ES2343929B2

ES2343929B2 - GEN E FOR ANTITUMORAL TREATMENT.

Info

Publication number: ES2343929B2
Application number: ES200801167A
Authority: ES
Inventors: Houria Boulaiz; Consolacion Melguizo Alonso; Jose Carlos Prados Salazar; Antonia Aranega Jiménez; Ana Rosa Rama Ballesteros; Raul Ortiz Quesada
Original assignee: Universidad de Granada
Current assignee: Universidad de Granada
Priority date: 2008-04-23
Filing date: 2008-04-23
Publication date: 2011-11-15
Anticipated expiration: 2028-04-23
Also published as: WO2009133220A1; ES2343929A1

Abstract

Gen E para el tratamiento antitumoral. Uso del gen E del bacteriófago ·X174, de su secuencia de aminoácidos y de composiciones farmacéuticas que lo contengan, que introducido y expresado en las células derivadas de tumores malignos, y especialmente en melanoma, es capaz de inducirles lesiones que las llevan a la muerte celular.Gene E for antitumor treatment. Use of the E gene of the bacteriophage · X174, its sequence of amino acids and pharmaceutical compositions containing it, which introduced and expressed in the cells derived from malignant tumors, and especially in melanoma, is capable of inducing lesions that lead to death mobile.

Description

GenEparael tratamiento antitumoral. GenEparael antitumor treatment.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología, biología molecularymedicina. Está relacionada conel desarrollode nuevos agentes parael tratamiento del cáncery, en particular, sereﬁereal uso del genEdel bacteriófago ΦX174,a su secuenciade aminoácidosy a composicionesfarmacéuticas quelo contengan, que introducidoy expresado en las células derivadasde tumores malignos,yespecialmente en melanoma, es capazde inducirles lesiones que las llevan a la muerte celular. The present invention is within the field of biology, molecular molecule biology. It is related to the development of new agents for the treatment of cancer and, in particular, the actual use of the ióX174 bacteriophage gene, to its amino acid sequence and to pharmaceutical compositions containing it, which introduced and expressed in the cells derived from malignant tumors, and especially in melanoma, is capable of inducing lesions that They lead to cell death.

Estado de la técnica anterior Prior art

La terapia génica consiste enla inserciónde genes enlas célulasde los tejidosde un individuo parael tratamiento de enfermedades.La introducciónde genes en células tumoralesparece unade las más prometedoras vías parael tratamiento del cáncer,demostrando su efectividad en diferentes tipos de tumores, mediante diferentes procedimientos: Gene therapy consists of the insertion of genes into the cells of an individual's tissues for the treatment of diseases. The introduction of genes into tumor cells seems to be one of the most promising ways for the treatment of cancer, demonstrating its effectiveness in different types of tumors, by different procedures:

1. one.: La introducción de genes supresores de tumores o inhibidores de oncogenes activados en las células tumorales. Por ejemplo, se han desarrollado tratamientos basados en el gen P53 para el sarcoma (HannayJ et al. 2007. Isolated limb perfusión: a novel delivery system for wild-type p53 and ﬁber-modiﬁed oncolytic adenoviruses to extremity sarcoma. Gene Ther., 14: 671-81), el cancer no microcítico de pulmón (Huang CL et al. 2007. Clinical signiﬁcance of the p53 pathway and associated gene therapyin non-small cell lung cancers. Future Oncol.,3:83-93),yel cáncerde próstata (Ahmad IM et al. 2007. 2-Deoxyglucose combined with wild-type p53 overexpression enhances cytotoxicity in human prostate cáncer cells via oxidative stress. Free Radie Biol Med. 28). The introduction of tumor suppressor genes or inhibitors of activated oncogenes in tumor cells. For example, treatments based on the P53 gene for sarcoma have been developed (HannayJ et al. 2007. Isolated limb perfusion: a novel delivery system for wild-type p53 and ﬁ ber-modi ﬁ ed oncolytic adenoviruses to extremity sarcoma. Gene Ther., 14 : 671-81), non-small cell lung cancer (Huang CL et al. 2007. Clinical signi ﬁ cance of the p53 pathway and associated gene therapyin non-small cell lung cancers. Future Oncol., 3: 83-93), and cancer prostate (Ahmad IM et al. 2007. 2-Deoxyglucose combined with wild-type p53 overexpression enhances cytotoxicity in human prostate cancer cells via oxidative stress. Free Radie Biol Med. 28).

2. 2.: El incremento en la inmunogenicidad de los tumores mediante la introducción de citoquinas. Por ejemplo, la transfección de genes de interleukinas para el tratamiento del glioma (Sonabend AM et al. 2008. A safety and efﬁcacy study of local delivery of interleukin-12 transgene by PPC polymer in a model of experimental glioma. Anticancer Drugs., 19: 133-142), el tratamiento del carcinoma hepatocelular (Zabala M et al. 2007. Induction of immunosuppressive molecules and regulatoryT cells counteracts the antitumor effect of interleukin-12-based gene therapyin a transgenic mouse model of liver. J Hepatol., 47: 807-815),oel cáncerde colony mama(HanariN et al. 2007. Combinatory gene therapywith electrotransfer of midkine promoter HSV-TK and interleukin-21. Anticancer Res., 27:2305-2310;Kudo-SaitoC et al. 2007. Intratumoral delivery of vector mediated IL-2 in combination with vaccine resultsin enhancedTcellavidity and anti-tumor activity. Cancer Immunol Immunother., 56: 1897-1910). The increase in the immunogenicity of tumors by the introduction of cytokines. For example, transfection of interleukin genes for the treatment of glioma (Sonabend AM et al. 2008. A safety and ef ﬁ cacy study of local delivery of interleukin-12 transgene by PPC polymer in a model of experimental glioma. Anticancer Drugs., 19 : 133-142), the treatment of hepatocellular carcinoma (Zabala M et al. 2007. Induction of immunosuppressive molecules and regulatoryT cells counteracts the antitumor effect of interleukin-12-based gene therapyin a transgenic mouse model of liver. J Hepatol., 47 : 807-815), or colony breast cancer (HanariN et al. 2007. Combinatory gene therapywith electrotransfer of midkine promoter HSV-TK and interleukin-21. Anticancer Res., 27: 2305-2310; Kudo-SaitoC et al. 2007. Intratumoral delivery of vector mediated IL-2 in combination with vaccine resultsin enhancedTcellavidity and anti-tumor activity. Cancer Immunol Immunother., 56: 1897-1910).

3. 3.: La introducción de genes que codiﬁcan para enzimas que aumentan la sensibilidadde la célula tumoral a agentes quimioterapéuticos. Por ejemplo, el tratamiento mediante la estrategia asesino-suicidas de tipo prodroga/droga basado enel usodela enzima timidin kinasao citosin desaminasa(Faneca H et al. 2007. Synergistic antitumoral effect of vinblastine and HSV-Tk/GCV gene therapymediated by albumin-associated cationic liposomes. J Control Release. Dec 14;TangQ et al. 2007. Experimental Studyof theRV-HSV-TK/GCV Suicide Gene TherapySystemin Gastric Cancer. Cancer Biother Radiopharm., 22:755-761; GopinathP et al. 2007. Apoptotic Induction with Bifunctional E. coli Cytosine Deaminase-Uracil Phosphoribosyltransferase Mediated Suicide Gene Therapyis Synergized by CurcuminTreatment In vitro. Mol Biotechnol., 19;NegroniL et al. 2007.Treatmentof colon cancer cells using the cytosine deaminase/5-ﬂuorocytosine suicide system induces apoptosis, modulation of the proteome, and Hsp90beta phosphorylation. Mol Cancer Ther., 6:2747-2756). The introduction of genes that code for enzymes that increase the sensitivity of the tumor cell to chemotherapeutic agents. For example, treatment by the drug-killer strategy of prodrug / drug-based use of the enzyme thymidine kinasao cytosine deaminase (Faneca H et al. 2007. Synergistic antitumoral effect of vinblastine and HSV-Tk / GCV gene therapymediated by albumin-associated cationic liposomes. J Control Release. Dec 14; TangQ et al. 2007. Experimental Study of the RV-HSV-TK / GCV Suicide Gene Therapy System Gastric Cancer. Cancer Biother Radiopharm., 22: 755-761; GopinathP et al. 2007. Apoptotic Induction with Bifunctional E. coli Cytosine Deaminase-Uracil Phosphoribosyltransferase Mediated Suicide Gene Therapyis Synergized by CurcuminTreatment In vitro. Mol Biotechnol., 19; NegroniL et al. 2007.Treatmentof colon cancer cells using the cytosine deaminase / 5- ﬂ uorocytosine suicide system moduli apoptos the proteome, and Hsp90beta phosphorylation. Mol Cancer Ther., 6: 2747-2756).

4. Four.: La introducción de genes que controlados por promotores tejido especíﬁcos inducen la muerte selectivade la célula tumoral. Por ejemplo, genes de lisis de acción directa (Olijslagers SJ et al. Additive cytotoxic effect of apoptin and chemotherapeutic agents paclitaxel and etoposide on human tumour cells. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2007, 100:127-131; Agu CA et al. The cytotoxic activity of the bacteriophage lambda-holin protein reduces tumour growth rates in mammary cancer cell xenograft models. J Gene Med. 2006; 8:229-241.; Boulaiz et al.Transfection of MSR3 melanoma cells with gef gene inhibit proliferation and induce modulation of the cell cycle. Cancer Science, 2003, 94: 564-568). The introduction of genes that controlled by specific tissue promoters induce selective death of the tumor cell. For example, direct-acting lysis genes (Olijslagers SJ et al. Additive cytotoxic effect of apoptin and chemotherapeutic agents paclitaxel and etoposide on human tumor cells. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2007, 100: 127-131; Agu CA et al. The cytotoxic activity of the bacteriophage lambda-holin protein reduces tumor growth rates in mammary cancer cell xenograft models. J Gene Med. 2006; 8: 229-241 .; Boulaiz et al. Transfection of MSR3 melanoma cells with gef gene inhibit proliferation and induce modulation of the cell cycle. Cancer Science, 2003, 94: 564-568).

En relación a este último apartado, la utilización de genes de acción directa, cabe destacar los siguientes sistemas: In relation to this last section, the use of direct action genes, the following systems should be highlighted:

a) Sistema de la linamarasa/linamarina que inducehipoxiayestrés oxidativoutilizando cianuro (CortesML et al. Cyanide bystander effect of the linamarase/linamarine killer-suicide gene therapysystem”. Journal Gene Medicine. 2002, 4:407-414.Patente.Nº 200503173.Patente Internacional PCT/ES2006/000702). a) The linamarase / linamarin system that induces hypoxyayesters by oxidizing or using cyanide (CortesML et al. Cyanide bystander effect of the linamarase / linamarine killer-suicide gene therapysystem. ”Journal Gene Medicine. 2002, 4: 407-414. Patent. No. 200503173.Patente International PCT / ES2006 / 000702).

b)Sistema basado en adenovirus oncolíticos para lesionar Sistema terapéutico basado en la transfección mediante adenovirus con capacidadde células tumorales (JiangH, Gomez-ManzanoC, AlemanyR, MedranoD, AlonsoM, BekeleBN,LinE, ConradCC,YungWK,FueyoJ. Comparativeeffectof oncolytic adenoviruses withE1A-55kDa orE1B-55kDa deletionsin malignant gliomas. Neoplasia. 7:48-56. 2005.Patente: P200600216.(R AlemanyandM Cascalló). b) Oncolytic adenovirus-based system to injure Therapeutic system based on adenovirus transfection with tumor cell capacity (JiangH, Gomez-ManzanoC, AlemanyR, MedranoD, AlonsoM, BekeleBN, LinE, ConradCC, YungWK, FueyoJ. Comparativeeffectof oncolytic adenoviruses withDa1A-55A-55 orE1B-55kDa deletionsin malignant gliomas Neoplasia 7: 48-56 2005. Patent: P200600216 (R AlemanyandM Cascalló).

c) Sistema del gen del factor de transcripción E2F-1 para tumores sólidos (DongY.B.,Yang H.L., Elliott M.J., Liu T.J., Stilwell A., Atienza C., McMasters K.M. Adenovirus mediated E2F-1 gene transfer efﬁciently induces apoptosis in melanoma cells. American Cancer Society, 1999; 86: 2021-2033). c) E2F-1 transcription factor gene system for solid tumors (DongY.B., Yang HL, Elliott MJ, Liu TJ, Stilwell A., Atienza C., McMasters KM Adenovirus mediated E2F-1 gene transfer ef ﬁ ciently induces apoptosis in melanoma cells, American Cancer Society, 1999; 86: 2021-2033).

d) Sistema de la apoptina, gen viral que induce apoptosis en células tumorales. (Noteborn M. Apoptin acts as a tumor-speciﬁc killer: potentials for an anti-tumor therapy. Cell. Mol. Biol, 2003). d) Apoptin system, a viral gene that induces apoptosis in tumor cells. (Noteborn M. Apoptin acts as a tumor-speci ﬁ c killer: potentials for an anti-tumor therapy. Cell. Mol. Biol, 2003).

e) Sistemasdelas Perforinasque lesionanlas membranas celulares [NarumiK,KojimaAand CrystalRG: Adenovirusvector-mediated perforinexpresión drivenbya glucocorticoid-inducible promoter inhibits tumor growth in vivo. AmJRespir Cell Biol 19:936-941, 1998]. e) Perforin systems that damage cell membranes [NarumiK, KojimaAand CrystalRG: Adenovirusvector-mediated perforinexpression drivenbya glucocorticoid-inducible tumor growth promoter in vivo. AmJRespir Cell Biol 19: 936-941, 1998].

f) Sistema del gende bacteriófago λ-holin que origina poros en la membrana celular (Agu CA, Klein R, Lengler J, SchilcherF, GregorW, PeterbauerT, BlasiU, SalmonsB, GunzburgWH and HohenadlC. 2007. Bacteriophageencoded toxins: the lambda-holin protein causes caspase-independent non-apoptotic cell death of eukaryotic cells. Cell Microbiol 9: 1753-1765). f) λ-holin bacteriophage gende system that causes pores in the cell membrane (Agu CA, Klein R, Lengler J, SchilcherF, GregorW, PeterbauerT, BlasiU, SalmonsB, GunzburgWH and HohenadlC. 2007. Bacteriophageencoded toxins: the lambda-holin protein causes caspase-independent non-apoptotic cell death of eukaryotic cells. Cell Microbiol 9: 1753-1765).

g) Sistema del gen gef que induce diferenciación celular (Boulaiz et al. 2003.Transfection of MSR3 melanoma cellswithgefgene inhibitproliferationand induce modulationofthecellcycle. Cancer Science, 94: 564-568). g) Gef gene system that induces cell differentiation (Boulaiz et al. 2003. Transfection of MSR3 melanoma cells withgefgene inhibitproliferationand induces modulationofthecellcycle. Cancer Science, 94: 564-568).

El empleo de otras proteínas de bacteriófagos para el tratamiento de enfermedades o desordenes proliferativos ya ha sido descrito.Así,enWO/2006/008312se describeelempleode proteínas holinde bacteriófagos(yen particular dela proteína S105 delfago λ)para inhibir el crecimiento celular o inducir la muerte celular, lo que es especialmente útil para limitar el crecimiento de células cancerosas o erradicarlas, sirviendo para el tratamiento del cáncer. The use of other bacteriophage proteins for the treatment of proliferative diseases or disorders has already been described. Thus, in WO / 2006/008312 it is described as using bacteriophage holin proteins (and in particular S105 protein λ) to inhibit cell growth or induce cell death , which is especially useful for limiting the growth of cancer cells or eradicating them, serving to treat cancer.

La proteínaEdel bacteriófago ΦX174 posee un totalde91 aminoácidos, con carácter muy hidrofóbicoy con una regiónN-terminal implicada en la inserción en la membrana siendo necesario su oligomerización para su correcta función. De sus cuatro dominios el primero es esencial para la lisis ya que a través de él se ancla a membrana (Lubitz W.et al. 1984. Requirement for a functional host cell autolytic system for lysis of Escherichia coli by bacteriophage ΦX174. J. Bacteriol. 15385-387). Un cambio conformacional en la Prolina de la posición 21 permite la formación de un puente disulfuro (SchonP. et al.1995.Two-stagemodelforintegrationoflysisproteinEof bacteriophagephiX174 into the cell envelope of Escherichia coli. FEMS Microbiol. Rev. 17:207-212) con el que se inicia la formación de un túnel transmembrana (Witte, A. et al. 1997. Proline 21, a residue within the alpha-helical domain of ΦX174 lysis protein E, is required for itsfunction in E. Coli. Molecular Microbiology. 26, 337-346). The bacteriophage ΦX174 protein has a total of91 amino acids, with a very hydrophobic character and an N-terminal region involved in the insertion into the membrane, and oligomerization is necessary for its correct function. Of its four domains, the first is essential for lysis since it is membrane anchored through it (Lubitz W. et al. 1984. Requirement for a functional host cell autolytic system for lysis of Escherichia coli by bacteriophage ΦX174. J. Bacteriol 15385-387). A conformational change in Proline from position 21 allows the formation of a disulfide bridge (SchonP. Et al. 1995. Two-stagemodelforintegrationoflysisproteinEof bacteriophagephiX174 into the cell envelope of Escherichia coli. FEMS Microbiol. Rev. 17: 207-212) with the that the formation of a transmembrane tunnel begins (Witte, A. et al. 1997. Proline 21, a residue within the alpha-helical domain of ΦX174 lysis protein E, is required for itsfunction in E. Coli. Molecular Microbiology. 26, 337-346).

Explicación de la invención Explanation of the invention.

Enla presenteinvenciónse describeel usodelgenEdel bacteriófago ΦX174(ydela proteínaqueexpresa)parael tratamiento de desórdenes proliferativos principalmente de carácter maligno, entre los que se encuentra el melanoma. The present invention describes the use of the faX174 bacteriophage gene (and the protein it expresses) for the treatment of proliferative disorders mainly of a malignant nature, including melanoma.

En un primer aspecto de la invención, se describe un polinucleótido de ARN o ADN aislado, de aquí en adelante polinucleótido de la invención, capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica, con una identidad con la SEQ ID Nº1de al menos un 50%, preferentemente de al menos un 60%, más preferentemente de al menos un 80%,ymás preferentemente de al menos un 90%, de al menos un 95% o de un 100%, para su uso en el tratamiento de desórdenes proliferativos. In a first aspect of the invention, an isolated RNA or DNA polynucleotide is described, hereinafter polynucleotide of the invention, capable of being translated into an amino acid sequence, with an identity with SEQ ID No. 1 of at least 50%, preferably at least 60%, more preferably at least 80%, and more preferably at least 90%, at least 95% or 100%, for use in the treatment of proliferative disorders.

Otro aspecto de la invención se reﬁere a una secuencia aminoacídica, de aquí en adelante secuencia aminoacídica de la invención, que comprende un péptido con una identidad con la SEQ ID Nº 1 de al menos un 80%, y más preferentemente de al menos un 90%, de al menos un 95% o de un 100%, para su uso en el tratamiento de desórdenes proliferativos. Another aspect of the invention relates to an amino acid sequence, hereinafter amino acid sequence of the invention, comprising a peptide with an identity with SEQ ID No. 1 of at least 80%, and more preferably of at least 90 %, of at least 95% or 100%, for use in the treatment of proliferative disorders.

LaSEQ ID NO:1recoge la secuencia de aminoácidos de la proteínaEaislada del bacteriófago ΦX174. Cuando comparamos la secuencia de la proteína E del bacteriófago ΦX174 con la secuencia de otras proteínas E de lisis aisladasde otras especiesdefagos(fago NC13, NC10, ΦK, ID8, α3, G4,WA2,...) esevidente queexisten ciertas regiones en que están más conservadas que otras. Esta información puede ser indicativade que esas zonas son cruciales para mantenerlaestructuraofuncióndelaproteína.Portanto,puedeesperarsequelaidentidadglobaldelasproteínas de lisis homologasala proteínaEdel bacteriófago ΦX174,aniveldelos aminoácidos,y más concretamenteanivel dela secuencia aminoacídicaquese recogeenlaSEQIDNO:1, seadeun50%o mayor,ymás preferiblementede un60%o mayorymás preferiblementedeun80,oun90%,un95%o mayor.La correspondencia entrela secuencia aminoacídicadela(s) proteína(s)E putativa(s)y la secuenciade otras proteínasse puede determinarpor métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, aquéllas se pueden determinar por una comparación directa de la información de secuencia aminoacídica procedentedela proteínaEhomologa putativa,yla secuencia aminoacídica que se recoge enlaSEQIDNO:1de estamemoria. The SEQ ID NO: 1 collects the amino acid sequence of the isolated bacteriophage ΦX174 protein. When we compare the sequence of bacteriophage protein ΦX174 with the sequence of other lysis proteins E isolated from other phage species (phage NC13, NC10, ΦK, ID8, α3, G4, WA2, ...) that there are certain regions where they are more preserved than others. This information may be indicative that these areas are crucial to maintain the protein function structure. However, the global identity of the homologous lysis proteins can be expected from the bacteriophage ΦX174, at the level of the amino acids, and more specifically at the level of the amino acid sequence that is collected in SEQIDNO: 1, preferably greater than 50% or more than 50% or more than 50% %, 95% or greater. The correspondence between the putative protein (s) amino acid sequence and the sequence of other proteins can be determined by methods known in the art. For example, they can be determined by a direct comparison of the amino acid sequence information from the putative Homologous protein, and the amino acid sequence that is collected in the SEQIDNO: 1 of the memory.

Péptidos homólogosala proteínaEdel bacteriófago ΦX174 (SEQ ID NO: 1) mantendrían su función biológica. Por ejemplo, la actividad de lisis de la célula hospedadora que reside en la porción N-terminal (Blasi and Lubitz 1985. Inﬂuence of C-terminal modiﬁcations of ΦX174 lysis geneEon its lysis-inducing properties. J. Gen. Virol. 66: 12091213.),querequiereun sistema enzimático autolíticode dicha célulahospedadora (Holtjey vanDuin 1984.MS2phage induced lysis of E. coli dependsupontheactivityofthe bacterial autolysins.Pp.195-199inC.Nombela,ed. Microbial cell wall synthesis and autolysis. Elsevier Science; Lubitz et al. 1984. Requirement for a functional host cell autolytic enzyme system for lysis of Escherichia coli by bacteriophage ΦX174.J. Bacterial. 159:385-387). Homologous peptides of the bacteriophage EX174 protein (SEQ ID NO: 1) would maintain their biological function. For example, the lysis activity of the host cell residing in the N-terminal portion (Blasi and Lubitz 1985. In ﬂ uence of C-terminal modifications of ΦX174 lysis geneEon its lysis-inducing properties. J. Gen. Virol. 66: 12091213 .), which requires an autolytic enzyme system from said host cell (Holtjey vanDuin 1984.MS2phage induced lysis of E. coli dependsupontheactivityofthe bacterial autolysins.Pp.195-199inC.Nombela, ed. Microbial cell wall synthesis and autolysis. Elsevier Science; Lubitz et al. 1984 Requirement for a functional host cell autolytic enzyme system for lysis of Escherichia coli by bacteriophage ΦX174.J. Bacterial. 159: 385-387).

Estos péptidos homólogosala proteínaEdel bacteriófago ΦX174 podrían sermodiﬁcados para potenciarla actividadbiológicadedicha enzima.Así,porejemplo,sepodrían sustituiraminoácidosenlaSEQIDNO:1parapotenciar dicha actividad.Los métodos para producir tales secuenciasderivadas aﬁnes,por ejemplo,por mutagénesis dirigidaal sitio, mutagénesis aleatoria, o escisión enzimática y/o ligación de ácidos nucleicos, son bien conocidos en la técnica, como lo son los métodos para determinar si el ácido nucleico así modiﬁcado tiene una homología signiﬁcativa con la secuenciaqueseestá considerando,por ejemplo,por hibridación.Estos péptidos serían homólogosala secuenciade aminoácidosdela SEQIDNO:1. These homologous peptides of the ióX174 bacteriophage protein could be modified to potentiate the biological activity of this enzyme. of nucleic acids, are well known in the art, as are the methods to determine if the nucleic acid so modified has a significant homology with the sequence that is being considered, for example, by hybridization. These peptides would be homologous to the amino acid sequence of SEQIDNO: 1.

Por tanto, como “gen E”, en el contexto de la presente invención, se deﬁne una secuencia de nucleótidos o polinucleótido,que constituyela secuencia codiﬁcantedela proteínaE,yque comprenderíadiversasvariantes procedentes de: Therefore, as a "gene E", in the context of the present invention, a nucleotide or polynucleotide sequence is defined, constituting the proteinE coding sequence, and which comprise various variants from:

a) moléculas de ácido nucléico que codiﬁcan un polipéptido que comprende la secuencia amínoacídica de la SEQ ID NO: 1, a) Nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,

b) moléculas de ácido nucléico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), b) nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),

c) moléculas de ácido nucléico cuya secuencia diﬁere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code,

d) moléculas de ácido nucléico que codiﬁcan un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidadde,al menos,un99%,98%,95%,oun90% conlaSEQIDNO:1 d) Nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 99%, 98%, 95%, or 90% with the SEQIDNO: 1

en las que el polipéptido codiﬁcado pordichos ácidos nucleicos posee la actividad biológica del genEdel bacteriófago ΦX174. in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the biological activity of the ióX174 bacteriophage gene.

Enotroaspectodelainvenciónse proporcionauna construccióngenéticadeADNoARN,en adelante construcción genética de la invención, la cual dirigiría la transcripción in vitro o intracelular del polinucleótido de la invención,y que comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: In another aspect of the invention there is provided a genetic construction of DNARNA, hereinafter genetic construction of the invention, which would direct the in vitro or intracellular transcription of the polynucleotide of the invention, and comprising at least one of the following types of sequences:

a) secuencia de nucleótidos, preferiblemente de doble cadena, que comprende, al menos, la secuencia codiﬁcante delaSEQIDNO:1parasutranscripción in vitro o in vivo,o a) nucleotide sequence, preferably double stranded, comprising at least the coding sequence of the SEQIDNO: 1 in vitro or in vivo para-transcription, or

b) secuencia de nucleótidos, preferiblemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende la secuencia codiﬁcante de la SEQ ID NO: 1, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc...para su uso en el tratamiento de desórdenes proliferativos. b) nucleotide sequence, preferably double stranded, corresponding to a gene expression system or vector comprising the coding sequence of SEQ ID NO: 1, operably linked with at least one promoter that directs the transcription of said sequence of nucleotides of interest, and with other sequences necessary or appropriate for transcription and their appropriate regulation in time and place, for example, start and end signals, cut sites, polyadenylation signal, origin of replication, transcriptional activators (enhancers), transcriptional silencers (silencers), etc ... for use in the treatment of proliferative disorders.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición (de aquí en adelante composición de la invención) que comprende el polinucleótido de la invención, la secuencia aminoacídica de la invención, y/o la construcción genética de la invención, o cualquiera de sus combinaciones, para su uso en el tratamiento de desordenes proliferativos. In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a composition (hereinafter composition of the invention) comprising the polynucleotide of the invention, the amino acid sequence of the invention, and / or the genetic construction of the invention, or any of its combinations, for use in the treatment of proliferative disorders.

En esta memoria se entiende por “desordenes proliferativos” aquellos tales como por ejemplo, hiperplasia prostética benigna, adenomatosisfamiliar, poliposis, neuroﬁbromatosis, psoriasis, proliferaciónde células lisasvasculares asociada con aterosclerosis, fíbrosis pulmonar, artritis, glomerulonefritisyestenosisyreestenosis posquirúrgicas,y se entiende por “desórdenes proliferativos malignos”, una variedad de cánceres incluyendo, pero sin limitar: carcinoma tal como de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, esófago,vesícula biliar,ovario, páncreas, estómago, cuello uterino, tiroides, próstatay piel, incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma de no Hodking, linfoma de células pilosas,ylinfoma de Burkett; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluyendo leucemias mielogénicas agudasycrónicas, síndrome mielodisplásicoyleucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimático, incluyendo ﬁbrosarcomayrabdomiosarcoma; tumoresdel sistema nervioso centralyperiférico,incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, gliomay schwannommas; otros tumores, incluyendo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, osteosarcoma, xeroderma pigmentario, queratoacantoma, cáncer folicularde tiroidey sarcomade Kaposi. In this report, "proliferative disorders" are understood to be those such as, for example, benign prostatic hyperplasia, familial adenomatosis, polyposis, neurophromatosis, psoriasis, lysasvascular cell proliferation associated with atherosclerosis, pulmonary fibrosis, arthritis, glomerulonephritis and post-surgical restenosis, and "proliferative" malignant ”, a variety of cancers including, but not limited to: carcinoma such as bladder, breast, colon, kidney, liver, lung, including small cell lung cancer, esophagus, gallbladder, ovary, pancreas, stomach, cervix , thyroid, prostate and skin, including squamous cell carcinoma; hematopoietic tumors of lymphoid lineage, including leukemia, acute lymphocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, B-cell lymphoma, T-cell lymphoma, Hodgkin lymphoma, non-Hodking lymphoma, hair cell lymphoma, and Burkett lymphoma; hematopoietic tumors of myeloid lineage, including acute and chronic myelogenous leukemias, myelodysplastic syndrome and promyelocytic leukemia; tumors of mesenchymal origin, including ﬁ brosarcomayrabdomiosarcoma; centrally peripheral nervous system tumors, including astrocytoma, neuroblastoma, gliomay and schwannommas; other tumors, including melanoma, seminoma, teratocarcinoma, osteosarcoma, pigmentary xeroderma, keratoacanthoma, thyroid follicular cancer and Kaposi's sarcoma.

En esta memoria, se entiende por “melanoma” un tumor maligno de los melanocitos, que se encuentra principalmente en piel, pero también enel sistemagastrointestinaly enel ojo.Es unode los cánceresde piel raros, pero causa la mayoría de las muertes por cáncer de piel. Se debe principalmente a un crecimiento incontrolado de las células pigmentarias, llamadas melanocitos. In this report, "melanoma" means a malignant tumor of the melanocytes, which is found mainly in the skin, but also in the gastrointestinal system and in the eye. It is one of the rare skin cancers, but causes the majority of skin cancer deaths. It is mainly due to uncontrolled growth of pigment cells, called melanocytes.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, los desórdenes proliferativos son desórdenes proliferativos malignos. En una realización aún más preferida de este aspecto de la invención, el desorden proliferativo maligno es el melanoma. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, proliferative disorders are malignant proliferative disorders. In an even more preferred embodiment of this aspect of the invention, the malignant proliferative disorder is melanoma.

Lascomposicionesdela presenteinvención permitenla transfección del polinucleótido,dela secuencia aminoacídicaodela construcción genéticadelainvenciónal interiorde una célula, in vivo o in vitro. La transfección se podría llevaracabo,perosin limitarnosa,transfeccióndirecta(sistemasquímicoscomo transferenciaconfosfatodecalcio,o físicos como la microinyección, la electroporación, o la introducción del ADN desnudo) o vectores (no virales, como por ejemplo los liposomas, liposomas catiónicos,o biolísticao Gene-gun;ovectores virales como retrovirus, adenovirus, virusadenoasociados(VAA),oherpesvirus)quefacilitenel accesodela proteínade lisis celulardelainvenciónal interiordela célula.Así, ejemplosde estosvectores son,sin limitarsea, retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del Herpes simplex, plásmidosdeDNA no virales, liposomas catiónicosyconjugados moleculares. The compositions of the present invention allow transfection of the polynucleotide, amino acid sequence or genetic construction of the invention inside a cell, in vivo or in vitro. The transfection could be carried out, but not limited, direct transfection (chemical systems such as transfer with calcium phosphate, or physical such as microinjection, electroporation, or the introduction of naked DNA) or vectors (non-viral, such as liposomes, cationic liposomes, or biolistic Gene-gun). ; viral shepherds such as retroviruses, adenoviruses, non-associated virus (VAA), or herpesvirus) that facilitate access to the cell lysis protein of the cell's internal invention. Thus, examples of these vectors are, without limitation, retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes simplex viruses, non-viral plasmids cationic liposomes and molecular conjugates.

Así, por ejemplo, la secuencia aminoacídica de la presente invención, así como el polinucleótido de la invención, pueden conjugarse con péptidoso proteínasde liberaciónu otros compuestosparafavorecersu transporteal interior de la célula. Entre estas proteínas se encuentran aquellas conocidas en el estado del arte, que tienen propiedades que favorecen la penetración en las células. Thus, for example, the amino acid sequence of the present invention, as well as the polynucleotide of the invention, can be conjugated with peptide or release proteins or other compounds to favor their internal transport of the cell. Among these proteins are those known in the state of the art, which have properties that favor cell penetration.

Una propiedad interesante de los liposomas es su habilidad natural para penetrar en células cancerosas. La pared endotelialdelosvasos sanguíneosen humanos sanos está recubiertapor células endotelialesque están unidasporla zonula occludens o“tight junctions”. Estas retienen grandespartículas enla sangre impidiendo suextravasación. Los vasos que nutren células tumorales no contienen el mismo nivel de selladoy son diagnósticamente más permeables. Los liposomas de ciertos tamaños, generalmente menores a 400 nm, pueden entrar rápidamente en áreas tumorales desdela sangre,pero son retenidosenel torrente sanguíneoporlas paredes endotelialesdelos tejidosvasculares sanos. Esta habilidad se conoce como “Enhanced Permeabiiity and Retention (EPR) effect”. Por ello, resulta especialmente adecuado formular moléculas anticancerígenas en liposomas. An interesting property of liposomes is their natural ability to penetrate cancer cells. The endothelial wall of healthy human blood vessels is covered by endothelial cells that are joined by the occludens zonula or tight junctions. These retain large particles in the blood preventing their extraction. Vessels that nourish tumor cells do not contain the same level of sealing and are diagnostically more permeable. Liposomes of certain sizes, generally smaller than 400 nm, can quickly enter tumor areas from the blood, but they are retained in the bloodstream through the endothelial walls of healthy vascular tissues. This ability is known as "Enhanced Permeabiiity and Retention (EPR) effect". Therefore, it is especially suitable to formulate anticancer molecules in liposomes.

Otro aspecto de la invención se reﬁere a una composición que comprende el polinucleótido de la invención, la secuencia aminoacídica de la invención, la construcción genética de la invención, o cualquiera de sus combinaciones, yademás un sistema lipídico. Another aspect of the invention relates to a composition comprising the polynucleotide of the invention, the amino acid sequence of the invention, the genetic construction of the invention, or any combination thereof, and also a lipid system.

La transfección del polinucleótido,la secuencia aminoacídicaola construccióngenéticadelainvención, se puede realizar, por tanto, mediante un sistema lipídico. Los liposomas que comprenden lípidos catiónicos pueden encontrar también utilización como portadores para terapéutica genética enaplicaciones in vivo.Se han utilizado desde hacemás de 20 años, como por ejemplo, el liposoma de dioleoxilfosfatidiletanolamina (DOTMA) que transfectaba con éxito un vector que expresa ADNc-luciferasa en cerebro embrionario de Xenopus in vivo. Transfection of the polynucleotide, the amino acid sequence or genetic construction of the invention, can therefore be performed by a lipid system. Liposomes comprising cationic lipids can also find use as carriers for genetic therapy in applications in vivo. They have been used for more than 20 years, such as, for example, dioleoxylphosphatidylethanolamine (DOTMA) liposome that successfully transfected a vector that expresses cDNA-luciferase in Xenopus embryonic brain in vivo.

La clave del éxito de la transfección por medio de vectores lipídicos radica en que protegen mecánicamente al ADN de la degradación plasmática, ofreciendo a la vez la oportunidad de controlar su biodistribución, independientemente del tamaño del segmentode ADN que se quieraexpresar. Asimismo, son no carcinogénicosypobremente inmunogénicos.ycadavez son más eﬁcientes frentea losvectores virales, sumadoa lasventajasdeextremaversatilidad,facilidad de preparaciónybioseguridad propias de las moléculas autoensamblables. Además, los liposomas pueden formularseventajosamenteen formasde administración tales como geles, pomadas, locionesysimilares,de acuerdo con procedimientos conocidos. Por tanto, en una realizaciónpreferida de este aspecto de la invención, el sistema lipídico es un liposoma. The key to the success of transfection through lipid vectors is that they mechanically protect DNA from plasma degradation, while offering the opportunity to control its biodistribution, regardless of the size of the segment of DNA to be expressed. They are also non-carcinogenic and poorly immunogenic, and they are perhaps more efficient against viral vectors, in addition to the advantages of versatility, ease of preparation and safety of the self-assembling molecules. In addition, liposomes can be advantageously formulated in administration forms such as gels, ointments, lotions and similar, according to known procedures. Therefore, in a preferred embodiment of this aspect of the invention, the lipid system is a liposome.

Un “liposoma”, taly como se entiende en esta memoria, es unavesícula esférica con una membrana compuesta de un fosfolípido y un colesterol bicapa. Los liposomas pueden estar compuestos de fosfolípidos derivados en la naturaleza con cadenas de lípidos mezclados (como la fosfatidiletanolamina presente en el huevo) o de componentes tensoactivos como elDOPE (dioleolylphosphatidylethanolamine). Por deﬁnición, los liposomas contienen un núcleo de solución acuosa; los lípidos esféricos que contienen material no acuoso se denominan micelas. A "liposome," as understood herein, is a spherical vesicle with a membrane composed of a phospholipid and a bilayer cholesterol. Liposomes can be composed of naturally-derived phospholipids with chains of mixed lipids (such as phosphatidylethanolamine present in the egg) or of surfactant components such as PDO (dioleolylphosphatidylethanolamine). By definition, liposomes contain a core of aqueous solution; spherical lipids that contain non-aqueous material are called micelles.

Se contempla que las composicionesdela presenteinvención puedan ser composicionesfarmacéuticas, que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de la secuencia polinucleotídica, de la secuencia de aminoácidosy/o delas construcciones genéticasdeARNóADNdelainvención,o cualquieradesus combinaciones,juntocon,opcionalmente,unoomásadyuvantesy/ovehículosfarmacéuticamente aceptables. It is contemplated that the compositions of the present invention may be pharmaceutical compositions, which comprise a therapeutically effective amount of the polynucleotide sequence, of the amino acid sequence and / or of the genetic constructions of the NADAD of the invention, or any combination thereof, optionally with one more adjuvant and pharmaceutically acceptable sheep.

Por tanto, en otro aspecto de la invención se proporciona una composición, de aquí en adelante composiciónfarmacéuticadelainvención, que contienela secuenciade polinucleótidosdelainvención,lasecuenciade aminoácidos delainvención,la construcción genéticadelainvención,o cualquierade sus combinaciones,y un sistema lipídico, para su uso como medicamento. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composiciónfarmacéutica de la invención se usa para el tratamiento de desórdenes proliferativos. En una realización más preferida de este aspectodelainvención,los desórdenes proliferativos son malignos,yen una realización particularde este aspecto de la invención, el desorden proliferativo maligno es el melanoma. Thus, in another aspect of the invention there is provided a composition, henceforth pharmaceutical composition of the invention, which contains the sequence of polynucleotides of the invention, the amino acid sequence of the invention, the genetic construction of the invention, or any combination thereof, and a lipid system, for use as a medicine. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the pharmaceutical composition of the invention is used for the treatment of proliferative disorders. In a more preferred embodiment of this aspect of the invention, proliferative disorders are malignant, and in a particular embodiment of this aspect of the invention, the malignant proliferative disorder is melanoma.

El término“medicamento”, taly como se usa en esta memoria,hace referenciaa cualquiersustancia usada para prevención, diagnóstico,alivio, tratamientoo curaciónde enfermedadesenel hombreylos animales.Enel contexto dela presenteinvenciónse reﬁere,por tanto,al usode composiciónfarmacéuticadelainvención como medicamento. The term "medication", as used herein, refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of disease in man and animals. In the context of the present invention it refers, therefore, to the use of pharmaceutical composition of the invention as a medicine.

Aunque sin limitarse, dicha composición farmacéutica puede aplicarse a cualquier tejido u órgano canceroso empleando las vías de administración conocidas en el estado de la técnica, por ejemplo por administración intratumoral Although not limited, said pharmaceutical composition can be applied to any tissue or cancerous organ using the routes of administration known in the state of the art, for example by intratumoral administration.

ointravesical.Lostejidosyórganoscancerosos incluyencualquiertipodetejidouórganoquetengauna membrana epitelial, tales comoel tractogastrointestinal,lavejiga,eltracto respiratorio,la vulva,el cérvix,lavaginao los bronquios; los tumores metastásicos locales del peritoneo; el cáncer bronquio-alveolar; el cáncer metastásico pleural; el cáncerdela bocaydelas amígdalas;el cáncer nasofaríngeo,de nariz,de laringe,de esófago,de estómago,decolon yde recto,delavesícula biliar,dela miel;ymás particularmenteel melanoma. or intravesical. Cancer tissues and organs include any type of tissue that has an epithelial membrane, such as the gastrointestinal tract, the bladder, the respiratory tract, the vulva, the cervix, lavagina or the bronchi; local metastatic tumors of the peritoneum; bronchial-alveolar cancer; pleural metastatic cancer; cancer of the mouth and tonsils; nasopharyngeal, nose, larynx, esophageal, stomach, decolon and rectum, biliary vesicle, honey; and more particularly melanoma.

En el contexto de la presente invención el término “homología”, tal y como se utiliza en esta memoria, hace referenciaala semejanza entredos estructuras debidaa una ascendenciaevolutiva común,ymás concretamente,ala semejanza entre los aminoácidos de dos o más proteínas o secuencias aminoacídicas. In the context of the present invention the term "homology", as used herein, refers to the similarity between structures due to a common evolutionary ancestry, and more specifically, to the similarity between the amino acids of two or more proteins or amino acid sequences.

El término “identidad”, taly como se utiliza en esta memoria, hace referencia ala proporciónde aminoácidos idénticos entre dos secuencias aminoácidicas que se comparan. The term "identity", as used herein, refers to the proportion of identical amino acids between two amino acid sequences that are compared.

Talycomo se usa en esta memoria,eltérmino “transfección” sereﬁereala introduccióno transferenciade una molécula de ácido nucléico exógena en una célula eucariota, incluyendo, pero no limitándose a ella, una molécula de ácido ribonucléicoo desoxiribonucleico (por ejemplo,RNAóDNAdesnudo). As used herein, the term "transfection" refers to the introduction or transfer of an exogenous nucleic acid molecule into a eukaryotic cell, including, but not limited to, a molecule of deoxyribonucleic ribonucleic acid (eg, naked RNAnDNA).

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” se reﬁere a la cantidad de polinucleótido, de la secuencia aminoacídica o a la cantidad de una construcción génica de RNA o DNAde lainvención,que permitansuexpresión intracelular calculadapara producirel efecto deseadoy,en general,vendrá determinada, entre otras causas,porlas características propiasde dichas secuenciasy construccionesy elefectoterapéuticoa conseguir. Los adyuvantesy vehículosfarmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia. In the sense used in this description, the term "therapeutically effective amount" refers to the amount of polynucleotide, amino acid sequence or the amount of an RNA or DNA gene construct of the invention, which allows for intracellular expression calculated to produce the desired effect and, in general , will be determined, among other causes, by the characteristics of said sequences and constructions and the therapeutic effect to be achieved. Pharmaceutically acceptable adjuvants and vehicles that can be used in said compositions are the vehicles known to those skilled in the art.

La composiciónfarmacéutica proporcionada por estainvención puede serfacilitada por cualquier víade administración, paralo cual dicha composición se formulará enla formafarmacéutica adecuadaala víade administración elegida. En una realización particular,la administración de la composición proporcionada por esta invención se efectúa por vía intratumoral. The pharmaceutical composition provided by this invention may be facilitated by any route of administration, for which said composition will be formulated in the appropriate pharmaceutical form to the route of administration chosen. In a particular embodiment, administration of the composition provided by this invention is carried out intratumorally.

El término “polinucleótido” como aquí se usa se reﬁere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, bien ribonucleótidos o bien desoxirribonucleótidos. Este término sólo se reﬁereala estructura primariadela molécula.Así, este término incluyeADNde cadenadobleo sencilla,aligualqueARNde cadena dobleo sencilla. También incluye todos los tiposde modiﬁcaciones conocidas (marcadores conocidos enla técnica, metilación, remates, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modiﬁcaciones internucleótidas como, por ejemplo, aquellas con uniones sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, triésteres de fósforo, amidatos de fósforo, carbamatos, etc.)y con uniones cargadas(por ejemplo,tioatosde fósforo, ditioatosde fósforo, etc.), aquellosque contienen mitades colgantes, como, por ejemplo, proteínas (incluyendo por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercalantes (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellosque contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con uniones modiﬁcadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), al igual que formas no modiﬁcadas del polinucleótido. The term "polynucleotide" as used herein refers to a polymeric form of nucleotides of any length, either ribonucleotides or deoxyribonucleotides. This term only refers to the primary structure of the molecule. Thus, this term includes single-strand double-stranded DNA, as well as single-stranded double strand. It also includes all types of known modifications (known markers in the art, methylation, auctions, substitution of one or more of the natural nucleotides with an analogue, internucleotide modifications such as, for example, those with uncharged junctions (for example, methyl phosphonates, phosphorus triesters, phosphorus amidates, carbamates, etc.) and with charged junctions (for example, phosphorus thioates, phosphorus dithioates, etc.), those containing pendant halves, such as, for example, proteins (including, for example, nucleases, toxins , antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), those with intercalating agents (for example, acridine, psoralen, etc.), those containing chelants (for example, metals, radioactive metals, boron, oxidative metals, etc. .), those containing alkylating agents, those with modified bonds (eg, anomeric alpha nucleic acids, etc.), as well as unmodified forms of the polynucleotide.

Un “vector” es un replicón al que se ha unido otro segmento polinucleótido, para realizar la replicación y/o expresión del segmento unido. A "vector" is a replicon to which another polynucleotide segment has been attached, to perform replication and / or expression of the bound segment.

Un “replicón” es cualquier elemento genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleótida dentro de una célula;esto es, capaz de replicarse bajo su propio control. A "replicon" is any genetic element that behaves as an autonomous unit of polynucleotide replication within a cell, that is, capable of replicating under its own control.

“Secuencia de control” se reﬁere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias codiﬁcadorasalasque estánligadas.La naturalezade dichas secuenciasde control diﬁere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal,yseñalesde terminación;en eucariotas, generalmente, dichas secuenciasde control incluyenpromotores, señalesde terminación, intensiﬁcadoresy, en ocasiones, silenciadores. Se pretende que el término “secuencias de control” incluya, como mínimo, todoslos componentes cuya presencia es necesaria paralaexpresión,ytambién puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa. "Control sequence" refers to polynucleotide sequences that are necessary to effect the expression of the coding sequences to which they are linked. The nature of said control sequences differs depending on the host organism; in prokaryotes, said control sequences generally include a promoter, a ribosomal binding site, and termination signals; in eukaryotes, generally, said control sequences include promoters, termination signals, enhancers and, sometimes, silencers. The term "control sequences" is intended to include, at a minimum, all components whose presence is necessary for expression, and may also include additional components whose presence is advantageous.

“Unidos de forma operativa” se reﬁere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control “unida de forma operativa” a una secuencia codiﬁcadora está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codiﬁcadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control. "Operationally linked" refers to a juxtaposition in which the components thus described have a relationship that allows them to function in the intended way. A control sequence "operatively linked" to a coding sequence is linked in such a way that expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.

Un “marco de lectura libre” (ORF) es una región de una secuencia de polinucleótidos que codiﬁca un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia codiﬁcadora o una secuencia codiﬁcadora completa. A "free reading frame" (ORF) is a region of a polynucleotide sequence that encodes a polypeptide; this region may represent a portion of a coding sequence or a complete coding sequence.

Una “secuencia codiﬁcadora” es una secuencia de polinucleótidos que se transcribe a ARNm y/o se traduce a un polipéptido cuando está bajo control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codiﬁcadora se determinan mediante un codónde iniciode traducción enelextremo5’yun codóndeﬁnalizacióndela traducción en el extremo 3’. Una secuencia codiﬁcadora puede incluir, pero no se limita a ARNm, ADNc, y secuencias de polinucleótidos recombinantes. A "coding sequence" is a polynucleotide sequence that is transcribed into mRNA and / or translated into a polypeptide when under the control of appropriate regulatory sequences. The limits of the coding sequence are determined by a translation start code in the last 5 'and a translation end code 3'. A coding sequence may include, but is not limited to mRNA, cDNA, and recombinant polynucleotide sequences.

Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otrascaracterísticas técnicas, aditivos, componenteso pasos.Para losexpertos enla materia, otros objetos,ventajas ycaracterísticas de la invención se desprenderán en parte de la descripciónyen parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplosydibujosse proporcionana modode ilustración,y nose pretendeque sean limitativosdela presente invención. Throughout the description and claims the word "comprises" and its variants is not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For experts in the field, other objects, advantages and characteristics of the invention will be derived in part from the description in part of the practice of the invention. The following examples and drawings are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.

Breve descripción de las ﬁguras Brief description of the ﬁ gures

Figura1. Observaciónmediante microscopía ópticadelos cambios morfológicosydensidad celular ocurridosen la líneaB16-F10 trasel tratamiento conelgenE(A, Control:B,Tratamiento congenE a48 horas,C,Tratamiento con genEa las 144h). Figure 1. Observation by optical microscopy of morphological changes and cell density occurred in the B16-F10 line after the treatment with E (A, Control: B, Congenital treatment at 48 hours, C, Gene treatment at 144h).

Figura 2. Estudio de la proliferación de la línea de melanoma B16-F10 sometida al tratamiento continuo mediante la transfección del gen E. Figure 2. Study of the proliferation of the B16-F10 melanoma line undergoing continuous treatment by transfection of the E gene.

Figura 3. Efecto antitumoral delgenEsobre tumores derivados de la línea de melanoma B16 en ratones Balb/c. Comparación del crecimiento del tumor tratado con genE conel crecimiento del tumor control. Figure 3. Delgen antitumor effect on tumors derived from the B16 melanoma line in Balb / c mice. Comparison of the growth of the tumor treated with genE with the growth of the control tumor.

Exposición detallada de modos de realización Detailed statement of embodiments

Acontinuación se ilustrará la invención mediante unos ensayosin vitro e in vivo, realizados por los inventores. The invention will be illustrated below by means of in vitro and in vivo tests carried out by the inventors.

a) Construcción del vector para la transfección del gen E a) Construction of the vector for transfection of the E gene

Para obtener una construcción adecuada que permitiera llevar a cabo el tratamientoin vivo e in vitro de las células de melanoma B16-F10yde los tumores desarrolladosa partirde ellas en animalesdeexperimentación, se procedió a la ampliﬁcación del gen E mediante primers especíﬁcos. El gen ampliﬁcado como resultado de la PCR, que se realizó permitiendoquelaTaq polimerasa añadiese colasde Adeninaenlosextremosdelgen,fueintegradogracias a la acción de la topoisomerasa en el vector pCDNA3.1 de expresión en eucariota. La ligación fue introducida en bacterias competentes DH5 alpha que fueron crecidas primero en placas de petri estérilesyluego en medio LB para la obtención de grandes cantidades de pCDNA 3.1D-E. El agente terapéutico una vez obtenidos fue secuenciado utilizando el primer universal T7, que se encuentra aguas arriba de los genes en el pcDNA3.1D, para comprobar la orientación correcta del insertoquegaranticela colocación correcta del promotor-codonde inicio del genE(correcta parala transcripcióndelgenE)ypara determinarla posible presenciade mutaciones.La construcción resultantefue transfectada enla línea B16-F10.Se realizaron también transfecciones en A-549yMCF-7. In order to obtain a suitable construction that allowed the in vivo and in vitro treatment of the B16-F10 melanoma cells and the tumors developed from them in experimental animals to be carried out, the E gene was amplified by specific primers. The gene ampli ﬁ ed as a result of the PCR, which was performed by allowing Taq polymerase to add Adenine tails in the outer end of the gene, was integrated thanks to the action of topoisomerase in the eukaryotic expression pCDNA3.1 vector. Ligation was introduced into competent DH5 alpha bacteria that were first grown in sterile petri dishes and then in LB medium to obtain large amounts of 3.1D-E pCDNA. The therapeutic agent once obtained was sequenced using the first universal T7, which is located upstream of the genes in the pcDNA3.1D, to verify the correct orientation of the insert which guarantees the correct placement of the promoter-codonde where the start of the E gene (correct for the transcription of the E gene) and for to determine the possible presence of mutations. The resulting construct was transfected on line B16-F10. Transfections were also performed in A-549 and MCF-7.

b) Transfección del gen E en células en cultivo b) Transfection of the E gene in cultured cells

La transfección se realiza mediante liposomas. Se preparó una mezcla de liposomas-vector de expresión con diferentes proporciones. La preparación fue realizada en medio sin suero bovino fetal. La posterior efectividad dela transfección determinóquela proporciónmás eﬁcazfue3/1 (liposoma/vector)quelafuelaquese utilizóen todaslas experienciasde transfección.Las células fueron transfectadasconelplásmidosólo (control)y conel plásmidoconel gen E insertado. Transfection is performed by liposomes. A mixture of liposomes-expression vector with different proportions was prepared. The preparation was performed in medium without fetal bovine serum. The subsequent effectiveness of transfection determined that the most effective ratio was 3/1 (liposome / vector) that was used in all transfection experiences. Cells were transfected with the plasmid only (control) and with the plasmid with the E gene inserted.

c) Efectividad de la transfección del gen E in Vitro c) Effectiveness of transfection of the E gene in Vitro

La optimizacióndela transfecciónfue realizada mediantedelgendela beta-galactosidasa,que permite unavaloración colorimétrica.Se realizó transfeccióndelas mismas células tumorales medianteliposomasy vector conteniendo el gen de la beta-galactosidasa en las mismas proporciones descritas anteriormente.Tras diferentes tiempos de inducción se procedió al revelado mediante x-gal que s transformado por la enzima dando una coloración azulada a la célula transfectada. Con este procedimiento observamos que la eﬁciencia de la transfección con la proporción vector/liposoma utilizada se situó entre el 50-70% en las línea B16-F10 de melanoma. En las líneas de cáncer de pulmón y cáncer de mama la tasa de transfección fue similar. The optimization of the transfection was carried out by means of the beta-galactosidase gene, which allows a colorimetric evaluation. Transfection of the same tumor cells was carried out by means of liposomes and vector containing the beta-galactosidase gene in the same proportions described above. After different induction times, the procedure was developed by x-gal. which is transformed by the enzyme giving a bluish color to the transfected cell. With this procedure we observed that the efficiency of transfection with the vector / liposome ratio used was between 50-70% in the B16-F10 melanoma lines. In the lines of lung cancer and breast cancer the transfection rate was similar.

d) Efecto de la expresión del gen E en la proliferación in vitro d) Effect of E gene expression on in vitro proliferation

La expresión del gen E en las células de melanoma B16-F10 en cultivo provoca una signiﬁcativa reducción en la tasa de proliferación celular. La inhibición de la proliferación fue progresiva situándose en un 15% a las 48 de tratamiento,enun50yun55%alas94y120horasde tratamientoyalcanzandola máxima inhibiciónalas144horas (68%). Resultados similares fueron observados en las líneas de cáncer de mama y de pulmón. The expression of the E gene in B16-F10 melanoma cells in culture causes a significant reduction in the rate of cell proliferation. Proliferation inhibition was progressive, reaching 15% at 48 treatment, 50% to 94% and 120 hours of treatment, reaching maximum inhibition at 144 hours (68%). Similar results were observed in the breast and lung cancer lines.

e) Efectividad de la transfección del gen E in vivo e) Effectiveness of E gene transfection in vivo

Tras la generación de melanomas en ratones el vector pCDNA3.1 con el gen E fue inoculado en los tumores utilizando un reactivo de naturaleza liposomal incorporando una solución de Glucosa al 10%. Tras una agitación suaveque permitela fusiónvector estructura liposomaly una incubaciónde30 minutosa temperatura ambientese procedió a las repetidas inyecciones con de 100 ul de la mezcla. La determinación de la efectividad de la transfección se realizó medianteelusodelvector conteniendoelgendelabeta-galactosidasa (control)que permitíaunavaloración colorimétrica del proceso. Dicha efectividad se situó entreel50y70%. After the generation of melanomas in mice, the pCDNA3.1 vector with the E gene was inoculated into the tumors using a reagent of a liposomal nature incorporating a 10% Glucose solution. After gentle agitation which allows the fusion of the liposomal structure and an incubation of 30 minutes at room temperature, repeated injections with 100 ul of the mixture were carried out. The effectiveness of the transfection was determined by using the vector containing the beta-galactosidase (control) gene that allowed a colorimetric evaluation of the process. This effectiveness was between 50 and 70%.

f) Expresión del gen E en tejido tumoral (melanoma) f) E gene expression in tumor tissue (melanoma)

Los tumores inducidosen ratones, trasel tratamiento mediantelosvectoresdeexpresiónnoreguladapcDNA3.1-D que contenían el gen E, fueron procesadospara obtenerelARNtotalydemostrarque entreéstese encontrabanARNs mensajerosque codiﬁcabanparalaproteínaE. MediantelarealizacióndeunaRT(retrotranscripción)yposteriormente una PCR con primers especíﬁcos para la ampliﬁcación del gen E,sepudo demostrarlapresenciaylaexpresión este gen en todas las muestras de tejido tratadas. La presencia de ampliﬁcaciones con bandas de 110 pb indicaban la presencia del gen E ypor tanto la eﬁcacia de la transfección. Tumors induced in mice, after treatment by means of the non-regulating expression receptors of the DNA3.1-D containing the E gene, were processed to obtain the total RNA and show that these were found messenger RNAs encoding protein E. Through the realization of an RT (retrotranscription) and subsequently a PCR with specific primers for the amplification of the E gene, the presence and expression of this gene could be demonstrated in all treated tissue samples. The presence of ampli ﬁ cations with bands of 110 bp indicated the presence of the E gene and therefore the effectiveness of the transfection.

g) Efecto antitumoral del gen E sobre melanoma in vivo g) Antitumor effect of gene E on melanoma in vivo

Para determinar la modiﬁcación en el crecimiento de tumores (melanomas) derivados de la línea B16-F10 e inducidosen ratonesse utilizarondos gruposde animalesdeexperimentación:Grupo1: tratamiento conpcDNA3.1D-Ey Grupo2 (control) tratamiento con pcDNA3.1D-Lacz. El tratamiento consistió en la administración del agente terapéutico(oelvectorcontrol)cada24h.,enuna secuencia continuade8días.Lasdosis utilizadasfueronde20 µgr delvector conelgen terapéuticoovectorvacio.Se procedióal sacriﬁciode animalesdeexperimentacióncada48h yala consiguienteextraccióndel tumor. Cada tumorfuevaloradovolumétricamente conel objetode determinarlas modiﬁcaciones de crecimiento. To determine the change in the growth of tumors (melanomas) derived from the B16-F10 line and induced in mice, use groups of experimental animals: Group1: treatment with PCDNA3.1D-E and Group2 (control) treatment with pcDNA3.1D-Lacz. The treatment consisted of the administration of the therapeutic agent (orcontroller control) every 24h., In a continuous sequence of 8 days. The doses used were 20 µg of the vector with the therapeutic oxygen empty agent. The animal was sacrificed every 48 hours and the tumor was subsequently removed. Each tumor is renewed volumetrically for the purpose of determining growth modi ﬁ cations.

La curva patrón del crecimiento del tumor sin tratamiento (control) demostró que los tumores aumentaron de tamaño progresivamente desde los dos díasdeevolución(volumenmediode 1.91 cm3)hasta los 2.34 cm3alas 144h de tratamiento. Este patrónde crecimientoyaha sido descrito en estos tiposde tumoresycorresponde una cinéticade crecimiento gompertziana, típica de los melanomas. The standard tumor growth curve without treatment (control) showed that the tumors gradually increased in size from two days of evolution (average volume of 1.91 cm3) to 2.34 cm3a 144h of treatment. This growth pattern has already been described in these types of tumors and corresponds to a kompertzian growth kinetics, typical of melanomas.

Ladeterminacióndel tamaño tumoralenlos gruposde ratones sometidosa tratamiento convectores conysinel gen E determina: The determination of tumor size in groups of mice undergoing convector treatment with the E gene determines:

1. Que el crecimiento delos tumores inducidos con B16-F10ytratados con el genEsufren disminución signiﬁcativadel tamaño tumoralalolargode todoel tratamiento.Elseguimientodel crecimiento tumoral demostróqueel volumendel tumorsesituóen0.54y0.75cm3alas48y96horasdeltratamientoloque suponeun mantenimientoen suvolumeninicialypor tanto una importantefaltade crecimiento. Estevalorse mantuvoalas144hde tratamiento en dondeelvolumenfuede0.6cm3.Sin embargoeldatomás interesantese produjoenlafase ﬁnaldel tratamiento en donde el tumor sólo alcanzo 0.4 cm3 lo que supone no sólo una disminución en cuanto al volumen inicial sino una reducción signiﬁcativa en relación al volumen alcanzado por el tumor tratado con el vector vacío (control) (13.07 cm3). 1. That the growth of tumors induced with B16-F10 and treated with the gene suffers a significant decrease in tumor size over the length of the entire treatment. The follow-up of tumor growth showed that the volume of the tumor was set at 0.54 and 0.75 cm 3 to the 48 and 96 hours of treatment, which is important for maintaining a significant amount of growth. This value was maintained144h of treatment where the volume was 0.6cm3. However, the most interesting one occurred in the final phase of the treatment where the tumor only reached 0.4 cm3 which means not only a decrease in the initial volume but a significant reduction in relation to the volume reached by the tumor treated with the vector vacuum (control) (13.07 cm3).

2.Queelcrecimientodelos tumores inducidosen ratonesytratados conelvectorvacio(control)y conelgende la beta-galactosidasa fue similar al de los tumores control sin tratamiento, lo que indica que, efectivamente, el efecto antitumoral es ocasionadoporla acción del gen E. 2.That the growth of tumors induced in mice and treated with an anti-vacuum (control) and beta-galactosidase gene was similar to that of control tumors without treatment, indicating that, indeed, the antitumor effect is caused by the action of the E gene.

h) Mecanismo de acción del gen E sobre melanoma h) Mechanism of action of gene E on melanoma

Los estudios realizadosmediante microscopía electrónicade transmisión sobrelos tejidos tumorales tratados conel gen E demuestran una alteración signiﬁcativa de la estructura de la membrana de las mitocondrias. Dichas organelas aparecen aumentadas de tamaño, desestructuradas, en menor cantidady con la presencia de roturas a nivel de las crestas. Esto sugiere un posible efecto del gen E, dado la estructura de la proteína que codiﬁca y su ﬁjación en membrana, sobre la integridadde dichas membranas. Studies carried out by transmission electron microscopy on tumor tissues treated with the E gene demonstrate a significant alteration of the membrane structure of the mitochondria. These organelles appear enlarged, unstructured, in smaller quantities and with the presence of breaks at the level of the ridges. This suggests a possible effect of the E gene, given the structure of the coding protein and its membrane fixation, on the integrity of these membranes.

i) Comparación de los efectos del gen E sobre melanoma con otros sistemas de genes killer i) Comparison of the effects of the E gene on melanoma with other killer gene systems

Los datos obtenidos en relación al crecimiento de los tumores inducidos con B16-F10y tratados con el genE indicanuna reduccióndetamañosuperiorala encontradaconotrostiposde tratamiento basadosenterapiagénicacon genes “killer” como es el caso del gen gef. The data obtained in relation to the growth of tumors induced with B16-F10 and treated with the E gene indicate a reduction of the size exceeded by other types of treatment based on genetic therapy with killer genes, as is the case of the gef gene.

Claims

1. Use of an isolated RNA or DNA polynucleotide capable of translating into an amino acid sequence comprising a peptide with an identity with the SEQID No. 1 selected from any of the following:

a. to.: al menos un 50%, at least 50%,

b. b.: al menos un 60%, at least 60%,

c. C.: al menos un 80%, at least 80%,

d. d.: al menos un 90%, at least 90%,

e. and.: al menos un 95%, o at least 95%, or

F. of 100% in the development of a medication for the treatment of proliferative disorders.

2.Use of an amino acid sequence that comprises a peptide with an identity with SEQID No. 1 selected from any of the following:

a. to.: al menos un 80%, at least 80%,

b. b.: al menos un 90%, at least 90%,

c. C.: al menos un 95%, o at least 95%, or

d. of 99%, in the development of a medication for the treatment of proliferative disorders.

3.Using a genetic construction of ADNoARN that comprises one of the following types of sequences:

a. to.: secuenciade nucleótidos,que comprende,al menos,el polinucleótidosegúnlareivindicación1 ola secuencia codiﬁcante de la SEQID NO: 1, para su transcripción in vitro o in vivo,o nucleotide sequence, comprising at least the polynucleotide according to claim 1 or the coding sequence of SEQID NO: 1, for transcription in vitro or in vivo, or

b. b.: secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y/o con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripcióny su regulación adecuada en tiempoylugar, nucleotide sequence, corresponding to a gene expression system or vector comprising the polynucleotide of claim 1, operably linked with at least one promoter that directs the transcription of said nucleotide sequence, and / or with other necessary or appropriate sequences for transcription and its appropriate regulation in time and place,

in the development of a medication for the treatment of proliferative disorders.

4. Use of a composition comprising the polynucleotide according to claim 1, the amino acid sequence according to claim 2, the genetic construct according to claim 3, or any combination thereof, for the preparation of a medicament for the treatment of proliferative disorders.

5. 5.: Uso de la composición según la reivindicación anterior, donde el desorden proliferativo es maligno. Use of the composition according to the preceding claim, wherein the proliferative disorder is malignant.

6. 6.: Uso de la composición según la reivindicación anterior,donde el desorden proliferativomaligno es el melanoma. Use of the composition according to the preceding claim, wherein the proliferative disorder is melanoma.

7. 7.: Composición que comprende: Composition comprising:

a. to.: un polinucleótido según la reivindicación 1, una secuencia aminoacídica según la reivindicación 2, una construcción genética segúnla reivindicación3,o cualquierade sus combinaciones,y a polynucleotide according to claim 1, an amino acid sequence according to claim 2, a genetic construct according to claim 3, or any combination thereof, and

b. b.: un sistema lipídico. A lipid system.

8. 8.: Composición según la reivindicación anterior, donde el sistema lipídico es un liposoma. Composition according to the preceding claim, wherein the lipid system is a liposome.

9. 9.: Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en la elaboración de un medicamento. Use of the composition according to any of claims 7-8, in the manufacture of a medicament.

10. Use of the composition according to any of claims 7-8, in the preparation of a medicament for the treatment of proliferative disorders.

11. eleven.: Uso de la composición según la reivindicación 10, donde el desorden proliferativo es maligno. Use of the composition according to claim 10, wherein the proliferative disorder is malignant.

12. 12.: Uso de la composición según la reivindicación 11, donde el desorden proliferativo maligno es el melanoma. Use of the composition according to claim 11, wherein the malignant proliferative disorder is melanoma.

LIST SEQUENCES

<110> University of Granada

<120> GenEparael antitumor treatment

<130> ES1634.11

<160> 1

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 91

<212> PRT

<213> Bacteriophage phi-Xl74

SPANISH OFFICE OF THE PATENTS AND BRAND

SPAIN

REPORT ON THE STATE OF THE TECHNIQUE

@ Int. Cl .: See additional sheet

@ ES2343 929

@ Application number: 200801167

@ Date of submission of the application: 04/23/2008

@ Priority date:

RELEVANT DOCUMENTS

Categoría Category: 56@ Documentos citados Reivindicaciones afectadas 56 @ Documents cited Claims Affected

A TO: YOUNG K. yYOUNG R. "Lytic Action of Cloned Phix174 Gene E". Journal of virology, 1982, Vol. 44, páginas 993-1002. Página 993, segunda columna. 1-6 YOUNG K. and YOUNG R. " Lytic Action of Cloned Phix174 Gene E ". Journal of virology, 1982, Vol. 44, pages 993-1002. Page 993, second column. 1-6

A TO: SANGER F. et al. "The Nucleotide Sequence of Bacteriophage Phix174". J. Mol. Biol, 1978, 125, páginas 225-246. Figura 4. 1-2 SANGER F. et al. " The Nucleotide Sequence of Bacteriophage Phix174 ". J. Mol. Biol, 1978, 125, pages 225-246. Figure 4 1-2

A TO: BERNHARDT T. G., ROOF W. D. yYOUNG R. "Genetic evidence that the bacteriophage phix174 lysis protein inhibits cell wall synthesis" Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America, 11.04.2000, vol. 97, No. 8, páginas 4297-4302. Páginas 4297 y4299-4302. 1-12 BERNHARDT T. G., ROOF W. D. and YOUNG R. " Genetic evidence that the bacteriophage phix174 lysis protein inhibits cell wall synthesis " Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 11.04.2000, vol. 97, No. 8, pages 4297-4302. Pages 4297 and 4299-4302. 1-12

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y:de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: reﬂeja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad yla de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the presentation date of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application

El presente informe ha sido realizado Dg para todas las reivindicaciones D para las reivindicaciones nº: This report has been produced Dg for all claims D for claims no:

Fecha de realización del informe 28.07.2010 Date of realization of the report 28.07.2010: Examinador M. Jesús García Bueno Página 1/5 Examiner M. Jesús García Bueno Page 1/5

Application number: 200801167

REPORT OF THE STATE OF THE TECHNIQUE

CLASSIFICATION OF THE OBJECT THE APPLICATION

C12N 15/63 (2006.01) A61K 9/127 (2006.01) A61K 35/74 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01)

Minimum documentation sought (classification system followed by the classification symbols)

C12N, A61K, A61P

Electronic databases consulted during the search (name of the database and, if possible, search terms used)

INVENES, EPODOC, WPI, TXTE, TXTF, MEDLINE, BIOSIS, NPL, XPESP, EMBASE, EMBL ALL.

Technical State Report (additional sheet) Page 2/5

Application number: 200801167

WRITTEN OPINION

Date of the Written Opinion: 28.07.2010

Statement

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986): Reivindicaciones 1-12 SÍ Claims 1-12 YES

Reivindicaciones Claims: NO NO

Actividad inventiva Inventive activity: Reivindicaciones 1-12 SÍ Claims 1-12 YES

(Art. 8.1 LP 11/1986) (Art. 8.1 LP 11/1986): Reivindicaciones NO Claims NO

The application is considered to comply with the industrial application requirement. This requirement was assessed during the formal and technical examination phase of the application (Article 31.2 Law 11/1986).

Opinion Base:

This opinion has been made on the basis of the patent application as published.

Report on the State of the Art (Written Opinion) Page 3/5

Application number: 200801167

WRITTEN OPINION

1. Documents considered:

Below are the documents belonging to the state of the art taken into consideration for the realization of this opinion.

Documento Document: Número Publicación o Identiﬁcación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date

D01 D01: YOUNG K. AND YOUNG R. "Lytic Action of Cloned Phix174 Gene E". Journal of virology, 1982, Vol. 44, páginas 993-1002. 1982 YOUNG K. AND YOUNG R. " Lytic Action of Cloned Phix174 Gene E ". Journal of virology, 1982, Vol. 44, pages 993-1002. 1982

D02 D02: SANGER F. et all. "The Nucleotide Sequence of Bacteriophage Phix174". J. Mol. Biol, 1978, 125, páginas 225-246. 1978 SANGER F. et all. " The Nucleotide Sequence of Bacteriophage Phix174 ". J. Mol. Biol, 1978, 125, pages 225-246. 1978

D03 D03: BERNHARDT T. G., ROOF W. D. AND YOUNG R. "Genetic evidence that the bacteriophage phix174 lysis protein inhibits cell wall synthesis" Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America, 11.04.2000, vol. 97, No. 8, páginas 42974302. 2000 BERNHARDT T. G., ROOF W. D. AND YOUNG R. " Genetic evidence that the bacteriophage phix174 lysis protein inhibits cell wall synthesis " Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 11.04.2000, vol. 97, No. 8, pages 42974302. 2000

2. Statement motivated according to articles 29.6 and 29.7 of the Regulations for the Execution of Law 11/1998, of March 20, on patents on novelty and inventive activity; quotes and explanations in support of this statement

The object of the present application is the use of an RNA or DNA polynucleotide that codes for a peptide with an identity with the SEQIDNO1 of at least 50%, in its amino acid sequence or an amino acid sequence with an identity of at least 80%; and a genetic construction of DNA or RNA to direct transcription in vitro

or intracellular of the invention polynucleotide and comprising the aforementioned polynucleotide or a nucleotide sequence corresponding to a gene expression system or vector comprising the coding sequence of SEQ ID NO 1, operably linked with at least one promoter, in the preparation of a medicament for the treatment of proliferative disorders ( claims 1-3) Finally, the object of the present invention also consists in the use of pharmaceutical compositions containing one of the objects of the above-mentioned invention or a combination of them for the preparation of a medicament for the treatment of proliferative disorders (claims 4-6). These pharmaceutical compositions also comprise a lipid system, preferably a liposome (claims 7-12).

The SEQIDNO1 collects the amino acid sequence of the protein isolated from the bacteriophagephix174.

Document D01 discloses an isolated DNA polynucleotide capable of being translated into a sequence comprising protein E (SEQ ID No 1), the amino acid sequence comprising this protein, a genetic construction of DNA or RNA that comprises the nucleotide sequence, corresponding to a gene expression system or vector comprising the polynucleotide capable of transducing an amino acid sequence comprising the protein E linked to the promotorlac, which produces lysis in infected cells by the phagophagus (see page 993, second column).

Document D02 discloses the complete E gene, which translates into sequences that correspond to different proteins, including protein E (SEQID No. 1). It also discloses the amino acid sequence comprising this protein, a genetic construction of DNA or RNA comprising the sequence. nucleotide, which comprises the polynucleotide that codes for the corresponding peptide SEQID No. 1 (see Figure 4).

Document D03 proposes a model for the mechanism of lysis of cells mediated by protein E, which is synthesized in the cytoplasm and integrated into the inner part of the membrane. The accumulation of proteinE in the membrane causes it to interact with MraY, inhibiting it, which could cause the inhibition of cell wall synthesis and cell lysis. This document also discloses the protein topology, taking into account that the C-terminal end is located in the cytoplasm, although it is not known, however, that the N-terminal end of the protein can cross the membrane (see pages 4297 and 4299-4302).

Report on the State of the Art (Written Opinion) Page 4/5

Application number: 200801167

WRITTEN OPINION

Additional sheet

1.NOVEDAD (Art.6Ley11 / 1986) AND INVENTIVE ACTIVITY (Art.8Ley11 / 1986).

1.1 -REIVINDICATIONS 1-6:

The claimed invention differs mainly from documents D01-D03 in that none of the documents cited shows the use of an RNA or DNA polynucleotide encoding a peptide with an identity with SEQ ID NO 1, of an amino acid sequence comprising the peptide with An identity with the SEQIDNO: 1 of at least 80%, or of a genetic construction of DNA or RNA to direct the in vitro or intracellular transcription of the polynucleotide of the invention, in the preparation of a medicament for the treatment of proliferative disorders.

It would not be obvious for an expert in the field to apply the characteristics of the cited documents and the agreement as disclosed in claims 1-6. Therefore, the object of these claims 1-6 meets the requirements of novelty and invasive activity in accordance with articles 6 and 8 of Law 11/1986.

1.2 -REIVINDICATIONS 7-12:

Document D01 is considered most representative of the state of the art for the purpose of claims 7-12, and shows a composition comprising an RNA or DNA polynucleotide encoding a peptide with an identity with SEQ ID NO 1 of at least 50%; in its amino acid sequence (see page 993, second column). The object of claims 7-12 of the present invention application differs from document D01 in that the composition further comprises a lipid system.

Therefore, the object of claims 7-12 is new implies an inventive activity according to articles 6 and 8 of Law 11/1986.

Report on the State of the Art (Opinion written additional sheet) Page 5/5