ES2342394T3

ES2342394T3 - Supervision de la insuficiencia cardiaca.

Info

Publication number: ES2342394T3
Application number: ES04763439T
Authority: ES
Inventors: Daniel Wagner
Original assignee: Centre de Recherche Public de la Sante
Current assignee: Centre de Recherche Public de la Sante
Priority date: 2004-07-23
Filing date: 2004-07-23
Publication date: 2010-07-06
Anticipated expiration: 2024-07-23
Also published as: ATE463743T1; WO2006007869A1; US20060029993A1; EP1782068A1; US7319017B2; PL1782068T3; DK1782068T3; EP1782068B1; DE602004026488D1

Abstract

Un procedimiento in vitro para identificar sujetos en riesgo de insuficiencia cardiaca después de un infarto de miocardio, que comprende analizar la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra corporal de un sujeto que ha padecido un infarto de miocardio y comparar esta concentración con una de referencia para concentraciones de metaloproteinasa de la matriz 9 en individuos que no han padecido un infarto de miocardio; en el que la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 se mide en una muestra tomada de un sujeto dentro de las 24 horas siguientes de sufrir un infarto de miocardio por el sujeto; y en el que una concentración aumentada de metaloproteinasa de la matriz 9 en la muestra corporal de un sujeto que ha padecido un infarto de miocardio sugiere que el sujeto está en riesgo de insuficiencia cardiaca.

Description

Supervisión de la insuficiencia cardiaca.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de una predisposición a desarrollar insuficiencia cardiaca en pacientes con infarto agudo de miocardio y también a medios para prevenir el desarrollo de dicha insuficiencia cardiaca. El procedimiento es cualitativo y/o cuantitativo, y puede adaptarse a la exploración a gran escala y a ensayos clínicos.

Durante las últimas décadas, los avances en el tratamiento del infarto agudo de miocardio (IM) han dado como resultado una reducción impresionante del 40% en la mortalidad durante la fase aguda. Sin embargo, a pesar de estos resultados, el desarrollo de insuficiencia cardiaca de aparición tardía después de IM no ha disminuido significativamente y continúa asociado con un elevado riesgo de muerte de más de 10 veces. Un mejor entendimiento de los factores implicados en el desarrollo de insuficiencia cardiaca de aparición tardía ayudará a identificar los pacientes de alto riesgo que se beneficiarán más probablemente de una intervención (Ref. 1-4).

RENKO J Y COL., junio 2004 (Ref. 18) divulgan un procedimiento en el que se mide el nivel de MMP-9 (metaloproteinasa de la matriz 9) en sujetos con antecedentes de infarto de miocardio (IM) y después se compara con la MMP-9 medida en controles. RENKO J Y COL. concluyeron que la MMP-9 está elevada en un sujeto con antecedentes de IM; y que la MMP-9 es un factor pronóstico significativo de IM. Además, este documento también muestra que el alto nivel de MMP-9 en hombres con antecedentes de IM puede reflejar una enfermedad cardiovascular (CV) grave en curso. RENKO J Y COL divulgan además que también se encuentra un alto nivel de MMP-9 en corazones con insuficiencia por arteriopatía coronaria.

BLANKENBERG Y COL, abril 2003 (Ref. 19) divulga también un procedimiento en el que se mide el nivel de MMP-9 (metaloproteinasa de la matriz 9) en sujetos con antecedentes de infarto de miocardio (IM) y después se compara con la MMP-9 medida en controles (= pacientes sin acontecimientos). BLANKENBERG Y COL. divulgan que la concentración de MMP-9 en plasma es un factor pronóstico de muerte cardiovascular en pacientes con arteriopatía coronaria (= cardiopatía coronaria). BLANKENBERG Y COL. también enseñan que la mediana basal de la concentración en plasma de MMP-9 era superior en pacientes con IM previo y que los pacientes con mayor concentración de MMP-9 tenían una mayor probabilidad (y por tanto, riesgo) de muerte CV; y que existe una clara relación entre el nivel de MMP-9 y la muerte CV.

Hasta hace poco, la evaluación de laboratorio inicial de pacientes que presentaban infarto de miocardio estaba constituida en su totalidad por mediciones de la creatina quinasa (CK) y troponina. Ambos son marcadores sensibles de lesión miocárdica y existe una correlación razonablemente buena entre los niveles de CK y el tamaño del infarto en ausencia de reperfusión. Sin embargo, ambos marcadores se ven enormemente afectados por un fenómeno de lavado durante la reperfusión, que hace difícil la interpretación de los marcadores en el entorno de la trombolisis y la angioplastia primaria/colocación de endoprótesis vasculares, que son actualmente el modo preferido de tratamiento de la mayoría de los pacientes con IM agudo. De hecho, la relación entre los niveles de CK/troponina y el tamaño del infarto o el riesgo de acontecimientos cardiacos futuros tales como insuficiencia cardiaca es contradictoria.

Se ha descubierto que varios marcadores de inflamación tales como la proteína C reactiva de alta sensibilidad (hs-CRP), el ligando CD40 soluble y la mieloperoxidasa son factores pronóstico independientes de muerte o infarto de miocardio no mortal a los 6 meses entre pacientes que presentan síndromes coronarios agudos. Sin embargo, esos marcadores no se han asociado con el desarrollo de insuficiencia cardiaca post-IM. El péptido natriurético tipo B (BNP) es una neurohormona cardiaca que se eleva en respuesta a sobrecarga de presión ventricular izquierda. El BNP está siendo reconocido cada vez más como un marcador pronóstico importante en pacientes con insuficiencia cardiaca e IM agudo. La utilidad de la determinación del BNP en la fase aguda del IM está limitada por fluctuaciones rápidas en los niveles de péptidos durante las primeras 24 horas del IM. Los niveles de BNP también se ven afectados por numerosas comorbilidades tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica e insuficiencia renal.

La gestión futura de pacientes con IM agudo que reciben terapia de reperfusión con trombolisis o angioplastia primaria/colocación de endoprótesis vasculares requiere una estrategia para estratificar los pacientes por riesgo con mayor precisión y orientar el tratamiento. Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar una nueva técnica para identificar sujetos en riesgo de desarrollar insuficiencia cardiaca después de IM.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento in vitro para identificar sujetos en riesgo de insuficiencia cardiaca después de un infarto de miocardio, que comprende analizar la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra corporal de un sujeto que ha padecido un infarto de miocardio y comparar esta concentración con una de referencia para concentraciones de metaloproteinasa de la matriz 9 en individuos que no han padecido un infarto de miocardio; en el que la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 se mide en una muestra tomada de un sujeto dentro de las 24 horas de sufrir un infarto de miocardio por el sujeto; y en el que una concentración aumentada de metaloproteinasa de la matriz 9 en la muestra corporal de un sujeto que ha padecido un infarto de miocardio sugiere que el sujeto está en riesgo de insuficiencia cardiaca.

El procedimiento proporciona además un procedimiento in vitro para identificar un infarto de miocardio en pacientes que padecen dolor torácico o problemas para respirar, que comprende analizar la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra corporal de un sujeto. De ahí que el procedimiento también pueda usarse por lo tanto para identificar sujetos que padecen infarto de miocardio (IM), en los que una concentración aumentada de metaloproteinasa de la matriz 9 (MMP-9) en la muestra corporal sugiere que el paciente ha padecido o padece un IM. Por el contrario, una concentración normal de metaloproteinasa de la matriz 9 excluye la presencia de un infarto de miocardio.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, el procedimiento comprende además,

proporcionar un kit para identificar el riesgo de un sujeto de desarrollar insuficiencia cardiaca después de un infarto de miocardio, comprendiendo el kit:

(i): medios para determinar la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra de un sujeto que ha padecido un infarto de miocardio; y

(ii): una referencia correspondiente a la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra de un individuo que no ha padecido un infarto de miocardio;

usar el kit para identificar una concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en la muestra del sujeto que ha padecido un infarto de miocardio;

usar el kit para comparar la concentración identificada con la concentración de referencia.

El procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la invención es útil para permitir al clínico tomar decisiones con respecto al mejor curso de tratamiento para un sujeto después de un IM agudo. Además, el procedimiento del primer aspecto es útil para controlar la eficacia de un supuesto tratamiento para la insuficiencia cardiaca después de un infarto de miocardio. Por lo tanto, el kit de acuerdo con el segundo aspecto es útil para proporcionar un pronóstico de la afección del sujeto, de modo que el clínico pueda llevar a cabo el tratamiento de acuerdo con el tercer aspecto. El kit también puede usarse para controlar la eficacia de un supuesto tratamiento para insuficiencia cardiaca después de un infarto de miocardio. Por lo tanto, el procedimiento y el kit son muy útiles para orientar un régimen de tratamiento para el clínico y para controlar la eficacia de dicho régimen de tratamiento.

Los inventores se han dado cuenta de que la remodelación ventricular y el IM recurrente son probablemente los mecanismos más importantes de la insuficiencia cardiaca de aparición tardía después del IM. Los inventores han reconocido que se produce un aumento de la expresión y actividad de metaloproteinasas de la matriz (MMP - una familia de metaloendopeptidasas neutras dependientes de cinc) en corazones humanos y animales durante el proceso de remodelación después de un IM. En particular, los niveles periféricos de MMP-9 están elevados en pacientes con síndrome coronario agudo e insuficiencia cardiaca y la deleción dirigida de MMP-9 atenúa la dilatación ventricular izquierda en el corazón del animal con infarto. Por lo tanto, los inventores se dieron cuenta de que la MMP-9 es un marcador fisiológico útil de remodelación ventricular izquierda e insuficiencia cardiaca en pacientes con infarto agudo de miocardio.

Los inventores han determinado que los niveles de MMP-9 pueden medirse en pacientes con IM agudo en el momento de la reperfusión y proporcionar una estimación útil del riesgo en 2 años (después de un infarto) de desarrollar remodelación ventricular izquierda e insuficiencia cardiaca.

Los marcadores que se miden actualmente en la investigación del corazón incluyen CPK, troponina, hc-CRP y pro-BNP. Sin embargo, no pueden usarse para predecir la insuficiencia cardiaca después de un infarto debido a que se ven afectados por el fenómeno de lavado durante la reperfusión (CPK, troponina). Además, son muy inestables durante los primeros 3 días después del infarto debido a cambios transitorios en la hemodinámina (pro-BNP). Además, se ven afectados por otras afecciones médicas tales como infección (hs-CRP), EPOC y enfermedad renal (pro-BNP). Además, la mayoría de estos marcadores se analizan por determinación de su presencia (o ausencia) y muy raramente por su concentración real. Por consiguiente, no es posible determinar si la concentración de estos marcadores está aumentada o disminuida en comparación con la concentración "normal" en individuos que no han padecido un IM. Además, la mayoría de estos marcadores muestran solamente si existe alguna respuesta inflamatoria después del infarto y no el proceso de reparación del corazón en curso.

Los inventores han establecido que los niveles en plasma circulantes de MMP-9 en el momento del IM sugieren el riesgo en dos años de desarrollar insuficiencia cardiaca, que se padece a menudo después de un infarto y con frecuencia causa la muerte. Por consiguiente, el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en el que se mide la concentración de MMP-9, proporciona un marcador pronóstico muy fiable para controlar el proceso de remodelación del corazón y también proporciona indicios en relación con la morfología del corazón después de un infarto.

El sujeto puede ser cualquier animal de interés veterinario y para el que sea pertinente un tratamiento post-IM (por ejemplo, gatos, perros, caballos, etc.). Sin embargo, se prefiere que el sujeto sea un ser humano que acaba de padecer un IM.

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En la muestra tomada del sujeto se miden los niveles de MMP-9 dentro de las 24 horas siguientes a un IM.

La muestra puede ser cualquier muestra corporal en la que se secrete MMP-9 (por ejemplo, puede ser líquido linfático o intersticial). La muestra puede ser una muestra de orina. Sin embargo, se prefiere medir o ensayar la MMP-9 en una muestra de sangre. La muestra de sangre puede ser venosa o arterial. Pueden ensayarse muestras de sangre para determinar los niveles de MMP-9 inmediatamente. Como alternativa, la sangre puede almacenarse en una nevera o incluso congelarse antes de que se realice el ensayo de MMP-9. La medición de MMP-9 puede realizarse en sangre completa. Sin embargo, en realizaciones preferidas de la invención, la sangre puede procesarse adicionalmente antes de que se realice un ensayo. Por ejemplo, puede añadirse un anticoagulante, tal como heparina, citrato, EDTA y otros. Como alternativa, la muestra de sangre puede centrifugarse para preparar una fracción de plasma o suero para un análisis adicional.

También se apreciará que pueden analizarse muestras corporales "recientes" inmediatamente después de que se hayan tomado de un sujeto. Como alternativa, las muestras pueden congelarse (por ejemplo, sumergiendo muestras recién extraídas en nitrógeno líquido) y almacenarse. Después, la muestra puede descongelarse y analizarse en una fecha posterior.

La MMP-9 puede ensayarse por varias formas conocidas por un experto en la materia. Por ejemplo, pueden emplearse inmunoensayos, tales como los ensayos descritos en el documento WO 00/20860, para medir los niveles de MMP-9. También puede determinarse la MMP-9 con análisis de transferencia de Western. Los inmunoensayos y análisis de transferencia de Western evalúan el nivel de proteína total de MMP-9. Sin embargo, ni los inmunoensayos ni los análisis de Western son capaces de determinar las concentraciones de las diferentes formas (activa o inactiva) de MMP-9.

Por consiguiente, la concentración total de enzima MMP-9 puede detectarse por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo fluorométrico, ensayo quimioluminiscente o radioinmunoensayo.

Sin embargo, un procedimiento preferido de medición de MMP-9 implica análisis de zimografía, y/o preferentemente, análisis de densitometría (por ejemplo, como se divulga en el Ejemplo). Con la zimografía, se mide la concentración de las diferentes formas (activa e inactiva) de MMP-9.

La zimografía puede comprender una etapa de electroforesis, una etapa de tratamiento de gel y una etapa de tinción y, después, viene seguida preferentemente de densitometría, como se divulga en el Ejemplo. La zimografía es una evaluación cuantitativa de la concentración de MMP-9 (tamaño de las bandas) y la densitometría es una evaluación cualitativa de la MMP-9 (densidad de las bandas). Por consiguiente, la zimografía y la densitometría generan información útil que no es posible obtener si se usan inmunoensayos o transferencias de Western.

Los inventores controlaron la concentración de MMP-9 en más de 100 pacientes que había padecido un IM en un estudio a largo plazo (2 años) y la compararon con la concentración de MMP-9 en más de 300 individuos que no habían padecido un IM. Se apreciará que la concentración de MMP-9 en pacientes con IM depende mucho de cuánto tiempo pase entre el momento del IM y el momento en que se ensayan los niveles de MMP-9 después del IM. Se apreciará que la concentración de MMP-9 en individuos que no habían padecido un IM fluctúa en cierta medida, pero que de promedio a lo largo de un periodo de tiempo dado, la concentración tiende a ser sustancialmente constante.

Por lo tanto, los inventores observaron que la concentración promedia de MMP-9 en individuos que no habían padecido un IM era de <200 píxeles^{2} (según se calculó usando el procedimiento descrito en el Ejemplo), que se corresponde con aproximadamente 30 ng/ml. Se apreciará que éste es un valor promedio y que un valor que se encuentre en algún punto entre el 10% por encima y el 10% por debajo del valor indicado puede ser igualmente concluyente en el contexto de la presente invención. Se hace referencia a ésta en el presente documento como la concentración "normal" de MMP-9 y se corresponde con los valores de referencia analizados anteriormente. Se apreciará que pueden obtenerse valores de referencia por ensayo de muestras de control (es decir, muestras de sujetos que no han padecido un IM). Como alternativa, los valores de referencia pueden registrarse en una tarjeta de datos. Por consiguiente, la referencia (ii) de acuerdo con el kit del segundo aspecto de la invención puede ser una muestra de control (para su ensayo) o estar en forma de una tarjeta de datos de referencia.

Además, los inventores observaron que la concentración de MMP-9 en los individuos que habían padecido un IM era de >200 píxeles^{2} (según se calculó usando el procedimiento descrito en el Ejemplo). Se hace referencia a ésta en el presente documento como la concentración "aumentada" de MMP-9. Los inventores observaron que existe una relación directa entre los niveles de MMP-9 y el riesgo de desarrollar insuficiencia cardiaca Cuanto mayor es la concentración de MMP-9, mayor es el riesgo. Usando un análisis multifactorial, los inventores determinaron que el valor de corte es log MMP-9 = 6,23. Por encima de este nivel de MMP-9, los pacientes tenían un riesgo 6,5 veces mayor de desarrollar insuficiencia cardiaca.

Puede elaborarse una calculadora de riesgo en forma de un gráfico y un programa informático para PC portátiles. La calculadora de riesgo estimará el riesgo en 2 años de desarrollar insuficiencia cardiaca después de un infarto de miocardio basándose en los dos factores pronóstico más sólidos en el estudio de los presentes inventores (i) el nivel de MMP-9; (ii) los antecedentes de un infarto de miocardio previo. Es concebible incluir además marcadores de riesgo clínico y biológico en la calculadora de riesgo.

Por consiguiente, los inventores se han dado cuenta de que esta diferencia en las concentraciones de MMP-9 entre los niveles normales y aumentados puede usarse como un marcador fisiológico, que sugiere el riesgo en dos años de desarrollar insuficiencia cardiaca después de un IM. Se apreciará que si un sujeto tiene una concentración aumentada de MMP-9 que es considerablemente superior a la concentración de MMP-9 "normal" (por ejemplo, >300 píxeles^{2}, >400 píxeles^{2}, >500 píxeles^{2}, >600 píxeles^{2}), entonces estaría en mayor riesgo de desarrollar insuficiencia cardiaca en los dos años siguientes al IM, entonces, que si la concentración de MMP-9 fuera sólo ligeramente superior a la concentración de MMP-9 "normal" (por ejemplo, entre 200-300 píxeles^{2}). Por consiguiente, un clínico sería capaz de tomar una decisión en relación con el curso de tratamiento necesario, por ejemplo, el tipo y la dosificación de agente terapéutico a administrar.

La mayoría de los estudios cardiacos existentes miden la presencia o ausencia de marcadores y no la concentración real del marcador. Dichos procedimientos dependen de una técnica de medición y detección común de ELISA en lugar de zimografía, que determina la concentración de MMP-9 activa. El uso de zimografía es poco común en dichos estudios puesto que requiere mucho tiempo.

Ventajosamente, la concentración de MMP-9 activa puede medirse en el plasma del individuo que ha padecido el infarto de miocardio. Se sabe que otras proteínas desempeñan un papel en la insuficiencia cardiaca después de un infarto, por ejemplo, fosfolambán, SERCA, \betaARK. Sin embargo, estas proteínas no pueden detectarse en el plasma de pacientes. Además, es sorprendente que existe una correlación entre la concentración de MMP-9 y el riesgo en dos años de desarrollar además una insuficiencia cardiaca Se sabe que otras proteínas desempeñan un papel en la insuficiencia cardiaca, tales como TNF-\alpha e IL-6, y están elevadas en el plasma de pacientes con IM. Sin embargo, no existe relación entre la concentración de estas proteínas y el pronóstico de cardiopatía. Por lo tanto, la medición de TNF-\alpha e IL-6 no es de uso clínico.

El kit de acuerdo con el segundo aspecto puede comprender medios adecuados para determinar la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en la muestra una vez que se ha obtenido del sujeto. Los medios de detección pueden comprender el uso de anticuerpos acoplados a un procedimiento colorimétrico. En este caso, el ensayo será positivo (alto riesgo) o negativo (bajo riesgo).

El kit puede comprender una calculadora de riesgo que incorpora el nivel de MMP-9 en forma de un gráfico o un programa informático para PC tradicional y/o portátil. La calculadora de riesgo puede comprender información en relación con otros factores de riesgo, por ejemplo, antecedentes de infarto de miocardio, diabetes y edad.

La calculadora de riesgo puede comprender información en relación con el nivel de MMP-9 y la presencia o ausencia de un infarto de miocardio previo.

Todas las características descritas en el presente documento (incluyendo cualquier reivindicación, resumen y dibujos adjuntos) y/o todas las etapas de cualquier procedimiento o proceso desvelado de este modo pueden combinarse con cualquiera de los aspectos anteriores en cualquier combinación, excepto combinaciones en las que al menos algunas de dichas características y/o etapas sean mutuamente excluyentes.

Para un mejor entendimiento de la invención, y para mostrar cómo pueden llevarse a efecto las realizaciones de la misma, se hará referencia ahora, a modo de ejemplo, al Ejemplo no limitante y a los dibujos, en los que:-

la Figura 1 ilustra los niveles de MMP-2 y MMP-9 determinados por zimografía en gelatina en 109 pacientes con IM agudo, 142 pacientes con dolor torácico atípico y arterias coronarias normales (sin CAD), 135 pacientes con arteriopatía coronaria estable (CAD estable) y 53 pacientes con angina inestable (USA);

la Figura 2 ilustra: (A) el curso temporal de los niveles de MMP-9 en pacientes con IM agudo después de la reperfusión; (B) la distribución de los niveles de MMP-9 en pacientes con IM agudo; y muestra un patrón bifásico con un pico de mayor tamaño y uno de menor tamaño. Se usó un procedimiento de densidad kernel para evaluar la densidad en los puntos especificados;

la Figura 3 ilustra la relación entre los niveles iniciales de MMP (transformados logarítmicamente) y el riesgo, dos años después del IM, de: (A) desarrollar insuficiencia cardiaca NYHA clase III-IV; y (B) tener una fracción de eyección <40%; y

Ejemplo

Se realizaron experimentos para ilustrar que los sujetos con niveles elevados de MMP-9 en el momento del infarto presentan un alto riesgo de desarrollo de remodelación ventricular izquierda e insuficiencia cardiaca de aparición tardía durante el seguimiento.

Procedimientos

Grupo de estudio. En el presente estudio, se evaluaron prospectivamente 109 pacientes consecutivos con IM agudo (<24 horas) remitidos para intervención coronaria primaria (PCI) al Centre Hospitalier Luxembourg/Institut National de Chirurgie Cardiaque et de Cardiologie Interventionnelle. Se definió el IM agudo por la presencia de dolor torácico típico, la presencia de una elevación significativa del segmento ST en dos o más derivaciones del ECG y una elevación máxima de creatina quinasa en plasma hasta al menos el doble de la normal (400 U/l). Todos los pacientes se sometieron a angioplastia coronaria y colocación de endoprótesis vasculares con el uso de abciximab a menos que estuviera contraindicado. Se tomaron muestras de sangre en el momento de la PCI. Se realizó un seguimiento de los pacientes en intervalos de 6 meses para cualquier acontecimiento cardiaco importante o el desarrollo de insuficiencia cardiaca clase NYHA III-IV.

Para evaluar la fracción de eyección y los volúmenes ventriculares izquierdos, los supervivientes a largo plazo se sometieron a una ventriculografía con radionúclidos 2 años (media de 24 meses, 11-37 meses) después del IM. Se determinó la fracción de eyección ventricular izquierda (FE), el volumen telediastólico (VTD) y el volumen telesistólico (VTS) de forma semiautomática. El investigador que realizaba la lectura de los estudios nucleares ignoraba el estado clínico de los pacientes o sus parámetros biológicos. Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado y el estudio se autorizó por el Comité de Ética local.

Mediciones. Todas las muestras de sangre se congelaron a -70ºC hasta su análisis. Se determinaron las actividades de MMP-2 y MMP-9 usando análisis de zimografía y densitometría. En resumen, se cargaron cantidades equivalentes de plasma (1 \mul) en un gel electroforesis de SDS-poliacrilamida al 10% copolimerizado con gelatinasa A y B (0,5 mg/ml cada una) como los sustratos. Se midieron los niveles de proteína C reactiva de alta sensibilidad (hs-CRP) y propéptido natriurético cerebral (pro-BNP) con un inmunoensayo enzimático tipo sándwich. Se determinó el factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha) con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

Zimografía. El objetivo era preparar un análisis zimográfico de metaloproteinasa de la matriz 2 y 9 por su capacidad para escindir gelatina A y B, respectivamente. El procedimiento incluía una electroforesis, un tratamiento de gel y una etapa de tinción, seguida de densitometría.

1) Electroforesis 1-1 Preparación

(i): Limpiar dos placas de vidrio con etanol al 70%;

(ii): sujetarlas en el soporte vertical;

(iii): rellenarlas con agua destilada para comprobar que no se producen fugas.

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1-2 Moldeo de gel

1

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El tampón de procesamiento se vertió primero hasta 1 cm por debajo del peine. Se añadió rápidamente 1 ml de isobutanol saturado en agua. Se dejó que el gel polimerizara durante aproximadamente 30 min. Se aspiró el isobutanol con papel absorbente y después se lavó con agua destilada. Se vertió el gel de apilamiento y el peine se ajustó asegurándose de evitar que quedaran burbujas de aire.

Cuando se había completado la polimerización (30 min), el peine se retiró lentamente y después los pocillos se aclararon con tampón de procesamiento.

1-3 Procedimiento de electroforesis

Las muestras se prepararon en hielo con el tampón de muestras de Tris-glicina SDS 2x. Los patrones se diluyeron para cargar el mismo el volumen y después se dejó que se asentaran durante 10 minutos antes de la carga. Los geles se colocaron en el soporte y el depósito se rellenó con tampón de procesamiento. Se cargaron las muestras y los patrones de peso molecular, así como los controles positivos de MMP2 y MMP9. Se dejó que las muestras migraran durante 2 horas, con el voltaje ajustado a 100 V.

2) Tratamiento del gel

(i): Renaturalización - Los geles se dejaron en remojo con agitación suave tres veces durante 20 minutos en 50 ml de tampón de renaturalización.

(ii): Desarrollo - Los geles se aclararon con 10 ml de tampón de desarrollo. Los geles se equilibraron con 50 ml de tampón de desarrollo durante 30 minutos a temperatura ambiente. El tampón se sustituyó con 50 ml de tampón nuevo y se incubó durante una noche a 37ºC.

(iii): Tinción - Los geles se dejaron en remojo durante 15 minutos en solución de tinción.

(iv): Decoloración - Los geles se dejaron en remojo en tampón de decoloración durante 5 minutos.

(v): Tampón de contraste - Los geles se dejaron en remojo en tampón de contraste hasta el momento en el que se secaron.

3) Análisis del gel

- Procedimiento de exploración

- Densitometría

4) Productos

3

5) Tampones Tris inferior (Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8)

4

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Tris superior (Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8)

5

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Tampón de carga 2X

6

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Tampón de procesamiento (10X)

7

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Tampón de renaturalización (10X)

: Triton X-100 al 2,5% en agua destilada.

\newpage

Tampón de desarrollo (10X)

: Tris 0,5 M, Brij 35 al 0,2%, NaCl_{2} 50mM, pH 7,6.

: 8

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Tinción

: Metanol al 40% v/v, ácido acético al 10% v/v, azul de Coomassie al 0,1% p/v.

: 9

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Decoloración

: Metanol al 30% v/v, ácido acético al 10% v/v.

: 10

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Tampón de contraste

: Glicerol al 5% v/v, ácido acético al 10% v/v.

: 11

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Caracterización de MMP. Para definir mejor los niveles periféricos de MMP, los inventores realizaron estudios adicionales. En primer lugar, los inventores midieron los niveles de MMP-2 y MMP-9 el día 0, el día 1 y el día 3 en pacientes con IM agudo (n = 20) para evaluar el curso temporal de liberación de MMP después de un IM. En segundo lugar, los inventores midieron la MMP-2, MMP-9, hs-CRP y TNF-\alpha en pacientes consecutivos sin IM que se estaban sometiendo a angiografía coronaria, que presentaban angina inestable (n = 53), angina estable (n = 135) o dolor torácico atípico con arterias coronarias normales (n = 142). En tercer lugar, los inventores midieron los niveles de MMP-9 a intervalos de 3 meses en pacientes con ICC estable (n = 15).

Análisis estadístico

Se obtuvieron índices estadísticos descriptivos como medias, desviaciones típicas y porcentajes según fuera apropiado para describir la población estudiada. Se usó ANOVA unidireccional para comparar los valores medios entre grupos de pacientes observados definidos por un acontecimiento clasificatorio (es decir, grupos definidos por una puntuación de NYHA de seguimiento de III-IV o una fracción de eyección de \leq40%). En el caso de un ensayo de Shapiro-Wilk significativo para datos normales, se usó un ensayo de Mann-Withney no paramétrico. Se realizó una correlación y regresión lineal para estudiar la relación entre factores pronóstico biológicos. Se usó un modelo de regresión logística para investigar la asociación de la puntuación de NYHA en 2 años con las características de los pacientes y los factores pronóstico biológicos. Después, se usó un modelo de regresión logística para modelar la fracción de eyección (\leq40%, >40%) en 2 años con las características del paciente y los factores pronóstico biológicos.

La construcción de modelos se desarrolló con eliminación hacia atrás por etapas, que requería una p < 0,05 para significación, partiendo de un modelo que contenía todas las variables. Después de la selección final, se ensayaron interacciones de variables siguiendo el mismo procedimiento. Se usó el ensayo de \chi^{2} de Wald y el ensayo de cociente de verosimilitudes para evaluar la significación de variables en el modelo. Un valor de p < 0,05 se consideraba estadísticamente significativo. Todos los ensayos eran bilaterales. Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico Intercooled Stata versión 7.0 (Stata Corporation, College Station, Texas, Estados Unidos).

Resultados

Las características clínicas basales de los pacientes con y sin desarrollo de ICC durante el seguimiento se resumen en la Tabla 1. De los 109 pacientes con IM agudo, 11 pacientes murieron y 15 pacientes desarrollaron insuficiencia cardiaca NYHA clase III-IV durante el seguimiento de 2 años. Se perdieron siete pacientes durante el seguimiento.

TABLA 1 Características clínicas de pacientes con y sin el desarrollo de insuficiencia cardiaca en supervivientes de IM

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Parámetros en el momento de la reperfusión

Los niveles de MMP-2 no estaban aumentados en pacientes en IM agudo, como se ilustra en la Figura 1. Sin embargo, como puede observarse en la Figura 1, al contrario que la MMP-2, los niveles de MMP-9 estaban significativamente aumentados en el momento de la reperfusión (p < 0,001). Los pacientes con arteriopatía coronaria estable o inestable no mostraban ninguna elevación de la MMP-9. Los niveles de hs-CRP estaban aumentados 4,6 veces en pacientes con IM agudo en comparación con pacientes sin arteriopatía coronaria (p < 0,001). Curiosamente, no existía correlación entre la MMP-9 y la hs-CRP (p = 0,23). De forma similar, se descubrió que el pro-BNP estaba aumentado en pacientes con IM agudo sin ninguna correlación con los niveles de MMP-9 (p = 0,92). Sin embargo, los niveles de MMP-9 se correlacionaban con los niveles de CPK (p < 0,0001) y TNF-\alpha (p = 0,005). Este era un primer indicio de que la MMP-9 podía estar relacionada con el tamaño del infarto.

Los inventores registraron niveles máximos de MMP-9 en el momento de la presentación inicial que, en el estudio de los presentes inventores, se correspondía con las primeras 24 horas después de la aparición de los síntomas, como se ilustra en la Figura 2A. A partir de entonces, la MMP-9 disminuía lentamente. Los inventores observaron una distribución bifásica de los valores de MMP-9 entre los pacientes con IM agudo con un primer pico principal y un segundo pico más pequeño, como se ilustra en la Figura 2B. El grupo de pacientes con ICC estable sin IM y con FE < 40% tenían niveles elevados de MMP-9 que no variaban significativamente en el transcurso de 3 meses (no se muestran los datos).

Factores pronóstico multifactoriales de ICC de aparición tardía

Como se muestra en la Tabla 2, los pacientes con altos niveles de MMP-9 en el momento del infarto era más probable que desarrollaran insuficiencia cardiaca durante su evolución post-IM. De hecho, la clase funcional de la NYHA en el seguimiento de 2 años era superior en pacientes con MMP-9 inicial elevada (p < 0,02). Esto era independiente del tratamiento con beta-bloqueantes o inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina. Usando un análisis multifactorial, los presentes inventores establecieron que los pacientes con altos niveles iniciales de MMP-9 (por encima del valor de corte del Log MMP-9 = 6,23) tenían una OR de 6,5 (IC 95% 1,7-25,3, p < 0,006) de desarrollar insuficiencia cardiaca de aparición tardía clase III-IV. El impacto de la MMP-9 sobre el desarrollo de la insuficiencia cardiaca después de un IM se muestra en la Figura. 3.

TABLA 2 Factores pronóstico biológicos de insuficiencia cardiaca de aparición tardía post-IM

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En la Tabla 2: Se realizó un seguimiento de los pacientes con IM agudo (n = 109) para el desarrollo de ICC y se evaluó su función cardiaca con ventriculografía con radionúclidos a los 2 años. Se midieron los factores circulantes en el momento del IM y se compararon entre pacientes con y sin desarrollo de ICC. * Análisis de varianza unidireccional. ** Ensayo de Mann-Withney no parámetrico. ICC, insuficiencia cardiaca congestiva, FE, fracción de eyección, VTD, volumen telediastólico, VTS, volumen telesistólico, TNF, factor de necrosis tumoral \alpha, BNP, péptido natriurético cerebral, CRP, proteína C reactiva, CPK, creatina quinasa, MMP, metaloproteinasa de la matriz.

Estos resultados se corroboraron por las mediciones de la función y de los volúmenes cardiacos en el seguimiento de 2 años, como se ilustra en la Tabla 2 y en la Figura 3. De hecho, los pacientes con niveles de MMP-9 iniciales elevados era más probable que desarrollaran remodelación y disfunción ventricular izquierda (%FE 43 \pm 9 frente a 52 \pm 11, p < 0,03). El impacto de los niveles de MMP-9 iniciales sobre la FE se representa en la Figura 3. Todos los demás parámetros biológicos determinados en el presente estudio (TNF-\alpha, pro-BNP, hs-CRP, creatina quinasa y MMP-2) también eran ligeramente superiores en pacientes que posteriormente desarrollarían insuficiencia cardiaca (Tabla 2). Sin embargo, la diferencia no era estadísticamente significativa y el análisis multifactorial sólo identificó a la MMP-9 como factor pronóstico de insuficiencia cardiaca de aparición tardía post-IM.

Es notable que los pacientes con antecedentes de IM tenían una OR de 5,6 (IC 95% 1,3-24,3, p = 0,02) de desarrollar insuficiencia cardiaca de aparición tardía después de un IM. El análisis multifactorial también identificó antecedentes de ingestión de aspirina en la presentación como un factor protector frente al desarrollo de insuficiencia cardiaca (OR de 0,15, IC 95% 0,04-0,6, p = 0,007).

Discusión

Estos datos ilustran que los pacientes con niveles elevados de MMP-9 en el momento del infarto presentan un alto riesgo de insuficiencia cardiaca después de un IM (muy probablemente como resultado de la remodelación ventricular izquierda). La medición de los niveles de MMP-9 representa un mejor indicador de riesgo de pacientes en riesgo de insuficiencia cardiaca, después de un IM, que pro-BNP, TNF-\alpha, hs-CRP o creatina quinasa. De hecho, una sola determinación de la MMP-9 en el momento de la terapia de reperfusión era capaz de determinar los pacientes en alto riesgo (OR de 6,5) para el desarrollo de insuficiencia cardiaca de aparición tardía NYHA clase III-IV y FE < 40%.

El éxito de las terapias de reperfusión modernas ha dado como resultado una proporción creciente de supervivientes a infartos (Ref. 1-4). Sin embargo, el riesgo de desarrollar ICC post-IM no ha disminuido, y probablemente aumentará, ya que la proporción de supervivientes aumentará adicionalmente por la implantación de desfibriladores automáticos (Ref. 11). Por lo tanto, la ICC después de un IM continúa siendo un problema importante. Los pacientes que desarrollan ICC días después de un IM tienen una alta tasa de mortalidad en el hospital. No obstante, se sabe poco acerca de los factores pronóstico de la ICC de aparición tardía (años) después de un IM. El análisis del estudio CARE ha puesto de manifiesto que los factores pronóstico clínicos más importantes de la ICC de aparición tardía post-IM son la edad, FE, diabetes, hipertensión e IM previo. Los antecedentes de IM también eran un factor pronóstico importante de ICC de aparición tardía en el estudio de los presentes inventores. Algunos de estos factores son similares a los factores pronóstico de la ICC aguda después de un IM, tales como la edad y la diabetes.

Entre los factores circulantes que reflejan la función ventricular izquierda, el pro-BNP está siendo reconocido cada vez más como un marcador pronóstico importante en pacientes con insuficiencia cardiaca e IM agudo (Ref. 12-15). Los resultados de niveles elevados de pro-BNP en pacientes con IM agudo confirman esos informes. Es digno de mención que los estudios previos que evaluaban el pro-BNP en el IM agudo han incluido muy pocos pacientes con angioplastia primaria y colocación de endoprótesis vasculares. Además, la utilidad de la determinación del BNP en la fase aguda del IM está limitada por las fluctuaciones rápidas en los niveles de péptidos durante las primeras 24 horas del IM. Los niveles de BNP también se ven afectados por numerosas comorbilidades tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica e insuficiencia renal.

Los resultados concuerdan con el descubrimiento descrito de que los niveles periféricos de MMP-9 aumentan de dos a tres veces después de un infarto de miocardio (Ref. 5-10). Los inventores observaron una correlación entre los niveles de creatina quinasa y MMP-9. Este hecho puede deberse a una población de pacientes heterogénea más pequeña, recibiendo sólo 9 pacientes terapia de reperfusión, en comparación con el grupo de IM agudo de los presentes inventores, en el que todos los pacientes se sometieron a angioplastia coronaria y colocación de endoprótesis vasculares, en la mayoría con el uso de abciximab.

Este es el primer informe que demuestra que la MMP-9 es un factor pronóstico independiente potente de remodelación ventricular izquierda e ICC después de un IM. Los niveles de MMP-9 en plasma postmiocárdicos tempranos tenían una relación inversa significativa con la función y el tamaño ventricular izquierdo a los 2 años. Este no era el caso para la creatina quinasa o el pro-BNP. Esto se explica potencialmente por el hecho de que la MMP-9 puede verse menos afectada por el fenómeno de lavado y los cambios hemodinámicos transitorios en el momento de la reperfusión, que complican la interpretación de los niveles de creatina quinasa y pro-BNP. En estudios por Omland y col., y Richards y col., sólo aproximadamente la mitad de los pacientes recibieron terapia de reperfusión con trombolisis y los niveles de BNP se determinaron del día 2 al 4, después del IM, cuando los niveles de péptidos estaban en un estado estacionario.

Hasta ahora, los estudios clínicos que investigaban los niveles de MMP-9 concluían que los niveles elevados se debían al proceso de ruptura de placas arteriales coronarias. Sin embargo, en vista de los estudios animales recientes, parece más probable que los neutrófilos que infiltran el miocardio infartado sean la fuente principal de MMP-9 en el entorno del IM agudo (Ref. 16-17). La MMP-9 actúa probablemente directamente sobre el miocardio como una proteasa y facilita la infiltración de neutrófilos y la desgranulación, exacerbando la lesión isquémica. Esto puede explicar por qué la MMP-9 parece ser un marcador preciso para determinar el grado de la lesión. Varios investigadores han buscando entender los beneficios terapéuticos potenciales de la inhibición de NEAP. Por ejemplo, las observaciones en el modelo de ratón transgénico de TNF-\alpha indican que la inhibición de MMP tiene una ventana de oportunidad estrecha en la fase temprana de la remodelación. De hecho, la inhibición de MUMP no tenía efecto beneficioso sobre la función y el tamaño ventricular en ratones de edad avanzada con ICC establecida.

Muchas citocinas, incluyendo TNF-\alpha y factores de crecimiento transformante, inducen la expresión de MMP. En el presente estudio, los niveles periféricos de TNF-\alpha estaban sólo ligeramente elevados en el momento del infarto de miocardio. No obstante, existía una correlación positiva entre los niveles de MMP-9 y TNF-\alpha que concuerda con la noción de que la cascada de citocinas se inicia por el TNF-\alpha durante la lesión miocárdica.

Al contrario que los informes previos, los inventores no observaron una elevación de los niveles de MMP-2 en el momento del IM. La diferencia entre el presente estudio y la técnica anterior puede estar relacionada posiblemente con una técnica analítica diferente. Usando zimografía, los inventores midieron la actividad enzimática de las MMP, que refleja el estado biológico, mientras que los inmunoensayos usados en el estudio anterior no distinguían entre la forma de proenzima activa e inactiva de las MMP.

En conclusión, la MMP-9 es un marcador robusto y muy temprano de remodelación ventricular izquierda en pacientes con IM agudo y, particularmente, los tratados con angioplastia primaria y colocación de endoprótesis vasculares. Por lo tanto, la MMP-9 es útil como marcador de pronóstico de acuerdo con la presente invención y puede usarse para orientar el tratamiento y demostrar la presencia de un infarto de miocardio.

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Claims

1. Un procedimiento in vitro para identificar sujetos en riesgo de insuficiencia cardiaca después de un infarto de miocardio, que comprende analizar la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra corporal de un sujeto que ha padecido un infarto de miocardio y comparar esta concentración con una de referencia para concentraciones de metaloproteinasa de la matriz 9 en individuos que no han padecido un infarto de miocardio; en el que la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 se mide en una muestra tomada de un sujeto dentro de las 24 horas siguientes de sufrir un infarto de miocardio por el sujeto; y en el que una concentración aumentada de metaloproteinasa de la matriz 9 en la muestra corporal de un sujeto que ha padecido un infarto de miocardio sugiere que el sujeto está en riesgo de insuficiencia cardiaca.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra es una muestra de sangre o una muestra de orina.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la muestra de sangre u orina se analiza inmediatamente después de tomarse del sujeto.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la muestra de sangre u orina se congela y se almacena antes de descongelarse y analizarse.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de metaloproteinasa de la matriz-9 se mide por zimografía.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la zimografía comprende una etapa de electroforesis, una etapa de tratamiento de gel y una etapa de tinción.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 se mide por zimografía y densitometría.

8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 se mide por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo fluorométrico, ensayo quimioluminiscente o radioinmunoensayo.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la muestra es una muestra de sangre y en el que la concentración aumentada de metaloproteinasa de la matriz 9 es superior a 30 ng/ml o 200 píxeles^{2}.

10. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende además

-: proporcionar un kit para identificar el riesgo de un sujeto de desarrollar insuficiencia cardiaca después de un infarto de miocardio, comprendiendo el kit:

(ii): una referencia correspondiente a la concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en una muestra de un individuo que no ha padecido un infarto de miocardio,

-: usar el kit para identificar una concentración de metaloproteinasa de la matriz 9 en la muestra del sujeto que ha padecido un infarto de miocardio;

-: usar el kit para comparar la concentración identificada con la concentración de referencia.