ES2342588B2 - Sistemas nanoparticulares elaborados a base de polimeros anionicos. - Google Patents
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Abstract
Sistemas nanoparticulares elaborados a base de
polímeros aniónicos.
La presente invención se refiere a un sistema
para la administración de ingredientes activos, que comprende
nanopartículas con un tamaño medio inferior a 1 micrómetro, que
comprenden a su vez: (a) al menos un polímero aniónico; (b) un
agente reticulante catiónico; y opcionalmente (c) un polímero
catiónico; caracterizado porque las nanopartículas se encuentran
entrecruzadas mediante interacciones de tipo electrostático.
Adicionalmente, la invención se refiere a composiciones
farmacéuticas, cosméticas, de higiene personal y nutricionales que
comprenden dicho sistema de nanopartículas, así como a
procedimientos para su preparación y usos del mismo.
Description
Sistemas nanoparticulares elaborados a base de
polímeros aniónicos.
La presente invención se refiere al desarrollo
de sistemas nanoparticulares útiles en la administración de
ingredientes activos. Más específicamente, la invención se refiere a
sistemas nanoparticulares que comprenden un polímero o una mezcla de
polímeros dotados de carga eléctrica negativa y una molécula o
mezcla de moléculas de bajo peso molecular de carga positiva capaces
de actuar como reticulantes iónicos de los polímeros anteriores sin
establecer enlaces químicos con los mismos. Adicionalmente, la
invención se refiere a composiciones farmacéuticas, cosméticas y
nutricionales que los comprenden, así como a procedimientos para su
preparación.
\vskip1.000000\baselineskip
La nanotecnología en general y, más
concretamente, los sistemas nanoparticulares, presentan un enorme
potencial claramente reconocido en numerosos campos (UNESCO, The
ethics and politics of nanotechnology, División of Ethics of Science
and Technology, UNESCO Ed., París, 2006), habiendo despertado un
gran interés sobre todo en el campo biomédico (U.S. Food and Drug
Administration. Nanotechnology, A Report of the U.S. Food and Drug
Administration Nanotechnology Task Forcé, FDA Ed., Rockville, MD,
July 2007), (OMS, Initiative for Vaccine Research of the Department
of Immunization, Vaccines and Biologicals, WHO/IVB/06.03, WHO
Ed., Geneva, Switzerland, April 2006). A pesar de lo
anteriormente mencionado, los sistemas nanoparticulares
desarrollados hasta la fecha no han dado respuesta a las
expectativas inicialmente depositadas en ellos. En consecuencia, la
idea general es que es necesario el desarrollo de nuevos sistemas
capaces de alcanzar el reto que supone el adecuado aprovechamiento
de su reconocido potencial (M. Friede and M.T. Aguado, Advanced
Drug Delivery Reviews, 57, 2005, 325-31); (T.G.
Park, J.H. Jeong, S.W. Kim, Advanced Drug Delivery Reviews,
58, 2006, 467-486).
Las causas de las limitaciones anteriormente
expuestas son diversas. Considerando el caso concreto de las
nanopartículas a base de quitosano, polímero citado ampliamente en
la literatura como indispensable para la formación de las mismas por
reticulación iónica, recientemente se ha hecho alusión a la ausencia
de valor añadido de este tipo de sistemas en comparación con
formulaciones más sencillas. Concretamente, los resultados que
presentan algunos trabajos cuestionan la pretendida versatilidad y
potencial de las nanopartículas de quitosano, al no encontrar
diferencias significativas en su comparación con simples
disoluciones de la molécula bioactiva y dicho polímero (A. M. Dyer,
M. Hinchcliffe, P. Watts, J. Castile, I.
Jabbal-Gill, R. Nankervis, A. Smith, and L. Illum,
Pharm. Res., 19, 2002, 998-1008). Por otro
lado, recientemente se ha señalado la citotoxicidad asociada a
dichas nanopartículas de quitosano, que se ha relacionado
directamente con la carga eléctrica superficial de estos sistemas
(B. Loretz and A. Bernkop-Schnürch,
Nanotoxicology, 1, 2007, 139-148). Este tipo
de resultados de toxicidad preocupan especialmente a agencias
regulatorias como la FDA, la cual cree importante no perder de vista
aspectos como la importante carga positiva asociada a algunos
sistemas nanoparticulares (U.S. Food and Drug Administration.
Nanotechnology, A Report of the U.S. Food and Drug Administration
Nanotechnology Task Forcé, FDA Ed., Rockville, MD, July 2007). Es
obvio, no obstante, que las ventajas o limitaciones de un sistema
nanoparticular no se derivan exclusivamente de una única
característica como su carga superficial, sino más bien de un
conjunto de características entre las que, además de la carga
superficial, también hay que tener en cuenta la propia naturaleza de
los componentes empleados en la elaboración de dichas
nanopartículas. Como ejemplo ilustrativo podemos recordar que el
carácter mucoadhesivo y la capacidad de interacción con las
superficies mucosas de nanopartículas elaboradas a base de un
polímero como el quitosano, han sido exclusivamente relacionados con
la naturaleza catiónica de este polímero y la carga superficial
positiva de los sistemas que se basan en su empleo. No obstante, la
carga superficial no se puede considerar el único factor responsable
de tal comportamiento o propiedades, habida cuenta de que no se
observan en igual medida cuando se emplean otros polímeros también
catiónicos. De hecho, en un estudio previo se ha podido demostrar
cómo sistemas nanoparticulares recubiertos con polímeros catiónicos
como la polilisina y el quitosano presentan comportamientos
drásticamente diferentes tras su administración in vivo, pese
a poseer carga neta superficial similar (Calvo P,
Vila-Jato JL and Alonso MJ; Int J Pharm.,
153, 1997, 41-50). Por tanto, parece lógico pensar
que la propia naturaleza de los componentes de este tipo de sistemas
nanoparticulares, junto con sus características
físico-químicas, son determinantes de su
comportamiento y, en consecuencia, de su potencial, tal y como ha
sido recientemente indicado (Moreau et al., Journal of
Drug Targeting, 10, 2002,161-173).
Consideraciones como las anteriormente expuestas
han llevado recientemente a sugerir el interés de investigar la
aplicación de nanotecnologías a nuevos materiales y desarrollar, de
este modo, nuevos sistemas nanoparticulares (U.S. Food and Drug
Administration, FDA Consumer magazine, FDA Ed.,
November-December 2005 Issue, 2005). Este interés se
hace más patente en el caso de nanosistemas destinados a
administración sistémica, donde los problemas de toxicidad y/o
efectos adversos o no deseados asociados a la carga superficial o
las características propias de los materiales empleados hasta ahora
en su desarrollo, cobran especial importancia. De hecho, aunque un
sistema con carga neta positiva pueda resultar de gran interés como
vehículo de administración tópica, esa carga positiva también puede
suponer un problema cuando se administra por vía sistémica ya que,
sin duda, dará lugar a hemoaglutinación y otros efectos adversos
relacionados con su interacción con componentes naturales del
organismo (Kainthan et al., Biomaterials 27, 2006,
5377-5390). Posiblemente por ello, diversos expertos
en el campo de la terapia génica han llegado incluso a predecir que
el desarrollo de nuevos vehículos es un campo de trabajo que se
prolongará durante los próximos 35 años (N. Blow, Nature,
450, 2007, 1117-1120), haciendo especial mención de
las limitaciones a las que se ha hecho alusión para el desarrollo de
vehículos de administración sistémica.
Hasta el momento, se han empleado varios
materiales para formular sistemas nanoparticulados, muchos de los
cuales han sido capaces de actuar como vehículos de administración
de fármacos o material genético. No obstante, aunque en muchos casos
se habla de sistemas de nanopartículas, es necesario tener presente
que bajo tal denominación se pueden englobar dos tipos de sistemas
claramente diferentes en cuanto a técnica de elaboración,
estructura, capacidad de asociación y liberación de moléculas,
versatilidad y potencial. Estos sistemas, claramente diferenciados
en la bibliografía (J.K. Vasir and V. Labhasetwar, Expert Opinión
on Drug Delivery, 3, 2006, 325-344) (Q. Gana, T.
Wang, C. Cochrane, P. McCarron, Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces 44, 2005, 65-73), son los
siguientes:
- Complejos nanoparticulares establecidos entre
materiales cargados positivamente y una molécula bioactiva con carga
neta negativa, como un derivado de ácido nucleico. Por ejemplo, la
elevada densidad de grupos amino presentes en el esqueleto del
quitosano permite la complejación de plásmidos ADN, de carga
negativa, dando lugar a la formación de forma espontánea pero no
controlada de complejos auto-ensamblados entre ambos
componentes. Estos complejos se obtienen sin poder controlar
propiedades tan importantes como el tamaño o la carga superficial de
los mismos, ya que la formación de este tipo de partículas se debe
al mero tropismo que se establece entre dos moléculas de carga
opuesta. De hecho, sin la concurrencia de la molécula bioactiva de
carga neta negativa no sería posible obtener tales nanosistemas. Por
consiguiente, no es posible desarrollar nanopartículas de este tipo
blancas o sin cargar con dicha molécula.
- Nanopartículas elaboradas a base de polímeros
reticulados. La reticulación es un proceso controlado que permite la
obtención de nanopartículas de tamaño y carga superficial
predeterminadas, homogéneas, ajustables y reproducibles. El proceso
de reticulación puede ser de tipo químico o iónico. El primero de
dichos procesos se basa en la formación de enlaces covalentes
estabilizantes debido al empleo de agentes del grupo de los
aldehidos, que se caracterizan por su toxicidad y por no ser
aceptados para su empleo en humanos. Además, este tipo de agentes
pueden dar lugar también a la reticulación e inactivación de la
propia molécula bioactiva que se pretende asociar al sistema, sobre
todo si se trata de moléculas con grupos amino, como en el caso de
péptidos y proteínas. Todos estos problemas de los aldehidos y
agentes reticulantes químicos se encuentran descritos en la
literatura.
\vskip1.000000\baselineskip
Por el contrario, la técnica de reticulación
iónica, también denominada de gelificación iónica o ionotrópica, se
caracteriza por su suavidad y por ser reversible. De modo
tradicional esta técnica se ha desarrollado entre una macromolécula
catiónica y un polianión, dando lugar a la formación de sistemas
que, a diferencia de los complejos, se caracterizan por ser
estructuras matriciales en las que la molécula bioactiva asociada se
encuentra total o parcialmente atrapada en el seno de la matriz
polimérica constitutiva de las mismas y generada en el proceso de
entrecruzamiento ionotrópico. Esta matriz polimérica se obtiene como
resultado de uniones iónicas inter- e
intra-moleculares entre el polianión y la
macromolécula catiónica, que gelifica espontáneamente bajo forma
nanoparticular. Este mecanismo de formación aporta, como valor
añadido con respecto a los complejos, una protección de la molécula
bioactiva frente al medio externo que no pueden aportar en igual
medida aquellos. Consecuentemente, estamos ante una técnica rápida,
económica, fácilmente reproducible y escalable y que requiere de una
tecnología muy simple, aspectos todos ellos de indudable interés
para la industria.
La técnica de reticulación iónica ha sido
descrita para la formación de nanopartículas de quitosano, molécula
catiónica que se retícula con el polianión tripolifosfato. No
obstante, las limitaciones anteriormente señaladas para este tipo de
sistemas que incluyen en su composición quitosano han llevado a
diversos autores a desarrollar sistemas en los que se combinan con
quitosano diferentes macromoléculas aniónicas, como por ejemplo
ácido hialurónico, pero que siempre han requerido de la presencia de
quitosano para su formación.
Otros materiales que también han sido utilizados
en el estado de la técnica para la obtención de sistemas de
nanopartículas comprenden dextranos, carragenina y poliarginina.
Así, los documentos WO2005021044 y US20077155658
describen sistemas menores de 200 nm que necesitan en una primera
fase el empleo de carbohidratos capaces de complejar el material
genético a asociar y, posteriormente, la adición de
poliarginina.
Los documentos US 6,565,873 y US 7,053,034
describen nanopartículas para cuya formación se requiere la
utilización de materiales grasos.
Los documentos US 2005/0266090 A1 y US
2005/0008572 A1 describen la formación de sistemas
núcleo-cubierta ("core-shell",
"Core-coat" o bien
"onion-like"), constituidos por dos partes
diferenciadas: un núcleo polimérico y una corona polimérica de
diferente composición rodeando a dicho núcleo. Dichas estructuras
son el resultado de aplicar una técnica en la que los polímeros
constitutivos son añadidos de forma secuencial y en la que es
preciso emplear, entre otras, etapas de atomización de las
soluciones (Propok et al., 2001; Prokop et al.,
2002).
Por otra parte, las técnicas utilizadas para la
formación de nanopartículas y sistemas nanoparticulados son en
general complejas y requieren composiciones determinadas que
repercuten en las propiedades y características de los mismos. El
documento WO 2001/9620698 A1 describe nanopartículas obtenidas por
una metodología de emulsificación que hace necesario el empleo de
disolventes orgánicos. El empleo de dichos disolventes entraña una
serie de riesgos perfectamente conocidos por las industrias por dar
lugar a especial preocupación por parte de las agencias
regulatorias.
Las nanopartículas descritas en el documento US
2005/0008572 A1 y que contienen un tipo de dextranos (dextranos
polialdehído) necesitan, para su formación, el establecimiento de un
enlace covalente con dicho componente para que se formen las mismas,
llevando finalmente a la formación de una entidad química
distinta.
El documento US 6,383,478 B1 se refiere a
nanopartículas para cuya elaboración es necesaria la obligada
incorporación de, por lo menos, dos polianiones, además de uno o más
cationes pequeños. En definitiva, se trata de sistemas con un
significativo grado de complejidad en cuanto a su composición.
El documento US 7,045,356 describe
nanopartículas multicapa para cuya formación es necesario establecer
unas condiciones tales que permitan la formación de enlaces
intermoleculares entre los polímeros.
El documento US 6,916,490 trata de sistemas
coacervados microparticulares que para su formación requieren
reticulación química entre los polímeros.
Los documentos US 6,919,091 y 7,098,032
describen sistemas de nanopartículas menores de 100 nanómetros para
cuya formación es preciso desarrollar tres etapas: (1º) complejación
del material genético a asociar; (2º) complejación con un segundo
polímero; (3º) reticulación iónica final para garantizar la
integridad del sistema.
Los documentos US 6,475,995 y 7,344,887
describen nanoestructuras producidas por electrodeposición o por
coacervación siendo los policationes sugeridos gelatina o
quitosano.
A la vista de los documentos del estado de la
técnica y de los inconvenientes que presentan los actuales sistemas
nanoparticulados en cuanto a composición, toxicidad y procedimiento
de obtención, existe, por tanto, la necesidad de desarrollar
sistemas nanoparticulados partiendo de materiales y reactivos
biocompatibles de baja toxicidad que proporcione un alto control en
las propiedades físico-químicas de las
nanopartículas y que puedan ser obtenidos mediante procedimientos
sencillos y eficaces.
Los autores de la presente invención han
encontrado que un sistema nanoparticulado de fácil obtención
mediante un procedimiento de gelificación iónica, en donde las
nanopartículas comprenden un polímero aniónico entrecruzado en
presencia de un agente reticulante catiónico, permite una eficaz
asociación de moléculas activas y la consiguiente liberación en el
medio adecuado. Dichas nanopartículas presentan la característica
adicional de no presentar toxicidad y ser estables en medios
biológicos evitando además la degradación de las moléculas activas
que llevan incorporadas.
Así, en un primer aspecto la invención se dirige
a un sistema para la administración de moléculas biológicamente
activas que comprende nanopartículas con un tamaño medio inferior a
1 micrómetro, que comprenden:
- a)
- al menos un polímero aniónico;
- b)
- un agente reticulante catiónico; y opcionalmente
- c)
- un polímero catiónico;
caracterizado porque las nanopartículas se
encuentran entrecruzadas mediante interacciones de tipo
electrostático.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende un sistema como se ha
definido anteriormente.
En un aspecto adicional, la invención hace
referencia a una composición cosmética que comprende un sistema como
se ha definido previamente.
En otro aspecto, la invención se dirige a una
composición nutricional que comprende un sistema como se ha definido
previamente.
En otro aspecto, la invención se dirige a una
composición destinada a diagnóstico que comprende un sistema como se
ha definido previamente.
En otro aspecto, la invención se dirige a un
procedimiento para la preparación de un sistema como se ha definido
anteriormente que comprende:
- a)
- preparar una solución acuosa de al menos un polímero aniónico;
- b)
- preparar una solución acuosa de un agente reticulante catiónico y, opcionalmente adicionar a ésta un polímero catiónico;
- c)
- mezclar bajo agitación las soluciones obtenidas en a) y b) con formación espontánea de las nanopartículas.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización particular, el polímero
catiónico opcional se adiciona a las nanopartículas una vez
formadas.
La invención hace referencia asimismo al uso de
un sistema como se ha definido anteriormente en la preparación de un
medicamento. En una realización particular, dicho medicamento es
para aplicación en terapia génica, silenciamiento o interferencia
genética o vacunación genética.
En un aspecto adicional, la invención hace
referencia al uso de un sistema como se ha definido anteriormente
para manipular o alterar las características biológicas de células
vivas tanto autólogas, como alogénicas, xenogénicas o de cultivos
celulares y posteriormente emplear dichas células o grupos celulares
para obtener un efecto terapéutico, diagnóstico, preventivo o con
fines regenerativos, o para modificar la producción de compuestos
por dichas células.
En otro aspecto adicional, la invención se
dirige al uso de un sistema como se ha definido anteriormente para
modificar, corregir o introducir propiedades organolépticas o
mejorar la estabilidad en un medicamento o en un producto
cosmético.
Un último aspecto de la invención se refiere al
uso de un sistema como se ha definido anteriormente para
acondicionar, modificar o restablecer las características de agua,
alimentos o suplementos nutricionales, así como para modificar,
corregir o introducir nuevas propiedades organolépticas o mejorar la
estabilidad de los mismos y para facilitar o hacer posible la
administración de alimentos o nutrientes a seres vivos.
Figura 1. Imágenes de TEM de sistemas
nanoparticulares elaboradas a base de ácido hialurónico asociando
RNA de interferencia siGAPDH.
La presente invención se dirige a la elaboración
de sistemas nanoparticulares para la administración de, entre otras,
moléculas biológicamente activas, que comprende nanopartículas con
un tamaño medio inferior a 1 micrómetro, donde dichas nanopartículas
comprenden al menos un polímero aniónico; un agente reticulante
catiónico; y opcionalmente un polímero catiónico; y caracterizado
porque las nanopartículas se encuentran entrecruzadas mediante
interacciones de tipo electrostático.
En la presente invención, por el término
"nanopartículas" se hace referencia a estructuras estables y de
características homogéneas, reproducibles y modulables perfectamente
diferenciables de sistemas autoensamblados, que se forman como
consecuencia de un proceso controlado de entrecruzamiento
ionotrópico del polímero aniónico constitutivo de las mismas mediado
por agentes reticulantes catiónicos. La interacción electrostática
que resulta entre los diferentes componentes de las nanopartículas
en el proceso de reticulación genera entidades físicas
características, que son independientes y observables, cuyo tamaño
promedio es inferior a 1 \mum, es decir, un tamaño promedio de
entre 1 y 999 nm.
Por el término "tamaño promedio" se
entiende el diámetro promedio de la población de nanopartículas, que
comprende la estructura reticulada polimérica, que se mueve
junta
en un medio acuoso. El tamaño promedio de estos
sistemas puede medirse utilizando procedimientos estándar conocidos
por el experto en la técnica, y que se describen, por ejemplo, en la
parte experimental a continuación.
Las nanopartículas del sistema de la invención
tienen un tamaño de partícula promedio inferior a 1 \mum, es
decir, tienen un tamaño promedio de entre 1 y 999 nm,
preferiblemente de entre 50 y 600 nm, incluso más preferiblemente de
entre 100 y 250 nm. El tamaño promedio de las partículas está
influido principalmente por la composición y las condiciones de
formación de partículas.
Por otra parte, las nanopartículas pueden
presentar una carga eléctrica (medida mediante el potencial Z), cuya
magnitud puede tomar valores positivos o negativos dependiendo de la
proporción de los diferentes componentes en el sistema. En una
realización particular de la invención, las nanopartículas presentan
carga negativa que puede variar entre -1 mV y -30 mV.
La carga negativa es particularmente adecuada
para garantizar la estabilidad de las nanopartículas tras la
administración por vía parenteral. Asimismo, también resulta de
interés para la administración a la superficie mucosa debido a la
presencia de enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas y de
afinidad al receptor. El potencial zeta de partícula de los sistemas
de la invención puede medirse utilizando procedimientos estándar
conocidos por el experto en la técnica, y que se describen, por
ejemplo, en la parte experimental de la presente memoria
descriptiva.
Por el término "polímero amónico" se
entiende cualquier polímero, preferiblemente de origen natural, con
una carga neta negativa, incluyendo en dicha definición aquellos
polímeros amónicos sobre los que se han efectuado modificaciones
tales como fragmentación enzimática o química o derivatización. En
una realización particular, el polímero aniónico se selecciona entre
ácido hialurónico o sales del mismo, sulfato de condroitina, sulfato
de queratano, sulfato de dextrano, heparina, carragenina,
glucomanano, así como fragmentos de los mismos o derivados de los
mismos.
El ácido hialurónico o hialuronano es un
glucosaminoglicano ampliamente distribuido a lo largo de los tejidos
conjuntivo, epitelial y neural. Es uno de los principales
componentes de la matriz extracelular y en general contribuye
significativamente a la proliferación y migración celular.
El hialuronano es un polímero lineal que
comprende la repetición de una estructura de disacárido formada por
la adición alterna de ácido D-glucurónico y
D-N-acetilglucosamina, unidos
alternando enlaces beta-1,4 y
beta-1,3 glucosídicos tal como se muestra en la
siguiente fórmula:
en la que el número entero n
representa el grado de polimerización, es decir, el número de
unidades de disacárido en la cadena de
hialuronano.
En el contexto de la presente invención, se
puede emplear ácido hialurónico con un amplio intervalo de pesos
moleculares. El ácido hialurónico de elevado peso molecular está
comercialmente disponible, mientras que el de peso molecular
inferior puede obtenerse mediante la fragmentación del ácido
hialurónico de elevado peso molecular, utilizando, por ejemplo, una
enzima hialuronidasa.
El término "hialurónico, ácido hialurónico,
hialuronano" tal como se utiliza en la presente descripción
incluye o bien el ácido hialurónico o bien una base conjugada del
mismo (hialuronato). Esta base conjugada puede ser una sal alcalina
del ácido hialurónico que incluyen sales inorgánicas tales como, por
ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio
y litio, sales orgánicas tales como sales de aminoácidos básicos a
pH neutro, preferiblemente dichas sales son farmacéuticamente
aceptables. En una realización preferida de la invención, la sal
alcalina es la sal de sodio del ácido hialurónico.
El sulfato de dextrano es un glucano
(polisacárido) complejo constituido por unidades de moléculas de
glucosa, cada una de las cuales contiene aproximadamente dos grupos
sulfato tal como se muestra en la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El sulfato de dextrano se prepara mediante
sulfatación de dextrano y posterior purificación mediante
procedimientos de sobra conocidos por un experto en la materia.
La heparina es una sustancia de origen natural
de la familia de los glicosaminoglicanos cuya estructura química
comprende la repetición de unidades monoméricas disacáridas de ácido
2-O-sulfo-\alpha-L-idurónico
y
2-deoxi-2-sulfamido-\alpha-D-glucopiranosil-6-O-sulfato,
representada a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde n es un número entero y
representa el grado de polimerización, es decir, el número de
unidades monoméricas en la cadena de
heparina.
En el contexto de la presente invención, es
posible emplear tanto la heparina fraccionada como la
no-fraccionada. La heparina tradicional o no
fraccionada se distingue claramente de la heparina fraccionada o de
bajo peso molecular. La primera de ellas es una sustancia natural
presente en todos los vertebrados. Ambos tipos de heparina se pueden
utilizar en forma de base libre o en forma de sal, como por ejemplo
su sal sódica o cálcica.
La heparina fraccionada o de bajo peso molecular
se produce por despolimerización química o enzimática de heparinas
convencionales. Ejemplos de este tipo de heparinas son enoxaparina,
parnaparina, dalteparina y nadroparina, así como sus sales tales
como las sales de sodio y calcio.
Los derivados de heparina también pueden ser
empleados en la composición de las nanopartículas de la presente
invención. Estos derivados son conocidos en el estado de la técnica
y se originan como consecuencia de la reactividad de los diferentes
grupos funcionales presentes en la molécula. Así, heparinas
N-acetiladas, O-descarboxiladas, oxidadas o reducidas
son ampliamente conocidas.
El sulfato de condroitina es un
glucosaminoglucano (GAG) sulfatado compuesto por una cadena de
azúcares alternados. Se encuentra normalmente unido a proteínas como
parte de un proteoglucano. Se representa mediante la siguiente
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que n es un número entero y
representa el grado de polimerización, es decir, el número de
unidades de disacáridos en la cadena de sulfato de condroitina y en
la que R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o
un grupo SO_{3}H. Cada monosacárido puede dejarse sin sulfatar,
sulfatarse una vez, o sulfatarse dos veces. La sulfatación está
mediada por sulfotransferasas
específicas.
En el contexto de la presente invención, el
término "sulfato de condroitina" incluye todos sus diferentes
isómeros y derivados, así como combinaciones de los mismos.
En una realización particular, el sulfato de
condroitina se selecciona entre las siguientes sustancias y
combinaciones de las mismas:
- -
- sulfato de condroitina A que está sulfatado predominantemente en el carbono 4 del azúcar N-acetilgalactosamina (GalNAc) y que también se conoce como sulfato de 4-condroitina (R_{1}=H, R_{2}=SO_{3}H y R_{3}=H)
- -
- sulfato de condroitina B que se denomina también sulfato de dermatano. Esta sustancia está compuesta por unidades de repetición lineales que contienen N-acetilgalactosamina y o bien ácido L-idurónico o bien ácido glucurónico, y cada disacárido puede estar sulfatado una vez o sulfatado dos veces.
- -
- sulfato de condroitina C que está sulfatado predominantemente en el carbono 6 del azúcar GalNAc y que se conoce también como sulfato de 6-condroitina (R_{1}=SO_{3}H, R_{2}=H y R_{3}=H);
- -
- sulfato de condroitina D que está sulfatado predominantemente en el carbono 2 del ácido glucurónico y en el carbono 6 del azúcar GalNAc y se conoce también como sulfato de 2,6-condroitina (R_{1}=SO_{3}H, R_{2}=H y R_{3}= SO_{3}H);
- -
- sulfato de condroitina E que está sulfatado predominantemente en los carbonos 4 y 6 del azúcar GalNAc y se conoce también como sulfato de 4,6-condroitina (R_{1}=SO_{3}H, R_{2}= SO_{3}H y R_{3}=H).
\vskip1.000000\baselineskip
El término "sulfato de condroitina" también
incluye sales orgánicas e inorgánicas del mismo. Generalmente, tales
sales se preparan, por ejemplo, mediante reacción de la forma básica
de este compuesto con una cantidad estequiométrica del ácido
apropiado en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los
dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos tales como éter,
acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de
sales inorgánicas incluyen, por ejemplo, sales de sodio, potasio,
calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, y las sales orgánicas
incluyen, por ejemplo, sales de etilendiamina, etanolamina,
N,N-dialquileno-etanolamina, trietanolamina,
glucamina y aminoácidos básicos. Preferiblemente las sales son
farmacéuticamente aceptables.
Las funciones de la condroitina dependen en
buena parte de las propiedades del proteoglucano global del que es
una parte. Estas funciones pueden dividirse de forma amplia en
papeles reguladores y estructurales. Sin embargo, esta división no
es absoluta y algunos proteoglucanos pueden desempeñar papeles tanto
estructurales como reguladores.
Con respecto a su papel estructural, el sulfato
de condroitina es un componente principal de la matriz extracelular,
y es importante para mantener la integridad estructural del tejido.
Como una parte de un agrecano, el sulfato de condroitina es un
componente principal del cartílago. Los grupos sulfato sumamente
cargados y de empaquetamiento compacto del sulfato de condroitina
generan repulsiones electrostáticas que proporcionan mucha de la
resistencia del cartílago a la compresión.
El sulfato de queratano es un glucosaminoglucano
sulfatado similar al sulfato de condroitina en el que el grupo
sulfato se encuentra en el glucurónico.
La carragenina o carragenano está formada por
unidades de galactosa y/o de anhidrogalactosa, sulfatadas o no,
unidas por enlaces alternos \alpha-1,3 y
\beta-1,4. Dependiendo del grado de sulfatación,
de las posiciones de los grupos sulfato y de la presencia de grupos
de anhidrogalactosa se distinguen varios tipos de carragenano, con
propiedades como hidrocoloides claramente distintas. A mayor
proporción de grupos sulfato, la solubilidad es mayor, y a mayor
proporción de grupos de anhidrogalactosa la solubilidad es menor. En
el contexto de la presente invención, están incluidos
todos los tipos de carrageno. Algunos de estos incluyen por ejemplo los carragenanos kappa, iota y lambda (k, i y l).
todos los tipos de carrageno. Algunos de estos incluyen por ejemplo los carragenanos kappa, iota y lambda (k, i y l).
El glucomanano es un polisacárido soluble en
agua de origen natural. La estructura de química de este compuesto
consiste en una cadena polimérica lineal con una pequeña proporción
de ramificaciones. En concreto, está formado por unidades de
D-manosa y D-glucosa unidas por
enlaces \beta-1,4 en una proporción de 1.6:1,
respectivamente.
En una realización particular de la invención,
el glucomanano empleado es un derivado de glucomanano con carga
negativa seleccionado entre los derivados fosforilados, carboximetil
y dicarboxi-glucomananos.
Las nanopartículas de la invención se
caracterizan por haberse formado a través de un mecanismo de
interacción iónica que provoca la precipitación conjunta de los
componentes de dichas nanopartículas en forma de nanoclusters como
consecuencia de la adición de un agente reticulante de carga
positiva. Además de ser un procedimiento sencillo, no se requiere el
uso de disolventes orgánicos o de sustancias auxiliares tóxicas. La
presencia del agente reticulante catiónico permite el
entrecruzamiento del polímero aniónico, y en su caso el
entrecruzamiento de éste con el polímero catiónico opcional,
mediante un proceso de gelificación iónica provocando la formación
espontánea de las nanopartículas. De esta manera se obtienen
nanopartículas con un tamaño, potencial y unas características
estructurales que las hacen ser adecuadas como sistemas de
administración de moléculas activas.
En una realización particular, el agente
reticulante es una amina de fórmula
H_{2}N-[(CH_{2})_{x}-NH-(CH_{2})_{y}]_{z}-NH_{2},
donde x, y y z toman, independientemente, un
valor comprendido entre 1 y 66. Preferentemente, x, y
y z, independientemente, presentan un valor comprendido entre
1 y 10.
De forma más preferente, la amina se selecciona
entre espermina, espermidina y sales de las mismas.
En una realización particular, la relación en
peso agente reticulante/polímero aniónico está comprendida entre
0.1/1 y 0.5/1, preferentemente entre 0.2/1 y 0.4/1, lo que
proporciona formulaciones con una baja polidispersidad.
En una realización particular de la invención,
las nanopartículas que constituyen el sistema pueden opcionalmente
comprender un polímero de carga positiva con el fin de modular las
características de los sistemas nanoparticulares que más importancia
presentan en su interacción con los medios biológicos, como son el
tamaño de partícula, la carga eléctrica superficial y la composición
y dotarlas así de una mayor versatilidad.
En el contexto de la presente invención, se
entiende por "polímero catiónico" cualquier polímero,
preferentemente de origen natural, con una carga neta positiva. En
una realización particular, el polímero catiónico se selecciona
entre dextranos cationizados, poliaminoácidos como la polilisina o
poliarginina, proteínas modificadas como la gelatina, colágeno y
atelocolágeno o sus derivados cationizados.
Por "dextrano cationizado" y "proteínas
modificadas como gelatinas, colágenos o atelocolágenos
cationizados", se entienden las moléculas anteriores modificadas
de manera que se introducen grupos amino que les otorgan un mayor
carácter catiónico al que ya poseen sin modificar.
Las nanopartículas de la presente invención
proporcionan sistemas con una elevada capacidad de asociación de
moléculas biológicamente activas con eficiencias superiores al 90%.
En consecuencia, en un aspecto adicional la invención se refiere a
un sistema como el que se ha definido anteriormente que comprende
además una molécula biológicamente activa.
El término "molécula biológicamente activa"
se refiere a cualquier sustancia que se utiliza en el tratamiento,
cura, prevención o diagnóstico de una enfermedad o que se utiliza
para mejorar el bienestar físico y mental de seres humanos y
animales, así como aquel compuesto que se destina a destruir,
impedir la acción, contrarrestar o neutralizar, cualquier organismo
nocivo. Las nanopartículas objeto de la presente invención son
adecuadas para incorporar moléculas biológicamente activas
independientemente de las características de solubilidad de las
mismas. La capacidad de asociación dependerá de la molécula
incorporada, pero en términos generales será elevada tanto para
moléculas hidrófilas, como para las de marcado carácter hidrófobo.
En una realización particular, la molécula biológicamente activa se
selecciona entre péptidos, proteínas, compuestos lipídicos o
lipofílicos, compuestos sacarídicos, compuestos de ácidos nucleicos
o nucleótidos como oligonucleótidos, polinucleótidos o bien
combinaciones de las moléculas citadas.
En una realización preferida de la invención, la
molécula biológicamente activa es un derivado de ácido nucleico, tal
como un plásmido de ADN, oligonucleótido, ARN de interferencia o un
polinucleótido. El plásmido de ADN es aquel que incorpora material
genético para ser introducido en células y expresar proteínas o bien
que actúe como precursor de RNA.
La proporción de principio activo incorporado en
las nanopartículas puede llegar a ser de hasta el 95% en peso con
respecto al peso total de los componentes de las nanopartículas. Sin
embargo, la proporción adecuada dependerá en cada caso del principio
activo que va a incorporarse, la indicación para la que se utiliza y
la eficiencia de administración. En una realización particular, la
proporción de principio activo se encuentra entre 1 y 10% en
peso.
En el caso específico de incorporar como
principio activo un polinucleótido tal como un plásmido de ADN o RNA
de interferencia, la proporción del mismo en dicho sistema estaría
entre un 1% y un 95% en peso, preferiblemente entre 1 y 30%, más
preferiblemente entre 1% y 5%, incluso más preferiblemente, en un
1%, 2,5% y en un 5%.
En otra realización particular, el sistema de
nanopartículas de la presente invención comprende, adicionalmente,
al menos un compuesto capaz de facilitar el seguimiento de dichas
nanopartículas tras su aplicación a un ser vivo. De forma
preferente, dicho compuesto es un marcador, tal como un antígeno de
membrana, o un agente de tinción como por ejemplo
4',6-diamidino-2-fenilindol
(DAPI).
En otra realización particular, el sistema de
nanopartículas de la invención comprende, además, al menos un
compuesto capaz de facilitar o reforzar el efecto de la molécula
biológicamente activa, tal como por ejemplo un adyuvante o un
inmunomodulador (inmunosupresor o inmunoestimulador). Asimismo, el
sistema de nanopartículas puede llevar incorporado un compuesto
capaz de interaccionar con componentes biológicos, como un
anticuerpo, un aptámero o un compuesto con afinidad por un receptor
existente en los seres vivos.
En otra realización particular, el sistema de
nanopartículas de la invención comprende, adicionalmente, un
compuesto estabilizante de tipo lipídico, graso u oleoso,
sacarídico, un derivado de aminoácido o proteico, un derivado de
óxido de etileno o un compuesto de tipo morfolino.
Todos los compuestos que pueden ser incorporados
al sistema de nanopartículas de la invención mencionados
anteriormente, se pueden adicionar a las soluciones de los polímeros
constituyentes de las nanopartículas previamente a la formación de
las mismas o bien pueden ser adicionados a las nanopartículas una
vez formadas.
En un aspecto adicional, la presente invención
se dirige a una composición farmacéutica que comprende el sistema de
nanopartículas previamente descrito.
Las composiciones farmacéuticas según la
invención, incluyen cualquier composición líquida (es decir,
suspensión o dispersión de las nanopartículas de la invención) para
aplicación por vía oral, bucal, sublingual, tópica, ocular, nasal,
pulmonar, ótica, vaginal, intrauterina, rectal, entérica o
parenteral, o cualquier composición en la forma de gel, pomada,
crema o bálsamo para su administración por vía tópica, ocular,
nasal, vaginal o rectal.
En una realización particular, la composición se
administra por vía oral. En este caso, las nanopartículas presentan
la ventaja adicional de ser estables en los fluidos
gastrointestinales, por lo que pueden alcanzar el tejido epitelial
intestinal sin sufrir degradación alguna y liberar allí el principio
activo.
Debido a sus buenas propiedades para la
administración sobre o a través de la piel, y a su estabilidad
duradera, el sistema de nanopartículas de la invención también es
adecuado para aplicaciones cosméticas. Por lo tanto, en otro
aspecto, la invención se dirige a una composición cosmética que
comprende el sistema de nanopartículas previamente descrito.
Las composiciones cosméticas según la invención
incluyen cualquier composición líquida (suspensión o dispersión de
nanopartículas) o cualquier composición que comprenda el sistema de
la invención y que esté en la forma de gel, crema, pomada o bálsamo
para su administración por vía tópica.
Dicha composición cosmética puede ser aplicada a
diversas partes superficiales del cuerpo humano o animal tal como la
piel, sistema piloso y capilar, uñas, labios y órganos genitales
externos, y a dientes o mucosas del cuerpo humano o animal.
En una realización particular de la invención,
la composición que comprenda el sistema de la invención tiene una
finalidad de higiene personal, o tiene el fin de perfumar, modificar
el aspecto de la superficie corporal y/o corregir olores corporales
y/o protegerla o mantenerla en buen estado.
En una variante de la invención, la composición
cosmética o de higiene personal también puede incorporar moléculas
activas de naturaleza lipófila e hidrófila que, aunque no tengan
ningún efecto terapéutico, tienen propiedades como agente cosmético
o de higiene personal. Entre las moléculas activas que pueden
incorporarse en las nanopartículas pueden citarse agentes
emolientes, conservantes, sustancias de fragancia, agentes antiacné,
agentes antifúngicos, antioxidantes, desodorantes,
antitranspirantes, agentes contra la caspa, despigmentantes, agentes
antiseborreicos, tintes, lociones bronceadoras, absorbentes de luz
UV, enzimas, entre otros.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición nutricional que comprende el sistema de nanopartículas
previamente descrito. Dicha composición nutricional puede ser un
alimento, un suplemento dietético o un suplemento nutricional. Las
composiciones nutricionales pueden incluir leche, yogures, zumos de
fruta y de vegetales, postres, productos infantiles o productos
deshidratados. La adición de las nanopartículas a la composición
nutricional se realiza mediante mezcla y homogenización según el
procedimiento técnico para elaborar cada producto.
Adicionalmente, otros componentes tales como las
vitaminas pueden añadirse a la composición nutricional. Ejemplos de
estos compuestos son vitamina A, vitaminas del grupo A, B, C, D, E,
ácido fólico o mezcla de los mismos.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para la preparación de un sistema de
nanopartículas como se ha definido previamente que comprende:
- a)
- preparar una disolución acuosa de al menos un polímero aniónico;
- b)
- preparar una disolución de un agente reticulante catiónico y, opcionalmente adicionar a dicha disolución un polímero catiónico;
- c)
- mezclar bajo agitación las disoluciones obtenidas en a) y b) con formación espontánea de las nanopartículas.
\vskip1.000000\baselineskip
En una variante del procedimiento, el polímero
catiónico se adiciona sobre las nanopartículas ya formadas, en lugar
de incorporarse a la disolución del agente reticulante.
La incorporación del/los polímero/s aniónico/s
se lleva a cabo mediante disolución acuosa del mismo a una
concentración de entre 0,1 y 6 mg/mL, más preferiblemente entre 0.1
y 5 mg/mL y aún más preferiblemente entre 0.1 y 3 mg/mL.
De acuerdo con otra realización particular, el
agente reticulante catiónico se disuelve en agua a una concentración
de entre 0,0625 y 1,5 mg/mL, preferiblemente entre 0,0625 y 1 mg/mL;
más preferiblemente entre 0,25 y 1 mg/mL, aún más preferiblemente
entre 0,5 y 1 mg/mL.
\newpage
La formación de las nanopartículas objeto de la
presente invención es consecuencia de un proceso controlado de
entrecruzamiento ionotrópico de los componentes que presentan carga
opuesta. Fruto de dicho proceso controlado, denominado reticulación
iónica o ionotrópica, se obtienen nanopartículas de tamaño y carga
superficial predeterminados, homogéneos, ajustables y reproducibles,
con independencia de que se asocie o no molécula bioactiva alguna y
de la carga eléctrica que ésta presente.
La molécula biológicamente activa, y/o el
compuesto capaz de facilitar el seguimiento de las nanopartículas
tras su aplicación a un ser vivo, y/o el compuesto capaz de
facilitar o reforzar el efecto de la molécula biológicamente activa,
y/o el compuesto capaz de interaccionar con componentes biológicos o
con afinidad por un receptor existente en los seres vivos, y/o el
compuesto estabilizante, o la molécula activa que actúa como agente
cosmético, es disuelto en una de las disoluciones a) o b),
dependiendo de la carga que posea, es decir, si presenta carga
negativa se disuelve en la disolución a) y, si por el contrario,
presenta carga positiva, se disuelve en la disolución b). En una
variante del procedimiento, dicha molécula se adiciona sobre las
nanopartículas una vez formadas.
En el caso de moléculas lipofílicas, éstas
pueden ser disueltas en primer lugar en un pequeño volumen de un
disolvente orgánico, de un aceite o compuesto lipídico o lipofílico,
o de una mezcla de agua y los compuestos anteriormente mencionados,
el cual seguidamente se adicionará a una de las disoluciones acuosas
mencionadas con anterioridad, de forma que la concentración en peso
del disolvente orgánico en la disolución final sea siempre menor al
95%. En un caso de este tipo, el disolvente orgánico tiene que
extraerse del sistema, a menos que sea farmacéuticamente
aceptable.
El procedimiento de elaboración de las
nanopartículas mencionadas puede incluir una etapa adicional de
liofilización, con el fin de preservarlas durante su almacenamiento
para que conserven sus características iniciales y se reduzcan los
volúmenes de producto que van a manipularse. Por otra parte, el
grado de reticulación de las nanopartículas puede aumentar con este
proceso, ya que puede tener lugar una aproximación entre las cadenas
poliméricas, lo que podría facilitar que aumente el grado de
entrecruzamiento polimérico, así como que se potencie el efecto del
agente reticulante. Para la liofilización de las nanopartículas
puede ser únicamente necesaria la adición de pequeñas cantidades de
azúcares tales como glucosa, sacarosa o trealosa a una concentración
que oscila desde un 1 hasta un 5% u otras moléculas que actúen como
crioprotectores y/o lioprotectores. Las nanopartículas de la
invención tienen la ventaja adicional de que el tamaño de partículas
antes y después de la liofilización no se modifica de manera
significativa. Es decir, las nanopartículas tienen la ventaja de que
pueden liofilizarse y resuspenderse sin ninguna alteración en las
características de las mismas.
Debido al elevado potencial de los sistemas
nanoparticulares de la presente invención en el campo biomédico,
dichos sistemas resultan adecuados para el tratamiento o prevención
de enfermedades en seres humanos y animales con el fin de
restablecer, corregir o modificar las funciones fisiológicas
ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica, metabólica o
modificadora de expresión de genes, o bien con el fin de establecer
un diagnóstico médico o veterinario.
En consecuencia, un aspecto adicional de la
presente invención se refiere al uso de un sistema de nanopartículas
como el definido previamente en la preparación de un
medicamento.
En una realización particular, los sistemas de
la invención resultan ser adecuados para transferir, in vivo
o ex vivo, un gen profiláctico, de diagnóstico o terapéutico,
tal y como un fragmento de ácido nucleico, a células
humanas/animales o a cultivos celulares primarios o modificados. En
consecuencia, el sistema de nanopartículas de la invención resulta
útil en la preparación de un medicamento destinado a terapia génica,
silenciamiento o interferencia genética, o vacunación genética.
En otra realización particular, los sistemas
nanoparticulados de la invención permiten manipular o alterar las
características biológicas de células vivas tanto autólogas, como
alogénicas, xenogénicas o de cultivos celulares y posteriormente
emplear dichas células o grupos celulares para obtener un efecto
terapéutico, diagnóstico, preventivo o con fines regenerativos, o
para modificar la producción de compuestos por dichas células con
fin de producción biotecnológica. En una realización particular,
dicha manipulación incluye la expansión o activación de poblaciones
celulares ex vivo y la adaptación de células para su
asociación efectiva a productos sanitarios empleados ex vivo
o in vivo, tales como micropartículas o microcápsulas,
matrices y andamiajes intrínsecos, biodegradables o no
biodegradables.
En un aspecto adicional, el sistema de
nanopartículas de la invención permite modificar, corregir o
introducir propiedades organolépticas o mejorar la estabilidad en un
medicamento o en un producto cosmético.
En otro aspecto adicional, los sistemas
nanoparticulados de la invención permiten tratar, acondicionar,
modificar o restablecer las características de agua, alimentos o
suplementos nutricionales, así como modificar, corregir o introducir
nuevas propiedades organolépticas o mejorar la estabilidad de los
mismos y facilitar o hacer posible la administración de alimentos o
nutrientes a seres vivos.
A continuación, para una mayor comprensión de
las características y ventajas de la presente invención, se hará
referencia a una serie de ejemplos que de forma explicativa
completen la descripción anterior, sin suponer en modo alguno que
ésta se vea limitada a los mismos.
Como procedimiento común a los ejemplos
detallados a continuación, se ha caracterizado a las nanopartículas
desde el punto de vista del tamaño, el potencial zeta (o carga
superficial) y la eficacia de encapsulación.
Durante la exposición de algunos de los
siguientes ejemplos se hace referencia a resultados obtenidos
mediante las siguientes técnicas:
El tamaño de partícula ha sido determinado
mediante la técnica de espectroscopia de correlación fotónica (PCS)
y haciendo uso, para ello, de una Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano
series, Nano-ZS, Malvern Instruments, UK) obteniendo
el tamaño medio de la pobración y el índice de polidispersión de la
misma. Para ello las muestras fueron convenientemente diluidas en
agua mili-Q.
El potencial Zeta partícula ha sido determinado
mediante la técnica de anemometría por dispersión de láser (LDA) y
haciendo uso, para ello, de una Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano series,
Nano-ZS, Malvern Instruments, UK). Para ello las
muestras fueron convenientemente diluidas en una disolución
milimolar de KCl.
La eficiencia de asociación de material genético
a las nanopartículas ha sido determinada mediante la técnica de
electroforesis en gel de agarosa. Para ello se preparó un gel de
agarosa al 1% en tampón TAE
(Tris-Acetato-EDTA, Tris 40 mM,
Ácido acético 1%, EDTA 1 mM) pH 8 con bromuro de etidio (10 mg/mL, 5
mL) y se utilizó un tampón de carga y marcador de migración
compuesto de glicerina (30%), azul de bromofenol (0.25%) y xileno
cianol (0.25%). Se aplicó una diferencia de potencial de 100 mV
durante 30 minutos y se empleó material genético libre como
control.
Los siguientes polímeros, tal y como se utilizan
en los siguientes ejemplos, fueron adquiridos a diferentes casas
comerciales: Ácido hialurónico, o hialurónico (Bioibérica, Spain),
sulfato de condroitina (Calbiochem, USA), sulfato de dextrano,
(Sigma, Spain), heparina (Sigma, Spain), glucomanano (Shimizu
Chemical, Japón)) y carragenina (FMC Biopolymer, ME, USA).
El plásmido de ADN pEGFP fue adquirido de Elim
Biopharmaceuticals (CA, USA).
El RNA de interferencia (siRNA) siGAPDH y siEGFP
fueron adquiridos de Ambion (USA) e Invitrogen (USA),
respectivamente.
La espermina y la espermidina fueron adquiridas
de Sigma Aldrich (Spain).
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon nanopartículas de ácido
hialurónico empleando espermina como agente reticulante según el
procedimiento previamente descrito. Se procedió a la asociación de
una macromolécula hidrofílica bioactiva en su composición,
seleccionando para tal fin material genético, concretamente un
plásmido, el pEGFP. Se trata de una macromolécula cargada
negativamente, por lo que se incorporó junto al hialurónico, de
carga también negativa, para evitar la aparición de interacciones
previas a la formación de las partículas.
Para ello se prepararon disoluciones acuosas de
ácido hialurónico (2 mg/mL) en agua mili-Q. Como
agente reticulante se empleó espermina disuelta en agua
mili-Q (0.75 mg/mL). El correspondiente material
genético se incorporó en una proporción de 2.5% en peso con respecto
a los componentes anteriores. La molécula bioactiva se incorporó a
la disolución del hialurónico y la disolución resultante se mezcló
con la disolución de espermina, bajo agitación magnética, la cual se
mantuvo durante media hora, permitiendo la completa evolución del
sistema hacia una forma nanoparticular estable. De este modo, se
prepararon nanopartículas con un tamaño medio de partícula de 532
\pm21 nm (índice de polidispersión de 0,34) y carga eléctrica
superficial negativa, de -21,1 \pm0,1 mV.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon nanopartículas a partir de ácido
hialurónico empleando espermina como agente reticulante según el
procedimiento previamente descrito, conteniendo RNA de interferencia
siGAPDH (carga de 5%). Los sistemas fueron caracterizadas
morfológicamente mediante microscopía de transmisión (TEM) (CM12,
Philips, Eindhoven, The Netherlands), utilizando ácido
fosfotúngstico 1% como agente de contraste. La Figura 1 muestra las
correspondientes imágenes. En dichas imágenes puede comprobarse que
los sistemas nanoparticulares presentan una forma regular esférica y
un tamaño de partícula homogéneo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon nanopartículas de sulfato de
condroitina empleando espermina como agente reticulante según el
procedimiento previamente descrito. Se procedió a la incorporación
de una macromolécula hidrofílica bioactiva en su composición,
seleccionando para tal fin material genético, concretamente un
plásmido, el pEGFP, o bien RNA de interferencia (siRNA), el siGAPDH.
En ambos casos se trata de macromoléculas cargadas negativamente,
por lo que se incorporaron junto al sulfato de condroitina de carga
también negativa, para evitar la aparición de interacciones previas
a la formación de las partículas. Para ello se prepararon
disoluciones acuosas de sulfato de condroitina (1 mg/mL) en agua
mili-Q. Como agente reticulante se empleó espermina
disuelta en agua mili-Q (0.5 mg/mL). El
correspondiente material genético se incorporó en una proporción de
5% en peso con respecto a los componentes anteriores. La molécula
bioactiva se incorporó a la disolución del sulfato de condroitina y
la disolución resultante se mezcló con la disolución de espermina,
bajo agitación magnética, la cual se mantuvo durante media hora,
permitiendo la completa evolución del sistema hacia una forma
nanoparticular estable. La Tabla 1 muestra el diámetro medio y carga
eléctrica superficial (potencial zeta) de los sistemas
obtenidos.
Se prepararon nanopartículas de sulfato de
dextrano según el procedimiento previamente descrito. Se procedió a
la incorporación de una macromolécula hidrofílica bioactiva en su
composición, seleccionando para tal fin material genético,
concretamente un plásmido, el pEGFP. Se trata de una macromolécula
cargada negativamente, por lo que se incorporó junto al sulfato de
dextrano, de carga también negativa, para evitar la aparición de
interacciones previas a la formación de las partículas. Como agente
reticulante se empleó la molécula catiónica espermina.
Para ello se prepararon disoluciones acuosas de
sulfato de dextrano (2 mg/mL) en agua mili-Q. Como
agente reticulante se empleó una solución acuosa de espermina
(0.6-0.8 mg/mL) en agua mili-Q. El
correspondiente material genético se incorporó en una proporción de
2.5% en masa. La molécula bioactiva se incorporó a la disolución del
sulfato de dextrano y la disolución resultante se mezcló con la
disolución de reticulante, bajo agitación magnética, la cual se
mantuvo durante media hora, permitiendo la completa evolución del
sistema hacia una forma nanoparticular estable. Las relaciones entre
el polímero y el reticulante se muestran en la Tabla 2. Asimismo,
dicha tabla muestra el diámetro medio y carga eléctrica superficial
(potencial zeta) de los sistemas obtenidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon nanopartículas de heparina según
el procedimiento previamente descrito.
Se procedió a la incorporación de una
macromolécula hidrofílica bioactiva en su composición, seleccionando
para tal fin material genético, concretamente un plásmido, el pEGFP,
o bien RNA de interferencia (siRNA), el siGAPDH. En ambos casos se
trata de macromoléculas cargadas negativamente, por lo que se
incorporaron junto a la heparina de carga también negativa, para
evitar la aparición de interacciones previas a la formación de las
partículas. Para ello se prepararon disoluciones acuosas de heparina
(1 mg/mL) en agua mili-Q. Como agente reticulante se
empleó una solución acuosa de espermina (0.75 mg/mL) en agua
mili-Q. El correspondiente material genético se
incorporó en una proporción de 5% en masa. La molécula bioactiva se
incorporó a la disolución de heparina y la disolución resultante se
mezcló con la disolución de reticulante, bajo agitación magnética,
la cual se mantuvo durante media hora, permitiendo la completa
evolución del sistema hacia una forma nanoparticular estable. La
Tabla 3 muestra el diámetro medio y carga eléctrica superficial
(potencial zeta) de los sistemas obtenidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon nanopartículas de carragenina
según el procedimiento previamente descrito. Se procedió a la
incorporación de una macromolécula hidrofílica bioactiva en su
composición, seleccionando para tal fin material genético,
concretamente un plásmido, el pEGFP. Se trata de una macromolécula
cargada negativamente, por lo que se incorporó junto a la
carragenina, de carga también negativa, para evitar la aparición de
interacciones previas a la formación de las partículas. Como agente
reticulante se empleó la molécula catiónica espermina. Para ello se
prepararon disoluciones acuosas de
\lambda-carragenina (0.5 mg/mL) en agua
mili-Q. Como agente reticulante se empleó una
solución acuosa de espermina (0.25 mg/mL) en agua
mili-Q. El correspondiente material genético se
incorporó en una proporción de 5% en masa. La molécula bioactiva se
incorporó a la disolución de carragenina y la disolución resultante
se mezcló con la disolución de reticulante, bajo agitación
magnética, la cual se mantuvo durante media hora, permitiendo la
completa evolución del sistema hacia una forma nanoparticular
estable. El diámetro medio de las nanopartículas obtenidas es de 136
\pm0,3 nm (índice de polidispersión de 0.23) y su carga eléctrica
superficial (potencial zeta) de -28,1 \pm 1,9 mV.
Claims (34)
1. Un sistema para la administración de
moléculas biológicamente activas que comprende nanopartículas
homogéneas con un tamaño medio inferior a 1 micrómetro, que
comprenden:
- (a)
- al menos un polímero aniónico;
- (b)
- un agente reticulante catiónico; y opcionalmente
- (c)
- un polímero catiónico;
caracterizado porque las nanopartículas
se encuentran entrecruzadas mediante interacciones de tipo
electrostático.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Sistema según reivindicación 1, donde el
polímero aniónico se selecciona entre ácido hialurónico o sales del
mismo, sulfato de condroitina, sulfato de queratano, sulfato de
dextrano, heparina, carragenina y glucomanano o derivados del
mismo.
3. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el agente reticulante catiónico
es una amina seleccionada entre espermina y espermidina, o sales de
las mismas.
4. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el polímero catiónico se
selecciona entre dextranos cationizados, poliaminoácidos y proteínas
modificadas.
5. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el tamaño medio de partícula
está comprendido entre 1 y 999 nm, preferiblemente entre 50 y 600
nm, más preferiblemente entre 100 y 400 nm.
6. Sistema según las reivindicaciones
precedentes, que adicionalmente comprende al menos una molécula
biológicamente activa.
7. Sistema según reivindicación 6, donde la
molécula biológicamente activa se encuentra en una proporción de
hasta un 95% en peso con respecto al peso total de los componentes
de las nanopartículas.
8. Sistema según reivindicaciones 6 ó 7, donde
la molécula biológicamente activa se selecciona entre péptidos,
proteínas, compuestos lipídicos o lipofílicos, compuestos
sacarídicos, compuestos de ácidos nucleicos o nucleótidos y mezclas
de los mismos.
9. Sistema según reivindicación 8, donde la
molécula biológicamente activa se selecciona entre ADN plasmídico,
un oligonucleótido, ARN de interferencia y un polinucleótido.
10. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que adicionalmente comprende al menos
un compuesto capaz de facilitar el seguimiento de las nanopartículas
tras su aplicación a un ser vivo.
11. Sistema según reivindicación 10, donde el
compuesto es un marcador, agente de seguimiento o un agente de
tinción.
12. Sistema según reivindicaciones 6 a 11, que
adicionalmente comprende un compuesto capaz de facilitar o reforzar
el efecto de la molécula biológicamente activa.
13. Sistema según reivindicación 12, donde el
compuesto es un adyuvante o un inmunomodulador.
14. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que adicionalmente comprende un
compuesto capaz de interaccionar con componentes biológicos o con
afinidad por un receptor existente en los seres vivos.
15. Sistema según reivindicación 14, donde el
compuesto es un anticuerpo o un aptámero.
16. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que adicionalmente comprende un
compuesto estabilizante de tipo lipídico, graso u oleoso,
sacarídico, un derivado de aminoácido o proteico, un derivado de
óxido de etileno o un compuesto de tipo morfolino.
17. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde las nanopartículas se encuentran
en forma liofilizada.
18. Una composición farmacéutica que comprende
un sistema como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones
1 a 17.
\newpage
19. Composición según la reivindicación 18, para
la administración por vía oral, bucal, sublingual, tópica, ocular,
nasal, pulmonar, ótica, vaginal, intrauterina, rectal, entérica o
parenteral.
20. Una composición cosmética o de higiene
personal que comprende un sistema como se ha definido en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 17.
21. Composición según reivindicación 20, para la
administración sobre piel, sistema piloso y capilar, uñas, labios,
órganos genitales externos, dientes o mucosas.
22. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 21, que comprende además agentes emolientes,
conservantes, sustancias de fragancia, agentes antiacné, agentes
antifungicos, antioxidantes, desodorantes, antitranspirantes,
agentes contra la caspa, despigmentantes, agentes antiseborreicos,
tintes, lociones bronceadoras, absorbentes de luz UV, o enzimas.
23. Una composición nutricional que comprende un
sistema como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1
a 17.
24. Un procedimiento para la preparación de un
sistema como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17
que comprende:
- a)
- preparar una disolución acuosa de al menos un polímero aniónico;
- b)
- preparar una disolución acuosa de un agente reticulante catiónico y, opcionalmente adicionar a ésta un polímero catiónico;
- c)
- mezclar bajo agitación las disoluciones obtenidas en a) y b) con formación espontánea de las nanopartículas.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Procedimiento según reivindicación 23, donde
el polímero catiónico se adiciona sobre las nanopartículas ya
formadas.
26. Procedimiento según reivindicaciones 23 ó
24, que comprende además la adición de una molécula biológicamente
activa, y/o un compuesto capaz de facilitar el seguimiento de las
nanopartículas tras su aplicación a un ser vivo, y/o un compuesto
capaz de facilitar o reforzar el efecto de la molécula
biológicamente activa, y/o un compuesto capaz de interaccionar con
componentes biológicos o con afinidad por un receptor existente en
los seres vivos, y/o un compuesto estabilizante, en la disolución a)
si es de naturaleza aniónica o en la disolución b) si es de
naturaleza catiónica.
27. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 25, que comprende una etapa adicional después
de la etapa c) en el que las nanopartículas se someten a un proceso
de liofilización.
28. Procedimiento según reivindicación 26, que
comprende una etapa adicional en la que se regeneran las
nanopartículas liofilizadas.
29. Uso de un sistema como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la preparación de un
medicamento.
30. Uso según reivindicación 28, donde el
medicamento es para terapia génica, silenciamiento o interferencia
genética, o vacunación genética.
31. Uso de un sistema como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para preparar una
composición para manipular o alterar las características biológicas
de células vivas tanto autólogas, como alogénicas, xenogénicas o de
cultivos celulares y posteriormente emplear dichas células o grupos
celulares para obtener un efecto terapéutico, diagnóstico,
preventivo o con fines regenerativos, o para modificar la producción
de compuestos por dichas células, o para producir la expansión o
activación de poblaciones celulares o para adaptarlas y asociarlas
de modo efectivo a micropartículas o microcápsulas, matrices y
andamiajes.
32. Uso de un sistema como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para modificar, corregir
o introducir propiedades organolépticas o mejorar la estabilidad en
un medicamento o en un producto cosmético o de higiene personal.
33. Uso de un sistema como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para acondicionar,
modificar o restablecer las características de agua, alimentos o
suplementos nutricionales, así como para modificar, corregir o
introducir nuevas propiedades organolépticas o mejorar la
estabilidad de los mismos y para facilitar o hacer posible la
administración de alimentos o nutrientes a seres vivos.
\newpage
34. Composición cosmética o de higiene personal
según se define en las reivindicaciones 20 a 22, para su uso en
higiene o estética, para perfumar, modificar el aspecto de la
superficie corporal y/o corregir olores corporales y/o protegerla o
mantenerla en buen estado.
Priority Applications (5)
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|---|---|---|---|
| ES200803136A ES2342588B2 (es) | 2008-10-28 | 2008-10-28 | Sistemas nanoparticulares elaborados a base de polimeros anionicos. |
| EP09823117.8A EP2366386A4 (en) | 2008-10-28 | 2009-10-26 | NANOPARTICULAR SYSTEMS MADE OF ANIONIC POLYMERS |
| PCT/ES2009/070461 WO2010049562A1 (es) | 2008-10-28 | 2009-10-26 | Sistemas nanoparticulares elaborados a base de polímeros aniónicos. |
| JP2011533777A JP2012506900A (ja) | 2008-10-28 | 2009-10-26 | アニオン性ポリマーから調製されるナノ粒子系 |
| US13/126,764 US20110256059A1 (en) | 2008-10-28 | 2009-10-26 | Nanoparticulate systems prepared from anionic polymers |
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|---|---|---|---|
| ES200803136A ES2342588B2 (es) | 2008-10-28 | 2008-10-28 | Sistemas nanoparticulares elaborados a base de polimeros anionicos. |
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| US6383478B1 (en) * | 1999-04-22 | 2002-05-07 | Vanderbilt University | Polymeric encapsulation system promoting angiogenesis |
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|---|---|---|---|---|
| WO2004096998A2 (en) * | 2003-04-29 | 2004-11-11 | Vanderbilt University | Nanoparticular tumor targeting and therapy |
| US20080254078A1 (en) * | 2005-09-16 | 2008-10-16 | Peter Kauper | Chitosan-Based Particles |
-
2008
- 2008-10-28 ES ES200803136A patent/ES2342588B2/es active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999018934A1 (en) * | 1997-10-09 | 1999-04-22 | Vanderbilt University | Micro-particulate and nano-particulate polymeric delivery system |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TIYABOONCHAI, WARE et al.; Formulation and characterization of amphotericin B-chitosan-dextran sulfate nanoparticles; International Journal of Pharmaceutics 329 (2007) páginas 142-149; ISSN 0378-5173. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2342588A1 (es) | 2010-07-08 |
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