. Para obtener el valor preciso de la temperatura de transición, se realizó un experimento por Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) utilizando un calorímetro Perkin-Elmer y utilizando cápsulas selladas que contenían una disolución acuosa de Bayﬁt®10WF15 al 0.5%-p. Se aplicó una velocidad de calentamiento de 10ºC/min, y se realizó un barrido de temperatura de -30 a 60ºC. En el primer barrido se observó un pico endotérmico correspondiente a la transición a una temperatura de 13.7ºC. Estos experimentos conﬁrman la termosensibilidad del Bayﬁt®10WF15.

La termosensibilidad de los copolímeros HEMA-Mm se estudió por DSC utilizando el calorímetro descrito anteriormente, utilizando cápsulas selladas que contenían el correspondiente hidrogel con grados de hidratación entre

0.02 y 0.09, y aplicando un ﬂujo de calentamiento de 10ºC/min en el intervalo de temperatura de -10 a 60ºC. La temperatura crítica de disolución inferior (LCST) se determinó a partir del máximo de la endoterma de la transición, el cual se corresponde con un cambio en las interacciones del polímero. A partir de dicho máximo predominan las interacciones hidrófobas en el polímero teniendo lugar el colapso del hidrogel (Diez-Peña E, Quijada-Garrido I, Frutos P, Barrales-Riande JM. Thermal properties of cross-linked poly(N-isopropylacrylamide) [P(N-iPAAm)], poly(methacrylic acid) [P(MAA)], their random copolymers [P(N-iPAAm-co-MAA)] and sequential interpenetrating polymer networks (IPNs). Macromolecules 2002; 35; 2667-2675). Todos los termogramas mostraron las correspondientes endotermas de la transición, y de los valores de los máximos se determinaron las temperaturas de transición (LCST), de 29, 31 y 35ºC para los hidrogeles preparados con 1, 5 y 10%-p del Mm, respectivamente. Estos experimentos conﬁrmaron la termosensibilidad de los hidrogeles. Es interesante resaltar que la introducción de porcentajes relativamente bajos del poloxámero en los copolímeros del macromonómero y HEMA da lugar a la obtención de sistemas termosensibles, si tenemos en cuenta que los hidrogeles de PHEMA no presentan esta sensibilidad. Además la temperatura de transición del poloxámero de partida se altera notablemente en los hidrogeles copoliméricos, colocándose en éstos en un intervalo de temperatura muy cercano al ﬁsiológico. En este sentido, estos hidrogeles tienen un gran potencial para aplicación en oftalmología, especialmente para administración tópica, si se tiene en cuenta que la temperatura de la córnea es de 32ºC.

Ejemplo 4

Biocompatibilidad del Bayﬁt®10WF15 y de los hidrogeles de HEMA y de metacrilato de Bayﬁt®10WF15

Para estos ensayos se utilizaron células de cultivo primario de ﬁbroblastos de piel humana de adulto (DPK-SKDF-HS Dominon Pharmakine) cultivadas a 37ºC. El medio de cultivo fue Minimal Essential Médium Eagle (MEM) modiﬁcado con HEPES y enriquecido con 10% de suero fetal bovino (FBS), 200 mM de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. El medio de cultivo se cambió a intervalos de tiempo seleccionados. Como control negativo se utilizó Thermanox® (TMX).

En primer lugar, se estudió la citotoxicidad del Bayﬁt®10WF15. Para ello, el compuesto (2.5 mg/ml) se dispersó en una disolución al 1%-p de poli(alcohol vinílico) (PVA) en MEM suplementado pero libre de suero. Esta disolución se diluyó sucesivamente con medio libre de suero. Los ﬁbroblastos humanos se sembraron a una densidad de 8 x 104 cel/ml en medio completo en una placa de cultivo de 96 pocillos y se incubaron hasta conﬂuencia. Después de 24 h de incubación, el medio se reemplazó con la correspondiente dilución y se incubó a 37ºC en atmósfera de aire humidiﬁcada con 5% CO2 durante 24 h. Se preparó una disolución de bromuro de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolio (MTT) en una disolución de tampón fosfato (PBS) templada (5 mg/ml) y ésta a su vez, se diluyó al 10% en medio fresco, se sustituyó la dilución de las placas por esta dilución de MTT y las placas se incubaron a 37ºC durante 4 h. Se extrajo el exceso de medio y MTT, y se adicionaron 100 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada pocillo con el ﬁn de disolver el MTT tomado por las células. Esto se mezcló durante 10 min y se midió la absorbancia con un detector Biotek Synergy HT usando una longitud de onda del ensayo 570 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm. La viabilidad celular se calculó a partir de la ecuación:

Viabilidad celular relativa = 100 x (DOM -DOB)/DOC

Donde, DOM,DOB,yDOC son las densidades ópticas de producción de formazán para la muestra, el blanco (MEM sin células) y el control (disolución al 1%-p de PVA en MEM suplementado y libre de suero). Se representó la curva dosis-viabilidad celular relativa con el ﬁn de determinar la concentración de compuesto que produce una depresión de la formación de MTT-formazán del 50%, valor que se denomina IC50, que resultó de 0.16 mg/ml; 32 μM. Se observó también que a partir de la concentración IC50 una tolerancia del compuesto en el resto de las concentraciones estudiadas, máxima de 1.4 mg/ml.

La citotoxicidad proveniente de cualquier extracto de los hidrogeles de HEMA-metacrilato de Bayﬁt®10WF15 preparados con 1 y 10%-p del macromonómero en la alimentación, se analizó mediante el ensayo MTT. Para este ensayo se utilizaron discos (14 mm de diámetro y 1 mm de espesor) recubiertos de los correspondientes hidrogeles. Los discos y el control negativo TMX se sumergieron en 5 ml de MEM a 37ºC, se extrajo el medio a diferentes tiempos (1, 2 y 7 días) y se reemplazó con otros 5 ml de medio fresco. Todos los extractos se obtuvieron bajo condiciones estériles. Los ﬁbroblastos se sembraron a una densidad de 8 x 104 cel/ml en medio completo en una placa de cultivos estéril de 96 pocillos y se incubaron 24 h. Entonces, el medio se reemplazó con el correspondiente extracto eluído y se incubó a 37ºC en atmósfera de aire humidiﬁcada con 5% CO2 durante 24 horas. Se preparó una disolución de MTT como la mencionada anteriormente. Se adicionaron 100 μl de MTT a cada uno de los pocillos y las placas se incubaron a 37ºC durante 4 horas. Se extrajo el exceso de medio y MTT y se adicionaron 100 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada uno de los pocillos con el ﬁn de disolver el MTT tomado por las células. Esto se mezcló en agitación y se midió la absorbancia con un lector de placas Biotek Synergy HT usando una longitud de onda del ensayo 570 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm. Los resultados se normalizaron con respecto al control negativo (TMX = 100%) y se realizó el estudio estadístico t-test para medias de dos muestras emparejadas. Se observó un aumento signiﬁcativo de la viabilidad celular en presencia de cualquiera de los extractos del hidrogel con el 1%-p de poloxámero (excepto a 7 días), y una disminución de la viabilidad celular en presencia de los extractos de los días 2 y 7 del hidrogel que contiene 10%-p del macromonómero. Sin embargo, la viabilidad en todos los casos se mantuvo superior al 80% con respecto del control TMX, lo que indica ausencia de citotoxicidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuesto de fórmula (I):

donde: -PEG representa un grupo polietilenglicol y PPG un grupo polipropilenglicol -R1 se selecciona entre hidrógeno o alquilo C1-C6, -n tiene un valor entre2y10, -m tiene un valor entre5y50.
2.

Compuesto según la reivindicación 1, donde: -R1 es un grupo metilo, -n tiene un valor entre4y8, -m tiene un valor entre 20 y 30.
3.

Compuesto según la reivindicación 2, donde: -n tiene un valor de 5, -m tiene un valor de 25.
4.

Procedimiento de obtención del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende las siguientes etapas:

i) disolver un poloxámero y un exceso de trietilamina en diclorometano, ii) adicionar a la disolución de la etapa (i) una disolución de cloruro de acriloílo en diclorometano.
5.

Hidrogel que comprende el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones1a3yun monómero acrílico hidróﬁlo.
6. Hidrogel según la reivindicación 5, donde el monómero acrílico hidróﬁlo se representa por la Fórmula (II):

donde: -R2 es un alquilo C1-C6, -R3 se selecciona entre H o -OH, -q tiene un valor entre0y4.
7.

Hidrogel según la reivindicación 6, donde: -R2 es un alquilo C1-C4

-R3 es H, -q tiene un valor entre0y2.
8.

Hidrogel según la reivindicación 7, donde: -R2 es un grupo metilo, -q tiene un valor de 1.
9.

Procedimiento de obtención del hidrogel según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, que comprende una copolimerización de un compuesto de fórmula (I) con un monómero acrílico de fórmula (II) en presencia de un iniciador radical.
10.

Procedimiento según la reivindicación 9, donde la copolimerización del compuesto de fórmula (I) y el monómero acrílico de fórmula (II) se lleva a cabo en una disolución de dioxano.
11.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones9ó10 donde el iniciador radical es azobisisobutironitrilo (AIBN).
12.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones9a11 donde la copolimerización se lleva a cabo a una temperatura de entre 50-60ºC.
13.

Uso del hidrogel según cualquiera de las reivindicaciones5a8 como vehículo para la liberación controlada de sustancias activas.
14. Uso según la reivindicación 13 donde la sustancia activa es un fármaco.
15. Uso del hidrogel según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 como coadyuvante en una composición farmacéutica.
16. Uso según la reivindicación 15 donde la composición farmacéutica se administra por vía tópica ocular.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud:200930587

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 10.08.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A

US 2005/0165208 A1 (POPP, A.A. et al.) 28/07/2005. Ver página 1, párrafo 2; reivindicaciones 1,7,16 y 18. 1-16

A

US 6316011 B1 (RON, E.S. et al.) 13/11/2001. Ver columnas 1 y 2, párrafos 2 y 3; columnas 26 y 27,ejemplo 1. 1-16

A

BADI, N & LUTZ, J. “PEG-based thermogels: Applicability in physiological media”. Journal of Controlled Release, 2009, Volumen 140, páginas 224-229. Ver página 224, Resumen; página 228, Conclusiones. 1-16

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 26.11.2010

Examinador N. Martín Laso Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud:200930587

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD C08G63/66(2006.01)

A61K47/10(2006.01) A61K47/34(2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

C08G, A61K

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, NPL, XPESP, CAS.

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud:200930587

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 26.11.2010

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-16 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-16 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud:200930587

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

US 2005/0165208 A1 (POPP, A.A. et al.) 28/07/2005

D02

US 6316011 B1 (RON, E.S. et al.) 13/1172001

D03

BADI, N & LUTZ, J. “PEG-based thermogels: Applicability in physiological media”. Journal of Controlled Release, 2009, Volumen 140, páginas 224-229. 2009
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La solicitud se refiere a ésteres acrílicos de poloxámeros con estructura de estrella de tres ramas de formula general I, a un procedimiento de obtención de dichos compuestos, a un hidrogel que comprende dichos compuestos, a un procedimiento de obtención de dicho hidrogel y al uso del hidrogel como vehículo para la liberación controlada de sustancias activas.

El documento D01 divulga ésteres acrílicos de poloxámeros con estructura de tres ramas en los que el número total de unidades de etilenglicol y propilenglicol está comprendido entre 3 y 5 (página 21, reivindicación 1). Dicho compuesto se prepara mediante reacción de glicerol alcoxilado con ácido metacrílico en presencia de un catalizador de esterificación y de un inhibidor de polimerización (páginas 21 y 22, reivindicación 7). Dicho documento divulga igualmente hidrogeles que comprenden dichos compuestos. El hidrogel se obtiene polimerizando los distintos ésteres acrílicos de poloxámeros con ácido metacrílico (páginas 22 y 23, reivindicaciones 16 y 18). Los hidrogeles pueden ser usados como vehículos de medicamentos (página 1, párrafo 2).

El documento D02 divulga un éster acrílico derivado de Pluronic (poloxámero con estructura lineal). Dicho compuesto se preparar mediante reacción de Pluronic F127 con cloruro de acriloilo en presencia de trietilamina. Posteriormente dicho derivado de Pluronic se funcionaliza en sus extremos con ácido poliacrílico mediante polimerización radicalaria, obteniéndose un gel que puede ser utilizado como vehículo para la liberación controlada de fármacos (columna 1, párrafos 2 y 3; columnas 26 y 27; ejemplo 1).

El documento D03 divulga un polímero biocompatible de polietilenglicol con estructura de estrella de 4 ramas. A partir de dicho polímero se preparan hidrogeles copolimerizando dicho polímero con metacrilatos de un oligómero del etilenglicol y 2(2-metoxietoxi)etil metacrilato. Los hidrogeles pueden ser utilizados en distintos campos, entre los que se encuentran distintas aplicaciones biológicas (página 224, Resumen; página 228, Conclusiones).

Ninguno de los documentos anteriores (considerados los más cercanos en el estado de la técnica) divulgan ni dirigen al experto en la materia hacia ésteres acrílicos de poloxámeros con estructura de tres ramas en los que el número total de unidades de etilenglicol y propilenglicol en cada rama del poloxámero se encuentra comprendido entre 7 y 60.

Por lo tanto, la invención definida en las reivindicaciones 1-16 de la solicitud es nueva y posee actividad inventiva (Art. 6.1 y
8.1 LP11/1986).

Informe del Estado de la Técnica Página 4/4