ES2342852T3

ES2342852T3 - Polimero.

Info

Publication number: ES2342852T3
Application number: ES07804448T
Authority: ES
Inventors: Martin Garnett; Paolo Ferruti; Elisabetta Ranucci
Original assignee: University of Nottingham; Universita degli Studi di Milano
Current assignee: University of Nottingham; Universita degli Studi di Milano
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2007-09-14
Publication date: 2010-07-15
Anticipated expiration: 2027-09-14
Also published as: ATE457326T1; EP2066731B1; AU2007301693A1; NZ575911A; AU2007301693B2; GB0619175D0; US8404223B2; US20100028445A1; CA2664462A1; EP2066731A1; DE602007004741D1; WO2008038038A1; NO20091594L; DK2066731T3

Abstract

Una composición que comprende un polímero de poliamidoamina (PAA) que comprende un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado.

Description

Polímero.

La presente invención se refiere a polímeros y, en particular, a poliamidoaminas, y a procedimientos para su fabricación. La invención se extiende al uso de dichos polímeros de poliamidoamina para formar composiciones reticuladas e hidrogeles, y al uso de dichas composiciones en diversas aplicaciones biológicas y no biológicas, tales como el suministro de biomoléculas a sitios diana y en sistemas de seguimiento de fluidos.

Las poliamidoaminas lineales (PAA) son polímeros conocidos, que están constituidos por una cadena básica que tiene grupos amido y amino terciario que se disponen regularmente a lo largo de la estructura básica. Las PAA están cargadas positivamente (es decir, son catiónicas) y son degradables en agua porque contienen enlaces amídicos hidrolizables en su cadena básica junto con funciones amínicas terciarias nucleófilas en su posición beta. Los polímeros pueden sintetizarse a partir de una amplia variedad de monoaminas primarias o bisaminas secundarias, que permite ejercer un control total sobre el espaciado y el pKa de los grupos catiónicos a lo largo de la estructura
básica.

Las PAA pueden diseñarse para que tengan un intervalo de propiedades fisicoquímicas útiles, dependiendo de qué monómeros o co-monómeros específicos se elijan, y también de su posición a lo largo de la estructura básica. Las PAA han demostrado tener una toxicidad biológica relativamente baja en contraste con muchos otros polímeros catiónicos. Además, los polímeros son altamente hidrófilos y, normalmente, se degradan en medios acuosos a una velocidad que depende de su estructura. La combinación de propiedades fisicoquímicas beneficiosas y una buena biocompatibilidad hacen a las PAA una elección adecuada para su uso en diversas aplicaciones biológicas.

Los polímeros catiónicos tales como PAA tienen aplicaciones potenciales en muchas áreas debido a su carga positiva. Los polímeros cargados positivamente han encontrado uso en la unión de diversas moléculas biológicas cargadas para su purificación (por ejemplo, unión a heparina), y también en la formación de complejos de polielectrolito. El término "polielectrolito" se da para polímeros cuyas unidades de repetición llevan un grupo electrolito, que se disocia en soluciones acuosas (por ejemplo, agua), creando así polímeros cargados. Los polímeros cargados tales como poli(D-lisina) y poli(L-lisina) (PLL) se han usado como sustratos de adhesión celular durante muchos años, aunque su toxicidad les hace problemáticos para este propósito.

Las PAA se han usado también en diversas aplicaciones médicas. Por ejemplo, las PAA pueden actuar como polímeros útiles para la preparación de complejos de polielectrolito para el suministro de biomoléculas con carga útil, tales como construcciones de ADN, a un sitio diana en un paciente. Por ejemplo, in vitro, las PAA con un número diferente de combinaciones de co-monómeros han presentado una buena actividad de transfección para diversas biomoléculas con carga útil. Se sabe que hay diversas barreras físicas que hacen difícil el suministro de una biomolécula con carga útil, tal como ADN plasmídico, al núcleo de las células. Dichas barreras incluyen medios fisiológicos tales como la sangre con altos contenidos de sal y de proteínas, la captación inicial hacia la célula, evitar la degradación en la célula mediante sistemas de endosoma/liposoma, transporte a través del citoplasma al núcleo y cruzar la propia membrana nuclear. Por lo tanto, hay una necesidad de desarrollar nuevos complejos de PAA que presenten un suministro mejorado de biomoléculas con carga útil al sitio diana.

Además de las aplicaciones médicas de las PAA, tales como sistemas de suministro de ADN para su uso en pacientes, también hay considerables aplicaciones para el uso de complejos de PAA en el suministro y protección de biomoléculas con carga útil activas en el entorno. Sin embargo, en muchas aplicaciones medioambientales, donde la molécula con carga útil puede exponerse a condiciones extremas, la estabilidad del complejo PAA-biomolécula es una consideración importante y, por lo tanto, es vital que el complejo esté suficientemente estabilizado para que sea eficaz. Adicionalmente, un problema significativo con el uso de PAA en muchas aplicaciones es que los polímeros tienen una tendencia a agregarse e interaccionar con superficies cargadas, tales como suelos y minerales. Por consiguiente, para reducir la agregación y evitar la interacción de las PAA con dichas superficies cargadas, se han usado PAA estabilizadas estéricamente complejadas con una superficie PEGilada. La PEGilación en entornos altamente salinos ha demostrado aumentar la estabilización contra la agregación no deseada de los complejos de PAA.

Los complejos de PAA para su uso en dichas aplicaciones médicas y medioambientales se han desarrollado también con la incorporación de co-polímeros de bloque de polietilenglicol (PEG) para aumentar la semi-vida de los complejos que circulan en la sangre. Por lo tanto, se han desarrollado procedimientos para producir complejos estabilizados estéricamente que incorporan PAA y PEG. Sin embargo, aunque los complejos de polielectrolito que se producen por estos procedimientos son razonablemente estables en algunos entornos, padecen el problema de que carecen de estabilidad en entornos biológicos de alto contenido de sal y alta concentración de proteínas. Los complejos PAA-PEG, por lo tanto, se desestabilizan rápidamente y finalmente se disgregan, liberando de esta manera la molécula con carga útil de la biomolécula en áreas lejos del sitio diana pretendido. Por consiguiente, tienen una aplicación limitada en entornos de altas concentraciones de sal y/o proteína. Para evitar que ocurra esta disgregación, los complejos de PAA pueden estabilizarse usando reticulaciones físicas entre las cadenas de PAA próximas. Además, para entornos marinos, donde existen altas concentraciones de sal y ambientes contaminados donde están presentes altas concentraciones de diversos agentes químicos, la estabilización de los complejos de PAA por reticulación física sería también altamente deseable.

Debido a su naturaleza hidrófila, cuando están reticuladas, las PAA pueden formar hidrogeles. Los hidrogeles de PAA tienen el potencial de actuar como estructuras de soporte en aplicaciones de ingeniería tisular. Adicionalmente, los hidrogeles basados en PAA han demostrado actuar también como sustratos biodegradables y biocompatibles para técnicas de cultivo celular.

Las PAA reticuladas pueden obtenerse por diversos procedimientos. Por ejemplo, PAA que llevan enlaces vinilo que están distribuidos regularmente a lo largo de la cadena principal, obtenidas por co-polimerización con monómeros adecuados, tales como alil amina pueden emplearse para resinas reticuladas mediante post-polimerización por radicales. Otro procedimiento es emplear aminas multi-funcionales como agentes de reticulación entre cadenas de PAA próximas. Por ejemplo, los diaminoalcanos contienen cuatro hidrógenos móviles y se comportan como monómeros tetrafuncionales, lo que favorece las conexiones intercadena o las reticulaciones entre cadenas de PAA próximas.

Por lo tanto, hay una necesidad significativa para la preparación de complejos de PAA reticulados, reducibles, (es decir, reversibles), que puedan usarse en diversas aplicaciones médicas y medioambientales, por ejemplo, para suministrar moléculas con carga útil biológicas. Un número de grupos de investigación han concebido estrategias en las que los complejos de polielectrolito con polímeros catiónicos como polietilenimina (PEI) y poli-L-lisina (PLL) pueden estabilizarse por reticulación. Un procedimiento anterior usaba reticulantes de escisión para estabilizar la superficie de los complejos de polielectrolito pre-formados. Otra estrategia implica la oligomerización de plantillas en la que se usan policationes muy pequeños, que después se polimerizan y/o se reticulan en presencia de ADN. En una modificación de esta estrategia, un oligómero más grande se reticula o enlaza usando enlaces disulfuro para dar una cadena lineal de pequeños segmentos de poli-ión, que se ensamblan por separado, o con el ADN para dar un polímero de alto peso molecular, reducible. Pueden usarse uniones no reducibles, aunque menos activas en términos de actividad de transfección de ADN.

Hay varias razones para el uso de estas diversas estrategias para reticular los polielectrolitos. En general, policationes más pequeños no condensan el ADN eficazmente o de forma estable. Sin embargo, la toxicidad de los polímeros catiónicos normalmente depende del peso molecular y, por lo tanto, el uso de polímeros catiónicos de alto peso molecular aumenta la toxicidad del complejo y, de esta manera, limita su aplicación particularmente en el campo médico. Por lo tanto, hay un equilibrio que en estos casos puede resolverse produciendo polímeros de mayor peso molecular escindibles que proporcionan también un mecanismo de liberación mejorado para la molécula de ADN con carga útil.

En el caso de las PAA que tienen una toxicidad intrínseca menor, es posible una estrategia diferente. En este caso pueden usarse polímeros más grandes, que simplemente están reticulados para estabilidad y que pueden escindirse para liberar el ADN. Los inventores de la presente invención han descrito previamente un procedimiento para producir complejos de PAA estabilizados estéricamente basados en co-polímeros tri-bloque PEG-PAA-PEG (Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1576, 269-286). Sin embargo, los inventores han descubierto que en el caso de las PAA, no es posible formar fácilmente reticulaciones para producir una estructura de PAA PEGilada reticulada, reducible y, por lo tanto, reversible. Esto se debe a que no hay ningún grupo amina libre disponible en la estructura para formar reticulaciones después del ensamblaje de la cadena de PAA.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es obviar o mitigar uno o más de los problemas de la técnica anterior, identificados en el presente documento o en otro, y proporcionar una ruta sintética sencilla, barata y práctica para el ensamblaje de complejos de PAA reticulados, reducibles (es decir, reversibles), estabilizados estéricamente, que también sean no tóxicos. Otro objeto de la invención es proporcionar diversas aplicaciones, biológicas u otras para el uso de co-polímeros de PPA-PEG reticulados, reducibles, estabilizados estéricamente, y sistemas de suministro producidos con estos polímeros.

Los inventores de la presente invención investigaron maneras en las que un complejo de PAA reticulado, reducible, podría producirse usando rutas sintéticas químicas. Creen que un mecanismo adecuado para reticular cadenas de polímeros próximas, sería incorporar átomos de azufre en cada molécula de PAA de manera que podrían formarse enlaces disulfuro (es decir, reticulaciones) entre ellas.

Por consiguiente, los inventores intentaron hacer reaccionar piridiltioetilamina (preparada mediante una primera etapa de reacción de aldritiol-2 con aminoetano tiol) con una poliamidoamina. Sin embargo, un problema con este sistema es que la mayor parte del producto se descompone en las condiciones de poliadición de PAA. Adicionalmente, este esquema de reacción implica también diversas etapas. Para resolver estos problemas, los inventores consideraron una ruta sintética alternativa.

Los inventores concibieron un nuevo esquema de reacción, mostrándose una realización del mismo en el Esquema 1. En primer lugar, un compuesto de bisacriloílo se hace reaccionar con una amina primaria y/o una di-amina secundaria, una o ambas de las cuales contiene un grupo disulfuro, para formar un primer compuesto intermedio que comprende un polímero de poliamidoamina que tiene grupos colgantes que contienen restos disulfuro. Este primer intermedio se reduce después de manera que el resto disulfuro se escinde para formar un segundo compuesto intermedio que comprende un polímero de poliamidoamina que tiene grupos colgantes que contienen grupos sulfhidrilo (o grupos tiol). El segundo compuestos intermedio puede oxidarse (por ejemplo, en aire) de manera que se forman enlaces disulfuro intermoleculares entre los grupos sulfhidrilo colgantes, formando de esta manera reticulaciones y produciendo una composición de PAA reticulada que comprende poliamidoamina reticulada (PAA), en la que las reticulaciones se forman
entre los restos sulfhidrilo colgantes correspondientes. La composición reticulada tenía naturaleza de gel o de hidrogel.

Como se muestra en el Esquema 1, la primera etapa de la reacción puede implicar también la reacción con moléculas de amina que no contienen grupos disulfuro, por ejemplo, en cualquiera de la amina primaria o la di-amina secundaria. Mediante la elección apropiada de los reactantes y sus proporciones, puede ejercerse control sobre el nivel (es decir, concentración, posición y espaciado) de los restos disulfuro colgantes que se incorporan en la composición final que se prepara. Dichas moléculas de amina que no contienen grupos disulfuro son más convenientemente aminas secundarias.

Adicionalmente, como se indica también en el Esquema 1, los grupos SH libres del segundo compuesto intermedio pueden activarse para facilitar la reticulación. Como se ilustra, dicha activación puede ser por reacción con un agente de activación adecuado, tal como disulfuro de bi-piridilo. Como se ilustra en los Ejemplos y, en particular, en el Ejemplo 11, la reacción fue sorprendentemente exitosa y convirtió los reactantes sustancialmente líquidos (es decir, una composición no reticulada) en un producto sustancialmente de tipo gel (es decir, una composición reticulada). Por lo tanto, los inventores han demostrado exitosamente un nuevo esquema de reacción para preparar polímeros de PAA que contienen sulfhidrilo, en los que los grupos sulfhidrilo reaccionan para formar reticulaciones y, de esta manera, formar un gel. Los inventores creen que, hasta la fecha, no se ha informado sobre complejos reticulados de PAA. Adicionalmente, los inventores continuaron para demostrar que añadiendo un agente reductor adecuado a la composición de hidrogel reticulada o poniendo el hidrogel en ciertas condiciones, de manera que pueda ocurrir la reducción, es posible invertir la reacción de reticulación para producir así una solución de polímero de PAA que no tenga grupos sulfhidrilo colgantes reticulados. Los inventores creen que son los primeros en preparar dicha composición de polímero de PAA reticulable, reducible.

Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición que comprende un polímero de poliamidoamina (PAA) que comprende un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado.

Mediante la expresión "resto colgante" se entiende un grupo que está unido a la cadena principal del polímero de PAA, pero que no es parte de la cadena principal.

Preferentemente, la composición comprende un polímero de poliamidoamina (PAA) lineal que comprende un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado.

Mediante la expresión "polímero de PAA lineal" se entienden monómeros de cadena sencilla sin puntos de ramificación, excluyendo aquí dendrímeros u otras estructuras ramificadas.

Preferentemente, la composición de acuerdo con el primer aspecto está adaptada para formar reticulaciones entre el resto colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado. En la invención, dichas reticulaciones implican la formación de enlaces disulfuro.

Cuando la composición no comprende cadenas de polímero de PAA reticulado, puede tener la forma de una solución. Sin embargo, cuando la composición está reticulada, forma un gel y puede denominarse hidrogel. Por consiguiente, la composición de acuerdo con el primer aspecto puede denominarse también "composición precursora de hidrogel". Preferentemente, la composición reticulada es un gel en condiciones normales de temperatura y presión (es decir, 1 atmósfera, 20ºC).

Preferentemente, la composición reticulada es reducible, de manera que tras la reducción de la composición reticulada, las reticulaciones entre las cadenas poliméricas se rompen. La reducción de la composición reticulada puede conseguirse mediante un agente reductor adecuado, tal como 1,4-ditiotreitol, metabisulfito sódico o glutatión reducido. Se observa también que los agentes reductores adecuados se encuentran también en tejidos biológicos, siendo los agentes principales glutatión y cisteína.

Ventajosamente, la composición de acuerdo con la invención es sustancialmente no tóxica o, al menos, tiene una menor toxicidad que los polímeros catiónicos conocidos usados habitualmente. Los valores de toxicidad in vitro para varias PAA normales (es decir, no anfóteras) son del orden de 0,5-4 mg/ ml (E. Ranucci y col., J Biomat. Sci Polymer Edn 2, 303-315,1991; ICR Hill y col., BBA 1427, 161-174, 1999). Las PAA anfóteras normalmente son incluso menos tóxicas, siendo algunas de ellas aproximadamente tan biocompatibles como el dextrano. Por lo tanto, se cree que dichos polímeros de PAA reticulados reducibles tienen numerosas aplicaciones en los campos médicos y no médicos, porque es posible cambiar la composición de la solución a gel (es decir, estados de hidrogel) y viceversa. Adicionalmente, la composición de acuerdo con la invención puede usarse para suministrar una molécula con carga útil, por ejemplo, una biomolécula con carga útil biológicamente activa a un sitio diana, como se describirá posteriormente en el presente documento, que también tiene numerosas aplicaciones biológicas y no biológicas.

El polímero de PAA puede sintetizarse a partir de un amplio intervalo de amidas y aminas, con la condición de que la amina sea un disulfuro terminado en amina primara y/o una di-amina secundaria que contiene un grupo disulfuro. Esto es útil para variar la interacción del polímero de PAA resultante con diversas moléculas con carga útil. Se prefiere que el polímero de PAA sea sustancialmente soluble en agua.

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El polímero de PAA de acuerdo con el primer aspecto de la invención puede contener grupos repetidos X e Y representados por la Fórmula general I:

(Fórmula I)-\{-[X]-[Y]-\}_{n}

en la que,

n es entre 5 y 500;

los grupos X, que pueden ser iguales o diferentes, son grupos que contienen amida de la fórmula

-[-L^{1}-CO-NR^{1}-L^{2}-NR^{2}-CO-L^{3}-]

en la que

L^{1} y L^{3} representan, independientemente, grupos etileno opcionalmente sustituidos;

L^{2} representa una cadena de alquileno opcionalmente sustituida; y

R^{1} y R^{2} representan, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente sustituido;

y los grupos Y, que pueden ser iguales o diferentes, representan grupos derivados de amina de la fórmula:

-[-NR^{3}-]- \hskip0.3cm o \hskip0.3cm -[-NR^{4}-L^{4}-NR^{5}-]-

en las que

R^{3}, R^{4} y R^{5} representan grupos alquilo opcionalmente sustituidos; y

L^{4} representa un grupo alquileno opcionalmente sustituido;

o R^{4}, R^{5} y L^{4}, junto con los átomos de nitrógeno a los que están unidos, forman un anillo opcionalmente sustituido, con la condición de que al menos alguno de R^{3}, R^{4} y R^{5} contenga grupos disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado.

Se prefiere que R^{1} y R^{2} sean hidrógeno. Cuando R^{1} y/o R^{2} representan un grupo alquilo opcionalmente sustituido, más preferentemente un grupo alquilo que contiene una cadena C_{1}-C_{20}, más adecuadamente una cadena C_{1}-C_{10} y aún más adecuadamente una cadena C_{1}-C_{5}.

R^{3}, R^{4} y R^{5} representan más preferentemente grupos alquilo opcionalmente sustituidos que contienen una cadena C_{1}-C_{20}, más adecuadamente una cadena C_{1}-C_{10} y aún más adecuadamente una cadena C_{1}-C_{5}.

L^{2} y L^{4} representan más preferentemente cadenas de alquileno opcionalmente sustituido que contiene 1-10 átomos de carbono, más adecuadamente 1-5 átomos de carbono y aún más adecuadamente 1-3 átomos de carbono. L^{2} y L^{4} preferentemente están no sustituidos. L^{2} representa más preferentemente -CH_{2}-. L^{4} representa más preferentemente -CH_{2}CH_{2}-.

Cuando cualquiera de L^{1}, L^{2}, L^{3} y L^{4} están sustituidos, los sustituyentes pueden seleccionarse entre un amplio intervalo, incluyendo, sin limitación, alquilo, alcoxi, acilo, acilamino, carboxi, ciano, halo, hidroxi, nitro, trifluorometilo y amino.

Cuando R^{1} y/o R^{2} está sustituido, los sustituyentes pueden seleccionarse entre un amplio intervalo, incluyendo, sin limitación, alquilo, alcoxi, acilo, acilamino, carboxi, ciano, halo, hidroxi, nitro, trifluorometilo y amino.

Cuando cualquiera de R^{3}, R^{4} y R^{5} están sustituidos, los sustituyentes pueden seleccionarse entre un amplio intervalo, incluyendo, sin limitación, alquilo, alcoxi, acilo, acilamino, carboxi, ciano, halo, hidroxi, nitro, trifluorometilo y amino. Al menos alguno de R^{3}, R^{4} y R^{5} están sustituidos con grupos seleccionados entre sulfhidrilo, sulfhidrilo activado y -S-S-R^{6}, en la que R^{6} representa alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre un amplio intervalo, incluyendo, sin limitación, alquilo, alcoxi, acilo, acilamino, carboxi, ciano, halo, hidroxi, nitro, trifluorometilo y amino.

A menos que el contexto indique otra cosa, las referencias en el presente documento a grupos alquilo debería considerarse que indican grupos alquilo opcionalmente sustituidos que contienen una cadena C_{1}-C_{20}, más adecuadamente una cadena C_{1}-C_{10} y aún más adecuadamente una cadena C_{1}-C_{5}.

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En la Fórmula I, n puede ser entre 5 y 400, más adecuadamente entre 10 y 300 y aún más adecuadamente entre 20 y 100.

Preferentemente, el peso molecular del polímero de PAA es entre 1500 Da y 120.000 Da, más preferentemente entre 3.000 Da y 90.000 Da, aún más preferentemente entre 4.000 Da y 60.000 Da y los más preferentemente entre 6.000 Da y 30.000 Da. Los inventores han apreciado la importancia de su nuevo esquema de reacción como se muestra en el Esquema 1 usado para la preparación de la composición de acuerdo con el primer aspecto.

Por consiguiente, en un segundo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de preparación de un polímero de poliaminoamida (PAA) que comprende un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado, comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar un compuesto de bisacriloílo con una amina primaria y/o una di-amina secundaria, una o ambas de las cuales contiene un grupo disulfuro.

Una realización del procedimiento del segundo aspecto se resume en el Esquema 1, y comprende el uso de diferentes monómeros para formar un co-polímero. Se apreciará que la composición de acuerdo con el primer aspecto, que se prepara por el procedimiento del segundo aspecto, comprende un polímero o co-polímeros de PAA. Los co-polímeros se preparan uniendo juntas dos o más secuencias lineales de diferentes homopolímeros diferentes y, en los casos en los que los homopolímeros son largos, se produce un co-polímero de bloque. El técnico experto apreciará cómo preparar co-polímeros di-bloque, tri-bloque, de bloques intercalados o de estereo-bloque, y cómo elegir combinaciones de diversos monómeros o co-monómeros para conseguir el polímero deseado.

Como se muestra en el Esquema 1 y como se describe en los Ejemplos, las PAA (que son preferentemente lineales) que contienen un grupo colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado, pueden sintetizarse en un número de estructuras y secuencias poliméricas diferentes, dependiendo de los monómeros elegidos.

El compuesto de bisacriloílo usado en el procedimiento puede tener la fórmula II:

(Fórmula II)-CH_{2}=CH-CO-NR^{1}-L^{2}-NR^{2}-CO-CH=CH_{2}

en la que R^{1}, R^{2}, y L^{2} son como se han definido con respecto a la Fórmula I.

Preferentemente, R^{1} y R^{2} son hidrógeno. Preferentemente, L^{2} es un grupo CH_{2}. Se prefiere más que el compuesto de bisacriloílo sea bisacrilamida de metileno (MBA).

En las realizaciones preferidas del procedimiento en las que se usa una amina primaria que contiene un disulfuro, la amina primaria que contiene un grupo disulfuro puede tener la fórmula III:

(Fórmula III)-NH_{2}-R^{3}

en la que R^{3} es como se ha definido en la Fórmula I.

Preferentemente, R^{3} representa un grupo alquilo, más preferentemente alquilo C_{1-2}, sustituido con -S-S-R^{6}, en la que R^{6} es como se ha definido anteriormente, y es más preferentemente un grupo alquilo C_{1-2} que puede estar opcionalmente sustituido.

Preferentemente, la amina primaria que contiene un grupo disulfuro es cistamina, que puede estar sin proteger. Sin embargo, preferentemente, se usa un derivado mono-protegido de la amina primaria en el procedimiento. De esta manera, más preferentemente, la amina primaria es cistamina, uno de cuyos grupos amina lleva un grupo protector. Los inventores creen que el uso de un disulfuro terminado en amina primaria en la preparación de la composición es ventajoso porque requiere el uso de un pequeño número de etapas y porque la mayor parte del producto no se descompone en las condiciones de poliadición de PAA. Los Ejemplos 1 a 3 ilustran el procedimiento del segundo aspecto.

En realizaciones del procedimiento en las que se usa di-amina secundaria que contiene un disulfuro, la di-amina secundaria puede tener la fórmula IV:

(Fórmula IV)H-NR^{4}-L^{4}-NR^{5}-H

en la que R^{4}, R^{5} y L^{4} son como se han definido en relación con la Fórmula I.

R^{4} o R^{5} pueden representar un grupo alquilo, más preferentemente alquilo C_{1-2}, sustituido con - S-S-R^{6}, en la que R^{6} es como se ha definido anteriormente, y más preferentemente es un grupo alquilo C_{1-2}, que opcionalmente puede estar sustituido.

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En una realización, el procedimiento de acuerdo con el segundo aspecto puede comprender hacer reaccionar un compuesto de bisacriloílo con una amina primaria que contiene un grupo disulfuro (es decir, de Fórmula III). En otra realización, el procedimiento puede comprender hacer reaccionar un compuesto de bisacriloílo con una di-amina secundaria que contiene un grupo disulfuro (es decir, de Fórmula IV). Se apreciará que el procedimiento puede comprender también hacer reaccionar un compuesto de bisacriloílo con una amina primaria que contiene un grupo disulfuro, mostrada como Fórmula III y además, una di-amina secundaria que contiene un grupo disulfuro, mostrada como Fórmula IV.

Sin embargo, para controlar el nivel de grupos disulfuro o sulfhidrilo introducidos en el polímero de PAA producido, se prefiere especialmente que el procedimiento de acuerdo con el segundo aspecto implique el uso de moléculas de amina que no contienen ningún grupo disulfuro. Por ejemplo, la amina primaria (que contiene grupos disulfuro) puede usarse junto con una di-amina secundaria (que no contiene grupos disulfuro), o viceversa, para dar un polímero con un nivel controlado de restos disulfuro colgantes.

En una realización más preferida, la di-amina secundaria puede no contener un disulfuro. Por lo tanto, con referencia a la Fórmula IV, preferentemente R^{4} es metilo. Preferentemente, R^{5} es metilo. Preferentemente L^{4} comprende un CH_{2} y más preferentemente CH_{2}CH_{2,} Por lo tanto, la di-amina secundaria puede tener preferentemente la fórmula V:

(Fórmula V)-CH_{3}-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CH_{3}

Por lo tanto, se prefiere que una di-amina secundaria sea dimetiletilendiamina (DMEDA), como se muestra en los Esquemas 1 y 4, o 2-metil-piperazina, como se muestra en los Esquemas 2 y 3.

Por lo tanto, preferentemente, el procedimiento de acuerdo con un segundo aspecto comprende hacer reaccionar un compuesto de bisacriloílo, preferentemente de Fórmula II, con una amina primaria que contiene un grupo disulfuro, preferentemente de Fórmula III, con una di-amina secundaria, preferentemente de Fórmula V.

Por lo tanto, como se muestra en el Esquema 1, en la etapa uno del procedimiento, el compuesto de bisacriloílo, la amina primaria que contiene un grupo disulfuro y, preferentemente, la di-amina secundaria se hacen reaccionar juntas. Las condiciones de reacción adecuadas para la etapa uno comprenden disolver una bisacrilamida y BOC-cistamina en agua y agitarlas juntas en atmósfera de nitrógeno durante 6 h. El componente de di-amina se añade después y se hacer reaccionar durante 72 horas más. La bisacrilamida se usa en una cantidad equimolar respecto a la suma de los componentes di-amina y BOC-cistamina. La cantidad de BOC-cistamina puede ajustarse para variar la proporción de unidades de repetición que contiene un grupo sulfhidrilo. Los Ejemplos 1-3 y el Esquema 5 ilustran esta
reacción.

Como se muestra en el Esquema 1, en la etapa dos del procedimiento de acuerdo con el segundo aspecto, el disulfuro colgante puede reducirse posteriormente para dar un grupo sulfhidrilo libre. La reducción puede realizarse usando cualquier agente de reducción conocido por el técnico experto, por ejemplo, ditiotreitol (DTT). Las condiciones de reacción adecuadas para la etapa dos comprenden una reacción en agua que contiene tampón tris a pH 8,5 durante 6 horas. Para el DTT, puede usarse un exceso molar de 3 veces, aunque para el bisulfito sódico, se requiere una cantidad 1000 veces mayor. Los ejemplos de reducción de polímero se muestran en los Ejemplos 4-9 usando metabisulfito sódico (véanse los Ejemplos 5, 7 y 9) o DTT (véanse los Ejemplo 4, 6 y 8) y la reacción mostrada en el Esquema 6. Como se muestra en el Esquema 1, en la etapa tres del procedimiento de acuerdo con el segundo aspecto, el grupo sulfhidrilo libre puede activarse tras la adición de un agente de activación adecuado, por ejemplo, disulfuro de dipiridilo, como se ilustra en los Ejemplos 10 y 12 y en el Esquema 7. Preferentemente, el grupo sulfhidrilo libre se hace reaccionar con un bisulfuro de dipiridilo para dar un grupo sulfhidrilo protegido/activado. Las condiciones de reacción adecuadas para la etapa tres comprenden tratar el polímero reducido con una cantidad equimolar de disulfuro de dipiridilo durante 15 horas en agua que contiene tampón tris a pH 8,5, como se detalla en los Ejemplos 10 y 12. Como alternativa, como se describe en el Ejemplo 34, puede usarse ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoico) en lugar de disulfuro de dipiridilo como un agente de activación.

Como se ha mencionado anteriormente, la composición de acuerdo con el primer aspecto puede existir como una solución en condiciones en las que hay poca o sustancialmente ninguna reticulación entre las cadenas de polímero de PAA. Sin embargo, los inventores han descubierto que la composición que comprende PAA lineal que comprende un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado proporciona un sistema de reticulación sorprendentemente útil, que puede modificarse para su uso en una diversidad de aplicaciones biológicas y no biológicas. En particular, los inventores creen que la composición de acuerdo con el primer aspecto puede usarse eficazmente en un procedimiento para la preparación de composiciones reticuladas, tales como hidrogeles, que tienen diversas aplicaciones en medicina.

Por lo tanto, de acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona un hidrogel que comprende una pluralidad de cadenas de polímero de poliamidoamina (PAA) que están reticuladas mediante grupos de unión que contienen enlaces disulfuro reducibles.

Mediante el término "hidrogel", se entiende un gel en el que el agua es el medio de dispersión principal. Por lo tanto, preferentemente, los componentes y subunidades del hidrogel, es decir, las cadenas poliméricas de PAA reticuladas se dispersan dentro del agua. Preferentemente, el hidrogel comprende al menos un 80% (p/p) de agua, más preferentemente al menos un 90% (p/p) de agua y más preferentemente, al menos un 95% (p/p), incluso más preferentemente, al menos un 98% (p/p) de agua.

Los componentes reticulados del hidrogel (es decir, las cadenas de PAA) pueden tener un grado de polimerización entre 5 y 500, más preferentemente entre 10 y 250 y más preferentemente aún entre 10 y 100. Suponiendo un peso molecular unitario repetido de 300, estos pueden tener intervalos de peso molecular de 1500 Da a 150.000 Da y más preferentemente entre 3.000 Da y 75.000 Da y aún más preferentemente entre 3.000 Da y 30.000 Da.

Mediante el término "reticulación", se entiende un enlace covalente formado entre grupos colgantes unidos a dos cadenas poliméricas diferentes. En la invención, dichas reticulaciones implican la formación de enlaces disulfuro.

Preferentemente, el hidrogel reticulado del tercer aspecto es reducible, en el que las reticulaciones entre las cadenas poliméricas de PAA pueden romperse cuando el hidrogel se reduce. Los hidrogeles se conocen per se. Sin embargo, un hidrogel que comprende polímeros de PAA reticulados, reducibles, no se conoce, y es esta capacidad de reducción la que proporciona ventajas significativas sobre los hidrogeles conocidos.

El hidrogel de PAA reticulado (sustancialmente insoluble) puede reducirse tras ponerlo en contacto con un agente reductor, por ejemplo, ditiotreitol (DTT), metabisulfito sódico o glutatión. Las condiciones de reacción adecuadas para la reducción del hidrogel son que el hidrogel hidratado se ajusta a un pH de 8,5 con hidróxido sódico y se hace reaccionar con un exceso de 3 veces de ditiotreitol o un exceso molar de 3000 veces de metabisulfito sódico. Esta reacción de reducción se ejemplifica en el Esquema 9 y los Ejemplos 23, 25 y 27, que describen la reducción con DTT y los Ejemplos 24, 26 y 28 que describen la reducción del hidrogel con metabisulfito sódico. Esto da como resultado una composición correspondiente (sustancialmente soluble) de acuerdo con el primer aspecto en el que las cadenas de PAA tienen grupos colgantes que contienen grupos sulfhidrilo.

La composición de PAA reducida, soluble, puede purificarse por procedimientos conocidos en la técnica, con la condición de que se mantenga una atmósfera sustancialmente libre de oxígeno. En la mayoría de los casos, la purificación se consigue por ultrafiltración (Biomacromolecules 2, 1023-1028, 2001; Biomacromolecules 6, 2229-2235, 2005; Biomacromolecules 7, 1215-1222, 2006), y como se describe en diversos ejemplos. Por lo tanto, ventajosamente, la composición de acuerdo con el primer aspecto que comprende una composición que contiene un polímero de PAA puede almacenarse en condiciones inertes, por ejemplo, en nitrógeno, en estado de hidrogel sólido (es decir, el hidrogel de acuerdo con el tercer aspecto) o como una solución sustancialmente acuosa (es decir, la composición del primer aspecto).

Si se purifica a partir del agente reductor, es decir, tras la re-oxidación, entonces la PAA que lleva sulfhidrilo vuelve a convertirse de nuevo en la red reticulada del hidrogel del tercer aspecto. Los inventores han descubierto que el aire es un agente oxidante suficientemente fuerte y esto se muestra en los Ejemplos 29, 31 y 33. Adicionalmente, la temperatura también es un factor que influye en si la composición es acuosa o un hidrogel. Por lo tanto, en verano (es decir, a temperaturas por encima de 30ºC), la solución acuosa puede dejarse en un vaso de precipitados durante un tiempo y se observará gelificación a medida que se desarrollan reticulaciones entre las cadenas de PAA adyacentes. Puede usarse también peróxido de hidrógeno diluido para provocar la gelificación. El polímero reducido típicamente en este tampón tris a pH 8,5 se haría reaccionar con una cantidad equimolar de solución al 5% de peróxido de hidrógeno durante 3 horas. Sin embargo, debería evitarse un exceso (más de 1,3 veces la cantidad estequiométrica).

Debe apreciarse que la composición de PAA soluble que comprende PAA reducido (debido a la acción del agente reductor) puede usarse para formar un hidrogel directamente. Debe apreciarse también que la PAA activada puede usarse también para formar un hidrogel directamente.

Adicionalmente, en otro aspecto, se proporciona un procedimiento de preparación de un hidrogel que comprende una pluralidad de cadenas de polímero de poliamidoamina (PAA) que están reticuladas mediante grupos de unión que contienen enlaces disulfuro reducibles, comprendiendo el procedimiento: (i) hacer reaccionar un compuesto de bisacriloílo con una amina primaria y/o una di-amina secundaria, una o ambas de las cuales contiene un grupo disulfuro, para formar cadenas de polímero de PAA y (ii) permitir que los enlaces disulfuro reducibles se formen entre las cadenas de polímero de PAA.

El hidrogel puede prepararse in situ, por ejemplo, usando cistamina no protegida como la amina primaria. Este procedimiento se describe en los Ejemplos 20 a 22.

Los inventores han descubierto que la composición de acuerdo con el primer aspecto o el hidrogel de acuerdo con el tercer aspecto pueden convertirse fácilmente en o sintetizarse como un co-polímero con PEG, para formar PAA reticulables PEGiladas. La inclusión de PEG en hidrogeles puede tener numerosos efectos beneficiosos, que comprenden mejorar la biocompatibilidad y reducir adicionalmente la toxicidad de los polímeros catiónicos y conferir propiedades de circulación prolongada de los hidrogeles si se formulan como nanopartículas. Por lo tanto, en una realización preferida, la composición del primer aspecto o el hidrogel del tercer aspecto comprenden un co-polímero de poliamidoamina (PAA) que comprende un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado y PEG.

El técnico experto apreciará la estructura y el comportamiento del PEG, que se ilustra en el Esquema 2. Preferentemente, la composición comprende un co-polímero de bloque de poli(amidoamina)-(etilenglicol). Preferentemente, la composición del primer aspecto del hidrogel o el hidrogel del tercer aspecto comprenden un co-polímero de bloque que tiene la estructura con bloques repetidos de poli(etilenglicol) y poli(amidoamina), en los que PEG contiene entre 2 y 500 y más preferentemente entre 10 y 250 unidades de etilenglicol. Los inventores creen que un procedimiento para incorporar PEG en la composición del primer aspecto o el hidrogel del tercer aspecto es particularmente útil.

Por lo tanto, de acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para preparar una composición que comprende un co-polímero de polietilenglicol (PEG) y poliamidoamina (PAA) que comprende un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado, que puede estar o no reticulada, comprendiendo el procedimiento poner en contacto monómeros de poliamidoamina (PAA) que comprenden un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo y sulfhidrilo activado con PEG terminado en amina; y permitir que se forme el co-polímero correspondiente.

Los inventores han previsto un nuevo procedimiento de acuerdo con el cuarto aspecto para preparar PAA reticulables PEGiladas. Las etapas (a) a (e) del Esquema 2 ilustran una realización del procedimiento del cuarto aspecto que da como resultado la preparación de un co-polímero de PAA PEGilada, donde n se refiere al número de monómeros de PEG. Por lo tanto, PEG puede hacerse reaccionar con un activador de polimerización adecuado, tal como carbodiimida (CDI), para producir una estructura PEGilada. Adecuadamente, n (mostrado en el Esquema 2) puede ser entre 0 y 100, más adecuadamente entre 5 y 8 y, aún más adecuadamente, entre 10 y 50. El producto de esta etapa (c) puede mezclarse con un disulfuro terminado en amina primaria (b) y/o una amina primaria o di-amina secundaria (a) en una proporción de a+b+c = 1, y hacerse reaccionar con una bisacrilamida como en el procedimiento del segundo aspecto. Preferentemente, la cantidad total de reactantes a+b+c es sustancialmente igual a la cantidad de bisacrilamida.

Como se muestra en el Esquema 2, el producto de esta etapa es un co-polímero multi-bloque de PAA lineal que comprende un polímero de poliamidoamina que tiene grupos colgantes que contienen restos disulfuro. Este puede reducirse con un agente reductor adecuado, de manera que el resto disulfuro se escinde y se sustituye por hidrógeno para formar un segundo compuesto intermedio que comprende un polímero de poliamidoamina que tiene grupos colgantes que contienen grupos sulfhidrilo (es decir, un grupo tiol). El segundo compuesto intermedio puede oxidarse (por ejemplo, al aire), de manera que se forman enlaces disulfuro intramoleculares entre los grupos sulfhidrilo colgantes formando de esta manera reticulaciones y produciendo una composición de PAA reticulada que comprende poliamidoamina (PAA) reticulada, en la que se forman reticulaciones entre los restos sulfhidrilo colgantes correspondientes. La composición reticulada es un hidrogel en condiciones normales. Como alternativa, el segundo compuesto intermedio puede hacerse reaccionar con un agente activante adecuado, tal como disulfuro de piridilo, para producir una poliamidoamina (PAA) que comprende un resto sulfhidrilo colgante, que a su vez forma la composición que comprende una poliamidoamina reticulada (PAA) que comprende un resto sulfhidrilo colgante. El producto resultante es un co-polímero de PEG-PAA lineal multi-bloque que contiene un grupo sulfhidrilo colgante para la reticulación.

Como alternativa, un co-polímero tri-bloque PEG-PAA-PEG puede producirse usando una reacción en dos etapas en la que un pequeño exceso de bisacriloílo está presente en la mezcla de reacción de polimerización para producir un polímero terminado en acrilato. Este producto puede hacerse reaccionar después adicionalmente mediante adición de PEG terminado en amina para dar un co-polímero tri-bloque terminado en amina.

Como se ilustra en el Esquema 3, que es otra realización del procedimiento del cuarto aspecto, los inventores han descubierto también que un monometoxi PEG (es decir, mono-protegido) puede modificarse con una di-amina primaria, que puede hacerse reaccionar posteriormente con otros co-monómeros para dar un co-polímero de PEG-PAA de tipo peine con las cadenas de PEG colgando de la cadena de polímero principal. Por la expresión "co-polímero de peine" se entiende uno en el que las cadenas de polímero (por ejemplo, PEG) se fijan a (es decir, cuelgan de) la cadena de polímero principal (por ejemplo, PAA), de la misma forma que las púas de un peine.

En esta realización del procedimiento, la adición secuencial de monometoxi PEG modificado con diamina después de la síntesis de PAA da como resultado, ventajosamente, una conformación tri-bloque PEG-PAA-PEG con grupos terminales protegidos con metoxi, como se muestra en el Esquema 4.

Los inventores creen que la composición y el hidrogel de acuerdo con la invención tendrán una utilidad considerable en muchos escenarios biomédicos, por ejemplo, en el suministro de biomoléculas con carga útil a un sitio diana.

Por lo tanto, de acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se proporciona una composición de suministro para suministrar una molécula con carga útil, comprendiendo la composición de suministro una molécula con carga útil combinada con la composición de acuerdo con el primer aspecto, o un hidrogel de acuerdo con el tercer aspecto.

De acuerdo con un sexto aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para preparar la composición de suministro de acuerdo con el quinto aspecto, comprendiendo el procedimiento poner en contacto una molécula con carga útil con la composición de acuerdo con el primer aspecto o con un hidrogel de acuerdo con el tercer aspecto, y exponer la mezcla a condiciones tales que la molécula con carga útil se combina con la composición o hidrogel, formando de esta manera una composición de suministro con carga útil de acuerdo con el quinto aspecto.

La composición de suministro puede ser una solución o un hidrogel y puede asumir cualquier forma o dimensión dependiendo de la molécula con carga útil a suministrar y la aplicación específica requerida. Por ejemplo, si la molécula con carga útil es una molécula polianiónica, tal como ADN, entonces tras complejarse con un polímero catiónico tal como PAA, hay una neutralización mutua de cargas. Esta neutralización conduce a una pérdida de hidrofilicidad y la pérdida resultante de moléculas de agua del complejo dirige la condensación de partículas a una estructura altamente enrollada. En dichos casos, no se formaría un hidrogel. Por consiguiente, preferentemente, la composición de suministro con carga útil puede comprender una partícula de soporte, por ejemplo, una micropartícula o una nanopartícula.

Por lo tanto, en un séptimo aspecto, se proporciona una partícula de soporte adaptada durante el uso para llevar una molécula con carga útil a un sitio diana, comprendiendo la partícula de soporte la composición de acuerdo con el quinto aspecto, en la que la molécula con carga útil es capaz de ser activa cuando la partícula es al menos adyacente al sitio diana.

La molécula con carga útil puede comprender un compuesto biológicamente activo (o biomolécula). Mediante el término "biomolécula", se hace referencia a cualquier molécula orgánica con una actividad y/o especificidad biológica, es decir, el compuesto tiene un efecto biológico sobre el alcance del sitio diana. La biomolécula puede ser una macromolécula de un organismo vivo. Por ejemplo, la molécula con carga útil puede comprender una célula entera, una parte de una célula, un virus, fago o un microorganismo o un orgánulo, o una partícula de virus, etc., un aminoácido, péptido, proteína, enzima, anticuerpo o un polisacárido. La carga útil puede comprender alternativamente otras moléculas o construcciones tales como materiales colorantes o particulados tales como micropartículas, nanopartículas u otros complejos de polielectrolito.

Sin embargo, preferentemente, la molécula con carga útil comprende una molécula polianiónica biológicamente activa, que preferentemente comprende una matriz regular de cargas negativas a lo largo de la misma. Por ejemplo, la molécula con carga útil puede comprender un ácido nucleico o un derivado del mismo. La molécula con carga útil puede comprender ADN o ADNc o ARN (por ejemplo, ARNm, ARNsi o ARNt). Ventajosamente, ocurre la atracción electrostática entre las cargas positivas del polímero de PAA y las cargas negativas de la molécula polianiónica, por ejemplo, la estructura de fosfato del ADN, para formar un complejo de polielectrolito que mejora la capacidad de la partícula de soporte de unirse y, por lo tanto, de llevar la carga útil.

El sitio diana puede ser un entorno biológico diana que requiere el suministro de la molécula con carga útil, por ejemplo, un sitio de tratamiento de un paciente, por ejemplo, un sitio con herida. El sitio diana puede ser un fluido corporal, un órgano, tejido, una célula, un grupo de células, tal como una masa tumoral. Dependiendo de la aplicación, el sitio diana puede ser intracelular (por ejemplo, para suministro de ADN) o extracelular (por ejemplo, matriz de hidrogel). Por consiguiente, el sitio diana puede estar fuera de una célula, es decir, en la matriz extracelular, o en la superficie de la célula.

Los tamaños adecuados de la partícula de soporte pueden variar de acuerdo con la carga útil y el uso. Para algunos usos, por ejemplo, el suministro de ADN, puede preferirse una formulación con tamaño de nanopartículas, en cuyo caso la partícula de soporte puede estar en el intervalo de 10 nm a 500 nm o más preferentemente de 20 nm a 250 nm, o más preferentemente aún entre 30 nm y 100 nm. Como se ilustra en las Figuras 3, 4, 6 y 7, los tamaños de partícula pueden estar entre 30 nm y 170 nm.

Para otros usos, por ejemplo, la incorporación de una proteína de baja liberación, puede preferirse una partícula de soporte de tamaño micrométrico con un intervalo de tamaño de 0,5 a 20 micrómetros o más preferentemente de 1 micrómetro a 5 micrómetros. Preferentemente, la partícula de soporte es de forma sustancialmente esférica y, por lo tanto, las dimensiones dadas anteriormente son el diámetro medio de la partícula. Sin embargo, dependiendo de las condiciones ambientales, una partícula original que tenga geometría esférica puede modificarse a una forma elíptica.

Debido a las considerables barreras físicas presentadas para el suministro de moléculas con carga útil a células y tejidos, puede preferirse incorporar diversos restos adicionales en las composiciones o el hidrogel de acuerdo con la invención y, en particular, el polímero de PAA de la misma. A modo de ejemplo, el polímero de PAA puede comprender adicionalmente ligandos dirigidos a la superficie celular o ligandos que se unen a la célula o secuencias dirigidas nucleares etc., que facilitan el suministro de la partícula de soporte al núcleo celular.

Ventajosamente, la química de las PAA descrita en el presente documento se presta fácilmente por sí misma a la incorporación de dichos restos y ligandos adicionales dentro del sistema de suministro o la partícula de soporte. Por ejemplo, pueden producirse fácilmente co-polímeros tri-bloque de PEG-PAA-PEG terminados en amina en la modificación del Esquema 2, que permite la adición de ligandos de reconocimiento biológicos, por ejemplo, para dirección y captación de células. La incorporación de otros grupos o restos colgantes dentro del polímero también es posible, y puede ser útil para la incorporación de otras funciones biológicas dentro del polímero de PAA, por ejemplo, incorporación de péptidos penetrantes en membrana o secuencias de localización nuclear, que las conocen bien los técnicos expertos.

Los inventores investigaron un procedimiento para incorporar una molécula con carga útil, tal como ADN, en la composición del primer aspecto o el hidrogel del tercer aspecto para preparar la composición del quinto aspecto, que puede usarse para formar una partícula de soporte del séptimo aspecto, La partícula de soporte se muestra en la Figura 2. Como se ilustra en el Esquema 4, que es una realización del procedimiento de acuerdo con el sexto aspecto, los inventores han descubierto que pueden producirse micelas de poli-ión que contienen una molécula con carga útil, tal como ADN, mezclando polímeros catiónicos PEGilados con ADN. En una realización de este procedimiento, esto puede conseguirse produciendo un PEG-PAA-PEG, como se ha descrito en relación con el procedimiento de acuerdo con el segundo aspecto respecto al Esquema 2 o el Esquema 3 y usando una PAA que contiene sulfhidrilo, descrito en el Esquema 1 como un reticulante. Este co-polímero de reticulación corto puede ser un co-polímero aleatorio con una pequeña concentración de disulfuros colgantes. Como alternativa, los polímeros de PAA con grupos disulfuro terminales pueden producirse mediante componentes poliméricos de reacción secuencial, en primer lugar usando la mezcla de componentes de bisacriloílo y di-amina y después una adición posterior del bisacriloílo con la cistamina monoprotegida.

Para producir complejos adecuados y, por lo tanto, partículas de soporte adecuadas de acuerdo con la invención, los inventores han descubierto que es ventajoso mantener una proporción apropiada de polímero de PAA a moléculas con carga útil, que, si se usa ADN, es la proporción PAA:ADN. Los inventores han demostrado previamente que las PEG-PAA pueden producir complejos de polielectrolito estabilizados estéricamente con ADN combinando PAA y PAA PEGilada (PEG-PAA-PEG) en proporciones adecuadas para dar proporciones de PEG a PAA apropiadas. Por lo tanto, considerando la optimización de estos complejos de polielectrolito, la localización de los sulfhidrilos en el PEG-PAA-PEG pueden situarse mejor inmediatamente entre los extremos de la PAA y el comienzo de los restos terminales de PEG para permitir una reducción sencilla del complejo cuando se requiera, para liberar así la molécula con carga útil. En este caso, una realización de un esquema para producir un número y localización controlados de restos sulfhidrilo, que puede preferirse, se ilustra en el Esquema 4.

El ensamblaje de la partícula de soporte puede conseguirse por procedimientos como se desvela en Rackstraw y col. (Biochimica et Biophysica acta 1576, 269-286, 2002). En esta publicación, se demostraba que una mezcla de PAA y PEG-PAA-PEG mezclado con ADN daba complejos estabilizados estéricamente pequeños, reproducibles, aunque la calidad de los complejos puede verse afectada por el orden de adición de los reactivos. Si se usan polímeros que contienen grupos sulfhidrilo libres, puede usarse un procedimiento similar. Como alternativa, si se usan grupos sulfhidrilo activados sobre uno de los componentes, la PAA corta puede mezclarse con la molécula con carga útil (por ejemplo, ADN), seguido de PEG-PAA-PEG. La estructura propuesta de la superficie de la partícula de soporte de acuerdo con el séptimo aspecto se ilustra en la Figura 2. Aunque los inventores no desean quedar ligados a hipótesis alguna, creen que la PAA corta forma un complejo suelto con el ADN. Al añadir el PEG-PAA-PEG el ADN se condensa totalmente con las cadenas de PEG orientadas hacia el medio externo. La PAA que ya está presente, experimenta entonces una reacción cruzada con los grupos sulfhidrilo colgantes en la PAA-PEG.

Ventajosa y preferentemente, la partícula de soporte puede reducirse con un agente reductor adecuado. Estos podrían incluir la reducción in vitro con agentes reductores tales como DTT o mercaptoetanol para recuperar ADN o la reducción in situ en un entorno celular mediante agentes reductores biológicos tales como glutatión o cisteína. Dicha reducción provoca que las reticulaciones entre las cadenas de PAA se rompan, provocando de esta manera que la partícula se desintegre, liberando de esta manera la molécula con carga útil (por ejemplo, ADN) en el sitio diana. Debido a que la actividad de la molécula con carga útil se mantiene dentro de la partícula de soporte, ventajosamente, la partícula de soporte es, por lo tanto, un sistema de suministro eficaz.

Los inventores realizaron otras investigaciones para dar soporte al uso de polímeros de PAA de acuerdo con la invención para la preparación de la partícula de soporte de acuerdo con el séptimo aspecto de la invención y, en particular, nanopartículas (complejos de polielectrolito) que contienen ADN que están reticulados para mejorar su estabilidad. Adicionalmente, los inventores investigaron el procedimiento de acuerdo con el procedimiento del sexto aspecto, para preparar la composición de suministro de acuerdo con el quinto aspecto. Los polímeros de PAA usados en estos experimentos implicaban el uso de una combinación de PAA PEGilada (como se usa en el procedimiento del cuarto aspecto) y también una poliamidoamina no PEGilada y los inventores descubrieron para su sorpresa que esta combinación PEGilada y no PEGilada da como resultado la producción de partículas con estabilidad mejorada.

Por lo tanto, preferentemente, la composición de acuerdo con el quinto aspecto, el procedimiento de acuerdo con el sexto aspecto y la partícula de soporte de acuerdo con el séptimo aspecto comprenden un uso de poliamidoamina (PAA) PEGilada y no PEGilada. Por lo tanto, preferentemente, la composición basada en PAA comprende un co-polímero de PEG-PAA-PEG o PEG-PAA y un homopolímero de PAA, conteniendo ambos grupos sulfhidrilo colgantes. Los Ejemplos 47 a 50 resumen los datos y se preparó un número de polímeros con diferentes especificaciones.

Los inventores prepararon numerosos co-polímeros adecuados, cuya química se ilustra en los esquemas de reacción 10 a 12. Los inventores han nombrado sus polímeros preferidos como Polímeros Complejantes (PC). El Esquema de reacción 10 ilustra las síntesis de moléculas precursoras de PC adecuadas y el esquema de reacción 11 ilustra la síntesis de polímeros complejantes preferidos a partir de estos precursores. La Figura 9 muestra una fórmula general para polímeros PC preferidos, en la que "a" y "b" pueden ser independientemente entre 1 y 200, preferentemente de 1 a 100 y más preferentemente entre 1 y 50. Los polímeros PC preferidos incluyen PC03 (en el que a es 16 y b es 15), PC04 (en el que a es 16 y b es 48) y PC05 (en el que a es 45 y b es 48).

Sin embargo, una composición basada en co-polímero de PEG-PAA-PEG preferida comprende PC06 (es decir, Polímero Complejante 06), que se describe en detalle en el Ejemplo 45. Como se muestra en la Figura 9 para CP06, "a" es 16 y "b" es 15.

Los inventores prepararon también un lote de homopolímeros de reticulación (XLP) y después fraccionaron este lote basándose en los pesos moleculares. El Esquema de Reacción 12 y el Ejemplo 46 describen la síntesis de diversos polímeros XLP preferidos de acuerdo con la invención. Los homopolímeros de reticulación (XLP) preferidos incluyen XLP-30K (30 kD), XLP-5K (5 kD), XLP-3K (3 kD), y XLP-1K (1 kD). Sin embargo, una composición basada en PAA más preferida (es decir, un homopolímero sin ningún PEG) comprende XLP10 (10 kD), que se describe con detalle en el Ejemplo 46.

El fundamento detrás del ensamblaje de estos polímeros de PAA en partículas de acuerdo con el séptimo aspecto sigue el de la publicación de Rackstraw anterior. La guía principal era que los complejos preferidos se forman por combinaciones particulares de los tres componentes, PAA PEGilada, PAA no PEGilada y ácido nucleico (AN), donde la proporción PEG-PAA y la proporción global de PAA a ácido nucleico se optimiza.

Se apreciará que a medida que cambian las especificaciones del polímero PEGilado (es decir, diferentes longitudes de cadena de PAA y diferentes longitudes de polímero), podría haber un mayor número posible de combinaciones diferentes de PEG-PAA-PEG:PAA:AN que podrían generar complejos óptimos y, por lo tanto, partículas de soporte de acuerdo con la invención. Los inventores han explorado las condiciones óptimas para polímeros de diferentes especificaciones y han investigado un intervalo de combinaciones de proporción de polímero de PAA y ADN para estar seguros de haber obtenido una formulación óptima.

El ensamblaje de las partículas de acuerdo con la invención se debe a una interacción del polímero de PAA con el ácido nucleico (por ejemplo, ADN) independientemente de si la PAA está constituida por el homopolímero o por el co-polímero. Los complejos altamente unidos dependen únicamente de que el PEG ocupe la superficie de las partículas y, por lo tanto, estarán relacionados con la proporción PEG:PAA total, aunque esto dependerá también de la proporción del área superficial al volumen y también del peso molecular del resto PEG.

Se apreciará que el tamaño de las partículas optimizadas depende en gran medida del tamaño de la cadena de ácido nucleico incorporada en su interior. Por ejemplo, para partículas de soporte de un tamaño mínimo (es decir, menor de 100 nm, por ejemplo, de aproximadamente 30-40 nm de diámetro) y con un peso molecular de PEG de 1700-2000, se ha determinado una proporción PEG-PAA total preferida en términos de Mn (peso molecular promedio en número) de los componentes poliméricos de entre 1:9 y 1:12. Sin embargo, los inventores han descubierto que pueden obtenerse también complejos bien formados en un intervalo de proporciones de 1:4 a 1:17.

De esta manera, el intervalo preferido de proporciones de Mn de PEG:PAA total para estas especificaciones de partícula puede ser de aproximadamente 1:4 a 1:17, más preferentemente de 1:7 a 1:15, aunque más preferentemente de aproximadamente 1:9 a 1:12.

Debería apreciarse que las proporciones preferidas disminuirán proporcionalmente a la proporción de área superficial a volumen de la construcción de partícula de soporte (puede suponerse que las construcciones tienen una geometría esférica toroidal dependiendo de las condiciones de formación) y se esperaría también que disminuyeran con una disminución en el peso molecular (PM) del componente de PEG.

Una de las ventajas del uso de una combinación de PAA PEGilada y PAA es que es posible formar complejos que no dan como resultado un exceso ni de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) ni de polímero, dando de esta manera un 100% de eficacia de partículas sin necesidad de limpieza. Para el polímero MBA-DMEDA mostrado en las Figuras 3 a 8, las proporciones PAA: AN preferidas están en el intervalo de 0,5:1 a 2:1. Se apreciará que para PAA, las proporciones están definidas por el peso molecular de la unidad de repetición de polímero comparada con el peso molecular de un nucleótido medio. Sin embargo, la proporción PAA:AN preferida es entre aproximadamente 1:1 y 1,5:1.

Además, los inventores han explorado también el número y disposición de grupos sulfhidrilo colgantes en los polímeros de PAA usados para asegurar que se obtiene una buena reticulación. Pueden requerirse diferentes grados de estabilidad de la partícula para diferentes aplicaciones. A la inversa, la capacidad para reducir las reticulaciones y liberar el ácido nucleico (por ejemplo, ADN), se hará más difícil a medida que aumenta el número de reticulaciones reducibles. Los datos presentados en los ejemplos es la primera evidencia de una especificación de polímero que producirá partículas reticuladas de acuerdo con la invención.

Los inventores han demostrado que ocurre una reticulación suficiente para estabilidad con una formulación en la que hay como media ocho grupos sulfhidrilo reducibles por polímero de PEG-PAA-PEG dispuesto con cuatro grupos en cada extremo de la cadena y que podrían ensamblarse en la superficie de la partícula de soporte. Sin embargo, una formulación con sólo cuatro grupos sulfhidrilo no parece proporcionar estabilidad extra. El polímero de reticulación contenía un grupo sulfhidrilo colgante en un 25% de las unidades de repetición equivalente a 1,5 grupos de reticulación en el reticulante comparado con el polímero de PEG-PAA-PEG.

Por lo tanto, los inventores han demostrado que el número de restos colgantes disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado de los polímeros de poliamidoamina (PAA) (PEGilada y no PEGilada) es un factor importante para determinar las características de las partículas de soporte resultantes. Preferentemente, la composición de acuerdo con la invención comprende un mínimo de seis grupos sulfhidrilo reducibles por cadena de PEG-PAA-PEG que se requieren para estabilidad y, preferentemente, un mínimo de ocho grupos sulfhidrilo reducibles por cadena de PEG-PAA-PEG. Puede requerirse un mayor número de grupos sulfhidrilo reducibles si se requiere un aumento de la estabilidad de la partícula de soporte para la aplicación particular. El polímero de reticulación preferentemente contiene 1-2 veces la cantidad de grupos sulfhidrilo colgantes contenida en el co-polímero de PEG:PAA:PEG.

Por lo tanto, es más preferente que el número de restos colgantes disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado del componente PEG-PAA sea como mínimo de seis, más preferentemente ocho, y que la cantidad de restos colgantes disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado en el componente PAA esté entre 0,5 y 2 veces la del componente PEG-PAA y más preferentemente entre 1 y 1,5 veces la del componente PEG-PAA.

Se muestran también algunos resultados sobre variaciones en el procedimiento usado para formar la composición de acuerdo con el quinto aspecto y las partículas de acuerdo con el séptimo aspecto, usando el procedimiento de acuerdo con el sexto aspecto. Los inventores variaron los volúmenes (es decir, las concentraciones) de los reactivos (es decir, la PAA PEGilada, la PAA no PEGilada y el ADN) usados en la preparación de las partículas y también el orden en el que los diferentes reactivos se añadieron entre sí durante el procedimiento. Hay claramente un número de maneras en el que los reactivos pueden mezclarse juntos. Por lo tanto, el procedimiento de acuerdo con el sexto aspecto puede comprender hacer reaccionar el polímero de PAA PEGilada con el ácido nucleico, seguido de reacción con PAA no PEGilada. Como alternativa, el procedimiento puede comprender hacer reaccionar PAA no PEGilada con el ácido nucleico seguido de reacción con PAA PEGilada.

Sin embargo, el procedimiento comprende preferentemente hacer reaccionar PAA PEGilada con PAA no PEGilada, seguido de reacción con ácido nucleico. Sorprendentemente la adición del ácido nucleico (es decir, ADN) a los polímeros en último lugar da como resultado que se produzcan composiciones y partículas mejoradas.

Los inventores encontraron difícil concebir maneras sencillas para medir si la reticulación había tenido lugar en la formación de partículas de soporte de la invención y también cómo de eficaz era. Por consiguiente, las Figuras 6 y 7 proporcionan algunos datos sobre la estabilidad de las partículas midiendo el tamaño de las partículas en presencia de diferentes concentraciones de sal usando la sal sulfato sódico, que es altamente disruptiva. Sería de esperar que las partículas poco estabilizadas mostraran un aflojamiento de los complejos representados por un tamaño de partícula más grande. Estos resultados se han obtenido para el intervalo de diferentes proporciones de componentes y los diferentes procedimientos de ensamblaje, y estos resultados generalmente están correlacionados con otros procedimientos que sugieren si ha ocurrido o no la reticulación.

Aunque sin desear quedar ligados a hipótesis alguna, las ideas del inventor sobre estabilidad se refieren a la teoría de polielectrolitos, que sugiere que los complejos formados están en equilibrio, aunque los inventores creen que este equilibrio es fuertemente a favor de la formación de partículas y, por lo tanto, las partículas deberían ser relativamente estables a menos que estén en presencia de altas concentraciones de sal, lo que alteraría los complejos.

Al considerar procedimientos para determinar la estabilidad de las partículas, los inventores han descubierto que para complejos a concentraciones bastante altas, la sal no altera mucho las partículas pero que las proteínas del suero sanguíneo lo hacen en mucha mayor medida. Sin embargo, en estas condiciones de concentraciones de partícula relativamente altas, estas condiciones no alteran la unidad de los complejos.

La metodología usada para determinar la reticulación surge a partir de un experimento sobre purificación de partículas. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que cuando se lavan extensivamente partículas no reticuladas en una membrana de ultrafiltración (por ejemplo, corte a 100.000 Da de PM), se disocian, pasan a través del filtro y después se vuelven a asociar en el otro lado. Basándose en estos hallazgos sorprendentes, los inventores creen que es improbable que sólo usando polímeros de PA largos sin reticulaciones degradables sería una manera adecuada de estabilizar estos sistemas de suministro, para suministro de genes en entornos de alta concentración de proteínas in vivo o para aplicaciones medioambientales donde se espera una alta dilución. Por lo tanto, es probable que el procedimiento de reticulación de acuerdo con la invención sea importante para estas dos aplicaciones.

El uso de filtración y examen mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) era el único procedimiento exitoso que los inventores han encontrado para demostrar inequívocamente que la reticulación de las nanopartículas se había conseguido. Por consiguiente, la Figura 8 muestra imágenes TEM de la formulación más preferida usando un par de campos representativos al microscopio.

Se apreciará que las diversas composiciones, el hidrogel y la partícula de soporte de acuerdo con la invención tienen muchas aplicaciones tanto en los campos médicos como no médicos. Un ejemplo de una aplicación no médica preferida implica el seguimiento de una fuente de agua en el medio ambiente. Actualmente, las fuentes de agua de cualquier suministrador de agua pueden seguirse usando un colorante fluorescente. Se añade un colorante fluorescente a la fuente de agua y el flujo de agua puede controlarse siguiendo la posición del colorante. Sin embargo, cuando se necesita seguir fuentes de agua adicionales en el mismo entorno, se requiere un colorante diferente, de manera que las diferentes fuentes de agua no se confundan. Se apreciará que sólo hay un número limitado de colorantes adecuados que pueden usarse en estas circunstancias, por lo que finalmente el número de colorantes disponibles que puede usarse para seguir las fuentes de agua se agota cuando es necesario seguir muchas fuentes de agua. Los inventores creen que este problema puede resolverse usando la partícula de soporte de acuerdo con el noveno aspecto para seguir el flujo de cualquier fuente de fluido en el medio ambiente.

Por lo tanto, en un octavo aspecto de la invención, se proporciona un sistema de seguimiento de fluidos para seguir un flujo de fluido, comprendiendo el sistema una partícula de soporte de acuerdo con el séptimo aspecto y un medio de detección para detectar la molécula con carga útil.

Por lo tanto, preferentemente, la molécula con carga útil comprende una molécula de seguimiento de fluido, que puede detectarse usando un medio de detección adecuado.

La invención se refiere también, en un noveno aspecto, a un procedimiento para seguir un fluido, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(i) aplicar una partícula de soporte de acuerdo con el séptimo aspecto que comprende una molécula con carga útil detectable a un fluido en una primera localización; y

(ii) detectar la molécula con carga útil en una segunda localización del fluido.

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Ventajosa y preferentemente, la partícula de soporte y, por lo tanto, la molécula con carga útil, es estable en el fluido, que puede ser agua. El sistema de seguimiento puede usarse para seguir agua en el medio ambiente. Las partículas de soporte pueden desplazarse largas distancias en el fluido y pueden usarse para comprobar la dirección de desplazamiento del fluido, por ejemplo, en el sistema de alcantarillado.

La partícula puede añadirse al fluido en una primera localización (esto se denomina fuente). La molécula con carga útil puede detectarse en el fluido en la segunda localización del fluido (esto se denomina posición de ensayo) mientras que aún está en la partícula de soporte. Sin embargo, preferentemente, el procedimiento comprende una etapa (antes de la etapa (ii) del procedimiento) de aislar la partícula del fluido en la segunda localización antes de la detección de la molécula con carga útil con el medio de detección. El procedimiento comprende preferentemente una etapa de aislar la molécula con carga útil de la partícula de soporte antes de la detección. La etapa de aislamiento puede comprender reducir la partícula de soporte para liberar la molécula con carga útil antes de la detección. La reducción puede conseguirse añadiendo un agente reductor tal como 1,4-ditiotreitol, ditioeritritol, metabisulfito sódico o glutatión reducido.

La molécula con carga útil preferentemente comprende una biomolécula, tal como un péptido o proteína. Sin embargo, se prefiere que la molécula con carga útil comprenda ácido nucleico y, preferentemente, ADN, que puede detectarse mediante un medio de detección adecuado, por ejemplo, por PCR. Este ADN, por lo tanto, se denomina "ADN de detección". En dichos casos, el medio de detección puede ser un secuenciador de ADN o una máquina de PCR.

La molécula con carga útil puede comprender un oligonucleótido monocatenario, que preferentemente es sintético. Por ejemplo, el oligonucleótido puede estar en el intervalo de aproximadamente 40-80 nucleótidos de longitud que tienen una secuencia predeterminada. Se apreciará que la secuencia específica de la molécula no es clave para la invención; lo es el hecho de que la secuencia actúa como marcador, huella o código de barras y es detectable. Por lo tanto, es posible cambiar la naturaleza de la molécula con carga útil (por ejemplo, la secuencia de la proteína o ADN) y usar así diferentes moléculas con carga útil y/o secuencias de las mismas para diferentes partículas de soporte y, de esta manera, seguir diferentes flujos de fluido en la misma zona simultáneamente.

Además de la detección de ADN, la molécula con carga útil puede comprender un compuesto de soporte, que puede ser ADN de soporte. El ADN de soporte puede degradarse y puede ser ADN de esperma de salmón bruto que se ha limpiado y fraccionado para dar una preparación de moléculas de ADN fundamentalmente monocatenarias de secuencia mixta con aproximadamente el mismo tamaño que el ADN de detección. La mezcla de ADN de detección y ADN de soporte (es decir, la molécula con carga útil) se incorpora entonces en la partícula de soporte reticulada de la invención. Ventajosamente, el uso del ADN de soporte reduce el coste del sistema. La proporción de ADN de detección a ADN de soporte puede estar en la región de 1:10 a 1:1000.

La partícula de soporte usada en el sistema del octavo aspecto puede comprender menos de 50 copias del ADN de detección, preferentemente menos de 30 copias y más preferentemente menos de 10 copias del ADN de detección. Sorprendentemente, los inventores creen que sólo se requiere una copia del ADN de detección por cada partícula de soporte. La etapa de detección puede comprender el uso de PCR para determinar que el ADN de soporte está presente y en qué cantidad.

En resumen, los inventores han demostrado que una composición del primer aspecto, que comprende un polímero de poliamidoamina (PAA) que comprende un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado o la composición del quinto aspecto, que incluye una molécula con carga útil, puede usarse para preparar un hidrogel del tercer aspecto por reticulación automática. También puede añadirse PEG para mejorar las propiedades del hidrogel. Sorprendentemente, los inventores han demostrado que las composiciones de acuerdo con la invención producen hidrogeles estables en condiciones fisiológicas. Adicionalmente, descubrieron también que los hidrogeles formados por la composición reticulada están adaptados para soportar biomoléculas tales como células, péptidos o moléculas de ADN. Además, ventajosamente, los hidrogeles de PAA reticulada son reducibles, de manera que una solución de polímero de PAA no reticulada puede formarse a partir del gel. Por lo tanto, los inventores creen que los hidrogeles formados por dichas composiciones que contienen PAA de reticulación, las propias soluciones no reticuladas y también la partícula de soporte descritas en el presente documento pueden usarse en un amplio intervalo de aplicaciones
médicas.

Por lo tanto, de acuerdo con un décimo aspecto de la invención, se proporciona una composición de acuerdo con el primer o quinto aspectos, o un hidrogel de acuerdo con el tercer aspecto o una partícula de soporte de acuerdo con el séptimo aspecto, para su uso como medicamento.

Los ejemplos de achaques específicos que pueden tratarse con el medicamento incluyen ingeniería tisular y escenarios de regeneración.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, se proporciona una composición de acuerdo con el primer o quinto aspecto, o un hidrogel de acuerdo con el tercer aspecto o una partícula de soporte de acuerdo con el séptimo aspecto, para su uso en el tratamiento de una afección médica caracterizada por pérdida o lesión tisular.

Adicionalmente, de acuerdo con un undécimo aspecto de la invención, se proporciona el uso de una composición de acuerdo con el primer o el quinto aspecto, o un hidrogel de acuerdo con el tercer aspecto o una partícula de soporte de acuerdo con el séptimo aspecto, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un afección médica caracterizada por pérdida o lesión tisular.

Además, las compasiones de acuerdo con el primer o el quinto aspecto, o un hidrogel de acuerdo con el tercer aspecto o una partícula de soporte de acuerdo con el séptimo aspecto pueden usarse en diversos procedimientos de tratamiento médico tales como el tratamiento de la pérdida o lesión tisular.

Por lo tanto, de acuerdo con un duodécimo aspecto, se proporciona una procedimiento para tratar, prevenir o mejorar a un individuo que padece una afección médica caracterizada por pérdida o lesión tisular, comprendiendo el procedimiento administrar a un individuo en necesidad de dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de acuerdo con el primer o el quinto aspecto o un hidrogel de acuerdo con el tercer aspecto o una partícula de soporte de acuerdo con el séptimo aspecto.

Los inventores prevén que el procedimiento de acuerdo con el duodécimo aspecto puede usarse para tratar un amplio intervalo de afecciones médicas caracterizadas por pérdida/lesión tisular. Los ejemplos de afecciones que pueden tratarse incluyen el tratamiento de heridas y lesiones relacionadas, trastornos degenerativos tisulares y pérdida de la función tisular. Por ejemplo, la herida puede ser crónica y puede ser abrasiva, por ejemplo, quemaduras. La herida puede formarse por presión tal como úlceras de decúbito y úlceras por presión. La herida puede ser aguda, y puede ser penetrante tal como un corte, un navajazo o como resultado de un aplastamiento del cuerpo del individuo que requiere tratamiento o por lesión o envejecimiento inducido por fármacos.

Los trastornos degenerativos tisulares específicos que pueden tratarse usando el procedimiento incluyen trastornos neurodegenerativos del disco intervertebral, cartílago y degeneración ósea tal como osteoartritis, osteoporosis, trastornos degenerativos del hígado, trastornos degenerativos del riñón, atrofia muscular, lesión o pérdida de nervios.

Se apreciará que la composición que comprende el polímero de PAA que contiene sulfhidrilo con o sin una molécula con carga útil puede usarse para formar el hidrogel del tercer aspecto en el sitio de tratamiento, y que esto permite la formación de una estructura de soporte de hidrogel, que está adaptada para soportar el crecimiento celular. Los inventores creen que las células podrán infiltrar el hidrogel en el sitio de tratamiento, formando de esta manera un cultivo celular o tejido en su interior. Este tejido puede sustituir y/o reparar entonces el tejido perdido o dañado en el sitio de tratamiento. Si se incluye una molécula con carga útil, entonces ésta puede usarse para potenciar o acelerar la regeneración del tejido.

En una primera realización del procedimiento de acuerdo con el duodécimo aspecto, el hidrogel puede formarse antes de la administración al individuo, por ejemplo, en un molde, usando el procedimiento del segundo o cuarto aspecto, si se requiere PEG. Una vez formado, el hidrogel puede administrarse entonces al sitio de tratamiento en el individuo. De nuevo, esto puede ser con o sin una molécula con carga útil.

En una segunda realización, una composición de precursor de hidrogel acuoso (es decir, la composición del primer aspecto), puede introducirse al sitio de tratamiento, que puede inducirse entonces in situ usando el procedimiento del segundo o cuarto aspecto para formar el hidrogel del tercer aspecto. Por lo tanto, el hidrogel puede prepararse in situ en el sitio de tratamiento con o sin una molécula con carga útil.

La composición de precursor acuoso preferentemente comprende el compuesto de bisacriloílo y una amina primaria o amina secundaria que contiene un grupo disulfuro, que después puede exponerse a condiciones adecuadas para formar un hidrogel del tercer aspecto. Se prefiere que el hidrogel o precursor de hidrogel se proporcione en un excipiente fisiológicamente aceptable. Mediante la expresión "excipiente fisiológicamente aceptable" se entiende cualquier solución adecuada, que sea capaz de conferir condiciones biológicamente aceptables a los polímeros de PAA, de manera que se forman reticulaciones entre las cadenas de polímero, dando como resultado de esta manera la gelificación para formar el hidrogel. Los ejemplos de excipientes adecuados los conocerá el técnico experto y pueden comprender un tampón fisiológico, tal como solución salina. Preferentemente, el excipiente se proporciona a un pH biológicamente aceptable, que permite la gelificación.

La elección de administrar o no el propio hidrogel del tercer aspecto o la composición precursora del hidrogel del primer o quinto aspecto al sitio de tratamiento depende de la afección médica específica a tratar. En cualquier caso, el hidrogel posterior puede usarse como una estructura de soporte para soportar al menos una célula en su interior, para reparar de esta manera el sitio de pérdida o lesión tisular.

De esta manera, los inventores han demostrado por primera vez que pueden prepararse polímeros de PAA de manera que tienen un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado y también que estos restos forman fácilmente reticulaciones entres ellos para formar un hidrogel reducible. De esta manera, preferentemente, el excipiente confiere condiciones biológicamente aceptables a las composiciones, de manera que se forman reticulaciones entre los polímeros de PAA, de manera que se forma el hidrogel en el sitio de tratamiento o antes de la administración al
mismo.

Hasta la fecha, los inventores creen que no ha sido posible formar hidrogeles de PAA reticulados reducibles a un pH biológicamente aceptable. Por lo tanto, los inventores creen que el uso de las composiciones y el hidrogel de acuerdo con la invención es un avance significativo respecto a la tecnología actual.

Una vez que el hidrogel se ha administrado a o se ha formado in situ en el sitio de tratamiento, entonces puede requerirse que libere la molécula con carga útil, si estuviera presente. Por lo tanto, preferentemente, el procedimiento comprende una etapa de reducir el hidrogel de manera que las reticulaciones se rompen, liberando de esta manera la molécula con carga útil en el sitio de tratamiento. La etapa de reducción puede conseguirse mediante la acción de agentes reductores biológicos presentes en el sitio de tratamiento, por ejemplo, tales como glutatión o cisteína. Como alternativa, el excipiente fisiológicamente aceptable puede comprender un agente reductor adecuado, de manera que después de un tiempo, el hidrogel formado en el sitio de tratamiento se disuelve lentamente liberando de esta manera la molécula con carga útil. Se prefiere que el excipiente biológicamente aceptable esté a un pH de entre 5 y 9, más preferentemente entre 6 y 8, aún más preferentemente, entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5. Se apreciará que el pH de la mayoría de las células es de aproximadamente 7,4. Por lo tanto, un excipiente más preferido tiene un pH de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 7,5. Se apreciará que dichos pH se denominan condiciones biológicamente aceptables.

Mediante la expresión "condiciones biológicamente aceptables" se entiende que el hidrogel usado en el procedimiento de la invención es sustancialmente estable en condiciones in vivo, es decir, condiciones de pH, fuerza iónica y temperatura que se encontrarían in vivo. Los inventores prevén principalmente el uso del procedimiento de acuerdo con el segundo o cuarto aspecto de la invención y, por lo tanto, el hidrogel para tratar trastornos caracterizados por lesión/pérdida de tejido en mamíferos y, en particular, en el hombre. Por lo tanto, se prefiere que el hidrogel se forme y sea estable en condiciones biológicamente aceptables en mamíferos y preferentemente en el hombre.

Los inventores creen que el sitio de tratamiento en los trastornos tratados estaría dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9,0. Sin embargo, se prefiere que el hidrogel se forme a un pH entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0. Como se describe en el presente documento, el procedimiento puede usarse para tratar heridas. En heridas crónicas, el pH puede ser entre 6,0 y 8,0. Por lo tanto, cuando se tratan heridas crónicas, se prefiere que el hidrogel sea estable entre un pH de aproximadamente 6,0 y 8,0 y preferentemente un pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5.

Los inventores creen que el sitio de tratamiento del individuo a tratar estaría a una fuerza iónica alta, es decir, de aproximadamente 0,15 M. Por lo tanto, se prefiere que el hidrogel se forme a una fuerza iónica de entre aproximadamente 0,01 M y aproximadamente 1 M, preferentemente entre aproximadamente entre 0,05 M y aproximadamente 0,5 M, más preferentemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,2 y aún más preferentemente entre aproximadamente 0,12 M y aproximadamente 0,17 M.

Se apreciará que los inventores prevén principalmente el uso de las composiciones y el hidrogel de acuerdo con la invención para tratar mamíferos y en particular el hombre. Los inventores han descubierto que es posible, por lo tanto, inducir la transición de las composiciones de acuerdo con la invención desde la solución que contiene el polímero de PAA no reticulada para formar el hidrogel reticulado según la demanda cuando está in situ en el sitio de tratamiento. Por lo tanto, preferentemente, el hidrogel usado en el procedimiento se forma por debajo de aproximadamente 40ºC, más preferentemente por debajo de aproximadamente 39ºC y aún más preferentemente por debajo de aproximadamente 38ºC. Por lo tanto, preferentemente, el hidrogel se forma a una temperatura de entre aproximadamente 36ºC y aproximadamente 38ºC y más preferentemente a aproximadamente 37ºC.

Sin embargo, debe apreciarse que en heridas crónicas, y también en órganos superficiales (tales como la piel, el ojo, etc.), la temperatura puede ser unos pocos grados menor, por ejemplo, aproximadamente de 32ºC a 34ºC. Por lo tanto, en realizaciones del procedimiento donde la composición se usa para tratar heridas crónicas u órganos superficiales, se prefiere que el hidrogel se forme a una temperatura de entre aproximadamente 32ºC y 34ºC.

Ventajosamente, eligiendo monómeros y co-monómeros específicos, que constituyen el polímero de PAA, es posible variar las propiedades estructurales y funcionales del hidrogel formado, y cómo interactúa y finalmente libera finalmente la molécula con carga útil si estuviera presente. Por lo tanto, el polímero de PAA reticulable y, por lo tanto, el hidrogel "se hacen a medida" específicamente, dependiendo del uso final del hidrogel.

Se prefiere que la composición de acuerdo con el primer o el quinto aspecto, o un hidrogel de acuerdo con el tercer aspecto se adapten para soportar al menos una célula, para formar de esta manera un medio de soporte celular fisiológicamente estable o una estructura de soporte para las células. Por lo tanto, el hidrogel o la composición, por lo tanto, puede sembrare con al menos una célula.

Por lo tanto, de acuerdo con un decimotercer aspecto de la presente invención, se proporciona un medio de soporte celular que comprende la composición de acuerdo con el primer o el quinto aspecto o un hidrogel de acuerdo con el tercer aspecto y al menos una célula.

El medio de soporte celular del decimotercer aspecto puede denominarse "estructura de soporte celda-hidrogel". Preferentemente, el medio de soporte celular está adaptado para soportar una pluralidad de células. Preferentemente, la o cada célula es bioquímicamente funcional in vivo. Por consiguiente, la pluralidad de células puede formar un cultivo celular o un tejido. Debido a que la composición del precursor de hidrogel del primer aspecto es una solución, puede suspenderse al menos una célula en su interior.

En un decimocuarto aspecto, se proporciona un procedimiento de preparación de un medio de soporte celular de acuerdo con el decimotercer aspecto, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(i) poner en contacto la composición de acuerdo con cualquiera del primer o quinto aspecto, o un hidrogel de acuerdo con el tercer aspecto, con al menos una célula; y

(ii) exponer el hidrogel o la composición a condiciones tales que al menos una célula esté soportada sobre el mismo o en su interior, formando de esta manera un medio de soporte celular.

El procedimiento de acuerdo con el decimocuarto aspecto puede realizarse in situ en el sitio de tratamiento o lejos del sitio de tratamiento y después transferirse al mismo. El técnico experto apreciará cómo cultivar diversos tipos de células con el hidrogel o las composiciones de acuerdo con la invención. Por lo tanto, se apreciará que los detalles específicos de las metodologías (tiempo de cultivo, temperaturas, medios de crecimiento, etc.) usadas dependerá del tipo de célula implicado y el uso final del medio de soporte celular (es decir, la estructura de soporte célula-
hidrogel).

Sin embargo, la etapa (i) del procedimiento de acuerdo con el decimocuarto aspecto puede comprender poner en contacto la solución de la composición precursora del hidrogel de acuerdo con el primer aspecto o la composición de suministro del quinto aspecto con la al menos una célula. La naturaleza de la etapa (ii) del procedimiento determinará si la composición en la etapa (i) es una solución reticulada o un hidrogel reticulado.

El procedimiento puede comprender exponer la composición precursora de hidrogel a condiciones tales que se forma un hidrogel en la etapa (i) antes de poner en contacto la al menos una célula con el mismo. Dichas condiciones pueden comprender reducir la temperatura de la composición por debajo de la temperatura de gelificación crítica, por ejemplo, menos de aproximadamente 39ºC y/o añadir un agente oxidante adecuado para permitir que ocurra la reticulación.

En una realización alternativa, la composición puede mantenerse inicialmente en condiciones en las que está en forma de solución de la composición del precursor de hidrogel no reticulado en la etapa (i) del procedimiento, a la que se añade al menos una célula en la etapa (ii). Por lo tanto, el procedimiento puede comprender exponer inicialmente la composición en la etapa (i) a condiciones en las que es una solución (es decir, no un hidrogel). Por ejemplo, la composición puede exponerse a un pH o temperatura o fuerza iónica a la que la composición no está reticulada y, por lo tanto, es sustancialmente líquida. El procedimiento puede comprender entonces la etapa de poner en contacto la al menos una célula con la fase acuosa en la etapa (i). Después de la etapa (i), la etapa (ii) comprende preferentemente exponer la composición de precursor líquido a condiciones en las que se forma un hidrogel formando reticulaciones entre las cadenas de PAA. El hidrogel que se forma, en el que está soportada al menos una célula, se denomina medio de soporte celular o estructura de soporte celular.

En otra realización, el medio de soporte celular puede prepararse lejos de la herida (por ejemplo, en el laboratorio), y administrarse después preferentemente al área a tratar. En este enfoque, el gel se formaría en una forma tridimensional predeterminada, por ejemplo, usando un molde, y las células pueden añadirse antes del procedimiento de gelificación o después de que se haya formado el gel. El gel pre-formado puede implantarse entonces en el cuerpo donde las células del paciente migran hacia la estructura de soporte del gel. Los ejemplos de este uso sería en tejidos, que tienen una capacidad migratoria y/o aquellos que son sensibles a la remodelación tisular. Los ejemplos son piel, hueso y nervios periféricos. El facultativo puede complementar también externamente el implante con otras células. Además, pueden añadirse al implante otros factores que pueden simular la célula y preferentemente el crecimiento tisular, por ejemplo, factores de crecimiento.

Preferentemente, el medio de soporte celular o hidrogel, preparado in situ en el área a tratar o lejos de la misma, se mantiene adecuadamente para permitir que al menos una célula se divida para formar un cultivo o tejido en su interior. Por consiguiente, se apreciará que el hidrogel actúa como una estructura de soporte para el tejido y, de esta manera, permite la reparación de la herida o la regeneración del tejido dañado.

Los inventores creen que el procedimiento de acuerdo con el duodécimo aspecto, puede usarse en una amplia variedad de procedimientos de tratamiento médico diferentes, tal como aplicaciones de regeneración/ingeniería tisular y en el curado de heridas. Los tipos de tejidos y heridas que pueden tratarse son variados y, por lo tanto, se apreciará que la invención no está limitada a ningún tipo específico de célula, que podría estar soportada y cultivada sobre el hidrogel administrado al sitio de tratamiento. Sin embargo, a modo de ejemplo, las células adecuadas que pueden soportarse en el hidrogel incluyen células epiteliales (por ejemplo, hepatocitos), neuronas, células endoteliales, osteoblastos (células óseas), condrocitos (células de cartílago), fibroblastos, células de músculo liso, osteoclastos, queratinocitos, células progenitoras de nervios, células de Schwann, células madre, macrófagos, células isleta y células tumorales, etc.

El tipo de célula que se pone en contacto con la composición o el medio de soporte celular dependerá del tipo de herida a reparar o del tipo de tejido a regenerar. Por lo tanto, a modo de ejemplo, si la herida es en la piel, puede ponerse en contacto entonces al menos una célula cutánea con el hidrogel, composición o medio de soporte celular. Si la herida es en el hueso, se pone en contacto preferentemente entonces al menos una célula ósea u osteoblasto con el hidrogel, composición o medio de soporte celular. Si la herida es un cartílago, se pone en contacto preferentemente entonces al menos un condrocito con el hidrogel, composición o medio de soporte celular. Si se ha dañado el tejido ocular, puede requerirse poner en contacto el hidrogel, composición o medio de soporte celular con las células madre del ojo. Se apreciará que diferentes tipos de células pueden ponerse en contacto con el hidrogel, composición o medio de soporte celular, si fuera necesario.

Las composiciones, hidrogel o medio de soporte celular, pueden combinarse en formulaciones que tienen un número de formas diferentes dependiendo, en particular, de la manera en la que se va a usar la formulación. Se apreciará que el vehículo de la composición de la invención debería ser uno que sea bien tolerado por el sujeto al que se le suministra y que posibilite, preferentemente, un suministro eficaz de la composición a un sitio diana. De esta manera, por ejemplo, la composición puede estar en forma de un líquido (es decir, la composición de acuerdo con el primer aspecto) o un hidrogel (es decir, la composición de acuerdo con el tercer aspecto) o cualquier otra forma adecuada que pueda administrarse a una persona o animal.

Las composiciones, hidrogel, partícula de soporte, medio de soporte celular o medicamento de acuerdo con la invención pueden usarse en una monoterapia (es decir, el uso de las composiciones, hidrogel, vehículo, partícula de soporte, medio/estructura de soporte celular o medicamento solo). Como alternativa, las composiciones, hidrogel, partícula de soporte, medio/estructura de soporte celular o medicamento de acuerdo con la invención pueden usarse como un adyuvante o en combinación con otras terapias conocidas.

En algunas circunstancias, las composiciones, hidrogel, partícula de soporte, medio/estructura de soporte celular o medicamento de acuerdo con la invención pueden administrarse por inyección en las áreas con herida. Las inyecciones pueden ser intravenosas (bolo o infusión) o subcutáneas (bolo o infusión).

Como alternativa, las composiciones, hidrogel, partícula de soporte, medio/estructura de soporte celular o medicamento pueden incorporarse también dentro de un dispositivo de liberación lenta o retrasada. Dichos dispositivos, por ejemplo, pueden situarse en o adyacentes al área a tratar, por ejemplo, mediante implante, y las composiciones, hidrogel, partícula de soporte, medio/estructura de soporte celular o medicamento pueden liberarse durante semanas o incluso meses. Dichos dispositivos pueden ser particularmente ventajosos cuando se requiere el tratamiento a largo plazo con el medicamento y que normalmente requerirán una administración frecuente (por ejemplo, al menos inyección o implante diario).

Se apreciará que la cantidad de composiciones, hidrogel, partícula de soporte, medio/estructura de soporte celular o medicamento de acuerdo con la invención requerido estará determinada por su actividad biológica y biodisponibilidad, que depende a su vez del modo de administración, las propiedades fisicoquímicas del medicamento empleado y si las composiciones, hidrogel, partícula de soporte, medio/estructura de soporte celular o medicamento se están usando como una monoterapia o en una terapia combinada. La frecuencia de administración está influida también por los factores mencionados anteriormente y, particularmente, por la semi-vida del medicamento dentro del sujeto a tratar.

Las dosificaciones óptimas a administrar las pueden determinar los expertos en la materia, y variarán con el medicamento particular que se use, la potencia de la preparación, el modo de administración y el avance de la patología. Factores adicionales que dependen del sujeto particular a tratar darán como resultado la necesidad de ajustar las dosificaciones, incluyendo la edad del sujeto, peso, género, dieta y tiempo de administración.

Pueden usarse procedimientos conocidos, tales como los empleados convencionalmente por la industria farmacéutica (por ejemplo, experimentación in vivo, ensayos clínicos, etc.), para establecer formulaciones específicas del medicamento de acuerdo con la invención y regímenes terapéuticos precisos (tales como dosis diarias y la frecuencia de administración).

Generalmente, puede usarse una dosis diaria de entre 0,01 \mug/kg de peso corporal y 1,0 g/kg de peso corporal del hidrogel de acuerdo con la invención para la prevención y/o tratamiento de una afección médica específica. Más preferentemente, la dosis diaria es entre 0,01 mg/kg de peso corporal y 100 mg/kg de peso corporal. Las dosis diarias pueden darse como una sola administración (por ejemplo, un solo comprimido diario). Como alternativa, el medicamento puede requerir la administración dos o más veces durante un día. Como un ejemplo, el medicamento de acuerdo con la invención puede administrarse como dos (o más, dependiendo de la gravedad de la afección) dosis diarias de entre 25 mg y 5000 mg. Un paciente que recibe tratamiento puede tomar una primera dosis después de levantarse y después una segunda dosis por la tarde (si está en un régimen de dos dosis) o a intervalos de 3 ó 4 horas posteriormente. Como alternativa, puede usarse un dispositivo de liberación lenta para proporcionar dosis óptimas a un paciente sin necesidad de administrar dosis repetidas.

En un decimoquinto aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de acuerdo con el primer o quinto aspecto, el hidrogel de acuerdo con el tercer aspecto o la partícula de soporte de acuerdo con el séptimo aspecto; y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona también en un decimosexto aspecto, un procedimiento para fabricar la composición farmacéutica de acuerdo con el decimoquinto aspecto, comprendiendo el procedimiento combinar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición, hidrogel o partícula de soporte de acuerdo con la presente invención; y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica puede comprender un medio/estructura de soporte celular de acuerdo con el decimotercer aspecto.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es cualquier cantidad que, cuando se administra a un sujeto, proporciona prevención y/o tratamiento de una afección médica especifica. Un "sujeto" puede ser un vertebrado, mamífero, animal doméstico o un ser humano.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" como se menciona en el presente documento es cualquier vehículo fisiológico conocido por los expertos habituales en la materia útil en la formulación de composiciones farmacéuticas. El vehiculo farmacéuticamente aceptable puede ser un líquido y la composición farmacéutica está en forma de una solución. En una realización preferida adicional, el vehículo farmacéutico es un gel o hidrogel y la composición está en forma de una crema o similares. En ambos casos, la composición puede aplicarse al sitio de tratamiento.

La cantidad de la composición, hidrogel, partícula de soporte o medio/estructura de soporte celular puede ser de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 800 mg. Preferentemente, la cantidad de composición, hidrogel, partícula de soporte o medio/estructura de soporte celular es de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg, más preferentemente, aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 250 mg, aún más preferentemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 60 mg y aún más preferentemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg.

La composición farmacéutica puede comprender una o más sustancias, que pueden actuar también como lubricantes, solubilizadores, agentes de suspensión, cargas, emolientes, adyuvantes de compresión o aglutinantes. Puede ser también un material de encapsulación. Los vehículos líquidos se usan en la preparación de soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires y composiciones presurizadas. La composición, hidrogel, partícula de soporte o medio/estructura de soporte celular o medicamento de acuerdo con la invención puede disolverse o suspenderse en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable tal como agua, un disolvente orgánico, una mezcla de ambos o aceites o grasas farmacéuticamente aceptables. El vehículo líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados tales como solubilizadores, emulsionantes, tampones, conservantes, edulcorantes, agentes saporíferos, agentes de suspensión, agentes espesantes, colorantes, reguladores de viscosidad, estabilizadores u osmo-reguladores. Los ejemplos adecuados de vehículos líquidos para administración oral y parenteral e implantes incluyen agua (que contiene parcialmente aditivos como en el caso anterior, por ejemplo, derivados de celulosa, preferentemente una solución de carboximetilcelulosa sódica), alcoholes (incluyendo alcoholes monohídricos y alcoholes polihídricos, por ejemplo, glicoles) y sus derivados y aceites (por ejemplo, aceite de coco y aceite de cacahuete fraccionados). Para administración parenteral, el vehículo puede ser también un éster oleoso, tal como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los vehículos líquidos estériles son útiles en composiciones en forma líquida estéril para administración parenteral. El vehículo líquido para composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propulsor farmacéuticamente aceptable.

En los casos donde se desea inyectar o implantar la composición, hidrogel, partícula de soporte o medio/estructura de soporte celular o medicamento de acuerdo con la invención directamente en el sitio de tratamiento, pueden utilizarse composiciones farmacéuticas líquidas que son soluciones o suspensiones estériles, por ejemplo, por inyección intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal, intravenosa y particularmente subcutánea, intracerebral o intracerebroventricular. La composición, hidrogel, partícula de soporte, medio/estructura de soporte celular o medicamento de acuerdo con la invención puede prepararse en forma de una composición estéril que puede disolverse o suspenderse en el momento de la administración usando agua estéril, solución salina u otro medio inyectable estéril apropiado. Los vehículos se inyectan para incluir los aglutinantes necesarios e inertes, agentes de suspensión, lubricantes, edulcorantes, conservantes, colorantes y revestimientos.

Se prefiere que la composición, hidrogel, partícula de soporte o medio/estructura de soporte celular o medicamento de acuerdo con la invención pueda implantarse en forma de una solución o suspensión estéril o gel o hidrogel que contiene otros solutos o agentes de suspensión (por ejemplo, suficiente solución salina o glucosa para hacer a la solución isotónica), sales biliares, goma arábiga, gelatina, monooleato de sorbitano, polisorbato 80 (ésteres de oleato de sorbitol y sus anhídridos copolimerizados con óxido de etileno) y similares. Preferentemente, la composición, hidrogel, partícula de soporte o medio/estructura de soporte celular o medicamento de acuerdo con la invención se implanta en forma de composición líquida o sólida (hidrogel). Las composiciones adecuadas para implantes incluyen formas líquidas, tales como soluciones, jarabes, elixires y suspensiones.

Todas las características descritas en el presente documento (incluyendo cualquiera de los dibujos adjuntos, resumen y dibujos) y/o todas las etapas de cualquier procedimiento o proceso descrito, pueden combinarse con cualquiera de los aspectos anteriores en cualquier combinación excepto combinaciones donde al menos alguna de dichas características y/o etapas sean mutuamente excluyentes.

Para una mejor comprensión de la invención y mostrar cómo las realizaciones de la misma pueden realizarse de forma efectiva, se hará referencia ahora, a modo de ejemplo, a los dibujos esquemáticos adjuntos en los que:

El Esquema 1 muestra un esquema de reacción química para la preparación de poliamidoamina (PAA) que contiene restos sulfhidrilo colgantes;

El Esquema 2 muestra un esquema de reacción química para la preparación de PEG-PAA reticulables para dar PEG-PAA lineal multi-bloque;

El Esquema 3 muestra un esquema de reacción química para la preparación de co-polímeros tipo peine de PEG-PAA reticulables;

El Esquema 4 muestra un esquema de reacción química para la preparación de PAA terminada en PEG con un bloque de grupos sulfhidrilo colgantes;

El Esquema 5 muestra un esquema de reacción química para preparar una poliamidoamina que contiene restos de cistamina;

El Esquema 6 muestra un esquema de reacción química para reducir polímeros que contienen cistamina protegida con Boc para dar un grupo sulfhidrilo libre;

El Esquema 7 muestra un esquema de reacción química para activar los grupos sulfhidrilo libres mediante intercambio de disulfuro de tiol por disulfuro de bipiridilo;

El Esquema 8 muestra un esquema de reacción química para la formación del hidrogel por reacción de polímeros que contienen un tiol reducido y polímeros que contienen un tiol activado;

El Esquema 9 muestra un esquema de reacción química para la reducción de hidrogeles a sus polímeros constitutivos;

El Esquema 10 muestra un esquema de reacción química para las síntesis de precursores del Polímero Complejante (PC)

El Esquema 11 muestra un esquema de reacción química para la síntesis general de polímeros PC;

El Esquema 12 muestra un esquema de reacción química para la síntesis de Polímeros de Reticulación (XLP);

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La Figura 1 muestra la estructura química de un hidrogel que consiste en PAA reticuladas juntas mediante enlaces formados entre los grupos sulfhidrilo colgantes;

La Figura 2 muestra un esquema de reticulación en complejos de polielectrolito para formar nanopartículas de suministro de ADN;

La Figura 3 es un diagrama de barras que muestra los tamaños de partícula de la proporción de MBA/DMEDA25-Pi a PEG-MBAIDMEDA16-SH-PEG 2:1 usando diferentes proporciones de PAA:ADN;

La Figura 4 es un diagrama de barras que muestra tamaños de partícula de una proporción MBAIDMEDA25-Pi a PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG 3:1 usando diferentes proporciones de PAA:ADN;

La Figura 5 muestra imágenes representativas de complejos producidos con una proporción de MBA/DMEDA25-Pi a PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG 2:1 y una proporción de PAA:ADN 1,25:1 y con una proporción de MBA/
DMEDA25-Pi a PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG 3:1 y una proporción de PAA:ADN 1,25:1 se muestran en la Figura 5. Las partículas toroidales se formaron de manera que tenían un tamaño de 35 nm y 20 nm, respectivamente;

La Figura 6 es un diagrama de barras que muestra tamaños de partícula de la proporción de MBA/DMEDA25-Pi a PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG 2:1 usando diferentes proporciones de PAA:ADN y haciendo uso del tercer procedimiento antes y después de la adición de sulfato sódico;

La Figura 7 es un diagrama de barras que muestra tamaños de partícula de la proporción de MBA/DMEDA25-Pi a PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG 3:1 usando diferentes proporciones de PAA:ADN y haciendo uso del 3^{er} procedimiento antes y después de añadir sulfato sódico;

La Figura 8 son imágenes TEM de una solución dejada sobre un filtro o filtrada después de la centrifugación de los complejos en una ultrafiltradora centrífuga. Los complejos usados están a una proporción de MBA/DMEDA25-Pi a PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG 2:1 usando una proporción de PAA:ADN de 1,5:1 y una proporción de MBA/
DMEDA25-Pi a PEG-MBA/DMEDA16-Cis-PEG de 2:1 usando una proporción de PAA:ADN 1,5:1; y

La Figura 9 muestra la estructura general de los polímeros complejantes (PC) - PC03: a = 16, b = 15; PC04: a = 16, b = 48; PC05: a = 45, b = 48; PC06: a = 45, b = 15.

Ejemplos Ejemplo 1

Polimerización de bisacrilamida de metileno (MBA) con 2-metil-piperazina (MP) y Boc-cistamina (30%) (MBA30-cist). En un matraz de fondo redondo, equipado con un agitador magnético y entrada de nitrógeno, la MBA (100,2 g, 0,65 mol) se disolvió en atmósfera inerte en agua destilada (200 ml). Se añadió Boc-cistamina (49,2 g, 0,195 mol) y se permitió que reaccionara durante 6 horas. Después se añadió MP (45,6 g, 0,455 mol) y se permitió que la solución de reactivo reaccionara con agitación, protegida de la luz directa. Después de 72 horas la solución viscosa se diluyó con solución 1,0 M de HCl hasta pH 5,0, se ultrafiltró a través de una membrana con un corte nominal de 5.000 y se liofilizó. El producto se aisló en forma de sal clorhidrato. Rendimiento 176,5 g, 85%, \overline{M}_{n} = 25700; \overline{P}_{m} = 49200.

Ejemplo 2

Polimerización de BP con MP y Boc-cistamina (30%) (BP30-cist). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1 pero usando BP (126,3 g, 0,65 mol) en lugar de MBA, siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento: 190,7 g (73,0%). \overline{M}_{n} = 23800; \overline{P}_{m} = 47000.

Ejemplo 3

Polimerización de BP con MP y Boc-cistamina (50%) (BP50-cist). Mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 2, pero usando una cantidad diferente de Boc-cistamina (82,0 g, 0,325 mol) y de MP (45,6 g, 0,325 mol), siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento: 209,4 g (75,8%).
\overline{M}_{n} = 21500; \overline{P}_{m} = 41700.

Ejemplo 4

Reducción de MBA30-cist con DTT (MBA30-SH-a). En un matraz de fondo redondo, equipado con un agitador magnético y entrada de nitrógeno, se disolvió MBA30-cist (100 g, 0,083 mol de Boc-cistamina colgantes) en atmósfera inerte en agua destilada (500 ml). El pH se ajustó a 8,5 con NaOH y se añadió un exceso de tres veces de DDT (38,3 g, 0,25 mmol). Se permitió que la solución de reactivo reaccionara durante 6 horas. Se diluyó con una solución acuosa 1,0 M de HCl hasta pH 2, se ultrafiltró a través de una membrana con un corte nominal de 5.000 usando agua desoxigenada y se liofilizó. El producto se aisló en forma de sal clorhidrato y se almacenó en atmósfera de nitrógeno. Rendimiento 70,0 g (81,9%). \overline{M}_{n} = 31600; \overline{P}_{m} = 62500.

Ejemplo 5

Reducción de MBA30-cist con Na_{2}S_{2}O_{5} (MBA30-SH-b). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 2, pero usando Na_{2}S_{2}O_{5} (47,3 g, 0,25 mol) en lugar de DDT, siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto se aisló de la misma manera, pero era necesario un menor pH (al menos pH 2) para eliminar completamente el ácido sulfuroso. Rendimiento: 71,8 g (84,0%). \overline{M}_{n} = 33400; \overline{P}_{m} = 67100.

Ejemplo 6

Reducción de BP30-cist con DDT (BP30-SH-a). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 4, pero usando BP30-cist (100 g, 0,075 mol de Boc-cistamina colgantes) en lugar MBA30-cist. Se usó un exceso de tres veces de DTT (34,5 g, 0,22 mmol), siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento: 74,5 g (87,7%). \overline{M}_{n} = 29000; \overline{P}_{m} = 60700.

Ejemplo 7

Reducción de BP30-cist con Na_{2}S_{2}O_{5} (BP30-SH-b). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 6, pero usando Na_{2}S_{2}O_{5} (42,6 g, 0,22 mol) en lugar de DTT. El producto se aisló de la misma manera, pero era necesario un pH menor (al menos pH 2) para eliminar completamente el ácido sulfuroso. Rendimiento: 69,5 g (80,0%). \overline{M}_{n} = 26800; \overline{P}_{m} = 50300.

Ejemplo 8

Reducción de BP50-cist con DTT (BP50-SH-a). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 6, pero usando BP50-cist (100 g, 0,118 mol de Boc-cistamina colgantes) en lugar de BP30-cist. Se usó un exceso de tres veces de DTT (54,41 g, 0,35 mmol), siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento: 65,1 g (82,0%). \overline{M}_{n} = 23400; \overline{P}_{m} = 25900.

Ejemplo 9

Reducción de BP50-cist con Na_{2}S_{2}O_{5} (BP50-SH-b). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 8, pero usando de Na_{2}S_{2}O_{5} (67,1 g, 0,35 mol) en lugar de DTT. El producto se aisló de la misma manera, pero era necesario un pH menor (al menos pH 2) para eliminar completamente el ácido sulfuroso. Rendimiento: 66,1 g (83,3%). \overline{M}_{n} = 22800; \overline{P}_{m} = 45300

Ejemplo 10

Intercambio de disulfuro de tiol entre MBA30-SH y disulfuro de bipiridilo (MBA30-Pi). En un matraz de fondo redondo, equipado con un agitador magnético y entrada de nitrógeno, se disolvió MBA30-SH (50 g, 0,043 mol de grupos funcionales tiol) en atmósfera inerte en tampón TRIS desoxigenado (100 ml, 0,1 M, pH 8,5). Se añadió disulfuro de bipiridilo (10,4 g, 0,047 mol) a la solución agitada, que casi inmediatamente se hizo amarilla, debido a la presencia de 2-mercaptopiridina y se permitió que reaccionara durante 15 horas. Posteriormente, la solución se diluyó con solución acuosa 1,0 M de HCl a pH 3,0, se ultrafiltró a través de una membrana con un corte nominal de 5.000 y se liofilizó. El producto se aisló en forma sal clorhidrato. Rendimiento 50,2 g, 91,8%. \overline{M}_{n} = 30000; \overline{P}_{m} = 58400.

Ejemplo 11

Formación de hidrogel mediante intercambio de disulfuro de tiol activado entre MBA30-Pi y MBA30-SH (HG-MBA30-a). En un matraz de fondo redondo, equipado con un agitador magnético y entrada de nitrógeno, se disolvió MBA30-Pi (50 g, 0,039 mol de grupos disulfuro activados) en atmósfera inerte en tampón TRIS desoxigenado (80 ml, 0,1 M, pH 8,5). Se añadió MBA30-SH (40,5 g, 0,039 mol de grupos funcionales tiol) a la solución agitada, que casi inmediatamente se hizo viscosa y amarilla. Después de media hora, la agitación se detuvo y se permitió que la mezcla reactiva reaccionara durante 15 horas. Se formó un hidrogel transparente sólido. Se molió, se lavó con HCl 1,0 M y varias veces con una solución de etanol:agua 1:1, hasta que las aguas de lavado ya no aparecían más coloreados. El hidrogel se lavó después tres veces con acetona y se secó al vacío para obtener un polvo fino. Rendimiento 81,2 g, 94,2%.

Con referencia al Esquema 8, se muestra el esquema de reacción para la formación de un hidrogel mediante la reacción de polímeros que contienen un tiol reducido y polímeros que contienen un tiol activado.

Ejemplo 12

Intercambio de disulfuro de tiol entre BP50-SH y disulfuro de bipiridilo (BP50-Pi). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 10, pero usando en BP50-SH (50 g, 0,0748 mol de grupos funcionales tiol) en lugar de MBA30-SH, cambiando en consecuencia la cantidad de disulfuro de bipiridilo (17,9 g, 0,0814 mol), siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento: 51,4 g (88,5%). \overline{M}_{n} = 19900; \overline{P}_{m} = 40100.

Ejemplo 13

Formación de hidrogel mediante intercambio de disulfuro de tiol activado entre BP50- Pi y BP50-SH. (HG-BP50-a). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 11, pero usando BP50-Pi (50,0 g, 0,064 mol de grupos disulfuro activados) en lugar de MBA30-Pi y BP50-SH (43,1 g, 0,064 mol de grupos funcionales tiol) en lugar de MBA30-SH, siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento 81,7 g (95,0%).

Ejemplo 14

Formación de hidrogel mediante oxidación de MBA30-SH por el oxígeno del aire (HG-MBA30-b). En un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético, se disolvió MBA30-SH (50 g, 0,039 mol de grupos funcionales tiol) en tampón TRIS (40 ml, 0,1 M, pH 8,5). Cuando se formó una solución transparente, se transfirió a una placa Petri y se cubrió. Después de 48 horas se formó un gel transparente, de consistencia y aspecto similares a HG-MBA30-a obtenido en el Ejemplo 11. Se molió, se lavó con HCl 0,1 M y después varias veces con agua destilada hasta que las aguas de lavado aparecieron neutras. El hidrogel se lavó después tres veces con acetona y se secó al vacío para obtener un polvo fino. Rendimiento 46,3 g, 92,7%.

Ejemplo 15

Formación de hidrogel mediante oxidación de MBA30-SH mediante peróxido de hidrógeno (HG-MBA30-c). En un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético, se disolvió MBA30-SH (50 g, 0,039 mol de grupos funcionales tiol) en tampón TRIS (30 ml, 0,1 M, pH 8,5). Cuando se formó una solución transparente, se añadió una solución de peróxido de hidrógeno al 5% en agua (26,7 ml, 0,039 mol) y la agitación se detuvo después de unos pocos minutos. Casi inmediatamente la solución se hizo más viscosa que antes. Después de 3 horas se formó un gel transparente, de consistencia y aspecto similares a HG-MBA30-a y HG-MBA30-a. Se molió, se lavó con HCl 0,1 M y después varias veces con agua destilada hasta que las aguas de lavado aparecieron neutras. El hidrogel se lavó después tres veces con acetona y se secó al vacío para obtener un polvo fino. Rendimiento 47,4 g, 94,9%.

Ejemplo 16

Formación de hidrogel mediante oxidación de BP30-SH mediante el oxígeno del aire (HG-BP30-a). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 14, pero sustituyendo BP30-SH (50 g, 0,043 mol de grupos funcionales tiol) por MBA30-SH, siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento 47,7 g, 95,6%.

Ejemplo 17

Formación de hidrogel mediante oxidación de BP30-SH mediante peróxido de hidrógeno (HG-BP30-b). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 15, pero sustituyendo BP30-SH (50 g, 0,043 mol grupos funcionales tiol) por MBA30-SH, cambiando en secuencia la cantidad de peróxido de hidrógeno (29,2 g, 0,043 mol), siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento 45,8 g, 91,8%.

Ejemplo 18

Formación de hidrogel mediante oxidación de BP50-SH mediante el oxígeno del aire (HG-BP50-b). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 14 pero sustituyendo BP50-SH (50 g, 0,064 mol de grupos funcionales tiol) por MBA30-SH, siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento 46,1 g, 92,4%.

Ejemplo 19

Formación de hidrogel mediante oxidación de BP50-SH mediante peróxido de hidrógeno (HG-BP50-c). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 15 pero sustituyendo BP50-SH (50 g, 0,064 moles de grupos funcionales tiol) por MBA30-SH, cambiando en consecuencia la cantidad de peróxido de hidrógeno (43,36 g, 0,064 mol) y la cantidad de tampón TRIS (20 ml), siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento 46,9 g, 94,0%.

Ejemplo 20

Polimerización de MBA con MP y cistamina (30%) (HG-MBA30-d). En un matraz de fondo redondo, equipado con un agitador magnético y entrada de nitrógeno, se disolvió MBA (100,2 g, 0,65 mol) en atmósfera inerte en agua destilada (200 ml). Se añadió bis-clorhidrato de cistamina (22,0 g, 0,0975 mol) con la cantidad estequiométrica de hidróxido de litio monohidrato (8,18 g, 0,195 mol). Cuando la disolución se hubo completado, se añadió MP (45,6 g, 0,455 mol) se agitó durante media hora y se permitió que reaccionara con agitación, protegido de la luz directa. Después de 120 horas, se formó un gel transparente, de consistencia y aspecto similares a HG-MBA30-a obtenido en el Ejemplo 11. El hidrogel se molió, se lavó con HCl 0,1 M y después varias veces con agua destilada hasta que las aguas de lavado aparecieron neutras. El hidrogel se lavó después tres veces con acetona y se secó al vacío para obtener un polvo fino. Rendimiento 46,3 g, 92,7%.

Ejemplo 21

Polimerización de BP con MP y cistamina (30%) (HG-BP30-c). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 20 pero usando BP (126,3 g, 0,65 mol) para MBA, siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento: 203,6 g (89,6%). Consistencia y aspecto similares a los de HG-BP30-a obtenido en el Ejemplo 16.

Ejemplo 22

Polimerización de BP con MP y cistamina (50%) (HG-BP50-d). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 21, pero usando una cantidad diferente de clorhidrato de cistamina (36,6 g, 0,163 mol) y de MP (32,6 g, 0,325 mol), siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento: 195,0 g (89,0%). La consistencia y el aspecto eran similares a los de HG-BP30-a obtenido en el Ejemplo 13.

Ejemplo 23

Reducción y disolución de HG-MBA30-d con DTT (MBA30-SH-c). En un matraz de fondo redondo, equipado con un agitador magnético y entrada de nitrógeno, se permitió que HG-MBA30-d (100 g, 0,049 mol de grupos cistamina) se hinchara en atmósfera inerte en agua destilada (500 ml). El pH se ajustó a 8,5 con NaOH y se añadió un exceso de tres veces de DTT (22,45 g, 0,15 mmol). Se permitió que la solución de reactivo reaccionara durante 6 horas. Se diluyó con solución acuosa de HCl 1,0 M hasta pH 2, se ultrafiltró a través de una membrana con un corte nominal de 5.000 en agua desoxigenada y finalmente se liofilizó. El producto se aisló en forma de sal clorhidrato y se almacenó en atmósfera de nitrógeno. Rendimiento 73,1 g (73,2%). \overline{M}_{n} = 32600; \overline{P}_{m} = 63500.

Ejemplo 24

Reducción y disolución de HG-MBA30-d con Na_{2}S_{2}O_{5} (MBA30-SH-d). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 23 pero usando Na_{2}S_{2}O_{5} (27,7 g, 0,15 mol) para DTT, siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto se aisló de la misma manera pero era necesario un menor pH (al menos pH 2) para eliminar completamente el ácido sulfuroso. Rendimiento: 74,7 g (74,6%). \overline{M}_{n} = 31400; \overline{P}_{m} = 60200.

Ejemplo 25

Reducción y disolución de HG-BP30-d con DTT (BP30-SH-c). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 23, pero usando HG-BP30-c (100 g, 0,043 moles de grupos cistamina) en lugar de HG-MBA30-d. Se usó un exceso de tres veces de DTT (19,9 g, 0,13 mmol), siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento: 68,5 g (68,4%). \overline{M}_{n} = 23400; \overline{P}_{m} = 447200.

Ejemplo 26

Reducción y disolución de HG-BP30-d con Na_{2}S_{2}O_{5} (BP30-SH-d). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 25, pero usando Na_{2}S_{2}O_{5} (24,5 g, 0,13 mol) en lugar de DTT, siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto se aisló de la misma manera, pero era necesario un menor pH (al menos pH 2) para eliminar completamente el ácido sulfuroso. Rendimiento: 71,9 g (71,8%). \overline{M}_{n} = 31400; \overline{P}_{m} = 60200.

Ejemplo 27

Reducción y disolución de HG-BP50-d con DTT (BP50-SH-c). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 23 pero usando HG-BP30-c (100 g, 0,043 mol de grupos cistamina) en lugar de HG-MBA30-d. Se usó un exceso de tres veces de DTT (19,9 g, 0,13 mmol), siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento: 68,5 g (68,4%). \overline{M}_{n} = 23400; \overline{P}_{m} = 47200.

Ejemplo 28

Reducción y disolución de HG-BP30-d con Na_{2}S_{2}O_{5} (BP30-SH-d). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 25 pero usando Na_{2}S_{2}O_{5} (24,5 g, 0,13 mol) en lugar de DTT, siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto se aisló de la misma manera, pero era necesario un menor pH (al menos pH 2) para eliminar completamente el ácido sulfuroso. Rendimiento: 71,9 g (71,8%). \overline{M}_{n} = 31400; \overline{P}_{m} = 60200.

Ejemplo 29

Formación de hidrogel mediante oxidación de MBA30-SH-d mediante el oxígeno del aire (HG-MBA30-e). Mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 14, pero sustituyendo MBA30-SH-d por MBA30-SH-a, siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento 45,2 g, 90,6%.

Ejemplo 30

Formación de hidrogel mediante oxidación de MBA30-SH-d mediante peróxido de hidrógeno (HG-MBA30-f). Mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 15 pero sustituyendo MBA30-SH-d por MBA30-SH-a, siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento 46,2 g, el 92,6%.

Ejemplo 31

Formación de hidrogel mediante oxidación de BP30-SH-d mediante el oxígeno del aire (HG-BP30-d). Mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 14, pero sustituyendo BP30-SH-d (50 g, 0,043 mol de grupos funcionales tiol) por MBA30-SH-a, siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento 45,6 g, 91,4%.

Ejemplo 32

Formación de hidrogel mediante oxidación de BP30-SH-d mediante peróxido de hidrógeno (HG-BP30-e). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 15 pero sustituyendo BP30-SH (50 g, 0,043 mol de grupos funcionales tiol) por MBA30-SH, cambiando en consecuencia la cantidad de peróxido de hidrógeno (29,2 g, 0,043 moles), siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento 43,8 g, 87,7%.

Ejemplo 33

Formación de hidrogel mediante oxidación de BP50-SH-d mediante el oxígeno del aire (HG-BP50-e). Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 14, pero sustituyendo BP50-SH (50 g, 0,064 moles de grupos funcionales tiol) por MBA30-SH, siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento 44,8 g, 89,9%.

Ejemplo 34

Formación de hidrogel mediante oxidación de BP50-SH-d mediante peróxido de hidrógeno (HG-BP50-f). Mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 15, pero sustituyendo BP50-SH (50 g, 0,064 moles de grupos funcionales tiol) por MBA30-SH, cambiando en consecuencia la cantidad de peróxido de hidrógeno (43,36 g, 0,064 moles) y la cantidad de tampón TRIS (20 ml), siendo las otras condiciones de reacción iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento 44,1 g, 88,5%.

Ejemplo 35

Los Ejemplos 10, 12 pueden duplicarse de la siguiente manera. Puede seguirse el mismo procedimiento que en el Ejemplo 10 ó 12, pero sustituyendo el ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoico), cuya fórmula se muestra a continuación, por una cantidad equimolecular de 2,2'-dipiridilsulfuro, siendo las otras condiciones iguales.

1

El producto resultante contiene restos ácido tio(2-nitrobenzoico) en lugar de restos 2-piridilsulfuro. Su reactividad hacia las reacciones de intercambio de tiol es la misma.

Materiales y Procedimientos Materiales

(L)-cisteína (\geq 99,0%), carbonato potásico (99%), 1,4-ditio-D,L-treitol (99%) se adquirieron en Fluka y se usaron sin purificación adicional. D_{2}O (99,9%) estabilizado sobre una bobina de plata, 2,2-metilenbisacrilamida (denominada en lo sucesivo en el presente documento MBA) 1,4-(D,L)-ditiotreitol (denominado en lo sucesivo en el presente documento DTT), metabisulfito sódico (Na_{2}S_{2}O_{5}), disulfuro de bipiridilo, tris-hidroximetilaminometano (denominado en lo sucesivo en el presente documento TRIS) y 2-metilpiperazina (denominada en lo sucesivo en el presente documento MP) se adquirieron en Aldrich.

Las soluciones acuosas de HCl normal se adquirieron en Rieden de Haen. El ácido 2,2-bis(acrilamido)acético (denominado en lo sucesivo en el presente documento BAC), bis(acriloil)piperazina (denominada en lo sucesivo en el presente documento BP) y N-terc-butiloxicarbonil cistamina se sintetizaron como se ha descrito previamente (Ferruti, P.; Ranucci, E.; Trotta, F.; Gianasi, E.; Evagorou, GE; Wasil, M.; Wilson, G.; Duncan, R. Macromol. Chem. Phys. 1999, 200, 1644; Ferruti, P. Macromol. Synth. 1985, 9, 25 y K.A. Jacobson, B. Fischer, X. Ji, Bioconjugate Chem. 1995, 6, 255).

Instrumentos y Procedimientos

Los espectros de ^{1}H y ^{13}C se obtuvieron en un espectrómetro Brüker Advance 400, que funcionaba a 500,133 MHz (^{1}H) y a 125,00 MHz (^{13}C). Las trazas de la cromatografía de exclusión de tamaños (SEC) se obtuvieron haciendo uso de columnas G4000 PW TSK-gel y G3000 PW TSK-gel producidas por TosoHaas. Las dos columnas se conectaron en serie y la fase móvil era tampón Tris, pH 8,10; caudal 1 ml/min (bomba HPLC modelo Waters 515); el detector UV era un Waters modelo 486 que funciona a 230 nm; el detector de refracción era un Waters modelo 2410. Las muestras se prepararon en tampón Tris con una concentración del 1% en polímero. Las determinaciones de peso molecular estaban basadas en una curva de calibrado obtenida con patrones de pululano.

Sumario y Conclusiones

Usando estos ejemplos, los inventores han demostrado que pueden producirse PAA que contienen restos cistamina que están protegidas con BOC usando dos pares diferentes de co-monómeros y diferentes niveles de incorporación de cistamina. Todos estos polímeros diferentes pueden reducirse para dar un grupo sulfhidrilo libre usando ditiotreitol o metabisulfito sódico como reductor. Los polímeros activados que contienen disulfuro de bipiridilo se han producido mediante una reacción de intercambio de disulfuro de tiol usando polímeros producidos por cualquiera de las PAA con diferentes co-monómeros.

Los inventores han demostrado adicionalmente que los hidrogeles pueden prepararse a partir de estos polímeros que contienen cistamina por numerosas rutas. Estas rutas son (1) mezcla de polímeros que contienen un grupo sulfhidrilo libre y polímeros que contienen polímeros activados por disulfuro de piridilo o (2) oxidación usando el oxígeno del aire o peróxido de hidrógeno. Los inventores han demostrado también que los hidrogeles pueden crearse in situ por incorporación de cistamina no protegida en la reacción de polimerización, demostrado también usando dos pares de comonómeros diferentes y diferentes cantidades de cistamina. Los hidrogeles preparados por esta ruta pueden reducirse para formar polímeros no reticulados usando ditiotreitol o bisulfito sódico como agentes reductores. Los polímeros no reticulados producidos de esta manera pueden volver a ensamblarse en hidrogeles usando el oxígeno del aire o peróxido de hidrógeno, exactamente igual que polímeros recién preparados.

En conclusión, los inventores observaron que las poliamidoaminas descritas en el presente documento proporcionan un grupo versátil de polímeros que pueden sintetizarse conteniendo un grupo cistamina. Puede usarse una diversidad de rutas químicas para reducir o activar los polímeros para formar hidrogeles y los hidrogeles pueden reducirse a sus polímeros constitutivos y reformarse. Se espera que este grupo versátil y diverso de polímeros reticulables reversiblemente encuentre aplicación, por lo tanto, en diversas aplicaciones biomédicas como hidrogeles u otras aplicaciones donde la reticulación es beneficiosa.

Otros Instrumentos y Procedimientos

Los espectros RMN de ^{1}H y ^{13}C se realizaron en un espectrómetro Brüker Advance 400 que funcionaba a 400,132 MHz (^{1}H) y 100,623 (^{13}C). Las trazas de la cromatografía de exclusión de tamaños (SEC) de polímeros solubles en disolventes orgánicos (patrones de poliestireno) se obtuvieron usando columnas Phenomenex Phenogel 500, 103 y 104 A, conectadas en serie, equipadas con un detector UV que funcionaba a 254 nm, una fase móvil 9/1 (v/v) de diclorometano/metanol. Las trazas de SEC de polímero soluble en agua (patrones de pululano) se obtuvieron usando un instrumento BOMBA DE HPLC WATERS 515, con columnas Toso-Haas 486, usando tampón Tris 0,1 M, pH 8,00 \pm 0,05 como fase móvil, equipado con un detector doble de dispersión luz Viscotek 270 y un detector Rl Waters
2410.

Materiales

Tris-(hidroximetil)-aminometano (TRIS) (>99,8%), 2-mercaptopiridina (>95%), hidróxido de litio monohidrato (>98%) y di-clorhidrato de cistamina (>98%), éter metílico de poli(etilenglicol) 750, éter metílico de poli(etilenglicol) 2000, carbonil di-imidazol (>97%), piperazina (>99%), morfolina (>99%), N,N'-metilenbis(acrilamida) (>98%), N,N'-dimetilendiamina (>98%), di-terc-butil-dicarbonato (>98%), se adquirieron en Fluka y se usaron tal cual se recibieron. Los disolventes de calidad analítica para HPLC se adquirieron en Fluka y se usaron tal cual se recibieron. D_{2}O (99,9%), d_{6}-DMSO (99,8%), CDCl_{3} (99,8%), 2,2'-ditiodipiridina (98%) se adquirieron en Aldrich y se usaron tal cual se recibieron. El agua se destiló dos veces.

Ejemplo 36 Homo poli(MBA-DMEDA), 30K, terminado en morfolina (MBA-DMEDA30)

Para el compuesto MBA-DMEDA30, "A30" se refiere al Mn aproximado del polímero.

Se añadió MBA (1,54 g, 10,0 mmol) en pequeñas porciones a una solución acuosa de DMEDA (0,88 g, 10,0 mmol en 3,5 ml de agua) en atmósfera de nitrógeno. Se permitió que la solución reactiva reaccionara durante 72 horas con agitación, después se añadió morfolina (87,5 \mul, 1,0 mmol) y se permitió que reaccionara durante 24 horas. Posteriormente el pH se ajustó a 2,5 con HCl acuoso 1 M, la solución se ultrafiltró a través de una membrana con un corte de peso molecular de 3.000 y se secó por congelación.

El producto se caracterizó por SEC y espectroscopía de RMN.

^{1}H RMN (d_{6}-DMSO): 2,25 (s, 6H, CH_{3}N), 2,39 (t, 4H, CO-CH_{2}-CH_{2}-N), 2,51 (s, 4H, N-CH_{2}-CH_{2}-N), 2,66 (t, 4H, CO-CH_{2}-); 4,56 (m, ancho, 2H, NH-CH_{2}-NH), 8,82 (t, ancho, 2H, NH).

\overline{M}_{n} : 27000, \overline{P}_{m} : 42000; Rendimiento: 2,6 g, 93%.

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Ejemplo 37 Homo poli(MBA-DMEDA), 5 K, terminado en amino (Esquema 1/B) (MBA-DMEDAS)

Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 36, pero usando una cantidad diferente de DMEDA (0,924 g, 10,5 mmol), siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto bruto se destiló con agua y se liofilizó sin purificación adicional.

Rendimiento: cuantitativo. \overline{M}_{n} : 3800; \overline{P}_{m} : 7900

Espectro de RMN similar al obtenido con el producto del Ejemplo 36.

Ejemplo 38 Homo poli(MBA-DMEDA), 10 K, terminado en amino (Esquema/1B) (MBA-DMEDA10)

Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 36, pero usando una cantidad diferente de DMEDA (0,902 g, 10,25 mmol) siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto bruto se destiló con agua y se liofilizó sin ninguna purificación adicional.

Rendimiento: cuantitativo. \overline{M}_{n} : 11600; \overline{P}_{m} : 28000

Espectro de RMN similar al obtenido para el producto del Ejemplo 36.

Ejemplo 39 Clorhidrato de N-terc-butiloxicarbonil cistamina (Cist-mBoc,*HCl)

Se añadió TEA (2,696 g, 26,65 mmol) a una solución en metanol seco (100 ml) de bis-clorhidrato de cistamina (2,00 g, 8,88 mmol) y la solución se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadió di-terc-butildicarbonato (1,941 g, 8,88 mmol) y la reacción se agitó durante 2,5 horas más, controlando el progreso de la reacción por CCF (eluyente: cloroformo/alcohol isopropílico 1:1, Rf producto: 0,25). El disolvente se evaporó después y se añadió una solución acuosa de KH_{2}PO_{4} 1 M (60 ml, pH = 4,2). La fase acuosa se extrajo con éter dietílico (50 ml) para retirar la N,N'-di-terc-butiloxicarbonil cistamina, después se llevó a pH 9 con NaOH 1 M y se extrajo con acetato de etilo (6 x 15 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron a sequedad. El residuo se disolvió en agua a pH 4 (HCl). La solución transparente obtenida se secó por congelación y la N-terc-butiloxicarbonil-cistamina se aisló en forma de clorhidrato (1,03 g, 40%).

^{1}H RMN (D_{2}O): 1,30 (s, 9H, Boc CH_{3}), 2,72 (t, 2H, CH_{2}-S), 2,83 (t, 2H, CH_{2}-S), 3,21-3,31 (m, 4H, NH_{3}+-CH_{2} y CONH-CH_{2}).

Ejemplo 40 Mono-metoxi PEG2000 terminado en mono-piperazina - (PEG2000-NH)

Con referencia al Esquema 10A, en un matraz de fondo redondo de dos bocas equipado con una barra agitadora, entrada de vacío/nitrógeno y un tapón de vidrio, se reblandeció mono-metoxi-PEG 2000 (5 mmol, 10 g) con calentamiento moderado, se purgó y se mantuvo en atmósfera de nitrógeno. Se añadió CHCl_{3} (50 ml) permitiendo que se disolviera el PEG y posteriormente se añadió CDI (15 mmol, 2,4 g) en pequeñas porciones. Después de 1 hora, el CDI sin reaccionar se inactivó por adición de agua (5 ml) y la fase orgánica se extrajo con salmuera (4 x 30 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro, se añadió piperazina (1,3 g, 15 mmol) y la solución se dejó en agitación durante 1 hora. La solución orgánica se extrajo con salmuera hasta que las aguas de lavado alcanzaron un pH neutro. Se secó posteriormente sobre sulfato sódico anhidro y el disolvente se evaporó a presión reducida. El producto aceitoso de color amarillo pálido bruto se mantuvo al vacío durante varios días hasta que se obtuvo una sustancia cerosa con rendimiento cuantitativo.

^{1}H RMN (D_{2}O): 2,71 (t, ancho, 4H, CH_{2}-NH-CH_{2}, piperazina), 3,30 (s, 3H, O-CH_{3}, extremo PEG), 3,38 (ancho, 4H, CH_{2}-N(CO)-CH_{2}, piperazina), 3,5-3,8 (m, ancho, 70 H, CH_{2}O-CH_{2}, cadena PEG), 4,17 (ancho, 2H, CO-O-CH_{2}, PEG).

Ejemplo 41 Mono-metoxi-PEG750 terminado en mono-piperazina (PEG750-NH)

Con referencia al Esquema 10A, se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 40, pero usando un mono-metoxi PEG con una longitud de cadena diferente en la misma cantidad molar (5 mmol, 3,27 g), siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto se aisló de la misma manera.

^{1}H RMN (D_{2}O): 2,71 (t, ancho, 4H, CH_{2}-NH-CH_{2}, piperazina), 3,30 (s, 3H, O-CH3, extremo PEG), 3,38 (ancho, 4H, CH_{2}-N(CO)-CH_{2}, piperazina), 3,5-3,8 (m, ancho, 70 H, CH_{2}O-CH_{2}, cadena PEG), 4,17 (ancho, 2H, CO-O-CH_{2}, PEG).

Ejemplo 42 PC03 (PC16-4-15)

Con referencia al Esquema 10C y el Esquema 11 y la Figura 9, para el compuesto PC16-4-15), "PC" significa "Polímero Complejante" y los números se refieren al número medio de unidades de repetición del extremo PEG, la parte que contiene SH y la parte de homo-MBA-DMEDA, respectivamente. Por lo tanto, para PC03, el polímero complejante tiene 16 unidades de repetición del extremo PEG, 4 unidades de repetición para la parte que contiene SH y 15 unidades de repetición para la parte homo-MBA-DMEDA.

En un matraz de dos bocas, MBA (0,308 g, 2,0 mmol), el producto obtenido en el Ejemplo 4 (0,460 g, 1,6 mmol) y TEA (0,160 g, 0,220 ml, 1,6 mmol) se disolvieron en etilenglicol (2 ml) bajo un flujo de nitrógeno. La reacción se controló por CCF (eluyente: cloroformo/alcohol isopropílico 1:1, Cist-mBoc Rf: 0,25). Una vez completada la reacción, se añadió el producto obtenido en el Ejemplo 41 (0,152 g, 0,2 mmol) diluido en etilenglicol (0,5 ml). Se permitió que la mezcla reaccionara durante 5 días. Finalmente se añadió el producto obtenido en el Ejemplo 37 (0,5 g, 0,2 mmol) diluido en etilenglicol (2 ml) y se permitió que la mezcla reaccionara durante 5 días. Una vez completada la reacción la mezcla se diluyó en agua (100 ml), se añadió una solución acuosa de HCl 1 M hasta que se alcanzó pH 4 y la solución final se dializó contra agua (5 x 1 l) en un tubo de diálisis con un corte nominal de 3.500. El producto purificado se liofilizó finalmente. Rendimiento: 52%.

^{1}H RMN (D_{2}O): 1, 41 (s, O-C-(CH_{3})_{3}, cist-m-Boc), 2,57 (s, N-CH_{3}, bloque-PAA), 2,61 (m, CO-CH_{2}-CH_{2}-N, bloque-PAA), 3,07 (s, N-CH_{2}-CH_{2}-N, bloque-PAA), 3,11 (m, CO-CH_{2}-CH_{2}-N, bloque-PAA), 3,67 (s, O-CH_{2}-CH_{2}-O, bloque-PEG), 4,57 (s, NH-CH_{2}-NH, bloque-PAA), 6,22 (d, CH=CH_{2}, extremo).

Las proporciones integrales entre los picos de RMN integrales son como se esperaban. Se calcula un rendimiento de reacción del 72% en base a la señal de referencia para el doble enlace sin reaccionar (6,22 ppm).

Ejemplo 43 PC04 (PC16-4-48)

Para PC04, el polímero complejante tenía 16 unidades de repetición del extremo PEG, 4 unidades de repetición para la parte que contiene SH y 48 unidades de repetición para la parte homo-MBA-DMEDA.

Con referencia a la Figura 9, se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 42, pero usando el producto obtenido en el Ejemplo 38 (1,0 g, 0,2 mmol) en lugar del producto obtenido en el Ejemplo 37, siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento: 54%. El espectro de RMN era similar al obtenido para el producto del Ejemplo 42. Las proporciones integrales entre los picos de RNM integrales son como se esperaba. Rendimiento de reacción del 70%.

Ejemplo 44 PC05 (PC45-4-15)

Por lo tanto, para PC05, el polímero complejante tiene 45 unidades de repetición del extremo PEG, 4 unidades de repetición para la parte que contiene SH y 15 unidades de repetición para la parte homo-MBA-DMEDA.

Con referencia a la Figura 9, se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 42, pero usando el producto obtenido en el Ejemplo 40 (0,4 g, 0,2 mmol) en lugar del producto obtenido en el Ejemplo 41, siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento: 53%. El espectro de RMN era similar al obtenido para el producto del Ejemplo 42. Las proporciones integrales entre los picos de RMN integrales son como se esperaba. Rendimiento de reacción del 68%.

Ejemplo 45 PC06 (PC45-4-48)

Por lo tanto, para PC03, el polímero complejante tiene 45 unidades de repetición del extremo PEG, 4 unidades de repetición para la parte que contiene SH y 48 unidades de repetición para la parte homo-MBA-DMEDA.

Con referencia a la Figura 9, se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 44, pero usando el producto obtenido en el Ejemplo 38 (1,0 g, 0,2 mmol) en lugar del producto obtenido en el Ejemplo 37, siendo las cantidades de los otros reactivos iguales. El producto se aisló de la misma manera. Rendimiento: 56%. El espectro de RMN era similar al obtenido para el producto del Ejemplo 42. Las proporciones integrales entre señales de RMN eran como se esperaba. Se calcula un rendimiento de reacción del 65% basándose en las integrales de pico referidas al doble enlace no reaccionado (6,22 ppm).

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Ejemplo 46 (XLP - 30 K, XLP-1 - 0 K, XLP - 5 K, XLP - 3 K, XLP - 1 K) (MBA-Pi25-110, MBA-Pi25-35, MBA-Pi25-20, MBA-Pi25-10, MBA-Pi25-4)

Con referencia al Esquema 12, para cada etiqueta: Pi25 se refiere al contenido molar de grupos Pi de las unidades de repetición, el segundo número se refiere al número medio de unidades de repetición en las cadenas polímero.

Polimerización de MBA con DMEDA y cistamina (30%) (HG-MBA30-q)

En un matraz de fondo redondo, equipado con un agitador magnético y entrada de nitrógeno, se disolvió MBA (100,2 g, 0,65 mol) en atmósfera inerte en agua destilada (200 ml). Se añadió bis-clorhidrato de cistamina (22,0 g, 0,0975 mol) con la cantidad estequiométrica de hidróxido de litio monohidrato (8,18 g, 0,195 mol). Cuando la disolución se hubo completado, se añadió DMEDA (40,1 g, 0,455 mol), se agitó durante media hora y se permitió que reaccionara sin agitar, protegido de la luz directa. Después de 120 horas se formó un gel transparente, de consistencia y aspecto similares a HG-MBA30-a obtenido del Ejemplo 11. El hidrogel se molió, se lavó con HCl 0,1 M y varias veces con agua destilada hasta que las aguas de lavado aparecieron neutras. El hidrogel se lavó después tres veces con acetona y se secó al vacío para obtener un polvo fino. Rendimiento 46,3 g, 92,7%.

Reducción y disolución de HG-MBA30-q con DTT (MBA30-SH-e)

En un matraz de fondo redondo, equipado con un agitador magnético y entrada de nitrógeno, se permitió que HG-MBA30-d (100 g, 0,049 mol de grupos cistamina) se hinchara en atmósfera inerte en agua destilada (500 ml). El pH se ajustó a 8,5 con NaOH y se añadió un exceso de tres veces de DTT (22,45 g, 0,15 mmol). Se permitió que la solución reaccionara durante 6 horas. Se diluyó con solución acuosa de HCl 1,0 M hasta pH 2, se ultrafiltró a través de una membrana con un corte nominal de 5.000 en agua desoxigenada y finalmente se liofilizó. El producto se aisló en forma de sal clorhidrato y se almacenó en atmósfera de nitrógeno. Rendimiento 71,8 g (71,8%). \overline{M}_{n} : 29000; \overline{P}_{m} : 56000.

Intercambio de disulfuro de tiol entre MBA30-SH-e y disulfuro de bipiridilo (MBA30-Pi-b)

En un matraz de fondo redondo, equipado con un agitador magnético y entrada de nitrógeno, se disolvió MBA30-SH (50 g, 0,043 mol de grupos funcionales tiol) en atmósfera inerte en tampón TRIS desoxigenado (100 ml, 0,1 M, pH 8,5). Se añadió disulfuro de bi-piridilo (10,4 g, 0,047 mol) a la solución agitada, que casi inmediatamente se hizo amarilla, debido a la presencia de 2-mercaptopiridina y se permitió que reaccionara durante 15 horas. Posteriormente la solución se diluyó con una solución acuosa de HCl 1,0 M hasta pH 3,0, se fraccionó por ultrafiltración a través de membranas con un corte de peso molecular 30.000; 10.000; 5.000; 3.000; 1.000. Cada fracción se liofilizó por separado.

^{1}H RMN (D_{2}O): 2,71 (m, CO-CH_{2}-CH_{2}-N), 2,77 (s, N-CH_{3}), 3,35 (m, CO-CH_{2}CH_{2}-N), 3,46 (s, N-CH_{2}-CH_{2}-N), 4,57 (s, NH-CH_{2}-NH), 7,27 (m, piridina, N-CH-CH), 7,67-7-77 (m, piridina, N-C-CH-CH), 8,38 (m, piridina, N-CH-CH).

XLP-30K: rendimiento: 4,3 g; XLP-10K: rendimiento: 3,6 g; XLP-5K: rendimiento: 10,2 g; XLP-3K: rendimiento: 4,7 g; XLP-1 K: rendimiento: 13,7 g.

Rendimiento total: 67%. Rendimiento de reacción: 83%.

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Ejemplo 47 Reducción de PC06 con DTT

La reducción de PEG-MBA/DMEDA16-Cis-PEG con DTT (PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG). En un matraz de fondo redondo, equipado con un agitador magnético y entrada de nitrógeno, se disolvió PEG-MBA/DMEDA16-Cis (250 mg, 0,013 mmol) en atmósfera inerte en agua destilada (10 ml). El pH se ajustó a 8,5 con NaOH y se añadió un exceso de DTT de diez veces (160 mg, 0,104 mmol). Se permitió que la solución reactiva reaccionara durante 1 hora. Se diluyó con solución acuosa de HCl 1,0 M hasta pH 2, se ultrafiltró a través de una membrana con un corte nominal de 5.000 usando agua desoxigenada y se liofilizó. El producto se aisló en forma de sal clorhidrato y se almacenó en atmósfera de nitrógeno.

Ejemplo 48 Fabricación de complejos

La interacción entre las poliamidoaminas y el ADN se ha caracterizado usando ADN de esperma de salmón bruto (ADNss) que se había limpiado y fraccionado para dar una preparación principalmente de moléculas de ADN monocatenario.

El ADNss (2,5 \mug) se mezcló a diferentes proporciones con polímeros para formar un complejo policatiónico de ADN (ADN: PAA, 1:1, 1,25:1, 1,5:1 y 2:1). La proporción se calcula como bases de ADN por monómero del polímero. También, la proporción de MBA/DMEDA25-Pi a PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG ha variado (es decir, 2:1 y 3:1).

Adicionalmente, también se investigó el orden de adición de los reactivos. Se usaron los tres procedimientos diferentes mostrados a continuación en los que varió el orden de adición de los componentes:

(1): se añade MBA/DMEDA25-Pi (pequeño volumen, 20 \mul) al ADN (2,5 \mug en 50 \mul), después se añade PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG para formar el complejo;

(2): se añade MBA/DMEDA25-Pi (gran volumen, 30 \mul) al ADN (2,5 \mug en 50 \mul), después se añade PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG parar formar el complejo; y

(3): se añade MBA/DMEDA25-Pi (gran volumen, 30 \mul) a PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG (20 \mul), después se añaden los polímeros al ADN (2,5 \mug en 50 \mul).

Los tamaños de las partículas de soporte que comprendían PAA y ADN, en diversas condiciones (es decir, qué procedimiento de preparación se usó y qué proporción se usó) se han evaluado usando Dispersión de Luz Dinámica (DLS), y los resultados se muestran en las Figuras 3 y 4.

Usando el 3^{er} procedimiento, todos los tamaños de partícula son comparables, mientras que se observa alguna variación para el 1^{er} procedimiento a bajas proporciones PAA:ADN. El tamaño, empleando el 2º procedimiento usando una proporción de MBA/DMEDA25-Pi a PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG 2:1 y una proporción PAA:ADN 1:1, es menor que el de la formulación 3:1. Los tamaños de partícula pequeños pueden obtenerse usando una formulación reticulada y están en un intervalo adecuado para aplicaciones biomédicas o medioambientales.

Las imágenes de Microscopía Electrónica de Transmisión representativas (TEM) de los complejos producidas con una proporción de MBA/DMEDA25-Pi a PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG 2:1 y una proporción PAA:ADN 1,25:1 y con una proporción MBA/DMEDA25-Pi a PEG- MBA/DMEDA16-SH-PEG 3:1 y una proporción PAA:ADN 1,25:1 se muestran en la Figura 5. Se formaron partículas con forma toroidal que tenían un tamaño de 35 nm y 20 nm, respectivamente.

Procedimiento TEM: se puso una gota de cada muestra en rejillas de cobre revestidas con resina Pioloform (Taab Laboratory Equipment, Reading, RU) y un exceso de líquido se transfirió usando papel de filtro. Después de secar el aire, las rejillas se hicieron flotar sobre una gota de solución de tinción de acetato de uranilo (4% p/v en EtOH/H_{2}O v/v 50/50) durante 15 minutos, después de lo cual se lavaron una vez en EtOH v/v al 50% y dos veces en agua purificada, seguido de secado al aire. Las rejillas se analizaron usando un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1010 (Jeol, Welwyn Garden City, RU) que funcionaba a una tensión de 80 kV. Se tomaron microfotografías a diversos aumentos con una cámara digital Kodak Megaplus 1.6i usando el paquete de programas Analysis 3.0.

Ejemplo 49 Comportamiento de los complejos en presencia de sulfato sódico

Se investigó la estabilidad de los complejos en diferentes concentraciones de sal. Los complejos se prepararon como se ha descrito anteriormente, usando el 3^{er} procedimiento. Después se añadieron agua, sulfato sódico 1 mM o sulfato sódico 10 mM a los complejos y los tamaños se midieron usando DLS. Como se observa en las Figuras 5 y 6 los complejos preparados usando una proporción de MBA/DMEDA25-Pi a PEG-MBA/DMEDA16-SH-PEG 2:1 son más estables (tamaños de partícula más pequeños) a sulfato sódico que la formulación 3:1.

Ejemplo 50 Formulaciones reticuladas

Las formulaciones reticuladas se compararon con su estado no reticulado. Los complejos se pusieron encima de una ultrafiltradora centrífuga (peso de corte: 100 kDa, Microcon YM-100, Amicon, Fischer Scientific, Loughborough, RU) y se centrifugaron a 1000 g durante 30 min. Se tomaron imágenes TEM del filtrado y de lo que quedaba en el filtro.

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La Figura 8 muestra más complejos en el filtro para la formulación reticulada (fotografías superiores) comparado con el sistema no reticulado (fotografías inferiores), y atravesó menos por el filtro para la formulación reticulada (superior) comparado con la no reticulada (inferior). Esta es la prueba de que tuvo lugar la reticulación física.

Claims

1. Una composición que comprende un polímero de poliamidoamina (PAA) que comprende un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición comprende un polímero de poliamidoamina (PAA) lineal que comprende un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado.

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la composición está adaptada para formar reticulaciones entre los restos colgantes disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la composición reticulada es reducible, de manera que tras la reducción de la composición reticulada, las reticulaciones entre las cadenas de polímero se rompen.

5. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polímero de PAA contiene grupos repetidos X e Y representados por la fórmula general I:

(Fórmula I)\{-[X]-[Y]-\}_{n}

en la que,

n es entre 5 y 500;

-[-L^{1}-CO-NR^{1}-L_{2}-NR_{2}-CO-L^{3}-]-

en la que

L^{2} representa una cadena de alquileno opcionalmente sustituida, y

-[-NR^{3}-]- \hskip0.3cm o \hskip0.3cm -[NR^{4}-L^{4}-NR^{5}-] -

en la que

R^{3}, R^{4} y R^{5} representan grupos alquilo opcionalmente sustituidos, y

L^{4} representa un grupo alquileno opcionalmente sustituido;

o R^{4}, R^{5} y L^{4}, junto con los átomos de nitrógeno a los que están unidos, forman un anillo opcionalmente sustituido,

con la condición de que al menos alguno de R^{3}, R^{4} y R^{5} contenga grupos disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado.

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6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que R^{1} y R^{2} son hidrógeno.

7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que R^{1} y/o R^{2} representa un grupo alquilo opcionalmente sustituido que contiene una cadena C_{1}-C_{20}.

8. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que R^{3}, R^{4} y R^{5} representan grupos alquilo opcionalmente sustituidos que contienen una cadena C_{1}-C_{20}.

9. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que L^{2} y L^{4} representan cadenas de alquileno opcionalmente sustituido que contienen 1-10 átomos de carbono.

10. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en la que cualquiera de L^{1}, L^{2}, L^{3} y L^{4} están sustituidos, seleccionándose los sustituyentes entre alquilo, alcoxi, acilo, acilamino, carboxi, ciano, halo, hidroxi, nitro, trifluorometilo y amino.

11. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en la que al menos alguno de R^{3}, R^{4} y R^{5} están sustituidos con grupos seleccionados entre sulfhidrilo, sulfhidrilo activado y -S-S-R^{6}, en la que R^{6} representa alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre alquilo, alcoxi, acilo, acilamino, carboxi, ciano, halo, hidroxi, nitro, trifluorometilo y amino.

12. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en la que en la Fórmula I, n es entre 20 y 100.

13. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en la que el peso molecular del polímero de PAA está entre 1500 Da y 120.000 Da.

14. Un procedimiento para preparar un polímero de poliamidoamina (PAA) que comprende un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo, o sulfhidrilo activado, comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar un compuesto de bisacriloílo con una amina primaria y/o una di-amina secundaria, una o ambas de las cuales contiene un grupo disulfuro.

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el compuesto de bisacriloílo usado el procedimiento tiene la fórmula II:

(Fórmula II)-CH_{2}=CH-CO-NR^{1}-L^{2}-NR^{2}-CO-CH=CH_{2}

en la que R^{1}, R^{2}, y L^{2} son como se han definido respecto a la Fórmula I.

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16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que R^{1} y R^{2} son hidrógeno.

17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que L^{2} es un grupo CH_{2}.

18. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que el compuesto de bisacriloílo es bisacrilamida de metileno (MBA).

19. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que cuando se usa una amina primaria que contiene un disulfuro, la amina primaria que contiene un grupo disulfuro tiene la fórmula III:

(Fórmula III)NH_{2}-R^{3}

en la que R^{3} es como se ha definido en la Fórmula I.

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20. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que R^{3} representa un grupo alquilo sustituido con -S-S-R^{6}, en la que R^{6} es como en la reivindicación 11.

21. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, en el que la amina primaria que contiene un grupo de disulfuro es cistamina, que puede estar no protegida.

22. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, en el que la amina primaria es cistamina, uno de cuyos grupos amina lleva un grupo protector.

23. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 14 a 22, en el que cuando se usa una di-amina secundaria que contiene un disulfuro, la di-amina secundaria tiene la Fórmula IV:

(Fórmula IV)H-NR^{4}-L^{4}-NR^{5}-H

en la que R^{4}, R^{5} y L^{4} son como se han definido respecto a la Fórmula I.

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24. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, en el que R^{4} o R^{5} representan un grupo alquilo sustituido con -S-S-R^{6}, en la que R^{6} y es como se ha definido en la reivindicación 11.

25. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 24, en el que el procedimiento implica el uso de moléculas de amina que no contienen ningún grupo disulfuro.

26. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 25, en el que la di-amina secundaria tiene la Fórmula V:

(Fórmula V)CH_{3}-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CH_{3}

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27. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 26, en el que la di-amina secundaria es dimetiletilendiamina (DMEDA), como se muestra en los Esquemas 1 y 4, o 2-metil-piperazina, como se muestra en los Esquemas 2 y 3.

28. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 27, comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar un compuesto de bisacriloílo de Fórmula II, con una amina primaria que contiene un grupo de disulfuro de Fórmula III, con una di-amina secundaria de Fórmula V.

29. Un hidrogel que comprende una pluralidad de cadenas de polímero de poliamidoamina (PAA) que están reticuladas mediante grupos de unión que contienen enlaces disulfuro reducibles.

30. Un hidrogel de acuerdo con la reivindicación 29 que comprende la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o que se prepara usando el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 28.

31. Un hidrogel de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 29 o la reivindicación 30, en el que el hidrogel reticulado es reducible, en el que las reticulaciones entre las cadenas de polímero de PAA se rompen cuando se reduce el hidrogel.

32. Un hidrogel de acuerdo con la reivindicación 31, en el que el hidrogel de PAA reticulado es reducible después de entrar en contacto con un agente reductor, por ejemplo, ditiotreitol (DTT), metabisulfito sódico o glutatión.

33. Un procedimiento para preparar un hidrogel que comprende una pluralidad de cadenas de polímero de poliamidoamina (PAA) que están reticuladas mediante grupos de unión que contienen enlaces disulfuro reducibles, comprendiendo el procedimiento: (i) hacer reaccionar un compuesto de bisacriloílo con una amina primaria y/o una di-amina secundaria, una o ambas de las cuales contiene un grupo disulfuro, para formar cadenas de polímero de PAA y (ii) permitir que se formen enlaces disulfuro reducibles entre las cadenas de polímero de PAA.

34. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o un hidrogel de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, comprendiendo la composición o hidrogel un co-polímero de poliamidoamina (PAA) que comprende un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo, o sulfhidrilo activado y PEG.

35. Un procedimiento para preparar una composición que comprende un co-polímero de polietilenglicol (PEG) y poliamidoamina (PAA), que comprende un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo, o sulfhidrilo activado, que puede estar reticulado o no, comprendiendo el procedimiento poner en contacto monómeros de poliamidoamina (PAA) que comprenden un resto colgante disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado con PEG terminado en amina; y permitir que se forme el co-polímero correspondiente.

36. Una composición de suministro para suministrar una molécula con carga útil, comprendiendo la composición de suministro una molécula con carga útil combinada con la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o un hidrogel de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32.

37. Un procedimiento para preparar la composición de suministro de acuerdo con la reivindicación 36, comprendiendo el procedimiento poner en contacto una molécula con carga útil con la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o un hidrogel de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 y exponer la mezcla a condiciones tales que la molécula con carga útil se combina con la composición o hidrogel, formando de esta manera una composición de suministro con carga útil de acuerdo con la reivindicación 36.

38. Una partícula de soporte adaptada durante su uso para llevar una molécula con carga útil a un sitio diana, comprendiendo la partícula de soporte la composición de acuerdo con la reivindicación 36, en la que la molécula con carga útil es capaz de ser activa cuando la partícula es al menos adyacente al sitio diana.

39. Una partícula de soporte de acuerdo con la reivindicación 38, en la que la molécula con carga útil comprende un compuesto o biomolécula biológicamente activo.

40. Una partícula de soporte de acuerdo con la reivindicación 38 o la reivindicación 39, en la que la molécula con carga útil comprende una célula entera, parte de una célula, un virus, fago, un microorganismo, un orgánulo, una partícula de virus, etc., un aminoácido, péptido, proteína, enzima, anticuerpo o un polisacárido.

41. Una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40, en la que la molécula con carga útil comprende un ácido nucleico o un derivado del mismo.

42. Una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 41, en la que la molécula con carga útil comprende ADN o ADNc o ARN (por ejemplo, ARNm, ARNsi o ARNt).

43. Una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 42, en la que la partícula de soporte está en un intervalo de tamaño de 10 nm a 500 nm.

44. Una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 43, en la que la partícula de soporte comprende poliamidoamina (PAA) PEGilada y no PEGilada.

45. Una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 44, en la que la composición basada en PAA comprende un co-polímero de PEG-PAA-PEG o PEG-PAA, y un homopolímero de PAA, conteniendo ambos grupos sulfhidrilo colgantes.

46. Una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 45, en la que la proporción de PEG:PAA total es entre 1:4 y 1:17, preferentemente entre las proporciones de 1:9 a 1:12.

47. Una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 46, en la que la proporción de PAA:ácido nucleico (AN) es entre 0,5:1 y 2,0:1, preferentemente entre 1:1 y 1,5:1.

48. Una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 47, en la que el número de restos colgantes disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado del componente PEG-PAA es como mínimo seis, preferentemente ocho, y en la que la cantidad de restos colgantes disulfuro, sulfhidrilo o sulfhidrilo activado en el componente PAA es entre 0,5 y 2 veces la del componente PEG-PAA, preferentemente entre 1 y 1,5 veces la del componente PEG-PAA.

49. Una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 48, preparándose la partícula de soporte haciendo reaccionar PAA PEGilada con PAA no PEGilada, seguido de contacto de la composición resultante con ácido nucleico.

50. Un sistema de seguimiento de fluido para seguir el flujo de fluido, comprendiendo el sistema una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 49, y un medio de detección para detectar la molécula con carga útil.

51. Un procedimiento de seguimiento de fluido, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(i) aplicar una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 49 que comprende una molécula con carga útil detectable a un fluido, en una primera localización; y

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52. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 51, comprendiendo el procedimiento una etapa de aislar la partícula del fluido en la segunda localización antes de la detección de la molécula con carga útil con el medio de detección.

53. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 51 o la reivindicación 52, en el que el procedimiento comprende una etapa de aislar la molécula con carga útil de la partícula de soporte antes de la detección.

54. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 53, en el que la etapa de aislamiento comprende reducir la partícula de soporte para liberar la molécula con carga útil antes de la detección.

55. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 54, en el que la molécula con carga útil comprende ácido nucleico, tal como ADN, que puede detectarse usando un medio de detección adecuado, por ejemplo, PCR.

56. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55, en el que la molécula con carga útil comprende un oligonucleótido monocatenario.

57. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 56, en el que la molécula con carga útil comprende un compuesto de soporte, que puede ser ADN de soporte.

58. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 57, en el que el ADN de soporte se degrada para dar una preparación principalmente de moléculas de ADN monocatenario de secuencia mixta con aproximadamente el mismo tamaño que el ácido nucleico de detección.

59. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o de las reivindicaciones 34 ó 36, o un hidrogel de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, o una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 49, para su uso como un medicamento.

60. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o de las reivindicaciones 34 ó 36, o un hidrogel de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, o una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 49, para su uso en el tratamiento de una afección médica caracterizada por pérdida o lesión tisular.

61. Una composición de acuerdo con la reivindicación 60, en la que la afección caracterizada por pérdida o lesión tisular incluye el tratamiento de heridas y daños relacionados, trastornos degenerativos tisulares y pérdida de la función tisular.

62. Una composición de acuerdo con la reivindicación 61, en la que los trastornos degenerativos tisulares que pueden tratarse incluyen trastornos neurodegenerativos del disco intervertebral, degeneración de cartílago o hueso tal como osteoartritis, osteoporosis, trastornos degenerativos del hígado, trastornos degenerativos del riñón, atrofia muscular, lesión o pérdida de nervios.

63. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o de las reivindicaciones 34 ó 36, o un hidrogel de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, o una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 49 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección médica caracterizada por pérdida o lesión tisular.

64. Un medio de soporte celular que comprende la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o de las reivindicaciones 34 ó 36, o un hidrogel de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, y al menos una célula.

65. Un procedimiento para preparar un medio de soporte celular de acuerdo con la reivindicación 63, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(i) poner en contacto la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o de las reivindicaciones 34 ó 36, o un hidrogel de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 con al menos una célula; y

(ii) exponer el hidrogel o composición a condiciones tales que la al menos una célula esté soportada sobre el mismo o en su interior, formando de esta manera un medio de soporte celular.

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66. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o de las reivindicaciones 34 ó 36, o un hidrogel de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, o una partícula de soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 49; y un excipiente farmacéuticamente aceptable.