ES2342394T3 - Supervision de la insuficiencia cardiaca. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento in vitro para identificar sujetos en riesgo de insuficiencia cardiaca después de un infarto de miocardio, que comprende analizar la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra corporal de un sujeto que ha padecido un infarto de miocardio y comparar esta concentración con una de referencia para concentraciones de metaloproteinasa de la matriz 9 en individuos que no han padecido un infarto de miocardio; en el que la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 se mide en una muestra tomada de un sujeto dentro de las 24 horas siguientes de sufrir un infarto de miocardio por el sujeto; y en el que una concentración aumentada de metaloproteinasa de la matriz 9 en la muestra corporal de un sujeto que ha padecido un infarto de miocardio sugiere que el sujeto está en riesgo de insuficiencia cardiaca.
Description
Supervisión de la insuficiencia cardiaca.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de una predisposición a desarrollar
insuficiencia cardiaca en pacientes con infarto agudo de miocardio y
también a medios para prevenir el desarrollo de dicha insuficiencia
cardiaca. El procedimiento es cualitativo y/o cuantitativo, y puede
adaptarse a la exploración a gran escala y a ensayos clínicos.
Durante las últimas décadas, los avances en el
tratamiento del infarto agudo de miocardio (IM) han dado como
resultado una reducción impresionante del 40% en la mortalidad
durante la fase aguda. Sin embargo, a pesar de estos resultados, el
desarrollo de insuficiencia cardiaca de aparición tardía después de
IM no ha disminuido significativamente y continúa asociado con un
elevado riesgo de muerte de más de 10 veces. Un mejor entendimiento
de los factores implicados en el desarrollo de insuficiencia
cardiaca de aparición tardía ayudará a identificar los pacientes de
alto riesgo que se beneficiarán más probablemente de una
intervención (Ref. 1-4).
RENKO J Y COL., junio 2004 (Ref. 18) divulgan un
procedimiento en el que se mide el nivel de MMP-9
(metaloproteinasa de la matriz 9) en sujetos con antecedentes de
infarto de miocardio (IM) y después se compara con la
MMP-9 medida en controles. RENKO J Y COL.
concluyeron que la MMP-9 está elevada en un sujeto
con antecedentes de IM; y que la MMP-9 es un factor
pronóstico significativo de IM. Además, este documento también
muestra que el alto nivel de MMP-9 en hombres con
antecedentes de IM puede reflejar una enfermedad cardiovascular (CV)
grave en curso. RENKO J Y COL divulgan además que también se
encuentra un alto nivel de MMP-9 en corazones con
insuficiencia por arteriopatía coronaria.
BLANKENBERG Y COL, abril 2003 (Ref. 19) divulga
también un procedimiento en el que se mide el nivel de
MMP-9 (metaloproteinasa de la matriz 9) en sujetos
con antecedentes de infarto de miocardio (IM) y después se compara
con la MMP-9 medida en controles (= pacientes sin
acontecimientos). BLANKENBERG Y COL. divulgan que la concentración
de MMP-9 en plasma es un factor pronóstico de muerte
cardiovascular en pacientes con arteriopatía coronaria (=
cardiopatía coronaria). BLANKENBERG Y COL. también enseñan que la
mediana basal de la concentración en plasma de
MMP-9 era superior en pacientes con IM previo y que
los pacientes con mayor concentración de MMP-9
tenían una mayor probabilidad (y por tanto, riesgo) de muerte CV; y
que existe una clara relación entre el nivel de
MMP-9 y la muerte CV.
Hasta hace poco, la evaluación de laboratorio
inicial de pacientes que presentaban infarto de miocardio estaba
constituida en su totalidad por mediciones de la creatina quinasa
(CK) y troponina. Ambos son marcadores sensibles de lesión
miocárdica y existe una correlación razonablemente buena entre los
niveles de CK y el tamaño del infarto en ausencia de reperfusión.
Sin embargo, ambos marcadores se ven enormemente afectados por un
fenómeno de lavado durante la reperfusión, que hace difícil la
interpretación de los marcadores en el entorno de la trombolisis y
la angioplastia primaria/colocación de endoprótesis vasculares, que
son actualmente el modo preferido de tratamiento de la mayoría de
los pacientes con IM agudo. De hecho, la relación entre los niveles
de CK/troponina y el tamaño del infarto o el riesgo de
acontecimientos cardiacos futuros tales como insuficiencia cardiaca
es contradictoria.
Se ha descubierto que varios marcadores de
inflamación tales como la proteína C reactiva de alta sensibilidad
(hs-CRP), el ligando CD40 soluble y la
mieloperoxidasa son factores pronóstico independientes de muerte o
infarto de miocardio no mortal a los 6 meses entre pacientes que
presentan síndromes coronarios agudos. Sin embargo, esos marcadores
no se han asociado con el desarrollo de insuficiencia cardiaca
post-IM. El péptido natriurético tipo B (BNP) es
una neurohormona cardiaca que se eleva en respuesta a sobrecarga de
presión ventricular izquierda. El BNP está siendo reconocido cada
vez más como un marcador pronóstico importante en pacientes con
insuficiencia cardiaca e IM agudo. La utilidad de la determinación
del BNP en la fase aguda del IM está limitada por fluctuaciones
rápidas en los niveles de péptidos durante las primeras 24 horas del
IM. Los niveles de BNP también se ven afectados por numerosas
comorbilidades tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica e
insuficiencia renal.
La gestión futura de pacientes con IM agudo que
reciben terapia de reperfusión con trombolisis o angioplastia
primaria/colocación de endoprótesis vasculares requiere una
estrategia para estratificar los pacientes por riesgo con mayor
precisión y orientar el tratamiento. Por consiguiente, un objeto de
la presente invención es proporcionar una nueva técnica para
identificar sujetos en riesgo de desarrollar insuficiencia cardiaca
después de IM.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona un procedimiento in vitro para
identificar sujetos en riesgo de insuficiencia cardiaca después de
un infarto de miocardio, que comprende analizar la concentración de
metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra corporal de un sujeto
que ha padecido un infarto de miocardio y comparar esta
concentración con una de referencia para concentraciones de
metaloproteinasa de la matriz 9 en individuos que no han padecido
un infarto de miocardio; en el que la concentración de
metaloproteinasa de la matriz 9 se mide en una muestra tomada de un
sujeto dentro de las 24 horas de sufrir un infarto de miocardio por
el sujeto; y en el que una concentración aumentada de
metaloproteinasa de la matriz 9 en la muestra corporal de un sujeto
que ha padecido un infarto de miocardio sugiere que el sujeto está
en riesgo de insuficiencia cardiaca.
El procedimiento proporciona además un
procedimiento in vitro para identificar un infarto de
miocardio en pacientes que padecen dolor torácico o problemas para
respirar, que comprende analizar la concentración de
metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra corporal de un
sujeto. De ahí que el procedimiento también pueda usarse por lo
tanto para identificar sujetos que padecen infarto de miocardio
(IM), en los que una concentración aumentada de metaloproteinasa de
la matriz 9 (MMP-9) en la muestra corporal sugiere
que el paciente ha padecido o padece un IM. Por el contrario, una
concentración normal de metaloproteinasa de la matriz 9 excluye la
presencia de un infarto de miocardio.
De acuerdo con un segundo aspecto de la
invención, el procedimiento comprende además,
proporcionar un kit para identificar el riesgo
de un sujeto de desarrollar insuficiencia cardiaca después de un
infarto de miocardio, comprendiendo el kit:
- (i)
- medios para determinar la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra de un sujeto que ha padecido un infarto de miocardio; y
- (ii)
- una referencia correspondiente a la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra de un individuo que no ha padecido un infarto de miocardio;
usar el kit para identificar una concentración
de metaloproteinasa de la matriz 9 en la muestra del sujeto que ha
padecido un infarto de miocardio;
usar el kit para comparar la concentración
identificada con la concentración de referencia.
El procedimiento de acuerdo con el primer
aspecto de la invención es útil para permitir al clínico tomar
decisiones con respecto al mejor curso de tratamiento para un
sujeto después de un IM agudo. Además, el procedimiento del primer
aspecto es útil para controlar la eficacia de un supuesto
tratamiento para la insuficiencia cardiaca después de un infarto de
miocardio. Por lo tanto, el kit de acuerdo con el segundo aspecto es
útil para proporcionar un pronóstico de la afección del sujeto, de
modo que el clínico pueda llevar a cabo el tratamiento de acuerdo
con el tercer aspecto. El kit también puede usarse para controlar la
eficacia de un supuesto tratamiento para insuficiencia cardiaca
después de un infarto de miocardio. Por lo tanto, el procedimiento y
el kit son muy útiles para orientar un régimen de tratamiento para
el clínico y para controlar la eficacia de dicho régimen de
tratamiento.
Los inventores se han dado cuenta de que la
remodelación ventricular y el IM recurrente son probablemente los
mecanismos más importantes de la insuficiencia cardiaca de aparición
tardía después del IM. Los inventores han reconocido que se produce
un aumento de la expresión y actividad de metaloproteinasas de la
matriz (MMP - una familia de metaloendopeptidasas neutras
dependientes de cinc) en corazones humanos y animales durante el
proceso de remodelación después de un IM. En particular, los niveles
periféricos de MMP-9 están elevados en pacientes
con síndrome coronario agudo e insuficiencia cardiaca y la deleción
dirigida de MMP-9 atenúa la dilatación ventricular
izquierda en el corazón del animal con infarto. Por lo tanto, los
inventores se dieron cuenta de que la MMP-9 es un
marcador fisiológico útil de remodelación ventricular izquierda e
insuficiencia cardiaca en pacientes con infarto agudo de
miocardio.
Los inventores han determinado que los niveles
de MMP-9 pueden medirse en pacientes con IM agudo en
el momento de la reperfusión y proporcionar una estimación útil del
riesgo en 2 años (después de un infarto) de desarrollar
remodelación ventricular izquierda e insuficiencia cardiaca.
Los marcadores que se miden actualmente en la
investigación del corazón incluyen CPK, troponina,
hc-CRP y pro-BNP. Sin embargo, no
pueden usarse para predecir la insuficiencia cardiaca después de un
infarto debido a que se ven afectados por el fenómeno de lavado
durante la reperfusión (CPK, troponina). Además, son muy inestables
durante los primeros 3 días después del infarto debido a cambios
transitorios en la hemodinámina (pro-BNP). Además,
se ven afectados por otras afecciones médicas tales como infección
(hs-CRP), EPOC y enfermedad renal
(pro-BNP). Además, la mayoría de estos marcadores se
analizan por determinación de su presencia (o ausencia) y muy
raramente por su concentración real. Por consiguiente, no es posible
determinar si la concentración de estos marcadores está aumentada o
disminuida en comparación con la concentración "normal" en
individuos que no han padecido un IM. Además, la mayoría de estos
marcadores muestran solamente si existe alguna respuesta
inflamatoria después del infarto y no el proceso de reparación del
corazón en curso.
Los inventores han establecido que los niveles
en plasma circulantes de MMP-9 en el momento del IM
sugieren el riesgo en dos años de desarrollar insuficiencia
cardiaca, que se padece a menudo después de un infarto y con
frecuencia causa la muerte. Por consiguiente, el procedimiento de
acuerdo con el primer aspecto de la invención, en el que se mide la
concentración de MMP-9, proporciona un marcador
pronóstico muy fiable para controlar el proceso de remodelación del
corazón y también proporciona indicios en relación con la morfología
del corazón después de un infarto.
El sujeto puede ser cualquier animal de interés
veterinario y para el que sea pertinente un tratamiento
post-IM (por ejemplo, gatos, perros, caballos,
etc.). Sin embargo, se prefiere que el sujeto sea un ser humano que
acaba de padecer un IM.
\newpage
En la muestra tomada del sujeto se miden los
niveles de MMP-9 dentro de las 24 horas siguientes a
un IM.
La muestra puede ser cualquier muestra corporal
en la que se secrete MMP-9 (por ejemplo, puede ser
líquido linfático o intersticial). La muestra puede ser una muestra
de orina. Sin embargo, se prefiere medir o ensayar la
MMP-9 en una muestra de sangre. La muestra de sangre
puede ser venosa o arterial. Pueden ensayarse muestras de sangre
para determinar los niveles de MMP-9 inmediatamente.
Como alternativa, la sangre puede almacenarse en una nevera o
incluso congelarse antes de que se realice el ensayo de
MMP-9. La medición de MMP-9 puede
realizarse en sangre completa. Sin embargo, en realizaciones
preferidas de la invención, la sangre puede procesarse
adicionalmente antes de que se realice un ensayo. Por ejemplo, puede
añadirse un anticoagulante, tal como heparina, citrato, EDTA y
otros. Como alternativa, la muestra de sangre puede centrifugarse
para preparar una fracción de plasma o suero para un análisis
adicional.
También se apreciará que pueden analizarse
muestras corporales "recientes" inmediatamente después de que
se hayan tomado de un sujeto. Como alternativa, las muestras pueden
congelarse (por ejemplo, sumergiendo muestras recién extraídas en
nitrógeno líquido) y almacenarse. Después, la muestra puede
descongelarse y analizarse en una fecha posterior.
La MMP-9 puede ensayarse por
varias formas conocidas por un experto en la materia. Por ejemplo,
pueden emplearse inmunoensayos, tales como los ensayos descritos en
el documento WO 00/20860, para medir los niveles de
MMP-9. También puede determinarse la
MMP-9 con análisis de transferencia de Western. Los
inmunoensayos y análisis de transferencia de Western evalúan el
nivel de proteína total de MMP-9. Sin embargo, ni
los inmunoensayos ni los análisis de Western son capaces de
determinar las concentraciones de las diferentes formas (activa o
inactiva) de MMP-9.
Por consiguiente, la concentración total de
enzima MMP-9 puede detectarse por ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo fluorométrico,
ensayo quimioluminiscente o radioinmunoensayo.
Sin embargo, un procedimiento preferido de
medición de MMP-9 implica análisis de zimografía,
y/o preferentemente, análisis de densitometría (por ejemplo, como
se divulga en el Ejemplo). Con la zimografía, se mide la
concentración de las diferentes formas (activa e inactiva) de
MMP-9.
La zimografía puede comprender una etapa de
electroforesis, una etapa de tratamiento de gel y una etapa de
tinción y, después, viene seguida preferentemente de densitometría,
como se divulga en el Ejemplo. La zimografía es una evaluación
cuantitativa de la concentración de MMP-9 (tamaño de
las bandas) y la densitometría es una evaluación cualitativa de la
MMP-9 (densidad de las bandas). Por consiguiente, la
zimografía y la densitometría generan información útil que no es
posible obtener si se usan inmunoensayos o transferencias de
Western.
Los inventores controlaron la concentración de
MMP-9 en más de 100 pacientes que había padecido un
IM en un estudio a largo plazo (2 años) y la compararon con la
concentración de MMP-9 en más de 300 individuos que
no habían padecido un IM. Se apreciará que la concentración de
MMP-9 en pacientes con IM depende mucho de cuánto
tiempo pase entre el momento del IM y el momento en que se ensayan
los niveles de MMP-9 después del IM. Se apreciará
que la concentración de MMP-9 en individuos que no
habían padecido un IM fluctúa en cierta medida, pero que de
promedio a lo largo de un periodo de tiempo dado, la concentración
tiende a ser sustancialmente constante.
Por lo tanto, los inventores observaron que la
concentración promedia de MMP-9 en individuos que no
habían padecido un IM era de <200 píxeles^{2} (según se
calculó usando el procedimiento descrito en el Ejemplo), que se
corresponde con aproximadamente 30 ng/ml. Se apreciará que éste es
un valor promedio y que un valor que se encuentre en algún punto
entre el 10% por encima y el 10% por debajo del valor indicado puede
ser igualmente concluyente en el contexto de la presente invención.
Se hace referencia a ésta en el presente documento como la
concentración "normal" de MMP-9 y se
corresponde con los valores de referencia analizados anteriormente.
Se apreciará que pueden obtenerse valores de referencia por ensayo
de muestras de control (es decir, muestras de sujetos que no han
padecido un IM). Como alternativa, los valores de referencia pueden
registrarse en una tarjeta de datos. Por consiguiente, la
referencia (ii) de acuerdo con el kit del segundo aspecto de la
invención puede ser una muestra de control (para su ensayo) o estar
en forma de una tarjeta de datos de referencia.
Además, los inventores observaron que la
concentración de MMP-9 en los individuos que habían
padecido un IM era de >200 píxeles^{2} (según se calculó
usando el procedimiento descrito en el Ejemplo). Se hace referencia
a ésta en el presente documento como la concentración
"aumentada" de MMP-9. Los inventores observaron
que existe una relación directa entre los niveles de
MMP-9 y el riesgo de desarrollar insuficiencia
cardiaca Cuanto mayor es la concentración de MMP-9,
mayor es el riesgo. Usando un análisis multifactorial, los
inventores determinaron que el valor de corte es log
MMP-9 = 6,23. Por encima de este nivel de
MMP-9, los pacientes tenían un riesgo 6,5 veces
mayor de desarrollar insuficiencia cardiaca.
Puede elaborarse una calculadora de riesgo en
forma de un gráfico y un programa informático para PC portátiles.
La calculadora de riesgo estimará el riesgo en 2 años de desarrollar
insuficiencia cardiaca después de un infarto de miocardio basándose
en los dos factores pronóstico más sólidos en el estudio de los
presentes inventores (i) el nivel de MMP-9; (ii)
los antecedentes de un infarto de miocardio previo. Es concebible
incluir además marcadores de riesgo clínico y biológico en la
calculadora de riesgo.
Por consiguiente, los inventores se han dado
cuenta de que esta diferencia en las concentraciones de
MMP-9 entre los niveles normales y aumentados puede
usarse como un marcador fisiológico, que sugiere el riesgo en dos
años de desarrollar insuficiencia cardiaca después de un IM. Se
apreciará que si un sujeto tiene una concentración aumentada de
MMP-9 que es considerablemente superior a la
concentración de MMP-9 "normal" (por ejemplo,
>300 píxeles^{2}, >400 píxeles^{2}, >500
píxeles^{2}, >600 píxeles^{2}), entonces estaría en mayor
riesgo de desarrollar insuficiencia cardiaca en los dos años
siguientes al IM, entonces, que si la concentración de
MMP-9 fuera sólo ligeramente superior a la
concentración de MMP-9 "normal" (por ejemplo,
entre 200-300 píxeles^{2}). Por consiguiente, un
clínico sería capaz de tomar una decisión en relación con el curso
de tratamiento necesario, por ejemplo, el tipo y la dosificación de
agente terapéutico a administrar.
La mayoría de los estudios cardiacos existentes
miden la presencia o ausencia de marcadores y no la concentración
real del marcador. Dichos procedimientos dependen de una técnica de
medición y detección común de ELISA en lugar de zimografía, que
determina la concentración de MMP-9 activa. El uso
de zimografía es poco común en dichos estudios puesto que requiere
mucho tiempo.
Ventajosamente, la concentración de
MMP-9 activa puede medirse en el plasma del
individuo que ha padecido el infarto de miocardio. Se sabe que
otras proteínas desempeñan un papel en la insuficiencia cardiaca
después de un infarto, por ejemplo, fosfolambán, SERCA, \betaARK.
Sin embargo, estas proteínas no pueden detectarse en el plasma de
pacientes. Además, es sorprendente que existe una correlación entre
la concentración de MMP-9 y el riesgo en dos años
de desarrollar además una insuficiencia cardiaca Se sabe que otras
proteínas desempeñan un papel en la insuficiencia cardiaca, tales
como TNF-\alpha e IL-6, y están
elevadas en el plasma de pacientes con IM. Sin embargo, no existe
relación entre la concentración de estas proteínas y el pronóstico
de cardiopatía. Por lo tanto, la medición de
TNF-\alpha e IL-6 no es de uso
clínico.
El kit de acuerdo con el segundo aspecto puede
comprender medios adecuados para determinar la concentración de
metaloproteinasa de la matriz 9 en la muestra una vez que se ha
obtenido del sujeto. Los medios de detección pueden comprender el
uso de anticuerpos acoplados a un procedimiento colorimétrico. En
este caso, el ensayo será positivo (alto riesgo) o negativo (bajo
riesgo).
El kit puede comprender una calculadora de
riesgo que incorpora el nivel de MMP-9 en forma de
un gráfico o un programa informático para PC tradicional y/o
portátil. La calculadora de riesgo puede comprender información en
relación con otros factores de riesgo, por ejemplo, antecedentes de
infarto de miocardio, diabetes y edad.
La calculadora de riesgo puede comprender
información en relación con el nivel de MMP-9 y la
presencia o ausencia de un infarto de miocardio previo.
Todas las características descritas en el
presente documento (incluyendo cualquier reivindicación, resumen y
dibujos adjuntos) y/o todas las etapas de cualquier procedimiento o
proceso desvelado de este modo pueden combinarse con cualquiera de
los aspectos anteriores en cualquier combinación, excepto
combinaciones en las que al menos algunas de dichas características
y/o etapas sean mutuamente excluyentes.
Para un mejor entendimiento de la invención, y
para mostrar cómo pueden llevarse a efecto las realizaciones de la
misma, se hará referencia ahora, a modo de ejemplo, al Ejemplo no
limitante y a los dibujos, en los que:-
la Figura 1 ilustra los niveles de
MMP-2 y MMP-9 determinados por
zimografía en gelatina en 109 pacientes con IM agudo, 142 pacientes
con dolor torácico atípico y arterias coronarias normales (sin CAD),
135 pacientes con arteriopatía coronaria estable (CAD estable) y 53
pacientes con angina inestable (USA);
la Figura 2 ilustra: (A) el curso temporal de
los niveles de MMP-9 en pacientes con IM agudo
después de la reperfusión; (B) la distribución de los niveles de
MMP-9 en pacientes con IM agudo; y muestra un patrón
bifásico con un pico de mayor tamaño y uno de menor tamaño. Se usó
un procedimiento de densidad kernel para evaluar la densidad en los
puntos especificados;
la Figura 3 ilustra la relación entre los
niveles iniciales de MMP (transformados logarítmicamente) y el
riesgo, dos años después del IM, de: (A) desarrollar insuficiencia
cardiaca NYHA clase III-IV; y (B) tener una fracción
de eyección <40%; y
Se realizaron experimentos para ilustrar que los
sujetos con niveles elevados de MMP-9 en el momento
del infarto presentan un alto riesgo de desarrollo de remodelación
ventricular izquierda e insuficiencia cardiaca de aparición tardía
durante el seguimiento.
Grupo de estudio. En el presente estudio,
se evaluaron prospectivamente 109 pacientes consecutivos con IM
agudo (<24 horas) remitidos para intervención coronaria primaria
(PCI) al Centre Hospitalier Luxembourg/Institut National de
Chirurgie Cardiaque et de Cardiologie Interventionnelle. Se definió
el IM agudo por la presencia de dolor torácico típico, la presencia
de una elevación significativa del segmento ST en dos o más
derivaciones del ECG y una elevación máxima de creatina quinasa en
plasma hasta al menos el doble de la normal (400 U/l). Todos los
pacientes se sometieron a angioplastia coronaria y colocación de
endoprótesis vasculares con el uso de abciximab a menos que
estuviera contraindicado. Se tomaron muestras de sangre en el
momento de la PCI. Se realizó un seguimiento de los pacientes en
intervalos de 6 meses para cualquier acontecimiento cardiaco
importante o el desarrollo de insuficiencia cardiaca clase NYHA
III-IV.
Para evaluar la fracción de eyección y los
volúmenes ventriculares izquierdos, los supervivientes a largo
plazo se sometieron a una ventriculografía con radionúclidos 2 años
(media de 24 meses, 11-37 meses) después del IM. Se
determinó la fracción de eyección ventricular izquierda (FE), el
volumen telediastólico (VTD) y el volumen telesistólico (VTS) de
forma semiautomática. El investigador que realizaba la lectura de
los estudios nucleares ignoraba el estado clínico de los pacientes
o sus parámetros biológicos. Todos los pacientes firmaron un
consentimiento informado y el estudio se autorizó por el Comité de
Ética local.
Mediciones. Todas las muestras de sangre
se congelaron a -70ºC hasta su análisis. Se determinaron las
actividades de MMP-2 y MMP-9 usando
análisis de zimografía y densitometría. En resumen, se cargaron
cantidades equivalentes de plasma (1 \mul) en un gel
electroforesis de SDS-poliacrilamida al 10%
copolimerizado con gelatinasa A y B (0,5 mg/ml cada una) como los
sustratos. Se midieron los niveles de proteína C reactiva de alta
sensibilidad (hs-CRP) y propéptido natriurético
cerebral (pro-BNP) con un inmunoensayo enzimático
tipo sándwich. Se determinó el factor de necrosis tumoral \alpha
(TNF-\alpha) con un ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzimas.
Zimografía. El objetivo era preparar un
análisis zimográfico de metaloproteinasa de la matriz 2 y 9 por su
capacidad para escindir gelatina A y B, respectivamente. El
procedimiento incluía una electroforesis, un tratamiento de gel y
una etapa de tinción, seguida de densitometría.
- (i)
- Limpiar dos placas de vidrio con etanol al 70%;
- (ii)
- sujetarlas en el soporte vertical;
- (iii)
- rellenarlas con agua destilada para comprobar que no se producen fugas.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El tampón de procesamiento se vertió primero
hasta 1 cm por debajo del peine. Se añadió rápidamente 1 ml de
isobutanol saturado en agua. Se dejó que el gel polimerizara durante
aproximadamente 30 min. Se aspiró el isobutanol con papel
absorbente y después se lavó con agua destilada. Se vertió el gel de
apilamiento y el peine se ajustó asegurándose de evitar que
quedaran burbujas de aire.
Cuando se había completado la polimerización (30
min), el peine se retiró lentamente y después los pocillos se
aclararon con tampón de procesamiento.
Las muestras se prepararon en hielo con el
tampón de muestras de Tris-glicina SDS 2x. Los
patrones se diluyeron para cargar el mismo el volumen y después se
dejó que se asentaran durante 10 minutos antes de la carga. Los
geles se colocaron en el soporte y el depósito se rellenó con tampón
de procesamiento. Se cargaron las muestras y los patrones de peso
molecular, así como los controles positivos de MMP2 y MMP9. Se dejó
que las muestras migraran durante 2 horas, con el voltaje ajustado
a 100 V.
- (i)
- Renaturalización - Los geles se dejaron en remojo con agitación suave tres veces durante 20 minutos en 50 ml de tampón de renaturalización.
- (ii)
- Desarrollo - Los geles se aclararon con 10 ml de tampón de desarrollo. Los geles se equilibraron con 50 ml de tampón de desarrollo durante 30 minutos a temperatura ambiente. El tampón se sustituyó con 50 ml de tampón nuevo y se incubó durante una noche a 37ºC.
- (iii)
- Tinción - Los geles se dejaron en remojo durante 15 minutos en solución de tinción.
- (iv)
- Decoloración - Los geles se dejaron en remojo en tampón de decoloración durante 5 minutos.
- (v)
- Tampón de contraste - Los geles se dejaron en remojo en tampón de contraste hasta el momento en el que se secaron.
- Procedimiento de exploración
- Densitometría
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- Triton X-100 al 2,5% en agua destilada.
\newpage
- Tris 0,5 M, Brij 35 al 0,2%, NaCl_{2} 50mM, pH 7,6.
-
8
\vskip1.000000\baselineskip
- Metanol al 40% v/v, ácido acético al 10% v/v, azul de Coomassie al 0,1% p/v.
-
9
\vskip1.000000\baselineskip
- Metanol al 30% v/v, ácido acético al 10% v/v.
-
10
\vskip1.000000\baselineskip
- Glicerol al 5% v/v, ácido acético al 10% v/v.
-
11
\vskip1.000000\baselineskip
Caracterización de MMP. Para definir
mejor los niveles periféricos de MMP, los inventores realizaron
estudios adicionales. En primer lugar, los inventores midieron los
niveles de MMP-2 y MMP-9 el día 0,
el día 1 y el día 3 en pacientes con IM agudo (n = 20) para evaluar
el curso temporal de liberación de MMP después de un IM. En segundo
lugar, los inventores midieron la MMP-2,
MMP-9, hs-CRP y
TNF-\alpha en pacientes consecutivos sin IM que
se estaban sometiendo a angiografía coronaria, que presentaban
angina inestable (n = 53), angina estable (n = 135) o dolor
torácico atípico con arterias coronarias normales (n = 142). En
tercer lugar, los inventores midieron los niveles de
MMP-9 a intervalos de 3 meses en pacientes con ICC
estable (n = 15).
Se obtuvieron índices estadísticos descriptivos
como medias, desviaciones típicas y porcentajes según fuera
apropiado para describir la población estudiada. Se usó ANOVA
unidireccional para comparar los valores medios entre grupos de
pacientes observados definidos por un acontecimiento clasificatorio
(es decir, grupos definidos por una puntuación de NYHA de
seguimiento de III-IV o una fracción de eyección de
\leq40%). En el caso de un ensayo de Shapiro-Wilk
significativo para datos normales, se usó un ensayo de
Mann-Withney no paramétrico. Se realizó una
correlación y regresión lineal para estudiar la relación entre
factores pronóstico biológicos. Se usó un modelo de regresión
logística para investigar la asociación de la puntuación de NYHA en
2 años con las características de los pacientes y los factores
pronóstico biológicos. Después, se usó un modelo de regresión
logística para modelar la fracción de eyección (\leq40%, >40%)
en 2 años con las características del paciente y los factores
pronóstico biológicos.
La construcción de modelos se desarrolló con
eliminación hacia atrás por etapas, que requería una p < 0,05
para significación, partiendo de un modelo que contenía todas las
variables. Después de la selección final, se ensayaron
interacciones de variables siguiendo el mismo procedimiento. Se usó
el ensayo de \chi^{2} de Wald y el ensayo de cociente de
verosimilitudes para evaluar la significación de variables en el
modelo. Un valor de p < 0,05 se consideraba estadísticamente
significativo. Todos los ensayos eran bilaterales. Los análisis
estadísticos se realizaron con el paquete estadístico Intercooled
Stata versión 7.0 (Stata Corporation, College Station, Texas,
Estados Unidos).
Las características clínicas basales de los
pacientes con y sin desarrollo de ICC durante el seguimiento se
resumen en la Tabla 1. De los 109 pacientes con IM agudo, 11
pacientes murieron y 15 pacientes desarrollaron insuficiencia
cardiaca NYHA clase III-IV durante el seguimiento de
2 años. Se perdieron siete pacientes durante el seguimiento.
Los niveles de MMP-2 no estaban
aumentados en pacientes en IM agudo, como se ilustra en la Figura 1.
Sin embargo, como puede observarse en la Figura 1, al contrario que
la MMP-2, los niveles de MMP-9
estaban significativamente aumentados en el momento de la
reperfusión (p < 0,001). Los pacientes con arteriopatía coronaria
estable o inestable no mostraban ninguna elevación de la
MMP-9. Los niveles de hs-CRP estaban
aumentados 4,6 veces en pacientes con IM agudo en comparación con
pacientes sin arteriopatía coronaria (p < 0,001). Curiosamente,
no existía correlación entre la MMP-9 y la
hs-CRP (p = 0,23). De forma similar, se descubrió
que el pro-BNP estaba aumentado en pacientes con IM
agudo sin ninguna correlación con los niveles de
MMP-9 (p = 0,92). Sin embargo, los niveles de
MMP-9 se correlacionaban con los niveles de CPK (p
< 0,0001) y TNF-\alpha (p = 0,005). Este era
un primer indicio de que la MMP-9 podía estar
relacionada con el tamaño del infarto.
Los inventores registraron niveles máximos de
MMP-9 en el momento de la presentación inicial que,
en el estudio de los presentes inventores, se correspondía con las
primeras 24 horas después de la aparición de los síntomas, como se
ilustra en la Figura 2A. A partir de entonces, la
MMP-9 disminuía lentamente. Los inventores
observaron una distribución bifásica de los valores de
MMP-9 entre los pacientes con IM agudo con un primer
pico principal y un segundo pico más pequeño, como se ilustra en la
Figura 2B. El grupo de pacientes con ICC estable sin IM y con FE
< 40% tenían niveles elevados de MMP-9 que no
variaban significativamente en el transcurso de 3 meses (no se
muestran los datos).
Como se muestra en la Tabla 2, los pacientes con
altos niveles de MMP-9 en el momento del infarto era
más probable que desarrollaran insuficiencia cardiaca durante su
evolución post-IM. De hecho, la clase funcional de
la NYHA en el seguimiento de 2 años era superior en pacientes con
MMP-9 inicial elevada (p < 0,02). Esto era
independiente del tratamiento con beta-bloqueantes o
inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina. Usando un
análisis multifactorial, los presentes inventores establecieron que
los pacientes con altos niveles iniciales de MMP-9
(por encima del valor de corte del Log MMP-9 = 6,23)
tenían una OR de 6,5 (IC 95% 1,7-25,3, p <
0,006) de desarrollar insuficiencia cardiaca de aparición tardía
clase III-IV. El impacto de la MMP-9
sobre el desarrollo de la insuficiencia cardiaca después de un IM
se muestra en la Figura. 3.
En la Tabla 2: Se realizó un seguimiento de los
pacientes con IM agudo (n = 109) para el desarrollo de ICC y se
evaluó su función cardiaca con ventriculografía con radionúclidos a
los 2 años. Se midieron los factores circulantes en el momento del
IM y se compararon entre pacientes con y sin desarrollo de ICC. *
Análisis de varianza unidireccional. ** Ensayo de
Mann-Withney no parámetrico. ICC, insuficiencia
cardiaca congestiva, FE, fracción de eyección, VTD, volumen
telediastólico, VTS, volumen telesistólico, TNF, factor de necrosis
tumoral \alpha, BNP, péptido natriurético cerebral, CRP, proteína
C reactiva, CPK, creatina quinasa, MMP, metaloproteinasa de la
matriz.
Estos resultados se corroboraron por las
mediciones de la función y de los volúmenes cardiacos en el
seguimiento de 2 años, como se ilustra en la Tabla 2 y en la Figura
3. De hecho, los pacientes con niveles de MMP-9
iniciales elevados era más probable que desarrollaran remodelación
y disfunción ventricular izquierda (%FE 43 \pm 9 frente a 52
\pm 11, p < 0,03). El impacto de los niveles de
MMP-9 iniciales sobre la FE se representa en la
Figura 3. Todos los demás parámetros biológicos determinados en el
presente estudio (TNF-\alpha,
pro-BNP, hs-CRP, creatina quinasa y
MMP-2) también eran ligeramente superiores en
pacientes que posteriormente desarrollarían insuficiencia cardiaca
(Tabla 2). Sin embargo, la diferencia no era estadísticamente
significativa y el análisis multifactorial sólo identificó a la
MMP-9 como factor pronóstico de insuficiencia
cardiaca de aparición tardía post-IM.
Es notable que los pacientes con antecedentes de
IM tenían una OR de 5,6 (IC 95% 1,3-24,3, p = 0,02)
de desarrollar insuficiencia cardiaca de aparición tardía después
de un IM. El análisis multifactorial también identificó
antecedentes de ingestión de aspirina en la presentación como un
factor protector frente al desarrollo de insuficiencia cardiaca (OR
de 0,15, IC 95% 0,04-0,6, p = 0,007).
Estos datos ilustran que los pacientes con
niveles elevados de MMP-9 en el momento del infarto
presentan un alto riesgo de insuficiencia cardiaca después de un IM
(muy probablemente como resultado de la remodelación ventricular
izquierda). La medición de los niveles de MMP-9
representa un mejor indicador de riesgo de pacientes en riesgo de
insuficiencia cardiaca, después de un IM, que
pro-BNP, TNF-\alpha,
hs-CRP o creatina quinasa. De hecho, una sola
determinación de la MMP-9 en el momento de la
terapia de reperfusión era capaz de determinar los pacientes en
alto riesgo (OR de 6,5) para el desarrollo de insuficiencia cardiaca
de aparición tardía NYHA clase III-IV y FE <
40%.
El éxito de las terapias de reperfusión modernas
ha dado como resultado una proporción creciente de supervivientes a
infartos (Ref. 1-4). Sin embargo, el riesgo de
desarrollar ICC post-IM no ha disminuido, y
probablemente aumentará, ya que la proporción de supervivientes
aumentará adicionalmente por la implantación de desfibriladores
automáticos (Ref. 11). Por lo tanto, la ICC después de un IM
continúa siendo un problema importante. Los pacientes que
desarrollan ICC días después de un IM tienen una alta tasa de
mortalidad en el hospital. No obstante, se sabe poco acerca de los
factores pronóstico de la ICC de aparición tardía (años) después de
un IM. El análisis del estudio CARE ha puesto de manifiesto que los
factores pronóstico clínicos más importantes de la ICC de aparición
tardía post-IM son la edad, FE, diabetes,
hipertensión e IM previo. Los antecedentes de IM también eran un
factor pronóstico importante de ICC de aparición tardía en el
estudio de los presentes inventores. Algunos de estos factores son
similares a los factores pronóstico de la ICC aguda después de un
IM, tales como la edad y la diabetes.
Entre los factores circulantes que reflejan la
función ventricular izquierda, el pro-BNP está
siendo reconocido cada vez más como un marcador pronóstico
importante en pacientes con insuficiencia cardiaca e IM agudo (Ref.
12-15). Los resultados de niveles elevados de
pro-BNP en pacientes con IM agudo confirman esos
informes. Es digno de mención que los estudios previos que
evaluaban el pro-BNP en el IM agudo han incluido muy
pocos pacientes con angioplastia primaria y colocación de
endoprótesis vasculares. Además, la utilidad de la determinación
del BNP en la fase aguda del IM está limitada por las fluctuaciones
rápidas en los niveles de péptidos durante las primeras 24 horas
del IM. Los niveles de BNP también se ven afectados por numerosas
comorbilidades tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica e
insuficiencia renal.
Los resultados concuerdan con el descubrimiento
descrito de que los niveles periféricos de MMP-9
aumentan de dos a tres veces después de un infarto de miocardio
(Ref. 5-10). Los inventores observaron una
correlación entre los niveles de creatina quinasa y
MMP-9. Este hecho puede deberse a una población de
pacientes heterogénea más pequeña, recibiendo sólo 9 pacientes
terapia de reperfusión, en comparación con el grupo de IM agudo de
los presentes inventores, en el que todos los pacientes se
sometieron a angioplastia coronaria y colocación de endoprótesis
vasculares, en la mayoría con el uso de abciximab.
Este es el primer informe que demuestra que la
MMP-9 es un factor pronóstico independiente potente
de remodelación ventricular izquierda e ICC después de un IM. Los
niveles de MMP-9 en plasma postmiocárdicos tempranos
tenían una relación inversa significativa con la función y el
tamaño ventricular izquierdo a los 2 años. Este no era el caso para
la creatina quinasa o el pro-BNP. Esto se explica
potencialmente por el hecho de que la MMP-9 puede
verse menos afectada por el fenómeno de lavado y los cambios
hemodinámicos transitorios en el momento de la reperfusión, que
complican la interpretación de los niveles de creatina quinasa y
pro-BNP. En estudios por Omland y col., y Richards
y col., sólo aproximadamente la mitad de los pacientes recibieron
terapia de reperfusión con trombolisis y los niveles de BNP se
determinaron del día 2 al 4, después del IM, cuando los niveles de
péptidos estaban en un estado estacionario.
Hasta ahora, los estudios clínicos que
investigaban los niveles de MMP-9 concluían que los
niveles elevados se debían al proceso de ruptura de placas
arteriales coronarias. Sin embargo, en vista de los estudios
animales recientes, parece más probable que los neutrófilos que
infiltran el miocardio infartado sean la fuente principal de
MMP-9 en el entorno del IM agudo (Ref.
16-17). La MMP-9 actúa probablemente
directamente sobre el miocardio como una proteasa y facilita la
infiltración de neutrófilos y la desgranulación, exacerbando la
lesión isquémica. Esto puede explicar por qué la
MMP-9 parece ser un marcador preciso para determinar
el grado de la lesión. Varios investigadores han buscando entender
los beneficios terapéuticos potenciales de la inhibición de NEAP.
Por ejemplo, las observaciones en el modelo de ratón transgénico de
TNF-\alpha indican que la inhibición de MMP tiene
una ventana de oportunidad estrecha en la fase temprana de la
remodelación. De hecho, la inhibición de MUMP no tenía efecto
beneficioso sobre la función y el tamaño ventricular en ratones de
edad avanzada con ICC establecida.
Muchas citocinas, incluyendo
TNF-\alpha y factores de crecimiento
transformante, inducen la expresión de MMP. En el presente estudio,
los niveles periféricos de TNF-\alpha estaban sólo
ligeramente elevados en el momento del infarto de miocardio. No
obstante, existía una correlación positiva entre los niveles de
MMP-9 y TNF-\alpha que concuerda
con la noción de que la cascada de citocinas se inicia por el
TNF-\alpha durante la lesión miocárdica.
Al contrario que los informes previos, los
inventores no observaron una elevación de los niveles de
MMP-2 en el momento del IM. La diferencia entre el
presente estudio y la técnica anterior puede estar relacionada
posiblemente con una técnica analítica diferente. Usando zimografía,
los inventores midieron la actividad enzimática de las MMP, que
refleja el estado biológico, mientras que los inmunoensayos usados
en el estudio anterior no distinguían entre la forma de proenzima
activa e inactiva de las MMP.
En conclusión, la MMP-9 es un
marcador robusto y muy temprano de remodelación ventricular
izquierda en pacientes con IM agudo y, particularmente, los
tratados con angioplastia primaria y colocación de endoprótesis
vasculares. Por lo tanto, la MMP-9 es útil como
marcador de pronóstico de acuerdo con la presente invención y puede
usarse para orientar el tratamiento y demostrar la presencia de un
infarto de miocardio.
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XP002904146 ISSN: 0009-7322.
Claims (10)
1. Un procedimiento in vitro para
identificar sujetos en riesgo de insuficiencia cardiaca después de
un infarto de miocardio, que comprende analizar la concentración de
metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra corporal de un
sujeto que ha padecido un infarto de miocardio y comparar esta
concentración con una de referencia para concentraciones de
metaloproteinasa de la matriz 9 en individuos que no han padecido un
infarto de miocardio; en el que la concentración de
metaloproteinasa de la matriz 9 se mide en una muestra tomada de un
sujeto dentro de las 24 horas siguientes de sufrir un infarto de
miocardio por el sujeto; y en el que una concentración aumentada de
metaloproteinasa de la matriz 9 en la muestra corporal de un sujeto
que ha padecido un infarto de miocardio sugiere que el sujeto está
en riesgo de insuficiencia cardiaca.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la muestra es una muestra de sangre o
una muestra de orina.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que la muestra de sangre u orina se analiza
inmediatamente después de tomarse del sujeto.
4. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la muestra de
sangre u orina se congela y se almacena antes de descongelarse y
analizarse.
5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de
metaloproteinasa de la matriz-9 se mide por
zimografía.
6. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que la zimografía comprende una etapa de
electroforesis, una etapa de tratamiento de gel y una etapa de
tinción.
7. El procedimiento de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior, en el que la concentración de
metaloproteinasa de la matriz 9 se mide por zimografía y
densitometría.
8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de
metaloproteinasa de la matriz 9 se mide por ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzimas (ELISA), ensayo fluorométrico, ensayo
quimioluminiscente o radioinmunoensayo.
9. El procedimiento de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior, en el que la muestra es una muestra de
sangre y en el que la concentración aumentada de metaloproteinasa de
la matriz 9 es superior a 30 ng/ml o 200 píxeles^{2}.
10. El procedimiento de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior, que comprende además
- -
- proporcionar un kit para identificar el riesgo de un sujeto de desarrollar insuficiencia cardiaca después de un infarto de miocardio, comprendiendo el kit:
- (i)
- medios para determinar la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra de un sujeto que ha padecido un infarto de miocardio; y
- (ii)
- una referencia correspondiente a la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra de un individuo que no ha padecido un infarto de miocardio,
- -
- usar el kit para identificar una concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en la muestra del sujeto que ha padecido un infarto de miocardio;
- -
- usar el kit para comparar la concentración identificada con la concentración de referencia.
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