ES2347694T3 - Variantes de la molecula gp130 solubles utiles como medicamento. - Google Patents
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Abstract
Polipéptido-dímero de dos fragmentos monoméricos, en el que los fragmentos monoméricos comprenden (a) los dominios 1 a 3 (D1 a D3) de la parte extracelular de la glicoproteína (gp) 130 pero no contienen dominios adicionales (D4 a D6) de sgp130 y (b) en sus extremos C-terminal un espaciador polipéptido que posee una longitud de 5 a 30 aminoácidos, en el que ambos fragmentos monoméricos están unidos covalentemente entre sí, en el que la longitud del espaciador determina la unión óptima de la proteína dimérica resultante al complejo IL-6/receptor de IL-6 soluble y en el que dicho polipéptido-dímero muestra un potencial significativamente reducido de formar agregados homoméricos y fragmentos de moléculas y en el que se obtiene una productividad significativamente incrementada en células huésped.
Description
Se describe un polipéptido-dímero formado por dos
fragmentos monoméricos idénticos que comprende los dominios
1 a 3 de la parte extracelular (soluble) de la glicoproteína
(gp) 130 y un espaciador polipéptido concreto, unidos
covalentemente entre sí, y que supone ventajas
significativas respecto a su tasa de producción en células
huésped, su purificación mejorada y su potencial para unirse
a complejos IL-6/receptor IL-6 soluble. Además, se describe
- una
- composición farmacéutica que contiene dicha molécula
- dimérica y diversos usos médicos.
- La
- citoquina pleiotrópica interleuquina-6 (IL-6)
muestra un amplio espectro de funciones biológicas entre las
cuales las más notables son la estimulación de las células B
y T, el control de los procesos inmunitarios adquiridos e
innatos y la inducción de la síntesis de proteínas de fase
aguda en el hígado. La IL-6 ejerce su actividad a través de
un receptor IL-6 unido a membrana o soluble (“IL-6R” o
“gp80”) el cual tras la unión induce la dimerización de la
gp130 para desencadenar respuestas celulares.
Dado que el domino citoplasmático de IL-6R carece de
actividad quinasa, la señalización por el homodímero gp130
puede ser inducida por la IL-6 unida al IL-6R unido a
membrana o soluble. Mientras que gp130 puede hallarse en
prácticamente todos los tipos celulares, la expresión de
-2 –
IL-6R está restringida a los hepatocitos y leucocitos. Sin
embargo, las células pueden ser activadas por IL-6 a través
de sIL-6R el cual es liberado desde las células que expresan
IL-6R ya sea mediante escisión proteolítica o mediante corte
y empalme (splicing) alternativo. Este mecanismo se denomina
trans-señalización. De hecho, se ha demostrado que diversas
- actividades
- celulares son dependientes del complejo de
- sIL-6R más IL-6 y no son inducibles por la IL-6 sola.
- La
- trans-señalización juega un papel clave en la
- transición
- de las respuestas inmunitarias innatas a las
- adquiridas
- y es crucial para el aclaramiento de los
infiltrados neutrofílicos y el reclutamiento y activación de
células T y B para una respuesta inmunitaria mantenida. La
alteración de la regulación de este mecanismo conlleva el
desarrollo y persistencia de enfermedades alérgicas
inflamatorias y/o crónicas tales como la enfermedad de
Crohn, la artritis reumatoide, el asma y otras.
Para el tratamiento de estas enfermedades, se ha
demostrado que el bloqueo específico de los procesos
mediados por IL-6 es terapéuticamente efectivo.
Desafortunadamente, todos los compuestos disponibles en la
actualidad para este fin hasta el momento tienen el problema
de provocar efectos secundarios graves en parte (por ejemplo
infecciones secundarias, tuberculosis, sepsis), toxicidad o
inmunogenicidad. Adicionalmente, también se han observado
dificultades indisolubles durante el desarrollo de un
procedimiento de purificación útil y económico.
La solución de estos problemas técnicos se consigue
mediante las realizaciones caracterizadas en las
-3 –
reivindicaciones. En el transcurso de los experimentos que
han dado lugar a la presente invención, se observó que la
purificación del compuesto original sgp130F que comprende
dos moléculas de la parte extracelular completa de gp130 era
insatisfactoria. Esta proteína de fusión, si se expresa en
células eucariotas CHO tiende a formar productos secundarios
indeseables tales como ciertos fragmentos más pequeños,
oligómeros y agregados en combinaciones diversas. No fue
posible hallar ningún tipo de método de purificación que
fuera adecuado para separar el compuesto diana de estas
impurezas en cantidades adecuadas debido a las propiedades
físicas y químicas muy similares entre las impurezas y el
- producto
- de interés. Entre los métodos analizados se
- incluyeron diferentes
- cromatografías de afinidad, de
- exclusión
- de tamaño y de intercambio iónico, estrategias
para cambiar la solubilidad de la proteína mediante
suplementación iónica o cambios en el pH y otros. Ninguno de
estos métodos dio resultados satisfactorios o fue adecuado
para ser realizado a mayor escala para desarrollar un
proceso de purificación que cumpliera con las buenas
prácticas de fabricación (GMP). Por el contrario, se observó
que una variante más corta de la molécula original sgp130Fc,
denominada sgp130(D1-3)Fc, que carece de los dominios
extracelulares 4 a 6 era separable de los productos
secundarios contaminantes. Ello indicaba que los elementos
formadores de agregados con los dominios de fibronectina III
(dominios 4 a 6) de la molécula original sgp130Fc se habían
eliminado con éxito. Además, esta molécula se expresó por
células eucariotas a niveles considerablemente más elevados.
-4 –
En la siguiente etapa se optimizó la eficiencia de
unión a IL-6/sIL-6R de la nueva molécula sgp130(D1-3)Fc
mediante la fusión de espaciadores polipéptidos de diferente
longitud entre sgp130(D1-3) y la parte IgG-Fc. La capacidad
de unión de las moléculas resultantes se determinó mediante
ensayos de enzimoinmunoanálisis (ELISA) específicos y se
comparó con la molécula original sgp130Fc (Figura 5).
Se ha demostrado que la unión de los complejos
IL-6/sIL-6R inhibe el efecto anti-apoptótico de IL-6 sobre
los monolitos en pacientes con enfermedad de Crohn indicando
que dicho compuesto es útil para el tratamiento de dicha
enfermedad y de enfermedades relacionadas tales como la
colitis, la artritis reumatoide, la psoriasis, la
peritonitis y otras.
La enfermedad de Crohn es una enfermedad inflamatoria
crónica de todo el tracto gastrointestinal caracterizada por
recidivas frecuentes de inflamación aguda. La inflamación
asociada con infección, lesión y otros factores induce
rápidamente una reacción de fase aguda (APR) acompañada de
la expresión de proteínas de fase aguda (APPs). La APR
provoca principalmente un aumento de la permeabilidad
vascular y fiebre. Los miembros de la familia de la IL-6
incrementan la expresión de los genes APP de tipo II que
está mediada por la (STAT3). La potente activación de STAT3
(es decir fosforilación de tirosina) se ha descrito en
tejido de colon de pacientes con enfermedades intestinales
inflamatorias (IBD). Además, se ha observado una disminución
-/
de la actividad STAT3 en ratones IL-6 asociada a una
disminución del desarrollo de colitis de ratón experimental
-5 –
(Suzuki y otros, J. Exp. Med 2001, 193:471). Esto
experimentos indican que la activación de STAT3 mediada por
IL-6/sIL-6R juega un papel clave en el desarrollo y
perpetuación de la colitis. En otro modelo inflamatorio, la
artritis reumatoide (RA), se ha demostrado que STAT3 es
importante para la supervivencia de los fibroblastos
sinoviales de la RA (Krause y otros, J. Immunol, 2002,
169:6610). Por ello se ha sugerido que STAT3 puede ser una
buena diana para la terapia génica. También se conoce que la
activación constitucional de STAT3 es un factor “causante de
cáncer” y se acompaña de un incremento de proteínas
anti-apoptóticas como Bcl-2 y Bcl-XL (Turkson y otros,
Oncogene, 2000, 19:6613).
Se ha observado que la activación de STAT3 mediada por
IL-6/sIL-6R es reducida significativamente por
sgp130(D1-3)Fc con un nivel de eficacia comparable al del
compuesto original sgp130Fc. Además, sgp130(D1-3)Fc
(sgp130Var) se expresa en células eucariotas en cantidades
más elevadas que sgp130Fc, genera menos productos
secundarios no deseados y es separable de las impurezas
residuales mediante cromatografía en columna estándar. Estas
ventajas mejoran de forma significativa el desarrollo de
procedimientos de producción acordes con las GMP y disminuye
el coste de los productos.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Dibujo esquemático de las moléculas
sgp130(D1-D3)Sn
Las variantes sgp130(D1-D3)Sn se generaron mediante
deleción de los dominios D4 a D6 de la molécula original
-6 –
sgp130Fc y su substitución por un espaciador polipéptido de
longitud diversa (Sn). La “n” indica el número de
repeticiones dentro de la región del espaciador. A
continuación la molécula se dimeriza covalentemente ya sea
mediante un fragmento IgG-Fc (panel superior) para construir
sgp130(D1-D3)Sn-Fc o (panel inferior) mediante fusión
adicional con un elemento conector artificial o natural que
confiere uniones covalentes, por ejemplo mediante la
formación de puentes disulfuro, interacciones químicas u
otros (sgp130(D1-D3)Sn-L). Además, estas moléculas pueden
contener etiquetas para la purificación y/u otros fines de
detección.
Figura 2: Expresión de sgp130(D1-D3)Sn en células CHO
Se muestra como ejemplo de la expresión de
sgp130(D1-D3)Sn la correspondiente a sgp130(D1-D3)S1-Fc. Se
transfectó transitoriamente el constructo correspondiente
(pDEST40_sgp130(D1-D3)S1-Fc) en células CHO. En paralelo,
otro grupo de células CHO se transfectó con un constructo
que comprendía la sgp130Fc original. Las células se
incubaron durante 24 horas, se recogió el sobrenadante y se
inmunoprecipitaron las proteínas de fusión sgp130.
Finalmente se analizaron los precipitados mediante SDS-PAGE
y se detectaron utilizando un anticuerpo IgG anti-humano
según los procedimientos de transferencia Western estándar.
Figura 3: Purificación de las moléculas de fusión
sgp130Fc
Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) de sgp130Fc.
El panel superior muestra el perfil de elución
(cromatograma) derivado durante la filtración en gel por
-7 –
rastreo UV. Los paneles medio e inferior representan el
análisis de las fracciones recolectadas mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE) y
- tinción
- con coomassie (COOM) o argéntica según
- procedimientos estándar.
- Figura
- 4: Purificación de moléculas de fusión
sgp130(D1-D3)-Fc
- (A)
- Se muestra como ejemplo de la purificación de las moléculas sgp130(D1-D3)Sn-Fc mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) la correspondiente a sgp130(D1-D3)S1-Fc. El panel superior muestra el perfil de elución (cromatograma) derivado durante la filtración en gel mediante rastreo UV. Los paneles medio e inferior representan el análisis de las fracciones recolectadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE) y tinción con coomassie (COOM) o argéntica según procedimientos estándar.
- (B)
- La comparación de los cromatogramas de elución de las SEC de variantes con espaciadores (GGGGS)n muestra las propiedades de purificación óptimas con un espaciador de longitud n = 3 que no se correlaciona con un incremento continuo de la actividad biológica (ver diagrama a continuación y figura 5).
Figura 5: Unión específica de los complejos
IL-6/sIL-6R por moléculas sgp130(D1-D3)Sn-Fc
Se recubrieron placas de 96 pocillos con moléculas
sgp130(D1-D3)Sn-Fc purificadas (con n = 0 a 3) y se
incubaron con cantidades crecientes de IL-6 + receptor de
-8 –
IL-6 soluble (sIL-6R) recombinante. Los complejos IL-6/sIL-6R unidos se detectaron utilizando un anticuerpo anti-IL-6R de ratón y un anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (□,•, ■, ▲). En paralelo se analizó la molécula sgp130Fc original (♦).
Figura 6: Dibujo esquemático de un ensayo para detectar
anticuerpos que se unen a sgp130(D1-D3)Sn-Fc
(A) sgp130(D1-D3)Sn-Fc fijada a una matriz sólida se
incuba con una mezcla de anticuerpos (por ejemplo, los
contenidos en muestras de suero) marcados previamente (por
ejemplo, con colorantes fluorescentes). Los anticuerpos no
unidos se lavan y se detectan las moléculas con unión
específica mediante tecnologías de última generación. (B)
sgp130(D1-D3)Sn-Fc fijada a una matriz sólida se incuba con
una mezcla de anticuerpos (por ejemplo, los contenidos en
muestras de suero). Los anticuerpos no unidos se lavan y los
complejos sgp130(D1-D3)Sn-Fc / anticuerpo remanentes se
incuban a continuación con una cantidad determinada de
sgp130(D1-D3)Sn-Fc marcada (por ejemplo con colorantes
fluorescentes) y finalmente se detectan mediante tecnologías
de última generación.
Figura 7: Secuencia de ADNc del sgp130(D1-D3)
optimizado
La secuencia incluye el péptido señalizador así como
los dominios D1 a D3 de sgp130. La secuencia de optimizó en
cuanto a los codones presentes para la expresión del
polipéptido codificado en células de mamífero.
Figura 8: Secuencia de aminoácidos de gp130(D1-D3)
soluble
-9 –
Algunos fragmentos de molécula están subrayados del
modo siguiente: Péptido señalizador:
tipo C2 similar a Ig (D1):
fibronectina tipo III (D2):
5 Dominio fibronectina tipo III (D3):
Por tanto, la presente invención hace referencia a un
polipéptido-dímero de dos fragmentos monoméricos, en el que
los fragmentos monoméricos comprenden los dominios 1 a 3 (D1
a D3) de la parte extracelular de la glicoproteína (gp) 130
10 pero no contienen dominios adicionales (D4 a D6) de sgp130 y en sus extremos C-terminales un espaciador polipéptido que posee una longitud entre 5 y 30 aminoácidos, en el que ambos fragmentos monoméricos están unidos covalentemente entre sí, en el que la longitud del espaciador determina la unión
15 óptima de la proteína dimérica resultante al complejo IL-6/receptor IL-6 soluble y en el que dicho polipéptido-dímero muestra un potencial significativamente disminuido para formar agregados homoméricos y fragmentos de moléculas, y en el que se obtiene una productividad
20 significativamente superior en células huésped. Los polipéptidos-dímero de la presente invención pueden sintetizarse mediante métodos conocidos. El término “soluble” tal como se utiliza en la presente invención (abreviatura “s”) hace referencia a una molécula gp130 que
25 carece de al menos el dominio intracelular y el dominio transmembrana. Los dominios utilizados pueden comprender los dominios extracelulares D1 a D3 de gp130 o pueden comprender
-10 –
mutantes o fragmentos de los mismos que mantengan la
capacidad para inhibir la actividad del complejo agonista
IL-6/sIL-6R. Preferentemente, el polipéptido correspondiente
a la parte soluble de gp130 es el único polipéptido
biológicamente activo del polipéptido-dímero de la presente
invención.
En una realización preferente, los dos fragmentos
monoméricos del polipéptido-dímero de la presente invención
son idénticos.
La unión entre los dos monómeros para formar el dímero
puede llevarse a cabo por un experto en la técnica mediante
métodos bien conocidos. Para formar el dímero, las dos
moléculas gp130 solubles pueden unirse entre sí mediante uno
o más puentes disulfuro. Ello puede conseguirse, por ejemplo
mediante expresión recombinante, en la que la secuencia de
ácidos nucleicos que codifica sgp130 se fusiona en su
extremo C-terminal con un conector de polipéptidos que
contiene uno o más codones que codifican residuos cisteína
entre el extremo C-terminal de sgp130 y el codón de
finalización. Alternativamente, para generar el dímero
pueden emplearse conectores en el extremo de cada molécula
sgp130 que confieran otro tipo de unión intermolecular (por
ejemplo covalente, iónica) entre las dos moléculas sgp130.
Estos conectores pueden ser completamente artificiales (por
ejemplo, repeticiones de poliglicina que pueden
interrumpirse con serina, alanina y/o treonina a intervalos
determinados). Alternativamente, para generar el dímero, las
dos moléculas gp130 solubles pueden fusionarse por su
extremo C-terminal a un fragmento IgG-Fc que incluya la
-11 –
región bisagra (ya sea directamente o mediante un conector).
Además, pueden eliminarse residuos cisteína libres de la
región bisagra de la molécula Fc mediante mutación para
reducir el riesgo de formación de puentes disulfuro
intermoleculares no deseados. Adicionalmente, las moléculas
del dímero pueden marcarse, por ejemplo con
His-His-His-His-His-His (His6), Myc, Strep, poliarginina,
Flag, proteína verde fluorescente (GFP), TAP, glutatión
S-transferasa (GST), HA, péptido de unión a calmodulina
(CBP), péptido de unión a maltosa (MBP), V5, HSV, S, virus
de la estomatitis vesicular (VSV), Proteína C, Luciferasa,
Glu-Glu, E, beta-GAL, T7 u otros epitopos de los cuales se
encuentran disponibles anticuerpos u otras moléculas de
unión para permitir la purificación mediante sistemas de
cromatografía adecuados y/o la detección, por ejemplo
mediante transferencia Western, ELISA, bioensayos etc.
Para proporcionar una distancia óptima entre las dos
subunidades sgp130 dentro de la molécula dimérica, la cual
es necesaria para obtener una unión óptima al complejo
IL-6/sIL-6R, las subunidades sgp130 se fusionan en su
extremo C-terminal con espaciadores (poli)peptídicos que
poseen una longitud entre 5 y 30 aminoácidos,
preferentemente (i) 10 a 25 o (ii) 15 a 25 aminoácidos o,
particularmente preferente, de 10 a 15 aminoácidos. El tipo
de aminoácidos que forman el espaciador no es
particularmente crítico, sin embargo, son preferentes
aminoácidos (como G o S) que (a) garanticen una flexibilidad
estérica ideal que permita un alineamiento óptimo de los
monómeros, (b) no sean fácilmente accesibles por proteasas y
-12 –
anticuerpos y (c) no estén cargados para disminuir o
eliminar cualquier agregación no deseada del dímero con
otras moléculas o la formación de trímeros etc. Son
aminoácidos preferentes para la construcción de la molécula
espaciadora una o más repeticiones de la secuencia de
aminoácidos “GGGGS”, sin embargo el espaciador puede
comprender cualquier otra secuencia que incremente la unión
al ligando de dicha molécula sgp130.
En una realización particularmente preferente del
polipéptido-dímero de la presente invención, el espaciador
- está
- glicosilado de forma selectiva para proteger la
- molécula de su escisión proteolítica.
- En
- una realización adicionalmente preferente, el
polipéptido-dímero de la presente invención forma menos de
un 50% de agregados homoméricos y fragmentos de molécula,
preferentemente menos de un 25% de agregados homoméricos y
fragmentos de molécula, más preferentemente menos de un 10%
de agregados homoméricos y fragmentos de molécula, y más
preferentemente, menos de un 5% de agregados homoméricos y
fragmentos de molécula.
La presente invención también da a conocer
polinucleótidos que codifican un polipéptido-dímero (o los
monómeros respectivos) de la presente invención, los cuales
pueden optimizarse en cuanto a los codones presentes para la
producción eficiente de la proteína codificada en células
huésped eucariotas, bacterias, células de levadura o
insecto. Preferentemente, dicho polinucleótido comprende la
secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 7.
-13 –
Además, la presente invención también se refiere a
vectores que contienen un polinucleótido de la invención y
las células huésped correspondientes.
Pueden utilizarse diversos métodos para generar e
identificar mutaciones o modificaciones de sgp130 que poseen
las propiedades deseadas. Puede utilizarse la mutagénesis
específica de sitio mediante técnicas estándar del ADN que
codifica sgp130 o métodos de última generación tales como la
digestión de restricción y ligadura, seguida del análisis de
la recopilación de productos para identificar las moléculas
mutadas que poseen las propiedades deseadas.
Los polipéptidos-dímero de la presente invención se
producen preferentemente mediante técnicas de recombinación
utilizando polinucleótidos que codifican un polipéptido de
la presente invención y vectores, preferentemente vectores
de expresión que contienen dichos polinucleótidos. Para la
producción de los polipéptidos de la presente invención, los
polinucleótidos se obtienen a partir de clonas existentes,
es decir, preferentemente codifican polipéptidos existentes
de forma natural o partes de los mismos. También son útiles
para la producción del polipéptido o polipéptidos de la
presente invención los polipéptidos codificados por
cualquier polinucleótido que se hibride al complemento del
ADN o ARN nativo bajo condiciones alta o moderadamente
estrictas (para sus definiciones, ver Sambrook, Molecular
Cloning A Laboratory Manual (“Clonación molecular. Un manual
de laboratorio”), Cold Spring Habor Laboratory (1989) Nueva
York) siempre y cuando el polipéptido mantenga la actividad
biológica de la secuencia nativa.
-14 –
Los vectores recombinantes pueden construirse mediante
métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, por
ejemplo Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual
(“Clonación molecular. Un manual de laboratorio”), Cold
Spring Habor Laboratory (1989) Nueva York. Pueden utilizarse
diversos sistemas de vectores de expresión/huésped para
contener y expresar las secuencias que codifican los
polipéptidos sgp130 de la presente invención. Estos
incluyen, sin carácter limitante, microorganismos tales como
bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN
cósmidos, bacteriófagos recombinantes o plásmidos; levaduras
transformadas con vectores de expresión de levaduras;
sistemas de células de insecto infectadas con vectores de
expresión víricos (por ejemplo baculovirus); sistemas de
células de plantas transformadas con vectores de expresión
víricos (por ejemplo virus del mosaico de la coliflor, CaMV,
virus del mosaico del tabaco, TMV) o vectores de expresión
bacterianos (por ejemplo li o pBR322); o sistemas de células
de animales.
Los “elementos de control” o “secuencias reguladoras”
son aquellas regiones no traducidas de los potenciadores del
vector, promotores y regiones 5’ y 3’ no traducidas que
interaccionan con las proteínas celulares del huésped para
proceder a la transcripción y traducción. Dichos elementos
pueden varias en su potencia y especificidad. Dependiendo
del sistema de vector y huésped utilizado, pueden utilizarse
cualquier número de elementos de transcripción y traducción
adecuados, incluyendo promotores constitucionales e
inducibles. Por ejemplo, al clonar en sistemas bacterianos,
-15 –
pueden utilizarse promotores inducibles tales como el
promotor lacZ híbrido de Bluescript RTM.phagemid
(Stratagene, LaJolla, CA) o el plásmido pSPORT1.TM (Gibco
BRL) o similares. Puede utilizarse el promotor de la
polihedrina de baculovirus en células de insecto. Pueden
clonarse en el vector promotores o potenciadores derivados
de genomas de células de planta (por ejemplo, genes de
choque térmico, RUBISCO y de proteínas de almacenamiento) o
de virus de plantas (por ejemplo promotores o secuencias
líder virales). En sistemas de células de mamífero, son
preferentes promotores de genes de mamífero o de virus de
mamífero. Si es necesario para generar una línea celular que
contenga múltiples copias de la secuencia que codifica los
polipéptidos de sgp130, pueden utilizarse vectores basados
en SV40 o EBV con un marcador seleccionable adecuado.
En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse una serie
de vectores de expresión en función del uso previsto del
polipéptido-dímero de la presente invención. Como vectores
adecuados para ser utilizados en la presente invención se
incluye, sin carácter limitante, el vector de expresión pSKK
para la expresión en bacterias.
En la levadura, Saccharomyces cerevisiae, pueden
utilizarse una serie de vectores que contienen promotores
constituyentes o inducibles tales como el factor alfa, la
alcohol oxidasa, y el PGH; para revisión ver Grant y otros
(1987) Methods Enzymol. 153:516-544.
En casos en los que se utilizan vectores de expresión
en plantas, las secuencias de expresión que codifican el
anticuerpo de la presente invención pueden ser conducidas
-16 –
por cualquiera de una serie de promotores. Por ejemplo,
pueden utilizarse promotores virales tales como los
promotores 35S y 19S del CaMV solos o en combinación con la
secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, N (1987) EMBO J.
6:307-311). Alternativamente, pueden utilizarse promotores
de planta tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o
promotores de choque térmico (Coruzzi, G. y otros (1984)
EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. y otros (1984) Science
224:838-843; y Winter, J. y otros (1991) Results Probl. Cell
Differ. 17:85-105). Los constructos pueden introducirse en
células de planta mediante transformación de ADN directa o
mediante transfección mediada por patógenos. Dichas técnicas
se describen en diversas revisiones generalmente disponibles
(ver, por ejemplo Hobbs, S. y Murry, L.E. en McGraw Hill
Yearbook of Science and Technology (“Anuario de ciencia y
tecnología”) (1992) McGraw Hill, Nueva York, NY; pp.
191-196.
También puede utilizarse un sistema de insecto para
expresar las moléculas sgp130 de la presente invención. Por
ejemplo, en uno de estos sistemas, se utiliza el virus de la
polihedrosis nuclear de Autographa california (AcNPV) como
vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera
frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias
pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal
como el gen de la polihedrina, y situarse bajo el control
del promotor de la polihedrina. La inserción exitosa del gen
que codifica sgp130 hará que se inactive el gen de la
polihedrina y producirá un virus recombinante que carece de
la proteína de recubrimiento. A continuación pueden
-17 –
utilizarse los virus recombinantes para infectar, por
ejemplo células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en
las cuales puede expresarse APOP (Engelhard, E.K. y otros
(1994.) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227).
En células huésped de mamífero, pueden utilizarse
diversos sistemas de expresión basados en virus. En los
casos en los que se utiliza como vector de expresión un
adenovirus, las secuencias que codifican el o los
polipéptidos de la presente invención pueden ligarse dentro
de un complejo de transcripción/traducción de adenovirus
formado por el promotor tardío y la secuencia líder
tripartita. Puede utilizarse la inserción en una región no
esencial E1 o E3 del genoma viral para obtener un virus
viable capaz de expresar la proteína en células infectadas
(Logan, J. y Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:
3655-3659). Además, pueden utilizarse potenciadores de la
transcripción, tales como el potenciador del virus del
sarcoma de Rous (RSV) para incrementar la expresión de
células huésped de mamífero.
También pueden utilizarse cromosomas humanos
artificiales (HACs) para suministrar fragmentos de ADN más
grandes que pueden estar contenidos y expresarse en un
plásmido. Los HACs de 6 a 10 M se construyen y liberan a
través de métodos de liberación convencionales (liposomas,
polímeros amino policatiónicos o vesículas) con fines
terapéuticos.
También pueden utilizarse señales de iniciación
específicas para conseguir una traducción más eficiente.
Dichas señales incluyen el codón de iniciación ATG y
-18 –
secuencias adyacentes. En los casos en los que las
secuencias que codifican la sgp130, su codón de iniciación y
las secuencias por encima se insertan en el vector de
expresión adecuado, pueden no necesitarse señales de control
de la traducción o la transcripción adicionales. Sin
embargo, en el caso de que solamente se inserte la secuencia
de codificación, deben proporcionarse señales de control de
la traducción exógenas incluyendo el codón de iniciación
ATG. Además, el codón de iniciación debería hallarse en el
marco de lectura correcto para garantizar la traducción de
todo el inserto. Los elementos de control de la traducción y
los codones de iniciación pueden ser de orígenes diversos,
tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la
expresión puede incrementarse mediante la inclusión de
potenciadores que sean adecuados para el sistema celular
concreto que se utiliza, tales como los descritos en la
literatura (Scharf, D. y otros (1994) Results Probl. Cell
Differ. 20:125-162.
Además, puede escogerse una cepa de células huésped por
su capacidad para modular la expresión de las secuencias
insertadas o para procesar las cadenas de polipéptidos
expresadas del modo deseado. También puede utilizarse el
procesamiento post-traducción que escinde una forma “prepro”
del polipéptido para facilitar una inserción, plegamiento
y/o función correctas. Están disponibles del American Type
Culture Collection (ATCC; Bethesda, MD) diferentes células
huésped que poseen una maquinaria celular específica y
mecanismos característicos para actividades post-traducción
(por ejemplo CHO, HeLa, MDCK, HEK293 o W138) y pueden
-19 –
escogerse para garantizar una modificación y procesamiento
correctos de las cadenas polipeptídicas extrañas. Para la
producción de alto rendimiento y a largo plazo de
polipéptidos recombinantes, es preferente la expresión
estable. Por ejemplo, pueden transformarse las líneas
celulares que expresan de forma estable las cadenas sgp130
utilizando vectores de expresión que pueden contener
orígenes de replicación virales y/o elementos de expresión
endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo o en
un vector diferente. Tras la introducción del vector, se
permitirá que las células crezcan durante 1-2 días en un
medio enriquecido antes de cambiarse a un medio selectivo.
El fin del marcador seleccionable es conferir resistencia a
la selección, y su presencia permite el crecimiento y
recuperación de las células que expresan con éxito las
secuencias introducidas. Las clonas resistentes de células
transformadas estables pueden proliferar utilizando técnicas
adecuadas al tipo celular.
Tras la introducción de uno o varios vectores
recombinantes, las células huésped se cultivan en un medio
selectivo, que selecciona el crecimiento de las células que
contienen el vector. Puede utilizarse cualquier número de
sistemas de selección para recuperar las líneas celulares
transformadas. Estos incluyen, sin carácter limitante, la
timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler, M. y
otros (1977) Cell 11:223-232 y los genes de la adenina
fosforibosiltransferasa (Lowy, I. y otros (1980) Cell
22:817-823) que pueden utilizarse en células tk.sup. y
aprt.sup. respectivamente. También puede utilizarse la
-20 –
resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas
como base de la selección; por ejemplo, dhfr que confiere
resistencia al metotrexato (Wigler, M. y otros (1980) Proc.
Natl. Acd. Sci. 77: 3567-3570); npt que confiere resistencia
a los aminioglucósidos neomicina y, G-418 (Colbere-Garapin,
F. y otros (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14) y als o pat que
confieren resistencia a la clorosulfona y la fofinotricina
acetiltransferasa, respectivamente (Murray, ver cita
previa). Se han descrito genes seleccionables adicionales,
por ejemplo trpB, que permite que las células utilicen indol
en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las células
utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman S.C. y
Mulligan, R.C. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-8051).
Recientemente, ha ganado popularidad la utilización de
marcadores visibles, utilizándose extensamente marcadores
como las antocianinas, la beta-glucoronidasa y su substrato
el GUS y la luciferasa y su substrato la luciferina, no
solamente para identificar transformantes, si no también
para cuantificar la cantidad de expresión de proteína
transitoria o estable atribuible a un sistema de vector
específico (Rhodes, C.A. y otros (1995) Methods Mol. Biol.
55:121-131).
La purificación de los polipéptidos recombinantes se
lleva a cabo mediante uno de los métodos conocidos para este
fin, es decir, cualquier procedimiento convencional que
suponga extracción, precipitación, cromatografía,
electroforesis o similares. Un procedimiento de purificación
adicional que puede utilizarse es la cromatografía de
afinidad utilizando anticuerpos monoclonales u otras
-21 –
moléculas que se unan al polipéptido diana y que se
produzcan e inmovilicen en una matriz de gel contenida
dentro de una columna. Las preparaciones impuras que
contienen el polipéptido recombinante se pasan a través de
la columna o se utilizará la matriz en tecnologías de
proceso por lotes para unirse a los polipéptidos diana. El
polipéptido se unirá a la matriz mientras que las impurezas
no lo harán. Tras el lavado se eluye el polipéptido de la
matriz mediante un cambio en el pH o la fuerza iónica.
En consecuencia, la presente invención también se
refiere a un método para la producción de un
polipéptido-dímero de la presente invención, que comprende
cultivar una célula huésped transformada con una secuencia
de ADN que codifica dicho polipéptido y recuperar el
polipéptido de dicha célula huésped o del medio de cultivo.
- Los
- polipéptidos-dímero de la presente invención son
- útiles
- para el tratamiento y/o prevención de todas las
- patologías
- en las cuales la actividad del complejo
IL-6/sIL-6R agonista contribuye a la patogénesis de la
enfermedad y debe ser inhibida. Por ejemplo, los usos
terapéuticos de los polipéptidos-dímero de la presente
invención incluirían los siguientes:
a) Aparentemente IL-6 está directamente involucrada en
el mieloma múltiple actuando ya sea de forma autocrina
o paracrina para promover la formación tumoral. Además,
los niveles elevados de IL-6 crean efectos secundarios
indeseables tales como la resorción ósea, la
hipercalcemia y la caquexia. En estos casos es conocido
que sIL-6R sensibiliza las células diana de IL-6. Por
-22 –
tanto, los polipéptidos-dímero de la presente invención
tal como se describen en la misma serían beneficiosos
tanto para los efectos secundarios como para inhibir el
crecimiento tumoral.
b) En enfermedades autoinmunes: el significado
patogénico de IL-6 en las enfermedades autoinmunes ha
sido revisado por diversos autores en la literatura
(ver, por ejemplo Yoshizaki y otros (1992) Semin.
Immunol. 4(3):155-166), de tanto, la interferencia con
la transducción de la señal de IL-6 puede ser útil en
el tratamiento de las enfermedades autoinmunes
(Nishimoto y otros (1999) Intern. Med. 38(2):178-182).
Son ejemplos de estas patologías el lupus eritematoso
sistémico, la tiroiditis de Hashimoto, la escleroderma,
- la
- artritis reumatoide, la esclerosis múltiple,
- la
- epitelitis
- autoinmune, la diabetes mellitas, el
- síndrome
- de Sjögren, la polimiositis, la
glomerulonefritis y otras enfermedades inflamatorias,
tales como la psoriasis, la enfermedad de Crohn, la
colitis ulcerosa y la uveítis. Además, se mencionan
algunas enfermedades cancerosas asociadas a inflamación
como el cáncer de colon.
c) En la osteoporosis, que puede exacerbarse por la
disminución de los niveles de estrógenos en las mujeres
post-menopáusicas o tras una ooforectomía,
aparentemente IL-6 es un mediador crítico de la
osteoclastogénesis, que provoca resorción ósea. Es
importante destacar que, aparentemente IL-6 juega un
papel principal en el estado de depleción de
-23 –
estrógenos, y aparentemente está mínimamente
involucrado en el mantenimiento óseo normal. De acuerdo
con ello, la evidencia experimental indica que los
anticuerpos bloqueadores de función contra IL-6 pueden
disminuir el número de osteoclastos. Aunque también se
utiliza el tratamiento sustitutivo con estrógenos,
parece que existen efectos secundarios que pueden
incluir un incremento del riesgo de cáncer de mama y
endometrio. Por tanto, los polipéptidos-dímero de la
presente invención serían más específicos para reducir
la osteoclastogénesis a niveles normales.
d) IL-6 puede ser un mediador del factor de necrosis
tumoral (TNF) que provoca la caquexia asociada con el
SIDA y el cáncer, quizás reduciendo la actividad de la
lipoproteína lipasa en el tejido adiposo. En
consecuencia, los polipéptidos-dímero de la presente
invención descritos en la misma serían útiles para
aliviar o disminuir la caquexia de dichos pacientes.
e) Infecciones bacterianas y virales: se ha demostrado
la presencia del virus del herpes humano (HHV8) en más
del 91% de las lesiones de sarcoma de Karposi (KS).
Además, el virus ha sido identificado en el linfoma de
efusión primaria (PEL) y en pacientes con enfermedad de
Castleman multicéntrica (MCD). Curiosamente, se ha
demostrado que las células dendríticas de la médula
ósea de pacientes con mieloma múltiple (MM) están
infectadas por HHV8. Desde entonces, la asociación de
HHV8 con el MM ha sido objeto de un intenso debate, que
se ha revisado recientemente. El genoma de HHV8
-24 –
codifica diversas proteínas con homologías
significativas con proteínas anti-apoptóticas,
quimioquinas y citoquinas humanas, incluyendo una forma
vital de la IL-6 viral (vIL-6) con un 25% de homología
con la IL-6 humana. Se ha demostrado que vIL-6 posee
actividades biológicas reminiscentes de la IL-6 humana,
es decir estimulación de la proliferación de células de
hibridoma de ratón y de mieloma humano. Más
recientemente, se ha demostrado en ratones a los que se
inyectaba células NIH3T3 transfectadas con vIL-6, que
vIL-6 inducía angiogénesis y hematopoyesis. Se concluyó
que mediante estas funciones vIL-6 juega un papel
importante en la patogénesis de las enfermedades
asociadas a HHV8. La contribución del IL-6R a la
señalización por vIL-6 ha generado polémica. Un grupo
utilizando sobrenadantes no purificados de células
COS-7 transfectadas con vIL-6 ha demostrado que la
actividad STAT se inducía en células que expresaban
gp130 pero no IL-6R. Por el contrario, otro grupo ha
hallado que la actividad de vIL-6 se reducía mediante
un antagonista de IL-6R abogando por una participación
de IL-6R en la señalización por vIL-6.
Por tanto, la presente invención también se refiere a
una composición farmacéutica que contiene una cantidad
efectiva de un polipéptido-dímero o de un polinucleótido de
la presente invención, preferentemente combinado con un
vehículo farmacéuticamente aceptable. El término
“farmacéuticamente aceptable” pretende englobar cualquier
vehículo, que no interfiera con la efectividad de la
-25 –
actividad biológica del principio activo y que no sea tóxico
para el huésped al que se administra. En la técnica son bien
conocidos ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables
entre los que se incluyen soluciones salinas tamponadas con
fosfato, agua, emulsiones tales como emulsiones aceite/agua,
diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles,
etc. Dichos vehículos pueden formularse mediante métodos
convencionales y pueden administrarse al individuo a una
dosis efectiva.
El término una “cantidad efectiva” se refiere a una
cantidad del principio activo que es suficiente para afectar
el curso y la gravedad de la enfermedad, provocando la
reducción o remisión de dicha patología.
La “dosis efectiva” útil para el tratamiento y/o
prevención de estas enfermedades o alteraciones puede
determinarse utilizando métodos conocidos por los expertos
en la técnica (ver por ejemplo, Finl y otros (1975) The
Pharmacological Basis of Therapeutics (“Bases farmacológicas
de la terapéutica”), Goodman y Gilman, editores. Macmillan
Publishing Co., Nueva York, pp. 1-46).
La administración de composiciones adecuadas puede
efectuarse por diferentes vías, por ejemplo mediante
administración endovenosa, intraperitoneal, subcutánea,
intramuscular, tópica (por ejemplo mediante enema,
inhalación, ungüento, gotas) o intradérmica. La vía de
administración, obviamente, depende del tipo de tratamiento
y del tipo de compuesto contenido en la composición
farmacéutica. El régimen de dosificación vendrá determinado
por el médico al cargo y otros factores clínicos. Como es
-26 –
sabido en el técnica médica, la dosificación en un paciente
en particular depende de diversos factores, incluyendo el
tamaño del paciente, la superficie corporal, el peso, la
edad, el sexo, el compuesto en concreto a administrar, el
tiempo y vía de administración, el tipo de tratamiento, el
estado de salud y otros fármacos que se administren de forma
concomitante.
Los usos médicos preferentes de los polipéptidos-dímero
y polinucleótidos de la presente invención descritos
previamente son el tratamiento de la resorción ósea, la
hipercalcemia, la caquexia, los tumores, el cáncer, las
enfermedades autoinmunes, las enfermedades inflamatorias
como la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la
artritis reumatoide, la artritis reumatoide juvenil, el
asma, la psoriasis, el lupus eritematoso, la esclerosis
múltiple, la uveítis y otras, las infecciones virales o
bacterianas.
Los ejemplos siguientes describen la invención en mayor
detalle:
Ejemplo 1: Preparación de las variantes
sgp130(D1-D3)Sn-Fc de sgp130
(A) Material
La secuencia optimizada en codones de sgp130Fc
(longitud completa) fue sintetizada y proporcionada en forma
de un constructo pCR-Script-AMP por GeneART (Regensburg,
Alemania). Los componentes del sistema de clonación Gateway
(ADN polimerasa AccuPrime Pfx, donador de vectores pDONR221,
el vector de expresión controlado por promotor de CMV
pcDNA-DEST40, la recombinasa BP y LR para la transferencia
-27 –
del inserto y las células E. Coli competentes) se
adquirieron de Invitrogen (Karlsruhe, Alemania). El kit de
mutagénesis específica de sitio QuickChange II se obtuvo de
Stratagene (Amsterdam, Holanda). Los cebadores de
mutagénesis purificados HYPUR fueron de MWG Biotech
(Ebersberg, Alemania). Las células CHO-K1 se obtuvieron de
la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares
(Braunschweig, Alemania). Los componentes para los medios de
cultivo se obtuvieron tal como sigue: Medio F12 de Ham y PBS
(PAA Laboratories; Cölbe, Alemania), FBS (Biochrom; Berlin,
Alemania), solución Tripsina/EDTA (Invitrogen) y solución
G418 (Sigma-Aldrich; Taufkirchen, Alemania). El reactivo de
transfección Lipofectamina 2000 se obtuvo de Invitrogen.
Santa Cruz (Heidelberg, Alemania) suministró la “Protein A/G
Plus Agarose” para la inmunoprecipitación. Tanto para la
inmunoprecipitación como para la detección primaria en
membranas Western, se utilizó in anticuerpo monoclonal
IgG(Fc) antihumano de ratón (CBL102; Chemicon; Hofheim,
Alemania). La detección secundaria en las membranas Western
se realizó con un anticuerpo anti-ratón IgG unido a HRP,
substrato de transferencia Western ECL-Plus e Hyperfilm ECL
(todos de GE Healthcare; Freiburg, Alemania). Los frascos de
cultivo rotativos (2,1 L, superficie 2,5X) se obtuvieron de
Greiner Bio-One (Frickenhausen, Alemania).
(B) Construcción de sgp130(D1-D3)Sn-Fc
Sgp130Fc de longitud completa se subclonó en pDONR221
utilizando cebadores Gateway, ADN polimerasa AccuPrime Pfx y
recombinasa BP mediante un procedimiento Gateway estándar.
Se verificó completamente la secuencia del inserto
-28 –
subclonado utilizando cebadores superpuestos hacia delante y
hacia atrás cada 250-300 pares de bases. En una mutagénesis
específica de sitio con el kit QuikChange II, los dominios
D4-D6 de sgp130Fc se substituyeron por elementos
espaciadores ideales (S1, S2, S3 y S5) utilizando un par de
cebadores que salvaba el final del dominio D3 (YED) y el
- inicio
- de la parte Fc (SCD) de sgp130Fc y codificaba un
- número
- diferente de repeticiones de la secuencia de
- espaciador
- de aminoácidos
“glicina-glicina-glicina-glicina-serina” (GGGGS). La
variante sgp130(D1-D3)Fc se dejó sin espaciador (a modo de
aclaración: si se menciona una variante “sgp130(D1-D3)S0-Fc”
significa que la molécula no contiene péptido espaciador y
por tanto es idéntica a sgp130(D1-D3)Fc. Las clonas
positivas se identificaron mediante digestión de restricción
con AlwNI y se verificó mediante secuenciación completa tal
como se ha descrito anteriormente. A continuación, se
transfirió el inserto al vector de expresión pcDNA-DEST40
mediante recombinación Gateway LR. Como el inserto codifica
dos codones de finalización después de la parte Fc, los
marcadores de pcDNA-DEST40 (epítopos V5 y 6xHis) no están
presentes en las proteínas sgp130(D1-D3)Sn-Fc. De nuevo, las
clonas positivas se identificaron mediante digestión de
restricción con AlwNI: no fue necesaria la verificación de
secuencia, pues el procedimiento de recombinación Gateway es
altamente específico y no supone la amplificación de ADN. La
transferencia correcta de insertos utilizando las
recombinasas Gateway se ha verificado en experimentos
independientes en nuestro laboratorio.
-29 –
(C) Cultivo y transfección
Se cultivaron células CHO-K1 en medio F12 de Ham
suplementado con FBS al 10% a 37ºC y en una ambiente
saturado de humedad con un 5% de CO2. Los cultivos de
mantenimiento se dividieron cada 3-4 días y se utilizaron
solamente hasta los 20 pases. Las células se transfectaron
con el constructor de expresión
pcDNA-DEST40_sgp130(D1-D3)Sn-Fc utilizando Lipofectamina
2000 y condiciones estándar para CHO-K1 suministrada por
Invitrogen. Para un primer ensayo de expresión transitoria,
las células CHO-K1 se transfectaron en placas de 6 pocillos,
y se recolectaron tanto las células como los sobrenadantes
24 horas después de la transfección. Sgp130(D1-D3)Sn-Fc se
inmunoprecipitó de los sobrenadantes utilizando “Protein A/G
Plus Agarose” y el anticuerpo IgG (Fc) anti-humano según las
instrucciones del fabricante. Se extrajo la proteína total y
se realizaron transferencias Western con el anticuerpo IgG
(Fc) anti-humano con los lisados celulares y los
- inmunoprecipitados
- tal como describe Waetzig y otros, J.
- Immunol.168: 5342 (2002).
- (D) Expresión de sgp130(D1-D3)Sn-Fc en células CHO
- Tras
- una expresión transitoria exitosa, se
transfectaron células CHO-K1 y se seleccionaron utilizando
400 µg/mL de G418 en placas de 10 cm. Para obtener una
primera impresión de la calidad y propiedades del producto,
se transfirió un pool policlonal CHO-K1 preseleccionado a
frascos de cultivo rotativos. Se recolectaron los
sobrenadantes de las células confluentes tres veces por
semana, se centrifugaron dos veces a 4.000 rpm y 4ºC durante
-30 –
15 minutos para eliminar los desecho celulares y o bien se
procesaron inmediatamente o se congelaron a -80ºC. En
paralelo, se seleccionaron clonas celulares estables del
pool pre-seleccionado utilizando el método de la dilución
limitada y se caracterizaron mediante análisis de expresión
con transferencia Western tal como se ha descrito
anteriormente. La clona con la expresión más alta y estable
se transfirió a frascos de cultivo rotativos y se utilizó
para la producción adicional.
(E) Resultados
Tal como se demuestra en la figura 2,
sgp130(D1-D3)Sn-Fc (mostrado a modo de ejemplo para
sgp130(D1-D3)S1-Fc) se expresión con unas tasas de expresión
que eran incluso mejores que las obtenidas con la proteína
sgp130Fc original. Ello indica que la expresión de una
variante más pequeña de sgp130Fc parece ser mayor y confiere
ventajas para la preparación de la proteína. Finalmente,
tasas de producción mayores significaran costes menores para
la producción a nivel industrial.
(A) Material
Los filtros de acetato de celulosa (0,45 µm) para un
filtro de vacío se adquirieron de Sartorius (Göttingen
Alemania). El PBS fue de PAA Laboratories (Cölbe, Alemania).
Todos los materiales para la cromatografía de afinidad y
exclusión de tamaño (SEC) se obtuvieron de GE Healthcare
(Freiburg, Alemania): material MabSelect (código de producto
17-5199-01) en una columna XK16/20, columnas de
desalinización PD-10 y HiLoad 26/60 Superdex 200 pg para
-31 –
SEC. La unidades de concentración de membrana Amicon
Ultra-15 50 kD Ultracel-PL se adquirieron de Millipore
(Eschborn, Alemania). La solución de archilamida-bis
prefabricada (19:1, 30%) fue suministrada por Bio-Rad
(Munich, Alemania).
(B) Cromatografía de afinidad
A modo de ejemplo de la purificación de las variantes
sgp130(D1-D3)SnFc se muestra la purificación de
sgp130(D1-D3)S1-Fc. Se purificaron los sobrenadantes con
sgp130(D1-D3)S1-Fc de los cultivos en frasco de cultivo
rotativo a 4ºC utilizando una bomba peristáltica P-1 y un
sistema AKTA Purifier 100 (ambos de GE Healthcare; Freiburg,
Alemania). El protocolo se basó en las recomendaciones del
fabricante para la purificación de anticuerpos monoclonales.
Tras la centrifugación, se ajustó el pH del sobrenadante
fresco o descongelado (en hielo) a 6,7-7,0. Tras dos rondas
de filtración en vacío (0,45 µM), se desgasificó el
sobrenadante y, en caso necesario, se ajustó de nuevo el pH
a un valor de 6,7-7,0. A continuación, se cargó la columna
de cromatografía de afinidad equilibrada con PBS (6-25 mL de
MabSelect en una columna XK16/20) con 2-4 L de sobrenadante
a una velocidad de flujo de 3-10 mL/min utilizando la bomba
P-1. Tras lavado con PBS, se transfirió la columna al
purificador ÄKTA y se lavó de nuevo con PBS hasta que la A280
se estabilizó tras la eliminación cuantitativa de proteína
no unida. Para la elución el sistema ÄKTA se equipó con dos
tampones de citrato sódico 50 mM a pH de 3,25 y 5,5,
respectivamente, que se mezclaron para producir las
condiciones de pH deseadas. Una etapa de lavado a pH 5,1 se
-32 –
siguió de la elución a pH 3,7. Se recolectaron fracciones de
10 mL en tubos de 15 mL que contenían 2 mL de Tris-HCl 1 M
(pH 11). Se agruparon las fracciones de los picos, y se
midió el pH y se ajustó a 7,5, en caso necesario. La
concentración de proteína del pool se midió mediante A280 y
se concentró cuidadosamente hasta un máximo de 1,5 mg/mL
utilizando unidades Amicon Ultra-15 50 kD. Se utilizaron
columnas de desalinización PD-10 equilibradas con PBS para
cambiar el tampón a PBS, seguido de otra medición de la
concentración de proteína a 280 nm.
(C) Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) mediante
filtración de gel
Para la SEC, es recomendable una concentración máxima
de 1,2 mg/mL en PBS. La SEC se realizó con el sistema ÄKTA
en una columna HiLoad 26/60 Superdex 200 pg equilibrada con
PBS a una velocidad de flujo de 0,8 mL/min.
Sgp130(D1-D3)S1-Fc se eluyó como un pico único tras una
meseta baja de agregados de alto peso molecular (figura 4A).
En los primero pases, se obtuvieron muestras de todas las
fracciones para análisis mediante PAGE (ver más adelante).
Se agruparon las fracciones de los picos, se determinó su
concentración de proteína y se fijó a 400-500 µg/mL, y se
congelaron alícuotas de un solo uso a -80ºC para
almacenamiento a largo plazo.
(D) Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)
Se analizaron muestras del pool y de las fracciones
mediante PAGE nativa (gel de poliacrilamida al 7,5%) seguida
de tinción con argéntica o con Coomassie (figura 4A).
(E) Resultados
-33 –
Tal como se muestra en las figuras 4A y 4B, la cantidad
de productos secundarios no deseados se redujo
significativamente en comparación con el producto original
sgp130Fc, que se purificó en paralelo en otro experimento
(los resultados se muestran en la figura 3). Además, la
elución del producto principal (carriles 8 a 14 en la figura
4A) es claramente separable de las fracciones de las
impurezas (carriles 1 a 6 en la figura 4A). Sgp130Fc tiende
a generar cantidades mucho mayores de impurezas (ver el
primer pico del cromatograma y la PAGE en la figura 3).
Además, ninguna de las fracciones de la elución que contenía
el producto principal (carriles 6 a 11 en la figura 3) está
libre de impurezas. Estos resultados indican una mejora
evidente de sgp130(D1-D3)Sn-Fc en comparación con la
molécula sgp130Fc original. Sin embargo, la longitud del
espaciador es decisiva para la capacidad de purificación de
las moléculas sgp(130(D1-D3)Sn-Fc. La actividad de unión y,
por tanto, la eficacia terapéutica mejora al aumentar la
longitud del espaciador. Existe una “ventana de capacidad de
purificación óptima” con un máximo cuando n = 3 (figura 4B).
Por tanto, la longitud ideal del espaciador está entre 3 y 5
elementos, dependiendo de la necesidad de una actividad
óptima o una pureza y rendimiento óptimos.
Ejemplo 3: Comparación de las propiedades de unión al
complejo IL-6/sIL-6R de sgp130Fc y sgp130(D1-D3)Sn-Fc
(A) Material
Las placas de microtitulación de 96 pocillos Microlon
se adquirieron de Greiner Bio-One (Frickenhausen, Alemania).
La IL-6 y el receptor IL-6 soluble (sIL-6R) recombinantes
-34 –
humanos se obtuvieron de BioSource (Solingen, Alemania) y
R&D Systems (Wiesbaden, Alemania), respectivamente. El
anticuerpo primario anti-sIL-6R (clona M91, ratón IgG1) se
obtuvo de Beckman Coulter (Krefeld, Alemania). El anticuerpo
secundario anti-ratón IgG conjugado con HRP de GE Healthcare
(Freiburg, Alemania) fue el mismo que en los experimentos de
transferencia Western (ver Ejemplo 1, A y C). El substrato
de HRP tetrametilbencidina (TMB) prefabricado se adquirió de
Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Alemania).
(B) Enzimoinmunoensayo (ELISA)
Para el control de calidad y poder comparar entre lotes
diferentes de variantes de sgp130Fc se diseñó un ELISA
estándar. Todas las etapas excepto el recubrimiento se
realizaron a temperatura ambiente, todas las etapas de
lavado se realizaron tres veces con un volumen de 250 µL, y todas las condiciones de midieron por triplicado. Se recubrió una placa de microtitulación de 96 pocillos con 100 ng/pocillo de sgp130Fc original como estándar interno y una cantidad equimolar de sgp130(D1-D3)Sn-Fc en 100 µL de PBS a 4ºC durante una noche. Así la sgp130Fc y sus variantes sirvieron como reactivo de captura, detectándose el sIL-6R unido (ver más adelante). Tras el lavado con Tween-20 al 0,05% en PBS, se bloquearon todos los pocillos con 200 µL / pocillo de BSA al 3% en PBS durante 2 horas. A continuación, se eliminó la solución de bloqueo, y se incubaron los pocillos durante 1 hora con una serie de diluciones 1:2 (100 µL / pocillo) de IL-6 humana
recombinante (3,2 µg/mL a 50 ng/mL) y sIL-6R (1,6 µg/mL a 25
-35 –
ng/ml) en BSA al 3% en PBS. Tras lavar con Tween-20 al 0,05%
en PBS, los pocillos se incubaron con el anticuerpo primario
anti-sIL-6R a una dilución 1:2.000 en BSA al 3% en PBS (100
µL / pocillo) durante 1 hora. Otra serie de tres etapas de lavado con Tween-20 al 0,05% en PBS se siguió de una incubación de 1 hora con el anticuerpo secundario anti-ratón IgG conjugado con HRP a una dilución de 1:5.000 (100 µL / pocillo). Tras lavar con Tween-20 al 0,05% en PBS y subsiguientemente con dH2O, se incubaron las placas con 100 µL / pocillo de substrato TMB durante aproximadamente 5 minutos (dependiendo de la intensidad del color azul del revelado). La reacción de substrato se detuvo añadiendo a los pocillos 100 µL / pocillo de ácido sulfúrico 0,5M. Finalmente se determinó la A450 en un lector de placas de microtitulación.
(C) Resultados
Los resultados del ensayo de unión se muestran en la
figura 5. La eficiencia de unión de sgp130(D1-D3)Sn-Fc
dependía principalmente del número de repeticiones del
espaciador utilizado en las respectivas variantes. En este
caso las variantes que contenían 2 y 3 repeticiones (S2 y
S3) se unían igual o incluso mejor que sgp130Fc. Ello indica
que la modificación de la sgp130Fc originaria para mejorar
su purificación no modificaba sus actividades biológicas y
su uso potencial como medicamento para el tratamiento de las
enfermedades activadas por IL-6.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> CONARIS research institute AG
-36 –
<120> variantes solubles de la molécula gp130 útiles como
medicamento
<130> C 1068
<140> EP 05 028 420.7
<141> 2005-12-23
<160> 4
<170> PatentIn version 3.2
<210>
<211> 6
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Marcador His
<400> 1
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> secuencia del espaciador
<400> 2
<210> 3
<211> 972
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> ADNc de sgp130(D1-D3)
<400> 3
<211> 324
<212> PRT
<213> artificial
<220> 10 <223> sgp130(D1-D3)
<400> 4
-38 –
-40 –
Claims (24)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Polipéptido-dímero de dos fragmentos monoméricos, en el que los fragmentos monoméricos comprenden (a) los dominios 1 a 3 (D1 a D3) de la parte extracelular de la glicoproteína (gp) 130 pero no contienen dominios adicionales (D4 a D6) de sgp130 y (b) en sus extremos C-terminal un espaciador polipéptido que posee una longitud de 5 a 30 aminoácidos, en el que ambos fragmentos monoméricos están unidos covalentemente entre sí, en el que la longitud del espaciador determina la unión óptima de la proteína dimérica resultante al complejo IL-6/receptor de IL-6 soluble y en el que dicho polipéptido-dímero muestra un potencial significativamente reducido de formar agregados homoméricos y fragmentos de moléculas y en el que se obtiene una productividad significativamente incrementada en células huésped.
-
- 2.
- Polipéptido-dímero, según la reivindicación 1, en el que los dos fragmentos monoméricos son idénticos.
-
- 3.
- Polipéptido-dímero, según la reivindicación 1 o 2, en el que la dimerización covalente de ambos monómeros se obtiene mediante uno o más puentes disulfuro.
-
- 4.
- Polipéptido-dímero, según la reivindicación 3, en el que el o los puentes disulfuro se generan mediante la fusión de los fragmentos monoméricos a una molécula IgG-Fc.
-
- 5.
- Polipéptido-dímero, según la reivindicación 3, en el que el o los puentes disulfuro se generan mediante la
-41 – -
- 6.
- Polipéptido-dímero, según la reivindicación 1 o 2, en el que la dimerización covalente de ambos monómeros se obtiene mediante cualquier otro tipo de unión química o física.
-
- 7.
- Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el espaciador polipéptido está glicosilado selectivamente para proteger la molécula de la escisión proteolítica.
-
- 8.
- Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el espaciador polipéptido posee una longitud de 10 a 25 aminoácidos.
-
- 9.
- Polipéptido-dímero, según la reivindicación 8, en el que el espaciador polipéptido posee una longitud de 15 a 25 aminoácidos.
-
- 10.
- Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el espaciador posee la secuencia de aminoácidos (GGGGS)n siendo n 1, 2, 3, 4, 5 o
- fusión
- de los fragmentos monoméricos a un polipéptido
- natural
- o artificial, que comprende uno o más residuos
- cisteína libremente accesibles.
- 6.
-
- 11.
- Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que forma menos de un 50% de agregados homoméricos y fragmentos de moléculas.
-
- 12.
- Polipéptido-dímero, según la reivindicación 11, que forma menos de un 25% de agregados homoméricos y fragmentos de moléculas.
-
- 13.
- Polipéptido-dímero, según la reivindicación 12, que forma menos de un 10% de agregados homoméricos y fragmentos de moléculas.
-42 – -
- 14.
- Polipéptido-dímero, según la reivindicación 13, que forma menos de un 5% de agregados homoméricos y fragmentos de moléculas.
-
- 15.
- Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que los monómeros comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 8.
-
- 16.
- Polinucleótido que codifica un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
-
- 17.
- Polinucleótido, según la reivindicación 16, en el que la secuencia del polinucleótido está optimizada en codones para la producción de la proteína codifica en células huésped eucariotas, bacterias, levaduras o células de insecto.
-
- 18.
- Polinucleótido, según las reivindicaciones 16 o 17, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la figura 7.
-
- 19.
- Vector de expresión que contiene un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.
-
- 20.
- Célula huésped que contiene un vector de expresión, según la reivindicación 19.
-
- 21.
- Método para la producción de un polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende cultivar una célula huésped según la reivindicación 20, recuperar el polipéptido-monómero o dímero de dicha célula huésped o del medio de cultivo y su purificación.
-
- 22.
- Composición farmacéutica que contiene un polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones
-43 –1 a 15 o un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18. - 23. Utilización de un polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o de un 5 polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de la resorción ósea, la hipercalcemia, la caquexia, un tumor, el cáncer, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o una10 infección bacteriana o viral.
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-
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