ES2349544T3 - Control de la expresión génica dependiente de receptores de andrógenos inhibiendo la actividad de amina oxidasa de la demetilasa lisina-específica (lsd1). - Google Patents
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Abstract
Uso de al menos un inhibidor de las amina oxidasas seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de pargilina, clorgilina y deprenil para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata, donde el inhibidor de las amina oxidasas que es al menos uno inhibe a la LSD1 en complejo con AR y por consiguiente redunda en una disminución de la expresión génica AR-dependiente.
Description
Control de la expresión génica dependiente de
receptores de andrógenos inhibiendo la actividad de amina oxidasa de
la demetilasa lisina-específica (LSD1).
La presente invención se refiere al uso de al
menos un inhibidor de las amina oxidasas seleccionado de entre los
miembros del grupo que consta de pargilina, clorgilina y deprenil
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del
cáncer de próstata, donde el inhibidor de las amina oxidasas que es
al menos uno inhibe a la LSD1 en complejo con AR y por consiguiente
redunda en una disminución de la expresión génica
AR-dependiente. La invención también se refiere a
métodos de ensayo que permiten poner a prueba a los moduladores de
la LSD1 con respecto a su capacidad para modular la función de
LSD1, y preferiblemente para inhibirla.
El receptor de andrógenos (AR) es un miembro de
la familia de receptores de hormonas esteroides de factores de
transcripción que regulan diversas funciones biológicas entre las
cuales se incluyen el crecimiento y la diferenciación celular, el
desarrollo, la homeostasis y varias funciones orgánicas en un
mamífero, y en particular en un humano. Uniendo ligandos adecuados
tales como andrógenos al dominio de unión de ligandos, son
activadas funciones del AR que son esenciales para la
diferenciación, el desarrollo y el mantenimiento de los órganos
reproductores masculinos o femeninos y de órganos no reproductores,
(tales como por ejemplo la próstata o las mamas).
La regulación transcripcional por medio de
receptores nucleares tales como el receptor de andrógenos (AR)
implica una interacción con múltiples factores que actúan de manera
tanto secuencial como combinatoria para reorganizar la
cromatina^{1}. Ocupa un lugar central en esta reorganización
dinámica la modificación de las histonas nucleares. Las colas
N-terminales de las histonas son sometidas a varias
modificaciones covalentes tales como acetilación, fosforilación,
ubiquitinación y metilación por específicas enzimas^{2}
modificadoras de la cromatina. La metilación de la histona en
residuos de lisina específicos está vinculada tanto con la
activación^{2} como con la represión transcripcional. Al buscarse
nuevas proteínas que interactúan con el AR, se comprobó que la
demetilasa 1 lisina-específica (LSD1)^{3}
es un ejemplo de las enzimas modificadoras de la cromatina.
La LSD1 contiene un dominio de SWIRM (dominio de
SWIRM = dominio de las proteínas SWI3, RSC8 y MOIRA) situado
centralmente que funciona como un putativo motivo de interacción de
proteína-proteína, y también contiene un dominio de
amina oxidasa (AO) C-terminal que alberga la
actividad de demetilasa^{3} (Fig. 1b). La LSD1 y el AR endógenos
se asocian in vivo en tejidos sensibles a los andrógenos,
tales como el testículo (Fig. 1a). Para mapear el dominio de
interacción entre la LSD1 y el AR in vitro, fueron llevados a
cabo análisis pull-down con LSD1 etiquetada y
mutantes de la misma junto con proteínas de fusión de
GST-AR. Como se muestra en la figura 1b, la LSD1 de
longitud completa, así como el dominio de SWIRM
(175-246 de LSD1) y el dominio de AO
(247-852 de LSD1) se asocian con el terminal N
(NTD), el dominio de unión de DNA (DBD), o el dominio de unión de
ligandos (LBD) del AR. En contraste con ello, ni el terminal N de la
LSD1 (1-174 de LSD1) ni el control de GST
interactúan con el AR.
El documento WO-A 02/19.964 dio
a conocer el uso del inhibidor de la MAO-B
(MAO-B = monoaminooxidasa B)
desmetil-selegelina para el tratamiento de
enfermedades neoplásicas o estados que incluyen a una serie de
tumores, incluyendo los tumores de próstata.
El documento "Y. Shi et al., Histone
Demethylation mediated by the Nuclear Amine Oxidase Homolog LSD1,
Cell 119 (2004), 941-953" se refiere a la
evidencia de que la LSD1, que es un homólogo nuclear de amina
oxidasas, funciona como una histona demetilasa y un correpresor
transcripcional desmetilando LSD1-específicamente
la histona H3 lisina 4, que está vinculada a la transcripción
activa.
Las mismas revelaciones pueden encontrarse en
los documentos "S. Kubicek et al., A crack in Histone
Lysine Methylation, Cell 119 (2004), 903 a 906" y "J. Couzin,
Long-Sought Enzyme Found - Revealing New Gene
Switch on Histones, Science 306 (2004), 2171".
Se ha descubierto ahora sorprendentemente que la
enzima desmetilante LSD1 es expresada ubicuamente en tejidos
fetales y adultos humanos y murinos (Figura 2a y datos no
ilustrados). Además se detectó también que la LSD1 se encuentra en
las mismas células (y en las mismas áreas subcelulares) donde está
situado el AR (Figuras 2c, d). En el curso de la investigación que
ha redundado en la presente invención, los anteriores (y
adicionales) hallazgos llevaron a la conclusión de que la enzima
desmetilante LSD1 puede ejercer una influencia controladora en la
expresión génica andrógeno-dependiente.
El documento "Kubicek S. and Jenuwein T., A
crack in histone lysine methylation, Cell 119 (2004),
903-6" comenta los hallazgos de Shi et
al. a los que se ha aludido anteriormente y aporta adicional
información de fondo.
El documento "Couzin J., Molecular biolog.
Long-sought enzyme found, revealing new gene switch
on histones, Science 306 (2004), 2171" resume los
descubrimientos sobre enzimas que actúan como demetilasas en las
histonas.
El documento "Chen D. et al.,
Regulation of transcription by a protein methyltransferase, Science
284 (1999), 2174-7" da a conocer la CARM1 (CARM1
= arginina metiltransferasa 1 asociada a coactivador) y su función
como coactivador secundario.
El documento "Heinlein C. and Chang C.,
Androgen receptor (AR) coregulators: an overview, Endrocr. Rev
23(2002), 175-200" da información sobre la
regulación del receptor de andrógenos.
En la siguiente descripción se explica más
ampliamente la invención haciendo referencia a las Figuras.
En las Figuras:
La Figura 1 muestra lo siguiente: (a) la LSD1
interactúa con AR y LSD1 in vivo e in vitro. (b) el
AR coinmunoprecipita con LSD1. Extractos de testículo de ratón
fueron inmunoprecipitados con un anticuerpo
\alpha-LSD1 o IgG de conejo de control. El diez
por ciento del extracto usado para la inmunoprecipitación fue
cargado como entrada. Los Western-blots fueron
decorados con anticuerpos \alpha-AR y
\alpha-LSD1. a, Fueron llevados a cabo ensayos
pull-down de GST con mutantes de LSD1 etiquetados y
las correspondientes proteínas de fusión de GST-AR
expresadas bacterialmente (KCl 150 mM/NP40 al 0,15%). Se usaron como
control proteínas GST. (NTD; dominio N-terminal,
DBD; dominio de unión de DNA, LBD; dominio de unión de
ligandos).
La Figura 2 muestra análisis de expresión de
LSD1. La expresión de mRNA de LSD1 en tejidos humanos fue examinada
mediante análisis Northern blot en un Conjunto de Expresión Tisular
Múltiple Humana (a) y un Northern blot de testículo humano (b).
(c): Coloración inmunohistoquímica de LSD1 y AR en próstata normal y
tumoral humana. Se detecta inmunorreactividad para LSD1 (A, B) y AR
(C, D) en el epitelio secretorio de células de próstata normales
(A, C, flechas) y tumorales (B, D, flechas). Todas las secciones se
tomaron de la misma muestra de prostatectomía radical. Ampliación:
250 aumentos. (d) Localización subcelular de la LSD1 y del AR
endógenos en las células de tumor de próstata LNCaP humanas. El AR
(rojo) se colocaliza con la LSD1 (verde) en el núcleo tras la
adición del agonista de AR +R1881.
La Figura 3 muestra cómo la LSD1 interactúa con
la cromatina: (a) La coloración con azul de Coomassie revela la
interacción de GST-LSD1 expresada bacterialmente con
histonas nucleares in vitro (KCl 600 mM/NP40 al 0,3%). (b):
La LSD1 etiquetada interactúa con la cola N-terminal
de histona H3 acoplada a sefarosa. Las células LNCaP fueron
incubadas con o sin R1881 (c, d, e), tratadas con o sin pargilina
(d) o transfectadas con siRNA (siRNA = ARN pequeño de
interferencia) (e). Fueron llevadas a cabo ChIP (ChIP =
inmunoprecipitación de cromatina) o Re-ChIP
(Re-ChIP = inmunoprecipitación secuencial de
cromatina) con los anticuerpos indicados. La cromatina precipitada
fue amplificada mediante PCR (PCR = reacción cadena de la
polimerasa) usando los cebadores que flanquean a la región
promotora (ARE I+II), la región central (centro) o la región
potenciadora (ARE III) del gen PSA regulado por AR. El
silenciamiento ("knockdown") de la LSD1 mediado por siRNA se
verifica mediante análisis Western blot (e, cuadro inferior) usando
anticuerpos \alpha-AR y
\alpha-LSD1.
La Figura 4 muestra cómo la LSD1 controla la
proliferación celular y la actividad transcripcional inducida por
AR. Células 293 (a, b, d, e), CV-1 (c) y LNCaP (f,
g) fueron transfectadas con los informadores
AR-dependientes indicados en presencia de plásmido
de expresión de AR (a-e). Las células fueron
tratadas con o sin R1881, pargilina, deprenil o clorgilina. La
activación de AR dependiente de ligandos e inducida por LSD1 (a, b,
c) es mediada por el dominio de AO (247-852 de
LSD1, d) y bloqueada por inhibidores de la monoamina oxidasa (e).
En las células LNCaP, la pargilina (f) y el silenciamiento de la
LSD1 mediado por siRNA bloquean la actividad del AR (g, cuadro
izquierdo). El silenciamiento de la LSD1 inhibe la proliferación de
células LNCaP inducida por R1881 (h, cuadro izquierdo). El
silenciamiento de la LSD1 se verifica mediante análisis de
inmunofluorescencia (g, cuadro derecho, flechas) y Western blot (h,
cuadro derecho) usando anticuerpos \alpha-AR y
\alpha-LSD1. Las barras representan la media +SD
(SD = desviación característica) (n \geq 5).
En un aspecto, la invención se refiere al uso de
al menos de un inhibidor de las amina oxidasas seleccionado de
entre los miembros del grupo que consta de pargilina, clorgilina y
deprenil para la fabricación de un medicamento para el tratamiento
del cáncer de próstata, donde el inhibidor de las amina oxidasas,
que es al menos uno, inhibe a la LSD1 en complejo con AR y redunda
por consiguiente en una disminución de la expresión génica
AR-dependiente.
Según la invención, se usa al menos uno de
dichos inhibidores de las amina oxidasas. Puede usarse un inhibidor
de las amina oxidasas, o bien pueden usarse varios inhibidores de
las amina oxidasas. En realizaciones preferidas de la invención, el
uso comprende a un inhibidor de las amina oxidasas. El inhibidor de
las amina oxidasas que es al menos uno es seleccionado de entre los
miembros del grupo que consta de pargilina, clorgilina y deprenil.
Ventajosamente y por lo tanto con la máxima preferencia, el
inhibidor de las amina oxidasas es pargilina.
La demetilasa lisina-específica
se indica habitualmente de manera abreviada como "LSD1". En el
sentido en el que se le utiliza en la presente memoria descriptiva
y en las reivindicaciones, el vocablo "modulando" significa un
cambio ya sea en la dirección de mejorar la actividad o bien en la
dirección de reducir la actividad. Según la invención, se prefiere
un bloqueo de la actividad de LSD1.
En una realización preferida de los usos
inventivos, la actividad de LSD1 que se modula es la actividad
desmetilante de la LSD1. Esto significa que la LSD1 ejerce una
influencia como catalizador en una reacción química donde son
eliminados grupos metilo diana en una molécula de polímero, y con
ello es efectuada toda influencia en la actividad de la molécula.
Para dar tan sólo un ejemplo, un inhibidor de las amina oxidasas
seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de
pargilina, clorgilina y deprenil puede bloquear la desmetilación de
mono- y dimetil H3-K9 durante la transcripción
inducida por andrógenos. En una adicional realización preferida de
la invención, cuando se usa al menos un inhibidor de las amina
oxidasas seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de
pargilina, clorgilina y deprenil, la actividad de demetilasa de la
LSD1 que se controla es la acción desmetilante de la LSD1 en las
marcas de histona represoras en el residuo 9 de lisina en la
histona H3 (H3-K9), y más preferiblemente en las
marcas de histona represoras en mono- y dimetil
H3-K9, incrementándose con ello la expresión génica
regulada por el AR.
En una composición preferida según la invención,
se usa un inhibidor de las amina oxidasas seleccionado de entre los
miembros del grupo que consta de pargilina, clorgilina y deprenil,
si bien es posible y puede ser ventajoso el uso de más de un
inhibidor de las amina oxidasas.
La invención también se refiere a un método de
ensayo que permite poner a prueba a los inhibidores de la LSD1 con
respecto a su capacidad para inhibir la función de LSD1, donde al
menos una sustancia química que supuestamente ejerce inhibición de
la función de LSD1 es sometida a una o varias reacciones de
desmetilación de mono- y dimetil H3-K9 donde dicha
LSD1 está implicada bajo condiciones que son similares o idénticas a
las condiciones fisiológicas.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la
expresión "capacidad para modular la función de LSD1" significa
la capacidad de una sustancia química que pretendida o
supuestamente es un modulador de la enzima demetilasa
lisina-específica (LSD1) para modular la función de
dicha enzima. La modulación puede ser una modulación iniciadora y/o
activadora, o bien puede ser una modulación desaceleradora o
desactivadora o inhibidora o incluso bloqueadora. Según el método de
ensayo de la presente invención, se prefiere una modulación
inhibidora o bloqueadora.
Como sustancias químicas, pueden ser puestas a
prueba por el método de ensayo de la presente invención básicamente
todas las sustancias químicas que pretendida o supuestamente ejerzan
una acción moduladora en la LSD1. En realizaciones preferidas de
los métodos de ensayo de la presente invención, la reacción o las
reacciones es o son una reacción o reacciones en las que la LSD1
está también implicada en su ambiente natural bajo condiciones
naturales. En otras palabras: El método de ensayo de la presente
invención hace uso de aquellas reacciones bioquímicas o reacciones
fisiológicas en las que la LSD1 está implicada al ejercer su acción
moduladora natural, p. ej. en el AR.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, se entiende
que la expresión "condiciones fisiológicas" significa unas
condiciones que le permiten a un mamífero, o específicamente a un
humano, existir y estar en aceptables condiciones de vida sin carga
indebida alguna relativa a la temperatura, a la presión, a la
acidez/basicidad, a las condiciones acuosas/de humedad de sistemas
líquidos, al contenido de oxígeno del ambiente gaseoso, etc. Tales
condiciones se aplican al método de ensayo de la presente invención
durante la fase de prueba. Según realizaciones preferidas de la
presente invención, dichas condiciones fisiológicas son condiciones
que se establecen al aplicar dicho método de ensayo y que son
similares o idénticas a las condiciones que están presentes en una o
en más de una reacción donde la LSD1 actúa bajo condiciones
fisiológicas.
Una realización preferida de la presente
invención se refiere a un método de ensayo en el que la reacción a
la que se somete la sustancia química que es al menos una, con la
finalidad de modular dicha reacción, y preferiblemente de
bloquearla, es la reacción de desmetilación, realizada por la LSD1,
en las marcas de histona represoras de mono- y dimetil
H3-K9.
Otra realización preferida de la presente
invención se refiere a un método de ensayo en el que la reacción a
la que se somete la sustancia química que es al menos una, con la
finalidad de modular dicha reacción, y preferiblemente de
bloquearla, es la reacción de superacción
ligando-dependiente e inducida por LSD1 de AR en
las células 293 o CV-1, modulando así la actividad
de AR ligando-dependiente, y preferiblemente
bloqueándola.
Una adicional realización preferida de la
presente invención se refiere a un método de ensayo en el que la
reacción a la que es sometida la sustancia química que es al menos
una, con la finalidad de modular dicha reacción, y preferiblemente
de bloquearla, es la reacción de proliferación
andrógeno-dependiente de las células LNCaP o
MCF-7, modulando así dicha proliferación celular
andrógeno-dependiente, y preferiblemente
bloqueándola.
Se describe a continuación más detalladamente la
invención.
Para examinar el patrón de expresión de la LSD1,
se llevaron a cabo análisis Northern blot. El mRNA de LSD1
es expresado ubicuamente en tejidos fetales y adultos humanos y
murinos (Fig. 2a y datos no ilustrados) como un transcripto de 3,3
kb (Fig. 2b). Para investigar la localización de la LSD1 en la
próstata, se usaron análisis inmunohistoquímicos. Como se muestra
en la figura 2c, la LSD1 es detectada en el epitelio de la próstata
normal y en células tumorales. Como aspecto importante, estas
células también expresan AR (Fig. 2c), indicando que la LSD1 y el
AR están colocalizados.
A continuación fue estudiada por
inmunofluorescencia (Fig. 2d) la localización subcelular de la LSD1
y del AR endógenos en células LNCaP de cáncer de próstata humano. La
LSD1 está presente en el núcleo en ausencia y en presencia del
agonista de AR R1881. La adición de R1881 redunda en una
colocalización nuclear de AR y LSD1. Tomados juntamente, los datos
demuestran que la LSD1 es una proteína nuclear que se colocaliza con
el AR en tejidos sensibles a los andrógenos tales como la
próstata.
\newpage
Puesto que se descubrió que la LSD1 se asocia
con la cromatina y desmetila la H3-K4 in
vitro^{3}, se examinó si la LSD1 interactúa directamente con
las histonas nucleares. Los análisis de interacción demostraron una
asociación física con histonas nucleares in vitro (Fig. 3a).
Además, los análisis demuestran que la LSD1 interactúa con la cola
N-terminal de la histona H3 (Fig. 3b).
Para determinar si la LSD1 y el AR se asocian
con la cromatina in vivo, células LNCaP tratadas con R1881
fueron sometidas a inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Como se
muestra en la figura 3c, DNA genómico correspondiente a los
elementos de respuesta a andrógenos (ARE I + II y ARE III) que están
situados en el promotor y el potenciador del gen del antígeno
específico de la próstata (PSA), fue respectivamente
inmunoprecipitado de manera ligando-dependiente con
anticuerpos \alpha-AR. El DNA genómico derivado de
una región entre el potenciador y el promotor no fue enriquecido,
demostrando así especificidad (Fig. 3c). La LSD1 se asocia con la
cromatina tanto en presencia como en ausencia de ligando (Fig.
3c).
Para demostrar que la LSD1 y el AR forman
complejos ligando-dependientes sobre AREs
cromatinizados, células LNCaP tratadas con agonistas fueron
sometidas a inmunoprecipitación secuencial de cromatina
(Re-ChIP), primero con un anticuerpo
\alpha-AR y a continuación con anticuerpos
\alpha-LSD1 o IgG \alpha de conejo de control.
Es importante señalar que ambas regiones con contenido de ARE fueron
enriquecidas, demostrando que la LSD1 y el AR forman un complejo
ligando-dependiente sobre cromatina (Fig. 3c).
Puesto que la expresión del gen del PSA es
inducida por el AR de manera agonista-dependiente,
fueron analizados los niveles de metilación de marcas de histona
represoras tales como la histona 3 en la lisina 9
(H3-K9), la histona 3 en la lisina 27
(H3-K27) y la histona 4 en la lisina 20
(H4-K20). La transcripción inducida por andrógenos
va acompañada por una fuerte disminución de mono-, di- y trimetil
H3-K9 en el promotor del PSA (Fig. 3d). Puesto que
la LSD1 es una AO que cataliza la desmetilación, fue llevada a cabo
una prueba para determinar si inhibidores de las monoamina oxidasas
tales como la pargilina
(N-metil-N-2-propinil-bencilamina),
la clorgilina
(N-metil-N-propargil-3-(2,4-diclorofenoxi-)propilamina)
o el deprenil (= seregelina;
(R)-(-)-N,2-dimetil-N-2-propinilfenetilamina)
podrían interferir en la función de LSD1. Como aspecto importante,
la pargilina bloquea la desmetilación de mono- y dimetil
H3-K9 durante la transcripción inducida por
andrógenos, mientras que permanecen sin variación los niveles de
metilación de trimetil H3-K9 y el estado de
metilación de H3-K27 y de H4-K20
(Fig. 3 y datos no ilustrados). Como aspecto interesante, la
metilación de la histona H3 en la lisina 4 (H3-K4)
no es alterada in vivo (datos no ilustrados).
Para demostrar que la desmetilación
ligando-dependiente de mono- y dimetil
H3-K9 es ejecutada por LSD1, células LNCaP fueron
transfectadas con siRNAs dirigidos contra LSD1 o un control no
relacionado con la misma. Esto conduce a una eficiente y específica
regulación a menos de la LSD1 endógena, pero no afecta al nivel de
AR endógeno (Fig. 3e, cuadro inferior). Como aspecto importante, el
silenciamiento de la LSD1 bloquea la desmetilación
ligando-dependiente de mono- y dimetil
H3-K9 (Fig. 3e). La cantidad de H3 total no se ve
influenciada por el silenciamiento de la LSD1 (Fig. 3e). Tomados
juntamente, estos datos demuestran la asociación
ligando-dependiente de LSD1 y AR sobre AREs
cromatinizados en el promotor del gen del PSA. Esto conduce a la
desmetilación específica de las marcas de histona represoras mono-
y dimetil H3-K9.
A continuación se llevaron a cabo ensayos de
transfección transitoria para poner a prueba si la LSD1 modula la
actividad transcripcional del AR. La coexpresión de LSD1 y AR
redunda en una fuerte activación ligando-dependiente
de un informador MMTV-luciferasa (Fig. 4a), lo cual
no se observa en ausencia ya sea de ligando o bien de AR (datos no
ilustrados). La estimulación de la actividad de AR por parte de la
LSD1 es potente en distintas líneas celulares, y tanto promotores
mínimos AR-responsivos sintéticos como complejos
fueron activados por la LSD1 de manera
ligando-dependiente (Fig. 4b, c). La estimulación de
la actividad de AR es selectiva puesto que la LSD1 no afecta a la
actividad transcripcional de los correspondientes receptores de
hormonas esteroides (datos no ilustrados).
Además, queda demostrado que el dominio de AO
(247-852 de LSD1) de la LSD1 es suficiente para
estimular la actividad del gen informador AR- y
ligando-dependiente, mientras que el terminal N
(1-175 de LSD1) y el dominio de SWIRM
(176-246 de LSD1) no lo hacen (Fig. 4d). Todos los
mutantes de LSD1 están presentes en el núcleo y son expresados a
niveles similares (datos no ilustrados).
Para investigar si el desplazamiento de las
marcas de histona represoras por parte de la LSD1 redunda en una
incrementada expresión génica regulada por el AR, fueron usados en
transfecciones transitorias inhibidores de las monoamina oxidasas
tales como pargilina, clorgilina y deprenil. Estos inhibidores
perjudican severamente la inactivación del AR inducida por la LSD1
(Fig. 4e). Como aspecto importante, en las células LNCaP de tumor
de próstata, que expresan AR endógeno, solamente informadores
andrógeno-dependientes pero no informadores no
afines tales como el TK-LUC son inhibidos por la
pargilina, demostrando así especificidad (Fig. 4f).
A continuación, LSD1 expresada endógenamente fue
eficientemente usada en células LNCaP por RNAi mediado por vector
(pSUPER-LSD1) (Fig. 4g, cuadro derecho).
Paralelamente al silenciamiento de la LSD1, se observó una
significativa disminución ligando-dependiente de la
expresión del gen informador PSA-LUC, indicando una
deteriorada actividad transcripcional del AR como consecuencia del
silenciamiento de la LSD1 (Fig. 4g, cuadro izquierdo). Puesto que
la LSD1 gobierna la actividad transcripcional de AR, podrían ser
reguladas por la LSD1 otras funciones controladas por andrógenos
tales como el crecimiento celular
andrógeno-dependiente.
\newpage
Para abordar esta cuestión, células LNCaP fueron
infectadas con un lentivirus
(pLV-THM-LSD1) que expresa siRNA
dirigido contra LSD1. La infección con
pLV-THM-LSD1 ocasiona una eficiente
y específica regulación a menos de la LSD1 endógena, pero no afecta
al nivel de AR endógeno (Fig. 4h, cuadro derecho). Como aspecto
importante, en comparación con células transducidas con el virus
pLV-THM-control, la proliferación
andrógeno-inducida de células LNCaP es
espectacularmente inhibida por el silenciamiento de la LSD1 mediado
por pLV-THM-LSD1 (Fig. 4h, cuadro
izquierdo). Estos datos demuestran la importancia fisiológica de la
LSD1 en el control de la proliferación celular y la regulación
génica inducida por andrógenos.
En resumen, los datos anteriormente expuestos
demuestran que la función de AR es controlada por la demetilasa
LSD1. La LSD1 y el AR se asocian en AREs cromatinizados de genes AR
diana de una manera ligando-dependiente, lo cual
redunda en una concomitante desmetilación de las marcas de histonas
represoras mono- y dimetil H3-K9. La LSD1 ha sido
descrita como un componente de complejos
correpresores^{4-7}, y un modelo reciente propone
que la LSD1 reprime la transcripción de genes silenciados por
Co-REST debido a la desmetilación de las marcas de
histona activadoras en H3-K4^{3}. Sin embargo,
cuando está formando complejo con AR, la LSD1 desmetila las marcas
de histona represoras mono- y dimetil H3-K9 y
promueve con ello la activación génica. Así, en dependencia de los
específicos consortes que interactúen, la acción de LSD1 puede
redundar en un silenciamiento o bien en una activación
génico(a). Es de importancia nuestra observación de que
inhibidores tales como la pargilina controlan la actividad de
demetilasa de la LSD1 y con ello regulan al AR. Así, la modulación
específica de la actividad de LSD1 podría ser un prometedor
objetivo terapéutico en tejidos tales como el cerebro, el testículo
y la próstata, donde el AR desempeña un fundamental papel
fisiológico.
Han sido anteriormente descritos los plásmidos
siguientes: pSG5-AR, CMX-Flag,
GST-AR-NTD,
GST-AR-DBD,
GST-AR-LBD,
MMTV-LUC, y TK-LUC^{8};
ARE_{2x-}TATA-LUC,
ARE_{2x-}TK-LUC^{9};
Slp-ARU-TATA-LUC^{10};
PSA-LUC^{11}; pLV-THM
(http://www.tronolab.unige.ch/); pSUPER^{12}. Para construir
CMX-Flag-LSD1, 1-174
de CMX-Flag-LSD1,
175-246 de
CMX-Flag-LSD1 y
247-854 de
CMX-Flag-LSD, los correspondientes
fragmentos fueron amplificados por PCR e insertados en el sitio
NcorI/Nhel de CMX-Flag.
pSUPER-control, pSUPER-LSD1 y
pLV-THM-LSD1 fueron construidos
según (http://www.tronolab.unige.ch/) y según lo publicado^{12}.
Las secuencias pueden ser facilitadas a petición.
El anticuerpo policlonal
\alpha-LSD1 de conejo fue generado según
procedimientos estándar. Las coloraciones fueron llevadas a cabo
usando un protocolo^{13} para la recuperación de antígenos e
inmunoperoxidasa indirecta. Se usaron \alpha-AR
441 (Santa Cruz) y \alpha-LSD1 en una dilución de
1:75 y 1:500, se usaron como anticuerpos secundarios IgG de conejo
e IgG de ratón (1:500; Dako), y las inmunorreaciones fueron
visualizadas con el complejo ABC diluido a 1:50 en PBS (PBS =
solución salina tamponada con fosfato) (Vectastain, Vector).
Células 293 y CV-1 fueron
cultivadas y transfectadas como está descrito^{13}. Células LNCaP
fueron cultivadas en RPM11640 exento de rojo de fenol y
suplementado con un 10% de suero bovino fetal de doble extracción
(dsFCS) y transfectadas con Effectene (Qiagen). Se usaron las
cantidades siguientes por pocillo: de NMTV-LUC,
ARE_{2x}-TATA-LUC
ARE_{2x}-TK-LUC,
TK-LUC, PSA-LUC,
Slp-ARU-TATA-LUC,
500 ng de cada uno, y se transfectaron por pocillo 25 ng de
plásmidos de expresión para AR; 500 ng de plásmidos de expresión
para 1-174 de LSD1, 175-246 de
LSD1, 247-852 de LSD1,
pSUPER-control y pSUPER-LSD1; y de
100 a 500 ng de plásmidos de expresión para LSD1. Las sustancias
químicas fueron obtenidas como se indica a continuación: pargilina
(Sigma); deprenil y clorgilina (ICN Biomedicals Inc.); R1881
(Schering AG, Berlín). Las células fueron tratadas con o sin R1881
10^{-10}M, 3 x pargilina 10^{-3}M, 1 x deprenil 10^{-3}M o 1 x
clorgilina 10^{-4}M por espacio de 18 horas como se indica. La
actividad de luciferasa fue sometida a ensayo como está
descrito^{14}. Todos los experimentos fueron repetidos al menos
cinco veces por duplicado.
Los experimentos de ChIP fueron llevados a cabo
esencialmente como está descrito^{15}. Células LNCaP fueron
tratadas por espacio de 18 horas con o sin pargilina y por espacio
de 120 min. con o sin R1881 10^{-8}M como se indica. Las células
LNCaP fueron transfectadas durante tres días antes de la recolección
para CHIP con o sin siRNA (Qiagen) siguiendo las instrucciones del
fabricante. La inmunoprecipitación fue llevada a cabo con
anticuerpos específicos (\alpha-monoMeK9H3,
\alpha-diMeK9H3,
\alpha-triMeK9H3,
\alpha-monoMeK4H3,
\alpha-diMeK4H3,
\alpha-triMeK4H3, \alpha-H3
(abcam), \alpha-LSD1 y \alpha-AR
PG21 (Upstate Biotechnology) sobre
GammaBind^{MF}-Sepharose 4B
(GE-Healthcare). Se usaron para PCR
1-5 \mul de 50 \mul de extracto de DNA. Para
los ensayos Re-ChIP, las inmunoprecipitaciones
fueron lavadas secuencialmente con TSE I, TSE II, tampón III y
TE^{15}. Los complejos fueron eluidos mediante incubación con DTT
(DTT = ditiotreitol) 10 mM a 37ºC por espacio de 30 min., y fueron
diluidos 50 veces con tampón de dilución^{15}, efectuándose a
continuación una segunda inmunoprecipitación con el anticuerpo
indicado. Las secuencias cebadoras fueron las siguientes: central;
PSA (-2223/-1951)
5'-TGGGTTGGGTCAGGTTTTGGTT-3' y
5'-TCTTCCCCTGTTTCTAGTT
GAGTG-3'; y los cebadores de la PCR para ARE I+II (PSA (-459/121)) y ARE III (PSA (-4288/3922)) han sido descritos anteriormente^{16}.
GAGTG-3'; y los cebadores de la PCR para ARE I+II (PSA (-459/121)) y ARE III (PSA (-4288/3922)) han sido descritos anteriormente^{16}.
Las células fueron analizadas esencialmente como
está descrito^{14}. La coloración de anticuerpos primarios fue
llevada a cabo con las diluciones que se indican:
\alpha-AR 441 (1:500) y
\alpha-LSD1 (1:5000). La localización subcelular
fue visualizada usando anticuerpos secundarios etiquetados con Alexa
Fluor 488 y 546 (1:6000; Molecular Probes). Los núcleos fueron
coloreados con 1 \mug ml^{-1} de DAPI (Roche).
Los experimentos fueron llevados a cabo
esencialmente como está descrito^{8}. Las inmunoprecipitaciones
desde extractos de testículo murino fueron llevadas a cabo con
anticuerpo \alpha-LSD1 o con IgG de conejo de
control. Los Western blots fueron decorados como se indica. El diez
por ciento de extracto de testículo fue cargado como entrada.
Los ensayos pull-down con GST
fueron llevados a cabo con cantidades iguales de GST o de proteínas
de fusión con GST como está descrito^{8} usando tampón que
contenía KCl 150 mM y un 0,15% de NP40 (Fig. b) o KCl 600 mM y un
0,3% de NP40 (Fig. 3a). Los Pull-downs con cola de
histona H3 acoplada a sefarosa fueron llevados a cabo como está
descrito^{17} en Tris 20 mM pH 8,5, NaCl 150 mM, 0,5% de NP40. El
diez por ciento de las proteínas traducidas in vitro fue
cargado como entrada.
Fueron llevados a cabo análisis Northern blot
con un Conjunto de Expresión Tisular Múltiple Humana y un Northern
Blot Tisular Múltiple Humano (BD Biosciences Clontech) con una sonda
LSD1-específica que abarcaba ya sea los pares de
bases 1-741 o bien los pares de bases
1-2556, etiquetada con Stripes (Ambion) e
hibridizada como se recomienda.
Se usaron
pLV-THM-control y
pLV-THM-LSD1 para producir
lentivirus recombinantes para infectar células LNCaP como está
descrito^{18}. Las células infectadas fueron cultivadas por
espacio de 72 horas en medio suplementado con un 10% de dsFCS. 0,3
x 10^{4} células fueron cultivadas en una placa de 96 pocillos con
o sin R1881 10^{-7}M. El Ensayo Colorimétrico de proliferación
celular ELISA con incorporación de BrDU (Roche) fue llevado a cabo
según las instrucciones del fabricante. Los experimentos fueron
repetidos tres veces por cuadruplicado.
La invención describe los siguientes ensayos
para poner a prueba a inhibidores de la LSD1 en cuanto a su
capacidad para bloquear la función de LSD1 y con ello de AR.
1) El primer ensayo para poner a prueba a
inhibidores que bloquean las funciones de LSD1 y AR puede llevarse
a cabo como se muestra en la Figura 3d. El inhibidor bloquea la
desmetilación de LSD1 en marcas de histona represoras en la histona
H3, preferiblemente en marcas de histona represoras en el residuo 9
de lisina en la histona H3 (H3-K9), y más
preferiblemente en las marcas de histona represoras en mono- y
dimetil H3-K9.
2) El segundo ensayo para poner a prueba a
inhibidores que bloquean las funciones de LSD1 y AR puede ser
llevado a cabo como se muestra en las Figuras 4e y 4f. Un inhibidor
de LSD1 bloquea la superacción ligando-dependiente
inducida por LSD1 de AR en células 293 o CV-1. Un
inhibidor de LSD1 bloquea la actividad de AR
ligando-dependiente.
3) El segundo ensayo para poner a prueba
inhibidores que bloquean las funciones de LSD1 y AR puede ser
llevado a cabo en células que crecen de una manera
andrógeno-dependiente, tales como las células LNCaP
o las células MCF-7. Análogamente al silenciamiento
de LSD1 mediado por siRNA (Figura 4h), un inhibidor de este tipo
bloquea la proliferación celular inducida por andrógenos.
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Esta lista de referencias que cita el
solicitante se aporta solamente en calidad de información para el
lector y no forma parte del documento de patente europea. A pesar de
que se ha procedido con gran esmero al compilar las referencias, no
puede excluirse la posibilidad de que se hayan producido errores u
omisiones, y la OEP se exime de toda responsabilidad a este
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Dependiente de los Receptores de Andrógenos
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptgggttgggt caggttttgg tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 24
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<212> DNA
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<223> Polinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttcccctg tttctagttg agtg
\hfill24
Claims (5)
1. Uso de al menos un inhibidor de las amina
oxidasas seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de
pargilina, clorgilina y deprenil para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata, donde el
inhibidor de las amina oxidasas que es al menos uno inhibe a la LSD1
en complejo con AR y por consiguiente redunda en una disminución de
la expresión génica AR-dependiente.
2. Uso según la reivindicación 1, donde el
inhibidor de las amina oxidasas es pargilina.
3. Método de ensayo que permite poner a prueba a
los moduladores de la LSD1 con respecto a su capacidad para modular
la función de LSD1, donde al menos una sustancia química que
supuestamente ejerce modulación de dicha función de LSD1 es
sometida a una o varias reacciones de desmetilación de mono- y
dimetil H3-K9, donde dicha LSD1 está implicada bajo
condiciones que son similares o idénticas a las condiciones
fisiológicas.
4. Método de ensayo que permite poner a prueba a
los moduladores de la LSD1 con respecto a su capacidad para modular
la función de LSD1, donde al menos una sustancia química que
supuestamente ejerce modulación de dicha función de LSD1 es
sometida a la reacción de superacción
ligando-dependiente inducida por LSD1 de AR en
células 293 o CV-1, modulando así la actividad de
AR ligando-dependiente, y preferiblemente
bloqueándola.
5. Método de ensayo que permite poner a prueba a
los moduladores de la LSD1 con respecto a su capacidad para modular
la función de LSD1, donde al menos una sustancia química que
supuestamente ejerce modulación de dicha función de LSD1 es
sometida a la reacción de proliferación de células LNCaP o
MCF-7 andrógeno-dependiente,
modulando así dicha proliferación celular
andrógeno-dependiente, y preferiblemente
bloqueándola.
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