ES2340978B1 - METHOD OF EXTRACTION AND DETECTION OF ANTIGENS FROM ANISAKIS IN FOODS INTENDED FOR HUMAN OR ANIMAL CONSUMPTION. - Google Patents
METHOD OF EXTRACTION AND DETECTION OF ANTIGENS FROM ANISAKIS IN FOODS INTENDED FOR HUMAN OR ANIMAL CONSUMPTION. Download PDFInfo
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Abstract
Método de extracción y detección de antígenos
de
Anisakis en alimentos destinados al consumo humano
o animal.Method of extraction and detection of antigens of
Anisakis in food intended for human or animal consumption.
La presente invención se refiere a un método de extracción y detección de alérgenos de parásitos de pescado en muestras alimentarias para el consumo humano o animal. La extracción se basa en aplicar soluciones con baja fuerza iónica, homogeneización, sonicación y diferentes pH a diversos tipos de pescado ya sean frescos o tratados. La detección se basa en métodos inmunoquímicos mediante el uso de anticuerpos policlonales que permiten detectar proteínas antigénicas del parásito así como anticuerpos policlonales que permiten detectar el alérgeno Ani s 4, que por sus características físico-químicas resiste el tratamiento térmico del alimento. El método es sensible, ya que se puede detectar Ani s 4 en cantidades inferiores a 1ppm con tasas de recuperación mayores a un 65%. El método descrito es específico ya que no muestra reactividad cruzada con componentes de las distintas matrices ensayadas.The present invention relates to a method of extraction and detection of fish parasite allergens in food samples for human or animal consumption. The removal It is based on applying solutions with low ionic strength, homogenization, sonication and different pH at various types of Fish whether fresh or treated. The detection is based on methods immunochemicals by using polyclonal antibodies that allow to detect parasite antigenic proteins as well as polyclonal antibodies that allow the detection of the Ani s 4 allergen, that by its physical-chemical characteristics resists The heat treatment of food. The method is sensitive, since Ani s 4 can be detected in amounts less than 1ppm with rates of recovery greater than 65%. The described method is specific. since it does not show cross reactivity with components of the different matrices tested.
Description
Método de extracción y detección de antígenos de Anisakis en alimentos destinados al consumo humano o animal.Method of extraction and detection of Anisakis antigens in food intended for human or animal consumption.
La presente invención se refiere a un método de extracción y detección de alérgenos de parásitos de pescado en muestras alimentarias para el consumo humano o animal. La extracción se basa en aplicar soluciones con baja fuerza iónica, homogeneización, sonicación y diferentes pH a diversos tipos de pescado ya sean frescos o tratados. La detección se basa en métodos inmunoquímicos mediante el uso de anticuerpos policlonales que permiten detectar proteínas antigénicas del parásito así como anticuerpos policlonales que permiten detectar el alérgeno Ani s 4, que por sus características físico-químicas resiste el tratamiento térmico del alimento. El método es sensible, ya que se puede detectar Ani s 4 en cantidades inferiores a 1 ppm con tasas de recuperación mayores a un 65%. El método descrito es específico ya que no muestra reactividad cruzada con componentes de las distintas matrices ensayadas.The present invention relates to a method of extraction and detection of fish parasite allergens in food samples for human or animal consumption. The removal It is based on applying solutions with low ionic strength, homogenization, sonication and different pH at various types of Fish whether fresh or treated. The detection is based on methods immunochemicals by using polyclonal antibodies that allow to detect parasite antigenic proteins as well as polyclonal antibodies that allow the detection of the Ani s 4 allergen, that by its physical-chemical characteristics resists The heat treatment of food. The method is sensitive, since Ani s 4 can be detected in amounts less than 1 ppm with rates of recovery greater than 65%. The described method is specific. since it does not show cross reactivity with components of the different matrices tested.
El género Anisakis incluye parásitos nemátodos que pertenecen a varias especies relacionadas. Mediante el uso de marcadores morfológicos y genéticos/moleculares actualmente se reconocen las siguientes especies de Anisakis: Anisakis pegreffii, Anisakis physeteris, Anisakis schupakovi, Anisakis simplex, Anisakis typical, Anisakis ziphidarum, Anisakis typica, Anisakis brevispicuiata o Anisakis paggiae.The Anisakis genus includes nematode parasites that belong to several related species. Through the use of morphological and genetic / molecular markers, the following Anisakis species are now recognized : Anisakis pegreffii, Anisakis physeteris, Anisakis schupakovi, Anisakis simplex, Anisakis typical, Anisakis ziphidarum, Anisakis typica, Anisakis brevispisakiagiagista og .
Las especies de Anisakis alcanzan la madurez sexual en el estómago de cetáceos y, menos frecuentemente, en pinnipedos. Estos mamíferos pueden infestarse por ingestión de a) hospedadores paraténicos, es decir, peces (principalmente teleósteos) y cefalópodos (principalmente calamares), que albergan la tercera fase larvaria del parásito (L3), y b) por ingestión de krill, como intermedio, que también alberga las larvas L3 (por ejemplo, ballenas). Anisakis species reach sexual maturity in the stomach of cetaceans and, less frequently, in pinnipeds. These mammals can be infested by ingestion of a) paratenic hosts, that is, fish (mainly teleosts) and cephalopods (mainly squid), which house the third larval phase of the parasite (L3), and b) by ingestion of krill, as intermediate, which It also houses L3 larvae (for example, whales).
Al igual que los mamíferos marinos, los seres humanos también pueden infestarse por larvas L3 de Anisakis mediante la ingestión de peces y calamares crudos o poco cocinados portadores del parásito, lo cual produce una enfermedad clínica denominada anisakiosis o anisakiasis.Like marine mammals, humans can also be infested with L3 larvae of Anisakis by ingesting raw or undercooked fish and squid carrying the parasite, which produces a clinical disease called anisakiosis or anisakiasis.
Cuando las larvas L3 de Anisakis infestan a seres humanos, a menudo causan síntomas gastrointestinales que pueden estar asociados con reacciones alérgicas de distinta gravedad. Dependiendo de la localización de las larvas y los síntomas dominantes, se han presentado cuatro formas clínicas principales de anisakiosis (gástrica/gastroalérgica, intestinal, extragastrointestinal y alérgica) en seres humanos. En la forma gástrica (aguda) de anisakiosis, la larva penetra la pared gástrica y frecuentemente se observa un curso clínico caracterizado por dolor epigástrico agudo, náuseas y vómitos unas pocas horas después de la ingestión de pescado que contenga larvas de Anisakis L3 vivas. Además, también pueden observarse síntomas alérgicos en individuos sensibilizados (aproximadamente el 10% de los casos).When Anisakis L3 larvae infest humans, they often cause gastrointestinal symptoms that may be associated with allergic reactions of varying severity. Depending on the location of the larvae and the dominant symptoms, four main clinical forms of anisakiosis (gastric / gastroallergic, intestinal, extragastrointestinal and allergic) have been presented in humans. In the gastric (acute) form of anisakiosis, the larva penetrates the gastric wall and a clinical course often characterized by acute epigastric pain, nausea and vomiting is observed a few hours after ingestion of fish containing live Anisakis L3 larvae. In addition, allergic symptoms can also be observed in sensitized individuals (approximately 10% of cases).
La presencia de larvas de Anisakis en pescado produce en el consumidor la infestación por las larvas vivas cuando se consume el pescado crudo o sometido a tratamientos. La larva L3 de Anisakis es capaz de segregar proteínas que pueden producir reacciones alérgicas graves en individuos sensibilizados. Estas reacciones pueden ser producidas por la ingestión de las larvas vivas o muertas. Varios de los alérgenos de Anisakis descritos hasta la fecha son estables a congelación, altas temperaturas o altas presiones y resistentes a variaciones de pH y a la acción de enzimas digestivas. En su estructura poseen entre otros, grupos sulfidrilo (SH) que posibilitan la formación enlaces covalentes con proteínas de la matriz en la que se encuentran, lo que puede complicar su extracción y modificar su capacidad antigénica.The presence of Anisakis larvae in fish produces in the consumer infestation by live larvae when raw or consumed fish is consumed. The Anisakis L3 larva is able to secrete proteins that can cause serious allergic reactions in sensitized individuals. These reactions can be produced by ingestion of live or dead larvae. Several of the Anisakis allergens described to date are stable to freezing, high temperatures or high pressures and resistant to variations in pH and the action of digestive enzymes. In their structure they have, among others, sulfydryl (SH) groups that allow the formation of covalent bonds with matrix proteins in which they are found, which can complicate their extraction and modify their antigenic capacity.
Existen diferentes técnicas de complejidad y eficacia variables para detectar la presencia de la larva de Anisakis en el músculo y vísceras de pescado. Se pueden enumerar las siguientes: Examen visual simple, transiluminación con luz ultravioleta, digestión, espectroscopia de imagen por absorción/reflexión, diferencia de conductividad (W093/14400). Todas ellas tienen como objetivo la detección del parásito vivo o muerto pero no detectan la presencia de antígenos del parásito en el músculo del pescado.There are different techniques of varying complexity and efficacy to detect the presence of the Anisakis larva in the muscle and fish viscera. The following can be listed: Simple visual examination, transillumination with ultraviolet light, digestion, absorption / reflection image spectroscopy, conductivity difference (W093 / 14400). All of them are aimed at detecting the live or dead parasite but do not detect the presence of parasite antigens in the fish muscle.
Por otra parte han sido descritas técnicas de detección basadas en secuencias nucleotídicas y peptídicas pertenecientes a las larvas de Anisakis pero que no están basadas en la extracción, concentración o captura de los antígenos de Anisakis a partir de muestras alimentarias (WO2008006927 A1).On the other hand, detection techniques based on nucleotide and peptide sequences belonging to the Anisakis larvae have been described but are not based on the extraction, concentration or capture of the Anisakis antigens from food samples (WO2008006927 A1).
El problema técnico que plantea la detección de antígenos alergénicos de larvas de Anisakis es la dificultad en la extracción de antígenos propios del parásito que sean válidos en un paso posterior para inducir la producción de anticuerpos contra dichos antígenos y/o para que sean detectados por anticuerpos ya generados con anterioridad.The technical problem posed by the detection of allergenic antigens of Anisakis larvae is the difficulty in extracting the parasite's own antigens that are valid at a later step to induce the production of antibodies against said antigens and / or to be detected by antibodies. already generated previously.
Se han descrito métodos de extracción de antígenos que utilizan la incubación de larvas vivas a rangos de pH similares al del estómago de humanos (ES2209592 y Moneo et al. (2005) Parasitol. Res. 96(5):285-9). Para una detección precisa se requiere un proceso de extracción de antígenos que sea robusto, rápido, eficaz y sencillo que permita la detección de antígenos presentes en una muestra que contenga o haya contenido larvas de Anisakis vivas o muertas.Antigen extraction methods have been described that utilize the incubation of live larvae at pH ranges similar to that of the human stomach (ES2209592 and Moneo et al . (2005) Parasitol. Res . 96 (5): 285-9). For an accurate detection, an antigen extraction process is required that is robust, fast, efficient and simple that allows the detection of antigens present in a sample that contains or contains live or dead Anisakis larvae.
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En el caso de parásitos de peces que suponen un riesgo para la salud, como las especies pertenecientes al género Anisakis, hay que añadir que las matrices varían de un pescado a otro, incluso tratándose de pescados frescos, y se pueden modificar al aplicar procesos de conservación y tratamiento tecnológico debido a la labilidad de las proteínas del pescado y a la rápida oxidación de sus lípidos. Por ello, es necesario disponer de un método de extracción sencillo, sin pasos complejos de captura y aislamiento de un alérgeno de interés en salud humana, que sea aplicable a diferentes pescados, ya sean frescos, congelados o cocinados y que permita la detección de antígenos alérgenos en concentraciones traza.In the case of fish parasites that pose a health risk, such as species belonging to the Anisakis genus, it should be added that the matrices vary from one fish to another, even in the case of fresh fish, and can be modified by applying processes of conservation and technological treatment due to the lability of fish proteins and the rapid oxidation of their lipids. Therefore, it is necessary to have a simple extraction method, without complex capture and isolation steps of an allergen of interest in human health, which is applicable to different fish, whether fresh, frozen or cooked and that allows the detection of antigens Allergens in trace concentrations.
La presente invención se refiere a un método de extracción y detección de alérgenos de parásitos de pescado en muestras alimentarias para el consumo humano o animal. El método permite la extracción sencilla y eficaz sin pasos de captura y aislamiento del alérgeno. Además se identifica la presencia de alérgenos de interés en salud humana. Mediante la aplicación de este método se extraen alérgenos de Anisakis en concentraciones inferiores a 1 ppm y con tasas de recuperación superiores a un 65%. El método es aplicable a diferentes pescados, a muestras procedentes de diferentes partes del pescado o a otras muestras que contienen cualquier procesado de pescado. La detección de los antígenos de Anisakis se lleva a cabo por medio de técnicas inmunoquímicas basadas en anticuerpos policlonales. Utilizando anticuerpos policlonales frente a un extracto crudo del Anisakis, se detectan diferentes proteínas del parásito permitiendo la identificación de antígenos incluso en los casos en que la inspección veterinaria no detecta al parásito. Asimismo al utilizar anticuerpos policlonales dirigidos al alérgeno Ani s 4, se puede detectar la presencia del alérgeno que, debido a sus propiedades físico-químicas de bajo peso molecular, termoestabilidad, resistencia a pepsina y a altas presiones resiste los procesados, tratamientos o los diferentes procesos culinarios. El método descrito es específico ya que no muestra reactividad cruzada con componentes de las distintas matrices ensayadas.The present invention relates to a method of extracting and detecting allergens of fish parasites in food samples for human or animal consumption. The method allows simple and efficient extraction without capture and isolation steps of the allergen. In addition, the presence of allergens of interest in human health is identified. By applying this method, Anisakis allergens are extracted at concentrations below 1 ppm and with recovery rates above 65%. The method is applicable to different fish, samples from different parts of the fish or other samples that contain any fish processing. The detection of Anisakis antigens is carried out by means of immunochemical techniques based on polyclonal antibodies. Using polyclonal antibodies against a crude Anisakis extract, different proteins of the parasite are detected allowing the identification of antigens even in cases where veterinary inspection does not detect the parasite. Also by using polyclonal antibodies directed to the Ani s 4 allergen, the presence of the allergen can be detected which, due to its low molecular weight physicochemical properties, thermostability, resistance to pepsin and high pressures resists the processes, treatments or different processes Culinary The described method is specific since it does not show cross reactivity with components of the different matrices tested.
La extracción y posterior detección de algunos alérgenos en alimentos puede ser complicada ya que suelen estar en concentraciones traza y en matrices complejas. Además cuando se trata de alimentos ya elaborados, conservados o cocinados, la extracción y detección de los alérgenos puede verse alterada por el procesamiento del alimento. La detección por métodos inmunoquímicos basados en anticuerpos (ELISA, Western blot, dot blot o tiras inmunocromatográficas) permite la identificación específica del alérgeno en el extracto. Sin embargo, la alteración del alérgeno por el procesamiento del alimento puede alterar su extracción y/o detección. En la presente invención, esto se soluciona utilizando un método de extracción sencillo y eficaz y una detección por medio de anticuerpos policlonales generados contra un extracto crudo del parásito y/o detectando alérgenos que sean estables y por lo tanto que puedan ser detectados incluso después de que el alimento sea congelado, calentado o sometido a otros tratamientos.The extraction and subsequent detection of some Food allergens can be complicated since they are usually in trace concentrations and in complex matrices. Also when it is about processed, preserved or cooked food, the Allergen extraction and detection may be altered by the food processing The detection by immunochemical methods antibody based (ELISA, Western blot, dot blot or strips immunochromatographic) allows specific identification of the Allergen in the extract. However, the alteration of the allergen by food processing can alter its extraction and / or detection. In the present invention, this is solved using a simple and efficient extraction method and detection by means of polyclonal antibodies generated against a crude extract of parasite and / or detecting allergens that are stable and therefore that can be detected even after the food is frozen, heated or subjected to other treatments.
El método de la presente invención conduce a un resultado inesperado, ya que se simplifican los pasos de extracción de antígenos de Anisakis, consiguiéndose de al mismo tiempo un efecto sorprendente en la detección posterior de antígenos específicos de Anisakis, tal como se demuestra en los ejemplos, obteniéndose una tasa de recuperación del antígeno Ani s 4, inyectado en músculo de pescado, de un 65% y una sensibilidad de detección de menos de 1 ppm.The method of the present invention leads to an unexpected result, since the steps of Anisakis antigen extraction are simplified, while at the same time achieving a surprising effect in the subsequent detection of Anisakis specific antigens, as demonstrated in the examples , obtaining a recovery rate of Ani s 4 antigen, injected into fish muscle, of 65% and a detection sensitivity of less than 1 ppm.
En este sentido, el principal aspecto de la presente invención es un método de extracción y detección de antígenos del género Anisakis en un alimento destinado al consumo humano y/o animal que comprende: Obtener la muestra de alimento. Añadir una solución hipotónica a la muestra de alimento para fracturar las membranas celulares y homogeneizar para seguir fracturando las membranas intactas. Sonicar el homogenado para liberar con mayor eficacia los antígenos. Separar el sobrenadante. Reducir el pH del sobrenadante hasta un valor igual o menor de 3. Incubar el sobrenadante. Neutralizar el pH. Separar el sobrenadante del producto obtenido, en este caso el sobrenadante se denomina extracto crudo y, analizar el extracto crudo por medio de técnicas inmunoquímicas.In this sense, the main aspect of the present invention is a method of extraction and detection of antigens of the Anisakis genus in a food intended for human and / or animal consumption comprising: Obtaining the food sample. Add a hypotonic solution to the food sample to fracture cell membranes and homogenize to continue fracturing intact membranes. Sonicate the homogenate to more effectively release the antigens. Separate the supernatant. Reduce the pH of the supernatant to a value equal to or less than 3. Incubate the supernatant. Neutralize the pH. Separate the supernatant from the product obtained, in this case the supernatant is called crude extract and, analyze the crude extract by means of immunochemical techniques.
Los ejemplares del género Anisakis son nematodos parásitos, cuyo ciclo vital afecta a los peces y mamíferos marinos. Son infecciosos para los seres humanos y causan anisakiasis, una reacción alógica severa. Las especies del género Anisakis a las que se refiere la presente invención se seleccionan de la lista que comprende, sin limitarse, Anisakis pegreffii, Anisakis physeteris, Anisakis schupakovi, Anisakis simplex, Anisakis typical, Anisakis ziphidarum, Anisakis typica, Anisakis brevispicuiata o Anisakis paggiae. Preferiblemente se selecciona la especie Anisakis simplex.The specimens of the Anisakis genus are parasitic nematodes, whose life cycle affects marine fish and mammals. They are infectious to humans and cause anisakiasis, a severe allogic reaction. Species of the genus Anisakis to respect the present invention are selected from the list comprising, but not limited, Anisakis pegreffii, Anisakis physeteris, Anisakis schupakovi, Anisakis simplex, typical Anisakis, Anisakis ziphidarum, typica Anisakis, brevispicuiata Anisakis or Anisakis paggiae . Preferably, the species Anisakis simplex is selected.
El término "solución hipotónica" hace referencia a una solución con una concentración de soluto menor que la concentración de soluto del interior de la célula (citoplasma). De este modo, en una célula sumergida en una solución hipotónica, el agua difunde al interior de la célula sin límite y como consecuencia tiende a romper las membranas celulares, es decir, la célula muere y se libera el contenido del citoplasma.The term "hypotonic solution" makes reference to a solution with a solute concentration less than the solute concentration inside the cell (cytoplasm). Thus, in a cell submerged in a hypotonic solution, the water diffuses into the cell without limit and as a consequence tends to break cell membranes, that is, the cell dies and Cytoplasm content is released.
El término "homogeneizar" tal como se usa en la presente invención hace referencia al proceso que permite romper las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta a las paredes de un tubo. El dispositivo que permite la homogeneización se denomina homogeneizador. Existen homogeneizadores en los que está calibrada la separación entre el émbolo y la pared para producir homogenizados con un tamaño de partícula determinado.The term "homogenize" as used in the present invention refers to the process that allows break the cells with the help of a rotary plunger that fits to the walls of a tube. The device that allows the Homogenization is called homogenizer. There are homogenizers in which the separation between the piston and the wall is calibrated to produce homogenized with a particle size determined.
El término "sonicar" tal como se usa en la presente invención se refiere a la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energía aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se suele aplicar en frío para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podría provocar la desnaturalización de las proteínas.The term "sonicar" as used in the The present invention relates to the application of ultrasound to a cell suspension The intense agitation produced destroys the cell membranes Depending on the frequency, intensity and applied energy structures can also be destroyed subcellular and even solubilize protein complexes. Is usually apply cold to avoid overheating the samples which could cause protein denaturation.
Por tanto, todas las técnicas descritas anteriormente se emplean para destruir las células y liberar sus proteínas. Cada una de las técnicas produce un efecto en la destrucción de las membranas celulares y todos ellos constituyen una forma efectiva de extraer las citadas proteínas.Therefore, all the techniques described previously used to destroy cells and release their proteins Each of the techniques produces an effect on the destruction of cell membranes and all of them constitute a effective way to extract the aforementioned proteins.
El término "separar el sobrenadante" tal como se entiende en la presente invención se refiere al fraccionamiento y selección de la fracción líquida también denominada sobrenadante. Para ello se emplean técnicas que permiten la separación de las fracciones sólidas o en suspensión que son insolubles de las fracciones líquidas que contienen las proteínas solubles. Preferiblemente la separación se lleva a cabo mediante centrifugación.The term "separate the supernatant" such as understood in the present invention it refers to fractionation and selection of the liquid fraction also called supernatant. For this, techniques are used that allow the separation of solid or suspended fractions that are insoluble liquid fractions containing proteins soluble. Preferably the separation is carried out by centrifugation
Concretamente, una vez que el homogenado es sonicado, se procede a su fraccionamiento mediante centrifugación y se selecciona solamente el sobrenadante.Specifically, once the homogenate is sonicated, it is fractionated by centrifugation and only the supernatant is selected.
La reducción del pH se lleva a cabo mediante la adición de un ácido con el objeto de conseguir un pH por debajo de 3. Se debe mantener en incubación a ese pH. La incubación se realiza preferiblemente a temperatura ambiente de entre 16ºC y 27ºC. El objeto de reducir el pH por debajo de 3 es recuperar de forma específica aquellos antígenos que permanecen solubles a un pH menor de 3, ya que este pH se aleja del punto isoeléctrico (Pl) de las proteínas antigénicas (Pl de Ani s 4 = 5,6) que se pretenden detectar pero no es necesario que las larvas estén vivas. En el pH que coincide con el Pl de una proteína, ésta se encuentra en las condiciones de menor solubilidad y por tanto, para poder recuperar las proteínas en su forma soluble es necesario alejarse lo suficiente del Pl de los antígenos de interés. A continuación se neutraliza el pH alcanzando un valor de entre 6 y 8. Preferiblemente la reducción del pH se lleva a cabo por medio de ácido clorhídrico (HCl). Asimismo, la neutralización del pH se lleva a cabo preferiblemente por medio de NaOH.The pH reduction is carried out by addition of an acid in order to achieve a pH below 3. It should be kept in incubation at that pH. Incubation is performed preferably at room temperature between 16 ° C and 27 ° C. He in order to reduce the pH below 3 is to recover specific those antigens that remain soluble at a lower pH of 3, since this pH moves away from the isoelectric point (Pl) of the antigenic proteins (Pl of Ani s 4 = 5.6) that are intended detect but it is not necessary that the larvae are alive. In the pH which coincides with the Pl of a protein, it is found in the conditions of lower solubility and therefore, in order to recover proteins in their soluble form it is necessary to get away from it enough of the Pl of the antigens of interest. Then you neutralizes the pH reaching a value between 6 and 8. Preferably pH reduction is carried out by means of hydrochloric acid (HCl). Also, pH neutralization is carried out. preferably by means of NaOH.
El análisis del extracto crudo se lleva a cabo por medio de técnicas inmunoquímicas. Las técnicas inmunoquímicas permiten la detección de antígenos del género Anisakis. Parte de los antígenos que se pueden detectar mediante el método descrito son alérgenos.The analysis of the crude extract is carried out by means of immunochemical techniques. Immunochemical techniques allow the detection of antigens of the Anisakis genus. Part of the antigens that can be detected by the described method are allergens.
Un antígeno es una sustancia que desencadena la formación de anticuerpos y puede causar una respuesta inmune.An antigen is a substance that triggers the antibody formation and may cause an immune response.
Un alérgeno es una sustancia que puede inducir en un individuo una reacción de hipersensibilidad en personas susceptibles. En estas personas se reconoce el alérgeno como sustancia "extraña" y ajena al organismo en el primer contacto. En exposiciones posteriores, el sistema inmunológico reacciona a la exposición de forma exagerada, con liberación de sustancias que alteran la homeostasis del organismo, lo que da lugar a los síntomas propios de la alergia.An allergen is a substance that can induce in an individual a hypersensitivity reaction in people susceptible. In these people the allergen is recognized as "foreign" substance and foreign to the organism in the first contact. In subsequent exposures, the immune system reacts to the Exaggerated exposure, with release of substances that they alter the homeostasis of the organism, which gives rise to the symptoms own allergy.
La inmunoquímica se basa en la utilización de un anticuerpo específico (policlonal o monoclonal), previamente marcado mediante un enlace químico con una enzima (preferiblemente por conjugación) que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antígeno, aplicado a una muestra. El complejo antígeno-anticuerpo así formado, mediante la utilización de alguna de las enzimas específicas (peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc), permite ser localizado e identificado dentro de las muestras obtenidas. El análisis del extracto crudo mediante técnicas inmunoquímicas puede permitir la detección (presencia) o no (ausencia) de antígenos de Anisakis en cualquiera de sus fases de desarrollo reconocidos por anticuerpos específicos.Immunochemistry is based on the use of a specific antibody (polyclonal or monoclonal), previously labeled by a chemical bond with an enzyme (preferably by conjugation) that can transform a substrate into visible, without affecting the ability of the antibody to form a complex with the antigen, applied to a sample. The antigen-antibody complex thus formed, through the use of any of the specific enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), allows to be located and identified within the samples obtained. The analysis of the crude extract by immunochemical techniques can allow the detection (presence) or not (absence) of Anisakis antigens in any of its developmental phases recognized by specific antibodies.
Una realización preferida es el método descrito donde además se lleva a cabo la concentración del extracto crudo obtenido. La concentración se lleva a cabo preferiblemente mediante precipitación por un alcohol. Preferiblemente el alcohol es etanol 100% (o etanol absoluto) y se añade al extracto crudo en una relación de 1:5 a 1:9 (extracto crudo:etanol).A preferred embodiment is the described method. where the concentration of the crude extract is also carried out obtained. The concentration is preferably carried out by precipitation by an alcohol. Preferably the alcohol is ethanol 100% (or absolute ethanol) and added to the crude extract in a 1: 5 to 1: 9 ratio (crude extract: ethanol).
En otra realización preferida del método, el análisis se lleva a cabo mediante la utilización de anticuerpos policlonales anti-antígeno de Anisakis y de anticuerpos policlonales anti-Ani s 4.In another preferred embodiment of the method, the analysis is carried out using polyclonal anti- Anisakis antigen antibodies and polyclonal anti-Ani s 4 antibodies.
Utilizando anticuerpos policlonales frente a un extracto crudo de Anisakis, se detectan diferentes proteínas del parásito permitiendo la identificación del mismo incluso en los casos en que la inspección veterinaria no lo detecte. La utilización de anticuerpos policlonales dirigidos frente al alérgeno Ani s 4, permite detectar la presencia del alérgeno y debido a sus propiedades físico-químicas (bajo peso molecular, termoestabilidad, resistencia a pepsina y a altas presiones, etc.), se puede identificar en muestras procesadas industrialmente o en diferentes procesos culinarios.Using polyclonal antibodies against a crude Anisakis extract, different proteins of the parasite are detected allowing the identification of the same even in cases where the veterinary inspection does not detect it. The use of polyclonal antibodies directed against the Ani s 4 allergen, allows to detect the presence of the allergen and due to its physicochemical properties (low molecular weight, thermostability, resistance to pepsin and high pressures, etc.), can be identified in samples Industrially processed or in different culinary processes.
Otra realización preferida es el método donde el análisis se lleva a cabo por medio o bien de western blot o bien de dot blot. El western blot permite la separación de proteínas desnaturalizadas mediante la implementación de la electroforesis. Las proteínas son transferidas desde el gel hacia la membrana (preferiblemente de nitrocelulosa), donde son examinadas utilizando los anticuerpos específicos para la proteína. El dot blot permite la detección de las proteínas antigénicas de interés mediante la aplicación de la mezcla de proteínas o extracto crudo a una membrana como un punto (dot) y seguidamente se aplican anticuerpos específicos. El dot blot permite ahorrar tiempo al no tener que emplear cromatografía o electroforesis, sin embargo, no ofrece información acerca de los antígenos detectados, de modo que solamente se puede confirmar la presencia o ausencia de dichos antígenos. El análisis puede ser llevado a cabo además, sin limitarse, o bien por medio de la técnica ELISA o bien por medio de tiras inmunocromatográficas.Another preferred embodiment is the method where the analysis is carried out by either western blot or dot blot . The western blot allows the separation of denatured proteins through the implementation of electrophoresis. Proteins are transferred from the gel to the membrane (preferably nitrocellulose), where they are examined using antibodies specific for the protein. The dot blot allows the detection of the antigenic proteins of interest by applying the mixture of proteins or crude extract to a membrane as a dot ( dot ) and then specific antibodies are applied. The dot blot saves time by not having to use chromatography or electrophoresis, however, it does not offer information about the detected antigens, so that only the presence or absence of these antigens can be confirmed. The analysis can also be carried out, without limitation, either by means of the ELISA technique or by means of immunochromatographic strips.
Según otra realización preferida más, la muestra de alimento se obtiene o bien de pescado o bien de cualquier alimento que contenga cualquier derivado de pescado.According to yet another preferred embodiment, the sample of food is obtained either from fish or from any food containing any fish derivative.
Teniendo en cuenta que los parásitos del género Anisakis tienen un ciclo vital que afecta a los peces y mamíferos marinos, la muestra de alimento puede ser pescado fresco, elaborado, conservado o cocinado, sin limitarse a estos tipos de pescado. Además, la muestra de alimento también puede obtenerse de cualquier producto alimentario que contenga cualquier derivado de pescado, entendiéndose como derivado de pescado cualquier producto procesado que comprenda cualquier parte del pescado incluyendo proteínas o extractos de pescado.Taking into account that parasites of the Anisakis genus have a life cycle that affects marine fish and mammals, the food sample can be fresh, processed, preserved or cooked fish, without being limited to these types of fish. In addition, the food sample can also be obtained from any food product containing any fish derivative, fish derivative being understood as any processed product comprising any part of the fish including fish proteins or extracts.
El término "pescado" tal como usa en la presente invención hace referencia a los peces (pescado vertebrado) o a las especies acuáticas invertebradas (pescado invertebrado) como por ejemplo, sin limitar, a los cefalópodos, que han sido extraídos de un medio natural o artificial en el que se estas especies pasan alguna de las etapas de su ciclo de vida.The term "fish" as used in the The present invention refers to fish (vertebrate fish) or to invertebrate aquatic species (invertebrate fish) as for example, without limitation, to cephalopods, which have been extracted of a natural or artificial environment in which these species pass some of the stages of its life cycle.
En una realización más preferida, la muestra de alimento se obtiene de un pescado del género Merluccius o Engraulis. Preferiblemente la muestra de alimento se selecciona o bien pescado de la especie Merluccius merluccius, o bien pescado de la especie Engraulis encrasicholus. La merluza (Merluccius merluccius) y el boquerón (Engraulis encrasicholus) son los principales alimentos relacionados en los casos de alergia por Anisakis, según la Sociedad Española de Alergología e Inmunología Clínica (SEAIC).In a more preferred embodiment, the food sample is obtained from a fish of the genus Merluccius or Engraulis . Preferably the food sample is selected either fish of the species Merluccius merluccius , or fish of the species Engraulis encrasicholus . Hake ( Merluccius merluccius ) and anchovy ( Engraulis encrasicholus ) are the main related foods in cases of Anisakis allergy, according to the Spanish Society of Allergology and Clinical Immunology (SEAIC).
Según otra realización preferida la muestra de alimento se obtiene de un pienso. El pienso puede contener cualquier derivado de pescado y/o puede estar destinado a la alimentación de especies de acuicultura u otras especies destinadas a consumo humano.According to another preferred embodiment the sample of Food is obtained from a feed. The feed can contain any derived from fish and / or may be intended for feeding aquaculture species or other species intended for consumption human.
En otra realización preferida de cualquiera de los métodos anteriores se extraen y detectan antígenos de la especie Anisakis simplex.In another preferred embodiment of any of the above methods antigens of the Anisakis simplex species are extracted and detected.
Según otra realización preferida, el método se emplea para evaluar la eficacia de los tratamientos de los alimentos para matar o eliminar parásitos del género Anisakis o inactivar o suprimir sus alérgenos. Los tratamientos de los alimentos comprenden el tratamiento térmico (congelación o alta temperatura), alta presión hidrostática, succión por vacío o electrocución, sin limitarse a estos tratamientos.According to another preferred embodiment, the method is used to evaluate the efficacy of food treatments to kill or eliminate parasites of the Anisakis genus or inactivate or suppress their allergens. Food treatments include heat treatment (freezing or high temperature), high hydrostatic pressure, vacuum suction or electrocution, without being limited to these treatments.
Según la legislación nacional, se fija la obligatoriedad, para los establecimientos que sirven comida, de someter todos los pescados que se vayan a servir en crudo o casi crudos a una temperatura igual o inferior a -20ºC durante 24 horas una vez que el producto ha alcanzado esta temperatura. Esto incluye productos de la pesca que han sido sometidos a un proceso de ahumado en frío en el que la temperatura central del producto no ha sobrepasado los 60ºC. Igualmente estarán obligados a garantizar la congelación en las mismas condiciones si se trata de productos de la pesca en escabeche o salados, cuando este proceso no baste para destruir las larvas. Mediante el método de la presente invención se puede evaluar la eficacia de dichos tratamientos en la elaboración y/o preparación de los productos de la pesca así como determinar la presencia o ausencia de alérgenos tales como Ani s 4.According to national legislation, the mandatory, for establishments serving food, of submit all fish that are to be served raw or almost raw at a temperature equal to or less than -20ºC for 24 hours Once the product has reached this temperature. This includes fishery products that have undergone a smoking process cold in which the core temperature of the product has not exceeded 60 ° C. They will also be obliged to guarantee the freezing under the same conditions if they are products of the pickled or salted fish, when this process is not enough to destroy the larvae By the method of the present invention, can evaluate the effectiveness of these treatments in the elaboration and / or preparation of fishery products as well as determine the presence or absence of allergens such as Ani s 4.
Otro aspecto de la presente invención es un kit para la extracción y detección de antígenos del género Anisakis que comprende solución hipotónica, soluciones para cambiar el pH de los productos obtenidos, anticuerpos policlonales anti-antígeno de Anisakis y anticuerpos policlonales anti-Ani s 4.Another aspect of the present invention is a kit for the extraction and detection of antigens of the Anisakis genus comprising hypotonic solution, solutions for changing the pH of the products obtained, polyclonal anti- Anisakis antigen antibodies and polyclonal anti-Ani s 4 antibodies.
Las soluciones para cambiar el pH de los productos obtenidos tal como se describe a lo largo de esta explicación de la invención, comprenden una solución que reduzca el pH por debajo de 3 y una solución que neutralice el pH ácido conseguido tras adicionar la solución anterior.The solutions to change the pH of products obtained as described throughout this explanation of the invention, comprise a solution that reduces the pH below 3 and a solution that neutralizes the acidic pH achieved after adding the previous solution.
Según una realización preferida, el kit comprende, además, instrucciones para llevar a cabo la extracción y detección de antígenos del género Anisakis. En las citadas instrucciones se indica el volumen que ha de añadirse a los productos obtenidos y el orden de adición, así como los pasos intermedios que han de llevarse a cabo de acuerdo con el principal aspecto de la presente invención. Es decir, en las instrucciones se describirá el protocolo que ha de seguirse para llevar a cabo tanto la extracción de antígenos de Anisakis como la detección de los mismos.According to a preferred embodiment, the kit further comprises instructions for carrying out the extraction and detection of antigens of the Anisakis genus. In these instructions, the volume to be added to the products obtained and the order of addition are indicated, as well as the intermediate steps to be carried out in accordance with the main aspect of the present invention. That is, the instructions will describe the protocol to be followed to carry out both the extraction of Anisakis antigens and their detection.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants not they intend to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be partly detached of the description and in part of the practice of the invention. The following figures and examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
Fig. 1. Muestra el proceso de extracción de proteínas del parásito en muestras de peces.Fig. 1. Shows the process of extracting proteins from the parasite in fish samples .
M: Muestra.M: Sample.
H: Homogeneización.H: Homogenization.
S: Sonicación.S: Sonication.
SOL: solución hipotónica, pH neutro.SOL: hypotonic solution, neutral pH.
B: Bajar el pH del sobrenadante.B: Lower the pH of the supernatant.
N: Neutralizar.N: Neutralize.
E: Extracto crudo para analizar.E: Crude extract to analyze.
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Fig. 2. Muestra la detección de antígenos de Anisaki y del alérgeno Ani s 4 en diferentes pescados de consumo humano.Fig. 2. Shows the detection of Anisaki antigens and Ani s 4 allergen in different fish for human consumption .
M: Merluccius merluccius (Merluza).M: Merluccius merluccius (Hake).
E: Engraulis encrasicolus (Boquerón).E: Engraulis encrasicolus (Boquerón).
S: Sardina pilchardus (Sardina).S: Sardine pilchardus (Sardine).
Mu: Mullus spp. (Salmonete).Mu: Mullus spp. (Red mullet).
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Anti-E: Anticuerpos anti extracto crudo.Anti-E: Anti antibodies raw extract
Anti-Ani s 4: Anticuerpos anti-Ani s 4.Anti-Ani s 4: Antibodies anti-Ani s 4.
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Fig. 3. Muestra la presencia de antígenos y del alérgeno de Ani s 4 de Anisakis por western blot en diferentes partes de un mismo pescado.Fig. 3. It shows the presence of Anis s 4 antigens and Anisakis allergen by western blot in different parts of the same fish .
V: Ventresca. C: Cola.V: Ventresca. C: Cola.
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Anti-E: Anticuerpos anti extracto crudo.Anti-E: Anti antibodies raw extract
Anti-Ani s 4: Anticuerpos anti-Ani s 4.Anti-Ani s 4: Antibodies anti-Ani s 4.
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Fig. 4. Muestra la presencia de antígenos de Anisakis y del alérgeno Ani s 4 por dot blot en diferentes pescados.Fig. 4. Shows the presence of Anisakis antigens and Ani s 4 allergen by dot blot in different fish .
M: Merluccius merluccius (Merluza).M: Merluccius merluccius (Hake).
E: Engraulis encrasicolus (Boquerón).E: Engraulis encrasicolus (Boquerón).
M1 a M10 y B1 a B10: muestras correspondientes a distintos ejemplares de merluza (M) y boquerón (E).M1 to M10 and B1 to B10: samples corresponding to different specimens of hake (M) and anchovy (E).
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Anti-E: Anticuerpos anti extracto crudo.Anti-E: Anti antibodies raw extract
Anti-Ani s 4: Anticuerpos anti-Ani s 4.Anti-Ani s 4: Antibodies anti-Ani s 4.
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Fig. 5. Muestra la sensibilidad de detección de Ani s 4 y recuperación en ensayos de adición.Fig. 5. Shows the sensitivity of Ani s 4 detection and recovery in addition tests .
A: Recuperación y detección de Ani s 4 recombinante inyectado en músculo de bacaladillas (Micromesistius poutassou).A: Recovery and detection of recombinant Ani s 4 injected into bacaladilla muscle ( Micromesistius poutassou ).
B: Recuperación y detección de Ani s 4 para determinar la recuperación del alérgeno.B: Recovery and detection of Ani s 4 for Determine allergen recovery.
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Fig. 6. Muestra el efecto del pH en la extracción de Ani s 4.Fig. 6. Shows the effect of pH on the extraction of Ani s 4 .
A: extracción de Ani s 4 en Miicromessistius poutassou (bacaladilla) a pH <3.A: extraction of Ani s 4 in Miicromessistius poutassou (bacaladilla) at pH <3.
B: extracción de Ani s 4 en Miicromessistius poutassou (bacaladilla) a pH 7.B: extraction of Ani s 4 in Miicromessistius poutassou (bacaladilla) at pH 7.
C: extracción de Ani s 4 en Engrauiis encrasicoius (boquerón) a pH <3.C: extraction of Ani s 4 in Engrauiis encrasicoius (anchovy) at pH <3.
D: extracción de Ani s 4 en Engrauiis encrasicoius (boquerón) a pH =7.D: Ani s 4 extraction in Engrauiis encrasicoius (anchovy) at pH = 7.
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A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen el método de extracción y detección de antígenos de Anisakis.The invention will now be illustrated by tests carried out by the inventors that describe the method of extraction and detection of Anisakis antigens.
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Se mezclaron 10 g de músculo de bacaladilla con 30 mL de 30 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 6,8. Se homogeneizó hasta obtener una mezcla homogénea y sin grumos. La mezcla se sometió a sonicación durante 30 segundos a 18 watts y se incubó en agitación orbital vertical durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación se centrifugó durante 30 minutos a 4000 g y 20ºC, el sedimento se descartó y 5 mL de sobrenadante se pasaron a un tubo limpio. Se añadió HCl 5N hasta obtener un pH de 2. Se incubó 15 minutos a temperatura ambiente y el pH se neutralizó con NaOH 5N. Seguidamente se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos y se centrifugó durante 15 minutos a 3000 g y 20ºC. El sobrenadante fue el extracto en el que se encontraban los antígenos de Anisakis (extracto crudo). Este proceso puede verse resumido en la Fig. 1.10 g of bacaladilla muscle were mixed with 30 mL of 30 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 6.8. It was homogenized to obtain a homogeneous mixture without lumps. The mixture was sonicated for 30 seconds at 18 watts and incubated in vertical orbital shaking for 10 minutes at room temperature. It was then centrifuged for 30 minutes at 4000 g and 20 ° C, the sediment was discarded and 5 mL of supernatant was passed to a clean tube. 5N HCl was added until a pH of 2 was obtained. It was incubated 15 minutes at room temperature and the pH was neutralized with 5N NaOH. It was then incubated at room temperature for 15 minutes and centrifuged for 15 minutes at 3000 g and 20 ° C. The supernatant was the extract in which the antigens of Anisakis (crude extract) were found. This process can be summarized in Fig. 1.
Un paso alternativo es la concentración del extracto. Para ello se tomó una alícuota de 1 mi del extracto crudo y se mezcló con 9 mi de etanol absoluto en reposo y temperatura ambiente, durante 15 minutos. A continuación se centrifugó durante 15 minutos a 3000 g y 20ºC. Se Descartó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 100 \mul de tampón de muestra de electroforesis.An alternative step is the concentration of abstract. For this, a 1 ml aliquot of the crude extract was taken and mixed with 9 ml of absolute ethanol at rest and temperature atmosphere, for 15 minutes. It was then centrifuged for 15 minutes at 3000 g and 20 ° C. The supernatant and the sediment was resuspended in 100 µl of sample buffer of electrophoresis
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La detección de proteínas del parásito o del alérgeno Ani s 4 por western blot se llevó a cabo mediante los siguientes pasos:The detection of parasite or Ani s 4 allergen proteins by western blot was carried out by the following steps:
- 1.one.
- Se hizo un gel de acrilamida al 16%.Be made a 16% acrylamide gel.
- 2.2.
- Se prepararon las muestras diluyéndolas en un volumen adecuado de tampón de carga. El tampón de carga de muestras para geles de SDS-PAGE estaba compuesto por: 12.5 mi Tris 1 M pH 6.8 (concentración final 125 mM), 40 mi SDS 10% (concentración final 4%), 20 mi Glicerol (concentración final 20%), 2 mi Azul de Bromofenol 0.2% (concentración final 0.042%), se llevó hasta un volumen final de 100 mi con H_{2}O destilada. En caso de requerirse condiciones reductoras, se añadió 5% de 2-Mercaptoetanol fresco.Be they prepared the samples by diluting them in an adequate volume of loading buffer Sample loading buffer for gels SDS-PAGE was composed of: 12.5 mi Tris 1 M pH 6.8 (final concentration 125 mM), 40 ml SDS 10% (final concentration 4%), 20 ml Glycerol (final concentration 20%), 2 ml Blue Bromophenol 0.2% (final concentration 0.042%), took up to final volume of 100 ml with distilled H2O. In case of if reducing conditions were required, 5% of Fresh 2-Mercaptoethanol.
- 3.3.
- Se cargaron las muestras en los pocillos del gel de acrilamida.Be they loaded the samples into the wells of the gel acrylamide
- 4.Four.
- Se realizó la electroforesis a 40 V/gel (1.2 V/cm^{2}).Be performed the electrophoresis at 40 V / gel (1.2 V / cm2).
- 5.5.
- Se equilibró el gel y la nitrocelulosa (NC) en tampón de transferencia sometiéndolo a agitación orbital durante 15 minutos (Composición del tampón de transferencia: 50 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.4).Be equilibrated gel and nitrocellulose (NC) in transfer buffer subjecting it to orbital agitation for 15 minutes (Composition of transfer buffer: 50 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.4).
- 6.6.
- Se llevó a cabo la transferencia por difusión durante toda la noche, temperatura ambiente y agitación.Be carried out the broadcast transfer overnight, room temperature and stirring.
- 7.7.
- Se Incubó la NC en el detergente no iónico Nonidet P-40 (NP-40) 3% en solución salina tamponada con fosfato (ClNa 0,15 M, Tampón fosfato pH 7.0) (PBS) a temperatura ambiente en agitación durante 30 minutos.Be He incubated the NC in the non-ionic Nonidet P-40 detergent (NP-40) 3% in phosphate buffered saline (0.15 M ClNa, pH 7.0 phosphate buffer) (PBS) at room temperature in Stirring for 30 minutes.
- 8.8.
- Se lavó la NC en PBS a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta un total de 3 veces.Be washed the NC in PBS at room temperature under stirring for 5 minutes and repeated up to a total of 3 times.
- 9.9.
- Se incubó con antisuero de conejo anti-extracto crudo del parásito o con antisuero de conejo anti-Ani s 4 diluidos 1/8000 en solución diluyente durante 2 horas a temperatura ambiente y agitación (Composición de la solución diluyente: 10 mM Tris-salino, 5% de Suero de Ternera Fetal (STF), 1% Tween 20, pH 7.4).Be incubated with rabbit anti-crude extract antiserum of the parasite or with rabbit antiserum anti-Ani s 4 diluted 1/8000 in diluent solution for 2 hours at temperature ambient and stirring (Composition of the diluent solution: 10 mM Tris-saline, 5% Fetal Calf Serum (STF), 1% Tween 20, pH 7.4).
- 10.10.
- Se lavó en solución de lavado a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta un total de 3 veces (Composición de la solución de lavado: 0.5M NaCl, 2 mM Tris-Cl pH 7.4, 0.1% Tween 20).Be washed in wash solution at room temperature under stirring for 5 minutes and repeated up to a total of 3 times (Wash solution composition: 0.5M NaCl, 2 mM Tris-Cl pH 7.4, 0.1% Tween 20).
- 11.eleven.
- Se incubó con Antisuero Anti-IgG de conejo conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1/5000 en Solución Diluyente durante 1 hora a temperatura ambiente y agitación.Be incubated with rabbit anti-IgG antiserum conjugate with alkaline phosphatase diluted 1/5000 in Diluent Solution during 1 hour at room temperature and stirring.
\newpage\ newpage
- 12.12.
- Se lavó en solución de lavado a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta un total de 4 veces.Be washed in wash solution at room temperature under stirring for 5 minutes and repeated up to a total of 4 times.
- 13.13.
- Se lavó en solución salina a temperatura ambiente en agitación durante 1 minuto. Composición de la solución salina: 0.15 mM NaCl.Be washed in saline at room temperature under stirring for 1 minute. Composition of the saline solution: 0.15 mM NaCl.
- 14.14.
- Se incubó con BCIP-NBT (5-Bromo-4-Choro-3-Indolyl Phosphate-Nitro Blue Tetrazolium) a temperatura ambiente durante 30 minutos.It was incubated with BCIP-NBT ( 5-Bromo-4-Choro-3-Indolyl Phosphate-Nitro Blue Tetrazolium ) at room temperature for 30 minutes.
- 15.fifteen.
- Finalmente se paró la reacción con H_{2}O o PBS y se analizó.Finally the reaction was stopped with H2O or PBS and analyzed.
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Un ejemplo de los resultados cuando se analizaron diferentes peces se muestra en la Fig. 2. En la Fig. 3 se muestra los resultados cuando se analizaron diferentes muestras extraídas del mismo pez.An example of the results when analyzed different fish shown in Fig. 2. In Fig. 3 you shows the results when different samples were analyzed extracted from the same fish.
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La detección de proteínas del parásito o del alérgeno Ani s 4 por dot blot se llevó a cabo mediante los siguientes pasos:Detection of the parasite or Ani s 4 allergen proteins by dot blot was carried out by the following steps:
- 1.one.
- Se aplicaron 10 \mul del extracto crudo en una membrana de NC.Be applied 10 µl of the crude extract on a membrane of NC
- 2.2.
- Se dejó secar la NC durante 30 minutos a 25ºC.Be Let the NC dry for 30 minutes at 25 ° C.
- 3.3.
- Se lavó la NC en PBS a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta 3 veces.Be washed the NC in PBS at room temperature under stirring for 5 minutes and repeated up to 3 times.
- 4.Four.
- se incubó con antisuero de conejo anti-extracto crudo o con antisuero de conejo anti-Ani s 4 diluidos 1/8000 en solución diluyente durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Composición de la solución diluyente: 10 mM Tris-salino, 5% STF, 1% Tween 20, pH 7.4.be incubated with rabbit antiserum anti-raw extract or with rabbit antiserum anti-Ani s 4 diluted 1/8000 in diluent solution for 1 hour at room temperature in agitation. Composition of the diluent solution: 10 mM Tris-saline, 5% STF, 1% Tween 20, pH 7.4.
- 5.5.
- Se lavó en solución de lavado a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta 3 veces. Composición de la solución de lavado: 0.5M NaCl, 2 mM Tris-Cl pH 7.4, 0.1% Tween 20.Be washed in wash solution at room temperature under stirring for 5 minutes and repeated up to 3 times. Composition of the Wash solution: 0.5M NaCl, 2mM Tris-Cl pH 7.4, 0.1% Tween 20.
- 6.6.
- Se incubó con Antisuero Anti-IgG conejo conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1/5000 en solución diluyente durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación.Be incubated with rabbit anti-IgG antiserum conjugated with alkaline phosphatase diluted 1/5000 in diluent solution for 1 time at room temperature under stirring.
- 7.7.
- Se lavó en solución de lavado a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta 3 veces.Be washed in wash solution at room temperature under stirring for 5 minutes and repeated up to 3 times.
- 8.8.
- Se lavó en solución salina temperatura ambiente en agitación durante 1 minuto. Composición de la solución salina: 0.15 mM NaCl.Be washed in saline at room temperature under stirring for 1 minute. Composition of the saline solution: 0.15 mM NaCl.
- 9.9.
- Se incubó con BCIP-NBT (5-Bromo-4-Choro-3-Indolyl Phosphate-Nitro Blue Tetrazolium) a temperatura ambiente durante 10 minutos.It was incubated with BCIP-NBT ( 5-Bromo-4-Choro-3-Indolyl Phosphate-Nitro Blue Tetrazolium ) at room temperature for 10 minutes.
- 10.10.
- Finalmente se paró la reacción con H20 o PBS y se analizó.Finally the reaction was stopped with H20 or PBS and analyzed.
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Un ejemplo de los resultados se muestra en la Fig. 4.An example of the results is shown in the Fig. 4.
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Se prepararon diferentes muestras de 10 gr de bacaladilla. A cada una se le inyectó una cantidad determinada de Ani s 4 recombinante (4 \mug, 2 \mug, 1 \mug y 0 \mug), para obtener las siguientes concentraciones del alérgeno: 0,4 ppm, 0,2 ppm y 0,1 ppm. El recombinante se inyectó en diferentes zonas de cada muestra de músculo de pescado. El extracto se preparó y concentró como se ha detallado previamente. La detección de Ani s 4 recombinante se realizó como el ejemplo 2. Como control, se prepararon diferentes concentraciones (0,4 ppm, 0,2 ppm y 0,1 ppm) de Ani s 4 en PBS con BSA al 0,5% y se introdujo en los pocillos correspondientes del gel. La recuperación de Ani s 4 recombinante superó el 65% y la sensibilidad de detección fue < 1 ppm como se puede observar en la Fig. 5.Different samples of 10 grams of bacaladilla Each one was injected with a certain amount of Ani s 4 recombinant (4 \ mug, 2 \ mug, 1 \ mug and 0 \ mug), for obtain the following allergen concentrations: 0.4 ppm, 0.2 ppm and 0.1 ppm. The recombinant was injected into different areas of Each sample of fish muscle. The extract was prepared and concentrated as previously detailed. The detection of Ani s 4 Recombinant was performed as Example 2. As a control, it was prepared different concentrations (0.4 ppm, 0.2 ppm and 0.1 ppm) of Ani s 4 in PBS with 0.5% BSA and introduced into the wells corresponding gel. The recovery of recombinant Ani s 4 exceeded 65% and detection sensitivity was <1 ppm as You can see in Fig. 5.
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Para valorar el efecto del pH en la extracción de antígenos, se inyectó la misma concentración de Ani s 4 recombinante en muestras de bacaladillas y boquerones (4 \mug de recombinante en 10 gr de pescado; volumen de solución inyectada = 250 \mul repartidos en 4 puntos de inyección por muestra de pescado). Se siguió el proceso de extracción descrito en el ejemplo 1. Una vez que las muestras fueron homogeneizadas, sonicadas y centrifugadas, el sobrenadante obtenido se dividió en dos alícuotas de 15 mi. Una de ellas se mantuvo a pH neutro, mientras que la otra se acidificó a pH <3. Los siguientes pasos se realizaron como se ha descrito previamente.To assess the effect of pH on extraction of antigens, the same concentration of Ani s 4 was injected recombinant in samples of bacaladillas and anchovies (4 \ mug of recombinant in 10 gr of fish; volume of solution injected = 250 µm divided into 4 injection points per sample of fish). The extraction process described in the example was followed 1. Once the samples were homogenized, sonicated and centrifuged, the supernatant obtained was divided into two aliquots of 15 mi. One of them was kept at neutral pH, while the other it was acidified to pH <3. The following steps were performed as has previously described.
La detección se realizó por inmunoblot con antisuero específico anti-Ani s 4 como se describe en el ejemplo 2. En la Fig. 6 se observa una gran diferencia en el rendimiento de la extracción entre los dos pHs, siendo claramente superior la extracción a pH ácido.The detection was performed by immunoblot with specific anti-Ani s 4 antiserum as described in example 2. In Fig. 6 a great difference is observed in the extraction performance between the two pHs, being clearly superior extraction at acidic pH.
Claims (11)
- a.to.
- Obtener la muestra de alimento,Get the sample of food,
- b.b.
- añadir una solución hipotónica a la muestra del apartado (a) y homogeneizar,add a hypotonic solution to the Sample of section (a) and homogenize,
- c.C.
- sonicar el homogenado del apartado (b),sonicate the homogenate of the section (b),
- d.d.
- separar el sobrenadante del producto del apartado (c),separate the product supernatant of section (c),
- e.and.
- reducir el pH del sobrenadante del apartado (d) hasta un valor igual o menor de 3,reduce the pH of the supernatant of section (d) up to a value equal to or less than 3,
- f.F.
- incubar el sobrenadante del apartado (e) y neutralizar el pH,incubate the section supernatant (e) and neutralize the pH,
- g.g.
- separar el sobrenadante del producto del apartado (f) (extracto crudo) yseparate the product supernatant of section (f) (crude extract) and
- h.h.
- analizar el extracto crudo del apartado (g) por medio de técnicas inmunoquímicas.analyze the raw extract of the section (g) by means of immunochemical techniques.
\vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
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2008
- 2008-12-10 ES ES200803495A patent/ES2340978B1/en not_active Expired - Fee Related
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2009
- 2009-12-10 WO PCT/ES2009/070573 patent/WO2010066936A1/en active Application Filing
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010066936A1 (en) | 2010-06-17 |
| ES2340978A1 (en) | 2010-06-11 |
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