ES2341083A1 - Usod e nanoparticulas como agentes citotoxicos. - Google Patents
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Abstract
Uso de nanopartículas como agentes citotóxicos. La presente invención se refiere al uso de nanopartículas con una elevada intensidad de absorbancia SPR y que comprenden externamente un recubrimiento inerte e internamente un núcleo metálico, como agentes citotóxicos; y/o para la elaboración de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de enfermedades infecciosas. Además, la presente invención se refiere a un método para la inducción de citotoxicidad en una muestra con células que comprende la puesta en contacto de la muestra con las nanopartículas arriba citadas y la irradiación de las mismas con luz de una longitud de onda entre 350 y 500 nm. Así, la presente invención puede aplicarse en biomedicina o en fototerapia para inducir la muerte tanto de células procariotas como eucariotas, o en cualquier otro campo en el que se desee inducir citotoxicidad en cualquier tipo de muestra.
Description
Uso de nanopartículas como agentes
citotóxicos.
La presente invención se refiere al uso de
nanopartículas con elevada intensidad de absorbancia SPR, en un
estrecho rango de longitud de onda, como agentes citotóxicos para la
inducción de muerte celular. Así la presente invención puede
aplicarse en biomedicina, en métodos de fototerapia para el
tratamiento de enfermedades mediante la inducción de muerte celular.
Más concretamente la presente invención puede aplicarse en
tratamientos de enfermedades infecciosas mediante la inducción de la
muerte de microorganismos.
La fabricación y estudio de nanomateriales ha
tenido un desarrollo creciente durante la pasada década. Los
materiales con dimensiones nanométricas representan un cambio
significativo en sus propiedades físico-químicas y
en algunos casos son origen de nuevos fenómenos. Sin embargo, los
estudios relacionados con la actividad biológica de estos
nanomateriales aún son muy incipientes. Algunas investigaciones
recientes muestran resultados importantes relacionados con la
actividad de diferentes medicamentos y con la función
antimicrobiana. Entre los nanomateriales utilizados se encuentra la
plata (Ag), conocida por sus propiedades como desinfectante desde
hace alrededor de 1200 años. Preparaciones de este metal han sido
utilizadas durante siglos con varios usos médicos, como son:
profilaxis ocular de recién nacidos, uso tópico en heridas por
quemaduras, tratamiento de infecciones ortopédicas y otras
dolencias. La plata también sirve como un potente bactericida,
actuando contra un amplio espectro de microorganismos. Se cree que
cationes de este metal reaccionan con las proteínas, provocando su
inactivación, mediante la formación de enlaces de coordinación con
grupos-SH de residuos de Cys. Cuando este material
es preparado en forma de nanopartículas es de esperar una mayor
actividad antimicrobiana debido al aumento de la superficie
específica de interacción. Análisis mediante Microscopía Electrónica
de Transmisión (TEM) e investigaciones proteómicas sugieren que las
nanopartículas de plata interactúan con los componentes de la
membrana bacteriana, causando cambios estructurales que terminan por
provocar la disipación de la fuerza protón-motriz y
consecuentemente inducen la muerte de la célula. Se cree también que
la inactivación general de proteínas celulares a causa del
tratamiento con iones Ag^{+} tiene otras consecuencias graves,
como la pérdida de la capacidad de replicación del ADN.
Adicionalmente, se encontró que la unión de iones Ag^{+} con
grupos funcionales de las proteínas puede dar lugar a su
desnaturalización. Las nanopartículas de Ag también pueden
utilizarse como agentes antimicrobianos efectivos al ser aplicadas
como recubrimiento de superficies que requieren una función
bactericida, por ejemplo, en los casos de material médico y filtros
para tratamiento de agua.
Otra aplicación interesante de las
nanopartículas metálicas en el campo de la biología es la detección
de concentraciones muy bajas de moléculas mediante el efecto
denominado "Surface-enhanced Raman Scattering"
(SERS), descubierto a finales de la década del 1970. Este fenómeno
está relacionado con un incremento gigantesco de la dispersión Raman
(10^{10}-10^{15}) en el entorno de
nanopartículas metálicas. En una de sus interpretaciones, el
fenómeno se relaciona con la resonancia electromagnética en las
nanoestructuras de metales nobles, lo cual ha servido de base para
la teoría electromagnética del SERS. Actualmente, esta resonancia
electromagnética es denominada "Surface Plasmon Resonante"
(SPR), e incluye fenómenos y aplicaciones muy diversas, tales como
"SPR biosensing", terapia fotodinámica usando el plasmon de las
nanocorazas o nanocortezas de Au y líneas de transmisión óptica
basadas en nanopartículas. Todas estas aplicaciones están basadas en
los intensos campos electromagnéticos que se producen en la vecindad
de las nanopartículas metálicas a causa de la polarización de un
campo electromagnético externo. La intensidad e incremento de este
campo electromagnético local vienen determinadas por la forma,
tamaño, configuración y composición de las nanopartículas.
El incremento de la intensidad del campo
electromagnético en la superficie de una nanopartícula aislada y
excitada resonantemente es alrededor de 30 veces. Sin embargo, en
puntos intermedios entre nanopartículas acopladas, la intensidad del
campo puede intensificarse unas 5000 veces. Por tanto, en la
proximidad de un sistema de nanopartículas, la intensidad de luz de
excitación se amplifica por un factor que varía entre 10^{3} y
10^{7}. Es de destacar también que la intensidad de estos campos
electromagnéticos decae rápidamente con la distancia a la superficie
de la nanopartícula metálica.
Otro aspecto importante es el cambio en la
actividad química de las nanopartículas bajo los efectos de una
radiación luminosa (láser o lámpara fluorescente). La radiación
láser de las nanopartículas metálicas (de Ag) diluidas en solución
acuosa provoca la fragmentación o fusión del coloide. Se ha
demostrado que la radiación láser origina la
foto-eyección de electrones, provocando la
ionización-oxidación superficial de las
nanopartículas y la consecuente segregación de iones (Ag^{+}).
Este fenómeno se intensifica en presencia de iones Cl^{-}, debido
a un ataque oxidativo O_{2}/Cl^{-} ("oxidative etching"),
que en el caso de las nanopartículas de Ag con morfología de planos
gemelos puede dar lugar a su disolución completa. El efecto de
ataque oxidativo ha sido utilizado para la
foto-conversión de nano-esferas en
otras nanopartículas de distinta morfología.
Recientemente se han explorado las posibles
aplicaciones foto-terapéuticas de nanopartículas
metálicas, proponiéndose tratamientos anticancerígenos basados en
las propiedades foto-térmicas de las nanopartículas
de Au (1-3). En estos casos la actividad de la
nanopartícula se basa en el calentamiento local producido en zonas
irradiadas debido a su proximidad con los nanoelementos. El papel de
las nanopartículas es asegurar una absorción efectiva de la
radiación a través del fenómeno SPR y transferir el exceso de
energía en forma calor al tejido adyacente. Utilizando un láser
continuo con una longitud de onda de 820 nm y una potencia de 4
W/cm^{2}, Hirsch y sus colaboradores (1) han observado incrementos
en la temperatura de aproximadamente 37ºC por encima de las
condiciones fisiológicas en áreas irradiadas en presencia de los
nanoelementos.
Sin embargo, la aplicación de las nanopartículas
utilizadas en la presente invención no se basa en el aumento de la
temperatura. Los efectos conseguidos están más bien relacionados con
el plasmon inducido sobre la superficie de las nanopartículas. Es
decir, el efecto conseguido en la presente invención se debe a una
propiedad óptica específica de las nanopartículas utilizadas, y no a
una propiedad térmica. Así mismo, los efectos
foto-térmicos quedan descartados como causa de la
muerte de las células, ya que la radiación electromagnética
utilizada en la presente invención es de baja potencia media, 0,018
W/cm^{2}, es decir, 220 veces menor que la utilizada en
tratamientos fototérmicos reportados por otros autores (1).
Por lo tanto, la muerte celular conseguida
mediante la presente invención se debe en parte a las
características ópticas especiales de las nanopartículas utilizadas.
Dichas nanopartículas presentan una serie de peculiaridades
importantes, entre las cuales están: una intensidad de absorbancia
SPR elevada (entre 0,4 y 1,2, para un paso óptico de 1 cm^{2}) en
un rango estrecho de longitudes de onda entre 350 y 500 nm. Cuando
la zona de aplicación de las nanopartículas se irradia con luz de
una longitud de onda cercana al máximo de absorbancia SPR de las
nanopartículas (preferentemente entre 400 y 410 nm), se originan
campos electromagnéticos elevados en el entorno de las;
nanopartículas que pueden dar lugar a diversos fenómenos que
afectarían a la viabilidad de las células, tales como
electroporación: de la membrana celular, ataque fotooxidativo o
formación de especies reactivas de oxígeno, los cuales serían
responsables en última instancia de la muerte de las células.
Ninguno de los documentos localizados en el
estado de la técnica comprende el uso de las nanopartículas
utilizadas en la presente invención para inducir muerte celular. La
utilización de estas nanopartículas aprovechando su propiedad física
SPR anteriormente mencionada hace posible que en la presente
invención, a diferencia de otros casos descritos en el estado de la
técnica, se emplee radiación electromagnética de baja potencia para
inducir campos electromagnéticos elevados en el entorno de las
nanopartículas, los cuales actúan eficazmente induciendo muerte
celular.
El efecto fue ensayado en células procariotas,
particularmente en cepas de laboratorio de la bacteria
Escherichia coli. Esta aplicación de las nanopartículas de la
invención aún no ha sido prevista en los documentos del estado de la
técnica analizados.
La presente invención se refiere al uso de
nanopartículas con una elevada intensidad de absorbancia SPR (entre
0,4 y 1,2) a un rango de longitudes de onda entre 350 y 500 nm,
preferentemente entre 400 y 410 nm, como agente citotóxico para
inducir muerte celular. La estimulación del campo electromagnético
en el entorno de las nanopartículas adheridas a la superficie
celular conlleva la inhibición del crecimiento de dichas células y,
eventualmente, su muerte. Debido a que la radiación electromagnética
utilizada en la presente invención es de baja potencia se descartan
los efectos foto-térmicos como la causa de la muerte
de las células. Por el contrario, la presente invención propone como
causas de la muerte celular la electroporación de la membrana
celular, el ataque foto-oxidativo ("photooxidative
etching") del núcleo de Ag de las nanopartículas, produciendo
iones de Ag^{+} tóxicos, o la fotoinducción de la formación de
especies reactivas de oxígeno en el medio celular próximo a las
nanopartículas. Todos estos efectos tienen su origen en los altos
campos electromagnéticos inducidos en el entorno de las
nanopartículas específicamente utilizadas en la presente invención
al ser sometidas a radiación electromagnética de baja potencia.
Las nanopartículas utilizadas en la presente
invención presentan la característica física de poseer una elevada
intensidad de absorbancia SPR en un rango estrecho de longitudes de
onda entre 350 y 500 nm, preferentemente entre 400 y 410 nm. Se
trata además de nanopartículas que comprenden un núcleo interno,
preferentemente de plata (Ag) o de aleaciones que comprendan plata.
Además las nanopartículas están recubiertas por un material inerte
semiconductor, cerámico y/o dieléctrico, siendo preferentemente un
óxido metálico semiconductor, cerámico y dieléctrico del grupo:
SiO_{2}, GeO_{2}, ZrO_{2}, TiO_{2}, ZnO_{2}. De manera
particular, en la presente invención se utilizan nanopartículas de
Ag recubiertas por una capa externa de SiO_{2}, denominadas
nanopartículas Ag-sílice.
Las nanopartículas usadas en la presente
invención, una vez unidas a la superficie celular e irradiadas con
una longitud de onda dentro del rango entre 350
nm-500 nm, preferentemente entre 400 y 410 nm,
inducen la muerte de células procariotas, aunque por sus
características este efecto también es extensible a células
eucariotas.
En la presente invención se entiende por
enfermedad infecciosa a la manifestación clínica provocada por la
acción de microorganismos u otros agentes infectivos, como por
ejemplo, bacterias, hongos, levaduras, virus, protozoos, etc.
A efectos de la presente invención el término
elevada intensidad de absorbancia SPR se define entre los valores
0,4 y 1,2 (para un paso óptico de 10 mm). Asimismo, el término rango
estrecho de longitud de onda se define entre 350 y 500 nm.
En la presente invención se define como agente
citotóxico a todo aquel que causa toxicidad en las células
suprimiendo sus funciones y/o provocando su muerte. Se refiere a
cualquier tipo de célula, procariota o eucariota, preferentemente
células bacterianas. Además, en la presente invención, la inducción
de citotoxicidad en una muestra comprende la esterilización,
desinfección o conservación de la misma; así como cualquier otro
efecto procedente de la inducción de la citotoxicidad en las células
presentes en la muestra.
La muestra comprende células vivas cuya
citotoxicidad, y eventualmente muerte, se desea inducir, y ésta
puede ser de cualquier tipo, tanto sólida como líquida, y de
cualquier origen. Así, por ejemplo, la muestra puede ser tanto
material o instrumental quirúrgico o de laboratorio, como agua u
otro líquido, como un medio de cultivo o un tejido biológico.
Por otro lado, mencionar que la dosis efectiva
de nanopartículas para provocar la muerte celular en la presente
invención corresponde a una concentración de al menos 0,15x10^{14}
nanopartículas por litro.
Figura 1. Caracterización física de la
nanopartícula Ag-sílice.
A. Espectro de absorción de una suspensión de
nanopartículas de Ag-sílice que muestra la banda del
Plasmon centrada en 400 nm. El eje X muestra la longitud de onda
(nm) y el eje Y la absorbancia (a.u).
La gráfica interior muestra la distribución de
tamaños medidos mediante TEM. El eje X muestra el diámetro de las
nanopartículas siendo su valor medio 11 nm.
B. Imagen HRTEM (Microscopía Electrónica de
Transmisión de Alta Resolución) de una nanopartícula de
Ag-sílice mostrando el recubrimiento de sílice
amorfo (flechas negras). La fotografía además muestra los planos
cristalinos gemelos ("twin planes"), flechas blancas, y las 5
caras o pliegues gemelos que conforman el tipo de morfología o de
crecimiento de nanopartículas con forma de decaedro. En este tipo de
morfología de nanopartículas se potencia el fenómeno de ataque
oxidativo ("oxidative etching") debido a distorsiones
significativas de la red cristalina, a la relajación superficial y
en general a la presencia de defectos.
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Figura 2. Efecto de las nanopartículas de
Ag-sílice en cultivos de bacterias E.
coli .
A. Imagen de TEM de una suspensión de células de
Escherichia coli en presencia de nanopartículas de
Ag-sílice añadidas en una concentración de
0.15x10^{14} nanopartículas/L. Se muestra la adherencia de las
nanopartículas de la invención a la superficie celular. Esta unión
es imprescindible para conseguir que los altos campos
electromagnéticos inducidos en el entorno de las nanopartículas,
debido al fenómeno SPR, alcancen e interactúen con las células.
B. Curvas de crecimiento de las bacterias
medidas a través de OD^{600} (Densidad Óptica del medio de cultivo
líquido a 600 nm), eje Y, versus el tiempo de crecimiento en
minutos, eje X. Cuadrados, sin nanopartículas, estrellas, con una
concentración de 0.15x10^{14} nanopartículas/L, triángulos, con
1,5x10^{14} nanopartículas/L y círculos, con 15x10^{14}
nanopartículas/L.
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Figura 3. Efecto bactericida en medio
líquido.
Estas gráficas muestran las curvas de
crecimiento bacteriano mediante las medidas de OD^{600} (eje Y)
frente al tiempo de crecimiento en minutos (eje X) y bajo diferentes
tratamientos. Para estos experimentos se utilizó una concentración
intermedia correspondiente a 1.5x10^{14} nanopartículas/L, para la
cual no se manifiesta toxicidad intrínseca de forma previa a la
aplicación de la radiación. De esta forma cualquier efecto
foto-bactericida conseguido cuando se aplica la
radiación puede ser discriminado con respecto al efecto de toxicidad
intrínseca de la nanopartícula. Los círculos corresponden a muestras
irradiadas y los cuadrados corresponden a las muestras control (sin
irradiación).
A. Muestra con nanopartículas de
Ag-sílice irradiadas a 405 nm (láser azul) sobre un
5% del volumen. Se evidencia una disminución en la OD^{600} entre
el 30% y el 40%, incluso siendo irradiado solamente un 5% del
volumen total del cultivo.
B. Muestra sin nanopartículas de
Ag-sílice irradiadas a 405nm (láser azul) sobre un
15% del volumen. En este caso se observó una ligera disminución en
la OD^{600}.
C. Muestra con nanopartículas de
Ag-sílice irradiadas a 633 nm (láser rojo). No
muestran cambios significativos en el crecimiento celular.
D. Muestra sin nanopartículas de
Ag-sílice irradiadas a 633 nm (láser rojo). No
muestran cambios significativos en el crecimiento celular.
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Figura 4. Efecto bactericida en medio
sólido.
A. Cultivo de bacterias Escherichia coli
sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas
y con aplicación de dos tipos de radiación: láser azul (B) de 405 nm
y láser rojo (R) de 633 nm. Se observa un área libre de células
(superficie gris), claramente distinguible de la zona ocupada por
colonias bacterianas (superficie brillante, blanca) en la zona
irradiada con el láser azul de 405 nm (punto B). En cambio, dicha
zona libre de células no aparece cuando la placa es irradiada con el
láser rojo de 633 nm (punto R). Es decir, la luz azul es más
efectiva porque es cercana al máximo de absorbancia SPR de las
nanopartículas.
B. Cultivo de bacterias E. coli sembradas
sobre placas Petri de agar en ausencia de nanopartículas y con dos
tipos de irradiación: láser azul (B) de 405 nm y láser rojo (R) de
633 nm. No se observa ningún área libre de células. Es decir, el
tratamiento no es efectivo, a pesar de la radiación, debido a la
ausencia de nanopartículas.
C. Cultivo de bacterias E. coli sembradas
sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas y con
radiación de luz azul (B) de 405 nm durante 16 horas. Se observa un
área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405
nm (punto B).
D. Cultivo de bacterias E. coli sembradas
sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas después de
48 horas sin irradiación, habiendo sido antes irradiadas con luz
azul de 405 nm durante 16 horas. Después de 48 horas sin irradiación
sigue observándose un área libre de células en la zona irradiada con
el láser azul de 405 nm (punto B).
Es decir, el tratamiento con las nanopartículas
de la invención y luz de 405nm es efectivo y, además,
irreversible.
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Figura 5. Esquema representativo de los
mecanismos responsables de la muerte celular después del tratamiento
con las nanopartículas de la invención e irradiación con una
longitud de onda entre 350 y 500 nm.
A. Ataque directo a la superficie celular a
través de perturbaciones eléctricas en la pared celular y en la
membrana causando el mal funcionamiento de la células y
eventualmente su muerte.
B. Fenómeno de ataque fotooxidativo
("foto-oxidative etching"): liberación de iones
Ag^{+} de las nanopartículas Ag-sílice, en
presencia de anión Cl^{-} (presente en el medio de cultivo), que
son inyectados justo en la membrana celular.
C. Producción de especies reactivas de oxígeno
(ROS). La excitación de cromóforos endógenos bacterianos
foto-sensibles provoca la reducción de moléculas de
oxígeno cercanas, produciendo ROS muy reactivas capaces de matar a
las células.
La presente invención se refiere a la inducción
de muerte celular por parte de nanopartículas citotóxicas con
características ópticas especiales, adheridas a la superficie
celular e irradiadas con una frecuencia entre 350 y 500 nm.
La capa de sílice de las nanopartículas
Ag-sílice (preferentemente utilizadas en la presente
invención) disminuye la segregación intrínseca de iones Ag^{+} y
por ende sus efectos, como la coordinación con grupos SH proteicos,
disminuyendo también su toxicidad intrínseca. Sin embargo, el hecho
de que el recubrimiento de sílice sea muy fino (1-2
nm) posibilita que el campo electromagnético sobre la superficie
aislante sea intenso. Además, la capa o recubrimiento de sílice no
es compacta, es decir, presenta poros, los cuales permiten
reacciones químicas inducidas o intensificadas por la radiación
luminosa. Si el medio celular es rico en sales con presencia
abundante de iones Cl^{-} la radiación luminosa provoca la
foto-oxidación de la superficie de las
nanopartículas de Ag y la segregación o inyección de iones de plata.
De esta forma, mediante la irradiación con luz de la longitud de
onda adecuada en zonas seleccionadas se puede controlar la toxicidad
de las nanopartículas.
Tal y como se ha mencionado en el estado de la
técnica, las nanopartículas de Ag son conocidas por su actividad
antibiótica intrínseca. Sin embargo, en la presente invención la
capa de sílice aísla y estabiliza la Ag que forma el núcleo interno
de la nanopartícula atenuando o inhibiendo su efecto bactericida
intrínseco. En la presente invención se testó este fenómeno mediante
el estudio del crecimiento de la bacteria E. coli en la
presencia de nanopartículas Ag-sílice. Las
nanopartículas fueron añadidas al cultivo de bacterias, justo antes
del comienzo del su crecimiento exponencial, a concentraciones entre
0,15.10^{14} y 15.10^{14} nanopartículas/L. Las curvas de
crecimiento bajo estas condiciones, medidas en base al OD^{600},
se representan en la Figura 2B. Sólo se observó un débil efecto
tóxico con la mayor de las concentraciones de nanopartículas
utilizadas (15.10^{14} nanopartículas/L), lo que dio lugar a una
pequeña reducción del crecimiento de las bacterias. Estudios
similares llevados a cabo con nanopartículas de Ag no recubiertas a
concentraciones comparables con las anteriores mostraron un efecto
bactericida mucho mayor (disminución del crecimiento en un 90%). Por
lo tanto, se concluye que las nanopartículas utilizadas en la
invención (particularmente las nanopartículas
Ag-sílice) poseen un efecto inhibidor intrínseco
(previo a la aplicación de radiación) del crecimiento de los
cultivos bacterianos muy pequeño. Dicha atenuación de la toxicidad
intrínseca de las nanopartículas es debida a su recubrimiento
inerte, el cual, a su vez, debilita su efecto inductor de la muerte
celular permitiendo además su activación posterior mediante la
aplicación de la radiación requerida. Es decir, permite controlar
temporal y espacialmente la toxicidad de la nanopartícula, ya que
ésta ocurrirá solo en el momento y en el lugar en que sea aplicada
la radiación luminosa de la longitud de onda adecuada. Debido a que
las nanopartículas utilizadas en la presente invención se unen
eficazmente a la superficie celular (ver la Figura 2A), puede
concluirse que la reducción de toxicidad intrínseca de la Ag no es
debida a la falta de proximidad a las células.
Las nanopartículas utilizadas en la invención
han sido caracterizadas por varias técnicas físicas. La Figura 1A
muestra el espectro de absorción de una suspensión de nanopartículas
de Ag, observándose una elevada intensidad de absorbancia SPR en un
rango estrecho de longitudes de onda en torno a 400 nm. En la Figura
1B se muestran imágenes HRTEM donde se observan partículas de Ag
esféricas con un diámetro de 11 nm (ver la Figura 1A interna), cada
una de ellas cubierta con una capa amorfa de sílice de un espesor
entre 1 y 2 nm (flechas negras, Figura 1B). En las imágenes TEM se
distinguen además los planos gemelos, evidenciados por las flechas
blancas de la Figura 1B, junto con los cinco vértices contenidos en
cada cara, dando lugar a una morfología de decaedro. Este tipo de
estructura está formada por cinco mono cristales tetraédricos
orientados radialmente a través de una abscisa central, de tal forma
que todos los tetraedros tiene una esquina en común y cada uno de
ellos tiene dos caras en contacto con sus vecinos. Con este tipo de
morfología el fenómeno "oxidative etching" es amplificado
debido a distorsiones en el entramado del cristal.
El análisis los datos obtenidos por XRD
(Difracción de Rayos X) indica que la Ag de las nanopartículas está
formada por cristales con un diámetro de 11 nm. Además, los picos
característicos de sílice no están presentes en el espectro XRD, lo
que sugiere que este último material es amorfo. Las medidas
realizadas en las nanopartículas Ag-sílice por EDX
(Fluorescencia de Rayos X) muestran una ratio Si/O de ½ lo cual
coincide con la presencia de sílice amorfo en la superficie de las
nanopartículas.
Un requisito indispensable para observar el
efecto de los fenómenos causados por la absorbancia SPR es que la
estructura diana (en este caso la superficie celular) se encuentre
próxima a la superficie de la nanopartícula, donde el plasmón debe
originarse. Tal y como se ha demostrado en la presente invención
mediante TEM, las nanopartículas utilizadas se adhieren eficazmente
a la membrana de las células, acumulándose en su superficie (ver
Figura 2A). Para estudiar el efecto de los altos campos
electromagnéticos inducidos mediante la excitación de las
nanopartículas utilizadas en la invención mediante SPR, se usaron
dos láseres, llamados azul y rojo. La longitud de onda del láser
azul (405 nm) es muy próxima a la absorción máxima del espectro de
las nanopartículas utilizadas en la invención (Figura 1A). El láser
rojo tiene una longitud de onda de 633 nm, y fue elegido como
control negativo debido a que su absorción por las nanopartículas es
muy pequeña.
Un grupo de experimentos fueron llevados a cabo
en medios de cultivo líquidos, donde las bacterias fueron irradiadas
con un láser introducido en una caja termostática a 37ºC. Este hecho
permitió una fácil medición del OD^{600} en pequeños volúmenes de
cultivo, los cuales son requeridos para conseguir una irradiación
significativa con láseres cuyo foco de irradiación es de 1,4
mm^{2} aproximadamente. Por lo tanto, para un medio de 3 mm,
correspondiente al grosor de la cubeta o vial del cultivo, el
volumen irradiado es 4,2 \mul, lo cual corresponde aproximadamente
al 9,3% del total de los 45 \mul de cultivo original. La Figura 3
muestra las curvas de crecimiento medidas bajo estas condiciones. En
los cultivos donde se añadieron nanopartículas (concretamente
nanopartículas de Ag-sílice) se utilizó una
concentración de 1,5.10^{4} nanopartículas/L, que es la
concentración que causa una toxicidad intrínseca de las
nanopartículas de Ag medible (Figura 2B), lo que permite la
observación del efecto sobre el crecimiento celular debido
exclusivamente a la irradiación láser. Las muestras que contenían
nanopartículas Ag-sílice y fueron irradiadas con un
láser azul mostraron un crecimiento atenuado con un descenso en el
OD^{600} en la parte superior de la curva de entre el 30 y el 40%,
comparado con los experimentos control donde se usaron las mismas
muestras sin irradiación, o muestras sin nanopartículas irradiadas
con el mismo láser (ver Figura 3A). Por otro lado, experimentos
control realizados mediante la irradiación con el láser rojo, ya
fuera añadiendo o sin añadir nanopartículas, no mostraron cambios
significativos en el crecimiento celular (Figuras 3C y D). Estos
resultados indican claramente que las nanopartículas utilizadas en
la presente invención (particularmente las nanopartículas
Ag-sílice) deben estar presentes para que la
irradiación afecte negativamente al crecimiento celular. Además se
demuestra que el efecto observado se relaciona específicamente con
la aplicación de una longitud de onda (entre 350 y 500 nm
preferentemente entre 400 y 410 nm) que se corresponde con la mayor
intensidad de absorbancia SPR conseguida por las nanopartículas.
Los experimentos en medios de cultivo líquidos
no informan sobre la viabilidad de las células debido a que no
permiten distinguir entre la reducción de la velocidad de división
celular y la reducción del número de células viables.
Adicionalmente, debido a que únicamente se puede incidir con el
láser sobre una fracción del volumen total, y teniendo en cuenta que
la población de células cambia con el tiempo debido al movimiento de
las bacterias en la muestra, no se controla de manera exhaustiva la
dosis de radiación efectiva. Por lo tanto, en la presente invención
se utilizó también la irradiación de cultivos sólidos como sistema
de estudio y validación del método, ya que en este tipo de cultivos
la difusión de las bacterias es limitada y puede asumirse que la
radiación aplicada sobre la muestra es constante. Se utilizaron como
medio sólido placas de agar (medio LB), en las cuales las bacterias
fueron sembradas y crecidas hasta la formación de colonias que,
idealmente, cubrían toda la superficie de la placa. Las
nanopartículas Ag-sílice fueron introducidas en el
medio a una concentración de 1,5.10^{14} nanopartículas/L, tanto
en el inoculo utilizado para sembrar las placas como en el medio
LB-agar correspondiente a éstas, y la irradiación
con los láseres azul y rojo fue mantenida durante el crecimiento
celular completo y llevada a cabo sobre pequeñas áreas seleccionadas
y no superpuestas. La Figura 4 muestra el efecto bactericida en
medio sólido. La Figura 4 A muestra un cultivo de bacterias E.
coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de
nanopartículas y con aplicación de dos tipos de radiación: láser
azul (B), de 405 nm, y láser rojo (R), de 633 nm. Se observa un área
libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405 nm
(punto B) y, en cambio, dicha zona libre de células no aparece
cuando la placa es irradiada con el láser rojo de 633 nm (punto R).
Es decir, la luz azul es efectiva porque tiene una longitud de onda
similar a la del máximo de absorbancia SPR de las nanopartículas. La
Figura 4B muestra un cultivo de bacterias E. coli sembradas
sobre placas Petri de agar en ausencia de nanopartículas y con dos
tipos de irradiación: láser azul (B) de 405 nm y láser rojo (R) de
633 nm. No se observa ningún área libre de células en ningún caso.
Es decir, en ausencia de nanopartículas el tratamiento bactericida
no es efectivo. La Figura 4C muestra un cultivo de bacterias E.
coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de
nanopartículas y con irradiación de luz azul (B) de 405 nm durante
16 horas, periodo necesario para el crecimiento de las colonias
bacterianas en condiciones normales, observándose un área libre de
células en la zona irradiada (punto B). La Figura 4D muestra un
cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de
agar en presencia de nanopartículas, irradiadas con luz azul de 405
nm durante 16 horas, y mantenidas después sin irradiación a
temperatura óptima de crecimiento durante 48 horas más. Después de
48 horas sin irradiación sigue observándose un área libre de células
en la zona irradiada con el láser azul de 405 nm (punto B). Es
decir, el tratamiento con las nanopartículas de la invención y luz a
405 nm es efectivo y, además,
irreversible.
irreversible.
Por lo tanto, se pueden extraer dos conclusiones
importantes:
- \bullet
- La presencia de nanopartículas en la superficie celular y la irradiación de la zona con la longitud de onda a la cual las nanopartículas muestran su máxima absorbancia SPR (longitud de onda entre 350 y 500 nm, preferentemente entre 400 y 410 nm) es fundamental para el éxito del efecto citotóxico.
- \bullet
- En la zona donde se aplican las condiciones explicadas en el punto anterior no se observa una reactivación del crecimiento celular aunque se deje de aplicar la radiación. En presencia de las nanopartículas la irradiación a una frecuencia correspondiente al espectro de absorbancia SPR de las nanopartículas esteriliza la zona.
\vskip1.000000\baselineskip
Una de las causas de la muerte celular provocada
por las nanopartículas utilizadas en la invención debe ser un ataque
directo a la superficie celular a través de perturbaciones
eléctricas en la pared y/o la membrana de las células, causando su
mal funcionamiento y eventualmente se muerte (Figura 5A). De hecho,
los pulsos del láser a escala de nanosegundos, e incluso menores,
son capaces de perturbar temporalmente la integridad de la membrana
y este efecto ha sido usado para la transformación celular con ADN
exógeno.
Alternativamente, otros mecanismos indirectos
están implicados en la muerte celular. Es sabido que el fenómeno de
ataque fotooxidativo ("foto-oxidative etching")
libera cationes Ag^{+} de las nanopartículas
Ag-sílice en presencia de aniones Cl^{-} en la
disolución, lo cual da lugar a una inyección de los iones Ag^{+}
justo en la membrana celular. La capa o recubrimiento de las
nanopartículas no es compacta, es decir, presentan poros que
permiten reacciones químicas, que pueden a su vez ser inducidas o
intensificadas por la radiación luminosa. Si el medio celular es
rico en sales con abundante presencia de iones Cl^{-} la radiación
luminosa provoca la foto-oxidación de la superficie
de las nanopartículas de Ag y la segregación o inyección de iones
Ag^{+}. De esta forma, mediante la irradiación con luz de la
longitud de onda adecuada en zonas seleccionadas se puede controlar
la toxicidad de las nanopartículas. En el caso de células eucariotas
las nanopartículas pueden ser incluso fagocitadas, por lo que la
inyección de Ag^{+} ocurriría también directamente en su interior
(Figura 5B).
Por otro lado, la muerte celular puede
producirse debido a la producción de especies reactivas de oxígeno.
Este efecto ocurre debido a la absorción de luz
violeta-azul por cromóforos endógenos bacterianos
foto-sensibles, los cuales, una vez excitados, son
capaces de transferir la energía a moléculas de oxígeno cercanas,
produciendo especies reactivas de oxígeno (ROS), especialmente
oxígeno singlete (^{1}O_{2}), peróxido de hidrógeno
(H_{2}O_{2}) y radicales hidroxilo (OH). La presencia de las
nanopartículas en su superficie celular posibilita la amplificación
de la intensidad de luz efectiva, que a su vez incrementa la
producción de especies reactivas de oxígeno. Esta combinación de
luz, moléculas fotosensibles y especies reactivas de oxígeno se
conoce en el campo de la oncología como terapia
foto-dinámica. Las consecuencias tóxicas del
incremento de ROS en las células son conocidas e incluyen mutaciones
del genoma, peroxidación de lípidos, inhibición de la glucólisis y
de la síntesis de ADN.
Otro mecanismo sería el que sinérgicamente
integra varios, o todos, los arriba mencionados. De hecho, los poros
formados en la membrana debido a las perturbaciones eléctricas
facilitan la entrada de iones Ag^{+} o de especies reactivas de
oxígeno al interior de las células donde ejercen su efecto tóxico.
Alternativamente, los iones Ag^{+} pueden incluso inducir
directamente la generación de especies reactivas de oxígeno mediante
reacciones bien conocidas.
En conclusión la presente invención evidencia
dos claros fenómenos relacionados con el uso concreto de las
nanopartículas de la invención para la inducción de la muerte
celular:
- \bullet
- El recubrimiento inerte de las nanopartículas (particularmente sílice) reduce la toxicidad intrínseca de su núcleo de plata, en lugares o momentos donde tal efecto tóxico intrínseco no es requerido o es perjudicial. El momento y lugar en el cual se activa la toxicidad de las nanopartículas pueden controlarse mediante la aplicación selectiva de la radiación adecuada.
- \bullet
- La excitación de dichas nanopartículas con una radiación de una longitud de onda dentro de la banda (alrededor de 400 nm) de su absorbancia SPR (350-500 nm, preferentemente 400-410 nm), produce la activación del efecto tóxico que actúa induciendo la muerte celular a través de mecanismos bioactivos como la electroporación de la membrana, el ataque fotooxidativo o la fotoinducción de radicales libres.
\vskip1.000000\baselineskip
Así, el método evidenciado en la presente
invención tiene una aplicación directa relacionada con la inducción
de manera selectiva y controlada de muerte celular tanto en células
procariotas como eucariotas. La reducida toxicidad intrínseca de las
nanopartículas y los elevados campos eléctricos generados vía SPR
ofrecen multitud de aplicaciones en medicina y biología.
El primer aspecto de la presente invención se
refiere al uso de nanopartículas con una elevada intensidad de
absorbancia SPR, que comprenden externamente un recubrimiento inerte
(preferentemente un óxido metálico semiconductor seleccionado entre:
SiO_{2}, GeO_{2}, ZrO_{2}, TiO_{2}, ZnO_{2} o un metal
inerte) e internamente un núcleo metálico (preferentemente Ag), como
agentes citotóxicos. En una realización preferida de la invención
las nanopartículas presentan una intensidad de absorbancia SPR entre
0,4 y 1,2, para un paso óptico de 10 mm, a una longitud de onda de
400 nm.
El segundo aspecto de la presente invención se
refiere al uso de las nanopartículas arriba definidas para la
elaboración de una composición farmacéutica destinada al tratamiento
de enfermedades infecciosas.
El tercer aspecto de la presente invención se
refiere a un método para la inducción de citotoxicidad en una
muestra que comprende poner ésta en contacto con dichas
nanopartículas y la irradiación de las nanopartículas adheridas a la
superficie celular con luz de una longitud de onda entre 350 y 500
nm. La muestra puede ser de cualquier tipo, tanto sólida como
líquida, que comprenda células vivas. Por ejemplo la muestra puede
ser material o instrumental quirúrgico o de laboratorio. Otro tipo
de muestra puede ser agua, u otros líquidos, contaminados con
bacterias.
Los ejemplos que se exponen a continuación
tienen el objetivo de ilustrar la invención sin limitar el alcance
de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como puede verse en la Figura 1A en la
presente invención se elucidaron las propiedades ópticas especiales
de las nanopartículas empleadas. Así, la Figura 1A muestra el
espectro de absorción de una suspensión de nanopartículas de Ag con
elevada intensidad de absorbancia SPR en un rango de longitudes de
onda alrededor de 400 nm. Además, en la Figura 1B se muestran
imágenes HRTEM donde se observan partículas de Ag esféricas con un
diámetro de 11 nm (ver la Figura 1A interna), cada una de ellas
cubierta con una capa amorfa de sílice de un espesor entre 1 y 2 nm
(flechas negras, Figura 1B). Se distinguen los planos gemelos en las
imágenes TEM, los cuales son evidenciados por las flechas blancas de
la Figura 1B, junto con los cinco vértices contenidos en cada cara,
dando lugar a una morfología de decaedro. Este tipo de estructura
está formada por cinco mono cristales tetraédricos radialmente
orientados a través de una abscisa central de tal forma que todo el
tetraedro tiene una esquina en común y cada una de ellas tiene dos
caras en contacto con sus vecinas. Con este tipo de morfología el
fenómeno de ataque oxidativo ("oxidative etching") es
amplificado, debido a distorsiones en las interfases entre los
cristales tetrahédricos que conforman las nanopartículas.
Por otro lado, el análisis los datos obtenidos
por XRD (Difracción de Rayos X) indica que la Ag de las
nanopartículas se encuentra en forma de cristales con un diámetro de
11 nm. Además, los picos característicos de sílice no están
presentes en el espectro XRD, lo que sugiere que dicho material es
amorfo. Las medidas realizadas en las nanopartículas
Ag-sílice por EDX (Fluorescencia de Rayos X)
muestran un ratio Si/O de ½ lo cual coincide con la presencia de
sílice amorfo en la superficie de la nanopartícula.
\vskip1.000000\baselineskip
La adhesión exitosa de las nanopartículas a la
superficie celular se evidenció mediante imágenes TEM (Figura 2 A)
de una suspensión de células de E. coli en presencia de
nanopartículas de Ag-sílice añadidas en una
concentración de 0.15x10^{14} nanopartículas/L. Esta unión es
imprescindible para conseguir que los altos campos electromagnéticos
inducidos en el entorno de las nanopartículas debido al fenómeno SPR
alcancen las células e interactúen con ellas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un grupo de experimentos en
medios de cultivo líquidos, donde las bacterias fueron crecidas e
irradiadas con un láser en el interior de una caja termostática a
37ºC. Este hecho permitió una fácil medición del OD^{600} en
pequeños volúmenes de cultivo, los cuales son requeridos para
conseguir una irradiación significativa con láseres cuya superficie
de irradiación es de 1,4 mm^{2} aproximadamente. Por lo tanto,
para un espesor de la muestra de 3 mm, correspondiente a la anchura
de los viales empleados, el volumen irradiado es de 4,2 \mul, lo
cual corresponde aproximadamente al 9% del total de los 45 \mul
del cultivo original. La Figura 3 muestra las curvas de crecimiento
medidas bajo estas condiciones. En los cultivos donde se añadieron
nanopartículas (concretamente, nanopartículas de
Ag-sílice) se utilizó una concentración de
1,5.10^{4} nanopartículas/L, que es la concentración que causa una
toxicidad intrínseca de las nanopartículas de Ag medible (Figura
2B), lo que permite la observación de efectos en el crecimiento
celular debidos exclusivamente a la irradiación láser. Las muestras
que contenían nanopartículas Ag-sílice y fueron
irradiadas con un láser azul mostraron un crecimiento atenuado, con
un descenso en el OD^{600} en la parte superior de la curva de
entre el 30 y el 40%, comparado con los experimentos control donde
se usaron las mismas muestras sin irradiación, o muestras sin
nanopartículas irradiadas con el mismo láser (ver Figura 3A). Por
otro lado, experimentos control realizados mediante la irradiación
con el láser rojo, añadiendo o sin añadir nanopartículas, no
mostraron cambios significativos en el crecimiento celular (Figuras
3C y D). Estos resultados indican claramente que las nanopartículas
utilizadas en la presente invención (particularmente las
nanopartículas Ag-sílice) deben estar presentes para
que la irradiación afecte negativamente al crecimiento celular.
Además se demuestra que el efecto observado se relaciona
específicamente con la aplicación de una longitud de onda
correspondiente a la banda de absorbancia SPR de las nanopartículas,
que se encuentra en torno a \sim 400 nm (entre 350 y 500 nm,
preferentemente entre 400 y 410 nm).
Sin embargo, los experimentos en medios de
cultivo líquidos no informan sobre la viabilidad de las células
debido a que no permiten distinguir entre la reducción de la
velocidad de división celular y la reducción del número de células
viables. Adicionalmente, debido a que únicamente se puede incidir
con el láser sobre una fracción del volumen total, donde además la
población de células cambia con el tiempo debido al movimiento de la
bacteria en la muestra, en medios líquidos no puede llevarse a cabo
un control exhaustivo de la radiación efectiva. Por ello se llevaron
a cabo también experimentos en medios de cultivo sólidos (ver
ejemplo 4).
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención se utilizó la radiación
de cultivos sólidos como sistema de estudio y validación del método
ya que en este tipo de cultivos la difusión de las bacterias es
limitada y puede asumirse que la radiación aplicada sobre la muestra
es constante. Se utilizaron como medio sólido placas demedio LB en
agar, en las cuales las bacterias fueron sembradas y crecidas hasta
la formación de colonias que, idealmente, cubrían toda la superficie
de la placa. Las nanopartículas Ag-sílice se
encontraban presentes a una concentración de 1,5.10^{14}
nanopartículas/L, tanto en el inoculo utilizado para sembrar las
placas como en el propio medio de cultivo de las placas. La
irradiación con los láseres azul y rojo fue mantenida durante todo
el crecimiento celular y llevada a cabo sobre pequeñas áreas
seleccionadas no superpuestas. La Figura 4 muestra el efecto
bactericida en medio sólido. La Figura 4 A muestra un cultivo de
bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en
presencia de nanopartículas y con dos tipos de irradiación: láser
azul (B) de 405 nm y láser rojo (R) de 633 nm. Se observa un área
libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405 nm
(punto B) y, en cambio, dicha zona libre de células no aparece
cuando la placa es irradiada con el láser rojo de 633 nm (punto R).
Es decir, la luz azul es más efectiva porque tiene una longitud de
onda similar a la cual las nanopartículas presentan su máxima
absorbancia SPR. La Figura 4B muestra un cultivo de bacterias E.
coli sembradas sobre placas Petri de agar en ausencia de
nanopartículas y con dos tipos de irradiación: láser azul (B) de 405
nm y láser rojo (R) de 633 nm. No se observa ningún área libre de
células. Es decir, en ausencia de nanopartículas el tratamiento no
es efectivo. La Figura 4C muestra un cultivo de bacterias E.
coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de
nanopartículas y con irradiación de luz azul (B) de 405 nm durante
16 horas (periodo de crecimiento de las colonias celulares). Se
observa un área libre de células en la zona irradiada con el láser
azul de 405 nm (punto B). La Figura 4D muestra un cultivo de
bacterias E. coli similar al anterior, donde las bacterias
sembradas sobre placas Petri en presencia de nanopartículas, una vez
irradiadas con luz azul de 405 nm durante 16 horas, son después
mantenidas en crecimiento durante 48 horas adicionales, pero sin
irradiación. Después de 48 horas sin irradiación sigue observándose
un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de
405 nm (punto B). Es decir, el tratamiento con las nanopartículas de
la invención y luz a 405 nm es efectivo y, además, irreversible.
1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A Vol. 100
(23), 13549-13554 (2003).
2. Cáncer Letter 209,
171-176 (2004).
3. Nano Letters Vol. 7 (12),
3759-3765 (2007).
Claims (26)
1. Uso de nanopartículas con una elevada
intensidad de absorbancia SPR y que comprenden externamente un
recubrimiento inerte e internamente un núcleo metálico, como agentes
citotóxicos.
2. Uso, según la reivindicación 1, donde la
solución coloidal de nanopartículas presentan una intensidad de
absorbancia SPR entre 0,4 y 1,2, para un paso óptico de 10 mm, a una
longitud de onda de 400 nm.
3. Uso, según la reivindicación 1, donde el
recubrimiento inerte es un material semiconductor, cerámico y/o
dieléctrico.
4. Uso, según la reivindicación 3, donde el
recubrimiento inerte se selecciona entre: SiO_{2}, GeO_{2},
ZrO_{2}, TiO_{2} o ZnO_{2}.
5. Uso, según la reivindicación 1, donde el
metal comprendido en el núcleo de la nanopartícula es plata o
aleaciones que comprendan plata.
6. Uso, según la reivindicación 1, donde la
nanopartícula comprende externamente SiO_{2} e internamente un
núcleo de plata o aleaciones que comprendan plata.
7. Uso, según la reivindicación 1, donde el
efecto citotóxico se lleva a cabo tanto sobre células procariotas
como eucariotas.
8. Uso, según la reivindicación 7, donde el
efecto citotóxico se lleva a cabo sobre células bacterianas.
9. Uso de nanopartículas con una elevada
intensidad de absorbancia SPR y que comprenden externamente un
recubrimiento inerte e internamente un núcleo metálico, para la
elaboración de una composición farmacéutica destinada al tratamiento
de enfermedades infecciosas.
10. Uso, según la reivindicación 9, donde las
nanopartículas presentan una intensidad de absorbancia SPR entre 0,4
y 1,2, para un paso óptico de 10 mm, a una longitud de onda de 400
nm.
11. Uso, según la reivindicación 9, donde el
recubrimiento inerte es un material semiconductor, cerámico y/o
dieléctrico.
12. Uso, según la reivindicación 11, donde el
recubrimiento inerte se selecciona entre: SiO_{2}, GeO_{2},
ZrO_{2}, TiO_{2} o ZnO_{2}.
13. Uso, según la reivindicación 9, donde el
metal comprendido en el núcleo de la nanopartícula es plata o
aleaciones que comprendan plata.
14. Uso, según la reivindicación 9, donde la
nanopartícula comprende externamente SiO_{2} e internamente un
núcleo de plata o aleaciones que comprendan plata.
15. Método para la inducción de citotoxicidad en
una muestra con células que comprende:
- \bullet
- Poner en contacto la muestra con nanopartículas, con una elevada intensidad de absorbancia SPR y que comprenden externamente un recubrimiento inerte e internamente un núcleo metálico; e
- \bullet
- Irradiar las nanopartículas adheridas a la superficie celular con luz de una longitud de onda entre 350 y 500 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Método, según la reivindicación 15, donde la
muestra puede ser de cualquier tipo y origen siempre que presente
células vivas, tanto eucariotas como procariotas.
17. Método, según la reivindicación 16, donde
las células son bacterianas.
18. Método, según la reivindicación 15, donde la
muestra puede ser tanto sólida como líquida.
19. Método, según la reivindicación 18, donde la
muestra es material o instrumental quirúrgico o de laboratorio.
20. Método, según la reivindicación 18, donde la
muestra es una disolución acuosa.
21. Método, según la reivindicación 15, donde la
luz tiene una longitud de onda entre 400 y 410 nm.
\newpage
22. Método, según la reivindicación 15, donde
las nanopartículas presentan una intensidad de absorbancia SPR entre
0,4 y 1,2, para un paso óptico de 10 mm, a una longitud de onda de
400 nm.
23. Método, según la reivindicación 15, donde el
recubrimiento inerte es un material semiconductor, cerámico y/o
dieléctrico.
24. Método, según la reivindicación 23, donde el
recubrimiento inerte se selecciona entre: SiO_{2}, GeO_{2},
ZrO_{2}, TiO_{2} o ZnO_{2}.
25. Método, según la reivindicación 15, donde el
metal comprendido en el núcleo de la nanopartícula es plata o
aleaciones que comprendan plata.
26. Método, según la reivindicación 15, donde la
nanopartícula comprende externamente SiO_{2} e internamente un
núcleo de plata o aleaciones que comprendan plata.
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2009
- 2009-12-10 WO PCT/ES2009/070575 patent/WO2010066938A1/es active Application Filing
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PARGA, KENIA A. et al.; Core-shell nanoparticles for optical labeling in immunoassays; Abstracts of Papers, 227th ACS National Meeting, Anaheim, CA, United States, Marzo 28-Abril 1, 2004 (2004), CHED-730 Publisher: American Chemical Society, Washington, D. C. * |
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