ES2351326B1 - METHOD FOR THE IDENTIFICATION OF THE ORIGIN OF COMMERCIAL SPROCKETS. - Google Patents
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Abstract
Método para la identificación del origen de los piñones comerciales. En la presente invención se describe un método para la identificación del origen de la procedencia de los piñones comerciales, ya sea en lotes comerciales (entero o en trozos, con cáscara, etc.) o formando parte de salsas, postres, etc. Mediante el método descrito en la presente invención se averigua la procedencia del piñón denominado coloquialmente "piñón comercial", diferenciando preferentemente entre los piñones europeos procedentes de la especie de pinos Pinus pinea L., frente a los piñones chinos procedente de la especie de pinos Pinus koraiensis. Para ello se utilizan marcadores genéticos invariantes del cloroplasto, el Pt15169 y el Pt30204, que presentan un número de pb específico e invariable en los piñones de procedencia europea, frente al variable y mayor número de pb que presentan los piñones de procedencia china.Method for identifying the origin of commercial pine nuts. In the present invention a method for identifying the origin of the origin of commercial pine nuts is described, either in commercial lots (whole or in pieces, with shell, etc.) or as part of sauces, desserts, etc. By means of the method described in the present invention, the origin of the colloquially called "commercial pinion" is determined, preferably differentiating between the European pine nuts from the Pinus pinea L. pine species, compared to the Chinese pine nuts from the Pinus pine species Koraiensis To do this, invariant genetic markers of the chloroplast, Pt15169 and Pt30204 , are used , which have a specific and invariable pb number in the pine nuts of European origin, compared to the variable and greater number of bp that the pine nuts of Chinese origin present.
Description
Método para la identificación del origen de los piñones comerciales.Method for identifying the origin of commercial sprockets.
La presente invención se refiere a un método para la identificación de la especie de origen de los piñones comerciales, diferenciando preferentemente entre el piñón de origen europeo procedente de la especie de pino Pinus pinea y el piñón de origen chino procedente de la especie de pino Pinus koraiensis. Por lo tanto la presente invención puede englobarse dentro del campo de la industria alimentaria.The present invention relates to a method for the identification of the species of origin of the commercial pine nuts, preferably differentiating between the pinion of European origin from the Pinus pinea pine species and the pinion of Chinese origin from the Pinus pine species Koraiensis Therefore the present invention can be encompassed within the field of the food industry.
La especie de origen del piñón es importante ya que determina su tamaño, valor nutricional (y medicinal) y sabor. Sin embargo, los consumidores no suelen poder distinguir entre las diferentes especies, que frecuentemente se comercializan bajo el nombre genérico de "piñón" sin precisar su origen. En general, el piñón europeo es más apreciado que el chino por sus características organolépticas y alcanza mayores precios en el mercado. El piñón se comercializa tanto entero (con cáscara), pelado, en trozos o formando parte de productos procesados o derivados del mismo, como es la salsa italiana "pesto" o diferentes tipos de preparados de repostería.The species of origin of the pinion is important since which determines its size, nutritional (and medicinal) value and taste. However, consumers often cannot distinguish between different species, which are often marketed under the generic name of "pinion" without specifying its origin. In general, the European pinion is more appreciated than the Chinese for its organoleptic characteristics and reaches higher prices in the market. The pinion is sold both whole (with shell), peeled, in pieces or as part of processed products or derivatives thereof, such as the Italian sauce "pesto" or Different types of pastry preparations.
Ambos tipos de piñón, piñón europeo y piñón chino, se encuentran frecuentemente tanto en el mercado nacional como en el internacional. No existen estimaciones precisas de la producción mundial de piñón, pero se considera que pueda estar alrededor de las 20.000 toneladas en los años con buenas cosechas (Sharashkin y Gold 2004 Northern Nut Growers Association 95th Annual Report). Los piñones tienen un valor nutricional excepcional, con porcentajes altos de proteínas, micronutrientes y vitaminas, están libres de colesterol (FAO 1995 Non-wood forest producís from conifers, Chapter 8: Seeds, fruits and cones http://www.fao.org/docrep/X0453E/X0453e12.htm; Sharashkin y Gold 2004 op. cit.) y se recomiendan como un elemento importante para tener una dieta sana. Existen también evidencias epidemiológicas y clínicas sobre el efecto beneficioso del consumo regular de piñones en la prevención de enfermedades coronarias y los factores de riesgo asociados (Kris-Etherton y cols. 2008 Journal of Nutrition).Both types of pinion, European pinion and Chinese pinion, are frequently found both in the national and international markets. There are no precise estimates of world pine nut production, but it is considered that it may be around 20,000 tons in years with good harvests (Sharashkin and Gold 2004 Northern Nut Growers Association 95th Annual Report ). Pine nuts have an exceptional nutritional value, with high percentages of proteins, micronutrients and vitamins, are free of cholesterol (FAO 1995 Non-wood forest producís from conifers, Chapter 8: Seeds, fruits and cones http://www.fao.org /docrep/X0453E/X0453e12.htm ; Sharashkin and Gold 2004 op. cit.) and are recommended as an important element for a healthy diet. There is also epidemiological and clinical evidence on the beneficial effect of regular pine nut consumption in the prevention of coronary heart disease and associated risk factors (Kris-Etherton et al. 2008 Journal of Nutrition ).
España es uno de los mayores productores de piñón europeo del mundo, contando con aproximadamente el 75% de la extensión forestal mundial de Pinus pinea (unas 400.000 ha). La media anual de producción de piñón europeo con cáscara en España durante 1974-2000 se sitúa en 6.466 toneladas, con un rango de 3.201-10.360 toneladas dependiendo de la bondad de la cosecha (Barranco y Ortuño 2004 Estudios Agrosociales y Pesqueros). Sin embargo, debido a los menores costes de producción y al etiquetado ambiguo del producto, el mercado de piñón español se está viendo afectado por la presencia creciente de piñón chino en los últimos años, con los inconvenientes que este hecho conlleva, tanto para el mercado español como para los propios consumidores, ya que al no indicar la procedencia del piñón, se pueden comprar piñones de menor calidad sin tener conocimiento de ello.Spain is one of the largest producers of European pine nuts in the world, with approximately 75% of the global forest extension of Pinus pinea (about 400,000 ha). The annual average production of European pine nuts with shell in Spain during 1974-2000 stands at 6,466 tons, with a range of 3,201-10,360 tons depending on the goodness of the harvest (Barranco and Ortuño 2004 Agrosocial and Fisheries Studies ). However, due to lower production costs and ambiguous product labeling, the Spanish pine nut market is being affected by the growing presence of Chinese pine nut in recent years, with the inconvenience that this entails, both for the market Spanish as for the consumers themselves, since by not indicating the origin of the pinion, lower quality pine nuts can be purchased without knowledge of it.
En el estado de la técnica existen documentos que utilizan los marcadores genéticos del cloroplasto, Pt15169 y Pt30204, para el genotipado (estructura y diversidad genética) de diferentes especies de pinos (Vendramin GG et al. Molecular Ecology 1996), así como también para el estudio de la distribución de dichas especies en función de dicha diversidad genética (Young Hee Joung & Mark S. Roh Forest Genetics 2005). En ninguno de los documentos aludidos se menciona el estudio de los marcadores genéticos del cloroplasto, Pt15169 y Pt30204, en la especie P. koraiensis, productora del piñón chino, ni tampoco se indica el número de pb que presentan las variantes alélicas de dichos marcadores genéticos en esta especie. Por otro lado, en el estado de la técnica, no se conoce la existencia de ningún método para la identificación del piñón europeo frente al piñón chino, utilizando marcadores genéticos del cloroplasto, en los que se utilicen las variantes alélicas de cada marcador por presentar siempre un tamaño de pb determinado y diferente en el caso del piñón europeo frente al mayor y variable número de pb que presentan dichas variantes alélicas en el caso del piñón chino, haciendo dicha característica que se puedan diferenciar un tipo de piñón respecto del otro, y por lo tanto averiguar la especie de procedencia de los mismos.In the state of the art there are documents that use the genetic markers of the chloroplast, Pt15169 and Pt30204 , for the genotyping (structure and genetic diversity) of different pine species (Vendramin GG et al . Molecular Ecology 1996), as well as for the study of the distribution of these species according to said genetic diversity (Young Hee Joung & Mark S. Roh Forest Genetics 2005). None of the aforementioned documents mention the study of the genetic markers of the chloroplast, Pt15169 and Pt30204 , in the species P. koraiensis , producer of the Chinese pine nut, nor is the number of bp presented by the allelic variants of said genetic markers. In this species. On the other hand, in the state of the art, there is no known existence of any method for the identification of the European pinion against the Chinese pinion, using genetic markers of the chloroplast, in which the allelic variants of each marker are used for always presenting a determined and different size of bp in the case of the European pinion versus the greater and variable number of bp presented by said allelic variants in the case of the Chinese pinion, said characteristic making it possible to differentiate one type of pinion from the other, and by Therefore find out the kind of origin of them.
Vendramin y cols. (2008) han mostrado la existencia de una baja diversidad genética en el cloroplasto de Pinus pinea a lo largo de su distribución mundial. En un estudio en el que han analizado 12 marcadores genéticos del cloroplasto en 34 poblaciones diferentes de P. pinea distribuidas a lo largo del mediterráneo (España, Portugal, Francia, Italia, Croacia, Grecia, Turquía, Líbano, Marruecos y Túnez), han concluido que dicha especie presenta una ausencia casi total de variación en cuanto a los marcadores genéticos del cloroplasto analizados, en toda la variedad de especies, una característica raramente encontrada en cualquier otra especie de plantas. Por este motivo podemos concluir que un método para la identificación del origen del piñón comercial, basado en la utilización de marcadores genéticos del cloroplasto, para diferenciar entre piñón europeo (P. pinea) y piñón chino (P. koraiensis), tal como el descrito en la presente invención, es un método muy fiable y preciso, al estar basado en la identificación de marcadores genéticos del cloroplasto que presentan una mínima variabilidad genética, debido al bajo grado de diversidad genética que presenta la especie, P. pinea, productora de piñón europeo.Vendramin et al. (2008) have shown the existence of a low genetic diversity in the Pinus pinea chloroplast throughout its worldwide distribution. In a study in which they have analyzed 12 genetic markers of chloroplast in 34 different populations of P. pinea distributed throughout the Mediterranean (Spain, Portugal, France, Italy, Croatia, Greece, Turkey, Lebanon, Morocco and Tunisia), have concluded that this species presents an almost total absence of variation in the genetic markers of the chloroplast analyzed, in all the variety of species, a characteristic rarely found in any other species of plants. For this reason we can conclude that a method for identifying the origin of the commercial pinion, based on the use of genetic markers of chloroplast, to differentiate between European pinion ( P. pinea ) and Chinese pinion ( P. koraiensis ), such as the one described In the present invention, it is a very reliable and precise method, being based on the identification of genetic markers of the chloroplast that present a minimum genetic variability, due to the low degree of genetic diversity that the species presents, P. pinea , pinion producer European.
La presente invención describe un método para la identificación del origen de procedencia del piñón comercial, siendo capaz de diferenciar entre el piñón europeo procedente de la especie Pinus pinea L, frente al piñón chino procedente de la especie Pinus koraiensis. Así, el problema técnico solventado por la presente invención se refiere a la identificación de la especie de origen del piñón comercial, teniendo en cuenta que dicho origen determina el tamaño, valor nutricional, valor medicinal y sabor de los piñones, ya que frecuentemente, bajo el nombre genérico de "piñón" se comercializan piñones de diferentes especies. En este sentido, conviene diferenciar entre el piñón europeo y piñón chino, ya que el primero es más apreciado por sus características organolépticas y llega a alcanzar mayores precios en el mercado, que el segundo. Por lo tanto, gracias a la presente invención se solventa el problema técnico mencionado, ya que mediante la utilización de marcadores genéticos invariantes del cloroplasto, Pt15169 y Pt30204, se consigue diferenciar entre los piñones europeos (Pinus pinea L.) y los piñones chinos (Pinus koraiensis), gracias al diferente número de pb que presentan las variantes alélicas de dichos marcadores genéticos del cloroplasto en los piñones de una especie frente a los de otra.The present invention describes a method for identifying the origin of the commercial pinion, being able to differentiate between the European pinion from the Pinus pinea L species, compared to the Chinese pinion from the Pinus koraiensis species. Thus, the technical problem solved by the present invention relates to the identification of the species of origin of the commercial pine nut, taking into account that said origin determines the size, nutritional value, medicinal value and taste of the pine nuts, since frequently, under The generic name of "pine nut" is sold pine nuts of different species. In this sense, it is convenient to differentiate between the European and Chinese pine nuts, since the former is more appreciated for its organoleptic characteristics and reaches higher prices in the market, than the latter. Therefore, thanks to the present invention, the aforementioned technical problem is solved, since through the use of invariant genetic markers of the chloroplast, Pt15169 and Pt30204 , it is possible to differentiate between the European pine nuts ( Pinus pinea L. ) and the Chinese pine nuts ( Pinus koraiensis ), thanks to the different number of bp presented by allelic variants of said genetic markers of chloroplast in the pine nuts of one species versus those of another.
La presente invención describe un método para la determinación de la especie de origen del piñón comercial, principalmente diferenciar entre el piñón europeo (P. pinea) y el piñón chino (P. koraiensis), basado en la utilización de marcadores genéticos del cloroplasto, Pt30204 y Pt15169, útiles para distinguir entre ambos tipos de piñones, ya que presentan unas variantes alélicas de tamaño único y específico para cada marcador genético en el piñón europeo y en cambio, en el piñón chino, esas variantes alélicas de los marcadores genéticos son de un tamaño variable y mayor que en el caso del piñón europeo, lo que permite diferenciar uno del otro.The present invention describes a method for determining the species of origin of the commercial pinion, mainly differentiating between the European pinion ( P. pinea ) and the Chinese pinion ( P. koraiensis ), based on the use of genetic markers of the chloroplast, Pt30204 and Pt15169 , useful to distinguish between both types of pinions, since they have allelic variants of unique size and specific for each genetic marker in the European pinion and instead, in the Chinese pinion, those allelic variants of the genetic markers are of a variable size and larger than in the case of the European pinion, which allows differentiating one from the other.
Por el término de "piñón comercial", se entiende en la presente invención, todo aquel piñón crudo procedente de lotes comerciales de fabricación (pudiendo encontrarse entero, en trozos, con cáscara, etc), así como también cualquier tipo de producto derivado de piñones, como pueden ser por ejemplo la salsa italiana "pesto", o cualquier otro tipo de producto o alimento, salsa, etc que utilice piñones en su composición.By the term "commercial sprocket", it understood in the present invention, all that raw pine nut from of commercial manufacturing lots (can be found whole, in pieces, with shell, etc), as well as any type of product derived from pine nuts, such as salsa Italian "pesto", or any other type of product or food, sauce, etc. that uses pine nuts in its composition.
Figura 1. Fotografías de geles de acrilamida/bisacrilamida en los que se han corrido diferentes muestras problema de piñones y dónde se muestran el diferente tamaño de pb de las diferentes variantes alélicas de los marcadores moleculares del cloroplasto Pt30204 y Pt15169. A) Fotografía de un gel ejemplo de acrilamida/bisacrilamida que muestra el número de pb que presenta la variante alélica del marcador genético del cloroplasto Pt30204 del piñón europeo (parte izquierda de la fotografía) frente al número de pb que presenta la variante alélica del mismo marcador genético en el caso de muestras de piñón chino (parte derecha de la fotografía). B) Fotografía de un gel ejemplo de acrilamida/bisacrilamida que muestra el número de pb de la variante alélica del marcador genético del cloroplasto Pt15169 en muestras de piñón europeo (parte izquierda de la fotografía) frente al número de pb que presenta la variante alélica del mismo marcador genético en el caso de muestras de piñón chino (parte derecha de la fotografía).Figure 1. Photographs of acrylamide / bisacrylamide gels in which different pinion problem samples have been run and where the different bp size of the different allelic variants of the molecular markers of the chloroplast Pt30204 and Pt15169 are shown . A) Photograph of an example acrylamide / bisacrylamide gel showing the number of bp presented by the allelic variant of the genetic marker of the Pt30204 chloroplast of the European pinion (left part of the photograph) against the number of bp presenting the allelic variant thereof genetic marker in the case of samples of Chinese pinion (right part of the photograph). B) Photograph of an example acrylamide / bisacrylamide gel showing the bp number of the allelic variant of the genetic marker of the chloroplast Pt15169 in European pinion samples (left part of the photograph) versus the bp number that presents the allelic variant of the same genetic marker in the case of samples of Chinese pinion (right part of the photograph).
La presente invención resuelve el problema técnico de la identificación de la especie de origen del piñón comercial presente en diferentes lotes (entero, o en trozos, o con cáscara) o incluso formando parte de productos procesados o derivados del mismo, como en la salsa italiana "pesto" o cualquier otro producto procesado del que se pueda extraer ADN del piñón o de los trozos de piñones que lo conformen. Como se ha mencionado anteriormente y teniendo en cuenta que el origen del piñón determina el tamaño, valor nutricional, valor medicinal y sabor de los piñones, y que frecuentemente, bajo el nombre genérico de "piñón" se comercializan piñones de diferentes especies, conviene diferenciar entre el piñón europeo y piñón chino, ya que el primero es más apreciado por sus características organolépticas y llega a alcanzar mayores precios en el mercado que el segundo, y en muchas ocasiones, debido al etiquetado ambiguo del producto no se diferencia entre un tipo de piñón y otro.The present invention solves the problem technical identification of the species of origin of the pinion commercial present in different batches (whole, or in pieces, or with shell) or even part of processed products or derivatives thereof, as in the Italian sauce "pesto" or any other processed product from which DNA can be extracted from the sprocket or pieces of sprockets that make it up. How has it mentioned above and considering that the origin of the pine nut determines the size, nutritional value, medicinal value and flavor of the pine nuts, and that frequently, under the generic name "pine nuts" are sold pine nuts of different species, It is important to differentiate between the European pinion and the Chinese pinion, since the first it is more appreciated for its organoleptic characteristics and it reaches higher prices in the market than the second, and in Many times, due to ambiguous product labeling, difference between one type of pinion and another.
Así, en la presente invención se describe un método para la identificación de la especie de origen del piñón comercial, utilizando marcadores genéticos invariantes del cloroplasto, el Pt15169 y el Pt30204, gracias a la caracterización de las diferencias fijas existentes, en cuanto a número de pb, entre las variantes alélicas de estos marcadores genéticos del cloroplasto en función de la especie de origen. El tamaño de las variantes alélicas de los marcadores Pt15169 y Pt30204, es un tamaño único e invariable en el caso de los piñones europeos (Pinus pinea L), mientras que en el caso de los piñones chinos (Pinus koraiensis) ese tamaño es un tamaño variable y mayor. Así, gracias a esa diferencia en número de pb que presentan las variantes alélicas de los marcadores genéticos utilizados en la presente invención, se nos permite diferenciar entre los piñones de una especie frente a los de otra, de una manera clara y sin dejar lugar a dudas.Thus, in the present invention a method for the identification of the species of origin of the commercial pinion is described, using genetic markers of the chloroplast, Pt15169 and Pt30204 , thanks to the characterization of the existing fixed differences, in terms of number of bp, among allelic variants of these genetic markers of chloroplast depending on the species of origin. The size of the allelic variants of the Pt15169 and Pt30204 markers is a unique and invariable size in the case of European pine nuts ( Pinus pinea L ), while in the case of Chinese pine nuts ( Pinus koraiensis ) that size is one size variable and greater. Thus, thanks to this difference in the number of bp presented by the allelic variants of the genetic markers used in the present invention, we are allowed to differentiate between the pinions of one species against those of another, in a clear way and without leaving room for Doubts.
En la presente invención se demuestra que el marcador genético del cloroplasto Pt30204, en el piñón europeo presenta siempre la variante alélica de un tamaño específico que se corresponde con 145 pb, mientras que en el piñón chino este marcador genético presenta una variante alélica, en una franja que varía entre 158-168 pb, con una diferencia de al menos 13 pb, frente a la variante alélica del mismo marcador genético en el caso del piñón europeo. En el caso del marcador genético del cloroplasto Pt15169, el tamaño de la variante alélica del piñón europeo es 115 pb, mientras que en el piñón chino, la variante alélica de este marcador presenta una franja de variación que va de 133-148 pb, con una diferencia de al menos 18 pb respecto a la misma variante alélica pero del piñón europeo.In the present invention it is demonstrated that the genetic marker of the chloroplast Pt30204 , in the European pinion always presents the allelic variant of a specific size corresponding to 145 bp, while in the Chinese pinion this genetic marker presents an allelic variant, in a strip that varies between 158-168 bp, with a difference of at least 13 bp, compared to the allelic variant of the same genetic marker in the case of the European pinion. In the case of the genetic marker of the chloroplast Pt15169 , the size of the allelic variant of the European pinion is 115 bp, while in the Chinese sprocket, the allelic variant of this marker presents a range of variation ranging from 133-148 bp, with a difference of at least 18 bp with respect to the same allelic variant but of the European pinion.
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Así, gracias al método descrito en la presente invención se consigue diferenciar entre una especie de piñón y otra, con las ventajas que se consiguen mediante dicha identificación, ya que el piñón europeo posee mejores características organolépticas y un mayor tamaño que el piñón chino, por lo que la utilización del piñón europeo, ya sea para la fabricación de salsas, postres, como fruto seco tal cual, etc, proporciona mayores niveles nutricionales y proteicos, así como un mayor sabor y calidad a los platos, postres, etc, en los que se utiliza dicho piñón frente a los platos en los que se utiliza el piñón chino.Thus, thanks to the method described herein invention is able to differentiate between a kind of pinion and another, with the advantages that are achieved through such identification, since that the European pinion has better organoleptic characteristics and larger than the Chinese pinion, so the use of European pinion, whether for the manufacture of sauces, desserts, such as dried fruit as is, etc., provides higher nutritional levels and protein, as well as greater flavor and quality to the dishes, desserts, etc., in which said pinion is used in front of the dishes in which the Chinese pinion is used.
Así el primer objeto de la presente invención describe un método para la identificación de la especie de origen de los piñones comerciales que comprende los pasos de:Thus the first object of the present invention describes a method for the identification of the species of origin of Commercial sprockets comprising the steps of:
- a)to)
- Extraer el ADN de una muestra de piñón comercial.Extract DNA from a pinion sample commercial.
- b)b)
- Amplificar los marcadores genéticos de cloroplasto de la muestra del ADN extraído.Amplify the genetic markers of Chloroplast of the DNA sample extracted.
- c)C)
- Someter a electroforesis en un gel los fragmentos de ADN amplificados.Electrophoresis in a gel the amplified DNA fragments.
- d)d)
- Visualizar los fragmentos de ADN amplificados, preferentemente mediante secuenciadores automáticos.Visualize the DNA fragments amplified, preferably by sequencers automatic
- e)and)
- Analizar y comparar el número de pares de bases obtenido en el proceso de visualización de la muestra problema con un patrón de pares de bases conocido.Analyze and compare the number of pairs of bases obtained in the sample visualization process problem with a known base pair pattern.
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En una realización preferida, el método de la invención se caracteriza porque identifica preferentemente el piñón europeo, Pinus pinea, frente al piñón chino, Pinus koraiensis.In a preferred embodiment, the method of the invention is characterized in that it preferably identifies the European pinion, Pinus pinea , against the Chinese pinion, Pinus koraiensis .
En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque los marcadores genéticos de cloroplasto utilizados preferentemente son: Pt15169 y Pt30204. El número de pares de bases del marcador genético Pt15169 en el piñón europeo es 115 y en el piñón chino varía entre 133-148, con una diferencia de al menos 18 pares de bases frente al piñón europeo. El número de pares de bases del marcador genético Pt30204 en el piñón europeo es 145 y en el piñón chino varía entre 158-168, con una diferencia de al menos 13 pares de bases frente al piñón europeo.In another preferred embodiment the method of the invention is characterized in that the genetic chloroplast markers preferably used are: Pt15169 and Pt30204 . The number of base pairs of the genetic marker Pt15169 in the European pinion is 115 and in the Chinese pinion it varies between 133-148, with a difference of at least 18 base pairs compared to the European pinion. The number of base pairs of the genetic marker Pt30204 in the European pinion is 145 and in the Chinese pinion it varies between 158-168, with a difference of at least 13 base pairs compared to the European pinion.
En otra realización preferida el método de la invención se caracteriza porque en el paso b) los cebadores utilizados para la amplificación del marcador genético Pt15169 corresponden a las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y los utilizados para la amplificación del marcador genético Pt30204 corresponden a las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.In another preferred embodiment the method of the invention is characterized in that in step b) the primers used for the amplification of the genetic marker Pt15169 correspond to the sequences SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and those used for amplification of the marker Pt30204 genetic correspond to the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
Los ejemplos que se exponen a continuación tienen el objetivo de ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma.The examples set out below. they are intended to illustrate the invention without limiting the scope Of the same.
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Se seleccionan 85 muestras procedentes de lotes comerciales (etiquetados simplemente como "piñón") y de productos derivados (salsa "pesto"), adquiridos en supermercados de España e Italia, que fueron sometidas a análisis molecular para averiguar el origen de procedencia de los piñones contenidos en dichos lotes o salsas, mediante el método descrito en la presente invención.85 samples from lots are selected commercial (simply labeled "pinion") and of derived products ("pesto" sauce), purchased from supermarkets in Spain and Italy, which were subjected to analysis molecular to find out the origin of the pine nuts contained in said batches or sauces, by the method described in The present invention.
Por otro lado, también se seleccionaron 85 muestras de P. koraiensis procedentes de lotes comerciales obtenidos en origen y conservados en la colección de semillas del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), para averiguar el número de pb que presentaban las variantes alélicas de los marcadores genéticos del cloroplasto, Pt15169 y Pt30204, en dicha especie.On the other hand, 85 samples of P. koraiensis from commercial lots obtained at source and conserved in the seed collection of the National Institute of Agricultural and Food Technology and Research (INIA) were also selected, to find out the number of bp that presented the allelic variants of the genetic markers of chloroplast, Pt15169 and Pt30204 , in said species.
En el momento de la recepción de las muestras, éstas se almacenan en bolsas de papel independientes y son etiquetadas, manteniéndose en cámara fría a 4ºC y en ambiente seco (mediante un agente desecador como el gel de sílice) hasta la extracción del ADN.At the time of receipt of the samples, these are stored in separate paper bags and are labeled, keeping in a cold room at 4ºC and in a dry environment (using a drying agent such as silica gel) until DNA extraction.
Todos los análisis y ensayos realizados para la extracción del ADN de las diferentes muestras de piñones, se efectúan en condiciones estériles, teniendo en cuenta todas las precauciones normales para evitar contaminaciones de ADN ajeno a las muestras analizadas.All analyzes and tests performed for the DNA extraction from the different samples of pine nuts, it carried out under sterile conditions, taking into account all normal precautions to avoid contamination of foreign DNA analyzed samples.
La extracción de ADN se realiza mediante el kit Invisorb DNA Plant de Invitek (Berlin, Alemania) siguiendo el protocolo indicado por el fabricante o con un protocolo de extracción de ADN estándar como el descrito en Dellaporta y cols. (1983) Plant Molecular Biology Reporter. En el caso del material procedente de la salsa "pesto", los trozos de piñón se extraen de la misma manera, previo lavado de las muestras con agua estéril antes de proceder a la extracción del ADN.DNA extraction is carried out using the Invisorb DNA Plant kit from Invitek (Berlin, Germany) following the protocol indicated by the manufacturer or with a standard DNA extraction protocol such as that described in Dellaporta et al. (1983) Plant Molecular Biology Reporter . In the case of the material from the "pesto" sauce, the pinion pieces are extracted in the same way, after washing the samples with sterile water before proceeding to DNA extraction.
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Se utilizan aproximadamente entre 5-10 ng del ADN extraído de las diferentes muestras a analizar para proceder a su amplificación mediante la técnica PCR. Se prepara una mezcla de reacción que tiene un volumen final de mezcla de 10 \mul, en el que se incluyen además de la concentración de ADN mencionada todas las enzimas, nucleótidos, cebadores y tampones necesarios para llevar a cabo el proceso de amplificación de dicho ADN, mediante técnicas convencionales.They are used approximately between 5-10 ng of the DNA extracted from the different samples to analyze to proceed with its amplification using the PCR technique. A reaction mixture is prepared having a final volume of 10 µl mixture, in which they are included in addition to the DNA concentration mentioned all enzymes, nucleotides, primers and buffers necessary to carry out the process of amplification of said DNA, by conventional techniques.
El marcador genético del cloroplasto Pt30204 (amplificado mediante los cebadores con secuencia SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) consiste en repeticiones mononucleótidas de los motivos "A" y "G". El extremo 5'del cebador directo se sitúa en la base 30204 de la secuencia de P. Thunbergii depositada en GenBank con número D30204, dentro del gen cloroplástico clpP.The genetic marker of the Pt30204 chloroplast (amplified by primers with sequence SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) consists of mononucleotide repeats of motifs "A" and "G". The 5'-end of the direct primer is located at base 30204 of the P. Thunbergii sequence deposited in GenBank with number D30204, within the clpP chloroplast gene.
El marcador genético del cloroplasto Pt15169 (amplificado mediante los cebadores con secuencia SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4) consiste en repeticiones mononucleótidas de los motivos "C" y "T". El extremo 5' del cebador directo se sitúa en la base 15169 de la secuencia de P. Thunbergii depositada en GenBank con número D17510, dentro del gen cloroplástico rps2.The genetic marker of the Pt15169 chloroplast (amplified by primers with sequence SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) consists of mononucleotide repeats of the "C" and "T" motifs. The 5 'end of the direct primer is located at base 15169 of the P. Thunbergii sequence deposited in GenBank with number D17510, within the rps2 chloroplast gene .
La PCR se realiza en un termociclador modelo GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA).The PCR is performed in a model thermal cycler GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
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La visualización de los productos de PCR se realiza en secuenciadores automáticos marca LI-COR 4300 DNA Analyser (LI-COR Biosciences, Nebraska, EEUU) en geles de acrilamida/bisacrilamida (19:1) 6% (p/v), urea 7 M, siguiendo métodos estándar proporcionados por el fabricante.The display of PCR products is performs on LI-COR brand automatic sequencers 4300 DNA Analyzer (LI-COR Biosciences, Nebraska, USA) in acrylamide / bisacrylamide gels (19: 1) 6% (w / v), urea 7 M, following standard methods provided by the manufacturer.
Los pesos moleculares de las variantes alélicas de cada uno de los marcadores utilizados para diferenciar entre una especie de piñón y otra se obtienen mediante referencia a estándares comerciales o por comparación directa con muestras de P. pinea (de las que se conoce el tamaño molecular al existir sólo una variante alélica en los marcadores seleccionados por los inventores).The molecular weights of the allelic variants of each of the markers used to differentiate between one species of pinion and another are obtained by reference to commercial standards or by direct comparison with P. pinea samples (of which the molecular size is known at there is only one allelic variant in the markers selected by the inventors).
En la figura 1A se observa la diferencia en cuanto al número de pb que presenta la variante alélica del marcador genético del cloroplasto Pt30204 en las muestras analizadas de piñón europeo (izquierda de la fotografía) y las muestras de piñón chino (derecha de la fotografía). Como se observa en dicha fotografía, la variante alélica del marcador Pt30204 en el piñón europeo presenta, homogéneamente en todas las muestras analizadas, un tamaño aproximado de 145 pb, mientras que en las muestras de piñón chino presenta diferente número de pb, pero siempre dentro de un rango de pb que varía entre 158-168 pb.Figure 1A shows the difference in the number of bp presented by the allelic variant of the genetic marker of the chloroplast Pt30204 in the analyzed samples of European pinion (left of the photograph) and the samples of Chinese pinion (right of the photograph) . As can be seen in this photograph, the allelic variant of the Pt30204 marker in the European pinion presents, approximately homogeneously in all the samples analyzed, an approximate size of 145 bp, while in the Chinese pinion samples it presents a different number of bp, but always within of a range of bp that varies between 158-168 bp.
En la figura 1B, se muestra la diferencia en número de pb que presenta la variante alélica del marcador genético del cloroplasto Pt15169 en las muestras de piñón europeo (izquierda de la fotografía) y en las muestras de piñón chino (derecha de la fotografía). Al igual que en el caso del marcador Pt30204, las muestras analizadas de piñón europeo presentan homogeneidad en cuanto al número de pb, que en el caso del marcador genético Pt15169 es de 115 pb, mientras que en el caso del piñón chino, las muestras analizadas presentan un rango en cuanto a número de pb que varía entre 133-148 pb.In Figure 1B, the difference in bp number shown by the allelic variant of the genetic marker of the chloroplast Pt15169 is shown in the European pinion samples (left of the photograph) and in the Chinese pinion samples (right of the photograph). As in the case of the Pt30204 marker, the analyzed samples of European pinion show homogeneity in the number of bp, which in the case of the genetic marker Pt15169 is 115 bp, while in the case of the Chinese pinion, the samples analyzed they have a range in terms of the number of bp that varies between 133-148 bp.
Es un hecho extensamente reconocido en el estado de la técnica que los marcadores genéticos microsatélites siguen un modelo de mutación "paso a paso" (Goldstein DB et al. 1999), lo que hace muy difícil que existan variantes alélicas muy alejadas de los rangos medios de la especie. En general, los rangos medios de una especie se determinan mediante el análisis de unos pocos individuos (2-3), ya que incluso en una muestra pequeña existe una probabilidad muy alta de encontrar las variantes más comunes.It is a widely recognized fact in the state of the art that microsatellite genetic markers follow a "step by step" mutation model (Goldstein DB et al . 1999), which makes it very difficult for allelic variants to be very far from the middle ranges. of the species. In general, the average ranges of a species are determined by the analysis of a few individuals (2-3), since even in a small sample there is a very high probability of finding the most common variants.
En las 85 muestras de piñones analizadas, pertenecientes a diferentes lotes comerciales o a muestras de piñones presentes en las salsas tipo pesto, se encontraron siempre las mismas variantes alélicas: 145 pb para el marcador genético Pt30204 y 115 pb para el marcador Pt15169, con lo que se pueden asignar con confianza a P. pinea. Poniendo en conjunto estas 85 muestras y 816 muestras de P. pinea procedente de poblaciones naturales (que también han resultado fijadas para las mismas variantes alélicas), la probabilidad de encontrar una variante diferente en una muestra de P. pinea con los dos marcadores indicados en la presente invención, Pt15169 y Pt30204, es de 0.000001231 [es decir, 1/(85+816) x 1/(85+816)], es decir aproximadamente una entre un millón.In the 85 samples of pine nuts analyzed, belonging to different commercial batches or samples of pine nuts present in pesto type sauces, the same allelic variants were always found: 145 bp for the genetic marker Pt30204 and 115 bp for the marker Pt15169 , thus can be assigned with confidence to P. pinea . Putting together these 85 samples and 816 samples of P. pinea from natural populations (which have also been fixed for the same allelic variants), the probability of finding a different variant in a P. pinea sample with the two markers indicated in The present invention, Pt15169 and Pt30204 , is 0.000001231 [ie, 1 / (85 + 816) x 1 / (85 + 816)], that is approximately one in a million.
En el análisis molecular de las 85 muestras de P. koraiensis procedentes de lotes comerciales obtenidos en origen y conservados en la colección de semillas del INIA, tampoco se obtuvo una variante alélica fuera de los rango 158-168 pb para el marcador genético Pt30204 o fuera de los rangos 133-148 pb para el caso del marcador genético Pt15169. En este caso, la probabilidad de encontrar una variante en P. koraiensis fuera de estos rangos en los dos marcadores utilizados en la presente invención, Pt15169 y Pt30204, sería de 0.0001384 (1/85 x 1/85), es decir, aproximadamente una en diez mil.In the molecular analysis of the 85 samples of P. koraiensis from commercial lots obtained in origin and preserved in the INIA seed collection, an allelic variant outside the range 158-168 bp was not obtained for the genetic marker Pt30204 or outside of ranges 133-148 bp for the case of the genetic marker Pt15169 . In this case, the probability of finding a variant in P. koraiensis outside these ranges in the two markers used in the present invention, Pt15169 and Pt30204 , would be 0.0001384 (1/85 x 1/85), that is, approximately one In ten thousand.
Por lo tanto en la presente invención se describe un método para la identificación de la especie de origen del piñón comercial o derivados del mismo, específicamente la identificación del piñón europeo (P. pinea) frente al piñón chino (P. koraiensis), basado en la utilización de marcadores genéticos del cloroplasto (Pt15169 y Pt30204) que presentan siempre una variante alélica de tamaño específico y que no varía, en el piñón europeo y de tamaño variable y mayor (que en los piñones europeos), en el caso del piñón chino.Therefore, in the present invention a method is described for the identification of the species of origin of the commercial pinion or derivatives thereof, specifically the identification of the European pinion ( P. pinea ) against the Chinese pinion ( P. koraiensis ), based on the use of genetic markers of chloroplast ( Pt15169 and Pt30204 ) that always have an allelic variant of specific size and that does not vary, in the European pinion and of variable and larger size (than in the European pinions), in the case of the Chinese pinion .
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<110> Instituto Nacional de Investigaciones y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)<110> National Institute of Agricultural and Food Research and Technology (INIA)
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<120> MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN DEL ORIGEN DE LOS PIÑONES COMERCIALES<120> METHOD FOR THE IDENTIFICATION OF ORIGIN OF COMMERCIAL SPROCKETS
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<130> P-03008<130> P-03008
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<170> PatentIn version 3.5<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence
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<220><220>
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<223> Cebador directo 5'-3' Pt30204 <223> Direct primer 5'-3 ' Pt30204
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<212> DNA<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence
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<223> Cebador inverso 3'-5' Pt30204 <223> Reverse primer 3'-5 ' Pt30204
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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence
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<223> Cebador directo 5'-3' Pt15169 <223> Direct primer 5'-3 ' Pt15169
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