ES2340983T3

ES2340983T3 - RETINAL PROTEINS TRANSLOCATED OF PROTONS WITH CONTENT OF ALL-TRANS-RETINAL CONSTANT AND DELAYED PHOTOCICLE.

Info

Publication number: ES2340983T3
Application number: ES01960574T
Authority: ES
Inventors: Dieter Oesterhelt; Norbert Hampp; Matthias Pfeiffer
Original assignee: Actilor GmbH
Current assignee: Actilor GmbH
Priority date: 2000-07-27
Filing date: 2001-07-27
Publication date: 2010-06-14
Anticipated expiration: 2021-07-27
Also published as: DE50115374D1; ATE459641T1; DE10048383A1

Abstract

The invention relates to proton-translocating retinal proteins, which have a slower photocycle in comparison to the wild type and whose all <i>trans</i> retinal content in both the light-adapted and dark-adapted states does not differ by more than 10 %. The invention also relates to a photochromic composition and to the use of both the proton-translocating retinal proteins and the photochromic composition.

Description

Proteínas de retinal translocadoras de protones con contenido de todo-trans-retinal constante y fotociclo retardado.Proton translocating retinal proteins with constant all- trans- retinal content and delayed photocycle.

La invención se refiere a una proteína de retinal translocadora de protones, a una composición fotocrómica que contiene la proteína de retinal translocadora de protones y al uso de la proteína de retinal translocadora de protones y de la composición.The invention relates to a protein of retinal proton translocator, to a photochromic composition that contains the proton translocator retinal protein and to use of the proton translocator retinal protein and of the composition.

Las halobacterias son arqueas que, además de las bacterias y los eucariotas, forman un tercer dominio de la vida. Las arqueas deben su nombre a los biotopos poco comunes en los que se presentan. Frecuentemente viven en condiciones "arcaicas", es decir, a temperaturas, concentraciones de sales o valores de pH extremos como pudieron haber predominado sobre la antigua superficie terrestre.Halobacteria are archaea that, in addition to the Bacteria and eukaryotes form a third domain of life. The archaea owe their name to the rare biotopes in which they present They frequently live in "archaic" conditions, it is that is, at temperatures, salt concentrations or pH values extremes as they could have predominated on the old surface land.

Las arqueas halófilas comprenden 9 géneros (por ejemplo, Halobacterium, Haloferax, Natronomonas, etc.) y son en su totalidad extremófilas, es decir, viven en disoluciones salinas cuya concentración va de 2 molar hasta la saturación y que algunas veces todavía presentan adicionalmente valores de pH alcalinos de hasta pH 11. En la naturaleza, las halobacterias son parte de un complejo sistema ecológico. La creciente salinidad con radiación solar permanente en plantas productoras de sal o las condiciones en el Mar Muerto y otras aguas hipersalinas naturales permiten en principio después de los aguaceros anuales el crecimiento fotolitótrofo de la alga verde halotolerante Duniella parva hasta un contenido de sal de aproximadamente el 12%. Después de superar las condiciones óptimas para ella, la Duniella muere y hace posible el crecimiento masivo de arqueas halófilas que, debido a su contenido de carotinoides, frecuentemente conducen a una coloración rojiza de estas aguas.Halophilic archaea comprise 9 genera (for example, Halobacterium, Haloferax, Natronomonas , etc.) and are entirely extremophilic, that is, they live in saline solutions whose concentration ranges from 2 molar to saturation and which sometimes still have additional values alkaline pH of up to pH 11. In nature, halobacteria are part of a complex ecological system. The increasing salinity with permanent solar radiation in salt producing plants or the conditions in the Dead Sea and other natural hypersaline waters allow in principle after the annual showers the photolithotrophic growth of the Duniella parva halotolerant green algae to a salt content of approximately 12% After overcoming the optimal conditions for her, Duniella dies and makes possible the massive growth of halophilic arches that, due to their carotinoid content, frequently lead to a reddish coloration of these waters.

Las arqueas halófilas poseen, además de la fermentación, respiración aerobia y anaerobia, una posibilidad adicional de transformación de energía que es extraordinaria entre las arqueas: pueden captar y convertir energía mediante fotosíntesis dependiente de retinal. A diferencia de la fotosíntesis verde dependiente de la clorofila, en la captación y transformación de energía sólo participa una única proteína, concretamente una proteína de retinal translocadora de protones impulsada por la luz.Halophilic arches possess, in addition to the fermentation, aerobic and anaerobic respiration, a possibility additional energy transformation that is extraordinary among the archaea: they can capture and convert energy through photosynthesis retinal dependent Unlike green photosynthesis dependent on chlorophyll, in the uptake and transformation of energy only participates a single protein, specifically a proton translocating retinal protein driven by the light.

El ejemplo más conocido de una proteína de retinal translocadora de protones es la bomba de protones arqueobacteriana bacteriorodopsina (BR) que aprovecha la energía de la luz directamente para producir un gradiente de protones electroquímico que se transforma en energía química. La bacteriorodopsina es una proteína de la membrana intrínseca con un peso molecular de aproximadamente 26 kDa. La cadena de polipéptidos atraviesa la membrana siete veces y así forma una estructura secundaria de siete regiones transmembrana helicoidales. Un retinal (aldehído de vitamina A) está covalentemente unido a la cadena lateral de una lisina de la séptima hélice en el interior de la proteína. El grupo CH=N formado se llama base de Schiff (SB) y en el estado de partida está protonado en el nitrógeno (SBH). El trabajo de Haupts y col. (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 367-99, 1999) da una visión general sobre la bacteriorodopsina.The best known example of a protein Retinal proton translocator is the proton pump bacteriorodopsin (BR) archaebacterial that harnesses the energy of light directly to produce a proton gradient electrochemical that is transformed into chemical energy. The bacteriorodopsin is an intrinsic membrane protein with a molecular weight of approximately 26 kDa. The polypeptide chain it crosses the membrane seven times and thus forms a structure secondary of seven helical transmembrane regions. A retinal (vitamin A aldehyde) is covalently bound to the chain side of a lysine of the seventh helix inside the protein. The group CH = N formed is called the Schiff base (SB) and in the Starting state is protonated in nitrogen (SBH). The job from Haupts et al. (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 367-99, 1999) gives an overview on the bacteriorodopsin.

El cromóforo de BR absorbe luz verde amarillenta como máximo a 570 nm de manera que la BR parece violeta para el ojo humano. Después de la absorción de un protón, la proteína experimenta cambios químicos y estructurales que conducen a productos intermedios diferenciables espectroscópicamente medibles. Se denominan con las letras K, L, M, N y O y se indican respectivamente con la longitud de onda de la absorción máxima. El ciclo puede describirse simplificadamente de la siguiente manera:BR chromophore absorbs yellowish green light at a maximum of 570 nm so that the BR looks violet to the eye human. After the absorption of a proton, the protein undergoes chemical and structural changes that lead to Spectroscopically measurable differentiable intermediate products. They are named with the letters K, L, M, N and O and are indicated respectively with the maximum absorption wavelength. He cycle can be described simply as follows way:

BR_{570} \rightarrow K_{590} \rightarrow L_{550} \rightarrow M_{410} \rightarrow N_{560} \rightarrow O_{640} \rightarrow BR_{570}BR_ {570} \ rightarrow K_ {590} \ rightarrow L_ {550} \ rightarrow M_ {410} \ rightarrow N_ {560} \ rightarrow O_ {640} \ rightarrow BR_ {570}

La bacteriorodopsina es hasta la fecha la única proteína de retinal que se presenta en la naturaleza en forma de un cristal bidimensional. En la bacteria, los cristales están localizados en la llamada membrana púrpura. La organización en la membrana púrpura estabiliza la proteína hasta tal punto que ha sido propuesta para una serie de aplicaciones industriales (resumido en Oesterhelt y col., Quarterly Rev. Biophysics 24, 425-478, 1991). A este respecto pueden aprovecharse los cambios que se producen con la iluminación del valor de pH de la disolución, de la tensión eléctrica y del color.Bacteriorodopsin is the only one to date retinal protein that occurs in nature in the form of a two-dimensional glass In the bacteria, the crystals are located in the so-called purple membrane. The organization in the purple membrane stabilizes the protein to such an extent that it has been proposal for a series of industrial applications (summarized in Oesterhelt et al., Quarterly Rev. Biophysics 24, 425-478, 1991). In this regard they can take advantage the changes that occur with the illumination of the pH value of the dissolution, electrical voltage and color.

Por tanto, el cambio de color del violeta de la bacteriorodopsina en el estado inicial BR570 al amarillo en el producto intermedio M_{410} es la base para aplicaciones en la tecnología de la información óptica. La descomposición del producto intermedio M_{410} que tiene una vida media de pocos milisegundos es la etapa determinante de la velocidad en este ciclo. La intensidad de la luz y la constante de descomposición térmica del producto intermedio M determinan en el fotociclo la relación de los colores violeta y amarillo.Therefore, the color change of the violet of the bacteriorodopsin in the initial state BR570 to yellow in the intermediate product M_ {410} is the basis for applications in the optical information technology. Product breakdown intermediate M_ {410} which has a half-life of a few milliseconds It is the speed determining stage in this cycle. The light intensity and thermal decomposition constant of intermediate M determines in the photocycle the ratio of violet and yellow colors.

La parte de retinilideno de la bacteriorodopsina está presente en la oscuridad como una mezcla de configuraciones todo-trans, 15-anti y 13-cis, 15-sin en la relación de aproximadamente 60:40. Sólo la forma todo-trans del cromóforo media en el proceso fisiológico de la translocación de protones y pasa por el producto intermedio amarillo M_{410} ("ciclo trans"). Aunque la absorción de protones en la configuración 13-cis también conduce a un ciclo de cambios de color, el "ciclo cis", sin embargo éste se diferencia del "ciclo trans" en que no se forma ningún producto intermedio amarillo similar a M. Del "ciclo cis" la molécula salta con iluminación con una probabilidad muy pequeña al "ciclo trans". Este cambio del "ciclo cis" al "trans" se denomina adaptación a la claridad de la forma adaptada a la oscuridad. En la práctica esto significa que después de guardar en la oscuridad una muestra (adaptación a la oscuridad), una iluminación inicial sólo conduce a aproximadamente el 60% del producto intermedio M teórico. Mediante otra iluminación, la muestra se adapta poco a poco (adaptación a la claridad) de manera que finalmente todas las moléculas se transfieren al "ciclo trans" y pasan por el producto intermedio M.The retinylidene part of bacteriorodopsin is present in the dark as a mixture of all-trans, 15- anti and 13- cis configurations, 15- without in the ratio of approximately 60:40. Only the all-trans form of the medium chromophore in the physiological process of proton translocation passes through the yellow intermediate M_ {410} (" trans cycle"). Although the absorption of protons in the 13- cis configuration also leads to a cycle of color changes, the " cis cycle", however this differs from the " trans cycle" in that no yellow intermediate product similar to M. is formed. From the " cis cycle" the molecule jumps with illumination with a very small probability to the " trans cycle". This change from the " cis cycle" to the " trans " is called adaptation to the clarity of the form adapted to darkness. In practice this means that after storing a sample in the dark (adaptation to darkness), an initial illumination only leads to approximately 60% of the theoretical intermediate M. Through another illumination, the sample adapts little by little (adaptation to clarity) so that finally all the molecules are transferred to the " trans cycle" and pass through the intermediate product M.

El cambio de las moléculas del "ciclo cis" al "trans" conduce a un desplazamiento de varios nm del máximo de absorción y significa una desventaja considerable para el uso de bacteriorodopsinas durante la preparación de productos fotocrómicos, por ejemplo, películas ópticas o tintas de impresión.The change of the molecules from the " cis cycle" to the " trans " leads to a displacement of several nm of the maximum absorption and represents a considerable disadvantage for the use of bacteriorhodopsins during the preparation of photochromic products, for example, optical films or inks of Print.

Por tanto, sería deseable preparar proteínas de retinal translocadoras de protones cuyo máximo de absorción en estado adaptado a la oscuridad se correspondiera a ser posible de forma exacta al estado adaptado a la claridad. Además, sería ventajoso si pudiera aumentarse la estabilidad del producto intermedio M para poder observar a ser posible de forma exacta el cambio de color de violeta a amarillo de las moléculas presentes en el "ciclo trans".Therefore, it would be desirable to prepare proton translocating retinal proteins whose maximum absorption in the dark-adapted state corresponded to being exactly possible to the light-adapted state. In addition, it would be advantageous if the stability of intermediate M could be increased so as to be able to observe exactly if possible the color change from violet to yellow of the molecules present in the " trans cycle".

Según la invención, ahora se proporciona una proteína de retinal translocadora de protones que se selecciona del grupo de:According to the invention, a proton translocator retinal protein that is selected from group of:

(i)(i): Muteínas de una proteína de retinal translocadora de protones natural de arqueobacterias halófilas que presentan un fotociclo retardado (mutación de tipo 1) y cuyo: contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10% (mutación de tipo 2) y/oMuteins of a natural proton translocating retinal protein of halophilic archaebacteria that have a delayed photocycle (type 1 mutation) and whose: all- trans- retinal content in a state adapted to lightness and darkness does not differ from each other more than 10% (type 2 mutation) and / or

(ii)(ii): Homólogos de las muteínas (i) con fotociclo retardado cuya composición de isómeros de retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10%.Mutein homologues (i) with delayed photocycle whose composition of retinal isomers in been adapted to lightness and darkness does not differ each other more than 10%.

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Por una muteína se entiende proteínas de retinal translocadoras de protones modificadas por una sustitución, deleción o inserción. Las muteínas pueden presentar una o varias mutaciones. Las mutaciones de tipo 1 son a este respecto mutaciones que conducen a un retardo del fotociclo en comparación con la proteína de retinal natural de Halobacterium salinarum (SEC ID No.1). La medición del fotociclo se realiza a este respecto como se describe, por ejemplo, por Miller & Oesterhelt, Biochem. Biophys. Acta 1020, 57-64, 1990. Las mutaciones de tipo 2 conducen a una elevada constancia en comparación con la proteína de retinal natural de Halobacterium salinarum (SEC ID No.1) del contenido de todo-trans-retinal en la proteína adaptada a la claridad y a la oscuridad. El contenido de todo-trans-retinal se determina a este respecto como se describe por Tittor y col., Biophys. J. 67, 1682-1690, 1994. El porcentaje se refiere al contenido total de los isómeros de retinal determinables mediante el procedimiento mencionado. Normalmente, las mutaciones de tipo 1 y las mutaciones de tipo 2 afectan a distintos aminoácidos. Sin embargo, también es posible que una única mutación presente ambas acciones deseadas y, por tanto, pueda clasificarse al mismo tiempo como mutación de tipo 1 y de tipo 2. En tanto que las proteínas de retinal translocadoras de protones arqueobacterianas que se presentan naturalmente presenten un fotociclo retardado en comparación con la proteína de retinal translocadora de protones más conocida, es decir, la bacteriorodopsina de Halobacterium salinarum (SEC ID No.1) y su contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencie entre sí más del 10%, también valen en el marco de la presente invención como muteínas.A mutein means proton translocating retinal proteins modified by a substitution, deletion or insertion. Muteins can have one or several mutations. Type 1 mutations are in this respect mutations that lead to a delay of the photocycle compared to the natural retinal protein of Halobacterium salinarum (SEQ ID No.1). The measurement of the photocycle is carried out in this regard as described, for example, by Miller & Oesterhelt, Biochem. Biophys Acta 1020, 57-64, 1990. Type 2 mutations lead to high constancy compared to the natural retinal protein of Halobacterium salinarum (SEQ ID No.1) of the content of all- trans- retinal in the protein adapted to The light and the dark. The content of all- trans- retinal is determined in this regard as described by Tittor et al., Biophys. J. 67, 1682-1690, 1994. The percentage refers to the total content of retinal isomers determinable by the aforementioned procedure. Typically, type 1 mutations and type 2 mutations affect different amino acids. However, it is also possible for a single mutation to present both desired actions and, therefore, can be classified at the same time as a type 1 and type 2 mutation. As long as the naturally occurring archaebacterial proton translocating retinal proteins present a delayed photocycle compared to the best known proton translocator retinal protein, that is, the bacteriorodopsin of Halobacterium salinarum (SEQ ID No.1) and its all- trans- retinal content in a state adapted to lightness and darkness not differ from each other by more than 10%, they are also valid as muteins in the context of the present invention.

El término conocido para el experto "homólogo" designa una semejanza entre dos o más péptidos, polipéptidos o proteínas que puede determinarse mediante la coincidencia entre las secuencias mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, de comparaciones de secuencias asistidas por ordenador (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul y col., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410). El porcentaje de identidad resulta del porcentaje de intervalos idénticos en dos o más secuencias considerando los huecos u otras particularidades de secuencias. Generalmente se utilizan programas informáticos especiales con algoritmos que consideran los requisitos especiales.The term known to the expert "homolog" means a similarity between two or more peptides, polypeptides or proteins that can be determined by the match between sequences by known procedures, for example, of computer-assisted sequence comparisons (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410). The percentage of identity results from the percentage of identical intervals in two or more sequences considering the gaps or other peculiarities of sequences Computer programs are generally used special algorithms that consider the requirements special.

Los procedimientos preferidos para determinar la homología generan inicialmente la mayor coincidencia entre las secuencias investigadas. Los programas informáticos para determinar la c identidad entre dos secuencias comprenden, pero no se limitan a, el paquete informático GCG, incluido GAP (Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12 (12):387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl)); BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. y col., J. Mol. Biol. 215:403-410) (1999)). El programa BLASTX puede obtenerse del Centro nacional de información biotecnológica (NCBI) y de otras fuentes (BLAST Handbuch, Altschul S., y col., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., y col., Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). También puede usarse el conocido algoritmo de Smith Waterman para determinar el porcentaje de identidad.Preferred procedures to determine the homology initially generate the greatest coincidence between sequences investigated. The computer programs to determine the identity c between two sequences comprise, but are not limited a, the GCG software package, including GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl)); BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410) (1999)). The BLASTX program can be obtained from the National Center for Biotechnological information (NCBI) and other sources (BLAST) Handbuch, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al., Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). The well-known Smith algorithm can also be used Waterman to determine the percentage of identity.

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Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de aminoácidos comprenden los siguientes:Preferred parameters for the comparison of amino acid sequences comprise the following:

100100

El programa GAP también es adecuado para el uso con los parámetros anteriores. Los parámetros anteriores son los parámetros por defecto (default parameters) para las comparaciones de secuencias de aminoácidos no cambiando los huecos el valor en los extremos. Por tanto, la invención también comprende proteínas de fusión, es decir, proteínas de retinal translocadoras de protones con una proporción de proteínas de fusión. En secuencias muy cortas en comparación con la secuencia de referencia puede ser además necesario aumentar el valor esperado hasta 100.000 (expectation valué) y dado el caso reducir la longitud de palabra (word size) hasta 2.The GAP program is also suitable for use with the above parameters. The above parameters are the default parameters for comparisons of amino acid sequences not changing the gaps the value in the extremes Therefore, the invention also comprises proteins of fusion, i.e. proton translocator retinal proteins with a proportion of fusion proteins. In very short sequences in comparison to the reference sequence it can also be it is necessary to increase the expected value up to 100,000 (expectation I valued) and if necessary reduce the word length up to 2.

Pueden usarse otros algoritmos a modo de ejemplo, valores de apertura de huecos (gap opening penalties), valores de extensión de huecos (gap extensión penalties), matrices comparativas, incluidas las mencionadas en el manual del programa, Wisconsin-Paket, versión 9, septiembre de 1997. La elección depende de la comparación que va a realizarse y además de si la comparación se realiza entre pares de secuencias, prefiriéndose GAP o Best Fit, o entre una secuencia y una amplia base de datos de secuencias, prefiriéndose FASTA o BLAST.Other algorithms can be used as a example, opening values of gaps (gap opening penalties), gap extension values (gap extension penalties), matrices comparatives, including those mentioned in the program manual, Wisconsin-Paket, version 9, September 1997. The choice depends on the comparison to be made and in addition to if the comparison is made between pairs of sequences, preferring GAP or Best Fit, or between a sequence and a wide sequence database, with FASTA or BLAST being preferred.

Una coincidencia del 40% determinada con el algoritmo anteriormente mencionado se designa en el marco de esta solicitud como el 40% de identidad. Se aplica lo mismo a mayores porcentajes.A coincidence of 40% determined with the algorithm mentioned above is designated within the framework of this request as 40% identity. The same applies to seniors percentages

Ahora se ha mostrado sorprendentemente que la combinación de una mutación de tipo 1 y una mutación de tipo 2 en la proteína de retinal translocadora de protones según la invención puede conducir a una constancia considerable del contenido de todo-trans-retinal, así como a un retardo del fotociclo. El contenido de todo-trans-retinal de la forma adaptada a la oscuridad de la proteína de retinal translocadora de protones según la invención se diferencia de la forma adaptada a la claridad generalmente en no más del 10%. En formas de realización preferidas, las diferencias son incluso más pequeñas y se encuentran en como máximo el 8 o incluso como máximo el 5%. Además, se ha mostrado sorprendentemente que precisamente las muteínas cuyo contenido de todo-trans-retinal no se diferencia esencialmente en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad, es decir, en no más del 10% presentan un contenido de todo-trans-retinal de al menos el 60% en estado adaptado tanto a la claridad como a la oscuridad. Este efecto secundario inesperado es extraordinariamente ventajoso ya que cualquier aumento de la proporción de las moléculas que participan en el "ciclo trans" conduce con iluminación a un cambio de color más obvio y, por tanto, a una mejora de las propiedades ópticas.It has now been surprisingly shown that the combination of a type 1 mutation and a type 2 mutation in the proton translocating retinal protein according to the invention can lead to a considerable constancy of the all- trans- retinal content, as well as to a Photocycle delay. The all- trans- retinal content of the dark-adapted form of the proton translocating retinal protein according to the invention differs from the light-adapted form generally by no more than 10%. In preferred embodiments, the differences are even smaller and are at a maximum of 8 or even a maximum of 5%. In addition, it has been surprisingly shown that precisely the muteins whose content of all- trans- retinal does not differ essentially in a state adapted to lightness and darkness, that is, in no more than 10% they have an all- trans- retinal content at least 60% in a state adapted to both lightness and darkness. This unexpected side effect is extraordinarily advantageous since any increase in the proportion of the molecules that participate in the " trans cycle" leads with illumination to a more obvious color change and, therefore, to an improvement of the optical properties.

Según la invención se proporcionan muteínas que presentan un contenido de todo-trans-retinal constante en el intervalo de al menos el 60 al 100%, preferiblemente del 62% o 65% al 100%. Mientras que la mayoría de las proteínas de retinal presentan un contenido de todo-trans-retinal en el intervalo del 60 ó 65% al 85%, formas de realización especialmente preferidas prevén un contenido de todo-trans-retinal de al menos el 70% o el 75%, mejor incluso del 80% al 100%.According to the invention, muteins are provided which have a constant all- trans- retinal content in the range of at least 60 to 100%, preferably 62% or 65% to 100%. While most retinal proteins have an all- trans- retinal content in the range of 60 or 65% to 85%, especially preferred embodiments provide for an all- trans- retinal content of at least 70% or 75%, better even from 80% to 100%.

En una forma de realización preferida, la proteína de retinal translocadora de protones natural cuya(s) muteína(s) presenta(n) las propiedades anteriormente mencionadas es una bacteriorodopsina arqueobacteriana, por ejemplo, una rodopsina halobacteriana, preferiblemente bacteriorodopsina (SEC ID No. 1) de Halobacterium salinarum.In a preferred embodiment, the natural proton translocating retinal protein whose mutein (s) has the aforementioned properties is an archaebacterial bacteriorhodopsin, for example, a halobacterial rhodopsin, preferably bacteriorhodopsin (SEQ ID NO. 1) Halobacterium salinarum .

La proteína de retinal translocadora de protones según la invención comprende muteínas con una mutación de tipo 1 y de tipo 2 cuya secuencia de aminoácidos presenta al menos el 40% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1. En otras formas de realización, la identidad asciende a al menos el 50, 60 ó 70%. En formas de realización especialmente preferidas, la identidad asciende a al menos el 80, 90 ó 95%.Proton translocator retinal protein according to the invention comprises muteins with a type 1 mutation and type 2 whose amino acid sequence has at least 40% of identity with the amino acid sequence SEQ ID No.1. In others embodiments, the identity amounts to at least 50, 60 or 70% In especially preferred embodiments, the identity amounts to at least 80, 90 or 95%.

En otra forma de realización preferida, en el caso de la proteína de retinal translocadora de protones se trata de un homólogo con una secuencia de aminoácidos que en el intervalo de la hélice C y/o la hélice F presenta al menos el 60% de identidad con las secuencias de aminoácidos correspondientes de la bacteriorodopsina madura de SEC ID No.1. En otras formas de realización preferidas, el porcentaje de la identidad para la hélice C y/o la hélice F se encuentra en al menos el 70, 80 ó 90%, preferiblemente en al menos el 95%. El grado de identidad para la hélice C y F puede ser a este respecto igual o distinto.In another preferred embodiment, in the Proton translocator retinal protein case is about a homologue with an amino acid sequence that in the range of helix C and / or helix F has at least 60% identity with the corresponding amino acid sequences of the mature bacteriorodopsin of SEQ ID No.1. In other ways of preferred embodiment, the percentage of the identity for the propeller C and / or helix F is at least 70, 80 or 90%, preferably at least 95%. The degree of identity for the Helix C and F may be the same or different in this respect.

El fotociclo de la proteína de retinal translocadora de protones según la invención se retarda por la mutación de tipo 1. El tiempo de ciclo térmico asciende en cualquier caso a más de 10 ms, preferiblemente a más de 1 s o incluso a más de 10 s. En formas de realización especialmente preferidas, el tiempo de ciclo térmico se encuentra en el intervalo de minutos, es decir, asciende a más de 1 min, en otras formas de realización preferidas incluso a más de 5 ó 10 min. Sin embargo, el tiempo de ciclo térmico puede ascender en último extremo hasta 2 horas, pero generalmente a no más de 90 ó 60 min.The photocycle of the retinal protein proton translocator according to the invention is delayed by the Type 1 mutation. The thermal cycle time amounts to any case more than 10 ms, preferably more than 1 s or even more than 10 sec. In especially preferred embodiments, time thermal cycle is in the interval of minutes, that is, amounts to more than 1 min, in other preferred embodiments even more than 5 or 10 min. However, the thermal cycle time it can last up to 2 hours, but generally to no more than 90 or 60 min.

La mutación de tipo 1 de la proteína de retinal translocadora de protones puede consistir en un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que participan en la proteína natural en el ciclo catalítico. Por tanto, la presente invención comprende proteínas de retinal en las que, por ejemplo, una o varias de las posiciones de aminoácidos que participan en la translocación de protones del grupo de los restos de aminoácidos D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 y/o E204 según SEC ID No.1 o de los restos de aminoácidos correspondientes a ellos están modificadas en proteínas homologas. Un intercambio de aminoácidos preferido es D96N, es decir, el aminoácido D de la posición 96 de SEC ID No.1 o el aminoácido correspondiente en una proteína homologa se sustituyen con N. Otros intercambios de aminoácidos preferidos son D38R y D102R y/o D104R.Type 1 mutation of the retinal protein proton translocator can consist of an exchange of amino acids in one or more of the amino acid positions that they participate in the natural protein in the catalytic cycle. So, The present invention comprises retinal proteins in which, by example, one or more of the amino acid positions that participate in the translocation of protons of the group of the remains of amino acids D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 and / or E204 according SEQ ID No.1 or the amino acid residues corresponding thereto They are modified in homologous proteins. An exchange of Preferred amino acid is D96N, that is, amino acid D of the position 96 of SEQ ID No.1 or the corresponding amino acid in a Homologous protein is replaced with N. Other exchanges of Preferred amino acids are D38R and D102R and / or D104R.

La mutación de tipo 2 de las proteínas de retinal de las proteínas de retinal según la invención conduce a un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que forman la bolsa de unión a retinal, y/o posiciones inmediatamente contiguas. Por bolsa de unión a retinal se entiende la suma de aminoácidos que confieren a la base de Schiff del retinal sus propiedades químicas y físicas características. Los aminoácidos o aminoácidos inmediatamente contiguos que forman la bolsa de unión a retinal se seleccionan del grupo de los restos de aminoácidos Val49, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 y Met145 según SEC ID No.1 o de los restos de aminoácidos correspondientes a ellos en proteínas homólogas. En formas de realización preferidas, la mutación de tipo 2 es V49A, V49G, V49F, L93A, G122K, G122C, G122M, S141A, S141M, M1451, M145F, M145W, M145C o M145K. Estas mutaciones de tipo 2 producen de manera sorprendente una constancia de la proporción de todo-trans en la parte de retinilideno de la bacteriorodopsina en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad.Type 2 mutation of the proteins of retinal retinal proteins according to the invention leads to a amino acid exchange in one or more of the positions of amino acids that form the retinal binding bag, and / or positions immediately adjacent. Retinal binding bag means the sum of amino acids that confer on the Schiff base of the retinal its characteristic chemical and physical properties. Amino acids or immediately contiguous amino acids that form the binding bag to retinal are selected from the group of amino acid residues Val49, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 and Met145 according to SEQ ID No.1 or of the amino acid residues corresponding to them in proteins homologous In preferred embodiments, the type mutation 2 is V49A, V49G, V49F, L93A, G122K, G122C, G122M, S141A, S141M, M1451, M145F, M145W, M145C or M145K. These type 2 mutations surprisingly produce a record of the proportion of all-trans in the retinylidene part of the bacteriorodopsin in a state adapted to clarity and darkness.

En la siguiente Tabla se muestran los máximos de absorción y las relaciones de isómeros de retinal del tipo natural de Halobacterium salinarum (WT), de los mutantes de tipo 1 puros D96N, de los mutantes de tipo 2 puros M145F y L93A, así como de las proteínas de retinal según la invención D96N-M145F y D96N-L93A:The following table shows the maximum absorption and ratios of retinal isomers of the natural type of Halobacterium salinarum (WT), of the pure type 1 mutants D96N, of the pure type 2 mutants M145F and L93A, as well as of Retinal proteins according to the invention D96N-M145F and D96N-L93A:

1one

Las combinaciones especialmente preferidas de mutaciones de tipo 1 y de tipo 2 son, por ejemplo, V49A-D96N, L93A-D96N y M145F-D96N (véase la Figura 1).Especially preferred combinations of Type 1 and Type 2 mutations are, for example, V49A-D96N, L93A-D96N and M145F-D96N (see Figure 1).

En otra forma de realización, las proteínas de retinal según la invención se presentan en forma unida a la membrana presentando la membrana una densidad entre 1,10 y 1,20 g/cm^{3}. En una forma de realización preferida, la densidad asciende a entre 1,175 y 1,185 g/cm^{3}. Se prefiere especialmente la forma de una membrana púrpura con una densidad de 1,18 g/cm^{3}.In another embodiment, the proteins of retinal according to the invention are presented in membrane bound form the membrane having a density between 1.10 and 1.20 g / cm3. In a preferred embodiment, the density amounts to between 1,175 and 1,185 g / cm3. Especially preferred is the shape of a purple membrane with a density of 1.18 g / cm3.

Según la invención se proporcionan además ácidos nucleicos que codifican las proteínas de retinal anteriormente descritas. Estos ácidos nucleicos pueden producirse, por una parte, mediante mutaciones de genes ya conocidos para proteínas de retinal translocadoras de protones, por ejemplo, del gen que codifica la bacteriorodopsina de Halobacterium salinarum (Dunn y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6744-6748, 1981), por otra parte se preparan de forma completamente sintética según procedimientos conocidos. Como el código genético de las arqueas no se diferencia del de los procariotas y eucariotas, según las reglas conocidas también pueden prepararse ácidos nucleicos previstos para la transformación en halobacterias. No obstante, el experto se esforzará en considerar una utilización de codones adaptada al organismo huésped respectivamente previsto. En el caso de los ácidos nucleicos según la invención puede tratarse de ácidos ribonucleicos y/o ácidos desoxirribonucleicos.According to the invention, nucleic acids encoding the retinal proteins described above are also provided. These nucleic acids can be produced, on the one hand, by mutations of genes already known for proton translocating retinal proteins, for example, from the gene encoding the bacteriorodopsin of Halobacterium salinarum (Dunn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6744-6748, 1981), on the other hand they are prepared completely synthetically according to known procedures. Since the genetic code of archaea is not different from that of prokaryotes and eukaryotes, according to known rules, nucleic acids intended for transformation into halobacteria can also be prepared. However, the expert will endeavor to consider a codon use adapted to the host organism respectively provided. In the case of the nucleic acids according to the invention, they may be ribonucleic acids and / or deoxyribonucleic acids.

Según la invención se ponen además a disposición vectores que comprenden los ácidos nucleicos que codifican la proteína de retinal translocadora de protones. Dependiendo del organismo huésped previsto para este vector, el experto selecciona entre vectores arqueobacterianos, vectores para la expresión en procariotas (E. coli, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, etc.) o eucariotas (levadura, cultivos de células animales (CHO, HeLa, COS, etc.), plantas o células de vegetales, células de insectos).According to the invention, vectors comprising nucleic acids encoding the proton translocator retinal protein are also made available. Depending on the host organism provided for this vector, the expert selects among archaeobacterial vectors, vectors for expression in prokaryotes ( E. coli, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella , etc.) or eukaryotes (yeast, animal cell cultures (CHO, HeLa, COS, etc.), plant or plant cells, insect cells).

Según la invención se proporciona además una célula huésped que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína de retinal translocadora de protones según la invención o un vector según la invención. En el caso de las células huésped se trata, por ejemplo, de arqueas, preferiblemente halobacterias, con especial preferencia Halobacterium salinarum, cuya transformación se ha descrito (Cline y col., Can. J. Microbiol. 35, 148-152, 1989). Alternativamente, los vectores según la invención también pueden expresarse en E. coli u otros huéspedes procariotas, en caso de necesidad también en las células eucariotas anteriormente mencionadas.According to the invention, a host cell is also provided containing a nucleic acid encoding a proton translocating retinal protein according to the invention or a vector according to the invention. In the case of host cells these are, for example, archaea, preferably halobacteria, especially Halobacterium salinarum , whose transformation has been described (Cline et al., Can. J. Microbiol. 35, 148-152, 1989) . Alternatively, the vectors according to the invention can also be expressed in E. coli or other prokaryotic hosts, if necessary also in the aforementioned eukaryotic cells.

Según la invención se proporciona además una composición fotocrómica que puede contener, adicionalmente a una proteína de retinal translocadora de protones según la invención, estabilizadores, aditivos que reducen la formación de espuma y/o absorbentes de luz UV y/o sustancias tampón.According to the invention there is also provided a photochromic composition that may contain, in addition to a proton translocator retinal protein according to the invention, stabilizers, additives that reduce foaming and / or UV light absorbers and / or buffer substances.

La composición fotocrómica según la invención puede contener, por ejemplo, glicerol, polímeros orgánicos y/o disolventes orgánicos.The photochromic composition according to the invention it may contain, for example, glycerol, organic polymers and / or organic solvents

Las proteínas de retinal translocadoras de protones según la invención o las composiciones fotocrómicas que las contienen pueden usarse para preparar películas ópticas. La preparación de películas ópticas a partir de bacteriorodopsinas ya se conoce y se ha descrito detalladamente, por ejemplo, en Hampp y col., SPIE 3623, 243, 1999. Una película óptica preparada usando las proteínas de retinal translocadoras de protones según la invención es adecuada para grabaciones ópticas. Otra posibilidad de uso de tales películas ópticas se da con la interferometría o con el reconocimiento holográfico de patrones. También es posible el uso de películas ópticas como moduladores ópticos de la luz. Además, es posible la preparación de memorias de gran volumen para el almacenamiento óptico de datos (Birge, Scientific American, 1995, 66).Retinal translocating proteins from protons according to the invention or photochromic compositions that They contain can be used to prepare optical films. The preparation of optical films from bacteriorodopsins and it is known and described in detail, for example, in Hampp and col., SPIE 3623, 243, 1999. An optical film prepared using the proton translocating retinal proteins according to the invention It is suitable for optical recordings. Another possibility of using such optical films occur with interferometry or with the Holographic pattern recognition. It is also possible to use optical films as optical light modulators. It is also possible the preparation of large volume memories for the optical data storage (Birge, Scientific American, 1995, 66).

La presente invención proporciona además el uso de una proteína de retinal translocadora de protones y/o una composición fotocrómica como colorante de seguridad. En una primera forma de realización, la proteína de retinal y/o la composición fotocrómica se aplica sobre un documento que requiere seguridad o un objeto que requiere seguridad. En otra forma de realización, la composición fotocrómica (o la proteína de retinal) según la invención aplicada sobre el documento que requiere seguridad o el objeto que requiere seguridad se fija sobre el documento u objeto.The present invention further provides the use of a proton translocating retinal protein and / or a Photochromic composition as a safety dye. In a first embodiment, retinal protein and / or composition Photochromic applies to a document that requires security or a object that requires security. In another embodiment, the photochromic composition (or retinal protein) according to the invention applied to the document that requires security or the object that requires security is fixed on the document or object.

A este respecto, la fijación según de la presente invención puede efectuarse mediante inclusión física o acoplamiento covalente al documento. Según la invención, el documento que requiere seguridad es, por ejemplo, un papel de seguridad, un carnet o un billete de banco. Sin embargo, como documento también puede servir según la invención cualquier otro documento para el que existe una necesidad de seguridad.In this regard, fixing according to the The present invention can be carried out by physical inclusion or covalent coupling to the document. According to the invention, the document that requires security is, for example, a role of security, a card or a banknote. However, as document can also serve according to the invention any other document for which there is a need for security.

Finalmente, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar documentos con característica de seguridad que se caracteriza porque antes, durante o después de la preparación de un documento se aplica de forma habitual una proteína de retinal translocadora de protones según la invención o una composición fotocrómica según la invención y dado el caso se fija.Finally, the present invention provides a procedure to prepare documents with the characteristic of security that is characterized because before, during or after the document preparation is usually applied a protein of proton translocator retinal according to the invention or a photochromic composition according to the invention and if necessary fixed.

Las siguientes figuras y ejemplos explican la invención.The following figures and examples explain the invention.

La Figura 1 muestra los espectros de absorción de distintas proteínas de retinal translocadoras de protones según la invención en comparación con el espectro del tipo natural o de muteínas con sólo una mutación. Las líneas continuas muestran respectivamente el espectro de absorción en el estado adaptado a la claridad, las líneas discontinuas en el estado adaptado a la oscuridad. En particular muestran:Figure 1 shows the absorption spectra of different proton translocating retinal proteins according to the invention compared to the spectrum of the natural type or of Muteins with only one mutation. Solid lines show respectively the absorption spectrum in the state adapted to the clarity, dashed lines in the state adapted to the darkness. In particular they show:

Figura 1A Halobacterium salinarum natural con la secuencia de aminoácidos de SEC ID No.1. El máximo de absorción en el estado adaptado a la claridad se encuentra en 568 nm, en estado adaptado a la oscuridad en 560 nm.Figure 1A Halobacterium salinarum natural with the amino acid sequence of SEQ ID No.1. The maximum absorption in the light-adapted state is at 568 nm, in the dark-adapted state at 560 nm.

Figura 1B Espectro de absorción del mutante de tipo 1 D96N. El máximo de absorción se desplaza de 569 nm en el estado adaptado a la claridad hacia 560 nm en el estado adaptado a la oscuridad.Figure 1B Absorption spectrum of the mutant of type 1 D96N. The maximum absorption is displaced from 569 nm in the state adapted to clarity towards 560 nm in the state adapted to Darkness.

Figura 1C Mutante de tipo 2 V49A. El máximo de absorción se encuentra tanto en el estado adaptado a la claridad como en el estado adaptado a la oscuridad en 549 nm.Figure 1C Type 2 mutant V49A. The maximum of absorption is both in the state adapted to clarity as in the state adapted to darkness at 549 nm.

Figura 1D Proteína de retinal según la invención con la mutación doble V49A-D96N. El máximo de absorción de 559 nm en el estado adaptado a la claridad se desplaza 2 nm hacia 557 nm en el estado adaptado a la oscuridad.Figure 1D Retinal protein according to the invention with the double mutation V49A-D96N. The maximum of 559 nm absorption in the state adapted to clarity shifts 2 nm towards 557 nm in the dark-adapted state.

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Figura 1E Mutación de tipo 1 L93A. El máximo de absorción se encuentra tanto en el estado adaptado a la claridad como en estado adaptado a la oscuridad en 541 nm.Figure 1E Mutation type 1 L93A. The maximum of absorption is both in the state adapted to clarity as in a state adapted to darkness at 541 nm.

Figura 1F Proteína de retinal según la invención con la mutación doble L93A-D96N. El máximo de absorción se encuentra tanto en el estado adaptado a la claridad como en el estado adaptado a la oscuridad en 544 nm. Este mutante doble alcanza en el estado adaptado a la oscuridad una proporción de todo-trans de más del 80%.Figure 1F Retinal protein according to the invention with the double mutation L93A-D96N. The maximum of absorption is both in the state adapted to clarity as in the state adapted to darkness at 544 nm. This mutant double reaches in the dark-adapted state a proportion of all-trans of more than 80%.

Figura 1G Mutación de tipo 2 M145F. El máximo de absorción se encuentra en el estado adaptado a la claridad en 559 nm, en el estado adaptado a la oscuridad en 558 nm.Figure 1G Mutation type 2 M145F. The maximum of absorption is in the state adapted to clarity in 559 nm, in the dark-adapted state at 558 nm.

Figura 1H Proteína de retinal según la invención con la mutación doble D96N-M145F. Este mutante doble alcanza en el estado adaptado a la oscuridad una proporción de todo-trans del 66%; el máximo de absorción se encuentra tanto para la proteína de retinal adaptada a la claridad como para la adaptada a la oscuridad en 560 nm.Figure 1H Retinal protein according to the invention with the double mutation D96N-M145F. This double mutant in the dark-adapted state it reaches a proportion of 66% all-trans; the maximum absorption is finds both for retinal protein adapted to clarity as for the one adapted to the darkness at 560 nm.

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Example 1 Preparation of a photochromic composition

Para la preparación de una composición fotocrómica, las proteínas de retinal translocadoras de protones individuales se obtienen inicialmente o a partir de poblaciones de halobacterias naturales o recombinantemente mediante transformación de Halobacterium salinarum (Cline & Doolittle, J. Bact. 169,1341-1344,1987) según mutagénesis específica de sitio del gen de bacteriorodopsina (Dunn y col., Proc. Natl. Acad. Se., USA 78, 6744-6748). La membrana púrpura de las halobacterias transformadas se aísla y se purifica mediante procedimientos conocidos (Oesterhelt & Stoeckenius, Meth. Enzym. 31, 667-678, 1974). Para la obtención de bacteriorodopsina a gran escala puede utilizarse el procedimiento descrito en la solicitud de patente alemana 199 45 798.0.For the preparation of a photochromic composition, individual proton translocator retinal proteins are initially obtained or from natural halobacterial populations or recombinantly by transformation of Halobacterium salinarum (Cline & Doolittle, J. Bact. 169,1341-1344,1987) according to site-specific mutagenesis of the bacteriorodopsin gene (Dunn et al., Proc. Natl. Acad. Se., USA 78, 6744-6748). The purple membrane of the transformed halobacteria is isolated and purified by known procedures (Oesterhelt & Stoeckenius, Meth. Enzym. 31, 667-678, 1974). The procedure described in German patent application 199 45 798.0 can be used to obtain bacteriorodopsin on a large scale.

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Example 2 Fixing the photochromic composition on a surface

La composición fotocrómica según la invención puede incluirse, por ejemplo, físicamente en un material de matriz. Concretamente se suspenden homogéneamente, por ejemplo, 10 mg de membrana púrpura que contiene bacteriorodopsina-D96N/M145F en 4 ml de un colorante que endurece por UV (IFS 3000, Firma Schmitt) y se aplica sobre el documento que requiere seguridad. Después de la iluminación UV (según instrucciones del fabricante) del documento marcado de esa forma, las partículas de la membrana púrpura se encuentran en el plástico curado.The photochromic composition according to the invention it can be included, for example, physically in a matrix material. Specifically, they are suspended homogeneously, for example, 10 mg of purple membrane containing bacteriorodopsin-D96N / M145F in 4 ml of a dye which hardens by UV (IFS 3000, Schmitt Signature) and is applied on the document that requires security. After UV lighting (according to the manufacturer's instructions) of the document marked by that shape, the purple membrane particles are found in the cured plastic

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Example 3 Application of the photochromic composition through different procedures Screen printing

El principio de la impresión serigráfica es la impresión por penetración similarmente a una técnica de estarcido. El molde de impresión está constituido por un tejido de tamiz que se provee de una capa de barrera impermeable al colorante. El motivo de impresión queda abierto. La impresión se realiza mediante la extracción del tamiz relleno con colorante con una rasqueta. El colorante se transmite a este respecto al sustrato que se encuentra debajo. Para la preparación de un colorante para impresión serigráfica, en una disolución de PVA al 7,2% (Mowiol tipo 56-98) se agitan 100 mg/ml de membrana púrpura durante la noche. Cuando coinciden las propiedades reológicas con las de una muestra patrón, la mezcla obtenida puede imprimirse con una máquina de impresión serigráfica convencional.The principle of screen printing is the Penetration printing similar to a stencil technique. The printing mold consists of a sieve fabric that provides a barrier layer impermeable to the dye. The reason for Print remains open. Printing is done by extraction of the sieve filled with dye with a scraper. He dye is transmitted in this respect to the substrate found below. For the preparation of a dye for printing serigraphic, in a 7.2% PVA solution (Mowiol type 56-98) 100 mg / ml of purple membrane are stirred overnight. When rheological properties coincide with those of a standard sample, the mixture obtained can be printed with a conventional screen printing machine.

Offset printing

En 5 ml de un colorante sin pigmento (empresa Schmitt, UFO1) se agitan a 50ºC 1 g de membrana púrpura. La mezcla así obtenida puede imprimirse mediante la técnica de offset usual.In 5 ml of a dye without pigment (company Schmitt, UFO1) 1 g of purple membrane is stirred at 50 ° C. Mix so obtained can be printed using the offset technique usual.

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Example 4 Preparation of a safety feature resistant to abrasion

Puede lograrse una resistencia a la abrasión de la composición fotocrómica laminando, por ejemplo, los documentos recubiertos con proteína de retinal translocadora de protones mediante un aparato de laminado en caliente (GPM, Mylam 9) en una bolsa de láminas de tipo GHQ-120TR a una temperatura de 90 a 140ºC.Abrasion resistance of photochromic composition by laminating, for example, documents coated with proton translocator retinal protein by means of a hot rolling apparatus (GPM, Mylam 9) in a GHQ-120TR type foil bag at a temperature from 90 to 140 ° C.

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Example 5 Increase of the UV resistance of the characteristic of security

Para aumentar la resistencia UV de la característica de seguridad según la invención, la composición fotocrómica se mezcla con un absorbente de UV o un derivado del mismo en una concentración del 1 al 30%, preferiblemente del 3 al 10% peso/peso. Los absorbentes de UV preferidos son benzofenona, hidroxinaftoquinona, fenilbenzoxazol, éster de ácido cinámico, sulfonamida y éster de ácido aminobenzoico.To increase the UV resistance of the safety feature according to the invention, the composition Photochromic is mixed with a UV absorber or a derivative of same in a concentration of 1 to 30%, preferably 3 to 10% weight / weight. Preferred UV absorbers are benzophenone, hydroxynaphthoquinone, phenylbenzoxazole, cinnamic acid ester, sulfonamide and aminobenzoic acid ester.

<110> Max-Planck-Gesellschaft<110> Max-Planck-Gesellschaft

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<120> Composición fotocrómica<120> Photochromic composition

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<130> p31928<130> p31928

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<140><140>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<141><141>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<150> 1<150> 1

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<170> PatentIn ver. 2.1<170> PatentIn ver. 2.1

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<210> 1<210> 1

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 248<211> 248

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<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Malobacterium salinarum <213> Malobacterium salinarum

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 1<400> 1

22

Claims

1. Photochromic composition containing at least a proton translocating retinal protein selected from the group of:

(i)(i): Muteínas de una proteína de retinal translocadora de protones natural de arqueobacterias halófilas que presentan un fotociclo retardado (mutación de tipo 1) y cuyo contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10% (mutación de tipo 2) y/oMuteins of a natural proton translocator retinal protein of halophilic archaebacteria that have a delayed photocycle (type 1 mutation) and whose all- trans- retinal content in a state adapted to lightness and darkness does not differ from each other more than 10 % (type 2 mutation) and / or

(ii)(ii): Homólogos de las muteínas (i) con fotociclo retardado cuyo contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10%,Homologues of the muteins (i) with delayed photocycle whose content of all- trans- retinal in a state adapted to lightness and darkness does not differ from each other more than 10%,

which also contains one or more additives selected from stabilizers, additives that reduce formation of foam and UV light absorbing additives.

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2. Photochromic composition according to claim 1, characterized in that the proton translocating retinal protein has a composition of retinal isomers in a state adapted to the lightness and darkness of at least 60% of all- trans- retinal.

3. Photochromic composition according to claim 1 or 2, characterized in that the natural proton translocating retinal protein is an archaebacterial rhodopsin.

4. Photochromic composition according to one of claims 1 to 3, characterized in that the archeobacterial rhodopsin is a halobacterial rhodopsin.

5. Photochromic composition according to one of claims 1 to 4, characterized in that the archeobacterial rhodopsin is bacteriorodopsin (SEQ ID No.1) of Halobacterium salinarum .

6. Photochromic composition according to one of claims 1 to 5, characterized in that the homologue has an amino acid sequence that has at least 40% identity with the amino acid sequence SEQ ID No.1.

7. Photochromic composition according to one of claims 1 to 6, characterized in that the homologue has an amino acid sequence that in the range of helix C and / or F has at least 60% identity with the amino acid sequence SEQ ID No .one.

8. Photochromic composition according to at least one of claims 1 to 7, characterized in that the photocycle of the muteins with a type 1 mutation has a thermal cycle time of more than 10 ms.

9. Photochromic composition according to at least one of claims 1 to 8, characterized in that the type 1 mutation is an exchange of amino acids in one or more of the amino acid positions that participate in the catalytic cycle in the natural protein.

10. Photochromic composition according to claim 9, characterized in that the amino acids participating in the catalytic cycle are selected from the group comprising amino acid residues D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 and / or E204.

11. Photochromic composition according to at least one of claims 1 to 10, characterized in that the type 2 mutation is an exchange of amino acids in one or more of the amino acid positions that form the retinal binding pocket.

12. Photochromic composition according to claim 11, characterized in that the amino acids that form the retinal binding pockets are selected from the group comprising amino acid residues Val49, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 and Met145.

13. Photochromic composition according to one of claims 1 to 12, characterized in that it is a bacteriorhodopsin mutein of Halobacterium salinarum (SEQ ID No.1) with mutations selected from the following group:

V49A-D96N; L93A-D96N; M145F-D96N

or a homologue of such a mutein.

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

14. Photochromic composition according to at least one of claims 1 to 13, characterized in that the retinal protein is in the form of a purple membrane.

15. Photochromic composition according to claim 14, characterized in that the density of the purple membrane amounts to between 1.10 and 1.20 g / cm3.

16. Photochromic composition according to claim 15, characterized in that the density of the purple membrane amounts to 1,175 to 1,185 g / cm3.

17. Photochromic composition according to one of claims 1-16, characterized in that glycerol, organic polymers and / or organic solvents are contained.

18. Use of a translocating retinal protein of protons selected from the group of:

(iii)(iii): Homólogos de las muteínas (i) con fotociclo retardado cuyo contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10%,Homologues of the muteins (i) with delayed photocycle whose content of all- trans- retinal in a state adapted to lightness and darkness does not differ from each other more than 10%,

and / or a photochromic composition according to one of the claims 1-17 for preparing films Optical

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

19. Use according to claim 18, characterized in that the optical film is suitable for optical recording.

20. Use according to claim 18, characterized in that the optical film is suitable for interferometry.

21. Use according to claim 18, characterized in that the optical film is suitable for holographic pattern recognition.

22. Use according to claim 18, characterized in that the optical film is suitable as an optical light modulator.

23. Use of a translocating retinal protein of protons selected from the group of:

(iv)(iv): Homólogos de las muteínas (i) con fotociclo retardado cuyo contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10%,Homologues of the muteins (i) with delayed photocycle whose content of all- trans- retinal in a state adapted to lightness and darkness does not differ from each other more than 10%,

to prepare high volume memories for the optical data storage

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

24. Use of a translocating retinal protein of protons selected from the group of:

or a photochromic composition according to at least one of claims 1-20 as safety dye.

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

25. Use according to claim 24, characterized in that the proton translocating retinal protein and / or the photochromic composition is applied on a document that requires security or an object that requires security.

26. Use according to claim 25, characterized in that the proton translocating retinal protein and / or the photochromic composition applied on the document that requires security is fixed on the document or the object.

27. Use according to claim 26, characterized in that the fixing is carried out by physical inclusion or covalent coupling to the document or object.

28. Use according to one of claims 25-27, characterized in that the document requiring security is a security paper.

         \newpage\ newpage

29. Use according to one of claims 25-27, characterized in that the document requiring security is a card.

30. Use according to one of claims 25-27, characterized in that the document requiring security is a banknote.

31. Use according to one of claims 18-30, characterized in that the proton translocating retinal protein has a composition of retinal isomers in a state adapted to the lightness and darkness of at least 60% of all- trans- retinal.

32. Use according to one of claims 18-31, characterized in that the natural proton translocating retinal protein is an archaebacterial rhodopsin.

33. Use according to one of claims 18-32, characterized in that the archeobacterial rhodopsin is a halobacterial rhodopsin.

34. Use according to one of claims 18-33, characterized in that the archeobacterial rhodopsin is bacteriorodopsin (SEQ ID No. 1) of Halobacterium salinarum .

35. Use according to one of claims 18-34, characterized in that the homologue has an amino acid sequence that has at least 40% identity with the amino acid sequence SEQ ID No.1.

36. Use according to one of claims 18-35, characterized in that the homologue has an amino acid sequence that in the range of helix C and / or F has at least 60% identity with the amino acid sequence SEQ ID NO. one.

37. Use according to one of claims 18-36, characterized in that the photocycle of the muteins with a type 1 mutation has a thermal cycle time of more than 10 ms.

38. Use according to one of claims 18-37, characterized in that the type 1 mutation is an exchange of amino acids in one or more of the amino acid positions that participate in the natural protein in the catalytic cycle.

39. Use according to claim 38, characterized in that the amino acids participating in the catalytic cycle are selected from the group comprising amino acid residues D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 and / or E204.

40. Use according to one of claims 18-39, characterized in that the type 2 mutation is an exchange of amino acids in one or more of the amino acid positions that form the retinal binding pocket.

41. Use according to claim 40, characterized in that the amino acids that form the retinal binding pockets are selected from the group comprising amino acid residues Val49, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 and Met145.

42. Use according to one of claims 18-41, characterized in that it is a bacteriorhodopsin mutein of Halobacterium salinarum (SEQ 1 D No. 1) with mutations selected from the following group:

V49A-D96N; L93A-D96N; M145F-D96N

or a homologue of such a mutein.

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

43. Use according to at least one of claims 18-42, characterized in that the retinal protein is presented in the form of a purple membrane.

44. Use according to claim 43, characterized in that the density of the purple membrane is between 1.10 and 1.20 g / cm 3.

45. Use according to claim 44, characterized in that the density of the purple membrane amounts to 1,175 to 1,185 g / cm3.

46. Procedure for preparing documents with a safety feature , characterized in that a proton translocating retinal protein selected from the group of: is usually applied before, during or after the preparation of a document:

or a photochromic composition according to one of the claims 1-17 and, if necessary, is fixed.

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

47. Method according to claim 46, characterized in that the proton translocator retinal protein has a composition of retinal isomers in a state adapted to the lightness and darkness of at least 60% of all- trans- retinal.

48. A method according to claim 46 or 47, characterized in that the natural proton translocating retinal protein is an archaebacterial rhodopsin.

49. A method according to one of claims 46-48, characterized in that the archaebacterial rhodopsin is a halobacterial rhodopsin.

50. Method according to one of claims 46-49, characterized in that the archaebacterial rhodopsin is bacteriorodopsin (SEQ ID No.1) of Halobacterium salinarum .

51. A method according to one of claims 46-50, characterized in that the homologue has an amino acid sequence that has at least 40% identity with the amino acid sequence SEQ ID No.1.

52. Method according to one of claims 46-51, characterized in that the homologue has an amino acid sequence that in the range of helix C and / or F has at least 60% identity with the amino acid sequence SEQ ID NO. one.

53. Method according to one of claims 46-52, characterized in that the photocycle of the muteins with a type 1 mutation has a thermal cycle time of more than 10 ms.

54. Method according to one of claims 46-53, characterized in that the type 1 mutation is an exchange of amino acids in one or more of the amino acid positions that participate in the natural protein in the catalytic cycle.

55. Method according to claim 54, characterized in that the amino acids participating in the catalytic cycle are selected from the group comprising amino acid residues D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 and / or E204.

56. Method according to one of claims 46-55, characterized in that the type 2 mutation is an exchange of amino acids in one or more of the amino acid positions that form the retinal binding pocket.

57. Method according to claim 56, characterized in that the amino acids that form the retinal binding pockets are selected from the group comprising amino acid residues Val49, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 and Met145.

58. Method according to one of claims 46-57, characterized in that it is a Bacteriorhodopsin mutein of Halobacterium salinarum (SEQ 1 D No.1) with mutations selected from the following group:

V49A-D96N; L93A-D96N; M145F-D96N

or a homologue of such a mutein.

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

59. Method according to one of claims 46-58, characterized in that the retinal protein is presented in the form of a purple membrane.

60. Method according to claim 59, characterized in that the density of the purple membrane amounts to between 1.10 and 1.20 g / cm3.

61. The method according to claim 60, characterized in that the density of the purple membrane amounts to 1,175 to 1,185 g / cm3.

62. Photochromic composition according to any one of claims 1-17 wherein as another additive are contained buffer substances.