ES2342525B1 - Procedimiento para la identificacion genetica de la centolla europea del atlantico (maja brachydactyla). - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la identificación genética de
la centolla europea del Atlántico (Maja brachydactyla).
Se ha desarrollado un protocolo para la
identificación genética de la centolla europea del Atlántico
(Maja brachydactyla) frente a las demás especies del género
que se encuentran en el Mediterráneo (M. squinado, M. crispata y
M. goltziana). Estas especies constituyen un recurso comercial
de gran valor; su identificación es fundamental para posibilitar su
trazabilidad y correcto etiquetado y para orientar su gestión y
conservación.
El protocolo consiste en amplificar una región
de 671 pb del gen 16S del ADN mitocondrial, cuya secuencia
nucleotídica es característica de cada una de las 4 especies. En
particular, para diferenciar M. brachydactyla se han diseñado
cebadores específicos que permiten amplificar un fragmento interno
de 223 pb.
Description
Procedimiento para la identificación genética de
la centolla europea del Atlántico (Maja brachydactyla).
La centolla es un recurso pesquero muy
importante en Europa y, como tal, una exigencia básica de mercado es
la autentificación de su origen y su correcto etiquetado. Además, se
está explotando de forma intensiva y, de hecho, en el Mediterráneo,
la especie más comercializada ya se considera amenazada. Por eso
también es fundamental la identificación de estas especies para
desarrollar programas de recuperación y repoblación, de modo que se
asegure la incorporación correcta de cada especie en su área de
distribución geográfica.
La centolla es uno de los crustáceos de mayor
importancia económica en las costas europeas. Pertenece al género
Maja y en esta región se han definido cuatro especies: M.
brachydactyla, M. squinado, M. crispata y M. goltziana
(Neumann 1998), si bien el interés comercial se centra en las dos
primeras. M. brachydactyla se distribuye en el Atlántico
(desde el sur del Mar del Norte hasta Senegal) mientras que M.
squinado es endémica del Mediterráneo. M. crispata y
M. goltziana fueron descritas inicialmente tanto en el
Atlántico (desde el oeste de Portugal hasta el Golfo de Guinea) como
en el Mediterráneo, aunque los registros recientes corresponden al
Mediterráneo (Carmona-Suárez 2003, Fürböck y Patzner
2005; Soppelsa et al. 2005, Lelli et al. 2007).
La diferenciación de estas especies es muy
complicada, especialmente en el caso de M. brachydactyla y
M. squinado; se basa en una serie de caracteres morfológicos
como la forma de los primeros gonópodos, la forma de las espinas del
caparazón (y su disposición) y varias medidas morfométricas (Neumann
1998). Sin embargo, estas diferencias no son definitivas, son
apreciables sólo por expertos y tienen el inconveniente añadido de
que cambian a lo largo de la vida del individuo (no se observan en
estado larvario y varían entre juveniles y adultos). Por este
motivo, las centollas pescadas en el Atlántico (M.
brachydactyla, según Neumman) son todavía etiquetadas en los
mercados como M. squinado.
Desde el punto de vista comercial, las capturas
de centolla superaron las 5000 toneladas en el año 2005 (según los
últimos datos disponibles de la FAO); y, siendo un producto muy
apreciado en el mercado, alcanza además precios elevados. Se pesca
casi exclusivamente en el litoral Atlántico, mientras que en el
Mediterráneo es cada vez más difícil de encontrar. De hecho, en
algunas zonas del Mediterráneo, M. squinado se considera una
especie amenazada. Por estos motivos, se está desarrollando el
cultivo en cautividad, tanto para abastecer a los mercados y paliar
la sobreexplotación de las poblaciones naturales como para repoblar
y recuperar las áreas más afectadas.
Para resolver los problemas de identificación,
hemos llevado a cabo un estudio genético con marcadores de ADN
mitocondrial: un fragmento de 710 pb del gen COI y un fragmento de
560 pb del gen 16S (Sotelo et al. 2008), confirmando el
estatus de especie de cada una de las formas propuestas.
En este estudio concluimos además que el
fragmento de 16S es un marcador idóneo para la identificación de
estas centollas, por ser invariable dentro de especie y variable
entre especies. Conociendo la secuencia nucleotídica de estos
fragmentos, es posible asignar una muestra de centolla europea de
forma inequívoca a una de las cuatro especies. La ventaja de la
identificación genética es su validez en cualquier etapa del
desarrollo del individuo, desde larva a adulto, y su aplicación
sobre una pequeña cantidad de tejido del individuo analizado, por lo
que no es necesario disponer del individuo completo.
Aunque la secuenciación del fragmento del 16S es
un buen método de identificación, hemos diseñado un protocolo de
asignación molecular más rápido y sencillo, pero igualmente eficaz.
El principal objetivo es la identificación de M.
brachydactyla frente a M. squinado, ya que estas dos
especies de centolla son las más parecidas morfológicamente y de
mayor interés comercial. Sin embargo, para evitar cualquier posible
confusión con las demás especies del Mediterráneo, éstas también se
han incluido a la hora de desarrollar la técnica.
Carmona-Suárez CA
(2003) Reproductive biology and relative growth in the spider
crab Maja crispata (Crustacea: Brachyura: Majidae).
Scientia Marina 67: 75-80
Fürböck S, Patzner RA
(2005) Daily movement patterns of Maja crispata Risso
1827 (Brachyura: Majidae) Acta Adriatica 46:
41-45
Lelli S, Carpentieri P,
Colloca F, Ardizzone GD (2007) The spiny spider
crab Maja gotziana (Crustacea: Majidae) in south Lebanese
waters. JMBA2-Biodiversity Records (Published
on-line)
Neumann V (1998) A review of the
Maja squinado (Crustacea: Decapoda: Brachyura)
species-complex with a key to the eastern Atlantic
and Mediterranean species of the genus. Journal of Natural
History 32: 1667-1684
Soppelsa N, Zenetos A,
Papathanassiou E (2005) Maja goltziana
d'Oliveira, 1888 (Decapada, Brachyura, Majidae) in the southern
Tyrrhenian Sea. Crustaceana 78: 121-124
Sotelo G, Moran P, Posada D
(2008) Genetic identification of the northeastern Atlantic
spiny spider crab as Maja brachydactyla Balss, 1922.
Journal of Crustacean Biology 28: 76-81.
El objetivo de la invención es la identificación
genética inequívoca de la especie europea de centolla del Atlántico
frente a las del Mediterráneo. La invención se basa en la
amplificación de un fragmento de 671 pb del gen 16S del ADN
mitocondrial, para el que ya había cebadores disponibles con
anterioridad, y en el estudio de las diferencias en la secuencia
entre las 4 especies de centolla. Teniendo en cuenta estas
diferencias, se han diseñado cebadores específicos para un fragmento
interno de 223 pb en M. brachydactyla. Así, ante una muestra
de centolla europea, habiendo amplificado el fragmento mayor de
referencia, si amplifica también el fragmento menor, podremos
identificarla como M. brachydactyla. En caso contrario,
sabremos que procede del Mediterráneo.
El procedimiento para la identificación genética
de la especie europea del género Maja (centollas) del
Atlántico, M. brachydactyla, frente a las especies del mismo
género del Mediterráneo, M. squinado, M. crispata y M.
goltziana, consta de las siguientes etapas:
- 1.
- Extracción de ADN.
- 2.
- Amplificación por PCR de un fragmento de 671 pb del gen mitocondrial 16S.
- 3.
- Amplificación por PCR de un fragmento de 223 pb incluido en la región anterior.
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Para extraer ADN se parte de una muestra de
tejido de 0.5 cm^{3}, de músculo preferentemente. Se han descrito
muchos protocolos de extracción, pero uno de los más sencillos y
rápidos es el que utiliza la resina quelante Chelex [Estoup et
al. (1996) Mol Mar Biol Biotech 5: 295-298].
Consiste en homogeneizar el tejido en 400 \muL de una solución de
Chelex 100 (Bio Rad) al 10%. La solución debe mantenerse caliente y
en agitación antes de tratar la muestra. Para potenciar la
eliminación de proteínas, se añaden 30 \muL de proteasa 20 mg/mL
(Pronase, Roche) al homogeneizado. Éste se incuba primero a 60ºC
durante 1 hora (en un baño de agua, con agitación) y después a 99ºC
durante 15 minutos (en una estufa). Para que precipiten los restos
de tejido, junto con la resina, y el ADN quede en el sobrenadante,
se aplica una centrifugación final de 1 minuto.
Si la cantidad de muestra es limitante (si se
trata de una larva, por ejemplo), el kit NucleoSpin Tissue
(Macherey-Nagel) es más adecuado porque permite
recuperar más ADN y de mejor calidad. En este caso, se siguen las
instrucciones del fabricante.
Para comprobar la efectividad de la extracción,
una alícuota de 4 \muL se somete a electroforesis en un gel de
agarosa (Agarose D-1 low
EEO-QDT, Pronadisa) al 1% en tampón TBE 1x. El
gel lleva incorporado bromuro de etidio, de modo que el ADN se hace
visible bajo luz ultravioleta (Figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Para amplificar por PCR este fragmento se
utilizan los cebadores 16L29 y 16HLeu (SEQ ID NO 1 y 2,
respectivamente), que ya habían sido descritos para otros crustáceos
decápodos (en el laboratorio de Christoph Schubart). Hay que indicar
que el extremo 3' del fragmento corresponde al inicio del gen
tRNALeu. La reacción contiene: 1 \muL de extracción (ADN), 2
\muL de tampón 10x (160 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}, 670 mM
Tris-HCl pH 8.8, 0.1% Tween 20), 1 \muL de
MgCl_{2} 50 mM, 0.5 \muL de cada uno de los cebadores 20 \muM,
1 \muL de dNTP Mix 10 mM (Applied Biosystems), 0.2 \muL de ADN
polimerasa (BIOTAQ 5 U/\muL, Bioline) y agua bidestilada
estéril hasta completar un volumen de 20 \muL. El programa de
amplificación consiste en una desnaturalización inicial a 95ºC
durante 5 minutos, 35 ciclos de desnaturalización a 95ºC, templado a
55ºC y extensión a 72ºC, cada paso durante 20 segundos, y una
extensión final a 72ºC durante 7 minutos. El resultado se comprueba
migrando 4 \muL del producto de PCR en un gel de agarosa
(Agarose D-1 low EEO-QDT,
Pronadisa) al 2%, durante 30 minutos a 100 V. En el mismo gel se
co-migran también 3 \muL de un marcador de peso
molecular (HyperLadder IV, Bioline) para estimar el tamaño
del fragmento amplificado. Este marcador resulta en un patrón de 10
bandas, con un rango de 100 a 1000 pb (cada banda es un múltiplo
exacto de 100 pb). En toda muestra de centolla europea debe
visualizarse la banda de 671 pb (Figura 2).
\newpage
Teniendo en cuenta la secuencia nucleotídica del
fragmento de 671 pb en cada una de las especies (SEQ ID NO
3-6) y las posiciones que varían entre ellas (Figura
3), se diseñaron dos cebadores específicos (16Lbr y 16Hbr, SEQ ID NO
7 y 8, respectivamente) para amplificar un fragmento interno de 223
pb en M. brachydactyla (Figura 4). La reacción de
amplificación tiene la misma composición que la indicada
anteriormente, y el programa consta de una desnaturalización inicial
a 95ºC durante 5 minutos, 35 ciclos de desnaturalización a 95ºC
durante 20 segundos, templado a 45ºC durante 20 segundos y extensión
a 72ºC durante 15 segundos, y una extensión final a 72ºC durante 7
minutos. El resultado se comprueba del mismo modo que en el paso
anterior. Si se observa una banda de 223 pb podemos identificar la
muestra de centolla que se está analizando como M.
brachydactyla, procedente del Atlántico (Figura 5). En caso
contrario, si no se observa ninguna banda, podemos afirmar que la
muestra de centolla procede del Mediterráneo, pero no podemos
identificar la especie a la que pertenece (puede ser M. squinado,
M. crispata o M. goltziana) (Figura 5).
Se trata de un método sencillo y rápido. Los
equipos que se requieren son básicos en cualquier laboratorio de
análisis molecular y es posible analizar simultáneamente un número
elevado de muestras y obtener los resultados en horas. La gran
ventaja de la identificación genética frente a la morfológica (la
única disponible hasta el momento) es su aplicación a cualquier
individuo independientemente de la fase vital en que se encuentre,
porque no se ve afectada por cambios ontogénicos, y su aplicación a
muestras pequeñas de tejido, sin necesidad de tener individuos
completos e intactos.
La aportación de este procedimiento es la
diferenciación de la centolla del Atlántico, M.
brachydactyla, frente a las centollas del Mediterráneo, que se
verifica amplificando el fragmento mayor de 671 pb y el fragmento
menor de 223 pb. Actualmente, esta especie es la más importante para
el comercio y se está evaluando su cultivo en cautividad, por lo que
es fundamental asegurar su autenticidad en todo momento.
Figura 1. Fotografía de un gel de agarosa al 1%
en el que se ha comprobado una extracción de ADN a partir de
muestras de músculo de centolla. La primera calle de la izquierda
corresponde al marcador de peso molecular HyperLadder IV, y
las siguientes (de izquierda a derecha) a Maja brachydactyla
(br), M. squinado (sq), M. crispata (cr) y M.
goltziana (go). Se observa una banda de varios Kpb, resultado de
la rotura mecánica del ADN durante el proceso de extracción, pero no
se detectan fragmentos pequeños (de cientos de bases) que indicarían
que el ADN estaba dañado de antemano. Además, la intensidad de la
banda indica que la cantidad de ADN es suficiente para poder
realizar el análisis molecular.
Figura 2. Fotografía de un gel de agarosa al 2%
en el que se ha comprobado la amplificación por PCR del fragmento de
671 pb del gen 16S, a partir de muestras de centolla procedentes de
la costa europea. La primera calle de la izquierda corresponde al
marcador de peso molecular HyperLadder IV, y las siguientes
(de izquierda a derecha) a M. brachydactyla (br), M.
squinado (sq), M. crispata (cr) y M. goltziana
(go). En las cuatro calles se observa la banda de 671 pb.
Figura 3. Alineamiento de la secuencia
nucleotídica del fragmento de 671 pb del gen 16S de las cuatro
especies de centolla, M. brachydactyla, M. squinado, M.
crispata y M. goltziana (SEQ ID NO 3-6).
En el margen izquierdo se indica la especie a la que pertenece cada
línea de la secuencia, que aparece separada en bloques consecutivos
de 60 pb, tal como se indica en el margen derecho. Las columnas con
un asterisco en la base se corresponden con las posiciones de la
secuencia que no varían entre las especies; mientras que la ausencia
de asterisco marca las posiciones variables. Las posiciones
indicadas en minúscula, las 20 primeras y las 20 últimas,
corresponden a los cebadores 16L29 y 16HLeu (SEQ ID NO 1 y 2).
Figura 4. Localización de los cebadores
específicos de M. brachydactyla, 16Lbr y 16Hbr (SEQ ID NO 7 y
8), sobre el alineamiento del fragmento de 671 pb de las cuatro
especies de centolla. Se indican en negrita y subrayados, y, como se
puede observar, amplifican una región interna de 223 pb.
Figura 5. Fotografía de un gel de agarosa en el
que se ha comprobado la amplificación específica por PCR del
fragmento de 223 pb en M. brachydactyla. La primera calle de
la izquierda corresponde al marcador de peso molecular
HyperLadder IV, y las siguientes (de izquierda a derecha) a
M. brachydactyla (br), M. squinado (sq), M.
crispata (cr) y M. goitziana (go). Sólo se observa la
banda de 223 pb en la calle que corresponde a M.
brachydactyla.
SEQ ID NO 1 corresponde al cebador directo
diseñado en el laboratorio de Christoph Schubart para amplificar un
fragmento del gen 16S en varios crustáceos decápodos.
SEQ ID NO 2 corresponde al cebador reverso
diseñado en el laboratorio de Christoph Schubart para amplificar un
fragmento del gen 16S en varios crustáceos decápodos; localizado en
el extremo 5' del gen tRNALeu.
<110> Universidad de Vigo
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<120> Identificación genética de la
centolla europea del Atlántico (Maja brachydactyla)
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<130>
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<220>
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<223> Forward primer designed at Christoph
Schubart's lab to amplify a fragment of the 16S gene in several
decapod crustaceans.
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<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Reverse primer designed at Christoph
Schubart's lab to amplify a fragment of the 16S gene in several
decapod crustaceans; located in the 5' extreme of the tRNALeu
gene.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatattatct gccaaaatag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 671
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Maja brachydactyla
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 671
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Maja squinado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 671
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Maja crispata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 671
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Maja goltziana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Maja brachydactyla
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtttaaaa gccgcggtat tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Maja brachydactyla
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatagttttc aatttttaat tc
\hfill22
Claims (2)
1. Procedimiento para la identificación genética
de la especie de centolla europea del Atlántico, Maja
brachydactyla, frente a las especies del Mediterráneo, M.
squinado, M. crispata y M. goltziana,
caracterizado por consistir en:
- a.
- Obtener una muestra para evaluar.
- b.
- Extraer el ADN de la muestra.
- c.
- Amplificar por PCR un fragmento de 671 pb del ADN mitocondrial con los cebadores 16L29 y 16HLeu (SEQ ID NO 1 y 2, respectivamente) y comprobar la correcta amplificación.
- d.
- Amplificar por PCR un fragmento de 223 pb, incluido en la región anterior, con los cebadores específicos para M. brachydactyla 16Lbr y 16Hbr (SEQ ID NO 7 y 8, respectivamente). Comprobar la amplificación. Si es positiva, la muestra corresponde a M. brachydactyla. Si es negativa, a M. squinado, M. crispata o M. goltziana.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el
que la muestra a evaluar procede de una centolla en cualquier etapa
de desarrollo capturada en las costas europeas, del Atlántico o del
Mediterráneo.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200801656A ES2342525B1 (es) | 2008-06-02 | 2008-06-02 | Procedimiento para la identificacion genetica de la centolla europea del atlantico (maja brachydactyla). |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200801656A ES2342525B1 (es) | 2008-06-02 | 2008-06-02 | Procedimiento para la identificacion genetica de la centolla europea del atlantico (maja brachydactyla). |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2342525A1 ES2342525A1 (es) | 2010-07-07 |
| ES2342525B1 true ES2342525B1 (es) | 2011-04-26 |
Family
ID=42270133
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200801656A Active ES2342525B1 (es) | 2008-06-02 | 2008-06-02 | Procedimiento para la identificacion genetica de la centolla europea del atlantico (maja brachydactyla). |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2342525B1 (es) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7309589B2 (en) * | 2004-08-20 | 2007-12-18 | Vironix Llc | Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing |
-
2008
- 2008-06-02 ES ES200801656A patent/ES2342525B1/es active Active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SCHUBART, C. D. et al., "{}Molecular phylogeny of the crab genus Brachynotus (Brachyura: Varunidae) based on 16S rRNA gene"{}, HYDROBIOLOGIA, 2001, Vol. 449, poáginas 41-46, ISSN 0018-8158, todo el documento. * |
| SOTELO, G. et al., "{}Genetic identification of the northeastern Atlantic spiny spider crab as Maje brachydactyla Balss, 1922."{}, JOURNAL OF CRUSTACEAN BIOLOGY, 2008 Feb, Vol. 28, No. 1, páginas 76-81, ISSN: 0278-0372, todo el documento, en particular, Materiales y Métodos: 'DNA sequencing'; Resultados: 'Genetic differentiation for 16S'. * |
| SOTELO, G. et al., "{}Identification and characterization of microsatellite loci in the spiny spider crab Maja brachydactyla"{}, CONSERVATION GENETICS, 2007, Vol. 8, No. 1, páginas 245-247, ISSN: 1566-0621, todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2342525A1 (es) | 2010-07-07 |
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