ES2349611B2 - Procedimiento para detectar la sensibilidad de los microorganismos a quitosano. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para detectar la sensibilidad de los microorganismos a quitosano.
Método de detección de la sensibilidad de los microorganismos, preferiblemente hongos, al compuesto quitosano y método para modificar dicha sensibilidad. Estos métodos pueden aplicarse a la obtención o selección de hongos más resistentes o más sensibles a este compuesto. El método de detección de la sensibilidad comprende: analizar el perfil de ácidos grasos, poliinsaturados, saturados y monoinsaturados, de la membrana plasmática del microorganismo, y asociar el perfil de ácidos grasos obtenido con un fenotipo sensible a quitosano, el cual se caracteriza por presentar unos niveles mayores de ácidos grasos poliinsaturados que de ácidos grasos saturados y monoinsaturados. El método de modificación de la sensibilidad a quitosano comprende modificar la fluidez de la membrana plasmática del microorganismo, preferiblemente mediante la administración de quitosano en combinación con al menos un compuesto que modifique la fluidez de la membrana plasmática, o mediante la inducción de mutaciones en genes que codifican para enzimas desaturasas de ácidos grasos.

Description

Procedimiento para detectar la sensibilidad de los microorganismos a quitosano.
La presente invención se refiere a un método de detección de la sensibilidad de los hongos al compuesto quitosano y a un método para modificar dicha sensibilidad. Estos métodos pueden aplicarse a la obtención o selección de hongos más resistentes o más sensibles a este compuesto.
Estado de la técnica anterior
El quitosano es un polímero formado por subunidades de \beta-1-4-glucosamina, un derivado parcialmente desacetilado de la quitina, que posee efectos inhibidores del crecimiento de hongos y bacterias, pero no de células de mamífero. Estas propiedades lo convierten en un compuesto antibiótico idóneo para su aplicación en medicina y en la industria alimentaria (Rabea E.I., et al., 2003, BioMacromolecules 4, 1458-1465), aunque también es de utilidad para otros fines, como por ejemplo, para la inducción de la esporulación en hongos empleados como agentes del control biológico (WO2008102044 A1); o para controlar las plagas y enfermedades que afectan a plantas de horticultura y agricultura (US005374627 A), entre otros.
El quitosano ejerce su actividad antibiótica a través del daño en la membrana plasmática de bacterias y hongos, como Saccharomyces cerevisiae y hongos filamentosos (Zakrzewska, A., et al., 2005, Eukaryotic Cell 4:4, 703-715). Se ha sugerido que esto ocurre mediante la interacción de los grupos amino con carga positiva del quitosano con las cargas negativas de los fosfolípidos de la membrana plasmática (El Ghaouth, A. and Azul, J., 1992, Mycological research 96, 769-773).
Las membranas plasmáticas están compuestas principalmente por lípidos, asociados a proteínas y carbohidratos (en forma de glicolípidos y glicoproteínas), y su fluidez depende del tipo de ácidos grasos presentes, en concreto de la longitud de la cadena hidrocarbonada y del grado de insaturación, aunque también del nivel de esteroles y de la naturaleza de otros lípidos constituyentes. En el caso de los hongos, los ácidos grasos son los mismos para todos los hongos, sin embargo, los niveles de cada uno de ellos varía entre las distintas especies.
Los perfiles de los ácidos grasos celulares totales (Haack, S.K., et al., 1994, Applied and Environmental Microbiology 60, 2483-2493) se han utilizado normalmente para estimar biomasa microbiana y para obtener información de la diversidad y del estado nutricional de los microorganismos. El potencial del análisis de los ácidos grasos como herramienta taxonómica para hongos también ha recibido especial atención en estudios recientes (Kaur, A., et al., 2005, Current Science 89, 1103-1112). Estos estudios han demostrado que la comparación de los ácidos grasos es una medida robusta de similitud a nivel inferior a familia.
La sensibilidad de los hongos a quitosano es variable entre los distintos grupos de hongos, siendo más sensibles los hongos fitopatógenos, que los hongos nematófagos y entomopatógenos empleados como agentes de control biológico (Palma-Guerrero, J., et al., 2008, Journal of Applied Microbiology 104, 541-553).
Diversos trabajos se basan en el estudio del efecto de determinadas mutaciones sobre la sensibilidad a quitosano en la levadura S. cerevisiae. Así, la eliminación de genes que codifican proteínas implicadas en el mantenimiento de la integridad de la membrana plasmática así como diferentes formas de estrés de la membrana, conducen a un aumento en la sensibilidad a quitosano. Otros grupos de hongos sensibles a quitosano son aquellos que portan deleciones en genes implicados en la vía de señalización HOG (high-osmolarity glycerol). Se ha demostrado que las células expuestas a condiciones hipertónicas son ligeramente más resistentes a quitosano, mientras que las condiciones hipotónicas sensibilizan a las células frente al mismo. Deleciones en genes implicados en la síntesis y procesamiento de RNA, en la organización del citoesqueleto de actina, en la N-glicosilación de proteínas, en la síntesis de ergosterol, en la endocitosis o en la formación de la pared celular también se han asociado con un aumento en la sensibilidad al compuesto. Por otro lado, el empleo de drogas como la tunicamicina, miconazol y estaurosporina en combinación con el quitosano, provoca asimismo sensibilidad a este compuesto. También la exposición de las células a 37ºC, temperatura a la que se cree que aumenta la fluidez de la membrana, induce sensibilidad a quitosano (Zakrzewska, A., et al., 2007, Eukaryotic Cell 6:4, 600-608).
Pero no sólo se ha tratado de modificar la sensibilidad a quitosano en levaduras. En bacterias Gram negativas la deleción de genes que intervienen en la ruta de síntesis del ácido teicoico y lipoteicoico, conlleva un aumento en la resistencia a quitosano, debido a la disminución de las cargas negativas en la pared celular (Raafat, D., et al., 2008, Applied and Environmental Microbiology 74:12, 3764-3773).
No obstante, estos estudios de alteración de la sensibilidad a quitosano están encaminados hacia la elucidación de los efectos del quitosano sobre los microorganismos y su mecanismo de acción, así como a la identificación de los genes y procesos celulares implicados en dicha sensibilidad, sin llegar a proponer un método de detección de la misma.
Debido a la variabilidad en la vulnerabilidad de los microorganismos a quitosano y a las múltiples aplicaciones de este compuesto antibiótico, es necesario disponer de un método que permita determinar la sensibilidad o resistencia de los mismos.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona un método de detección de la sensibilidad de los hongos al compuesto quitosano y un método para modificar dicha sensibilidad.
Analizando los componentes que determinan la fluidez de la membrana plasmática, en concreto los ácidos grasos, de hongos resistentes y sensibles a quitosano, se ha observado un patrón diferencial entre ambos grupos, lo que ha permitido establecer una asociación entre el perfil de ácidos grasos obtenidos y la resistencia o sensibilidad del microorganismo. De manera que, dependiendo de las cantidades de determinados ácidos grasos, poliinsaturados, saturados y monoinsaturados, se puede clasificar a los hongos en sensibles o resistentes a quitosano.
Ya que la susceptibilidad a este compuesto está relacionada con la composición de ácidos grasos de la membrana del hongo, modificando dicha composición o, en general, la fluidez de la membrana plasmática, es posible alterar dicha susceptibilidad.
Por lo tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un método de detección de la sensibilidad a quitosano en microorganismos, de ahora en adelante "primer método de la invención", que comprende:
a.
analizar el perfil de ácidos grasos de la membrana plasmática del microorganismo, y
b.
asociar el perfil de ácidos grasos obtenido en el paso (a) con un fenotipo sensible a quitosano.
En la presente descripción se entiende por "microorganismo" cualquier ser vivo perteneciente al reino Bacteria o al reino Fungi, es decir, bacterias y hongos, entendiéndose como "hongo" tanto hongos filamentosos (mohos) como hongos levaduriformes (levaduras).
El quitosano interacciona con la membrana del hongo para ejercer sus efectos inhibitorios sobre el crecimiento, al igual que ocurre en el caso de otros microorganismos, como es el caso de las bacterias. Por ello, mediante el análisis de los componentes que determinan la fluidez de la membrana de bacterias, y más concretamente, de los ácidos grasos que las componen, sería posible establecer una relación entre la sensibilidad al quitosano y un determinado perfil de ácidos grasos, como en el caso de los hongos. En base a esto, aunque los ejemplos de la presente invención pongan de manifiesto la efectividad del método de detección de sensibilidad a quitosano y del método de modificación de dicha sensibilidad en hongos, también podría ser posible aplicarlos a las bacterias.
Se entiende por "perfil de ácidos grasos" la composición y cantidad de cada tipo de ácidos grasos que presenta la membrana plasmática del microorganismo. Los ácidos grasos son moléculas formadas por una larga cadena de átomos de carbono y de hidrógeno, de estructura lineal, con un número par de átomos de carbono, y en un extremo un grupo carboxilo. Su fórmula química es CH_{3}(CH_{2})_{m}COOH, (donde m indica la cantidad de átomos de carbono que forman la cadena hidrocarbonada, que pueden ser entre 4 y 35). Los ácidos grasos difieren entre sí por su longitud y por el número y posiciones de enlaces doble entre carbonos consecutivos (C=C). Estos ácidos grasos que forman parte de las membranas plasmáticas pueden ser, pero sin limitarnos, saturados, insaturados, monoinsaturados o poliinsaturados.
En el primer método de la invención es posible discriminar entre el fenotipo sensible y el resistente conociendo los perfiles de ácidos grasos poliinsaturados, monoinsaturados y saturados. Por ello, en una realización preferida de este aspecto de la invención, los ácidos grasos son ácidos grasos poliinsaturados, saturados y monoinsaturados; y en una realización más preferida, el microorganismo es un hongo.
Los "ácidos grasos poliinsaturados" son aquellos que presentan series n-2 a n-6 (donde n es la posición en la que se encuentran los dobles enlaces), cuyos dobles enlaces se encuentran separados por un carbono, es decir, formando un sistema dieno no conjugado. Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados podrían ser, sin limitarnos, el ácido linoleico (18:2 n-6), el linolénico (18:3 n-3), el araquidónico (C 20:4 n-6) o el docosahexaenoico (C 22:6 n-3). En los hongos, los ácidos grasos poliinsaturados presentes en la membrana son el linoleico y el linolénico. Por lo tanto, en otra realización preferida de este primer aspecto de la invención, los ácidos grasos poliinsaturados son: ácido linoleico o ácido linolénico.
Los "ácidos grasos saturados" son aquellos que poseen un enlace simple entre cada par de átomos de carbonos (C-C-C-C), y todos los átomos de carbono (menos el terminal) están unidos a dos átomos de hidrógeno, es decir, que están "saturados" de hidrógeno. La longitud de la cadena va desde cuatro carbonos hasta treinta y cinco, aunque los más comunes son los de 14, 16 y 18 átomos de carbono. Dada su estructura, los ácidos grasos saturados son sustancias extremadamente estables desde el punto de vista químico. Ejemplos de ácidos grasos saturados podrían ser, sin limitarnos, el ácido butírico (C 4:0), el láurico (C 12:0), el mirístico (C 14:0), el palmítico (C 16:0) o el esteárico (C 18:0). En los hongos, los ácidos grasos saturados presentes en la membrana son el palmítico y el esteárico. Por lo tanto, en otra realización preferida, los ácidos grasos saturados son: ácido palmítico o ácido esteárico.
Los "ácidos grasos monoinsaturados" son aquellos que tienen en la cadena un único doble enlace, es decir, una sola insaturación. Ejemplos de ácidos grasos monoinsaturados podrían ser, sin limitarnos, el ácido oleico (C 18:1 n-9) o el erúcico (C 22:1 n-9). En los hongos, de los ácidos grasos monoinsaturados, el único presente en las membranas es el oleico. Por lo tanto, en otra realización preferida, el ácido graso monoinsaturado es el ácido oleico.
Para comparar perfiles de ácidos grasos entre muestras según el número de instauraciones se utiliza el "índice de instauración", el cual indica el número de dobles enlaces de una grasa según las proporciones de sus ácidos grasos. Es un índice ampliamente utilizado, y se calcula multiplicando el porcentaje de cada ácido graso (relativo a todos los ácidos grasos presentes en la muestra) por el número de doble enlaces en él, y sumando los resultados para todos los ácidos grasos identificados en la muestra (Thompson, P.A., et al., 1992, Journal of Phycology 28, 488-497).
Analizando el perfil de los ácidos grasos se pueden obtener las relaciones entre los diferentes tipos de ácidos grasos presentes en la membrana. Este análisis se puede llevar a cabo por métodos conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante el empleo de cromatógrafos de gases o de resonancia magnética nuclear (RMN).
El análisis de la composición de ácidos grasos de la membrana de hongos de los que previamente se conocía su resistencia o sensibilidad, ha permitido establecer un perfil de ácidos grasos para cada uno de los fenotipos. Así, los hongos sensibles a quitosano se asocian con niveles más elevados de ácidos grasos poliinsaturados, preferiblemente de ácido linoleico y/o de ácido linolénico, que de ácidos grasos saturados y monoinsaturados, lo cual conlleva un índice de instauración más alto que el de los hongos resistentes, que a su vez determina una membrana plasmática más fluida; mientras que los hongos resistentes a quitosano se asocian con niveles mayores de ácidos grasos saturados, preferiblemente de ácido palmítico y/o esteárico, y monoinsaturados que de ácidos grasos poliinsaturados, con una reducción significativa, y en ocasiones ausencia, de ácido linolénico y de ácido linoleico, lo cual conlleva un índice de instauración más bajo que el de los hongos sensibles, que a su vez determina una membrana plasmática poco fluida. Por tanto, en otra realización preferida del primer método de la invención, el fenotipo sensible se asocia con unos niveles mayores de ácidos grasos poliinsaturados que de ácidos grasos saturados y monoinsaturados, y por tanto el fenotipo sensible muestra un mayor índice de insaturación.
La fluidez de la membrana puede variar con la composición química de sus componentes. Así, generalmente, la menor longitud o la mayor cantidad de enlaces insaturados de las cadenas de ácidos grasos, hace que las membranas sean más fluidas. Aunque también existen otros componentes presentes en las membranas que influyen en su fluidez, como pueden ser los esteroles o la naturaleza de otros lípidos constituyentes. La disminución de la temperatura también disminuye la fluidez de la membrana. Por tanto, las células podrían alterar la fluidez de sus membranas modificando su composición química. Por ejemplo, algunas bacterias y hongos son capaces de aumentar la concentración de ácidos grasos insaturados (dobles enlaces) a temperaturas bajas, mientras que cuando suben los cambian por ácidos grasos saturados.
Ya que los componentes determinantes de la fluidez de la membrana plasmática, y en concreto el perfil de ácidos grasos, están directamente relacionados con la sensibilidad de los microorganismos, preferiblemente hongos, a quitosano, es posible modificar dicha sensibilidad alterando la fluidez de la membrana, de manera que aumentado la fluidez aumenta la sensibilidad a quitosano y viceversa. Por tanto, un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de modificación de la sensibilidad a quitosano en microorganismos, de ahora en adelante "segundo método de la invención", que comprende modificar la fluidez de la membrana plasmática del microorganismo. La modificación de la fluidez de la membrana se puede realizar por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante cambios en la temperatura exógena, mediante la administración al microorganismo de formulaciones modificadas del quitosano, o de composiciones que comprendan quitosano y otro/s compuesto/s, capaces de modificar dicha fluidez, como por ejemplo, pero sin limitarnos, el DMSO (dimetil sulfóxido, de fórmula química CH_{3}SOCH_{3}) o el Alcohol Bencílico, que rigidizan y fluidizan la membrana respectivamente, o mediante sustancias que aumenten la actividad de las enzimas desaturasas. Otra alternativa es la inducción de mutaciones de sobreexpresión o silenciamiento de genes implicados en las rutas de síntesis de los componentes que determinan la fluidez, como por ejemplo, pero sin limitarnos, genes implicados en la ruta de síntesis de ácidos grasos de la membrana o de los esteroles.
Por tanto, en una realización preferida de este segundo aspecto de la invención, la modificación de la fluidez de la membrana se realiza mediante la administración de quitosano en combinación con al menos un compuesto que modifique la fluidez de la membrana plasmática. En una realización más preferida, el compuesto que modifica la fluidez de la membrana es: DMSO o Alcohol Bencílico. La administración combinada de quitosano con uno de estos compuestos podría realizarse de manera conjunta o secuencial.
En otra realización preferida, la modificación de la fluidez de la membrana se realiza mediante la inducción de mutaciones en genes que codifican para enzimas desaturasas de ácidos grasos. En otra realización preferida el microorganismo es un hongo, en una realización más preferida la enzima desaturasa es: oleoil-\Delta12 desaturasa o linoleoil-n3 desaturasa y en una realización aún más preferida la mutación es una deleción.
En la presente descripción se entiende por "mutación" cualquier cambio en la secuencia de nucleótidos del ADN, incluyendo, pero sin limitarnos, sustituciones, inserciones o deleciones de bases, inversiones, duplicaciones, adiciones, deleciones, translocaciones, poliploidía, aneuploidía, etc., ya sean de cambio, de pérdida o de ganancia de función génica. Estas modificaciones se pueden llevar a cabo mediante técnicas de ingeniería genética conocidas por cualquier experto en la materia.
Una "enzima desaturasa" es aquella que presenta funciones en la producción de los ácidos grasos insaturados y poliinsaturados y, por tanto, en el mantenimiento de las características funcionales de las membranas y sus componentes. Son enzimas de membrana capaces de introducir un doble enlace entre el grupo carbonilo y una insaturación preexistente en los ácidos grasos que forman parte de los fosfolípidos. La inhibición de la expresión de los genes que codifican para estas enzimas, lo cual puede realizarse mediante la inducción de mutaciones de pérdida de función génica, conduce a una disminución de los ácidos grasos poliinsaturados (a una membrana plasmática menos fluida) y a un aumento en la resistencia a quitosano, como se demuestra en los ejemplos de la presente invención. La sobreexpresión de estos genes conduciría, por tanto, a un aumento en la cantidad de ácidos grasos poliinsaturados (a una membrana plasmática más fluida) y a una mayor sensibilidad a quitosano. En el caso de los hongos existen, pero sin limitarnos, dos enzimas desaturasas: oleoil-\Delta12 desaturasa o linoleoil-n3 desaturasa.
En la presente descripción se entiende por "deleción" la mutación que implica, pero sin limitarnos, la pérdida de un fragmento de ADN de un cromosoma, de un gen completo, de un fragmento de un gen o de uno o varios nucleótidos de un gen.
El mutante de Neurospora crassa que porta una mutación de deleción del gen que codifica para la enzima oleoil-\Delta12 desaturasa empleado en el segundo método de la invención, es conocido por cualquier experto en la materia. Por otro lado, otro mutante de Neurospora crassa porta una mutación de deleción del gen, de un fragmento del gen o de uno o varios nucleótidos del gen correspondiente a la enzima linoleoil-n3 desaturasa (GenBank accession number XP_957857, NCU09497.2), mutante que también se puede realizar por métodos conocidos en el estado de la técnica.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Descripción de las figuras
Fig. 1. Representa el efecto de 1 mg/mL de quitosano sobre el crecimiento de Neurospora crassa . Fenotipo silvestre (WT) y dos fenotipos mutantes: N. crassa 16054, mutante para la enzima oleoil-\Delta12 desaturasa encargada de producir ácido linoleico (18:2) a partir de ácido oleico (18:1), y N. crassa 18505, mutante para la enzima linoleoil-n3 desaturasa encargada de producir ácido linolénico (18:3) a partir de ácido linoleico (18:2). Los asteriscos (**) indican diferencia significativa con el WT.
Ejemplos
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto efectividad del método de detección de la sensibilidad de los hongos al compuesto quitosano y del método para modificar dicha sensibilidad. Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
Ejemplo 1
Perfil de ácidos grasos de hongos sensibles y resistentes a quitosano
Se analizan los siguientes hongos para establecer una relación entre la composición de ácidos grasos de sus membranas y la sensibilidad a quitosano:
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Pochonia chlamydosporia (P.c.), hongo nematófago, aislado P.c.123 (Sevilla, aislado de Heterodea avenae). Resistente a quitosano.
-
Beauveria bassiana (B.b.), hongo entomopatógeno, aislado B.b.203 (Elche, Alicante, aislado de Rhynchophorus ferrugineus). Resistente a quitosano.
-
Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (Forl), hongo fitopatógeno (proporcionado por el Dr. R. González, SIA, Zaragoza). Sensible a quitosano.
-
Neurospora crassa (N.c.), fenotipo silvestre, 74-OR23-IVA (FGSC #2489), hongo saprofito. Sensible a quitosano.
Se inoculan 10 matraces de 250 mL, conteniendo 50 mL de medio PBS (caldo de patata con dextrosa, Becton Dickinson) al 1% con 4 discos de agar de 5 mm de diámetro, con hongo creciendo activamente procedente del borde de la colonia (de 14 días para P.c., B.b. y Forl y 2 días para N.c.) en medio CMA (agar harina de maíz). Tras 5 días de crecimiento a 25ºC con agitación (100 rpm) se filtran los matraces usando bomba de vacío y se liofiliza el micelio resultante, el cual se emplea para el análisis de ácidos grasos.
Tras homogeneizar los micelios individualmente, se determina la composición de ácidos grasos de la fracción lipídica total por extracción de grasa siguiendo el método de Folch (Folch et al., 1957, Journal of Biological Chemistry 226, 497-509), con una mezcla de cloroformo y metanol (Sigma, St. Louis, Mo, USA) en proporciones 1:1 y 2:1 para la primera y la segunda extracción respectivamente.
Las muestras se analizan siguiendo el método de Stoffel (Stoffel et al., 1959, Anal Chemistry 31, 307-308) por cromatografía gas-líquido usando una columna de capilaridad de sílica fusionada flexible SP^{TM} 2560 (100 mm de longitud, 0,25 mm de diámetro interno, y película de 0,2 \mum de grosor) en un cromatógrafo de gases Hewlett-Packard 5890 (Waldbronn, Alemania). La temperatura del horno se programa a 140ºC durante 5 minutos, con un ratio de subida de 4ºC por minuto hasta 230ºC, seguido de un ratio de 1ºC por minuto hasta 240ºC, la cual se mantiene por 6 minutos. El inyector y el detector de ionización se establecen a 250ºC. Se usa helio como gas carrier a una presión de 290 Kpa, y se identifican los picos por comparación de sus tiempos de retención con standards comprados en Sigma (St. Louis, Mo, USA).
Las concentraciones de los ácidos grasos se calculan en porcentaje respecto al contenido total. El "índice de insaturación" de cada muestra se calcula multiplicando el porcentaje de cada ácido graso (respecto a todos los ácidos grasos presentes en la muestra) por el número de dobles enlaces en él y sumando los resultados para todos los ácidos grasos identificados en la muestra. El resultado obtenido se muestra en la siguiente tabla, donde sólo se representan los valores obtenidos para los ácidos grasos mayoritarios, pero los porcentajes tienen en cuenta todos los ácidos grasos observados en la muestra.
TABLA 1 Perfiles de ácidos grasos de dos hongos sensibles y dos hongos resistentes quitosano. Porcentajes \pm Desviación Estándar. Distinto superíndice indica diferencia significativa (p<0.05) entre hongos para cada ácido graso. Cada valor representa la media de tres réplicas
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En la tabla 1 se puede observar que los hongos resistentes a quitosano (P.c. y B.b.) muestran niveles más altos de ácidos grasos saturados (C16:0 y C18:0) y monoinsaturados (C18:1 n9), y niveles más bajos de ácidos grasos poliinsaturados (C18:2 n-6 y C18:3 n-3), que los hongos sensibles a quitosano (N.c. y Forl). Siendo los valores de índice de instauración para N.c. (148 \pm 0,7) y Forl (157 \pm 1,7) significativamente mayores que los de los hongos resistentes P.c. (121 \pm 7,8) y B.b. (111 \pm 5,1). Dado que la fluidez de las membranas está influenciada por las insaturaciones de las cadenas de hidrocarburos, los hongos sensibles a quitosano presentan membranas más fluidas que los hongos resistentes a quitosano.
Así, según su perfil de ácidos grasos los hongos se pueden clasificar de la siguiente forma:
\bullet
Hongos sensibles a quitosano: muestran niveles significativamente más altos de ácidos grasos poliinsaturados, en concreto de ácido linoleico (18:2) y ácido linolénico (18:3). Por tanto, presentan niveles más bajos de ácidos grasos saturados y monoinsaturados. Muestran mayor índice de insaturación que los hongos resistentes.
\bullet
Hongos resistentes a quitosano: los niveles de ácidos grasos poliinsaturados son menores, con una reducción significativa de ácido linoleico (18:2), y reducción, llegando a ausencia en algunos casos, de ácido linolénico (18:3). Por tanto, muestran niveles más altos de ácidos grasos saturados, y un menor índice de insaturación que los hongos sensibles.
Ejemplo 2
Efecto del quitosano sobre mutantes para desaturasas de Neurospora crassa
Se utilizan mutantes de N. crassa para enzimas desaturasas de ácidos grasos, con el fin de corroborar la relación entre los niveles de ácidos grasos insaturados y la sensibilidad a quitosano. En N. crassa existen dos enzimas implicadas en la desaturación de ácidos grasos, una enzima es la oleoil-\Delta12 desaturasa, enzima monofuncional encargada de producir ácido linoleico (C18:2) a partir de ácido oleico (C18:1) y la otra enzima es la linoleoil-n3 desaturasa, una enzima n3-desaturasa capaz de producir ácido linolénico (C18:3) a partir de ácido linoleico (C18:2).
Los mutantes de N. crassa para los dos genes se solicitan al Fungal Genetics Stock Center (Kansas City, Missouri, USA). El mutante para la enzima oleoil-\Delta12 desaturasa está disponible (llamado FGSC16054), el mutante para la linoleoil-n3 desaturasa lo realizaron tras la petición de los inventores (llamado FGSC18505).
El quitosano utilizado es el denominado T8s, (Marine BioProducts GMBH, Alemania). Se trata de un quitosano con un peso molecular de 70 KDa, y un grado de desacetilación del 79,6%. Para utilizar experimentalmente el quitosano, previamente debe disolverse. Para ello, el quitosano en polvo se disuelve con Ácido Clorhídrico 0,25 M y se ajusta el pH a 5,6 con Hidróxido de Sodio 1 M. La disolución de quitosano se somete a diálisis en agua destilada a 4ºC, con dos cambios al día, a lo largo de tres días, para eliminar las sales presentes en el quitosano, o formadas al ajustar el pH de la disolución en HCI a 5,6 con NaOH (Benhamou, N., et al., 1994, Phytopathology 84, 1432-1444). Tras la diálisis se comprueba que el pH del quitosano se mantiene estable a 5,6. Finalmente, el quitosano disuelto se somete a esterilización mediante vapor húmedo en autoclave.
El medio de cultivo suplementado con quitosano se realiza preparando el medio de cultivo PDA (agar dextrosa patata, Oxoid). Una vez esterilizado con vapor húmedo en autoclave (20 minutos a 120ºC), se añade el volumen de quitosano necesario para obtener la concentración de quitosano 1 mg/mL. Por último, se dispensa el medio de cultivo en placas Petri de plástico estériles de 9 cm de diámetro. Como control se utilizan placas conteniendo PDA sin quitosano.
Las placas con el medio descrito se inoculan en el centro con discos de 5 mm tomados del borde de colonias de los hongos creciendo activamente (de 2 días para los 3 hongos) en medio CMA, y se incuban a 25ºC con luz. Se realizan tres réplicas por tratamiento.
Pasadas 10 horas se toman las medidas de crecimiento radial, se calculan los porcentajes de crecimiento de los hongos en medio con quitosano respecto al medio control, y se comparan los hongos mutantes con el silvestre (véase Figura 1).
En la figura 1 se puede observar que el mutante para la enzima oleoil-\Delta12 desaturasa (16054) muestra inhibición por el quitosano significativamente menor que el silvestre (WT), mientras que el mutante para la enzima linoleoil-n3 desaturasa (18505) muestra la misma sensibilidad a quitosano que el control.
Para confirmar que el cambio de sensibilidad en los mutantes es debido a una disminución en los ácidos grasos poliinsaturados, se miden los niveles de ácidos grasos de ambos mutantes, usando el mismo protocolo descrito en el ejemplo anterior. El resultado de los perfiles de ácidos grasos de N. crassa silvestre y de los dos mutantes puede observarse en la tabla 2.
TABLA 2 Perfiles de ácidos grasos de N. crassa silvestre (WT) y de los mutantes 16054 y 18505. Porcentajes \pm Desviación Estándar
2
Como se puede observar en la tabla 2, el mutante 16054, en el cual se ha delecionado el gen para la oleoil-\Delta12 desaturasa, no produce ácido linoleico (C18:2), y por tanto tampoco se produce ácido linolénico (C18:3), y se acumula gran cantidad de ácido oleico (18:1), mostrando un índice de instauración de 89 \pm 1,2, mientras que en el WT es de 148 \pm 0,7. El mutante 18505, en el que se ha delecionado la enzima linoleoil-n3 desaturasa, no muestra ácido linolénico, pero muestra mayores niveles de ácido linoleico (C18:2), y por tanto un índice de instauración (133 \pm 1,9) mayor que el mutante 16054, lo cual explica que su sensibilidad no sea significativamente diferente al WT.
De acuerdo con estos resultados, el aumento de resistencia a quitosano en el mutante 16054 es debido a la disminución de ácidos grasos poliinsaturados. Quedando así demostrado que se puede modificar la sensibilidad de los hongos a quitosano modificando la fluidez de la membrana plasmática.

Claims (14)

1. Método de detección de la sensibilidad a quitosano en microorganismos que comprende:
a.
analizar el perfil de ácidos grasos de la membrana plasmática del microorganismo, y
b.
asociar el perfil de ácidos grasos obtenido en el paso (a) con un fenotipo sensible a quitosano.
2. Método de detección de la sensibilidad a quitosano según la reivindicación 1, donde los ácidos grasos son poliinsaturados, saturados y monoinsaturados.
3. Método de detección de la sensibilidad a quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde el microorganismo es un hongo.
4. Método de detección de la sensibilidad a quitosano según la reivindicación 3, donde los ácidos grasos poliinsaturados son: ácido linoleico o ácido linolénico.
5. Método de detección de la sensibilidad a quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, donde los ácidos grasos saturados son: ácido palmítico o ácido esteárico.
6. Método de detección de la sensibilidad a quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde el ácido graso monoinsaturado es el ácido oleico.
7. Método de detección de la sensibilidad a quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el fenotipo sensible se asocia con unos niveles mayores de ácidos grasos poliinsaturados que de ácidos grasos saturados y monoinsaturados.
8. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano en microorganismos que comprende modificar la fluidez de la membrana plasmática del microorganismo.
9. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano según la reivindicación 8, donde la modificación de la fluidez de la membrana se realiza mediante la administración de quitosano en combinación con al menos un compuesto que modifique la fluidez de la membrana plasmática.
10. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano según la reivindicación 9, donde el compuesto que modifica la fluidez de la membrana es: DMSO o Alcohol Bencílico.
11. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano según la reivindicación 8 donde la modificación de la fluidez de la membrana se realiza mediante la inducción de mutaciones en genes que codifican para enzimas desaturasas de ácidos grasos.
12. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde el microorganismo es un hongo.
13. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano en microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, donde la enzima desaturasa es: oleoil-\Delta12 desaturasa o linoleoil-n3 desaturasa.
14. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano en microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 donde la mutación es una deleción.
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